JP3898389B2 - 抗健忘作用を有するペプチド - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の機能性ペプチドを有効成分として含有する、経口投与にも適した健忘症の予防及び／又は症状改善剤や、特定のペプチドを有効成分として含有する、機能性食品素材として摂取することができる健忘症の予防及び／又は症状改善用食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、高齢化社会の到来を迎え神経系の機能を保護し、老人性痴呆を防ぐ機能を持った食品成分や医薬が注目されている。従来、抗健忘症作用を有する物質として、鎮痛、麻酔等のオピオイド活性を有するペプチド（特開平９−２２７５９０号公報）、プロリルプロリン誘導体（特開平８−３１３２号公報）、プロリルエンドペプチダーゼ阻害作用を有するストレプトミセス属微生物の発酵生産物ＢＵ−４１６４ＥＡ及びＢ（特開平６−３３９３９０号公報）、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性を有する複素環化合物（特開平６−２７９４１３号公報）、プロリルエンドペプチダーゼ阻害作用を有するエンジュラシジンＡ（特開平５−３０１８２６号公報）、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性を有し、スコポラミン誘発健忘症モデルに対して活性を有するキノリン誘導体（特開平５−２７９３５５号公報）、プロリルエンドペプチダーゼ阻害作用を有し、ミクロビスポラ属微生物の発酵生産物であるペプチドＳＮＡ−１１５（特開平５−２６２７９５号公報）等が知られている。
【０００３】
他方、種々の疾病の予防あるいは治療に有用な機能性ペプチドについての様々な報告も近年数多くあり、本発明者らも配列番号１（Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）で表される、米の蛋白質に含まれる機能性ペプチドであるオリザテンシン（oryzatensin）が抗オピオイド活性、ファゴサイトーシス活性、インターロイキン−１産生促進活性をもつことを報告した（特開平７−２５８２８８号公報）。また、本発明者らは、牛乳カゼイン（κ-casein）のトリプシン消化物から得られ、補体Ｃ３ａのＣ−末端配列に高い類似性をもち、補体Ｃ３ａレセプターを介して回腸収縮活性、免疫促進活性を示す、抗オピオイドペプチドとして知られている、配列番号２（Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ）で表されるカソキシン（Casoxin）Ｃの側脳室内投与によって、オピオイドの鎮痛作用を抑制すること、またスコポラミン誘発及び脳虚血による健忘に対して改善効果を示すことを報告した（Opioid Simposium 17,Supplement,1996,96-100）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記カソキシンＣと同様に、補体Ｃ３ａも側脳室内投与によってスコポラミン誘発及び脳虚血による健忘に対して改善作用を示すことがわかったが、これらカソキシンＣ及び補体Ｃ３ａはいずれも経口投与では健忘に対して改善効果を示さなかった。本発明の課題は、経口投与あるいは機能性食品素材として摂取しても、健忘症の予防や症状改善作用を有する有用な機能性ペプチドを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、コメアルブミン由来のＣ３ａアゴニストである前記オリザテンシンのＣ−末端側に存在するＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇは、補体Ｃ３ａ活性に必要な疎水性残基−Ｘ1−Ｌｅｕ−Ｘ2−Ａｒｇという構造を有し、補体Ｃ３ａ活性を示す最も短いペプチドであり（図１参照）、またペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇは、プロリン残基を２個含むことからプロテアーゼに抵抗性であると予想された。しかし、該ペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＹＰＬＰＲ）は、経口投与の際に意外にも抗鎮痛活性ではなく鎮痛活性を示し、またオピオイドレセプターに親和性（affinity）を有することが分かった。オリザテンシンとペプチドＹＰＬＰＲのオピオイド活性を表１に、マウスにおけるペプチドＹＰＬＰＲの鎮痛活性を図２にそれぞれ示す。なお、図２(Ａ)は側脳室内投与を、図１(Ｂ)は経口投与の場合を示している。
【０００６】
【表１】
【０００７】
ペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇが、上記のように鎮痛活性やオピオイドレセプター親和性を示したことは、Ｎ−末端にＴｙｒをもち、オピオイド活性を示したためと考えられた。そこでペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇのオピオイド活性を除くためオピオイド活性に必要なＴｙｒを他の疎水性残基に置換したペプチドを合成し、合成ペプチドの活性をモルモット回腸アッセイ系又は補体Ｃ３ａレセプターアッセイにより検討した。補体Ｃ３ａレセプターアッセイには、125ＩでラベルしたＣ３ａとＣ３ａレセプター遺伝子を発現したＲＢＬ−２Ｈ３細胞を用いた。置換ペプチドの回腸収縮活性とレセプターアフィニティの結果を表２に示す。かかるアッセイの結果、ペプチドＴｒｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＷＰＬＰＲ）が最も強いＣ３ａ活性を示すことがわかった。
