JPH04503061A - 安定で強力なｇｒｆアナログ類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 安定で強力なＧＲＦアナログ類 本発明はヒトおよび他の動物、特に哺乳動物における下垂体の機能に影響を及ぼ すペプチドに関する。特に、本発明は下垂体による成長ホルモンの放出を促進す るペプチドに向けられている。本発明のペプチドは、血漿中およびｐＨ中性の水 性環境において、天然ＧＲＦ配列より安定である。

発明の背景 視床下部が、各下垂体ホルモンの分泌を刺激または抑制する視床下部産生の特別 な物質により腺下垂体の分泌機能を制御することを、生理学者らは長年認識して いた。１９８２年、ヒト膵臓（腫瘍）放出因子（ｈｐＧＲＦ）が、ヒト膵臓腫瘍 の抽出物から単離され、精製され、特徴づけられ、合成され、試験され、下垂体 による成長ホルモン（ＧＨ）の放出を促進することが判明した（ギレミン、アー ル（Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎ、Ｒ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２１８．５ ８５〜５８５　（１９８２）　）。それ以来、ラット種、ブタ種、ヒツジ種、ウ シ種およびヤギ種を包含する他の種からのまたヒト種からの対応する視床下部Ｇ Ｈ放出因子が特徴づけられ、合成されている。

ヒト視床下部ＧＲＦ　（ｈＧＲＦ）はｈｐＧＲＦと同一の構造式、すなわち、Ｉ Ｉ−Ｔｒｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｐｈｅ−丁ｈｒ−Ａｓｎ−８ｅ ｒ−丁ｙｒ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｖａ　ｌ　−Ｌｅｕ−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　１　ｎ− Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａ　１ａ−Ａ　ｒｇ−Ｌｙ　５−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ− Ａｓ　ｐ−P１ｅ−Ｍｅｔ　− ８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌ　ｎ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　ｌ　ｕ−Ｓｅｒ−Ａ ｉｎ−Ｇ　１　ｉ−Ｇ　ｌ　ｕ−Ａｒｇ−Ｇ　１　ｙ−Ａ　戟@ａ−Ａｒｇ−＾ １ａ− Ａｒｇ−Ｌｅｕ−ＮＨｔを有することが判明した。

ラットＧＲＦ　（ｒＧＲＦ）は８位にＳｅｒ残基および、ｌ−１ｉｓ−Ａｌａ− Ａｓｐ−Ａ　１ａ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙ　ｒ−Ａｒ ｇ−Ａｒｇ−ｌ　１ｅ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌ■■ −Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｕ−＋　１ ｅ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ａｒｇ−ＧＩｎ−ＧＩｎ−Ｇｌｙ−Ｇ　ｌｕ−Ａｒｇ−Ａ ｓ　ｎ−Ｇ　１　ｎ−Ｇ　ＩＬＩ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ａｒｇ−５ｅｒ−Ａｒｇ−Ｐｈ ｅ−Ａｓ　ｎ−ＯＨの構造式を有することが判明している（例えば米国特許第４ ．５９５，６７６号を参照）。

ブタＧＲＦは２８位にＳｅｒ残基を有することが判明した。

アミノ末端の最初の６アミノ酸の配列、および８位のＳｅｒ残基の一体化を含め た残部配列において１３個のアミノ酸が天然ペプチドと相違するｈＧＲＦの２９ −アミノ酸のアナログがジー・ペリセレビ（Ｇ、Ｖｅｌｉｃｅｌｅｂｉ）らによ り設計された（プロシーディングズ・オブ・ナシ１ナル・アカデミ−・オブ・サ イエンシーズ・オブ・ザ・ユナイティッド・スティソ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏ ｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ）　第８３巻、５３９７〜５３９９頁（ １９８６））。該アナログのアミドおよび遊離酸の形態は、Ｈ−Ｔｙ　ｒ−Ａ　 １ａ−Ａｓ　ｐ−Ａ　ｌａ−＋　１　ｅ−Ｐｈｅ−８ｅｒ−６ｅｒ−Ａ　ｌａ− Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ　−Ｌ■■ −Ｌｅｕ−Ａ　ｌ　ａ　−Ｇ　１　ｎ−Ｌｅｕ−Ａ　ｌａ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ａ ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇ　１　ｎ−Ｇ　１ｕ−Ｌｅｕ−Ｌ■普|Ａ　ｌａ −Ａｒｇ−ＮＨｔｌｏＲの構造式を有する。ラット下垂体前葉細胞の初代培養中 で成長ホルモン（ＧＨ）分泌を刺激する効力をアッセイした場合、該７ミ）’７ す０グｊｔｈＧＲＦ　（１−４０）ＯＨ（７）１．５７倍強力であり、一方該遊 離酸の形態は同一のアッセイにおいて１／６の効果であると報告されている。

ペイル（Ｖａｌｅ）ら（１９８７年５月２２日付は出願、米国特許出願第０５３ ．２３３号）は、別のタンパク質に結合しうる側鎖官能基を有する３１位残基を 利用する３１−残基のｈＧＲＦアナログを記載している。また、３１−残基ｈＧ ＲＦアナログは、８位のＡｓｎまたはＳｅｒ、１０位のＰｈｅ、または１５位の Ａｌａのような天然のＧＲＦの配列に見られる他の残基が置換していてもよい。

ＡｓｎまたはＳｅｒは２８位にあってもよい。３１アミノ酸残基を有し、別のタ ンパク質に結合しうる側鎖官能基を有する３１位残基を利用するこのペプチドの いくつかは、合成され、培養下垂体細胞上でｈＧＲＦレセプターに高い結合親和 性を有し、少なくとも部分的に体内における酵素分解に抵抗でき、実質的な効力 の増大を示すことが報告されている。

天然ＧＲＦの配列は１５位にＧｌｙ残基を有する。１５位にＡｌａまたはＬｅｕ を有するアナログは増大したＧＨ放出効果を有することが公知である（例えば米 国特許第４．６４９．１３１号ならびに第４，７３４，３９９号およびリング− ｘヌ（Ｌｉｎｇ、Ｎ）ら、クオ・バブイス（Ｑｕｏ　Ｖａｄ　ｉ　ｓ？）シンポ ジウム、サノフイ・グループ（Ｓａｎｏｆ　ｉ　Ｇｒｏｕｐ）、１９８５年５月 ２９〜３０日、ツールーズ・ラベゲ（Ｔｏｕ　ｌｏｕｓｅ−Ｌａｂｅｇｅ）　、 フランス（３０９〜３２２頁）参照）。

天然ＧＲＦ配列は血漿酵素により急速に不活性化されることが報告されている。

この急速な分解は、ジペプチジルアミノペプチダーゼ（ＤＡＰ）による該ペプチ ドの２−３結合の開裂を包含する（フローマン・エル・エイ（Ｆ　ｒｏｈｍａｎ 、ＬＡ）　、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲイシ璽ン（Ｊ、Ｃ ｌ１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、）、７８．９０６〜９１３　（１９９６））。

