JP2002080496A - 新規な降圧ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 経口投与が可能である、新規な降圧ペプチド
を得る。 【解決手段】 本発明により、既知の機能性ペプチドよ
り更に強力な降圧作用を有し、経口投与が可能な新規ペ
プチド（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｔｒ
ｐ、Ｘ＝Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇ）が与えられた。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、血圧降下剤として
有用な新規ペプチドに関する。

【０００２】

【従来の技術】わが国における高血圧患者数は３０００
万人を超えると言われており、経口投与で有効な安全な
血圧降下物質が求められている。既知の血圧降下物質と
しては交感神経遮断剤、アドレナリンアルファおよびベ
ータブロッカー、カルシウム拮抗剤、利尿剤、アンジオ
テンシン変換酵素阻害剤およびアンジオテンシンＡＴ１
レセプターアンタゴニスト等がある。

【発明が解決しようとする課題】

【０００３】本発明者らは、食品中に含まれる生理活性
物質の探索研究を行う中で、卵白を酵素で加水分解した
組成物中に、動脈弛緩作用を持ち、血圧降下作用を有す
る物質が含まれることをつきとめ、その物質がＡｒｇ−
Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（ｏｖｏｋｉ
ｎｉｎＩＩＩ）であることを示した（特開平１０−３６
３９４号）。その知見より、上記ペプチドと類似するペ
プチドにつき、その生理活性を検討してきたところ、Ａ
ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅという
配列を有するペプチドが血圧降下作用を有することを見
出した（特開２０００−１４３６９５号）。上記のＡｒ
ｇ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅから成る
ペプチドは優れた降圧ペプチドであるが、本発明者らは
そのペプチドを改変することにより、更に強力な降圧ペ
プチドを得る事を試みた。即ち、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｈ
ｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅを改変した種々のペプチド
を得て、より降圧作用が強力な新規ペプチドを得ること
が、本発明の課題である。

【課題を解決するための手段】

【０００４】上記のストラテジーに従い、Ａｒｇ−Ｐｒ
ｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅを改変したペプチ
ドを多数合成した。６番目のアミノ酸であるＰｈｅをＴ
ｒｐに、３番目のアミノ酸であるＰｈｅをＬｅｕにそれ
ぞれ改変することにより、降圧作用が既知のＡｒｇ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅと比べて約３倍
強まることを見出した。４番目のアミノ酸については、
ＨｉｓをＬｙｓ又はＡｒｇに変換しても、降圧活性を維
持していた。即ち、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ｐｒ
ｏ−Ｔｒｐ（Ｘは、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ）からなる
新規のペプチドが、より強い降圧活性を有している事を
見出した。本発明のペプチドは高血圧者に対しては作用
を示すが、正常血圧には影響を及ぼさない安全な降圧物
質である。

【０００５】

【発明の実施の形態】本発明は、Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅ
ｕ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ（Ｘは、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡ
ｒｇ）で表される、新規ペプチドである。本発明のペプ
チドは血圧降下作用を有するために、当該ペプチドを有
効成分として含有することを特徴とする血圧降下剤を作
成することが可能であり、そのようなペプチドもまた本
発明の範囲内である。上記でいうＡｒｇはアルギニン、
Ｐｒｏはプロリン、Ｌｅｕはロイシン、Ｔｒｐはトリプ
トファン、Ｈｉｓはヒスチジン、Ｌｙｓはリジンを示
す。かかるアミノ酸はいずれもＬ−体である。

【０００６】本発明のペプチドは、ペプチド合成法で取
得することができる。即ち、ペプチド合成に通常用いら
れる方法である液相法または固相法で、ペプチド結合の
任意の位置で二分される２種のフラグメントの一方に相
当する反応性カルボキシル基を有する原料と、他方のフ
ラグメントに相当する反応性アミノ基を有する原料と
を、２-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyl
uronium hexafluorophosphate(ＨＢＴＵ）等の活性エス
テルを用いた方法や、カルボジイミドを用いた方法等を
用いて縮合させることができる。生成する縮合物が保護
基を有する場合、その保護基を除去することによっても
製造し得る。