【０００８】
【表２】
【０００９】
また、本発明者らは、補体Ｃ３ａの側脳室内投与により、スコポラミン誘発健忘（図３Ａ参照）や、脳虚血による健忘（図３Ｂ参照）が改善されることを見い出したが、前記のように、経口投与では健忘に対して改善効果を示さなかった。そこで、ペプチドＴｒｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＷＰＬＰＲ）等を経口投与した場合におけるスコポラミンや脳虚血により誘発される健忘の改善作用について調べたところ、これらペプチドが優れた健忘症状改善効果を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、一般式Ｘ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ …（Ｉ）（式中、ＸはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐのいずれかを表す。）で示されるペプチドを有効成分として含有することを特徴とする健忘症の予防及び／又は症状改善剤（請求項１）や、一般式（Ｉ）におけるＸがＴｒｐであることを特徴とする請求項１記載の健忘症の予防及び／又は症状改善剤（請求項２）に関する。
【００１１】
また本発明は、一般式Ｘ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ …（Ｉ）（式中、ＸはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐのいずれかを表す。）で示されるペプチドを有効成分として含有することを特徴とする健忘症の予防及び／又は症状改善用食品（請求項３）や、一般式（Ｉ）におけるＸがＴｒｐであることを特徴とする請求項３記載の健忘症の予防及び／又は症状改善用食品（請求項４）に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の健忘症の予防及び／又は症状改善剤や、健忘症の予防及び／又は症状改善用食品は、配列番号３で示されるＸ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（式中、ＸはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐのいずれかを表す。）で示されるペプチド、好ましくはペプチドＴｒｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを有効成分として含有することを特徴とする。なお、これらアミノ酸はいずれもＬ−体である。また、かかる一般式Ｘ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（式中、ＸはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐのいずれかを表す。）で示されるペプチドは、血中コレステロール上昇抑制作用を示すことが本発明者らにより明らかにされている（特願平１０−１７７９７号）。
【００１３】
一般式Ｘ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（式中、ＸはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐのいずれかを表す。）で示されるペプチドは、どのようにして調製したものでも使用できるが、例えば次のようなペプチド合成法でも調製することができる。ペプチド合成に通常用いられる方法、即ち液相法または固相法でペプチド結合の任意の位置で二分される２種のフラグメントの一方に相当する反応性カルボキシル基を有する原料と、他方のフラグメントに相当する反応性アミノ基を有する原料とをＨＢＴＵ（2-(1H-Benzotriazole-1-y1)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate）等の活性エステルを用いた方法、カルボジイミドを用いた方法等を用いて縮合させ、生成する縮合物が保護基を有する場合、その保護基を除去することによって製造することができる。
【００１４】
この反応工程おいて反応に関与すべきでない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｂｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｐ−ビフェニルイソプロピロオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等が挙げられる。カルボキシル基の保護としては、例えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が挙げられるが、固相法の場合、Ｃ末端のカルボキシル基はクロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、Ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在下にあるいはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたはペプチド活性エステルを用いて実施する。