ポリペプチド中のＡｓｎ残基は、いくつかの条件において水の存在下で脱アミド 化が起こることが報告されている。しかしながら、脱アミド化の速度を支配する 規則は明らかでない。例えば、ポリペプチド、トリプシンにおいて、部分配列Ａ ｓｎ−３ｅｔを有するＡｓｎ残基のいくつかだけが脱アミド化し、一方他におい てはこれは起こらない（コシアコフ・エイ・エイ（Ｋｏｓｓｉａｋｏｆｆ。

ＡＡ）　、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４０．１９１〜１９４（１９８８ ）を参照）。

また、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）として開示されている合成ポリペプチド も合成されている。

発明の概要 本発明は、下垂体による成長ホルモンの放出を促進する合成ポリペプチド（ＧＲ Ｆペプチド（ＰＥＰＴＩＤＥ））を提供し、これは該ポリペプチドの８および２ ８位に通常見られるアミノ酸残基の代わりにＳｅｒ残基を有する。本発明のペプ チドは、血漿酵素による分解に対してまた水性環境における分解に対して天然Ｇ ＲＦ配列より安定である。

発明の詳細な説 明細書および請求の範囲中に使用するｒＧＲＦペプチド」なる語は、長さが約２ ７および４４残基の間であり下垂体による成長ホルモンの放出を促進する公知ポ リペプチドを意味する。実例としてのＧＲＦペプチドは、すべてここに参照文献 として合体させる米国特許第４，５１７，１８１号、第４，５１８，５８６号、 第４．５２８．１９０号、第４，５２９，５９５号、第４．５６３．３５２号、 第４．５８５．７５６号、第４，５９５，６７６号、第４．６０５，６４３号、 第４．６１０．９７６号、第４．６２６，５２３号、第４，６２８．０４３号お よび第４，６８９，３１８号、フェリックスーｃイ（Ｆｅｌｉｘ。

Ａ）、７フーシー・ティー（Ｗａｎｇ、Ｃ，Ｔ、）、ハイマー・イー（Ｈｅ　ｉ ｍｅ　ｒ、Ｅ）　、フｔ−ニアー轡エイ（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ。

Ａ）、ボリン・ディー（Ｂｏ　ｌ　ｉｎ、Ｄ）　、アーメッド・エム（Ａｈｍｅ ｄ、Ｍ）　、ランプロス・ティー（Ｌａｍｂｒｏｓ、Ｔ）　、モウレス・ティー （Ｍｏｗ　Ｉ　ｅ　ｓ、　Ｔ、）およびミラー・エル（Ｍｉｔｉｅｒ、Ｌ）、「 新規直鎖および環状ＧＲＦアナログの合成および生物学的活性（Ｓｙｎｔｈｅｓ ｉｓ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｔ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｎｏｖｅｌ　 Ｌｉｎｅｒ　＆　Ｃｙｃｌｉｃ　ＧＲＦ　Ａｎａｌｏｇｓ）Ｊ、ポスター会プレ ゼンテーション、第１Ｏ回アメリカ・ペプチド・シンポジウム（Ａｍｅ　ｒ　ｔ ｃａ　Ｐｅｐｔ　ｉｄｅ　Ｓｙｍｐｏｓ　ｉｕｍ）、セントルイス（Ｓｔ。

Ｌｏｕ　ｉ　ｓ）、１９８７年５月；トウ・ジェイーｘス（Ｔｏｕ　Ｊ。

Ｓ、）、ケンフェ・エル・エイ　（Ｋａｅｍｐ　ｆ　ｅ、Ｌ、Ａ）　、ビネヤー ド・ビー・ディー（Ｖｉｎｅｙａｒｄ、Ｂ、Ｄ、）、ブオノモ・エフ・シー（Ｂ ｕｏｎｏｍｏ、Ｆ、Ｃ，）　、プラー７ｚラ−ｘム・エイ（Ｄｅｌ　Ｉａ−Ｆｅ ｒａ、Ｍ、Ａ、）およびバイμ・シー・エイ（Ｂａ　ｉ　ｌ　ｅ、Ｃ，Ａ）、「 両親媒性成長ホルモン放出因子アナログ、ペプチドデザインおよびインビボの生 物活性（Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｒｅｌｅａ ｓｉｎｇＦａｃｔｏｒ　Ａｎａｌｏｇｓ、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｄｅｓｉｇｎａｎｄ 　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｉｎ　ｖｉｖｏ）Ｊ、バイオケミ カル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃ ｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ。

Ｃｏｍｍｕｎ、）、１３９＃２．７６３〜７７０頁（１９８６）：コイ・ディー ・エイチ（Ｃｏｙ、Ｄ、Ｈ，）ムルフィー・ダブり１−・エイ（Ｍｕ　ｒ　ｐ　 ｈ　ｙ、　Ｗ、Ａ、）　、スエイレスーダイアズ・ジエイ（Ｓｕｅｉｒｅｓ−Ｄ ｉａｚ、Ｊ、）、コイ・イー・ジエイ（Ｃｏｙ。

Ｅ、Ｊ、）、ランス・ブイーｘイ（Ｌａｎｃｅ、Ｖ、Ａ）、「成長ホルモン放出 因子のＮ末端領域上の構造活性研究（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　 ５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｎ−Ｔｅｒｍｉｎａｌ　Ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　 Ｇｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍ。

ｎｅ　Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ）Ｊ、ジャーナル台オブ會メディショ ナル−ケミストリ−（Ｊ、Ｍｅｄ、Ｃｈｅｍ、）　、２８．１８１〜１８５頁（ １９８５）；フェリックス・エイ−エム（Ｆｅｌ　ｉｘ、Ａ、Ｍ、）　、ハイマ ー・イー・ビー（Ｈｅ　ｉｍｅ　ｒ、Ｅ。

Ｐ、）　、％つＬ／ス−ティー・エフ（Ｍｏｗ　ｌ　ｅ　ｓ、　Ｔ、Ｆ、）　、 アイゼンバイス・エイチ（Ｅｉｓｅｎｂｅｉｓ、Ｈ，）、ロイング・ビー（Ｌｅ ｕｎｇ、Ｐ、）、ランプロス・ティー・ジェイ（Ｌａｍｂｒｏｓ、Ｔ、Ｊ、）　 、７−メツド・エム（Ａｈｍｅｄ、Ｍ）およびワン・シー・ティー（Ｗａｎｇ、 Ｃ，Ｔ、）　、ｒ新規成長ホルモン放出因子アナログの合成と生物学的活性（Ｓ ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ｎ ｏｖｅｌＧｒｏｗｔｈ　Ｈｏｒｍｏｎｅ　Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　Ｆａｃｔ。

