CZ397898A3

CZ397898A3 - Fragment leptinu (OB proteinu)

Info

Publication number: CZ397898A3
Application number: CZ983978A
Authority: CZ
Inventors: Kamal Al-Barazanji; Jonathan Robert Sanders Arch; Patrick Camilleri; William Artur Neville
Original assignee: Smithkline Beecham P. L. C.
Priority date: 1996-06-06
Filing date: 1997-06-04
Publication date: 1999-04-14
Also published as: JP2000512137A; NO985683L; CA2257240A1; WO1997046585A2; EP0912609A2; NO985683D0; PL330361A1; AU3337297A; BR9709529A; TR199802534T2; WO1997046585A3; IL127153A0; KR20000016402A; CN1221426A; NZ332879A; AR008765A1

Description

(57) Anotace:

Leptin nebo ob peptld nebo jeho funkční derivát, analog nebo varianta, které ovlivňují tělesnou hmotnost hlavně prostřednictvím ovlivnění využití energie. Farmaceutické přípravky obsahující takovou sloučeninu, způsoby pro přípravu takových sloučenin a použití takových sloučenin v lékařství.

CZ 3978-98 A3 » 4 *

0 4 4 4 4449«

4 4 •4 4444 40 41

W JW- <7f Λ4Η,

Fragment leptinu (OB proteinu)

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových sloučenin, hlavně nových peptidů, přípravků obsahujících takové sloučeniny a použití takových sloučenin v medicíně.

Dosavadní stav techniky

Mechanismus fyziologické regulace energetické rovnováhy v těle - příjem potravy versus výdej energie - je mnoho let předmětem diskuse. V nedávné publikaci v Nátuře.Zhang Y. a kol. (Nátuře 372, 425 - 431 (1994)) naznačuje, že jednou z molekul, která hraje klíčovou úlohu v regulaci energetické rovnováhy, je ob protein. Zhang a kol. také popisují klonování a sekvencování myšího a lidského genu pro ob protein nebo leptin.

Struktura lidského leptinu nebo (lidského ob proteinu a jeho použití v modulování tělesné hmotnosti u zvířat je popsána v UK patentové přihlášce publikované jako GB patent č.

292 382. Tato přihláška také popisuje určité fragmenty leptinu, o kterých je také uvedeno, že jsou schopné modulovat tělesnou hmotnost.

Collins a kol. v Nátuře, svazek 380, str. 677 (1996) popisuji, že vlastnosti leptinu redukující hmotnost mohou být přisouzeny zvýšené spotřebě energie, spíše než snížení příjmu potravy.

9 ·	9 · 9 9	99
	•	9	9 9 ·	9 9 9
		9	Λ β 9 9 β	9 9 9
		9	9 9 9	9
> -	9*9	9 9 9	99 9999	99

Podstata vynálezu

Nyní jsme objevili určité nové fragmenty leptinu, které překvapivě modulují tělesnou hmotnost hlavně zvýšením využití energie. Tyto fragmenty jsou proto považovány za použitelné pro léčbu nutričních a metabolických onemocnění, zejména obesity nebo diabetů.

V souladu s tím první aspekt předkládaného vynálezu poskytuje peptid nebo jeho funkční derivát, analog nebo variantu, která moduluje tělesnou hmotnost, hlavně prostřednictvím ovlivnění využití energie.

Výhodně je ovlivněním tělesné hmotnosti snížení tělesné hmotnosti.

výhodně je ovlivnění využití energie zvýšení spotřeby energie.

' Výhodně je peptid fragment ob proteinu, zejména lidského ob proteinu, nebo jeho funkční derivát, analog nebo varianta.

Dále budou proteinové fragmenty (nebo peptidy) označovány s ohledem na aminokyselinovou sekvenci lidského ob proteinu, za použití zkratek analogických s následující: 'proteinový fragment skládající se z aminokyselinových zbytků 1 až 6' je zkráceně uveden jako 'obl-6'.

Jednotlivé peptidy zahrnují ob21~26 (MVPIQK), ob27-32

•	9 9 *	9 9 · *
9	« 9	9 9 9 9 9
9	9 9 9	9 9 9 999
9	* 9	9 9 9
9 9 9	999 99	9999 «9

(VQDDTK), αί?33-36 (TLXK), Oh37-41 (TIVTR), o£42-54 (INDISHTQSVSSK), OĎ55-56 (QK), OĎ57-74 (VTGLDFIPGLHPILTLSK) , OĎ93-105 (NVIQISNDLENLR), ohl06-115 (DLLHVLAFSK), ohll6-149 (SCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEWALSR) a OÚ150-167 (LQGSLQDMLWQLDLSPGC), zejména Ojb57-74 (VTGLDFIPGLHPILTLSK).

Výhodné vynález obsahuje peptid tvořený jakýmkoliv jedním nebo více z výše uvedených jednotlivých peptidů.

Lépe vynález obsahuje peptid tvořený jakýmikoliv dvěma sousedními členy z výše uvedených jednotlivých peptidů.

Jak bylo uvedeno výše, vynález také obsahuje funkční deriváty, analogy a varianty peptidů zde uvedených.

Funkční deriváty zahrnují soli a solvaty peptidů zde uvedených a také peptidy podle předkládaného vynálezu, které jsou chemicky modifikované připojením skupin, které zlepšují fyzikální vlastnosti, jako je stabilita, nebo terapeutické vlastnosti, například farmakókinetické vlastnosti, proteinu..

Funkční analogy zahrnuj i.funkčně analogické peptidy, ve kterých je jedna nebo více aminokyselin peptidů podle předkládaného vynálezu nahrazena alternativní aminokyselinou.

Alternativní aminokyseliny zahrnují aminokyseliny,, které jsou stereochemicky alternativní k aminokyselinám v ob proteinu.

Funkční analogy, také zahrnují malé molekuly agonistické nebo antagonistické k peptidům podle předkládaného vynálezu. Takové

4« 4« · * 44

44 4 4 44 4

4 · 4 4 4 4

4 4 · 444 444

4 4 4 4 • «44444 44 44 sloučeniny mohou být připraveny a testovány podle známých postupů, jako jsou například postupy popsané v GB patentu č. 2 292 382.

Soli zahrnují farmaceuticky přijatelné soli, zejména farmaceuticky přijatelné adiční soli s kyselinou.