【００１５】
縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合はさらにペプチドのＣ末端の樹脂との結合を切断する。合成後のペプチドは、例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等、通常の方法に従い精製され、エドマン分解法でＣ−末端からアミノ酸配列を読み取るプロテインシークエンサー、ＧＣ−ＭＳ等で分析される。
【００１６】
本発明の一般式Ｘ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（式中、ＸはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐのいずれかを表す。）で示されるペプチド、好ましくはＴｒｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇは、健忘症の予防及び／又は症状改善剤、あるいは健忘症の予防及び／又は症状改善用食品として有用であるばかりでなく、また健忘の作用機作を研究するための医薬品開発のためのリード物質としても用いることができる。以下医薬品や機能性食品として用いる場合について説明する。
【００１７】
本発明で使用するペプチドの投与方法としては、経口投与、非経口投与のいずれでもよいが、経口投与が好ましい。また、投与量は投与方法、患者の症状・年齢等により異なるが、通常１回１〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜３００ｍｇを１日当たり１〜３回投与することが好ましい。そして、経口投与する場合、通常、製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用いられ、具体的には、乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン界面活性剤、プロピレングリコール、水等を例示することができる。
【００１８】
また、剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等を具体的に例示することができ、これらの製剤は常法に従って調製され、特に液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形態とすることもできる。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。これらの製剤は、上記ペプチドを０．１重量％以上、好ましくは０．５〜７０重量％の割合で含有することができる。これらの製剤はまた、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
【００１９】
本発明の一般式Ｘ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（式中、ＸはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐのいずれかを表す。）で示されるペプチド、好ましくはＴｒｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇは、健忘症の予防及び／又は症状改善用食品素材として、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜へ配合し、機能性食品として摂取することもできる。これらの食品は、上記ペプチドを０．０１重量％以上、好ましくは０．１〜１０重量％の割合で含有することができる。
【００２０】
（実施例）
次に本発明を実施例等により更に具体的に説明するが、本発明はかかる実施例等により限定されるものではない。なお実施例中「％」とあるのは断りのない限り重量％を意味する。
参考例［ペプチドの合成］
市販のＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａ１ｋｏ樹脂（置換率０．５ｍｅｑ／ｇ）０．８ｇをＰＳ３型ペプチド合成機（Protein Technologies社製）の反応槽に分取し、以下のように合成を行った。ここで、Ｐｍｃとは、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン６−スルフォニル基を示す。
【００２１】
まず、上記樹脂を反応容器に入れて、１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｐｒｏと、活性化剤として、１ｍｍｏｌのＨＢＴＵを、０．４ＭのＮ−メチルモルフォリンを含むジメチルフォルムアミドに溶解したものを１０ｍｌ反応槽に加え、室温にて２０分攪拌反応させた。得られた樹脂を２０％のピペリジンを含むメチルフォルムアミド２０ｍｌ中で、Ｆｍｏｃ基を除去処理し、ついで上記のＦｍｏｃ−Ｐｒｏをカップリングさせた方法と同様にＣ末端から順次Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ及びＦｍｏｃ−Ｘ（ＸはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐのいずれかを表す。）をカップルさせて、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）樹脂を得た。該樹脂を１０ｍｌの脱保護液（８２容量％トリフルオロ酢酸、５容量％チオアニソール、３容量％エタンジチオール、２容量％エチルメチルスルフィド、３容量％フェノール、５容量％水）中で室温にて４時間攪拌し、ペプチドを樹脂から遊離させた。
