JP3880664B2 - プロリルエンドペプチダーゼ阻害ペプチド - Google Patents
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【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、米蛋白由来のペプチド及び／又はその誘導体を有効成分とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高齢化社会を迎えた現代にとって老人医療の重要性が大きくクローズアップされている。その中でも痴呆症の予防や治療は、本人だけでなく家族や社会を含めた大きな問題となっている。痴呆症の代表的なものには脳血管性痴呆とアルツハイマー型痴呆があり、前者に比べ後者は原因が未だ完全には解明されていない。また、アルツハイマー型痴呆は健忘症とも言われ、短期間の記憶の消失以外には他の運動能力などにあまり障害が現れないため、介護に重い負担がかかり問題となっていて治療法の開発が急務となっている。このようにバックグラウンドや発症機構は未だ不明な点も多いが、治療薬の開発は活発に行われつつあり、臨床試験にまで進んでいるものもある。
【０００３】
プロリルエンドペプチダーゼ（以下、ＰＥＰということもある）（ＥＣ３．４．２１．２６）は、プロリンに特異性を持ち、そのカルボキシル基側でペプチドを切断するセリンプロテアーゼで、脳、睾丸、肝臓での活性が高いことが知られている（蛋白質核酸酵素、２５、５１３−５２３、（１９８０）、蛋白質核酸酵素、２９、１２７−１３３、（１９８４））。ＰＥＰは神経伝達物質サブスタンスＰや記憶に関係していると考えられるＴＨＲ（甲状腺刺激ホルモン）およびバソプレッシンを分解することが知られている。バソプレッシンは腎臓での水分再吸収に働くペプチドホルモンであるが、脳内で学習、記憶の過程にも関与しており、このホルモンの分解不活性化がおこると健忘症が進行するという事実がある。また、痴呆症患者のバソプレッシン量は、正常人のそれより少ないことがわかっている（ＢＩＯＩＮＤＵＳＴＲＹ、４、７８８−７９６、（１９８７））。
【０００４】
バソプレッシンのＰＥＰによる分解は、下記化１に示される。健康人では脳でのＰＥＰが正常に働いているが、何らかの理由で調節機構がはずれるとバソプレッシンが必要以上に分解され、記憶保持に傷害が現れる。したがって、この酵素の活性を阻害し痴呆症の治療をめざす研究がなされている。例えば、プロリルプロリナール誘導体（蛋白質核酸酵素、２９、１２７、（１９８４））、Ｎ−アシルピロリジン誘導体（特開昭６１−３７７６４、特開昭６１−１８３２９７、特開昭６１−２３８７７５、特開昭６１−２３８７９９、特開昭６２−１１４９５７）などがスクリーニングされている。
【０００５】
【化１】
【０００６】
しかし、これらは合成品のため安全性に問題があり、また構造が類似であるため既に構造活性相関が明らかとなっているのが現状である（ＡＢＣ、５５、３７−４３、（１９９１））。このような現状を打破するために、安全でしかも合成阻害剤にないユニークな構造を持った阻害物質が求められている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような業界のニーズに応えるためになされたものであって、特に安全性の高いすぐれたＰＥＰ阻害剤を開発する目的でなされたものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、本発明者らは、天然物質中に副作用のないプロリルエンドペプチダーゼ阻害物質を鋭意検索した結果、米蛋白中に本阻害物質の存在を認め、当該物質がペプチドＡ：Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ、ペプチドＢ：ｐＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、ペプチドＣ：ｐＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇという構造のペプチドであることを見いだし本発明を完成した。
本ペプチドの配列は蛋白質データーベースの検索から米蛋白のグリテリン上にあることが明らかとなった。すなわち、図１に示す、米蛋白グルテリンのアミノ酸配列において、Ａは白抜きの位置に、Ｃは枠で囲んだ位置に、Ｂは網かけの部分に示す位置に存在することが判明した。米は日本人が従来から主食とした食品であり、米に存在するペプチドは安全性からはなんら問題のないものである。
【０００９】
本発明のペプチドは、米蛋白質から得られるが、米蛋白質のほか、米蛋白質含有物質からも得ることができる。米蛋白質含有物質としては、玄米、白米、糠、また、米を原料とする醸造食品（清酒、味りん、味噌、醤油など）のほか、その副産物（糠、粕など）からも得ることができる。
【００１０】
本発明のペプチドは、米蛋白質（含有物質）を分解することによって製造し、酵素分解、化学的分解、物理的分解等既知の蛋白分解法が適宜使用される。酵素分解法はマイルドな条件で行われるので生成ペプチドの変性が低い等の利点があり、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、フイシンといった動植物起源の蛋白質分解酵素のほか、微生物起源の蛋白質分解酵素を用いて処理すればよい。
