JP2005325066A - 学習記憶増強剤、学習記憶を増強させる方法 - Google Patents

Abstract

【課題】アルツハイマー病等による記憶・学習障害の改善に有効な、学習記憶の増強作用を有する物質を得ることが本発明の課題である。
【解決手段】Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇは学習記憶の増強作用を有している。よって本発明により学習記憶増強剤として有用な機能性ペプチド、および上記ペプチドを用いて学習記憶を増強させる方法が与えられた。本発明のペプチドはアミノ酸残基が短く、かつ大豆由来であって特殊なアミノ酸も含まれていないから安価に調製することができ、安全性が高い素材であるという利点も有する。
【選択図】図１

Description

本発明は、学習記憶増強剤として有用な機能性ペプチドに関する。更に本発明は、上記ペプチドを用いて学習記憶を増強させる方法に関する。

社会の高齢化に伴い、アルツハイマー性の記憶・学習障害の患者は今後30〜40年の間に３倍に達すると言われている。そこで、その様な疾患を治療ないし予防するための手段が求められている。そのような状況の下で、学習記憶機能を増強する機能性ペプチドについてこれまでにいくつかの特許出願が行われている（特開平９−１２５９７号公報、特開平９−２２７５９０号公報）。

しかし特開平９−１２５９７号公報に係るペプチドは酸性線維芽細胞増殖因子の１−２９アミノ酸残基フラグメントの１６位アミノ酸システインが他のアミノ酸で置換されたペプチドフラグメントであり、アミノ酸残基数が長い。更に特開平９−２２７５９０号公報に係るペプチドは、Xaa−Tyr−Tyr−Pro−Thr（式中XaaはD-AlaまたはD-Ser）で表されるペプチド、D-Ala−Tyr−Tyr−Pro−Thrで表されるペプチド、及びD-Ala−Tyr−Tyr−Proで表されるペプチドであり、アミノ酸がＤ体であることが必要である。そこでこれらのペプチドには、合成が困難であり、また高価であるという問題点があった。

更に他の関連する知見として本発明者らは、内因性の摂食調節ペプチドであるエンテロスタチン（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）およびそのフラグメントがスコポラミンにより誘導された健忘症の予防・改善と血清コレステロール低下に有効である事を見出し、その知見について特許出願を行っている（特開２００２−８０３９３号公報）。

ところで、上記のエンテロスタチンの他に、大豆蛋白質が血清コレステロール降下作用を有することが知られている。そこで本発明者らは食品蛋白質の消化物に由来するペプチドの生理活性を検討したところ、いくつかのペプチドが補体Ｃ３ａレセプターを介して作用することを見出した。そのような検討の中で、米蛋白質に含まれる機能性ペプチドであるオリザテンシン（Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）を基にして設計したＣ３ａ低分子アゴニストＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇは、コレステロール低下作用を有することが見出された。そして、このペプチドと１残基のみ異なり、大豆グリシニンＡ５Ａ４Ｂ３サブユニットに存在するペプチドであるＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇも、コレステロール低下作用を有しており、更には中性脂肪低下作用及び摂食抑制作用を有することが報告されている（吉川正明ら、大豆たん白研究Ｖｏｌ２，１９９９年 １２５−１２８頁）。

特開平９−１２５９７号公報 特開平９−２２７５９０号公報 特開２００２−８０３９３号公報 吉川正明ら、大豆たん白研究Ｖｏｌ２，１９９９年 １２５−１２８頁

学習記憶機能を増強するペプチドについて、特開平９−１２５９７号公報、特開平９−２２７５９０号公報及び特開２００２−８０３９３号公報などの知見があるにも関わらず、アルツハイマー性あるいは非アルツハイマー性の記憶・学習障害の病態やその発現態様には個人差が大きい事を考えると、かかる病態を改善することができる活性を有する物質が更に求められている。また、老人性疾患に有効な物質は長期間服用することが必要であることを考えると、かかる物質は安全性が高く且つ経口投与が可能であることが望ましい。よって、そのような利点を有する学習記憶機能増強ペプチドを提供することが本発明の課題である。