【００２２】
ここに４０ｍｌの冷エーテルを添加し、ペプチドを沈殿させ、さらに冷エーテルにて３回洗浄して粗ペプチドを得た。これをＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ18−ＡＲ，φ２０×２５０ｍｍ）による逆相クロマトグラフィーにより０．１重量％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配にて展開して精製し、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＸはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐのいずれかを表す。）の配列を有するペプチドを得た。これら５種類のペプチドをプロテインシーケンサー（アプライド バイオシステムズ社製４７７Ａ型）により分析して、それぞれの組成であることを確認した。
【００２３】
実施例
［学習実験］
学習能に対するペプチドの効果を step-through 装置を用いた受動的回避実験により検討した。マウスを明暗２室に分かれた装置の明室に入れると、マウスは暗いところを好むことから暗室に入る。暗室に入ると床から電気ショック（２８−２９Ｖ、５ sec duration）を与えて、暗室が危険なことを教育する。２４時間マウスを再び同じ装置に入れ明暗に止まっている時間を測定する。
【００２４】
訓練試行３０分前にスコポラミン０．１ｍｇ／ｋｇを腹腔内に投与することにより（スコポラミン健忘）、または訓練試行３日前に両側総頚動脈を１０分間遮断すること（脳虚血健忘）によってマウスに健忘を誘発させた。訓練試行直後にペプチドを側脳室内または経口投与し、２４時間後テスト試行を行った。
【００２５】
［抗健忘作用］
スコポラミンは０．１ｍｇ／ｋｇで有意な健忘作用を示したことから、スコポラミン誘発健忘に対するペプチドＷＰＬＰＲの抗健忘作用について検討した。結果を図４に示す。図４から、３０ｎｍｏｌｅ／ｍｏｕｓｅの側脳室内投与（図４Ａ参照）または３００ｍｇ／ｋｇの経口投与（図４Ｂ参照）で、スコポラミン投与によって誘発された健忘に対してペプチドＷＰＬＰＲが有意に改善作用を示すことがわかった。スコポラミンはムスカリン性アセチルコリンレセプターアンタゴニストであること、また補体Ｃ３ａはモルモット回腸アッセイ系においてアセチルコリンの放出を促進することから、ペプチドＷＰＬＰＲの抗健忘作用は脳内Ｃ３ａレセプターによるアセチルコリンの放出によるものと考えられる。
【００２６】
また、脳虚血処置したマウスでは有意な健忘が見られたことから、スコポラミン誘発健忘の場合と同様に、脳虚血誘発健忘に対するペプチドＷＰＬＰＲの抗健忘作用について検討した。結果を図５に示す。図５から、ペプチドＷＰＬＰＲは、６０ｎｍｏｌｅ／ｍｏｕｓｅの側脳室内投与（図５Ａ参照）または３００ｍｇ／ｋｇの経口投与（図５Ｂ参照）で脳虚血健忘をコントロールレベルまで改善した。
【００２７】
【発明の効果】
コメ由来のオリザテンシンを基にして、ペプチドＷＰＬＰＲ等の経口投与で有効なＣ３ａアゴニストをはじめて設計したところ、これらペプチドはスコポラミン健忘及び脳虚血によって誘発した健忘に対して改善効果を示した。このように本発明によると、経口投与あるいは機能性食品素材として摂取しても、健忘症の予防や症状改善作用を有する有用な機能性ペプチドを提供することができる。また、ＷＰＬＰＲ配列を遺伝子の部位指定変異により米アルブミンまたは他のタンパク中に導入することにより経口で有効なＣ３ａ活性を内在するタンパク質を得ることもできる。
【００２８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】補体Ｃ３ａとコメ由来のオリザテンシンとの間のホモロジーを示す図である。
【図２】マウスにおけるペプチドＹＰＬＰＲの鎮痛活性を示す図である。
【図３】補体Ｃ３ａの側脳室内投与による、スコポラミン誘発健忘(Ａ)や脳虚血による健忘(Ｂ)に対する抗健忘作用を示す図である。
【図４】側脳室内投与(Ａ)及び経口投与(Ｂ)によるスコポラミン誘発健忘マウスに対するペプチドＷＰＬＰＲの抗健忘作用を示す図である。
【図５】側脳室内投与(Ａ)及び経口投与(Ｂ)による脳虚血誘発健忘マウスに対するペプチドＷＰＬＰＲの抗健忘作用を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の機能性ペプチドを有効成分として含有する、経口投与にも適した健忘症の予防及び／又は症状改善剤や、特定のペプチドを有効成分として含有する、機能性食品素材として摂取することができる健忘症の予防及び／又は症状改善用食品に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、高齢化社会の到来を迎え神経系の機能を保護し、老人性痴呆を防ぐ機能を持った食品成分や医薬が注目されている。従来、抗健忘症作用を有する物質として、鎮痛、麻酔等のオピオイド活性を有するペプチド（特開平９−２２７５９０号公報）、プロリルプロリン誘導体（特開平８−３１３２号公報）、プロリルエンドペプチダーゼ阻害作用を有するストレプトミセス属微生物の発酵生産物ＢＵ−４１６４ＥＡ及びＢ（特開平６−３３９３９０号公報）、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性を有する複素環化合物（特開平６−２７９４１３号公報）、プロリルエンドペプチダーゼ阻害作用を有するエンジュラシジンＡ（特開平５−３０１８２６号公報）、アセチルコリンエステラーゼ阻害活性を有し、スコポラミン誘発健忘症モデルに対して活性を有するキノリン誘導体（特開平５−２７９３５５号公報）、プロリルエンドペプチダーゼ阻害作用を有し、ミクロビスポラ属微生物の発酵生産物であるペプチドＳＮＡ−１１５（特開平５−２６２７９５号公報）等が知られている。
