JP5622593B2

JP5622593B2 - ペプチドを含む医薬または食品

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Publication number: JP5622593B2
Application number: JP2010548585A
Authority: JP
Inventors: 耕作大日向; 典正金川
Original assignee: Kyoto University
Current assignee: Kyoto University
Priority date: 2009-02-02
Filing date: 2010-02-01
Publication date: 2014-11-12
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Description

本発明は神経系に作用する医薬ないし医薬組成物に関する。また、本発明は、ペプチドまたはその類縁体に関し、詳しくは５−ＨＴ_１Ａ受容体、Ｄ_１受容体およびＧＡＢＡ_Ａ受容体の少なくとも1種を活性化するペプチドまたはその類縁体に関する。さらに本発明は、抗不安または睡眠改善用食品に関する。

現代のストレス社会を反映し、不安障害、統合失調症、うつ病などの精神疾患の増加が問題となっている。不安感は、生体において危険を回避するための警告として本来必要なものであるが、過剰な不安感は上記精神疾患の発症や症状の進行に関与するとともに、生活習慣病の発症リスクを上昇させることが知られており、精神的ストレスを緩和する食品や医薬品の開発が期待されている。このような抗不安作用を有する化合物は、安価に製造が可能で、経口投与で有効なものが望ましい。

ジペプチドは、合成も比較的簡単であり、食品タンパク質の酵素消化によっても大量に生産することができる。実際に、血圧降下作用を有するＡＣＥ阻害ペプチドや高甘味度甘味料であるアスパルテームが食品として実用化されている。しかしながら、抗不安作用を示すジペプチドの報告はない。生理活性を示すオリゴペプチドとしては鎮痛作用を有するオピオイドペプチドが知られている。さらに、ダイズの主要タンパク質であるβ-コングリシニンに由来するsoymorphinが抗不安作用を有することを明らかにしている(特許文献１)。

特開2007-91656

本発明者は、副作用がほとんど或いは全くない抗不安、鎮静、睡眠改善などの作用を有する薬剤及び食品を提供することを目的とする。

そこで上記課題を解決するべく、各種のペプチドの抗不安作用を調べていたところ、Ｔｙｒ−Ｌｅｕ、Ｐｈｅ−Ｌｅｕ、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ、Ｈｉｓ−Ｌｅｕ、Ｉｌｅ−Ｔｙｒ、Ｌｅｕ−Ｔｒｐ、などの特定の短鎖ペプチドが強力な抗不安、鎮静などの作用、５−ＨＴ_１Ａ受容体、Ｄ_１受容体およびＧＡＢＡ_Ａ受容体からなる群から選ばれる少なくとも1種の受容体を活性化する作用を有することを見出し、本発明を完成した。

本発明は、以下の医薬、抗不安または睡眠改善用食品、不安軽減または睡眠改善方法を提供するものである。
項１． Tyr(以下、Yと略すこともある)、Phe(以下、Fと略すときもある)、Trp(以下、Wと略すときもある) あるいはHis(以下、Hと略すときもある)と疎水性アミノ酸が隣接しているペプチドまたはその類縁体を有効成分とする医薬ないし医薬組成物。
項２． TyrあるいはPheと疎水性アミノ酸が隣接しているペプチドまたはその類縁体を有効成分とする項１に記載の医薬ないし医薬組成物。
項３．ＹＬ、ＦＬ、ＷＬ、ＨＬ、ＹＩ、ＦＩ、ＹＶ、ＬＹ、ＬＦ、ＬＷ、ＩＹ、ＩＦ、(Y/F/W/H)Ｌ(Y/F/W)，(Y/F/W/H)ＬＱ、Ｌ(Y/F/W)Ｌまたは(Y/F/W/H)Ｌ(Y/F/W)ＥＩＡＲ（但し、LはLeu、IはIle、VはVal、QはGln、EはGlu、AはAla、RはArgを表し、(Y/F/W/H)は、Ｈ、Ｗ、ＹまたはＦを表し、(Y/F/W)は、Ｗ、ＦまたはＹを表す。以下同じ。）を有効成分とする項１に記載の医薬ないし医薬組成物。
項４．ＹＬ、ＦＬ、ＷＬ、ＨＬ、ＹＩ、ＦＩ、ＦＶ、ＬＹ、ＬＦ、ＬＷ、ＩＹ、ＩＦ、ＹＬＹ、ＹＬＱ、ＬＹＬまたはＹＬＹＥＩＡＲを有効成分とする項３に記載の医薬ないし医薬組成物。
項５．抗不安剤、睡眠導入剤、睡眠改善剤、統合失調症治療薬または抗うつ薬である、項１〜４のいずれかに記載の医薬ないし医薬組成物。
項６． Tyr、Phe、TrpあるいはHisと疎水性アミノ酸が隣接しているペプチドまたはその類縁体を添加することを特徴とする、抗不安または睡眠改善用食品。
項７． TyrあるいはPheと疎水性アミノ酸が隣接しているペプチドまたはその類縁体を添加することを特徴とする、項６に記載の抗不安または睡眠改善用食品。
項８．ＹＬ、ＦＬ、ＷＬ、ＨＬ、ＹＩ、ＦＩ、ＹＶ、ＬＹ、ＬＦ、ＬＷ、ＩＹ、ＩＦ、(Y/F/W/H)Ｌ(Y/F/W)，(Y/F/W/H)ＬＱ、Ｌ(Y/F/W)Ｌまたは(Y/F/W/H)Ｌ(Y/F/W)ＥＩＡＲを添加することを特徴とする、項６に記載の抗不安または睡眠改善用食品。
項９．ＹＬ、ＦＬ、ＷＬ、ＨＬ、ＹＩ、ＦＩ、ＦＶ、ＬＹ、ＬＦ、ＬＷ、ＩＹ、ＩＦ、ＹＬＹ、ＹＬＱ、ＬＹＬまたはＹＬＹＥＩＡＲを添加することを特徴とする、項８に記載の抗不安または睡眠改善用食品。
項１０． Tyr、Phe、TrpあるいはHisと疎水性アミノ酸が隣接しているペプチドまたはその類縁体を必要とする対象に有効量投与することを特徴とする、不安軽減または睡眠改善方法。