Adiční soli peptidů s kyselinou jsou připraveny standartním způsobem ve vhodném rozpouštědle z původní sloučeniny a nadbytku kyseliny, jako je kyselina chlorovodíková, bromovodiková, sírová, fosforečná, octová, maleinová, jantarová nebo methansulfonová. Zejména výhodnou formou soli je acetat. Některé sloučeniny tvoří vnitřní soli nebo obojetné ionty, které mohou být přijatelné. Kationtové soli jsou připraveny reakcí původních sloučenin s nadbytkem alkalického činidla, jako je hydroxid, uhličitan nebo alkoxid obsahující vhodný kation. Kationty jako je Na⁺, K⁺, Ca²⁺ a NH₄ ⁺ jsou příklady kationtů přítomných ve farmaceuticky'přijatelných solích.

Solvaty zahrnují farmaceuticky přijatelné solvaty, jako jsou hydráty.

Mělo by být jasné,’že předkládaný vynález zahrnuje jak peptidové, tak nepeptidové sloučeniny.

Kromě toho vynález obsahuje subfragmenty jednotlivých peptidů c>jfc>21-26, OĎ27-32, OĎ33-36, Ob37-41, ob42-54, OÍ>55-56, OĎ57-74, ob93-105, obl06-115, obll6-149 a obl50-167, zejména OjĚ>57-74; nebo peptid tvořený z jakéhokoliv jednoho nebo více, zejména dvou sousedících členů, uvedených jednotlivých peptidů; nebo jejich funkční deriváty, analogy nebo varianty.

« A AA · A »· Ι· *» A A Á · · * * * * * « A A A * · · · · • A A A A A A ·Α· AAA « A V A ♦ » ·

AAA AAA AA AAAA AA AA

Vhodné peptidy nebo subfragmenty obsahují alespoň 4 aminokyseliny.

Peptidy podle předkládaného vynálezu jsou výhodně připraveny za použití běžných metod digerování, syntetických technik nebo za použití standartních expresních metod.

Tak, v dalším aspektu, vynález poskytuje způsob přo přípravu peptidu, nebo jeho funkčního derivátu, který obsahuje kroky:

hydrolýzu peptidu, zejména ob proteinu a konkrétně lidského ob proteinu, na alespoň dva fragmenty;

separaci peptidových fragmentů; a popřípadě potom přípravu jejich funkčních derivátů.'

Hydrolýza proteinu je výhodné provedena enzymovým digerováním, za použití například trypsinu.

Separace požadovaného peptidu je výhodné provedena za použití vhodných chromatografických technik, jako je chromatografie na koloně.

Specifické reakční podmínky pro zpracování ob proteinu, které odpovídají zajištění stability požadovaného produktu, .jsou určeny charakterem jednotlivých použitých činidel, například, pokud je činidlem trypsin, pak je reakce normálně provedena při teplotě v rozmezí 25 až 40 °C a pH v rozmezí 7 až 9, výhodně při 37 °C a pH 7,4.

Jak bylo uvedeno výše, peptidy podle předkládaného vynálezu mohou být také připravený běžnými syntetickými postupy, φφφ φφφ «» «φ φφ φφ » · φ * · · · φ φ φ φφφφ « » φ φ φ β * φ φφφ φφφ · φ φφ φφφφ φφ φφ například za použití peptidové syntesy na pevné nebo na kapalné fázi.

V souladu s tím poskytuje předkládaný vynález syntetický peptid nebo jeho funkční derivát, analog nebo variantu, který upravuje tělesnou hmotnost, hlavně prostřednictvím ovlivnění využití energie.

Jakékoliv peptidy zde uvedené tvoří část předkládaného vynálezu jako syntetické peptidy.

Peptidové vazebné jednotky proteinů podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny standařtními technikami peptidové syntézy za použití peptidového syntezátořu (Atherton, E. a Sheppard, R.C. (vydavatelé) (1989) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, LRL Press, Oxford) a potom následuje postup vhodný pro přímou tvorbu disulfidových nebo amidových vazeb.

Dobře známé způsoby pro syntesu peptidů jsou uvedeny v Ali a kol., Med. Chem. 29, 984 (1986) a J. Med. Chem. 30, 2291 (1987) a jsou zde uvedeny jako odkaz. Výhodně jsou peptidy připraveny technikou pevné, fáze podle Merrifielda (J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1964)). Nicméně, může být použita kombinace syntesy na pevné a kapalné fázi, jak je tomu v konvergentní sytese, ve které mohou být di-, tri-, tetra- nebo pentapeptidové fragmenty připraveny syntesou na pevné fázi a mohou být bud dále spojovány, nebo modifikovány syntesou v roztoku.

V průběhu syntesy jsou funkční skupiny postranních řetězců (například -NH₂, -COOH, -OH, -SH) chráněny v průběhu · 0 9 · · · · ·

009« 9 · »·» ··♦ • 0 0 · 0 · · 09···· o····· ·· ·· kondenzačních reakcí. Běžně je α-amino skupina přechodně chráněna jako fluorenylmethoxykarbonyl (Fmoc), ale mohou být použity jiné kyselina- nebo baze-labilní ochranné skupiny, například terč.-butoxykarbonyl (Boc). Aminoskupina postraního řetězce lysinu je chráněna jako terč.-butoxykarbonyl, benzyloxykarbonyl nebo p-chlorobenzyloxykarbonyl (Z nebo Cl-Z). Acetamidomethyl, trityl, terc.-butyl, S-terc.-butyl nebo para-methylbenzyl (p-MBz) chránění je použito pro cysteiny. Hydroxyskupiny jsou chráněny jako butyl- nebo benzylethery a karboxylové skupiny jsou chráněny jako butyl-, benzyl-(Bz) nebo cyklohexylestery.

Peptidy mohou být syntetizovány od C-konce,nebo od N-konce, výhodně od C-konce. Před navázáním je aktivována alfa-karboxylová skupina (vhodně chráněné aminokyseliny). Odborník v oboru může aktivovat chráněnou skupinu mnoha způsoby. Například, je možné použít

N,N'-dícyklohexylkarbodiimidu (DCC), 2-(lH-benzotriazol-l-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniumhexafluorfosfatu (HBTU), p-nitrofenylesteru (pNp), hydroxybenzotríazolesteru (HOBt), směsného anhydridu nebo symetrického ánhydridu N-hydroxysukcimidylesteru (OSu).

Syntesa peptidů v.'roztoku je provedena za použití běžných metod pro tvorbu amidových vazeb. Typicky je chráněná Boc-aminokyselina, která má volnou karboxylovou skupinu, navázána na chráněnou aminokyselinu, která má volnou aminoskupinu za použití vhodného karbodiiitiidového kondenzačního činidla, jako je N,Ν'-dicyklohexylkarbodiimid (DCC), popřípadě za přítomnosti 1-hydroxyběnzotriazolu (HOBT) a dimethylaminopyridinu (DMAP).