【０００３】
他方、種々の疾病の予防あるいは治療に有用な機能性ペプチドについての様々な報告も近年数多くあり、本発明者らも配列番号１（Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ）で表される、米の蛋白質に含まれる機能性ペプチドであるオリザテンシン（oryzatensin）が抗オピオイド活性、ファゴサイトーシス活性、インターロイキン−１産生促進活性をもつことを報告した（特開平７−２５８２８８号公報）。また、本発明者らは、牛乳カゼイン（κ-casein）のトリプシン消化物から得られ、補体Ｃ３ａのＣ−末端配列に高い類似性をもち、補体Ｃ３ａレセプターを介して回腸収縮活性、免疫促進活性を示す、抗オピオイドペプチドとして知られている、配列番号２（Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ）で表されるカソキシン（Casoxin）Ｃの側脳室内投与によって、オピオイドの鎮痛作用を抑制すること、またスコポラミン誘発及び脳虚血による健忘に対して改善効果を示すことを報告した（Opioid Simposium 17,Supplement,1996,96-100）。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
上記カソキシンＣと同様に、補体Ｃ３ａも側脳室内投与によってスコポラミン誘発及び脳虚血による健忘に対して改善作用を示すことがわかったが、これらカソキシンＣ及び補体Ｃ３ａはいずれも経口投与では健忘に対して改善効果を示さなかった。本発明の課題は、経口投与あるいは機能性食品素材として摂取しても、健忘症の予防や症状改善作用を有する有用な機能性ペプチドを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究し、コメアルブミン由来のＣ３ａアゴニストである前記オリザテンシンのＣ−末端側に存在するＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇは、補体Ｃ３ａ活性に必要な疎水性残基−Ｘ1−Ｌｅｕ−Ｘ2−Ａｒｇという構造を有し、補体Ｃ３ａ活性を示す最も短いペプチドであり（図１参照）、またペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇは、プロリン残基を２個含むことからプロテアーゼに抵抗性であると予想された。しかし、該ペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＹＰＬＰＲ）は、経口投与の際に意外にも抗鎮痛活性ではなく鎮痛活性を示し、またオピオイドレセプターに親和性（affinity）を有することが分かった。オリザテンシンとペプチドＹＰＬＰＲのオピオイド活性を表１に、マウスにおけるペプチドＹＰＬＰＲの鎮痛活性を図２にそれぞれ示す。なお、図２(Ａ)は側脳室内投与を、図１(Ｂ)は経口投与の場合を示している。
【０００６】
【表１】
ペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇが、上記のように鎮痛活性やオピオイドレセプター親和性を示したことは、Ｎ−末端にＴｙｒをもち、オピオイド活性を示したためと考えられた。そこでペプチドＴｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇのオピオイド活性を除くためオピオイド活性に必要なＴｙｒを他の疎水性残基に置換したペプチドを合成し、合成ペプチドの活性をモルモット回腸アッセイ系又は補体Ｃ３ａレセプターアッセイにより検討した。補体Ｃ３ａレセプターアッセイには、125ＩでラベルしたＣ３ａとＣ３ａレセプター遺伝子を発現したＲＢＬ−２Ｈ３細胞を用いた。置換ペプチドの回腸収縮活性とレセプターアフィニティの結果を表２に示す。かかるアッセイの結果、ペプチドＴｒｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＷＰＬＰＲ）が最も強いＣ３ａ活性を示すことがわかった。
【０００８】
【表２】
また、本発明者らは、補体Ｃ３ａの側脳室内投与により、スコポラミン誘発健忘（図３Ａ参照）や、脳虚血による健忘（図３Ｂ参照）が改善されることを見い出したが、前記のように、経口投与では健忘に対して改善効果を示さなかった。そこで、ペプチドＴｒｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＷＰＬＰＲ）等を経口投与した場合におけるスコポラミンや脳虚血により誘発される健忘の改善作用について調べたところ、これらペプチドが優れた健忘症状改善効果を有することを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、一般式Ｘ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ …（Ｉ）（式中、ＸはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐのいずれかを表す。）で示されるペプチドを有効成分として含有することを特徴とする健忘症の予防及び／又は症状改善剤（請求項１）や、一般式（Ｉ）におけるＸがＴｒｐであることを特徴とする請求項１記載の健忘症の予防及び／又は症状改善剤（請求項２）に関する。