本発明のペプチドまたはその類縁体を有効成分とする抗不安薬、睡眠障害治療薬、統合失調症治療薬、抗うつ薬、或いはこれら疾患の予防薬は、副作用が低く長期の服用に適したものである。

また、本発明の薬剤は経口投与で有効である。

さらに、天然の短鎖ペプチドは食品として摂取することも可能であり、疾患には至らないが、不安傾向や睡眠に問題を有する個体が食品として摂取することで、疾患を予防することが期待できる。

本発明のペプチドまたはその類縁体は、５−ＨＴ_１Ａ受容体、Ｄ_１受容体およびＧＡＢＡ_Ａ受容体からなる群から選ばれる少なくとも1種の受容体を活性化する作用を有し、これらの受容体活性化作用に基づく各種疾患の予防ないし治療作用を有することが期待される。

さらに、オピオイド受容体作動薬の活性化に基づく副作用は問題にならない。

高架式十字迷路ＹＬの腹腔内投与による抗不安作用（実施例１）ＹＬの経口投与による抗不安作用（実施例１）ＦＬの腹腔内投与による抗不安作用（実施例２）ＹＩの腹腔内投与による抗不安作用（実施例３）ＦＩの腹腔内投与による抗不安作用（実施例４）ＬＹの腹腔内投与による抗不安作用（実施例５）ＬＦの腹腔内投与による抗不安作用（実施例６）ＩＹの腹腔内投与による抗不安作用（実施例７）ＩＦの腹腔内投与による抗不安作用（実施例８）ＹＬＹの腹腔内投与による抗不安作用（実施例９）ＹＬＱの腹腔内投与による抗不安作用（実施例１０）ＬＹＬの腹腔内投与による抗不安作用（実施例１１）ＹＬＹＥＩＡＲの腹腔内投与による抗不安作用（実施例１２）ＹおよびＹ＆Ｌの腹腔内投与による抗不安作用（比較例１、２）ＹＬの抗不安作用に及ぼす５ＨＴ_１Ａ受容体アンタゴニストの影響ＹＬの抗不安作用に及ぼすドーパミンＤ_１受容体アンタゴニストの影響ＹＬの抗不安作用に及ぼすＧＡＢＡ_Ａ受容体アンタゴニストの影響ＹＬの抗不安作用に及ぼすベンゾジアゼピンサイトアンタゴニストの影響ＹＬの抗不安作用に及ぼすμオピオイド受容体アンタゴニストの影響ＹＬの抗不安作用に及ぼすδオピオイド受容体およびs_１受容体に対するアンタゴニストの影響ＹＬの抗不安作用に及ぼすシクロオキシゲナーゼ阻害剤の影響ＹＶの腹腔内投与による抗不安作用（実施例１３）ＷＬの腹腔内投与による抗不安作用（実施例１４）ＬＷの腹腔内投与による抗不安作用（実施例１５）ＷＬおよびＬＷの経口投与による抗不安作用（実施例１４、１５）ＨＬの腹腔内投与による抗不安作用（実施例１６）ＹＬとジアゼパムの抗不安作用の比較（比較例３）ＹＬの推定抗不安機構

薬理作用
本発明において、抗不安作用は、抗不安薬をスクリーニングするための不安関連行動評価法として開発され，広く用いられている高架式十字迷路試験により評価することができる（図１）。具体的には抗不安薬の候補物質を経口投与または腹腔内投与し、３０分後に高架式十字迷路にマウスを置いて、オープンアームに侵入した回数とオープンアーム上での滞在時間の変化を指標として、抗不安作用の強さを評価することができる。

