JP7339650B2

JP7339650B2 - ペプチド

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Publication number: JP7339650B2
Application number: JP2019134809A
Authority: JP
Inventors: 耕作大日向; 大貴小山; 雅樹笹井
Original assignee: Kyoto University
Current assignee: Kyoto University
Priority date: 2019-07-22
Filing date: 2019-07-22
Publication date: 2023-09-06
Anticipated expiration: 2039-07-22
Also published as: WO2021015222A1; JP2021017421A

Description

本発明は、ペプチドに関する。本発明はまた、当該ペプチドを含む医薬組成物、血圧降下剤、摂食抑制剤及び食品にも関する。

高血圧は脳卒中や心筋梗塞など死に直結する疾病を惹起することからサイレントキラーと呼ばれ、これを予防及び治療することが求められている。

食品タンパク質の酵素消化物から多彩な生理作用を示す生理活性ペプチドが多数見出されている。動脈硬化性疾患の発症は、血管、特に、血管内皮の機能低下が引き金となることが知られており、生理活性ペプチドの血管に対する機能が着目されている。

消化管は、外部環境（管腔内）と内部環境（体内）を分けるインターフェースであり、病原体や異物の侵入を防ぐとともに、栄養素を消化し体内に吸収する役割を担う。さらに、消化管は、管腔内の情報を受容し、その情報を体内に伝達し、循潔器系、内分泌系や神経系など種々の調節系と相互作用することが明らかになってきている。しかしながら、食品摂取により消化管内で生成する分子種は膨大であり、その受容機構の詳細は不明であった。

特許文献１及び非特許文献１～２には、摂食抑制、抗肥満、動脈弛緩、血圧降下、メタボリックシンドローム予防などの作用を有するペプチドが開示されている。

国際公開公報WO2012/070554号特開2018-184367号

Kagebayashi T et al. Mol Nutr Food Res. 2012 Sep;56(9):1456-63. Kontani Net al. Mol Nutr Food Res. Mol Nutr Food Res. 2014 Feb;58(2):359-64. Sasai M et al. Biochem Biophys Res Commun. 2018 Sep 5;503(2):1070-1074.

特許文献２及び非特許文献３には、消化管が受容する分子を体系的に検討するために、ジペプチドライブラリーを用いて腸内分泌細胞に対する応答性を検討し、Phe-Trp（FW）が高い反応性を示すことが開示されている。

本発明は、従来のペプチドよりもさらに高い血圧降下などの作用を有するペプチドを提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねたところ、ＫＦＷＧＫ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドが高い血圧降下作用を有することを見出した。本発明は、斯かる知見に基づいて、さらに検討を重ねて完成されたものである。

すなわち、本発明は以下の態様を包含する。

項１、ＫＦＷＧＫ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチド。

項２、項１に記載のペプチドを有効成分とする医薬組成物。

項３、項１に記載のペプチドを有効成分とする血圧降下剤。

項４、項１に記載のペプチドを有効成分とする摂食抑制剤。

項５、項１に記載のペプチドを含有する食品。

項５－１、項１に記載のペプチドを添加することを特徴とする食品。

項６、血圧降下のための、項５または項５－１に記載の食品。

項７、摂食抑制のための、項５または項５－１に記載の食品。

項８、項１に記載のペプチドを、必要とする患者または予備群に投与する工程を含む、血圧を降下及び／または摂食行動を抑制する方法。

項９、血圧を降下及び／または摂食行動を抑制するための、項１に記載のペプチド。

項１０、血圧を降下及び／または摂食行動を抑制するための医薬または食品を製造するための、項１に記載のペプチドの使用。

本発明のペプチドを有効成分とする医薬組成物、食品は、高い血圧降下作用を有し、副作用が低く長期の服用に適したものである。さらに、摂食抑制作用をも有する。また、本発明の医薬組成物、食品は、特に経口投与で有効である。

さらに、天然の短鎖ペプチドは食品として摂取することも可能であり、高血圧の個体が食品として摂取することで、動脈硬化などの疾患を予防することが期待できる。また、メタボリックシンドロームの予防に有効である。