ｒ　Ａｎａｌｏｇｓ）、第１９回欧州ペプチド・シンポジウム（Ｅｕｒｏｐｅａ ｎ　Ｐｅｐｔ　ｉｄｅ　Ｓｙｍｐｏｓ　ｉｕｍ）　、１９８６年８月３１日〜９ 月５日；フェリセレビ・ジー（Ｖｅｌｉｃｅ１６ｂｉ、Ｇ、）、パッチ・ニス（ Ｐａ　ｔ　ｔ　ｈ　ｉ、ｓ、）およびカイザー・イー・ティー（Ｋａ　ｉ　ｓ　 ｅ　ｒ、Ｅ、　Ｔ、）Ｊ潜在両親媒性ヘリカルカルボキシル末端を有する成長ホ ルモン放出因子のアナログのデザインおよび生物活性（Ｄｅｓｉｇｎ　ａｎｄ　 ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　Ａｎａｌｏｇｓ　ｏｆ　Ｇｒｏ ｗｔｈＨｏｒｍｏｎｅ　Ｒｅｌｅａｓｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ　ｗｉｔｈＰｏｔｅ ｎｔｉａｌ　Ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ　Ｈｅ１ｉｃａｌＣａｒｂｏｘｙｌ　Ｔｅ ｒｍｉｎｉ）Ｊ、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブリ サイエンシーズ・オブ・ザ・ユナイティッド・スティン・オブ・アメリカ（Ｐｒ ｏｃ、Ｎａｔ　Ｉ。

Ａｃａ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ）　８５．５３９７〜５３９９頁（１９８６）ニリング ーＸヌ（Ｌｉｎｇ、Ｎ、）、パイアート・エイ（Ｂａｉｒｄ、Ａ、）、ウェーレ ンバーグ・ダブリュウー・ビー（Ｗｅｈｒｅｎｂｅ　ｒｇ、Ｗ、Ｂ、）　、ムネ グミ・ティー（Ｍｕｎｅｇｕｍｉ、　’ｒ、）およびウエノ・エヌ（Ｕｅｎｏ、 Ｎ、）、「遺伝子工学により生産されたＧＲＦ治療剤の競合的拮抗薬としての合 成ＧＲＦアナログ（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ＧＲＦ　Ａｎａｌｏｇｓ　ａｓ　Ｃｏ ｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ　ｏｆ、ＧＲＦＴｈｅｒａｐｅｕ ｔｉｃ　Ａｇｅｎｔｓ　Ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙＧｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅ ｅｒｉｎｇ）Ｊ、クオ争バディス・ンンポシウム（Ｑｕｏ　Ｖａｄｉｓ　Ｓｙｍ ｐｏｓｉｕｍ）、サノ７４−グループ（Ｓａｎｏｆｉ　Ｇｒｏｕｐ）、１９８５ 年５月２９〜３０日、ツールーズラベゲ（Ｔｏｕ　ＩｏｕｓｅＬａｂｅｇｅ）、 フランス、３０９〜３２９頁に開示されている天然または合成ペプチドを包含す る。ＧＲＦペプチド（ＧＲＦ　ＰＥＰＴＩＤＥ）なる語は、その非毒性塩を包含 する。

ＧＲＦペプチドを定義するのに使用する命名法は、シニローグー（Ｓｃｈｒｏｄ ｅｒ）およびルーブック（Ｌｕｂｋｅ）、「ザ・ペプチド（Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔ　 １ｄｅ）Ｊ、アカデミツク・プＬ／ス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）（１９ ６５）に明記されたものであり、本明細書中では通常表記どおり、Ｎ末端のアミ ７基を左側に、Ｃ末端のカルボキシル基を右側に表す。アミノ酸残基が異性体を 有する場合は特に指示がない限り、Ｌ型アミノ酸を表すものとする。

ここに、Ｎ−［ベータ（パラ−ヒドロキシフェニル）プロピオニル］−残基はデ スアミノＴｙｒ　（またはＰＨＰＰ）と同一である。

ここに、Ｎ−［アルファ（パラ−ヒドロキシフェニル）アセチル］−はＰＨＰＡ と同一である。

本発明は以下の式： ％式％ ［式中、Ｒ１は（所望によりハロゲン、Ｃ，−Ｃ，アルキルまたはＣ，−Ｃ，ア ルコキシからなる群から選択される１または２のメンバーで置換されていてもよ い）ＰＨＰＰ、（所望によりハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはＣ，−Ｃ，ア ルコキシからなる群から選択される１または２のメンバーで置換されていてもよ い）ＰＨＰＡ、（所望によりハロゲン、Ｃ，−Ｃ，アルキルまたはＣ，−Ｃ，ア ルコキシからなる群から選択される１または２のメンバーで置換されていてもよ い’）Ｎ−［パラーヒドロキシベンゾイルコ、（所望によりハロゲン、Ｃ，−Ｃ ４アルキルまたはＣ，−Ｃ，アルコキシからなる群から選択される１または２の メンバーで置換されていてもよい）Ｎ−［パラ−ヒドロキシシンナモイル］また は（所望によりハロゲン、Ｃｌ−Ｃ４アルキルまたはＣ，−Ｃ，アルコキシから なる群から選択されるｌまたは２のメンバーで置換されていてもよい）Ｎ−［（ ４−ヒドロキシフェノキシ）アセチル］； ＲＩＳはＡｌａまたはＬｅｕ； ＲｔｔはＡｌａまたはＬｅｕ； ＲｔｓはＡｓｐまたはＧｌｕ； Ｒ８４はＳｅｔまたはＡｒｇ； ＲｓｓはＡｓｐまたはＳｅｒ； ＲｏｌｌはＡｒｇまたはＧｌｎ； Ｒ３，はＧａｙまたはＡｒｇ　： Ｒ４゜はＡｌａまたはＳｅｒ； Ｒ４ｔはＡｌａ、ＶａｌまたはＰｈｅであり、ＹはＣ−末端のアミノ酸残基のカ ルボキシル部分を意味し、これはＲａおよびＲｂが低級アルキルまたは水素であ る一ＣＯＯＲａ。

−ＣＲａＯ，−ＣＯＮＨＮＨＲａ、−ＣＯＮ　（ＲａＸＲｂ）または−ＣＨ，Ｏ Ｒａ基を意味する］ を有する合成ペプチドアナログ（ＧＲＦペプチド）；またはＮ末端のＲから、Ｃ 末端としての２７位から４４位のいずれかの残基まで伸びるその生物学的に活性 な断片：または前記のＨｓｅ（ラクトン）、ＨｓｅＯＨまたはＨｓ　ｅ　Ｎ（Ｒ ａ）（Ｒｂ）および／または前記の非毒性塩を提供する。