本発明のペプチドの抗不安作用は５−ＨＴ_１Ａ受容体アンタゴニストであるWAY100135によって阻害されるが、５−ＨＴ_１Ａ受容体に親和性を示さないことから、本発明のペプチドの抗不安作用は５−ＨＴ_１Ａ受容体の活性化を介した作用（５−ＨＴ_１Ａ受容体アゴニストまたは部分アゴニストと同様の作用を有する）であることが明らかになった。おそらく内因性のセロトニン遊離が促進されているものと考えられる。本発明のペプチドは、５−ＨＴ_１Ａ受容体の活性化に基づきうつ病、統合失調症などの予防ないし治療作用、記憶改善作用などがあると推定され、本発明の医薬ないし医薬組成物は、５−ＨＴ_１Ａ受容体作動薬、うつ病の予防ないし治療薬、統合失調症の予防ないし治療薬、記憶改善剤、抗不安剤、睡眠改善剤などとしても有用であり得る。

本発明ペプチドの抗不安作用は、ドーパミンＤ_１受容体アンタゴニストであるSCH23390で阻害されたが、ドーパミンＤ_１受容体に親和性を示さないことから、ドーパミンＤ_１受容体の活性化を介する作用（Ｄ_１受容体のアゴニストまたは部分アゴニストと同様の作用を有する）であることが明らかになった。おそらく内因性ドーパミンの遊離が促進されているものと考えられる。空間認知機能がドーパミンＤ_１受容体を介すること、また、精神分裂病においてＤ_１受容体の機能が低下していることから、認知症や精神分裂病などの疾患の予防ないし治療作用が期待できる。

本発明ペプチドの抗不安作用は、ＧＡＢＡ_Ａ受容体アンタゴニスト(bicuculline)で阻害されたこと、ならびにＧＡＢＡ_Ａ受容体に親和性を示さないことから、ＧＡＢＡ_Ａ受容体を介する作用（ＧＡＢＡ_Ａ受容体のアゴニストまたは部分アゴニストと同様の作用を有する）であることが明らかになった。おそらく内因性ＧＡＢＡの遊離が促進されているものと考えられる。また、本発明ペプチドの抗不安作用は、ベンゾジアゼピン受容体アンタゴニストflumazenilによって有意に阻害されたことから、抗不安作用は、ＧＡＢＡ_Ａ受容体のベンゾジアゼピンサイトを部分的に介していることが明らかになった。ＧＡＢＡ_Ａ受容体は、睡眠誘発作用を有することが知られているので、本発明のペプチドまたはその類縁体は、抗不安作用だけでなく睡眠誘発作用を有すると考えられ、睡眠導入剤としても有用である。特にＬＦは、運動量の低下が観察され、睡眠導入剤として有用である。

これまでダイズの主要タンパク質であるβ-コングリシニン由来のμオピオイドペプチドのsoymorphinがμオピオイド受容体を介して抗不安作用を示すことを本発明者らは見出しているが（特許文献１）、本発明のペプチドの抗不安作用は、μオピオイド受容体アンタゴニストであるnaloxoneによって阻害されなかったことから、本発明のペプチドの抗不安作用は、特許文献１のペプチドと異なりμオピオイド受容体を介していないことが明らかになった。

緑葉の主要タンパク質Rubisco由来のδオピオイドrubiscolinは、δオピオイド受容体に直接作用した後、σ_１受容体を活性化して抗不安作用を示すことが公知である。本発明のペプチドの抗不安作用は、δオピオイド受容体アンタゴニストであるnaltrindoleによって阻害されなかったことから、本発明のペプチドの抗不安作用は、δオピオイド受容体を介していないことが明らかになった。本発明のペプチドの抗不安作用は、σ_１受容体アンタゴニストであるBMY14802によって阻害されなかったことから、本発明のペプチドの抗不安作用は、σ_１受容体を介していないことが明らかになった。

Rubisco由来のもう一つの抗不安ペプチドMRW（rubimetide）は、プロスタグランジンＤ_２の放出促進および、２種類のＰＧＤ_２受容体のうちＤＰ_１受容体の活性化を介して抗不安作用を示す。本発明のペプチドの抗不安作用は、シクロオキシゲナーゼ阻害剤であるindomethacinによって阻害されなかったことから、本発明のペプチドの抗不安作用は、プロスタグランジン類とは関係しないことが明らかになった。したがって、本発明のペプチドは従来の抗不安ペプチドとは全く異なる作用機構を介しているものと考えられる。

本発明の好ましい有効成分は経口投与で有効であるのが確認されている。

有効成分
本発明の抗不安剤の有効成分は、ペプチドないしその類縁体である。

ペプチドとしては、Ｙ(Tyr)、Ｆ(Phe)、Ｗ (Trp)あるいはＨ (His)、好ましくは、Ｙ(Tyr)、Ｆ(Phe)あるいはＷ (Trp)、より好ましくはＹ(Tyr)あるいはＷ (Trp)を有する２〜８個、好ましくは２〜７個、より好ましくは２〜６個、さらに好ましくは２〜５個、特に好ましくは２〜４個、最も好ましくは２〜３個のアミノ酸からなるペプチドである。

ペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ体のアミノ酸、Ｄ体のアミノ酸或いはＤＬ体のアミノ酸（Ｄ体とＬ体が混合されたアミノ酸であればラセミ体といずれか一方のエナンチオマーが過剰なアミノ酸のいずれも含まれる）のいずれであってもよい。好ましくはＬ体のアミノ酸のみ、或いはＤ体のアミノ酸のみからなるペプチド、特にＬ体のアミノ酸のみからなるペプチドがよい。