【００１１】
また本発明は、一般式Ｘ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ …（Ｉ）（式中、ＸはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐのいずれかを表す。）で示されるペプチドを有効成分として含有することを特徴とする健忘症の予防及び／又は症状改善用食品（請求項３）や、一般式（Ｉ）におけるＸがＴｒｐであることを特徴とする請求項３記載の健忘症の予防及び／又は症状改善用食品（請求項４）に関する。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明の健忘症の予防及び／又は症状改善剤や、健忘症の予防及び／又は症状改善用食品は、配列番号３で示されるＸ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（式中、ＸはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐのいずれかを表す。）で示されるペプチド、好ましくはペプチドＴｒｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを有効成分として含有することを特徴とする。なお、これらアミノ酸はいずれもＬ−体である。また、かかる一般式Ｘ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（式中、ＸはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐのいずれかを表す。）で示されるペプチドは、血中コレステロール上昇抑制作用を示すことが本発明者らにより明らかにされている（特願平１０−１７７９７号）。
【００１３】
一般式Ｘ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（式中、ＸはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐのいずれかを表す。）で示されるペプチドは、どのようにして調製したものでも使用できるが、例えば次のようなペプチド合成法でも調製することができる。ペプチド合成に通常用いられる方法、即ち液相法または固相法でペプチド結合の任意の位置で二分される２種のフラグメントの一方に相当する反応性カルボキシル基を有する原料と、他方のフラグメントに相当する反応性アミノ基を有する原料とをＨＢＴＵ（2-(1H-Benzotriazole-1-y1)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate）等の活性エステルを用いた方法、カルボジイミドを用いた方法等を用いて縮合させ、生成する縮合物が保護基を有する場合、その保護基を除去することによって製造することができる。
【００１４】
この反応工程おいて反応に関与すべきでない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｂｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｐ−ビフェニルイソプロピロオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）等が挙げられる。カルボキシル基の保護としては、例えばアルキルエステル、ベンジルエステル等を形成し得る基が挙げられるが、固相法の場合、Ｃ末端のカルボキシル基はクロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、Ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂等の担体に結合している。縮合反応は、カルボジイミド等の縮合剤の存在下にあるいはＮ−保護アミノ酸活性エステルまたはペプチド活性エステルを用いて実施する。
【００１５】
縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合はさらにペプチドのＣ末端の樹脂との結合を切断する。合成後のペプチドは、例えばイオン交換クロマトグラフィー、逆相液体クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等、通常の方法に従い精製され、エドマン分解法でＣ−末端からアミノ酸配列を読み取るプロテインシークエンサー、ＧＣ−ＭＳ等で分析される。
【００１６】