血圧降下作用の評価結果血圧降下作用に及ぼす阻害薬の影響動脈弛緩作用に及ぼす阻害薬の影響予想される作用機構

本発明のペプチドは、ＫＦＷＧＫ（配列番号１）の５残基のアミノ酸配列を有するペプチド（ジペプチド）である。

本発明の別の態様においては、本発明のペプチドはＫＦＷＧＫ（配列番号１）の５残基またはアミノ酸配列を含むペプチドである。当該態様において、上記アミノ酸配列を含む限り、N末端側及び／またはC末端側（好ましくは、Ｃ末端側）にアミノ酸残基を付加することができる。付加されるアミノ酸残基の個数は限定されず、２０アミノ酸残基程度、好ましくは１０アミノ酸残基程度、より好ましくは５アミノ酸残基程度、さらに好ましくは４、３、２、若しくは１アミノ酸とすることができる。

付加されるアミノ酸残基は、天然アミノ酸であっても非天然のアミノ酸であってもよい。天然アミノ酸は、としては、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシンロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンのタンパク質を構成するアミノ酸残基、並びに、セレノシステイン、N-ホルミルメチオニン、ピロリシン、ピログルタミン等のその他のアミノ酸残基が含まれる。

ペプチドを構成するアミノ酸は、Ｌ体のアミノ酸、Ｄ体のアミノ酸或いはＤＬ体のアミノ酸（Ｄ体とＬ体が混合されたアミノ酸であればラセミ体といずれか一方のエナンチオマーが過剰なアミノ酸のいずれも含まれる）のいずれを使用することができる。好ましくはＬ体のアミノ酸のみ、或いはＤ体のアミノ酸のみからなるペプチド、特にＬ体のアミノ酸のみからなるペプチドが好ましい。

また、本発明で使用するペプチドが２以上の不斉炭素を含む場合、各エナンチオマーないしジアステレオマー或いはこれらの任意の比率の混合物のいずれの形態でもあり得る。エナンチオマーまたはジアステレオマーの分離は、通常のカラムで行う方法、光学活性カラムを使用する方法、光学活性基を導入して誘導体の形態で光学分割した後、その光学活性基を除去する方法や、光学活性の酸または塩基との塩を形成して光学分割する方法などの公知のいずれの方法を用いることができる。

ペプチドは、修飾を有することができる。ペプチドのアミノ末端（Ｎ末端）は、遊離のアミノ基（ＮＨ_２－）であっても、アセチル基（ＣＨ_３ＣＯ－）などの修飾を有するものであってもよい。ペプチドのカルボキシ末端（Ｃ末端）は、遊離のカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）であっても、アミド基などの修飾を有するものであってもよい。ペプチドのアミノ酸残基は、無修飾ものであっても、リン酸基、糖鎖などの修飾を有するものであってもよい。

本発明のペプチドは、塩（酸付加塩または塩基塩）であってもよい。酸付加塩としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸、臭化水素酸、過塩素酸などの無機塩、クエン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、ｐ－トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、メタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などの有機酸の塩が挙げられる。塩基塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウムなどのアルカリ金属塩、カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属塩などが挙げられる。

本発明のペプチドは、溶媒和物であってもよい。溶媒和物としては、水(水和物の場合)、メタノール、エタノール、イソプロパノール、酢酸、テトラヒドロフラン、アセトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセトアミド、アセトアミド、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジメトキシエタンなどの溶媒和物が挙げられる。

本発明のペプチドは、ペプチド合成法などの化学合成で取得することができる。即ち、ペプチド合成に通常用いられる方法である液相法または固相法で、反応性カルボキシル基を有する原料と、反応性アミノ基を有する原料とをＨＢＴＵ等の活性エステルを用いた方法や、カルボジイミドなどのカップリング剤を用いた方法等のペプチド合成において通常の方法により縮合させることができる。生成する縮合物が保護基を有する場合、その保護基を除去することによっても製造し得る。

この反応工程において反応に関与すべきでない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）、ｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ），９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等が挙げられる。カルボキシル基の保護剤としては例えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が挙げられるが、固相法の場合は、Ｃ末端のカルボキシル基はクロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、ｐ－アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在下にあるいはＮ－保護アミノ酸活性エステルまたはペプチド活性エステルを用いて実施する。

縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断する。更に、本発明のペプチドは通常の方法に従い精製される。例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等が挙げられる。合成したペプチドの合成はエドマン分解法でＣ－末端からアミノ酸配列を読み取るプロテインシークエンサー、ＧＣ－ＭＳ等で分析される。

本発明のペプチドは、酵素法によっても合成することが可能である（国際公開公報WO2003/010307参照）。

本発明のペプチドは、強力な血圧降下作用及び動脈弛緩作用を有する。後述の実施例に示すように、これらの作用はCCK₁受容体のアンタゴニストであるlorglumideにより抑制されることから、これらの作用はCCK₁受容体の活性化を介すると考えられる。

本発明のペプチドは、血圧降下作用及び動脈弛緩作用を有するため、血圧降下を必要とする高血圧症の患者などを投与対象とすることができる。なかでも、一部の治療薬（例えば、NOを介して動脈弛緩作用を示すもの）の作用減弱する高血圧発症後期の患者を対象とすることができる。

高血圧症の進行段階は、高血圧の発症から経時的に高血圧発症前期から高血圧発症後期へと進行すると理解される。高血圧発症前期とは、好ましくは、血管内皮細胞の機能、特に血管内皮由来弛緩因子である一酸化窒素の産生機能が維持されている段階を指すと理解される。高血圧発症後期とは、高血圧症が高血圧発症前期よりも進行し、好ましくは、上記のような血管内皮細胞の機能が減退している段階を指すと理解される。

また、本発明のペプチドは、内因性の摂食抑制ペプチドCCKの遊離を促進する作用を有するため、摂食抑制作用が期待できる。本発明のペプチドは、食後の満足感を増進する内因性摂食抑制ペプチドCCKを介する作用であり自然な満腹感を示すことが期待できる。

従って、本発明のペプチドは、血圧降下作用、動脈弛緩作用、摂食抑制作用及び摂食抑制作用を介した肥満の抑制作用を有し、さらには動脈硬化の防止に効果があり、メタボリックシンドロームの予防に有効である。メタボリックシンドローム患者では、CCK反応性が低下しているとの報告があり、このような観点からも、メタボリックシンドロームの予防薬としてより好適である。

本発明のペプチドは、医薬組成物または食品（食品組成物）として提供されうる。

本発明のペプチドまたはこれを含有する製品の投与経路は特に限定されるものではなく、経口投与、非経口投与（例えば、筋肉内または静脈内）、直腸内投与のなどを採用することができる。中でも、効果が高いとの観点から、経口投与または直腸内投与、特に経口投与が好ましい。

本ペプチドの投与量は、投与方法、投与される者の状態や年齢等により異なる。投与量は、必要とする患者または予備群の成人１日あたり通常は０．０１ｍｇ／ｋｇ～５００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．０５ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．１～３０ｍｇ／ｋｇである。本発明のペプチド（有効成分）は、製剤用担体と混合して調製した医薬組成物の形で投与することができる。製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用いられる。

本発明のペプチドはそれ自体医薬または食品として利用することができる。本発明のペプチドを単独で、もしくは適当な無毒性の経口摂取用担体、希釈剤または賦形剤とともに、タブレット（素錠、糖衣錠、発泡錠、フィルムコート錠、チュアブル錠など）、カプセルハードカプセルとソフトカプセルとのいずれも含む。）、トローチ、粉末、細粒剤、顆粒剤、液剤、懸濁液、乳濁液、ペースト、クリーム、注射剤（アミノ酸輸液、電解質輸液等の輸液に配合する場合を含む）、或いは腸溶性の錠剤、カプセル剤、顆粒剤などの徐放性製剤などの食品用もしくは医薬用の製剤にすることが可能である。

本発明の１つの態様としては、本発明のペプチドおよび医薬品として認められる希釈剤、担体、又は賦形剤を含む医薬組成物が挙げられる。別の態様として、本発明のペプチドを含有する（例えば、添加することにより含有することができる。）食品が挙げられる。

医薬又は食品中のペプチドの含有量は適宜選択が可能であるが一般に、０．０１～１００重量％の範囲である。

具体的には、医薬または食品に加えることができる製剤用担体ないし経口摂取用担体、希釈剤または賦形剤のような物質の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコール、水等が挙げられる。

剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。尚、液体製剤にあっては、用時、水または他の適当な溶媒に溶解または懸濁する形であってもよい。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。

これらの製剤は、本発明のペプチドを０．０１％～１００重量％、好ましくは１～９０重量％の割合で含有することができる。これらの製剤はまた、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。

経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分例えば乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式または乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤及び顆粒剤をそのまま或いはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒または錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸－メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤または顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま或いはグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。

経口投与用の液状製剤を製造するには、有効成分と白糖、ソルビトール、グリセリンなどの甘味剤とを水に溶解して透明なシロップ剤、更に精油、エタノールなどを加えてエリキシル剤とするか、アラビアゴム、トラガント、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを加えて乳剤または懸濁剤としてもよい。これらの液状製剤には所望により矯味剤、着色剤、保存剤などを加えてもよい。

本発明に係るペプチドを添加、配合して調製しうる食品の具体的形態としては、例えば、飲料類（コーヒー、ココア、ジュース、清涼飲料、ミネラル飲料、茶飲料、緑茶、紅茶、烏龍茶、乳飲料、乳酸菌飲料、ヨーグルト飲料、炭酸飲料、その他ノンアルコール飲料、アルコール飲料など）、菓子類（ハードキャンディー、ガム、グミ、ゼリー、プディング、ムース、ケーキ、キャンデー、クッキー、クラッカー、ビスケット、チョコレート、氷菓（アイスクリーム、アイスキャンディ、シャーベット、かき氷など）など）、ふりかけ、ドレッシング、調味料、大豆加工食品（豆腐、味噌、醤油、湯葉、きな粉、納豆など）、食肉加工食品(ハンバーグ、ミートローフ、ミートボール、つくねなど)、魚肉加工食品（かまぼこ、ちくわなど）、レトルト食品、ゼリー状食品（ゼリー、寒天、ゼリー状飲料等）、等を挙げることができる。本発明のペプチドを添加・配合して調製しうる食品としては、いわゆる健康食品、機能性食品、機能性表示食品、栄養補助食品、サプリメント、特定保健用食品、病者用食品・病者用組合せ食品（厚生労働省、特別用途食品の一種）または高齢者用食品（厚生労働省、特別用途食品の一種）としてもよく、素錠、フィルムコート錠、糖衣錠、顆粒、粉末、タブレット、カプセル（ハードカプセルとソフトカプセルとのいずれも含む。）、チュアブルタイプ、シロップタイプ、ドリンクタイプ等とすることもできる。本発明に係るペプチドを添加・配合した食品の調製は、それ自体公知の方法で行うことができる。

本発明のペプチドを含む食品は、例えば公知の食品に本発明のペプチドを添加して製造することができる。発明に係るペプチドを添加して製造しうる食品の具体的形態としては、例えば、飲料類（コーヒー、ココア、ジュース、清涼飲料、ミネラル飲料、茶飲料、緑茶、紅茶、烏龍茶、乳飲料、乳酸菌飲料、ヨーグルト飲料、炭酸飲料、その他ノンアルコール飲料、アルコール飲料など）、菓子類（ハードキャンディー、ガム、グミ、ゼリー、プディング、ムース、ケーキ、キャンデー、クッキー、クラッカー、ビスケット、チョコレート、氷菓（アイスクリーム、アイスキャンディ、シャーベット、かき氷など）など）、ふりかけ、ドレッシング、調味料、乳製品（牛乳、加工乳、クリーム、バター、チーズ、乳清（ホエイ）、アイスクリーム類、れん乳、粉乳、はつ酵乳（ヨーグルトなど）、乳酸菌飲料、乳飲料など）、大豆加工食品（豆腐、味噌、醤油、湯葉、きな粉、納豆など）、食肉加工食品(ハンバーグ、ミートローフ、ミートボール、つくねなど)、魚肉加工食品（かまぼこ、ちくわなど）、レトルト食品、ゼリー状食品（ゼリー、寒天、ゼリー状飲料等）等を挙げることができる。本発明に係るペプチドを添加した食品の調製は、それ自体公知の方法で行うことができる。