また、本発明で使用するペプチドが２以上の不斉炭素を含む場合、各エナンチオマーないしジアステレオマー或いはこれらの任意の比率の混合物のいずれの形態であってもよい。エナンチオマーまたはジアステレオマーの分離は、通常のカラムで行ってもよく、光学活性カラムを使用したり、光学活性基を導入して誘導体の形態で光学分割した後、その光学活性基を除去する方法や、光学活性の酸または塩基との塩を形成して光学分割するなどの公知のいずれの方法を用いてもよい。

ペプチドまたはその類縁体の塩としては、酸付加塩と塩基塩が挙げられる。酸付加塩としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、過塩素酸などの無機塩、クエン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸の塩が挙げられる。塩基塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩などが挙げられる。

溶媒和物としては、水(水和物の場合)、メタノール、エタノール、イソプロパノール、酢酸、テトラヒドロフラン、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、アセトアミド、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジメトキシエタンなどの溶媒和物が挙げられる。

有効成分がペプチドの場合
本発明の好ましい実施形態において、有効成分となるペプチドを構成するアミノ酸は、少なくとも２種のアミノ酸を有する；１つはＹ（Ｔｙｒ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｗ（Ｔｒｐ）あるいはＨ（Ｈｉｓ）であり、もう１つはＬ（Ｌｅｕ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｖ（Ｖａｌ）及びノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）からなる群から選ばれるいずれかの疎水性アミノ酸である。これらの２種のアミノ酸は隣接したユニットを構成しており、ＨＬ、ＷＬ，ＹＬ、ＦＬ、ＹＶ、ＦＶ，（Ｙ／Ｆ／Ｗ／Ｈ）−ノルロイシン、（Ｙ／Ｆ／Ｗ／Ｈ）−ノルバリンのようにＨ，Ｗ、ＹまたはＦがＮ末端側にあってもよく、ＬＹ、ＬＦ，ＬＷ、ＬＨ、ＩＹ、ＩＦ、ＩＷ、ＩＨ、ＶＨ、ＶＷ、ＶＹ、ＶＦ，ノルロイシン−（Ｙ／Ｆ／Ｗ／Ｈ）、ノルバリン−（Ｙ／Ｆ／Ｗ／Ｈ）のようにＨ，Ｗ、ＹまたはＦがＣ末端側にあってもよく、これらの２種のアミノ酸ユニットのＮ末端側もしくはＣ末端側にさらに１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個または１個のアミノ酸がペプチド結合により結合してもよい。

なお、Ｙ／Ｆ／Ｗ／ＨはＹ、Ｆ、Ｗ、またはＨを示し、ＨＷ，ＨＹ，ＨＦ，ＷＨ，ＹＨ，ＦＨ、ＷＹ，ＷＦ，ＹＷ，ＦＷ，ＨＨ，ＷＷ，ＹＦ、ＦＹ、ＹＹ、ＦＦなどのＹ、Ｆ、Ｗ、Ｈから選ばれる２個以上（好ましくは２個）のアミノ酸が連結されたペプチドであってもよい。Ｙ／Ｆは、ＹまたはＦを示し、ＹＦ、ＦＹ、ＹＹ、ＦＦなどのＹとＦから選ばれる２個以上（好ましくは２個）のアミノ酸が連結されたペプチドであってもよい。

Ｈ，Ｗ，Ｙ、Ｆに代えて３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）、４−メトキシフェニルアラニン、４−メルカプトフェニルアラニンなどを使用し得る。

本発明のペプチドにおいて、Ｙ、Ｆ、ＷあるいはＨはＮ末端にあるのが好ましい。

本発明で好ましく使用できる抗不安作用を有するペプチドを以下に示す。
Ｙ−（疎水性アミノ酸）；
Ｆ−（疎水性アミノ酸）；
Ｗ−（疎水性アミノ酸）；
Ｈ−（疎水性アミノ酸）；
（疎水性アミノ酸）−Ｈ；
（疎水性アミノ酸）−Ｗ；
（疎水性アミノ酸）−Ｙ；
（疎水性アミノ酸）−Ｆ；
(Y/F/W/H)−Ｌ−（任意のアミノ酸）_ｎ；
（任意のアミノ酸）_ｎ−(Y/F/W/H)−Ｌ；
（任意のアミノ酸）_ｎ１−(Y/F/W/H)−Ｌ−（任意のアミノ酸）_ｎ２；
（疎水性アミノ酸）−(Y/F/W/H)−（疎水性アミノ酸）；
(Y/F/W/H)−（疎水性アミノ酸）−(Y/F/W/H)；
｛(Y/F/W/H)−（疎水性アミノ酸）｝_ｍ；
｛（疎水性アミノ酸）−(Y/F/W/H)｝_ｐ；
｛(Y/F/W/H)−（疎水性アミノ酸）｝_ｑ−Ｙ；
｛（疎水性アミノ酸）−(Y/F/W/H)｝_ｒ−（疎水性アミノ酸）；
（式中、疎水性アミノ酸は、同一または異なってＬ（Ｌｅｕ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｖ（Ｖａｌ）及びノルロイシン（Ｎｌｅ）及びノルバリン（Ｎｖａ）からなる群から選択され、好ましくはＬ（Ｌｅｕ）、Ｉ（Ｉｌｅ）またはＶ（Ｖａｌ）、より好ましくはＬ（Ｌｅｕ）またはＩ（Ｉｌｅ）、特にＬ（Ｌｅｕ）である。