そこで本発明者らは、大豆グリシニンＡ５Ａ４Ｂ３サブユニットに存在し、血清コレステロールを低下させる機能を有する上記のペプチドＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＬＰＹＰＲ）に注目し、そのペプチドが脳の機能に及ぼす影響を検討した。その結果、ＬＰＹＰＲで表されるペプチドは学習記憶の増強に有効であることが見出された。当該ペプチドは、学習記憶の増強作用と血清コレステロール低下作用を併せ持つために、高齢化社会において上記のペプチドの有用性は非常に大きいと考えられる。

よって本発明は、ＬＰＹＰＲで表されるペプチドを有効成分として含有することを特徴とする、学習記憶増強剤を提供するものである。更に本発明は、ＬＰＹＰＲで表されるペプチドを投与することにより、学習記憶を増強させる方法も提供するものである。

ＬＰＹＰＲは学習記憶の増強作用を有している。よって本発明により学習記憶増強剤として有用な機能性ペプチド、および上記ペプチドを用いて学習記憶を増強させる方法が与えられた。本発明のペプチドはアミノ酸残基が短く、かつ大豆由来であって特殊なアミノ酸も含まれていないから安価に調製することができ、安全性が高い素材であるという利点も有する。

上記で述べたように本発明は、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇで表されるペプチドを有効成分として含有することを特徴とする学習記憶増強剤と、そのペプチドを投与することにより学習記憶を増強させる方法を提供するものである。本発明のペプチドの学習記憶増強剤を用いて、医薬品、機能性食品、栄養補助食品（いわゆるサプリメント）を開発することが可能である。ここでＬｅｕはロイシン、Ｐｒｏはプロリン、Ｔｙｒはチロシン、Ａｒｇはアルギニンを示す。かかるアミノ酸はいずれもＬ−体である。

本発明のペプチドは、ペプチド合成法で取得することができる。即ち、ペプチド合成に通常用いられる方法である液相法または固相法で、ペプチド結合の任意の位置で二分される２種のフラグメントの一方に相当する反応性カルボキシル基を有する原料と、他方のフラグメントに相当する反応性アミノ基を有する原料とを、２-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate(ＨＢＴＵ)等の活性エステルを用いた方法や、カルボジイミドを用いた方法等を用いて縮合させることができる。生成する縮合物が保護基を有する場合、その保護基を除去することによっても製造し得る。

この反応工程において反応に関与すべきでない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｂｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ），ｐ−ビフェニルイソプロピロオキシカルボニル、９ーフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等が挙げられる。カルボキシル基の保護剤としては例えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が挙げられるが、固相法の場合は、Ｃ末端のカルボキシル基はクロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、Ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在下にあるいはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたはペプチド活性エステルを用いて実施する。

縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断する。更に、本発明のペプチドは通常の方法に従い精製される。例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。
合成したペプチドの合成はエドマン分解法でＣ−末端からアミノ酸配列を読み取るプロティンシークエンサー、ＧＣ−ＭＳ等で分析される。

次に医薬品として用いる場合について説明する。本発明で使用するペプチドの投与経路としては、経口投与、非経口投与、直腸内投与のいずれでもよい。本発明の抗脱毛症剤は、経口的あるいは非経口的に投与することが可能である。本ペプチドの投与量は化合物の種類、投与方法、患者の症状、年齢等により異なるが、１日あたり通常は０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇである。本発明のペプチドは通常、製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用いられる。

具体的には、その様な物質の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。

剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解または懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。

これらの製剤は、本発明のペプチドを０．０１％〜１００重量％、好ましくは１〜９０重量％の割合で含有することができる。これらの製剤はまた、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。

経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分例えば乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式又は乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤及び顆粒剤をそのまま或いはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒又は錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸−メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま或いはグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。

経口投与用の液状製剤を製造するには、有効成分と白糖、ソルビトール、グリセリンなどの甘味剤とを水に溶解して透明なシロップ剤、更に精油、エタノールなどを加えてエリキシル剤とするか、アラビアゴム、トラガント、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを加えて乳剤又は懸濁剤としてもよい。これらの液状製剤には所望により矯味剤、着色剤、保存剤などを加えてもよい。

注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ぶどう糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。

直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジ及びモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜で被覆すればよい。