本発明の一般式Ｘ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（式中、ＸはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐのいずれかを表す。）で示されるペプチド、好ましくはＴｒｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇは、健忘症の予防及び／又は症状改善剤、あるいは健忘症の予防及び／又は症状改善用食品として有用であるばかりでなく、また健忘の作用機作を研究するための医薬品開発のためのリード物質としても用いることができる。以下医薬品や機能性食品として用いる場合について説明する。
【００１７】
本発明で使用するペプチドの投与方法としては、経口投与、非経口投与のいずれでもよいが、経口投与が好ましい。また、投与量は投与方法、患者の症状・年齢等により異なるが、通常１回１〜１０００ｍｇ、好ましくは１０〜３００ｍｇを１日当たり１〜３回投与することが好ましい。そして、経口投与する場合、通常、製剤用担体と混合して調製した製剤の形で投与される。製剤用担体としては、製剤分野において常用され、かつ本発明のペプチドと反応しない物質が用いられ、具体的には、乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン界面活性剤、プロピレングリコール、水等を例示することができる。
【００１８】
また、剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤等を具体的に例示することができ、これらの製剤は常法に従って調製され、特に液体製剤にあっては、用時、水又は他の適当な媒体に溶解又は懸濁する形態とすることもできる。また錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明のペプチドを水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また緩衝剤や保存剤を添加してもよい。これらの製剤は、上記ペプチドを０．１重量％以上、好ましくは０．５〜７０重量％の割合で含有することができる。これらの製剤はまた、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。
【００１９】
本発明の一般式Ｘ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（式中、ＸはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐのいずれかを表す。）で示されるペプチド、好ましくはＴｒｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇは、健忘症の予防及び／又は症状改善用食品素材として、プリン、クッキー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉ソーセージ等の魚肉練り製品や、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、みそ、しょう油、ドレッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、豆腐、こんにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各種総菜へ配合し、機能性食品として摂取することもできる。これらの食品は、上記ペプチドを０．０１重量％以上、好ましくは０．１〜１０重量％の割合で含有することができる。
【００２０】
（実施例）
次に本発明を実施例等により更に具体的に説明するが、本発明はかかる実施例等により限定されるものではない。なお実施例中「％」とあるのは断りのない限り重量％を意味する。
参考例［ペプチドの合成］
市販のＦｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ａ１ｋｏ樹脂（置換率０．５ｍｅｑ／ｇ）０．８ｇをＰＳ３型ペプチド合成機（Protein Technologies社製）の反応槽に分取し、以下のように合成を行った。ここで、Ｐｍｃとは、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン６−スルフォニル基を示す。
【００２１】
まず、上記樹脂を反応容器に入れて、１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｐｒｏと、活性化剤として、１ｍｍｏｌのＨＢＴＵを、０．４ＭのＮ−メチルモルフォリンを含むジメチルフォルムアミドに溶解したものを１０ｍｌ反応槽に加え、室温にて２０分攪拌反応させた。得られた樹脂を２０％のピペリジンを含むメチルフォルムアミド２０ｍｌ中で、Ｆｍｏｃ基を除去処理し、ついで上記のＦｍｏｃ−Ｐｒｏをカップリングさせた方法と同様にＣ末端から順次Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ及びＦｍｏｃ−Ｘ（ＸはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐのいずれかを表す。）をカップルさせて、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）樹脂を得た。該樹脂を１０ｍｌの脱保護液（８２容量％トリフルオロ酢酸、５容量％チオアニソール、３容量％エタンジチオール、２容量％エチルメチルスルフィド、３容量％フェノール、５容量％水）中で室温にて４時間攪拌し、ペプチドを樹脂から遊離させた。
【００２２】