を有する合成ペプチドアナログ（ＧＲＦペプチド）を提供する。

（所望によりハロゲン、Ｃ，−Ｃ，アルキルまたはＣ，−Ｃ，アルコキシよりな る群から選択される１または２のメンバーで置換されていてもよい）ＲＩ置換基 の例は、ｐ−ヒドロキシフェノキシアセチル、ｐ−ヒドロキシフェニルアセチル 、３−フルオロ−４−ヒドロキシフェニルアセチル、４−ヒドロキシ−３−メト キシフェニルアセチル、３−クロロ−４−ヒドロキシフェニルアセチル、ｐ−ヒ ドロキシベンゾイル、ｐ−ヒドロキシシンナモイルおよびｐ−ヒドロキシフェニ ルプロピオニルを包含する。

Ｃ，−Ｃ，アルキルなる語は、メチル、エチル、プロピル、ブチルおよびその異 性体を包含する。Ｃ，−Ｃ，アルコキシなる語は、メトキシ、エトキシ、プロピ ルオキシ、ブトキシおよびその異性体を包含する。ハロゲンなる語は、クロロ、 フルオロ、ヨードおよびブロモ原子を包含する。

本発明の具体例は、式：　ＰＨＰＰ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｐｈｅ −Ｔｈｒ−３ｅｒ−３ｅｒ−Ｔｙ　ｒ−Ａ　ｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａ　ｌ　−Ｌｅｕ −Ａ　１ａ−Ｇ　１　ｎ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａ　１　ａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａ　 １ａ−Ｌ■普|Ｇ　１ｎ− Ａｓｐ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇ　１ｎ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｇ　ｌｙ　 −Ｇ　１　ｕ−Ｓｅｒ−Ａｓ　ｎ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　ｌｕ−Ａ窒■|Ｇ　Ｉｙ− Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−ＮＨｔを有するペプチドＰＦＩＰ＋ ’−Ａｌａ’Ｓｅｔ”Ａｒｇ”Ａｌａ”　Ａｒｇ”Ａｌｔ”Ｌｅｕ”ｈＧＲＦ（ ２−４４）ＮＨｔである。

さらに、本発明の具体例は、式：ＰＨＰＡ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−１１ｅ− Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｓｅ　ｒ−Ｔｙ　ｒ　−Ａ　ｒｇ−Ａ　ｒｇ−Ｖａ　 １−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　−Ｇ　１　ｎ　−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ　−Ａ　１　ａ−Ａ　窒 ■|Ａｒｇ−Ｌｅｕ　− Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　 Ｉｎ−Ｇ１　ｙ−ＮＨｔを有するペプチド：ＰＨＰＡ−＾１ａ’ｓｅｔ’Ａｒｇ ”　Ｌｅｕ”　Ａｒｇ″’Ｌｅｕ”ｈＧＲＦ（２−３２）ＮＨｔである。

本発明のもう１つの具体化は、構造式：３−エトキシＰＨＰＡ−Ａｌａ−＾５ｐ −Ａ　１ａ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈ　ｒ−Ｓｅｒ−３ｅｒ−Ｔｙ　ｒ−Ａ　ｒｇ −Ａ　ｒｇ−Ｖａ　ｌ　−Ｌｅｕ−Ａ　ｌａ　−Ｇ　Ｉ　ｎ|Ｌｅｕ−Ｓｅｒ −Ａ　１　ａ−Ａ　ｒｇ−Ａ　ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ　−Ｇ　］　］ｎ−Ａｓｐ −１１ｅ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｒｇ　−ＮＨ（エチル）を有するペプチド：３− メトキシＰＨＰＡ−ＡＩａ”Ｓｅｔ’Ａｒｇ’　”Ａｌａ”　Ａｒｇ”　Ｌｅｕ ！７ｈＧＲＦ（２−２９）ＮＨ（エチル）である。

さらに、本発明の具体例は、式、Ｎ−［バラ−ヒドロキシベンゾイル］−Ａｌａ −Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−＾ｒｇ −＾ｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ａｌａ−＾ｒｇ −＾ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ −Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇａｙ−Ｈｓｅラクトンを有するペプチド：　Ｎ−［バへ− ヒドロキシベンゾイルロー八１ａ’ｓｅｔ’Ａｒｇ　’　”Ａ　ｌａ　”　Ａｒ ｇ”　’　Ｇｌ　ｕ”　Ｌｅｕ”Ｈｓｅ３３ｈＧＲＦ　（２−３３）ラクトンで ある。

本発明の好ましい具体例は、式：　Ｐ）ＩＰＰ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−１１ ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−＾ｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅ ｕ−Ａｌａ−Ｇｉｎ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａｌａ−＾ｒｇ−＾ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅ ｕ−Ｇ　Ｉ　ｎ　−Ａ　ｓ　ｐ−Ｉ　１ｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａ　ｒｇ−Ｇ　］ 　ｎ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　Ｉｙ−ＨｓｅＮＩ（ｔを有す驛yプ チド：　ＰＨＰＰ−Ａｌａ”Ｓｅｔ’Ａｒｇ”　Ａｌａ”　Ａｒｇ”　’Ｌｅｕ ″’１（ｓｅ”ｈＧＲＦ（２−３３）ＮＨ，である。

本発明のもう１つの好ましい具体例は、式：　ＰＨＰＰ−Ａｌａ−Ａｓｌ）−Ａ ｌａ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−３ｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖ ａｌ−Ｌｅｕ−＾１ａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌ ｅｕ−Ｌｅｕ　−Ｇ　１　ｎ−Ａｓ　ｐ−Ｉ　１　ｅ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｒｇ −Ｉｓ　ｅＮＨｔを有するペプチド：　ＰＨＰＰ−Ａ１ａ’Ｓｅｒ’八ｒｇ”Ａ ｌａへＡｒｇ”Ｌｅｕ”Ｈｓｅ”ｈＧＲＦ（２−３０）ＮＨｔである。

商業生産方法のため、好ましくはカルボキシ末端残基はホモセリン、ホモセリン ラクトン、ホモセリンアミドまたはホモセリンの低級Ｃ，−Ｃ，アルキル、２級 または３級アミドとする。

例えばそれぞれここに参照文献として合体さ昼る米国特許第４゜５２９．５９５ 号（２欄３５行〜５欄６４行）および米国特許第４゜６８９．３１８号（２欄２ ３行〜９欄１３行）に開示された方法を包含する適当な方法により、合成ＧＲＦ ペプチドアナログを合成する。