皮膚用外用剤を製造するには、有効成分を白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコールなどに加えて必要ならば加湿して練合し軟膏剤とするか、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体などの粘着剤と練合した後ポリアルキルなどの不織布に展延してテープ剤とする。

更に本発明の学習記憶増強剤を、機能性食品や栄養補助食品（いわゆるサプリメント）の形で投与することも本発明の一態様である。本発明の学習記憶増強剤を一般に飲食されている物や調味料などの中に配合することが可能であり、そのような飲食物は通常の方法で製造されるものであって特に限定されるものではない。

次に実例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。しかし下記の実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

（ペプチドの合成）
市販のＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｗａｎｇ樹脂（置換率０．５０ｍｅｑ／ｇ）０．６０ｇをＰＳ３型ペプチド合成機（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）の反応槽に分取し、新規ペプチドについて以下のように合成を行った。

まず、上記の樹脂を反応容器に入れて、１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｐｒｏと、活性化剤として、１ｍｍｏｌのＨＢＴＵを１０ｍｌの０．４Ｍ Ｎ−メチルモルフォリンを含むジメチルフォルムアミドに溶解したものを反応槽に加え、室温にて２０分攪拌反応させた。

得られた樹脂を２０重量％ピペリジンを含むジメチルフォルムアミド２０ｍｌ中で、Ｆｍｏｃ基を除去し、ついで上記のＦｍｏｃ−Ｐｒｏをカップリングさせた方法と同様にＣ末端から順次Ｆｍｏｃ−アミノ酸をカップルさせて、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ（ｏＢｚｌ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−樹脂を得た。該樹脂を１０ｍｌの脱保護液（８２容量％トリフルオロ酢酸、５容量％チオアニソール、３容量％エタンジオール、２容量％エチルメチルスルフィド、３容量％フェノール、５容量％水）中で室温にて４時間攪拌し、ペプチドを樹脂から遊離させた。

ここに４０ｍｌの冷エーテルを添加し、ペプチドを沈殿させ、さらに冷エーテルにて３回洗浄し粗ペプチドを得た。これをＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ ５Ｃ₁₈−ＡＲ，２０×２５０ｍｍ）による逆相クロマトグラフィーにより０．１重量％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配にて展開、精製し、Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを得た。本品をプロテインシーケンサー（アプライド バイオシステムズ社製４９２Ａ型）により分析した結果、上記の組成であることが判明した。

（学習促進作用）
学習能に対するペプチドの効果を、ステップスル−装置を用いた受動的回避実験により検討した。ｄｄｙマウス（オス、体重２４±２ｇ）を明暗２室に分かれた装置の明室に入れると、マウスは暗いところを好むことから暗室に入る。暗室に入ると床から電気ショック（２８−２９Ｖ、５ｓｅｃ ｄｕｒａｔｉｏｎ）を与えて、暗室が危険なことを教育する（訓練試行）。訓練試行直後に本発明のペプチド（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ：ＬＰＹＰＲ）を２０または１０ｎｍｏｌ／マウスの用量で側脳質内投与、あるいは１００または３０ｍｇ／ｋｇの用量で経口投与し、２４時間後にテスト試行を行った。即ちマウスを再び同じ装置に入れ、明暗に止まっている時間を測定することにより、本発明のペプチドの有無におけるマウスの学習能を比較した。

ＬＰＹＰＲを側脳質内投与（１０ｎｍｏｌ／マウス、２０ｎｍｏｌ／マウス）することによる影響を検討した（図１）。即ち、ケージの明室へ入れられたマウスが暗室へ移動するまでの時間（ｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｌａｔｅｎｃｙ：ｓｅｃ）を指標として、上記ペプチドの学習促進作用を検討した結果を図１に示す。マウスは暗室へ移動する性質を有しているが、学習により暗室が危険である事を記憶していると明室に留まるので、マウスが学習した場合にはｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈｌａｔｅｎｃｙが長くなる。