	··	• ·	»·
•	Φ	•	•	•	• · ♦	•
v	• ·	•	«	« ·	• · · ··	•
•	Λ	•	•	•	•	•
				• Ml	H ♦♦

Při syntese v kapalné fázi jsou spojovací reakce výhodně provedeny při nízké teplotě (například -20 °C) v rozpouštědlech jako je dichlormethan (DCM), dimethylformamid (DMF),

N-methylpyrrolidon (NMP), tetrahydrofuran (THF), acetonitril (ACN) nebo dioxan.

Pokud je použita metoda na pevné fázi, pak je peptid tvořen sekvenčně od karboxy-konce a směrem k amino-konci peptidu. Syntesa na pevné fázi začíná kovalentní vazbou C-konce chráněné aminokyseliny na vhodnou pryskyřici, jako je 4-{2',4'-dimethoxyfenyl-Fmoc-aminomethyl)fenoxy-pryskyřice (Rinkova amidová pryskyřice, H.Rink, Tetrahedron Letters, 28, 3787, (1987)), 4-benzyloxybenzylalkoholová pryskyřice (Wangova pryskyřice, S.S. Wang,. JACS 95, 1328, (1973)), nebo pryskyřice na bázi kyseliny 4-hydroxymethylfenoxyoctové.

Při syntese na pevné fázi je první aminokyselinový zbytek obyčejně navázán na nerozpustný polymer. Například, dva běžně používané polymery jsou polystyren (1% zesítovaný s divinylbenzenem) a 1% zesíťovaný polyakrylamid. Tyto polymery jsou funkcionalizovány tak, aby obsahovaly reaktivní skupinu, například -OH, -NH₂ a CH₂C1, pro navázání první aminokyseliny konečného peptidu (t.j. karboxy-konec). Volba vazby mezi první aminokyselinou a polymerem je určena karboxy-koncem peptidu. Například, peptidy mající karboxylové skupiny na C-konci mohou být vázáný esterovou vazbou a peptidy zakončené karboxamidem mohou být vázány amidovou vazbou.

Po navázání první chráněné aminokyseliny na požadovanou pryskyřici je ochranná skupina pro amino skupinu odstraněna «4 «4 ** ··

44 4 · 44 4

4 » 4 4 4 4

4« 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 *· • 4 4444 4· ·· reakcí se sekundárním aminem jako je piperidin a volný karboxyl další (chráněné) aminokyseliny je navázán na tuto aminoskupinu. Tento proces je sekvenčně opakován, bez izolace meziproduktů, dokud není vytvořen požadovaný peptid. Dokončený peptid může být odblokován a/nebo odštěpen z pryskyřice j akýmko1iv zpúsobem.

Výhodná rozpouštědla pro kondenzační reakce zahrnují, ale nejsou omezena na, dichlormethan (DCM), dimethylformamid (DMF) a N-methylpyrrolidon (NMP). Po syntese požadované sekvence je peptid zbaven ochranných skupin a je odštěpen z pryskyřice za použití kyseliny trifluoroctové nebo kyseliny trifluormethansulfonové.

Výhodným způsobem pro. odštěpení peptidu z nosné pryskyřice je reakce pryskyřice nesoucí peptid s kyselinou trifluoroctovou za přítomnosti vhodných kationtových a uhličitanových vychytávačů iontů jako je fenol, anisol, thioanisol, ethandithiol, voda nebo ethylenethylsulfid.

Pro získání sloučenin podle předkládaného vynálezu mohou být * syntetické peptidy cyklicky spojovány za použití technik v oboru dobře známých.

Například, spojování prostřednictvím disulfidové vazby dvou lineárních peptidů, které oba obsahuji cysteinové zbytky, může být selektivně provedeno reakcí volného thiolu na jednom řetězci s vhodně aktivovaným cysteinovým derivátem na druhém řetězci. Skupina, která je zejména vhodná jako odstranitelná ochranná skupina, je s-(karbomethoxysulfenyl)-derivát.

Příkladem tohoto způsobu je chránění cysteinových zbytků obou

»	♦ · ·	• ·	«*
•	» a	• *	« · «
»	• a a	a « »	• » a
*	• a	♦ ·	«
···	··· ··		• ·

lineárních peptidů za použití acetamidomethylové (Acm) skupiny. Reakce jednoho řetězce s octanem rtutnatým následovaným β-merkaptoethanolem odstraní acetamidomethylové ochranné skupiny. Při reakci druhého řetězce s karbomethoxysulfenylchloridem vzniká aktivovaný řetězec. Míchání dvou peptidů v ředěném vodném roztoku při pH okolo 7 až 8 způsobí odstranění karbomethylsulfenylové skupiny a tvorbu disulfidové vazby mezi řetězci.

Pokud se vytvoří intramolekulová disulfidové vazba, pak by měl být odpovídající lineární peptid zcela zbaven ochranných skupin a měl by být produkován jako dimerkaptan. Potom může být použito jakékoliv oxidační činidlo; o kterém je v Oboru známo, že je schopné způsobit konversi dimerkaptánu na disulfid. Příklady takový činidel jsou kyanoželezitany alkalických kovů (například kyanoželezitan draselný nebo kyanoželezitan sodný), plynný kyslík, dijodmethan nebo jod. Reakce je provedena ve vhodném inertním rozpouštědle, jako je vodný methanol nebo voda, při teplotách od přibližně Ό do 40 °C, při vysokém ředění. pH je obvyklé udržováno při přibližně 7 až 8. Cyklizace peptidů může být provedena, pokud je ještě připojen na pryskyřici nebo pokud jsou jiné funkční skupiny stále chráněny, ale výhodně je provedena na volném peptidů zbaveném ochranných skupin.

V případech, že mají být tvořeny dvě disulfidové vazby mezi dvěma lineárními peptidy mohou být použity dva typy cysteinových thiolových ochranných skupin, například Acm a trityl. Každý peptid bude obsahovat jeden z typů uspořádaný tak, že jeden pár cysteinů, které mají být navázány, bude chráněn tritylovými skupinami a druhý pár Acm. Při nezávislém · »· ·· • ·· « · · · · · o · φ * 9 ft ««♦ « · ♦ · ···« ·· ·· odstranění trityíové skupiny z každého peptidu vzniknou dva separované monothiolové deriváty, které mohou být spojeny aktivací thiolu na jednom peptidu 2,2'-dipyridylsulfidem a potom přidáním druhého monothiolového peptidu za zisku bis(S-acetamido-methyUdisulfidově vázaných peptidu. Druhý disulfid může být získán přímou oxidací tohoto produktu jodem jak popsal Kamber (B. Kamber, Helv. Chim. Acta 54, 927 (1971)) a Kamber et al. (B. Kamber a kol., Helv. Chim. Acta 63: 899 (1980)).