また、本発明のペプチドを含む食品が、牛乳、乳清（ホエイ）などウシ血清アルブミンを含む製品を原材料とする場合、当該食品の製造方法において、サチライシンによる加水分解の工程を含めることで、本発明のペプチドを含む食品を製造することができる。別の態様において、当該食品の製造方法において、凍結乾燥、酸及び／またはアルカリ処理などの本発明のペプチドを生成させる工程を含めることでも、本発明のペプチドを含む食品を製造することができる。

本発明のペプチドを含む食品は、いわゆる健康食品、機能性表示食品、特定保健用食品、栄養補助食品、サプリメント、病者用食品、病者用組合せ食品（厚生労働省、特別用途食品の一種）または高齢者用食品（厚生労働省、特別用途食品の一種）とすることができる。

次に実施例により本発明を更に具体的に説明する。しかし下記の実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

＜方法＞
血圧降下作用の評価、腸内分泌細胞のカルシウム応答性試験、及び動脈弛緩実験は、特許文献１及び非特許文献１に記載の方法に準じた。
（血圧降下作用の評価）
(i)使用動物
高血圧自然発症の雄ラット（SHRs/Izm）（日本ＳＬＣ社製）を使用した。SHRラットは、23±1℃、湿度50%、12時間/12時間の明暗サイクルに制御された部屋で飼育した。餌は固形SP飼料（株式会社フナバシファーム製）を与え、水と共に自由摂取させた。SHRラットは、２５週齢より高い週齢のラットを用いた。なお、SHRラットは２５週齢を超えると一部の降圧剤が効果を示しにくく、高血圧発症後期（Advanced stage）に相当すると考えられる。

(ii)非観血的血圧測定実験（Tail-cuff法）
無麻酔下のSHRラットについて、Tail-cuff法での収縮期血圧（Systolic blood pressure）を測定して。血圧測定には、MK-2000（室町機械社製)を用いて測定した。約3週間Tail-cuff装置でトレーニングをした動物を本実験に用いた。各試料を生理食塩水に溶解し、メタルゾンデを用いて強制的に経口投与した。血圧測定は、投与直前及び各表に示す投与からの経過時間後（2時間後、4時間後、6時間後、24時間後、48時間後）に行った。

評価は、投与直前に対する収縮期血圧の変化（ΔSystolic blood pressure）の算出により行った。

（動脈弛緩実験）
安楽死させたSHRラットから腸間膜動脈を摘出し、螺旋状に切開して標本を作成した。Krebs-Henseleit栄養液（（１２０ｍＭのＮａＣｌ，４．７ｍＭのＫＣｌ，１．２ｍＭのＭｇＳＯ_４，１．２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４，２．５ｍＭのＣａＣｌ_２，２５ｍＭのＮａＨＣＯ_３，１０ｍＭのグルコース）、３７℃、５％ＣＯ_２、９５％Ｏ_２混合ガス飽和）を満たしたマグヌス管中にこの標本を懸垂し、その張力（緊張）変化を歪みトランスデューサー（三栄社製）を介してポリグラフ上に記録した。

フェニレフリン（phenilephrine）であらかじめ動脈を収縮させた状態にしておき、安定したところでサンプルを加え、弛緩する程度を測定した。パパベリン（papaverine）で動脈を完全に弛緩させたときの収縮の程度を100%に対する収縮の程度の割合として、弛緩率（Relaxation）を算出した。

＜製造例＞

（ペプチド）
定法により、ペプチドKFWGK（配列番号１）を合成した。
（統計解析）
試験により得られたたデータを、試行数ｎの平均（Mean）と標準誤差（Standard error of the mean、SEM）との和で表した。2群間の比較にはt検定を用いた。3群間以上の比較には、データを１方向ANOVAにより解析し、引き続いて多重比較のためのTukey-Kramer試験を行った。対照（Control）に対してp<0.05の場合（図中、”*”）に、有意差ありと判定した。

＜実験及び結果＞
（実施例１：血圧降下作用（１））
ペプチドKFWGKを5.0μg/kgを経口投与したSHRラットを用いて、血圧降下作用を評価した（n=5）。溶媒の生理食塩水のみの投与を、対照（Control）とした（以下、同様）。投与後２時間後、４時間後、６時間後、２４時間後及び４８時間後の各時点で、Tail-cuff法により収縮期血圧を測定した。