【００１１】
この場合、清酒等発酵が充分に行われたものを原料とする場合には、蛋白質分解酵素で処理する必要はなく、必要あれば濃縮した後、直ちに抽出工程に入ればよい。また、未処理の米蛋白質のように蛋白質分解が行われていないものを原料としたり、粕や糠といった発酵副産物であって分解が充分に行われていないものを原料とする場合には、酵素処理することが好適である。
【００１２】
本発明のペプチドは、米だけからでなく、その他の穀類、肉類、その他の天然物やその分解物から単離精製することや、加水分解酵素の逆反応を利用したペプチド合成法、遺伝子工学的手法、有機化学的手法でのペプチド合成法により製造することができる。
【００１３】
天然物中からの分離精製は、有姿のままか必要ならば酸、アルカリ、または酵素により分解したものを、必要ならば抽出、濃縮したのち種々の吸着剤に対する吸着親和性の差、種々の溶剤に対する溶解性の差、分子篩効果による溶出速度の差などの通常分離精製に用いられる方法や、それらを適宜組み合わせておこなえばよい。
【００１４】
例えば、米蛋白質から本ペプチドを分離精製するには、液化液による清酒醸造法（今安聰ら：農化，６３，９７１（１９８９））により米から醸造した清酒を、減圧濃縮した濃縮液を原材料とするか、そのときの酒粕を蛋白源とし、それを蛋白分解酵素で分解、濃縮しプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を指標とし、種々のクロマトグラフィー、例えば、ＳＰ−セファデックスＣ−２５（ファルマシア社製）、ＳＰ−トヨパール６５０Ｓ（東ソー社製）によるイオン交換クロマトグラフィー、セファデックスＧ−１５（ファルマシア社製）、トヨパールＨＷ−４０（東ソー社製）によるゲル濾過、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫＣ１８（資生堂製）、ＣｏｓｍｏｓｉｌＣ１８（ナカライテスク社製）などによる逆相クロマトグラフィーなどにより実施することができる。
【００１５】
このようにして得られたペプチドは、後記する実施例からも明らかなように、卓越したＰＥＰ阻害能を有し、しかも天然物由来であって安全であり、現にウィスター系マウス１０匹を用いた１０日間の急性毒性試験においても、１０００ｍｇ／ｋｇの経口投与でも死亡例は認められず、高い安全性が確認された。
したがって、本ペプチドは、ＰＥＰ阻害剤、ヒトの痴呆症の予防、治療剤としてきわめて有用である。
また本発明においては、上記ペプチドのほか、上記ペプチドを基本骨格とし、このペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端から任意のアミノ酸を除いたり、及び／又は、別のアミノ酸等他の物質に置換してなるペプチド誘導体も、上記ペプチドと同様に使用することができる。
【００１６】
上記目的のために、本ペプチドは非経口的又は経口的に投与すればよいが、それらの投与方法に適した形態に製剤することができる。注射剤としての形態は本ペプチドを製薬補助剤（ｐＨ調節剤、等張剤、保存剤など）と共に無菌的に溶解すればよい。経口投与剤は製薬補助剤と共に薬剤の形態（錠剤、カプセル、顆粒剤など）をとれば良い。その他、吸入剤、外用剤としての利用も可能である。また本ペプチドは天然型のアミノ酸のみを含むので安定性が極めて高く、継続的に経口摂取可能であることから、既存の食品に含有させて痴呆症の予防、または治療の機能を持たせた機能性食品、特定保健用食品、栄養剤、または健康食品として食してもよい。
【００１７】
本ペプチドをヒトに対して適用するには、静脈、筋肉、又は経口投与するのが好ましい。本ペプチドの薬学的に有効な投与量は、患者の年令および個人個人の症状等によって異なるが、通常、静脈投与の場合はヒト１人当り１日に本ペプチドを０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ投与し、筋肉投与の場合はヒト１人当り１日に本ペプチドを０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ投与し、経口投与の場合はヒト１人当り１日に本ペプチドを０．５〜２０００ｍｇ／ｋｇ、望ましくは１〜１０００ｍｇ／ｋｇ投与する。
【００１８】
【実施例１】
プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性の測定と阻害ペプチドの精製を次のようにして行った。
【００１９】
１）ＰＥＰ阻害活性測定法
下記表１の手法にしたがい、ＰＥＰの阻害活性を測定した。
【００２０】
【表１】
【００２１】
すなわち、ＰＥＰ（フラボバクテリウム属菌由来）溶液、緩衝液、サンプルを混合した（３０℃、５分間）。次いでジオキサンにとかした合成基質（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｚ−ＮＮａｐ、及び／又はＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＭＣＡ）を加えて、３０℃で１０分間反応させた。そして塩酸を加えた後、ＯＤ４１０ｎｍで吸光度を測定した。
【００２２】