方法Ａとして、本発明のＧＲＦペプチドアナログを合成するための好ましい方法 を説明する。

方法Ａ アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）４３ ０Ａペプチド・シンセサイザー（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅ ｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フｔスター・シティ−（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ ）、カルフォルニア（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ））およびアプライド・バイオシス テムズにより供給された合成サイクルを使用する固相法により該ペプチドを合成 する。Ｂｏｃアミノ酸および他の反応剤は、アプライド・バイオシステムズおよ び他の商業源から供給される。Ｃ末端カルボキシアミドの生成のため、ダブルカ ップリング法を使用する逐次的なりｏｃ化学を出発物質であるｐ−メチルベンズ ヒドリルアミン樹脂に適用する。Ｃ末端酸の生成のため、対応するＰＡＭ樹脂を 使用する。アスパラギン、グルタミン、アルギニン、［アルファー（バラ−ヒド ロキシフェニル）酢酸］、［ベータ（バラヒドロキシフェニル　プロピオン酸コ 、バラヒドロキシ安息香酸、バラヒドロキシケイ皮酸およびバラヒドロキシフェ ノキシ酢酸を、予め形感させたヒドロキシベンゾトリアゾールエステルを使用す ることによりカップリングさせる。予め形成させた対称Ｂｏｃアミノ酸無水物を 使用して他のすさでのアミノ酸をカップリングさせる。

以下の側鎖保護方法すなわち、 Ａｒｇ、）−シル Ａｓｐ、ベンジル Ｇｌｕ、ベンジル Ｓｅｔ、ベンジル Ｔｙｒ、４−ブロモカルボベンゾキシ を使用する。

塩化メチレン中、トリフルオロ酢酸（Ｔ　Ｆ　Ａ）でＢｏｃの脱保護を行う。該 合成の完了の後、該ペプチドを脱保護し１０％のアニソールを含有する無水フッ 化水素で樹脂から開裂する。側鎖保護基の開裂および樹脂からのペプチドの開裂 を、０℃またはそれ以下、好ましくは一２０℃で３０分間、ついで０℃で３０分 間行う。ＨＦの除去後、ペプチド／樹脂をエーテルで洗浄し、該ペプチドを氷酢 酸で抽出し、凍結乾燥する。シンクロプレツブ（Ｓｙｎｃｈｒｏｐｒｅｐ）Ｓ− ３００（ジンクロム・インク・リンデン、インディアナ（ＳｙｎＣｈｒｏｍ　Ｉ ｎｃ、Ｌｎｄｅｎ、Ｉｎｄｉａｎａ））陽イオン交換カラム上、イオン交換クロ マトグラフィーにより精製を行う。２０％アセトニトリル中、２０ミリモラー　 トリス（ｐ　Ｈ６，８）の緩衝液を該ペプチドに適用し、同一溶媒中、０−０． ３モラー塩化ナトリウムのグラジェントにより該ペプチドを溶出させる。化合物 をさらに精製し、バイダック（Ｖｙｄａｃ）Ｃ−１８（セパレーションズ・グル ープ、ヘスペリア、カルフォルニア（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　Ｇｒｏｕｐ、Ｈ ｅ５ｐｅｒｉａ、Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ））カラム上、各層が０．１％ＴＦＡを 含有する水ニアセトニトリルのグラジェントを用いて逆相液体クロマトグラフィ ーにより脱塩する。所望の分画をプールし凍結乾燥し、所望のＧＲＦペプチドを トリフルオロ酢酸塩として得る。所望ならば、該トリフルオロ酢酸塩はよく知ら れたイオン交換法により他の適当な塩に変換できる。

実施例 実施例１　：　ＰＨＰＰ−Ａｌａ”Ｓｅｔ”Ａｒｇ”Ａｌａ”Ｌｅｕ”ｈＧＲＦ （２−３２）ＮＨｔ　；化合物Ｎｏ、１ 式：　ＰＲＰＰ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−３ｅｒ− Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ　−Ａ　１　ａ−Ｇ　Ｉｎ− Ｌｅｕ　−８ｅ　ｒ−Ａ　ｌ　ａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇ　１　 ｎ−Ａｓ　ｐ−１１ｅ−kｅｕ−３ｅｒ　− Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨｔを有するＧＲＦアナログペプチドの合 成は、方法Ａのように逐次的に行う。該化合物は予想されたアミノ酸分析を示し 、高速原子衝撃質量分析法（ＦＡＢ−ＭＳ）により予想された３６８１の単同位 体（Ｍ＋Ｈ）’を示した。

実施例２　：　ＰＨＰＡ−Ａｌａ″Ｓｅｒ”Ａｒｇ’　”Ａｌａ”　Ａｒｇ”　 ’Ｌｅｕ”ｈＧＲＦ（２〜３２）ＮＨｔ　；化合物Ｎ０９２ 式：　ＰＨＰＡ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ− Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａ　１ａ−Ｇ　１　ｎ−Ｌ ｅｕ−３ｅｒ−Ａ　ｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ａｓ ｐ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｓ■秩| Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨｔを有するＧＲＦアナログペプチドの合 成を方法Ａにおけるように逐次的に行う。該化合物は予想されたアミノ酸分析を 示し、ＦＡＢＭＳにより予想された３６６７の単同位体くＭ＋Ｈ）°を示した。

実施例３：（３−メトキシ−ＰＨＰＡ）−ＡＩａ’Ｓｅｔ”Ａｒｇ”　Ａｌａ” 　Ａｒｇ”Ｌｅｕ”ｈＧＲＦ（２−３２）Ｎｉ１．　；化合物Ｎ０１３構造式； ３−メトキシＰＨＰＡ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌｍ−＋　１ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ− Ｓｅｒ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−＾ｒｇ−Ｖ’ａ　１−Ｌｅｕ　−Ａ　ｌａ　 −Ｇ　Ｉｎ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａ　ｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇ 　ｌ@ｎ−Ａｓ　ｐ −１ｉｅ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−Ｇｌｙ−ＮＨｔを有する ＧＲＦアナログペプチドの合成を方法Ａのように逐次的に行う。該化合物は予想 されたアミノ酸分析を示し、ＦＡＢ−ＭＳにより予想された３６９８の単同位体 （Ｍ十Ｈ）”を示した。

実施例４：（３−フルオロ−ＰＨＰＡ）−Ａｌａ”Ｓｅｔ”＾ｒｇｌ！ＡＩａ” Ａｒｇ”Ｌｅｕ”ｈＧＲＦ（２−３２）ＮＨｌ　；化合物Ｎｏ、　４式：（３− フルオロ−Ｐ　ＨＰ　Ａ　）−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈ ｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｔ−Ｔｙ　ｒ−Ａ　ｒｇ　−Ａ　ｒｇ−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−Ａ 　１ａ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａ　ｌａ−Ａｒｇ−＾ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌ ■普|Ｇｌｎ −Ａｓｐ−１１ｅ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｉｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨｔ を有するＧＲＦアナログペプチドの合成を方法Ａのように逐次的に行う。該化合 物は予想されたアミノ酸分析を示し、ＦＡＢ−ＭＳにより予想された３６８６の 単同位体（Ｍ＋Ｈ）”を示した。