【０００７】この反応工程において反応に関与すべきで
ない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保
護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｂ
ｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ），ｐ−ビ
フェニルイソプロピロオキシカルボニル、９ーフルオレ
ニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等が挙げられ
る。カルボキシル基の保護剤としては例えばアルキルエ
ステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が挙げられ
るが、固相法の場合は、Ｃ末端のカルボキシル基はクロ
ロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹
脂、Ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に
結合している。縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤
の存在下にあるいはＮ−保護アミノ酸活性エステルまた
はペプチド活性エステルを用いて実施する。

【０００８】縮合反応終了後、保護基は除去されるが、
固相法の場合はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合
を切断する。更に、本発明のペプチドは通常の方法に従
い精製される。例えばイオン交換クロマトグラフィー、
逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー等が挙げられる。合成したペプチドの合成は
エドマン分解法でＣ−末端からアミノ酸配列を読み取る
プロティンシークエンサー、ＧＣ−ＭＳ等で分析され
る。

【０００９】次に医薬品として用いる場合について説明
する。本発明で使用するペプチドの投与経路としては、
経口投与、非経口投与、直腸内投与のいずれでもよい。
本発明の降圧剤は、経口的あるいは非経口的に投与する
ことが可能である。本ペプチドの投与量は化合物の種
類、投与方法、患者の症状、年齢等により異なるが、１
日あたり通常は０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋ
ｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇであ
る。本発明のペプチドは通常、製剤用担体と混合して調
製した製剤の形で投与される。製剤用担体としては、製
剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応
しない物質が用いられる。

【００１０】具体的には、その様な物質の例として乳
糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキ
ストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグ
ネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチル
セルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、
カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹
脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒド
ロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチル
セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコ
ール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タ
ルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタ
ン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウ
ム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノ
リン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴー
ル、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フ
ルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレング
ルコール、水等が挙げられる。

【００１１】剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒
剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム
剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。
これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤
にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解または
懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の
方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本
発明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に
応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させても
よく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。

【００１２】これらの製剤は、本発明のペプチドを０．
０１％〜１００重量％、好ましくは１〜９０重量％の割
合で含有することができる。これらの製剤はまた、治療
上価値のある他の成分を含有していてもよい。

【００１３】経口投与用の固形製剤を製造するには、有
効成分と賦形剤成分例えば乳糖、澱粉、結晶セルロー
ス、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などと混合して散剤と
するか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピル
セルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カル
ボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース
カルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式又は乾式造粒
して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤
及び顆粒剤をそのまま或いはステアリン酸マグネシウ
ム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これ
らの顆粒又は錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロー
スフタレート、メタクリル酸−メタクリル酸メチルポリ
マーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいは
エチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆
して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤
を製造するには、散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填す
るか、有効成分をそのまま或いはグリセリン、ポリエチ
レングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後
ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。

【００１４】経口投与用の液状製剤を製造するには、有
効成分と白糖、ソルビトール、グリセリンなどの甘味剤
とを水に溶解して透明なシロップ剤、更に精油、エタノ
ールなどを加えてエリキシル剤とするか、アラビアゴ
ム、トラガント、ポリソルベート８０、カルボキシメチ
ルセルロースナトリウムなどを加えて乳剤又は懸濁剤と
してもよい。これらの液状製剤には所望により矯味剤、
着色剤、保存剤などを加えてもよい。

【００１５】注射剤を製造するには、有効成分を必要に
応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウ
ム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム
などのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ぶどう糖などの等
張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアン
プルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、
シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾
燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成
分にレチシン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレ
ン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用
乳剤とすることもできる。

【００１６】直腸投与剤を製造するには、有効成分をカ
カオ脂、脂肪酸のトリ、ジ及びモノグリセリド、ポリエ
チレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解
し型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレン
グリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜で被
覆すればよい。

【００１７】皮膚用外用剤を製造するには、有効成分を
白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレ
ングリコールなどに加えて必要ならば加湿して練合し軟
膏剤とするか、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重
合体などの粘着剤と練合した後ポリアルキルなどの不織
布に展延してテープ剤とする。