結果を図１に示す。ペプチドKFWGKは、5μg/kgという低用量の投与で有意に血圧降下作用を示す。さらに、血圧降下作用は投与後２４時間後まで持続する。

（実施例２：血圧降下作用（２））
ペプチドKFWGKに加えてCCK₁受容体アンタゴニスト（CCK₁R Antagonist）であるロルグルミド（lorglumide）を添加して投与した場合について血圧降下作用を評価した。

溶媒のみの対照（対照）、ペプチドKFWGK単独（ペプチド）、ペプチドKFWGKとロルグルミドとの併用（ペプチド＋CCKアンタゴニスト）及びロルグルミド単独（CCKアンタゴニスト）について、投与後４時間後の時点で、Tail-cuff法により収縮期血圧を測定した（n= 7-8）。ペプチドKFWGKの投与量は50μg/kg、ロルグルミドの投与量は1 mg/kgとした。

結果を図２に示す。ペプチドKFWGKの血圧降下作用はロルグルミドにより阻害された。ペプチドKFWGKは血管弛緩作用により血圧降下作用を示すと考えられ、それはCCK1受容体の活性化を介した血管弛緩作用である推測される。

（実施例３：動脈弛緩実験）
ペプチドKFWGKを試験物質として、各種阻害剤の存在下または非存在下で動脈弛緩実験により動脈弛緩作用を評価した（n=1）。

サンプルとしてペプチドKFWGK50μg/kgを用いた。併用する阻害剤としては、CCK₁受容体アンタゴニスト（CCK₁R Antagonist）であるロルグミド（lorgumide）（10μM）及びシクロオキシゲナーゼ（Cyclooxygenase）阻害薬（COX Inhibitor）であるインドメタシン（indometachin）（3μM）を用いた。

阻害剤を用いる場合、阻害剤による前処理（pretreatment）後に、ペプチドKFWGK50μg/kgを投与した。

結果を図３に示す。ペプチドCCK₁受容体のアンタゴニストであるlorglumideを添加した場合に、動脈弛緩作用が有意に阻害された。一方、COX阻害剤であるインドメタシンを添加しても弛緩率は低下しなかった。従って、ペプチドKFWGKの動脈弛緩作用は、CCK₁受容体の活性化を介していると考えられる。

（考察）
本発明のペプチドKFWGKの予想される作用機構を図４に示す。

本発明のペプチドKFWGKは、CCK₁受容体を介した動脈弛緩作用を示す。また、経口投与により強力な生理作用を示すこと、及びCCK分泌は腸内分泌細胞がすることから、本発明のペプチドは作用点が血管と消化管の両方に存在し、消化管が中心的な作用点と考えられる。

加齢ラットにおける動脈弛緩反応は低下するが、特に、NOを介して動脈弛緩作用を示すペプチドは、加齢により顕著に動脈弛緩反応が減弱する。一方、加齢ラットにおいてCCK介して動脈弛緩作用を示すペプチドの反応性は低下しない。すなわち、CCK系を活性化する血圧降下ペプチドは加齢により反応性が低下した動物個体においても効果的に血圧降下作用を示すことが期待される。

CCKを介した血圧降下ペプチドとして、RF（最小有効用量は、15mg/kg、非特許文献２等）及びFW（最小有効量は1.5mg/kg等、非特許文献３等）が報告されている。本発明のペプチドKFWGKは5μg/kgでも血圧降下作用を示し、従来知られていたペプチドよりも低用量で血圧降下作用を示し、かつ、24時間にわたり持続的な作用を示す。しかも、CCK系を活性化するため、一部の血圧降下物質が効果を示しにくい加齢ラットにおいても効果を示すことが期待できる。また、分子量が大きな5残基ペプチドのほうが経口投与ではるかに強い生理活性を示すことから吸収を前提としない作用機構の寄与が少なくないと考えられる。

Claims

ＫＦＷＧＫ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドを有効成分とする、動脈弛緩剤。
動脈弛緩のために用いられる、ＫＦＷＧＫ（配列番号１）のアミノ酸配列を有するペプチドを含有する食品又は医薬組成物。