実施例５：（３−りｏ　ローＰＨＰＡ）−Ａｌａ″Ｓｅｒ”Ａｒｇ’　”Ａｌａ ”　Ａｒｇ”　Ｌｅｕ”ｈＧＲＦ（２−３２）ＮＨ，；化合物Ｎ０１５ 式：（３−り１：１１：ｌ　−ＰＨＰＡ）−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−ｌ　１ｅ −Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−８ｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａ　１−Ｌｅ ｕ−Ａ　１　ａ−Ｇ　Ｉｎ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａ　１　ａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌ ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｎ−`ｓｐ− ＋１ｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＮＨｔを有するＧ ＲＦアナログペプチドの合成を方法Ａにおけるように逐次的に行う。該化合物は 予想されたアミノ酸分析を示し、ＦＡＢ−ＭＳにより予想された３７０３の単同 位体（Ｍ＋Ｈ）”を示した。

実施例６　：　Ｎ−［バラ−ヒドロキシシンナモイル］−Ａ１ａ”Ｓｅｔ”Ａｒ ｇ”Ａｌａ１ＳＡｒｇ″’Ｌｅｕ！？ｈＧＲＦ（２−３２）ＮＨ，：化合物Ｎ０ １６式ニド［バラ−ヒドロキシシンナモイル］−＾１ａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−１１ ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−３ｅｒ−Ｔｙ　ｒ−Ａ　ｒｇ−Ａ　ｒｇ−Ｖａ　 １−Ｌｅｕ−Ａ　ｌ　ａ−Ｇ　ｌ　ｎ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ａ　ｌａ−Ａｒｇ−Ａ 窒■|Ｌｅｕ −Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ａｓｐ−１１ｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｇ　１　ｎ− Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　１ｙ−ＮＨｔを有するＧＲＦアナログペプチドの合成を方法Ａの ように逐次的に行う。該化合物は予想されたアミノ酸分析を示し、ＦＡＢ−ＭＳ により予想された３６７９の単同位体（Ｍ＋Ｈ）”を示した。

実施例７：Ｎ−［（バラ−ヒドロキシ−フェノキシ）アセチル］−Ａｌａ”Ｓｅ ｔ”Ａｒｇ’　”Ａｌａ”　Ａｒｇ”　Ｌｅｕ！７ｈＧＲＦ（２−３２）ＮＨｔ 　；化合物ＮＯ３７式：Ｎ−［バラ−ヒドロキシ−フェノキシ）アセチル］−Ａ ｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−１１ｅ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａ ｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａ　１−Ｌｅｕ−＾１ａ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ− Ａｒｇ−Ａ　ｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉ　ｎ−Ａｓ　ｐ−１１ｅ−Ｌｅｕ− Ｓｅｒ−Ａ　ｒｇ−Ｇ　１ｎ−Ｇ　Ｉｎ　−Ｇ　ｌｙ　−ＮＨｔをLする ＧＲＦアナログペプチドの合成を方法Ａのように逐次的に行う。

実施例８　：　Ｎ−［バラ−ヒドロキシ−ベンゾイル］−Ａｌａ’Ｓｅｔ”Ａｒ ｇ’　”Ａｌａ”Ａｒｇ”Ｌｅｕｔ７ｈＧＲＦ（２−３２）ＮＨｔ　；化合物Ｎ ｏ、８式二Ｎ−［バラ−ヒドロキシ−ベンゾイル−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａ ｒｇ−＾ｒｇーＶａｌーＬｅｕーＡｌａーＧｌｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａ ｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｉｎ−Ａｓ　ｐ−１　１　ｅ−Ｌｅｕ−Ｓ ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇ　Ｉｎ−Ｇ　］　ｎ−Ｇ　ｌｙ−ＮＨｔを有するＧＲＦアナロ グペプチドの合成を方法へのように逐次的に行う。

固相法によるＧＲＦアナログの製造に加え、あるアナログは遺伝子組換え生合成 法および合成法の組み合わせにより得ることができる。例えば、 ＰＨＰＰ−Ａｌａ’　Ｓｅ　ｔ”　Ａｒｇ”　Ａｌａ”　Ａｒｇ”　’Ｌｅｕ” 　Ｓｅ　ｒ”　’　Ａｒｇ”　ｂＧＲＦ　（２−４４）ＯＨは、Ｌｅｕ″’　ｂ ＧＲＦ　（１−４４）ＯＨについて記載された方法により（欧州特許出願０２　 １　２５３　１）以下の修飾にしたがい、生合成法および合成法の組み合わせに より得ることができる。

ｂＧＲＦ　（１−４４）ＯＨをコートするＤＮＡ（７）−１＝グメントニおいて 、Ｔｙ　ｒ’についてのコドンを欠失し、Ａｓｎ’　Ｌｙｓ’　”ＧｌｙＩ５Ｌ ｙｓ”Ａｓｎ”Ｌｙｓ”についてのコドンを、それぞれ（ＴＣＴ）Ｓ　ｅ　ｔ’ 、（ＣＧＴ）Ａｒｇ’　”　、（ＯＣＴ）Ａｌａ”、（ＣＧＴ）Ａｒｇ”、（Ｔ ＣＴ）Ｓｅ　ｒ”　’および（ＣＧＴ）Ａｒ　ｇ”で置換する。前駆体タンパク 質についての遺伝子をイー・コリ（Ｅ．Ｃｏ　ｌ　ｉ）発現ベクターに挿入する 。該タンパク質の発現、封入体の単離および前記欧州特許出願中に記載のギ酸中 、臭化シアンによるその開裂の後、ギ酸を減圧下除去する。

該残渣をジメチルホルムアミド中に溶解し、反応混合物中に含有されている粗Ｓ ｅｒ・Ａｒｇ’宜Ａｌａ’％Ａｒｇ”　’　Ｌｅｕ當７Ｓｅｒ″”　Ａｒｇ”　 ｂＧＲＦ（２−４４）ＯＨのアミノ末端Ａｌａを、ジイソプロピルエチルアミン のような適当な３級塩基の存在下、ベータ［パラ−ヒドロキシフェニルプロピオ ン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルでアシル化する。ついで、該ペプチ ドを記載方法により精製し、化合物ＮＯ１９、ＰＨＰＰ−Ａｌａ”　Ｓｅｔ＠Ａ ｒｇ’雪Ａｌａ”Ａｒｇ”　Ｌｅｕ”Ｓｅｔ”Ａｒｇ”ｂＧＲＦ　（１−４４） ＯＨを得る。