図１の結果より、ＬＰＹＰＲを投与することによりｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｌａｔｅｎｃｙは延長され、よって本発明のペプチドを投与することによりマウスの学習能が増強されていることが示された。図１においてｎ＝１２であり、６００秒を本実験におけるカットオフ値とした。マン アンド ホイットニ−（Ｍａｎｎ ａｎｄ Ｗｈｉｔｎｅｙ）法によりＵ検定を行ったところ、コントロール群の中央値（カラムで示された値）は２７６であり、１／４値は１１０．５であり、３／４値は５１８であった。またＬＰＹＰＲ１０ｎｍｏｌを側脳質内投与した群の中央値は５５９．５であり、１／４値は３６９．７５であり、３／４値は６００であった。またＬＰＹＰＲ２０ｎｍｏｌを側脳質内投与した群の中央値は６００であり、１／４値は３７６．５であり、３／４値は６００であった。

ここで中央値とは、ｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｌａｔｅｎｃｙの数値（秒）を数値の大きさの順番に従って並べた時に、中央に位置する値である。また１／４値は数値の順番において低い方から１／４の順位に相当する値であり、また３／４値は数値の順番において低い方から３／４の順位に相当する値である。ＬＰＹＰＲを１０ｎｍｏｌ投与した群においても、２０ｎｍｏｌ投与した群においてもＰ値は０．０５以下であり、コントロール群と比較して両群とも５％の危険率で有意差が認められた（Ｐ＜０．０５）。

更に、ＬＰＹＰＲを経口投与（３０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ）することによる影響を検討した（図２）。図２の結果においても、ＬＰＹＰＲを投与群においてｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｌａｔｅｎｃｙは延長され、本発明のペプチドを投与することによりマウスの学習能が増強されていることが示された。図２においてｎ＝１７であり、６００秒を本実験におけるカットオフ値とした。マン アンド ホイットニ−（Ｍａｎｎ ａｎｄ Ｗｈｉｔｎｅｙ）法によりＵ検定を行ったところ、コントロール群の中央値（カラムで示された値）は２９２であり、１／４値は６３であり、３／４値は５１７．５であった。またＬＰＹＰＲを３０ｍｇ／ｋｇ経口投与した群の中央値は５１８．５であり、１／４値は２１６であり、３／４値は６００であった。またＬＰＹＰＲを１００ｍｇ／ｋｇ経口投与した群の中央値は６００、１／４値は２３６であり、３／４値は６００であった。ＬＰＹＰＲを３０ｍｇ／ｋｇ投与した群においても、１００ｍｇ／ｋｇ投与した群においてもＰ値は０．０５以下であり、コントロール群と比較して両群とも５％の危険率で有意差が認められた（Ｐ＜０．０５）。

既に述べたように、内因性摂食調節ペプチドであるエンテロスタチン（Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ：ＶＰＤＰＲ）はコレステロール低下作用と抗健忘作用を有するが、正常マウスに対して学習促進作用は示さない。エンテロスタチンと本発明のペプチドであるＬＰＹＰＲは一部類似しているが、ＬＰＹＰＲにおいては摂食抑制作用と抗鎮痛作用は認められなかった。よってエンテロスタチンと本発明のＬＰＹＰＲは異なったメカニズムで作用していると考えられる。

ＬＰＹＰＲは学習記憶の増強作用を有している。本発明のペプチドはアミノ酸残基が短く、かつ大豆由来であって特殊なアミノ酸も含まれていないから安価に調製することができ、安全性が高い素材であるという利点も有する。よって本発明のペプチドは、医薬品、機能性食品、サプリメントとして利用される大きな可能性を有するものである。

図１は、本発明のペプチドを脳室内投与することによるｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｌａｔｅｎｃｙの変化を示したグラフである。 図２は、本発明のペプチドを経口投与することによるｓｔｅｐ−ｔｈｒｏｕｇｈ ｌａｔｅｎｃｙの変化を示したグラフである。

Claims (5)

1. Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇで表されるペプチドを有効成分として含有することを特徴とする、学習記憶増強剤。
2. 請求項1記載の学習記憶増強剤を有効成分として含有する医薬品。
3. 請求項１記載の学習記憶増強剤を有効成分として含有する機能性食品。
4. 請求項１記載の学習記憶増強剤を有効成分として含有する栄養補助食品。
5. Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇで表されるペプチドを投与することにより、学習記憶を増強させる方法。

Images