２）ＰＥＰ阻害ペプチドの精製（１）：酒粕起源
液化液による清酒醸造法により米から清酒を醸造したときの酒粕（水分３６％）を１００ｇを２ｌの水に懸濁しペプシン（１：６０，０００、シグマ社製）を４０ｍｇ加え、３７℃、ｐＨ１．５で１時間反応させ、中和した後、沸騰水浴中で１０分間加熱し、反応を停止した。５０００回転１０分間の遠心分離により溶解物を得て凍結乾燥により分解物５．８ｇを得た。次に、０．１％ＴＦＡ含有２０％アセトニトリルで平衡化したフジシリシア製クロマトレックスＯＤＳ（ＤＭ１０２０Ｔ）に、同様のバッファーに溶解した液化粕ペプシン分解物（凍結乾燥品）を吸着させた。その後、アセトニトリル６０％で溶出させた。
【００２３】
吸着画分をＰｒｅｐ Ｎｏｖａ−Ｐａｋ ＨＲＣ１８（６μｍ６０Ａ２５×１００ｍｍ×２）によりＴＦＡ、アセトニトリル系（Ａ：１０％ＣＨ3ＣＮ ｉｎ０．１％ＴＦＡ、Ｂ：６０％ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ０．１％ＴＦＡ ５ｍｌ／ｍｉｎ Ｂ．ｃｏｎｃ ２０−５０％／２０ｍｉｎ）で分画した。
次に、活性画分を更にＳｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＳ ３２０ ２Ｆ２１．５×３００ｍｍにより分画した。（Ａ：ｗａｔｅｒ、Ｂ：ＣＨ3ＣＮ ５ｍｌ／ｍｉｎ Ｂ．ｃｏｎｃ．１０％）
【００２４】
続いてμＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ ５μｍＣ４，１００Ａ １９×１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）により精製を進めた。（Ａ：１０％ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ０．１％ＴＦＡ、Ｂ：６０％ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ０．１％ＴＦＡ ５ｍｌ／ｍｉｎ，Ｂ．ｃｏｎｃ．４０−７０％／２０ｍｉｎ）
ついで、Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ Ｃ１８ ５μｍ，ＡＧ １２０Ａ １５×２５０ｍｍ（Ｓｈｉｓｅｉｄｏ）によって、アルカリ性（Ａ：５％ＣＨ3ＣＮ ｉｎ １０ｍＭ（ＮＨ4）2ＣＯ3，Ｂ：３５％ＣＨ3ＣＮ ｉｎ １０ｍＭ（ＮＨ4）2ＣＯ3 ３ｍｌ／ｍｉｎ，Ｂ．ｃｏｎｃ．２０−８０％／２０ｍｉｎ）における逆相ＨＰＬＣにより精製をおこなった。
最後に先の活性画分をμＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ ５μｍＣ４，１００Ａ １９×１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）により再度分画し（Ａ：１０％ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ０．０２％ＴＦＡ、Ｂ：６０％ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ０．０２％ＴＦＡ ５ｍｌ／ｍｉｎ，Ｂ．ｃｏｎｃ．６０−７０％／２０ｍｉｎ）、阻害物質のピークを単離した。
【００２５】
次に、阻害ペプチドのアミノ酸シーケンスをおこなった。その結果阻害ペプチドの配列は以下のようであった。
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ
【００２６】
３）ＰＥＰ阻害ペプチドの精製（２）：清酒起源
清酒は当社醸造の純米酒（Ｂｅ ＋３．０、アルコール分 １９．４％、酸度１．８０、アミノ酸度 １．８７）を用いた。ＴＦＡを０．１％加えた清酒をフジシリシア製クロマトレックスＯＤＳ（ＤＭ１０２０Ｔ）に直接吸着させ、６０％メタノールで洗浄後、１００％メタノールで溶出させた。吸着画分をＣａｐｃｅｌｌｐａｋ Ｃ １８ ５ｍｍ，ＡＧ １２０オングストローム（溶出条件：１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＣＯ3、アセトニトリル １１−２９％／２０ｍｉｎ、５ｍｌ／ｍｉｎ．）、更にＰｕｒｅｓｉｌ Ｃ １８、（Ｗａｔｅｒｓ）（溶出条件：０．１％ ＴＦＡ、アセトニトリル ２０−３５％／２０ｍｉｎ、５ｍｌ／ｍｉｎ．）、Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＳ ３２０（Ｓｈｏｄｅｘ）（溶出条件：蒸留水、５ｍｌ／ｍｉｎ．）で更に精製した。最後にＤｅｌｔａｐａｋ Ｃ４により（溶出条件：０．０２％ ＴＦＡ、アセトニトリル３０−６０％／２０ｍｉｎ、５ｍｌ／ｍｉｎ．）、２個の阻害ペプチドＢ、Ｃを単離した。
【００２７】