例えばここに参照文献として合体させるモレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、テ４−−　ｖ　ニアティス（Ｔ、Ｍａｎｉａｔ ｉｓ）ら、コールド・スプリング・ノ１−バー・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐ ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ。

１ａｔｏｒｙ）（１９８２）およびビー・パーパル（Ｂ、Ｐｅｒｂａｌ）、ア・ プラクティカル・ガイド・トウー・モレキュラー・クローニング（Ａ　Ｐｒａｃ ｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）、ジョ ン・ウィリー・アンド・す特表千４−５０３０６１　（１Ｇ） ンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉ　ｌｅｙ＆５ｏｎｓ）（１９８４）に記載の当業者によく 知られた組換えＤＮＡ技術により、本発明で使用する組換え宿主微生物をつくる 。

ケンペ（Ｋｅｍｐｅ）ら、バイオ・テクノロジー（ＢＩＯ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧ Ｙ）　、４巻、５６５〜５６ｇ頁（１９８６）中に開示された方法により、Ｃ末 端Ｈｓｅ　（ラクトン）、ＨｓｅＯＨおよびＨｓｅＮ　（Ｒａ）（Ｒｂ、）アナ ログを製造しうる。

実施例で製造されたペプチドを含めた本発明の合成ＧＲＦペプチドのすべては、 生物学的に活性であり下垂体によるＧＨの放出を刺激するのに有用であると考え られる。

該ペプチドの投与量は、体重のＩＫｇ当たり約５０ナノグラムと約５ミクログラ ムの間とするのが、ＧＨの分泌を起こすのに特に有効であると考えられる。

該ペプチドによりＧＨの分泌を刺激することにより、正常なＧＨレベルを有する ヒト、ウシおよび他の動物の成長増進が付随的に起こるはずである。そのうえ、 投与は体脂肪含量を変化させ、他のＧＨ依存性の代謝、免疫および発生の過程を 修飾するであろう。例えば、これらのアナログは、熱傷を受けた後のような状況 下でのヒトにおける同化過程を刺激する手段として有用でありうる。もう１つの 例としては、ニワトリ、シチメンチョウ、ブタ、ヤギ、ウシおよびヒツジのよう な商業的温血動物に該アナログを投与でき、また魚類および例えば海ガメおよび ウナギのような他の冷血海洋動物、および両性動物を育てる養殖に使用でき、そ の結果、成長を加速化させ、有効量の該ペプチドを与えることにより得られた、 脂肪に対するタンパク質の比率を増加させうる。

毎日の投与量には５０ナノグラム／Ｋｇと約５０マイクログラム／Ｋｇ体重との 間が、泌乳および成長を増加させるのに特に有効であると考えられる。

ヒトおよび動物に対する投与のためには、これらの合成ペプチドの純度は少なく とも９３％、好ましくは少なくとも９８％とすべきである。

医薬組成物を形成するために、医薬上または獣医学上許容しうる担体と、好まし くは持続性側形として組み合わせた該合成ペプチドまたはその非毒性塩を、ヒト を包含する動物に、静脈内、皮下、筋肉内、例えば鼻腔内のように経皮的に投与 しうる。治療されるべき対象者がそのような治療を要する場合、ＧＨの放出を刺 激するために医師が該投与を行いうる。必要な用量は、治療すべき個々の症状、 症状の重症度および所望の治療の継続期間により変化する。

該ペプチドはしばしば、酸付加塩または例えば亜鉛、鉄などの金属錯体（該投与 のための塩とみなされるもの）のような非毒性塩の形態で投与される。そのよう な酸付加塩の実例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩 、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、フハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸 塩、酒石酸塩などである。等張生理食塩水中にて静脈内注射により有効成分を投 与する場合、リン酸緩衝液等で行いうる。

医師の指導の下で該ペプチドをヒトに投与すべきである。通常、医薬組成物は固 体または液体の通常の医薬上許容しうる担体と共に該ペプチドを含有する。通常 、非経口投与量は、対象者の体重ｌキログラム当たり、ペプチド　約１００ナノ グラム〜約５０マイクログラムである。

本発明をその好ましい具体例に関し記載してきたが、ここに添付する請求の範囲 中に記載する本発明の範囲を逸脱しない限り、当業者にとって自明な種々の変形 および修飾をなし得るものと理解されるべきである。例えば、該ペプチド鎖の修 飾、特に該ペプチドのＣ末端から始まるｌまたは２残基の欠失を、今日までに公 知となった実験法通りに行うことができ、それにより当該ペプチドの生物学的効 能の本質的である部分そのものを保持するペプチドを創製する。

そしてそのようなペプチドは本発明の範囲内にあるものとみなされる。その上、 化合物１〜９の記載物のように本発明の範囲を逸脱しないで、ペプチド化学の技 術において公知のとおり、Ｃ末端へ付加することもでき、および／または天然に 存在する残基に代えて一般的にこれと同等な残基に置換でき、それにより、例え ば蛋白分解に対する抵抗性が増大した、また特許請求するポリペプチドの効力の 少なくとも本質的な部分を有する他のアナログを生成する。同様に、Ｃ末端のカ ルボキシル部分における公知の置換、例えば低級アルキルアミド、により同等な 分子が生産される。