任意のアミノ酸は、Ｌｅｕ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ａｌａ，Ｇｌｙ，Ｍｅｔ，Ｓｅｒ，Ｃｙｓ，Ｈｉｓ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｇｌｕ，Ｇｌｎ，Ｔｈｒ，Ｌｙｓ，Ｔｒｐ，Ｐｈｅ，Ａｒｇ，Ｔｙｒ，Ｐｒｏからなる２０種の天然アミノ酸と、βアラニン、サルコシン、オルニチン、ノルロイシン（Ｎｌｅ）及びノルバリン（Ｎｖａ）からなる群から選ばれるいずれかのアミノ酸である。
ｎ＝１〜６の整数、ｎ１＝１〜６の整数、ｎ２＝１〜６の整数、０≦ｎ１＋ｎ２≦６、ｍ＝２〜４の整数、ｐ＝２〜４の整数である。ｑ＝１〜３の整数、ｒ＝１〜３の整数である。）

より好ましいペプチドは、以下である。
Ｙ−（疎水性アミノ酸）；
Ｆ−（疎水性アミノ酸）；
Ｗ−（疎水性アミノ酸）；
Ｈ−（疎水性アミノ酸）；
（疎水性アミノ酸）−Ｙ；
（疎水性アミノ酸）−Ｆ；
（疎水性アミノ酸）−Ｗ；
(Y/F/W/H)−Ｌ−（任意のアミノ酸）_ｎ；
(Y/F/W/H)−（疎水性アミノ酸）−(Y/F/W/H)；
｛(Y/F/W/H)−（疎水性アミノ酸）｝_ｍ；
（式中、疎水性アミノ酸、任意のアミノ酸、(Y/F/W/H)は、前記に定義されるとおりである。）

有効成分がペプチド類縁体の場合
ペプチド類縁体には、有効成分の上記ペプチドの(1)Ｎ末端の修飾、(2)Ｃ末端の修飾、(3)チロシン残基、フェニルアラニン残基の類縁体が含まれる。
(1)ペプチドのＮ末端のアミノ基は、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、ジエチルアミノ、プロピルアミノ、ジプロピルアミノ、ｎ−ブチルアミノ、ジｎ−ブチルアミノ、などの直鎖または分岐を有する炭素数１〜４のアルキル基でモノ置換またはジ置換されたアミノ基でもよい。或いは、Ｎ末端のアミノ基または側鎖のアミノ基（Ｌｙｓを含む場合）は、ベンジル基、フェネチル基などのアラルキル基でモノ置換またはジ置換されていてもよく、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基などの炭素数１〜６の直鎖または分岐を有するアルカノイル基、ベンゾイル基などのアシル基で修飾されていてもよい。
(2)ペプチドのＣ末端のカルボキシル基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシルなどの炭素数１〜６のアルキル基とのエステル、ベンジル、フェネチルなどのアラルキル基とのエステル、アミノ基、メチルアミン、ジメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、プロピルアミン、ジプロピルアミン、ｎ−ブチルアミン、ジｎ−ブチルアミンなどの直鎖または分岐を有する炭素数１〜４のアルキル基でモノ置換またはジ置換されたアミン、またはアンモニアとのアミドを形成してもよい。
(3)チロシン残基の類縁体（I）、フェニルアラニン残基の類縁体(II)、ヒスチジン残基の類縁体（III）、トリプトファン残基の類縁体(IV)、としては、以下の式で示される残基が挙げられる：

(式中、Ｒ^１は炭素数１〜６の直鎖または分岐を有するアルキル基、アラルキル基または水素原子を示す。Ｒ^ａは、水素原子、アルカリ金属、アルカリ土類金属、メトキシメチル、２−テトラヒドロフラニル、２−テトラヒドロピラニルなどの酸性で切断可能な保護基、メチル、トリフルオロメチルのいずれかである。Ｒは同一または異なって、炭素数１〜６の直鎖または分岐を有するアルキル基（例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル）、アラルキル基(例えばベンジル又はヘキシル)、炭素数１〜６の直鎖または分岐を有するアルコキシ基（例えばメトキシ、エトキシ、ｎ−プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｔ−ブトキシ、ペントキシ、ヘキシルオキシ）、ＳＨ，炭素数１〜６の直鎖または分岐を有するアルキルチオ基（例えばメチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、イソプロピルチオ、ｎ−ブチルチオ、イソブチルチオ、ｔ−ブチルチオ、ペンチルチオ、ヘキシルチオ）、ＣＮ，ＮＯ_２，ハロゲン原子（Ｆ，Ｃｌ，Ｂｒ，Ｉ）、アミノ（ＮＨ_２）、モノまたはジ（Ｃ_１〜Ｃ_６低級アルキル）アミノ（例えばメチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、ブチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、ジプロピルアミノ、ジブチルアミノ）、アセトアミド、アセチル、トリフルオロメチル、水酸基、或いは、隣接する２つのＲもしくは隣接するＲとＯＲ^ａが一緒になって、メチレンジオキシまたはエチレンジオキシを示す。