Peptidové řetězce mohou být. také spojeny za použití vazebné skupiny, jako je NH(CH₂)_nCO-. Tohoto je nejsnáze dosaženo za použití N^a-Fmoc derivátu odpovídající aminokyseliny (NH₂(CH₂)_nCOOH) a jejím'zapracováním-do rostoucího peptidu v , průběhu běžné syntesy na pevné fázi. Podobná strategie může být použita pro spojování peptidových řetězců za použití karboxylových skupin postranního řetězce acidické aminokyseliny jako je kyselina glutamová, a amihoskupiny postranního bazické aminokyseliny jako je lysin. V. tomto případě mohou být. sloučeniny, jako je N⁶-g glutamyllysinový derivát uvedený dále, zapracovány do rostoucího peptidu v průběhu běžné syntesy napevné fázi.

• e »« ·« · ··· • « * • 9 · « · ·· ··· ch₃conh-ch-cooh f

I ch₂)

I co

I i

NH i

I (CH₂)₄ t

I

FmocNHCHCONH₂

Napojení na rostoucí peptid je provedeno prostřednictvím karboxylové skupiny kyseliny glutamové a odstraněním Fmoc skupiny na aminoskupině lysinu poskytuje výchozí bod pro adici dalších aminokyselin.

Alternativně může být na kyselině glutamové použita N^a-tritylová ochranná skupina a po vazbě může být tato skupina odstraněna 80% kyselinou octovou a může být^N-acetylována za použití anhydridu kyseliny octové. Další navázání mohou být provedena podle výše popsaného postupu.

N-koncové N-acetylové skupiny mohou být zavedeny acetylací volné amino skupiny proteinované odstraněním ochranné skupiny pro amino skupinu, za použití anhydridu kyseliny.octové. C-koncové karboxamidové skupiny jsou získány za použití vhodné pryskyřice pro syntesu na pevné fázi, jako je Rinkova amidová pryskyřice.'

Jak bylo uvedeno výše, peptidy podle předkládaného vynálezu

*	0	0 0		0 0	00
«	0	0	0	0	0 · 0
•	0 0	•	*	0 0	00 0
0 • 0 0	• 0··	0 0 0	0	0 0 0 0 0	0 00

mohou být také připraveny za použití rekombinantních DNA technik expresí DNA kódující polypeptidové sekvence.

V souladu s tím vynález obsahuje rekombinantní peptid nebo jeho funkční derivát, analog nebo variantu, který ovlivňuje tělesnou hmotnost, hlavně ovlivněním využití energie.

Jakýkoliv z peptidů zde uvedených tvoří část předkládaného vynálezu jako rekombinantní peptid.

V ještě dalším aspektu vynález obsahuje způsob pro přípravu sloučeniny podle předkládaného vynálezu, kde uvedený způsob obsahuje expresi DNA kódující uvedenou sloučeninu v rekombinantní hostitelské buňce a získání produktu.

DNA polymer obsahující nukleotidovou sekvenci, kódující sloučeninu, je také součástí vynálezu.

Způsob podle předkládaného vynálezu může být proveden konvenčními rekombinantními technikami, jako jsou techniky popsané v Maniatis a kol., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982 a CDN Cloning svazky I, II a III (D.M. Glover ed., IRL Press Ltd.).

Přesněji, způsob může obsahovat kroky:

i) přípravu replikovatelného expresního vektoru, který je schopen, v hostitelské buňce, exprese DNA polymeru obsahujícího nukleotidovou sekvenci, která kóduje uvedenou sloučeninu;

ii) transformaci hostitelské buňky uvedeným vektorem;

• Φ ·φ ·· ·<

φ · · φ φ · φ • V »« « · · » · • » φ Φ 9 Φ · ···*·· • · · · · * · ·#· ««· *· »··· * *· iii) kultivaci uvedené hostitelské buňky 2a podmínek umožňujících expresi uvedeného DNA polymeru za produkce uvedené sloučeniny; a ^í iv) získání uvedené sloučeniny.

Vynález také obsahuje způsob pro přípravu DNA polymeru kondenzací vhodných mono-, di- nebo oligomerických nukleotidových jednotek.

Příprava může být provedena chemicky, enzymaticky, nebo kombinací obou metod, .iň vitřo nebo. in vivo, jak je výhodné.

Tak může být DNA polymer připraven enzymatickým zpracováním vhodných DNA fragmentů, za použití konvenčních technik jako jsou techniky popsané v D.M. Roberts a kol., v Biochemistry 24, 5090 - 5098 (1985).

DNA fragmenty mohou., být získány digerováním DNA obsahující požadované sekvence nukleotidů vhodnými restrikčními enzymy, chemickou syntesou, enzymatickou polymerizací DNA nebo RNA templátů nebo kombinací těchto způsobů. Výhodně bude použita celková syntesa DNA fragmentů.

Digerování restrikčními enzymy může být provedeno ve vhodném pufru při teplotě 20 až 70 °C, výhodně v objemu 50 ml nebo méně s 0,1 až 10 mg DNA.

Enzymatická polymerizace DNA může být provedena in vitro za použití DNA polymerasy jako je DNA polymerasa I (Klenow fragment) ve vhodném pufru obsahujícím podle potřeby nukleosid ,4 4 · · * ·

4 »44 • 4 4 4 4 4

4 4 4 4

444 444 44 4444

44

4 4 • 4 « • 4 « 4 4 4

4

4 4 4 trifosfaty dATP, dCTP, dGTP a dTTP, při teplotě 10 až 37 °C, výhodně v objemu 50 ml nebo menším.

Enzymatická ligace DNA fragmentů může být provedena za použití DNA ligasy jako je T4 DNA ligasa ve vhodném pufru při teplotě 4 °C až teplotě místnosti a v objemu 50 ml nebo menším.

Chemická syntesa DNA polymeru nebo fragmentů může být provedena běžnými fosfotriesterovými, fosfitovými nebo fosforamiditovými chemickými metodami, za použití technik pevné fáze, jako jsou techniky popsané v Chemical and Enzymatic Synthesis of Protein Fragments - A Laboratory Manual (ed. H.G. Gašsen a A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982), nebo v jiných vědeckých publikacích, například v M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat a.R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 10, 6243 (1982); B.S. Sproat a W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 24, 5771 (1983); M.D. Matteuci a M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 21, 719 , (1980); M.D. Matteuci a M.H. Caruthers, Journal of the

American Chemical Society, 103, 3185 (1981); S.P. Adams a kol., Journal of the American Chemical Society, 105, 661 (1983); N.D. Sinha, J. Biernát, J. McMannus a H. Koéster, Nucleic Acids Research. 12, 4539 (1984); a H.W.D. Matthes a kol., EMBO Journal, 3, 801 (1984). Výhodně je použit automatický DNA syntezátor.