国際調査報告 ＳＡ　３３９９５

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．式： 【配列があります】 ［式中、Ｒ１は（所望によりハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはＣ１−Ｃ４ア ルコキシよりなる群から選択される１または２のメンバーで置換されていてもよ い）ＰＨＰＰ、（所望によりハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはＣ１−Ｃ４ア ルコキシよりなる群から選択される１または２のメンバーで置換されていてもよ い）ＰＨＰＡ、（所望によりハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはＣ１−Ｃ４ア ルコキシよりなる群から選択される１または２のメンバーで置換されていてもよ い）Ｎ−［パラ−ヒドロキシベンゾイル］、（所望によりハロゲン、Ｃ１−Ｃ４ アルキルまたはＣ１−Ｃ４アルコキシよりなる群から選択される１または２のメ ンバーで置換されていてもよい）Ｎ−［パラ−ヒドロキシシンナモイル］または （所望によりハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはＣ１−Ｃ４アルコキシよりな る群から選択される１または２のメンバーで置換されていてもよい）Ｎ−［（４ −ヒドロキシフェノキシ）アセチル］；Ｒ１５はＡｌａまたはＬｅｕ； Ｒ２２はＡｌａまたはＬｅｕ； Ｒ２５はＡｓｐまたはＧｌｕ； Ｒ３４はＳｅｒまたはＡｒｇ； Ｒ３５はＡｓｐまたはＳｅｒ； Ｒ３８はＡｒｇまたはＧｌｎ； Ｒ３８はＧｌｙまたはＡｒｇ； Ｒ４０はＡｌａまたはＳｅｒ； Ｒ４２はＡｌａ、ＶａｌまたはＰｈｅであり、ＹはＣ−末端のアミ ノ酸残基のカルボキシル部分を意味し、これはＲａおよびＲｂが低級アルキルま たは水素である−ＣＯＯＲａ、−ＣＲａＯ、−ＣＯＮＨＮＨＲａ、−ＣＯＮ（Ｒ ａ）（Ｒｂ）または−ＣＨ２ＯＲａ基を意味する〕を有するＧＲＦペプチド；ま たはＮ末端のＲから、Ｃ末端としての２７から４４位のいずれかの残基まで伸び るその生物学的に活性な断片：または前記のＨｓｅ（ラクトン）、ＨｓｅＯＨま たはＨｓｅＮ（Ｒａ）（Ｒｂ）および／または前記の非毒性塩。
2. ２．式【配列があります】 を有する請求項１記載のＧＲＦペプチド。
3. ３．式【配列があります】 を有する請求項１記載のＧＲＦペプチド。
4. ４．式［３−メトキシ−ＰＨＰＡ］【配列があります】を有する請求項１記載の ＧＲＦペプチド。
5. ５．式［３−フルオロ−ＰＨＰＡ］【配列があります】を有する請求項１記載の ＧＲＦペプチド。
6. ６．式［３−クロロ−ＰＨＰＡ］【配列があります】を有する請求項１記載の ＧＲＦペプチド。
7. ７．式Ｎ−［パラ−ヒドロキシシンナモイル］【配列があります】を有する 請求項１記載のＧＲＦペプチド。
8. ８．式Ｎ−［（４−ヒドロキシ−フェノキシ）アセチル］【配列があります】を 有する請求項１記載のＧＲＦペプチド。
9. ９．式Ｎ−［パラ−ヒドロキシベンゾイル］【配列があります】を有する請求項 １記載のＧＲＦペプチド。
10. １０．式： 【配列があります】 ［式中、Ｒ１は（所望によりハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはＣ１−Ｃ４ア ルコキシよりなる群から選択される１または２のメンバーで置換されていてもよ い）ＰＨＰＰ、（所望によりハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはＣ１−Ｃ４ア ルコキシよりなる群から選択される１または２のメンバーで置換されていてもよ い）ＰＨＰＡ、（所望によりハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはＣ１−Ｃ４ア ルコキシよりなる群から選択される１または２のメンバーで置換されていてもよ い）Ｎ−［パラ−ヒドロキシベンゾイル〕、（所望によりハロゲン、Ｃ１−Ｃ４ アルキルまたはＣ１−Ｃ４アルコキシよりなる群から選択される１または２のメ ンバーで置換されていてもよい）Ｎ−［パラ−ヒドロキシシンナモイル］または （所望によりハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはＣ１−Ｃ４アルコキシよりな る群から選択される１または２のメンバーで置換されていてもよい）Ｎ−［（４ −ヒドロキシフェノキシ）アセチル］；Ｒ１５はＡｌａまたはＬｅｕ； Ｒ２２はＡｌａまたはＬｅｕ； Ｒ２５はＡｓｐまたはＧｌｕ； Ｒ３４はＳｅｒまたはＡｒｇ； Ｒ３５はＡｓｐまたはＳｅｒ； Ｒ３６はＡｒｇまたはＧｌｎ； Ｒ３８はＧｌｙまたはＡｒｇ； Ｒ４０はＡｌａまたはＳｅｒ； Ｒ４２はＡｌａ、ＶａｌまたはＰｈｅであり、ＹはＣ−末端のアミノ酸残基のカ ルボキシル部分を意味し、これはＲａおよびＲｂが低級アルキルまたは水素であ る−ＣＯＯＲａ、−ＣＲａＯ、−ＣＯＮＨＮＨＲａ、−ＣＯＮ（Ｒａ）（Ｒｂ） または−ＣＨ２０Ｒａ基を意味する］で示されるＧＲＦペプチド，またはＮ末端 のＲから、Ｃ末端としての２７から４４位のいずれかの残基まで伸びるその生物 学的に活性な断片；または前記のＨｓｅ（ラクトン）、ＨｓｅＯＨまたはＨｓｅ Ｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）および／または前記の非毒性塩 の有効量を動物に投与することを特徴とする該動物において成長ホルモンの放出 を刺激する方法。 １１，医薬上許容される担体と組み合わせて、式：【配列があります】 ［式中、Ｒは（所望によりハロゲン、Ｃ１−４アルキルまたはＣ１−Ｃ４アルコ キシよりなる群から選択される１または２のメンバーで置換されていてもよい） ＰＨＰＰ、（所望によりハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはＣ１−Ｃ４アルコ キシよりなる群から選択される１または２のメンバーで置換されていてもよい） ＰＨＰＡ、（所望によりハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはＣ１−Ｃ４アルコ キシよりなる群から選択される１または２のメンバーで置換された）Ｎ−［パラ −ヒドロキシベンゾイル］、（所望によりハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたは Ｃ１−Ｃ４アルコキシよりなる群から選択される１または２のメンバーで置換さ れていてもよい）Ｎ−［パラ−ヒドロキシシンナモイル］または（所望によりハ ロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキルまたはＣ１−Ｃ４アルコキシよりなる群から選択さ れる１または２のメンバーで置換されていてもよい）Ｎ−［（４−ヒドロキシフ ェノキシ）アセチル］； Ｒ１５はＡｌａまたはＬｅｕ； Ｒ２２はＡｌａまたはＬｅｕ； Ｒ２５はＡｓｐまたはＧｌｕ； Ｒ３４はＳｅｒまたはＡｒｇ； Ｒ３５はＡｓｐまたはＳｅｒ； Ｒ３８はＡｒｇまたはＧｌｎ； Ｒ３９はＧｌｙまたはＡｒｇ； Ｒ４０はＡｌａまたはＳｅｒ； Ｒ４２はＡｌａ、ＶａｌまたはＰｈｅであり、ＹはＣ−末端のアミノ酸残基のカ ルボキシル部分を意味し、これはＲａおよびＲｂが低級アルギルまたは水素であ る−ＣＯＯＲａ、−ＣＲａＯ、−ＣＯＮＨＮＨＲａ、−ＣＯＮ（Ｒａ）（Ｒｂ） または−ＣＨ２ＯＲａ基を意味する］で示されるＧＲＦペプチドまたはＮ末端の Ｒから、Ｃ末端としての２７位から４４位のいずれかの残基まで伸びるその生物 学的に活性な断片；または前記のＨｓｅ（ラクトン）、ＨｓｅＯＨまたはＨｓｅ Ｎ（Ｒａ）（Ｒｂ）および／または前記の非毒性塩の有効量よりなることを特徴 とする動物における成長ホルモン放出刺激用組成物。