本発明の薬剤（抗不安剤、睡眠改善剤、統合失調症治療薬または抗うつ薬）または食品の有効成分のペプチドとしては、好ましくはＹＬ、ＦＬ、ＷＬ、ＨＬ、ＹＩ、ＦＩ、ＹＶ、ＬＹ、ＬＦ、ＬＷ、ＩＹ、ＩＦ、(Y/F/W/H)Ｌ(Y/F/W)，(Y/F/W/H)ＬＱ、Ｌ(Y/F/W)Ｌまたは(Y/F/W/H)Ｌ(Y/F/W)ＥＩＡＲ、より好ましくはＹＬ、ＦＬ、ＷＬ、ＨＬ、ＹＩ、ＦＩ、ＦＶ、ＬＹ、ＬＦ、ＬＷ、ＩＹ、ＩＦ、ＹＬＹ、ＹＬＱ、ＬＹＬまたはＹＬＹＥＩＡＲなどが挙げられる。

本発明のペプチドまたはその類縁体は、ＡＣＥ阻害作用を有するものがあるが、例えばＹＬはＩＹよりもＡＣＥ阻害作用が弱いにもかかわらず、抗不安作用は強いことから、ＡＣＥ阻害作用と抗不安作用は無関係と考えられる。

本発明のペプチドは、天然のタンパク質ないしポリペプチドの加水分解により得ることもでき、化学合成により得ることもできる。加水分解されるタンパク質ないしポリペプチドとしては、牛乳または人乳由来のカゼイン、α-ラクトアルブミン、β-ラクトグロブリン、ラクトフェリン、オボアルブミン、ウシおよびブタミオシン、血清アルブミン、ダイズβ-コングリシニン、グリシニン、コムギグルテニン、コメグルテリン、緑葉Ｒｕｂｉｓｃｏ，ナタネnapin、動物および植物に広く存在することが知られているアクチン（例えば、ヒト、ダイズ、コムギなど）などが挙げられ、ほとんどの食品タンパク質中に本発明のジペプチド配列が含まれる。これらの食品素材由来のペプチドは、そのまま或いは必要に応じて濃縮、脱塩、精製等の処理を行うことにより、そのまま食品とすることができる。

タンパク質の加水分解には、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、ぺプシン、カルボキシペプチダーゼ、サーモリシン、サチライシンなどの動物、植物ないし微生物由来の加水分解酵素の使用が例示され、これらの酵素を用い、ｐＨを酵素に応じて適切な値に調製し、３０〜４０℃程度の温度下に３０分から４８時間程度反応させることにより、本発明の有効成分のペプチドを得ることができる。得られた反応液から本発明のペプチドを精製して用いてもよく、食品素材を酵素分解した場合には、そのまま或いは他の食品素材に添加して食品ないし食品組成物とすることもできる。加水分解は、強酸(例えば塩酸、硝酸、硫酸など)または強塩基(水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化リチウムなどのアルカリ金属水酸化物、炭酸ナトリウム、炭酸カリウムなどのアルカリ金属炭酸塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウムなどのアルカリ金属炭酸水素塩)などの存在下に水中で、１〜１００℃の温度で、３０分から４８時間反応させることにより、本発明の有効成分のペプチドを得ることができる。加水分解の反応生成物は、ｐＨを調製した後、そのまま使用してもよく、精製により有効成分のペプチドを分離して使用してもよい。

また本発明のペプチドは、ペプチド合成法で取得することもできる。即ち、ペプチド合成に通常用いられる方法である液相法または固相法で、反応性カルボキシル基を有する原料と、反応性アミノ基を有する原料とをＨＢＴＵ等の活性エステルを用いた方法や、カルボジイミドなどのカップリング剤を用いた方法等のペプチド合成において通常の方法により縮合させることができる。生成する縮合物が保護基を有する場合、その保護基を除去することによっても製造し得る。

この反応工程において反応に関与すべきでない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ），９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等が挙げられる。カルボキシル基の保護剤としては例えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が挙げられるが、固相法の場合は、Ｃ末端のカルボキシル基はクロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在下にあるいはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたはペプチド活性エステルを用いて実施する。

縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断する。更に、本発明のペプチドは通常の方法に従い精製される。例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。合成したペプチドの合成はエドマン分解法でＣ−末端からアミノ酸配列を読み取るプロテインシークエンサー、ＧＣ−ＭＳ等で分析される。