DNA polymer je výhodně připraven ligací dvou nebo více DNA molekul, které dohromady tvoří DNA sekvenci kódující sloučeninu.

* A .1» ♦ > 9« 9 9

9¼ 9 V 9 9« 9 ·? 9» 9

9 99 9 9999 · *9 9 9 *. 9 O 9 99 9

9 9 9 * 9 ®

999 999 99 9999 99 ®9

DNA molekuly mohou být získány digerováním vektorů nesoucích požadované'kódující sekvence vhodnými restrikčními enzymy.

Přesná struktura DNA molekul a způsob, kterým jsou získány, závisí na struktuře požadovaného produktu. Návrh vhodné strategie pro konstrukci DNA molekul kódujících sloučeniny je pro odborníky v oboru rutinní záležitostí.

Exprese DNA polymeru kódujícího sloučeninu v rekombinantní hostitelské buňce může být provedena pomocí replikovatelného expresního vektoru schopného exprese DNA polymeru v hostitelské buňce. Expresní vektor je nový a tvoří část předkládaného vynálezu.

Replikovatelný expresní vektor může být připraven podle předkládaného vynálezu štěpením vektoru kompatibilního s hostitelskou buňkou za zisku lineárního DNA segmentu za použití intaktního replikonu a kombinováním uvedeného lineárního segmentu s jednou nebo více molekulami DNA, které, spolu s uvedeným lineárním segmentem, kódují sloučeninu při podmínkách pro ligaci.

'Ligace lineárního segmentu a jedné nebo více molekul DNA může být provedena simultáně nebo sekvenčně, jak je to výhodné.

Tak muže být DNA polymer, vyroben nebo vytvořen v průběhu konstrukce vektoru, pokud je to výhodné.

Volba vektoru bude částečně určena hostitelskou buňkou, která může být prokaryotická, jako je například E. coli, nebo eukaryotická, jako je například myší C127, myší myelomová * · 9 · 9 9 ♦ Μ '9 9 9 i’ 9 9« 9 -9 · · * • 9 99 9 9999 % 9 « 9 9 β 9 999999

9' 9 9 · 4 9 *

999 999 9» 9·99 *9 Μ buňka, ovariální buňka čínského křečka, mykotická, například z vláknitých hub nebo jednobuněčná kvasinka nebo hmyzí buňka jako je buňka odvozená od Drosophila. Hostitelská buňka může být také z transgenního zvířete. Výhodné vektory zahrnují plasmidy, bakteriofágy, kosmidy a rekombinantní viry odvozené od, například, baculoviru nebo viru vakcinie.

Příprava replikovatelného expresního vektoru může být provedena konvenčně za použití vhodných enzymů pro restrikci, polymerizaci a ligaci DNA, kde tyto techniky jsou popsány v Maniatis a kol., výše. Polymerizace a ligace mohou být provedeny způsobem popsaným výše pro přípravu DNA polymeru. Trávení restrikčními enzymy může být provedeno ve vhodném pufru při teplotě 20 až 70 °C, výhodně,v objemu 50 ml nebo menším s 0,1 až 10 mg DNA. '

Rekombinantní hostitelská buňka je připravena, podle předkládaného vynálezu, transformací hostitelské buňky replikovatelným expresním vektorem podle předkládaného vynálezu za transformačních podmínek. Vhodné transformační podmínky jsou běžné a jsou popsány například v Maniatis a kol., výše, nebo v DNA Cloning, svazek II,· D^M. Glover, red., IRL Press Ltd., 1985.

Volba transformačních podmínek je určena hostitelskou buňkou. Tak mohou být.bakteriální hostitelé jako je E. coli ošetřeny roztokem CaCl₂ (Cchen a kol., Proč. Nati. Acad. Sci.

69. 2110 (1973)) nebo roztokem obsahujícím směs RbCl, MnCl₂, octan draselný a glycerol, a potom 3-{N-morfolino)-propan-sulfonovou kyselinou, RbCl a glycerolem. Savčí buňky v kultuře mohou být transformovány vápníkovou ko-precipitací vektorové

♦	• · ·	i »	··	• ·
	V ♦	• 0	« ·	• ·

•	• · · ·	ΰ ·,	♦ « *	♦ H
*	• · »	*		V
···	v · · < ·	··*·	*<·	• *

DNA do buněk.

Vynález také zahrnuje vektor obsahující sloučeninu podle předkládaného vynálezu.

Vynález také zahrnuje hostitelskou buňku transformovanou replikovatelným expresním vektorem podle předkládaného vynálezu.

Kultivace transformovaných hositelských buněk za kultivačních podmínek umožňujících exresi DNA polymeru je provedena konvenčně, jak je popsáno, například, v Maniatis a kol., DNA Cloning, cit. výše. Tak jsou buňce výhodně dodávány živiny á je kultivována při téplotě pod 45 °C.

Produkt exprese je získán konvenčními způsoby podle typu hostitelské buňky. Proto, pokud je buňka bakteriální, jako je E. coli, tak může být lyžována fyzikálně, chemicky nebo enzymaticky a proteinový produkt může být izolován z vzniklého lyzátu. Pokud je produkt secernován bakteriální buňkou, pak může být získán z periplasmatíckého prostoru nebo živného media. Pokud je hostitelská buňka savčí, tak může být produkt izolován ze živného media.

DNA polymer může být vložen do vektorů navržených pro izolaci stabilně transformovaných savčích buněčných linií exprivujících produkt; například vektorů hovězího papilomaviru nebo amplifikováných vektorů v ovariálních buňkách čínského křečka (DNA cloning, svazek II, D.M. Glover, red., IRL Press 1985; Kaufman R.J. a kol., Molecular and Cellular Biology 5, 1750 - 1759 (1985); Pavlakis G.N. a Hamer, D.H. Proceedings

A A * A * *	A A A A
•	•	A	A A	A A A Á
»	•	a a	a 9' A	AAA AAA
i • A ·	A AAA	•	A A A A AAAA	A A ·» A A

of the National Academy of Sciences (USA) 80, 397 - 401 (1983); Goeddel, D.V. a kol., evropský patent č. 0 093 619 (1983)).

Peptidy připravené podle výše uvedených metod mohou být, pokud je to žádoucí, přečištěny mnoha technikami. Výhodné techniky zahrnují gelovou filtraci, chromatografii, HPLC s reversní fází a krystalizaci, zejména chromatografii.