【００１８】

【実施例】次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明
する。 （ペプチドの合成）市販のＦｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）
−Ｗａｎｇ樹脂（置換率０．５０ｍｅｑ／ｇ）０．６０
ｇをＰＳ３型ペプチド合成機（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）の反応槽に分取し、以下のよ
うに合成を行った。まず、上記の樹脂を反応容器に入れ
て、１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｐｒｏと、活性化剤とし
て、１ｍｍｏｌのＨＢＴＵを１０ｍｌの０．４Ｍ Ｎ−
メチルモルフォリンを含むジメチルフォルムアミドに溶
解したものを反応槽に加え、室温にて２０分攪拌反応さ
せた。

【００１９】得られた樹脂を２０重量％ピペリジンを含
むジメチルフォルムアミド２０ｍｌ中で、Ｆｍｏｃ基を
除去し、ついで上記のＦｍｏｃ−Ｐｒｏをカップリング
させた方法と同様にＣ末端から順次Ｆｍｏｃ−アミノ酸
をカップルさせて、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ
−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−樹脂
を得た。該樹脂を１０ｍｌの脱保護液（８２容量％トリ
フルオロ酢酸、５容量％チオアニソール、３容量％エタ
ンジオール、２容量％エチルメチルスルフィド、３容量
％フェノール、５容量％水）中で室温にて４時間攪拌
し、ペプチドを樹脂から遊離させた。

【００２０】ここに４０ｍｌの冷エーテルを添加し、ペ
プチドを沈殿させ、さらに冷エーテルにて３回洗浄し粗
ペプチドを得た。これをＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉ
ｌ５Ｃ₁₈−ＡＲ，２０×２５０ｍｍ）による逆相クロマ
トグラフィーにより０．１重量％トリフルオロ酢酸を含
むアセトニトリルの直線的濃度勾配にて展開、精製し、
Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐを得
た。本品をプロテインシーケンサー（アプライド バイ
オシステムズ社製４７７Ａ型）により分析した結果、上
記の組成であることが判明した。尚、同様の方法で、Ａ
ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ及びＡ
ｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐを得
た。

【００２１】（血圧変動の測定）１５〜２０週令の自然
高血圧ラットに、卵黄でエマルジョン化したペプチドを
ゾンデ針を使用して強制経口投与した。そして尾静脈部
の血圧をｔａｉｌ−ｃｕｆｆ法により経時的に測定し
た。無麻酔下血圧測定方法の概略を示す図を、図１に示
す。また、本発明のペプチドを高血圧ラットに、０．３
ｍｇ／ｋｇと０．１ｍｇ／ｋｇの用量で投与した場合の
血圧降下作用を表１に示す。尚、表１の値は、経口投与
４時間後の値である（ｎ＝５）。比較として、ｏｖｏｋ
ｉｎｉｎＩＩＩ及び既知ペプチドであるＡｒｇ−Ｐｒｏ
−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ（特開２０００−１
４３６９５号）を投与した結果を表１に併せて記載す
る。

【００２２】

【表１】

【００２３】この結果、本発明の新規ペプチド（Ａｒｇ
−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ、Ｘ＝Ｈｉｓ、
Ｌｙｓ又はＡｒｇ）は、自然発症高血圧ラット（ＳＨ
Ｒ）に対して０．３〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与
を行うことにより、１０〜１５ｍｍＨｇの血圧降下作用
をもたらした。この結果は、本発明の新規ペプチドを用
いることにより、ｏｖｏｋｉｎｉｎＩＩＩと比べて数十
分の１から１００の１の用量で、また既知のＡｒｇ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅと比べて約１／
３の用量で、同等の降圧効果が得られたことを示すもの
である。

【００２４】

【発明の効果】本発明により、既知の機能性ペプチドよ
り更に強力な降圧作用を有し、経口投与が可能な新規ペ
プチド（Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｔｒ
ｐ、Ｘ＝Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇ）が与えられた。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｘ−Ｐｒｏ−
   Ｔｒｐ（Ｘは、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ又はＡｒｇ）で表され
   る、新規ペプチド。
2. 【請求項２】 血圧降下作用を有する、請求項１記載の
   ペプチド。
3. 【請求項３】 請求項１記載のペプチドを有効成分とし
   て含有することを特徴とする、血圧降下剤。