本発明のペプチドは、酵素法によっても合成することが可能である（WO2003/010307参照）。

本発明のペプチドの投与経路は特に限定されるものではなく、経口投与、非経口投与、直腸内投与のいずれを採用することも可能であり、経口的あるいは非経口的に投与することができる。本ペプチドの投与量は化合物の種類、投与方法、投与される者の状態や年齢等により異なるが、成人１日あたり通常は０．０１〜５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０５〜１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１〜３０ｍｇ／ｋｇである。本発明のペプチド(有効成分)は通常、製剤用担体と混合して調製した医薬組成物の形で投与される。製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用いられる。

例えば、ＹＬ、ＦＬ、ＹＬＹＥＩＡＲのように有効量の範囲が広いペプチドの場合の成人１日当たりの経口投与での投与量は、５〜５００ｍｇ程度であり、注射などの非経口投与の場合には、それよりやや少ない投与量(例えば１〜１００ｍｇ程度)とすることができる。

また、ＷＬ、ＨＬのように、有効な投与量の幅が比較的狭い場合には、成人１日当たりの経口投与での投与量は、５〜１００ｍｇ程度であって、この範囲内で最適な投与量を常法に従い決定することができる。

上記以外のペプチドの成人１日当たりの投与量は、上記のペプチドの場合を参考にして容易に決定できる。

本発明のペプチドはそれ自体食品または医薬として利用することができ、或いは単独で、もしくは適当な無毒性の経口摂取用担体、希釈剤または賦形剤とともに、タブレット（素錠、糖衣錠、発泡錠、フィルムコート錠、チュアブル錠など）、カプセル、トローチ、粉末、細粒剤、顆粒剤、液剤、懸濁液、乳濁液、ペースト、クリーム、注射剤（アミノ酸輸液、電解質輸液等の輸液に配合する場合を含む）、或いは腸溶性の錠剤、カプセル剤、顆粒剤などの徐放性製剤などの食品用もしくは医薬用の製剤にすることが可能である。食品中のペプチドの含有量は適宜選択が可能であるが一般に、０．０１〜１００重量％の範囲である。

具体的には、医薬または食品に加えることができる製剤用担体ないし経口摂取用担体、希釈剤または賦形剤のような物質の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。

剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な溶媒に溶解または懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。

これらの製剤は、本発明のペプチドを０．０１％〜１００重量％、好ましくは１〜９０重量％の割合で含有することができる。これらの製剤はまた、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。

経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分例えば乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式又は乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤及び顆粒剤をそのまま或いはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒又は錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸−メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま或いはグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。

経口投与用の液状製剤を製造するには、有効成分と白糖、ソルビトール、グリセリンなどの甘味剤とを水に溶解して透明なシロップ剤、更に精油、エタノールなどを加えてエリキシル剤とするか、アラビアゴム、トラガント、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを加えて乳剤又は懸濁剤としてもよい。これらの液状製剤には所望により矯味剤、着色剤、保存剤などを加えてもよい。

注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ぶどう糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、更にマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化せしめ注射剤用乳剤とすることもできる。

直腸投与剤または膣投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジ及びモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜で被覆すればよい。

皮膚用外用剤を製造するには、有効成分を白色ワセリン、ミツロウ、流動パラフィン、ポリエチレングリコールなどに加えて必要ならば加湿して練合し軟膏剤とするか、ロジン、アクリル酸アルキルエステル重合体などの粘着剤と練合した後ポリアルキルなどの不織布に展延してテープ剤とする。

本発明に係るペプチドを添加・配合して調製しうる食品の具体的形態としては、例えば、飲料類（コーヒー、ココア、ジュース、清涼飲料、ミネラル飲料、茶飲料、緑茶、紅茶、烏龍茶、乳飲料、乳酸菌飲料、ヨーグルト飲料、炭酸飲料）、ガム、グミ、ゼリー、キャンデー、クッキー、クラッカー、ビスケット、氷菓（アイスクリーム、アイスキャンディ、シャーベット、かき氷等）、レトルト食品、ゼリー状食品（ゼリー、寒天、ゼリー状飲料等）、等を挙げることができる。本発明のペプチドを添加・配合して調製しうる食品としては、いわゆる健康食品、機能性食品、栄養補助食品、サプリメント、特定保健用食品、病者用食品・病者用組合わせ食品（厚生労働省、特別用途食品の一種）又は高齢者用食品（厚生労働省、特別用途食品の一種）としてもよく、素錠、フィルムコート錠、糖衣錠、顆粒、粉末、タブレット、カプセル（ハードカプセルとソフトカプセルとのいずれも含む。）、チュアブルタイプ、シロップタイプ、ドリンクタイプ等とすることもできる。本発明に係るペプチドを添加・配合した食品の調製は、それ自体公知の方法で行うことができる。

次に実施例により本発明を更に具体的に説明する。しかし下記の実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