Přečištěné produkty mohou být potom analyzovány na svou čistotu za použití HPLC, aminokyselinové analýzy, sekvencování aminokyselin a ostřelování rychlými atomy a/nebo elektrosprayové hmotnostní spektrometrie.

Funkční deriváty, analogy a varianty proteinů zde uvedených mohou být připraveny za použiti běžných technik, které jsou analogické k technikám zde uvedeným.

Jak bylo uvedeno výše, bylo dokázáno, že sloučeniny podle předkládaného vynálezu mají výhodné farmaceutické vlastnosti. V souladu s tím je také poskytnuta sloučenina podle předkládaného vynálezu pro použiti jako aktivní terapeutická substance.

Přesněji, sloučeniny podle předkládaného vynálezu se považují za schopné ovlivnění tělesné hmotnosti, hlavně zvýšením využití energie a jsou proto potenciálně použitelné pro léčbu nutričních á metabolických onemocnění, zejména obesity a diabetů.

Vynález také poskytuje způsob pro léčbu nutričních a metabolických onemocnění, který obsahuje podání účinného, farmaceuticky přijatelného á netoxického množství sloučeniny

	« a*	• a	• a	a a .
a	• a	♦ a	•	a a a
»	a a	a a 4	a a	a o a a
*	• ·	a a		a a
• a a	• ta a a	a a a a	a a	a a

podle předkládaného vynálezu.

Vynález dále poskytuje farmaceutické přípravky obsahující sloučeninu podle předkládaného vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič.

Při použití bude aktivní sloučenina obyčejně použita ve formě farmaceutického přípravku spolu s lidským nebo veterinárním farmaceutickým nosičem, ředidlem a/nebo přísadou, ačkoliv přesná forma přípravku bude záviset na způsobu podání.

Aktivní sloučenina může být, například, .použita ve...formě tablet, kapslí, pastilek nebo sirupů pro orální podání; ve formě prášku, aerosolu nebo rozprašovatelného roztoku pro inhalaci; ve formě sterilních roztoků pro parenterální podání, nebo ve formě krémů, pleťových vod, tekutých krémů, gelů, mastí . v nebo sprayů pro lokální podání. Parenterální způsoby podání zahrnuj í intravenosní, intramuskulární, subkutánní, transkutánní a intraperitoneální podání.

Také jsou zde obsaženy přípravky výše uvedených derivátů: vhodných pro použití v podkožně implantovatelných pumpách nebo prostředcích pro kontrolované uvolňování, v transdermálních náplastech a mikronizovaných prášcích vhodných pro intranasální podání.

Dávky pro. podání sloučenin podle předkládaného vynálezu jsou ty dávky, které budou způsobovat požadovaný účinek na léčený stav, kdy dávka bude záviset na věku, rozsahu nebo závažnosti zdravotního stavu a kontřaindikacích, pokud jsou nějaké.

Dávka bude v rozsahu od 0,001 mg/kg za děn do 50 mg/kg za den, ale výhodně od 0,01 do 1,0 mg/kg zá den.

•	• ··	a «
•	•	i a a	* · a
4	a a	a a a	a a · ·
t	a	• a a	a
«··	a a a	• a a · · a	a ·

Pevné orální dávkové formy mohou obsahovat běžné přísady jako jsou ředidla, například laktosa, mikrokrystalická celulosa, dihydrogenfosforečnan vápenatý, manitol, uhličitan hořečnatý, glycin, dextrosa, sacharosa, škrob, manitol, sorbitol a uhličitan vápenatý; pojivá, například kapalná glukosa, sirup, akacie, želatina, škrobový sliz, methylcelulosa, polyvinylpyrrolidon, alginaty a preželatinizovaný škrob; činidla podporující rozpadavost jako je například škrob, kyselina alginová, mikrokrystalická celulosa, pektin, zesítěný polyvinylpyrrolidon, glykolat škrob sodný, a natriumkarboxymethylcelulosa; kluzná činidla jako je například talek a oxid křemičitý; lubrikanty jako je například kyselina stearová a stearan hořečnatý; konzervační činidla jako je kyselina sorbová a methyl- nebo propyl-para-hydroxybenžoat, nebo farmaceuticky přijatelná smáčivá činidla jako je například laurylsíran sodný'.

Kapsle se skládají z obalu, obyčejně z želatiny spolu s . dalšími přísadami jako jě například glycerol, sorbitol, povrchově aktivní činidla, plniva nepropustná pro světlo, konzervační činidla, sladidna, chuťová korigens a barviva.

Obsah kapslí může obsahovat ředidla, kluzná činidla a činidla podporující rozpadavost. Tablety se skládají ze stlačeného prášku nebo granulí, mohou být potažené nebo nepotažené a mohou být navrženy tak, aby se rozpouštěly, dispergovaly nebo aby vyšuměly před podáním pacientovi, nebo aby se rozpouštěly nebo dispergovaly v gastrointestinálním traktu ihned po polknutí,, nebo, v případě tablet s potahem nerozpustným ve vodě, později. Tablety obvykle obsahují přísady jako jsou ředidla, pojivá, činidla podporující rozpadavost, kluzná činidla, lubrikans a

• · 99 t«	• 9 99
•	9	•	* 9	9 9 9 »
9	»	• 9	9 » 9	999 999
9 Η»	• • 1 ·	«	• * • 9 9 9« 9	9' 9 • 9 9»

mohou obsahovat barviva a chuťová korigens. Šumivé tablety výhodně obsahuji kyseliny spolu s uhličitany nebo hydrogenuhličitany. Potah tablet se může skládat z přirozených nebo syntetických pryskyřic, gum, nerozpustných plnidel, cukrů, změkčujících činidel, vícemocných alkoholů a vosků a mohou také obsahovat barviva a chuťová korigens. Zdravotní bonbony a pastilky jsou určeny pro rozpouštění v ústech. Zdravotní bonbony mohou být tvarované nebo stlačené a obvykle mají ochucený základ. Pastilky jsou vytvarovány ze základu želatiny a glycerolu nebo akacie a sacharosy. Mohou obsahovat konzervační činidla, stejně jako barviva a chuťová korigens.

Potahové pryskyřice obsahuji deriváty celulosy, zein, vinylové polymery a akrylové pryskyřice, a přípravky pro potahování obvykle obsahují změkčovací činidla, jako je ricinový olej a nebo glýcerol triacetat. Pryskyřice pro enterální potah zahrnují acetat-ftalat celulosy a kopolymery kyseliny metakrylové.

* r

Pevné přípravky pro orální podání mohou být získány běžnými způsoby míšení, plnění, granulování, tabletování a podobně. Opakované míšení může být použito pro distribuování aktivního činidla v přípravku za použití velkých množství plnidel.