ここに４０ｍｌの冷エーテルを添加し、ペプチドを沈殿させ、さらに冷エーテルにて３回洗浄して粗ペプチドを得た。これをＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ18−ＡＲ，φ２０×２５０ｍｍ）による逆相クロマトグラフィーにより０．１重量％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配にて展開して精製し、Ｘ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（ＸはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐのいずれかを表す。）の配列を有するペプチドを得た。これら５種類のペプチドをプロテインシーケンサー（アプライド バイオシステムズ社製４７７Ａ型）により分析して、それぞれの組成であることを確認した。
【００２３】
実施例
［学習実験］
学習能に対するペプチドの効果を step-through 装置を用いた受動的回避実験により検討した。マウスを明暗２室に分かれた装置の明室に入れると、マウスは暗いところを好むことから暗室に入る。暗室に入ると床から電気ショック（２８−２９Ｖ、５ sec duration）を与えて、暗室が危険なことを教育する。２４時間マウスを再び同じ装置に入れ明暗に止まっている時間を測定する。
【００２４】
訓練試行３０分前にスコポラミン０．１ｍｇ／ｋｇを腹腔内に投与することにより（スコポラミン健忘）、または訓練試行３日前に両側総頚動脈を１０分間遮断すること（脳虚血健忘）によってマウスに健忘を誘発させた。訓練試行直後にペプチドを側脳室内または経口投与し、２４時間後テスト試行を行った。
【００２５】
［抗健忘作用］
スコポラミンは０．１ｍｇ／ｋｇで有意な健忘作用を示したことから、スコポラミン誘発健忘に対するペプチドＷＰＬＰＲの抗健忘作用について検討した。結果を図４に示す。図４から、３０ｎｍｏｌｅ／ｍｏｕｓｅの側脳室内投与（図４Ａ参照）または３００ｍｇ／ｋｇの経口投与（図４Ｂ参照）で、スコポラミン投与によって誘発された健忘に対してペプチドＷＰＬＰＲが有意に改善作用を示すことがわかった。スコポラミンはムスカリン性アセチルコリンレセプターアンタゴニストであること、また補体Ｃ３ａはモルモット回腸アッセイ系においてアセチルコリンの放出を促進することから、ペプチドＷＰＬＰＲの抗健忘作用は脳内Ｃ３ａレセプターによるアセチルコリンの放出によるものと考えられる。
【００２６】
また、脳虚血処置したマウスでは有意な健忘が見られたことから、スコポラミン誘発健忘の場合と同様に、脳虚血誘発健忘に対するペプチドＷＰＬＰＲの抗健忘作用について検討した。結果を図５に示す。図５から、ペプチドＷＰＬＰＲは、６０ｎｍｏｌｅ／ｍｏｕｓｅの側脳室内投与（図５Ａ参照）または３００ｍｇ／ｋｇの経口投与（図５Ｂ参照）で脳虚血健忘をコントロールレベルまで改善した。
【００２７】
【発明の効果】
コメ由来のオリザテンシンを基にして、ペプチドＷＰＬＰＲ等の経口投与で有効なＣ３ａアゴニストをはじめて設計したところ、これらペプチドはスコポラミン健忘及び脳虚血によって誘発した健忘に対して改善効果を示した。このように本発明によると、経口投与あるいは機能性食品素材として摂取しても、健忘症の予防や症状改善作用を有する有用な機能性ペプチドを提供することができる。また、ＷＰＬＰＲ配列を遺伝子の部位指定変異により米アルブミンまたは他のタンパク中に導入することにより経口で有効なＣ３ａ活性を内在するタンパク質を得ることもできる。
【００２８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】補体Ｃ３ａとコメ由来のオリザテンシンとの間のホモロジーを示す図である。
【図２】マウスにおけるペプチドＹＰＬＰＲの鎮痛活性を示す図である。
【図３】補体Ｃ３ａの側脳室内投与による、スコポラミン誘発健忘(Ａ)や脳虚血による健忘(Ｂ)に対する抗健忘作用を示す図である。
【図４】側脳室内投与(Ａ)及び経口投与(Ｂ)によるスコポラミン誘発健忘マウスに対するペプチドＷＰＬＰＲの抗健忘作用を示す図である。
【図５】側脳室内投与(Ａ)及び経口投与(Ｂ)による脳虚血誘発健忘マウスに対するペプチドＷＰＬＰＲの抗健忘作用を示す図である。
Claims (4)
- 下記一般式（Ｉ）で示されるペプチドを有効成分として含有することを特徴とする健忘症の予防及び／又は症状改善剤。
Ｘ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ …（Ｉ）
（式中、ＸはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐのいずれかを表す。） - 一般式（Ｉ）におけるＸがＴｒｐであることを特徴とする請求項１記載の健忘症の予防及び／又は症状改善剤。
- 下記一般式（Ｉ）で示されるペプチドを有効成分として含有することを特徴とする健忘症の予防及び／又は症状改善用食品。
Ｘ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ …（Ｉ）
（式中、ＸはＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐのいずれかを表す。） - 一般式（Ｉ）におけるＸがＴｒｐであることを特徴とする請求項３記載の健忘症の予防及び／又は症状改善用食品。
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