（高架式十字迷路実験）
高架式十字迷路（Eleveted plus maze：EPM）は、２つのオープンアーム（open arm; 25cm×5cm）と２つのクローズドアーム（closed arm; 25cm×5cm×15 cm）からなり、それらのアームは床から50cm高くなった中央プラットフォームと結合している（図１参照）。高い位置にあるにも関わらず、クローズドアームの周りには囲いがあるために、マウスは安全に歩行する事ができる。一方、オープンアームの周囲は開放されていて囲いがないために、オープンアームを歩行するマウスは高い位置から転落するという不安感を感じる。そのために、マウスがオープンアームにいる時間が長いほど、あるいは進入回数が多いほど、マウスの不安感は緩和されており、抗不安活性の指標となる。

オープンアームの一つに面している中央プラットフォーム上にマウスを置いて試験を開始した。５分の試験時間の間、オープンアーム内で過ごした累積時間(time in open arms)、オープンアームを訪れた回数（visit to open arms）、いずれかのアームを訪れた回数の総数(total visits)を記録した。オープンアーム内で過ごした時間のパーセンテージ、オープンアームを訪れた回数のパーセンテージを不安の指標として計算した。

（オープンフィールド試験）
本実験に用いたオープンフィールドは、直径60 cm、高さ50 cm円筒状の灰色の装置で、黒い線で25区画に分割されている。マウスは新規環境におかれた場合に探索行動を行なうが、通常であれば装置の中央への探索は少ない。しかし抗不安薬を処置すると、中央の円への滞在時間および進入回数が増加する。ペプチドを投与して30分後にマウスを装置の中央に置き、5分間行動を観測した。

（統計解析）
高架式十字迷路試験で得たデータを、平均とSEMで表した。データを１方向または２方向ANOVAにより解析し、引き続いて多重比較のためのFisher試験を行った。

実施例１〜１６及び比較例１〜３(抗不安作用)
（実験及び結果）
生理食塩水溶水に溶解したＹＬ(実施例１、比較例３)、ＦＬ(実施例２)、ＹＩ(実施例３)、ＦＩ(実施例４)、ＬＹ(実施例５)、ＬＦ(実施例６)、ＩＹ(実施例７)、ＩＦ(実施例８)、ＹＬＹ(実施例９)、ＹＬＱ(実施例１０)、ＬＹＬ(実施例１１)、ＹＬＹＥＩＡＲ(実施例１２)、ＹＶ(実施例１３)、ＷＬ(実施例１４)、ＬＷ(実施例１５)、ＨＬ(実施例１６)、Ｙ(比較例１)、ＹおよびＬ(比較例２)、をマウスを高架式十字迷路上に置く前に各々図面に示される量で腹腔内投与（i.p.）あるいは経口投与（p.o.）した（n = 3〜14）。そして各ペプチドないしアミノ酸の投与群と非投与群（0 mg/kg）において、オープンアーム内で過ごした時間のパーセンテージとオープンアームを訪れた回数、アームを訪れた総数(total visits)を比較した。また、ＹＬについては、オープンフィールド試験により抗不安作用を調べた。その結果を図２〜図１４、図２２〜図２７および表３に示す。図２〜図１４、図２２〜図２７および表３に示されるように、本発明のペプチドは、有意または有意傾向をもってアームを訪れる回数とアームで過ごす時間の割合を延長した。また、ＹＬについては、高架式十字迷路実験でジアゼパムと同等以上の抗不安作用を示し、オープンフィールド試験においても有効性を示した。一方、Ｙ、Ｌの２つのアミノ酸は、抗不安作用はなかった。

また、得られた結果のまとめを表１に示す。

試験例１
本発明の抗不安ペプチドであるＹＬと各種受容体の以下のアンタゴニストを併用投与し、実施例１と同様に試験して、アンタゴニストによるＹＬの抗不安作用への影響、即ち、本発明のペプチドが作用する受容体を特定するための試験を行った。結果を図１５〜図２１と表２に示す。

表２に示される結果と、セロトニン、ドーパミン、ＧＡＢＡの上下関係を示す他の実験結果(データは示さない)から、図２８に示すような作用経路が考えられる。

また、ＹＬの抗不安作用は、高架式十字迷路実験とオープンフィールド試験の両方で確認されており、本発明のペプチドの有用性が実証された。

本発明の抗不安薬は、従来の抗不安薬とは異なる作用メカニズムを持っている可能性があり、新しいタイプの薬剤を提供できる。

Claims

ＹＬ、ＦＬ、ＷＬ、ＨＬ、ＹＩ、ＦＩ、ＹＶ、ＬＹ、ＬＦ、ＬＷ、ＩＹ、ＩＦ、ＹＬＹ、ＹＬＱ、ＬＹＬまたはＹＬＹＥＩＡＲを有効成分とし、抗不安剤、睡眠導入剤、睡眠改善剤、統合失調症治療薬または抗うつ薬である医薬ないし医薬組成物。
ＹＬ、ＦＬ、ＷＬ、ＨＬ、ＹＩ、ＦＩ、ＹＶ、ＬＹ、ＬＦ、ＬＷ、ＩＹ、ＩＦ、ＹＬＹ、ＹＬＱ、ＬＹＬまたはＹＬＹＥＩＡＲを有効成分とし、不安軽減用、睡眠導入用、睡眠改善用、統合失調症治療用または抗うつ用の経口投与剤（ただし、食品を除く。）。