Kapalné přípravky vhodné pro orální podání mohou být ve formě, například, elixírů, směsí, koncentrovaných roztoků, suspenzí, emulsí nebo hustých sirupů. Mohou být připraveny jako suchý produkt pro rekonstituci s vodou nebo jiným vehikulem před použitím. Takové kapalné přípravky mohou obsahovat běžné přísady jako jsou suspendační činidla, například sacharosa,

•	0 00 00	• 0
•	•	0 0 i	• 0 0
0	0	«00 00	« 0 0
0	0	0 0 0	0
• · *	0 0 0	00 0000	0 0

sorbitol, želatina, methylcelulosa, karboxymethylcelulosa, hydroxypropylmethylcelulosa, alginat sodný, xantanová guma, akacie, karagén, oxid křemičitý, gel obsahující stearan hlinitý; emulgační činidla, jako je například lecitin, akacie, sorbitan monooleat; vodná nebo nevodná vehikula, která zahrnují jedlé oleje, estery olejů, například estery glycerolu, ethanolu, glycerol; pufrovací činidla jako jsou například citráty a fosfáty alkalických kovů; konzervační činidla jako je například benzoat sodný, kyselina sorbová, methyl- nebo propyl-para-hydroxybenzoat; a pokud je to žádoucí, tak běžná chuůová korigens a barviva.

Přípravky mohou být implantovány subkutánně, například ve formě komprimovaných tablet nebo kapslí se zpomaleným uvolňováním.

Alternativně, přípravky vhodné pro injekce mohou být ve formě roztoků, suspenzí nebo emulzí, nebo suchých prásků, které jsou rozpuštěny nebo suspendovány ve vhodném vehikulu před použitím. ......

Kapalné jednotkové dávkové formy jsou připraveny za použití sloučenin a apyrogeního sterilního vehikula. sloučenina může být, v závislosti na vehikulu a použité koncentraci, buď rozpuštěná nebo suspendovaná ve vehikulu. Roztoky mohou být použity pro všechny formy parenterálního podání a jsou zejména vhodné pro intravenosní infusi. Při přípravě roztoků může být sloučenina rozpuštěna ve vehikulu, kdy roztok je upraven na izotonický roztok přidáním chloridu sodného, pokud je to třeba, a je sterilizován filtrací přes sterilní filtr za použití aseptické techniky před plněním do vhodných sterilních lékovek

*	9	• 9'	9 9	9« 99

•	•	• ·	«	• 9 « 9
9	9	* » 9	9 9	999 999
9	•	9 9	9	9 9
9 9 9	9	9	9999	9· 99

nebo ampulí a uzavřením. Alternativně, pokud je stabilita roztoku adekvátní, tak může být roztok v uzavřených kontainerech sterilizován v autoklavu. Výhodnými pomocnými činidly jsou pufry, solubilizační činidla, stabilizačníčinidla, konzervační činidla nebo baktericidní činidla, suspendační nebo emulgační činidla a/nebo lokální anestetika a mohou být rozpuštěna ve vehikulu.

Suché prášky, které mohou být rozpuštěny nebo suspendovány ve vhodném vehikulu před použitím, mohou být připraveny plněním předem sterilizovaných léčiv a dalších přísad do sterilního kontaineru za použití aseptické techniky ve sterilním prostředí. Alternativně mohou být léčivo a další přísady rozpuštěny ve vodném vehikulu, roztok může být sterilizován, filtrací a umístěn do vhodných kontainerů za použití aseptické techniky ve sterilním prostředí. Produkt je potom sušen sublimací ze zmraženého stavu a zásobníky jsou asepticky uzavřeny.

Parenterální suspenze, vhodné pro intramuskulární, subkutánní nebo intradermální injekci, jsou připraveny v podstatě stejným způsobem, s tou výjimkou, že sloučenina je suspendována ve sterilním vehikulu, místo rozpuštění a sterilizace nemůže být provedena filtrací. Sloučenina může být izolována ve sterilním stavu, nebo. může být alternativně sterilizována po„izolaci, například gamma zářením. Výhodně je-v přípravku obsaženo suspendační činidlo jako je například polyvinylpyrrolidon pro usnadnění jednotné distribuce sloučeniny.

V dalším aspektu je poskytnut způsob pro léčbu nutričních a

4			• 4	• 4	• 4
•		4	4	4	• 4 4
4		« 4	4	a	4 4 4 4
4		4	« 4	•
4*4	4·«		4 4	4 44 4	4 4

metábolických onemocnění, kde uvedený způsob obsahuje podání účinného, netoxického množství sloučeniny podle předkládaného vynálezu nemocnému.

Vynález také obsahuje použití sloučeniny podle předkládaného vynálezu pro výrobu léčiva pro léčbu nutričních a metábolických onemocnění, jako je obesita a diabetes.

Při podání sloučenin podle předkládaného vynálezu způsobem podle předkládaného vynálezu nejsou očekávány žádné neočekávané nežádoucí účinky.

Následující příklady ilustrují sloučeniny podle předkládaného vynálezu.

Příklady provedeni vynálezu

Farmaceutické metody: Aktivity sloučenin podle předkládaného vynálezu jsou hodnoceny způsobem uvedeným dále.

Účinek fragmentů leptinu- na příjem potravy u SD krys

Chirurgie

Krysy byly premedikovány Synuloxem (0,1 ml/100 gj přibližně 1 hodinu před anestesií a potom byla provedena anestesie Domitorem (0,04 ml/100 g i.m.) a subliroasou (0,9 ml/100 g

i.p.). Každé kryse byla stereotaktiky implantována kanyla do postranní mozkové komory za sterilních podmínek. Anestesie byla potom zrušena za použití Antisedanu a Nubainu (50% obj./obj50% obj./obj. 0,02 ml/100 g) i.p.. Po chirurgickém zákroku dostala každá krysa 0,05 ml Zenecarpu.

9 · 9

9 9 •9 99»·

9 9 999

Postup pokusu

Pokus 1: Po chirurgické zákroku byla tělesná hmotnost každého zvířete sledována denně v průběhu celého pokusu.

Pro verifikaci toho, že kanyla je zavedena-do postranní komory byl Ángiotensin II (100 ng/5 μΐ) injikován icv a příjem vody byl sledován po dobu 5 minut po injekci.

Příjem potravy za 24 hodin byl měřen v den 5 a 6 po chirurgickém zákroku. V den 6 byla zvířata rozdělena podle své tělesné hmotnosti do 3 skupin (a, b a c, 8 krys na skupinu) a potom se nechala hladová,,přes noc. V den pokusu (den 7) byla krysám podána následující' icv injekce:

skupina a: vehikulum (PBS, fosfátem pufrovaný roztok, 5 μΐ/krysu);

skupina b: lidský leptin (11,5 μg/5 μΐ); a skupina c: trypsinem digerováný leptin (30 μg/5 μΐ).

Známé množství potravy v množství větším než je denní potřeba bylo krysám podáno ihned po dokončení icv injekce. Dalších 24 hodin byl potom'měřen příjem potravy a tělesná hmotnost. Získané výsledky jsou ukázáný v tabulce 1.

Pokus 2: Samostatná skupina zvířat byla připravena přesně podle postupu popsaného výše, ale v den pokusu po hladovění přes noc byla zvířatům podána následující injekce:

skupina a: vehikulum (PBS, 5 μΐ/krysu); skupina b: lidský leptin (8,75 μg/5 μΐ); skupina c: myší leptin (10 μg/5 μΐ);

a	• ··	o a a·
•	a a a	a a a a
a	a a a a	a a a a a
a	a a a	a a
• · a	aa a a a	a aa a aa

skupina d: ob 57-74, sekvence VTGLDFIPGLHPILTLSK (3,33 W/5 μΐ).

Opět bylo známé množství potravy v množství větším než je denní potřeba bylo podáno ihned po injekci, změna v tělesné hmotnosti a množství konzumované potravy byly zaznamenávány 24 hodin. 2ískané výsledky jsou ukázány v tabulce 2.

Výsledky:

Tabulka l: Účinek lidského leptinu a jeho fragmentů podaných intracerebroventrikulárně na tělesnou hmotnost a příjem potravy u SD krys. * P <0,05.

hodinový Změna tělesné příjem potravy (g) hmotnosti (g/24 hodin)

Vehikulum	36,68 ±2,5	31,44 ± 1,2
(5 μΐ/krysu, n=8)
h-leptin	30,62 ± 1,5*	22,88 ± 2,05
(11,5 μg/křysu, n=8)
h-leptin digerováný	. 34,6 + 1,99	23,88 ± 1,2*
trypsinem (30μg/krysu,	n=8)	*

*	•		44	4 «	44	44

•	4	«		4 4	4	>4 4
	•	4 ·		4 ·	4 4 4	4 «44
•	•	4		4 4		4' 4
444	«1»		·*	• 44«	4»	• 4

Tabulka 2: Účinek lidského leptinu (h-leptinu), myšího leptinu (m-leptinu) a leptinového fragment 57-74 VTGLDFIPGLHPILTLSK podaných intracerebroventrikulárně na tělesnou hmotnost a příjem potravy u SD krys. * P <0,05.

í24 hodinový Změna tělesné příjem potravy (g) hmotnosti (g/24 hodin)

Vehikulum	32,16 ± 0,8	30,55 ±	0,67
(5 μ,Ι/krysu, n=8) h-leptin	33,70 ± 1,6	24,50 ±	3,7
(11,5 ng/krysu, n=8) m-leptin	3Í,3 ± 1,70	23,70 ±	2,18
(30 pg/krysu, n = 8) leptinový fragment	33,6 ± 0,9	26,8 ±	1,2*
57-74 (,33 ^g/krysu,n=8)

•	* AA AA	A A
	•	•	A A	A A ·
«	B	A A	AAA	AAA
B	A	A	A A	A.
AAA	·♦ ·		•A AAAA	A A

Claims

Patentové nároky

1. Peptid nebo jeho funkční derivát, analog nebo varianta, který ovlivňuje tělesnou hmotnost,, hlavně prostřednictvím ovlivnění využití energie.
2. Peptid nebo jeho funkční derivát, analog nebo varianta, který redukuje tělesnou hmotnost, hlavně prostřednictvím ovlivnění využiti energie.
3. Peptid podle nároku 1 nebo 2, kde peptid je fragment ob proteinu, nebo jeho funkční derivát, analog nebo varianta.
4. Peptid podle jakéhokoliv z nároků 1 až 3 vybraný z fragmentu ob proteinu v seznamu: ob21-26, ob2.7-32, oi>33-36, OP37-41, OĎ42-54, ob55-56, ob57-74, ob93-105, OĎ106-Í15, obll6-149 a obl50-167.

H’
5. Peptid podle jakéhokoliv z nároků 1 až 4, kde peptid má aminokyselinovou sekvenci VTGLDFIPGLHPILTLSK.
6. Peptid.podle nároku 1 tvořený jedním nebo více peptidy podle nároku 4.
7. Peptid podle nároku 1' tvořený dvěma sousedními členy peptidů podle nároku 4.
8. S rekombinantní peptid, který je peptidem podle jakéhokoliv z nároků -1 až 7.

• • ·♦ » * ·· • · · • • · « · «« * ♦ i * « ·· · • ·· «-·· ··
9. Nukleotidová sekvence kódující peptid podle jakéhokoliv z nároků 1 až 7.
10. Vektor obsahující nukleotidovou sekvenci kódující peptid podle jakéhokoliv z nároků 1 až 7.
11. Hostitelská buňka transformovaná replikovatelným expresním vektorem podle nároku 9.
12. Způsob přípravy peptidu podle nároku.1, nebo jeho funkčního derivátu vyznačující se t í m, že obsahuje kroky:

hydrolýzu peptidu na alespoň dva fragmenty;

separaci peptidových fragmentů; a popřípadě potom přípravu jeho funkčního derivátu.
13. Způsob přípravy peptidu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 7 vyznačující se tím, že obsahuje expresi DNA kódující uvedený peptid v rekombinantní hostitelské buňce a získání produktu.
14. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že obsahuje kroky:

i) přípravu replikovatelného expresního vektoru, který je schopen, v hostitelské buňce, exprese DNA polymeru obsahujícího nukleotidovou sekvenci, která kóduje požadovaný peptid;

ii) transformaci hostitelské buňky uvedeným vektorem;

iii) kultivaci uvedené hostitelské buňky za podmínek umožňujících expresi uvedeného DNA polymeru za produkce

• • ·« «« • 4 • t * • • • · • • · · • • • · • · « « · · ·· · • « • · · Φ«Φ· • · * · • ·

uvedeného peptidů; a iv) získání uvedeného peptidů.
15. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelný nosič.
16. Sloučenina pole nároku 1 pro použití jako aktivní terapeutická substance.
17. Sloučenina podle nároku 15 pro použití při léčbě nutričních a metabolických onemocnění.
18. Způsob pro léčbu nutričních a metabolických onemocnění vyznačující s e t i m, že obsahuje podání účinného, farmaceuticky přijatelného a netoxického množství sloučeniny podle nároku 1.
19. Použití sloučeniny podle ná.roku 1 pro výrobu léku pro .léčbu nutričních a metabolických onemocnění.