精製したペプチドをアミノ酸シーケンサーにより配列分析をおこなったが、配列を確認することは出来なかった。そこで、本ペプチドのＮ末端アミノ酸は何らかの官能基で保護されていると考え、脱保護を試みた。種々検討の結果、ピログルタミン酸アミノペプチダーゼ処理により、本ペプチドは脱保護され配列分析が可能となった。阻害ペプチドは以下の条件で３７℃で２４時間処理をした（５ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＵ Ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍａｔｅ Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，１００ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）。反応液を凍結乾燥後、Ｎ末端が脱保護されたペプチドを逆相ＨＰＬＣで分取した。脱保護したペプチドを分取した後（それぞれＢ′、Ｃ′）、アミノ酸配列を次のように決定した。Ｂ′：Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｃ′：Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ。
【００２８】
また、確認のためＮ末端保護ペプチドの分子量はレーザー緩衝飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ）島津−ＫＲＯＴＯＳ ＫＯＭＰＡＣＴ ＭＡＬＤＩ III．により測定した。ペプチドＢ、Ｃの分子量（ｍ＋Ｈ）+はＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳによりそれぞれ１６６４、１６６１という値で得られた。ペプチドＢの分子量は配列より得られた、Ｂ′の分子量とピログルタミン酸残基である１１１の和と一致した。これらの関係は、ＣとＣ′の間にも成り立った。従って我々は元のペプチドのアミノ酸配列を以下のように決定した。Ｂ：ｐＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｃ：ｐＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ。
【００２９】
【実施例２】
プロリルエンドペプチダーゼ阻害ペプチドの合成を次のようにして行った。
【００３０】
酒粕から得たペプチドとそのペプチドのＮ末から、Ｌｅｕを１又は２残基除いたペプチドをペプチド合成機（ベガ社製、ペプチカプラー２２００）により合成し、ＨＰＬＣにより精製した。プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を測定した。阻害率は次の式により算出し、得られた結果は、下記表２に示した。
阻害率＝（Ａ−Ｂ）×１００／Ａ
Ａ＝阻害剤を含まない場合の４１０ｎｍ吸収値
Ｂ＝阻害剤を含む場合の４１０ｎｍ吸収値
【００３１】
【表２】
【００３２】
【発明の効果】
本発明によって、すぐれたＰＥＰ阻害剤が得られる。本阻害剤は、ＰＥＰ阻害能にすぐれているだけでなく、天然物由来であってきわめて安全性が高いため、長期間に亘って投与することが可能であり、特に痴呆症の予防、治療に有用である。
【００３３】
また、本発明においては、ペプチドＡ、Ｂ、Ｃにおいて、これらを基本骨格とし、このペプチドのＮ末及び／又はＣ末から任意のアミノ酸を除くか、他の物質に置き換えることによって得られる新規物質も、すぐれたＰＥＰ阻害能を有し、本発明に係るＰＥＰ阻害剤として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】グルテリンのアミノ酸組成を示す。図中、網かけした部分は、ペプチドＡ、枠で囲んだ部分はペプチドＢ、白抜きの部分はペプチドＣをそれぞれ示す。
また、これらの配列において、ａ、ｂ、ｃは、それぞれ次の文献から得たものである。
ａ：ｐＲＥＥ７７，Ｆ．Ｔａｋａｉｗａ，Ｓ．Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｋ．ａｎｄ Ｏｏｎｏ，ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ ２０６， ３３−３５，（１９８６）
ｂ：λＲＧ２１，Ｔ．Ｍａｓｕｍｕｒａ，Ｋ．Ｋｉｄｚｕ，Ｙ．Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｎ．Ｍｉｔｓｕｋａｗａ，Ｔ．Ｈｉｂｉｎｏ，Ｋ．Ｔａｎａｋａ，ａｎｄＳ．Ｆｕｊｉｉ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２，７２３−７２５，（１９８９）
ｃ：ｐＲＥＥ Ｋ１，Ｆ．Ｔａｋａｉｗａ，Ｓ．Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｋ．ａｎｄＯｏｎｏ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７，３２８９，（１９８９）
【発明の属する技術分野】
本発明は、米蛋白由来のペプチド及び／又はその誘導体を有効成分とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
高齢化社会を迎えた現代にとって老人医療の重要性が大きくクローズアップされている。その中でも痴呆症の予防や治療は、本人だけでなく家族や社会を含めた大きな問題となっている。痴呆症の代表的なものには脳血管性痴呆とアルツハイマー型痴呆があり、前者に比べ後者は原因が未だ完全には解明されていない。また、アルツハイマー型痴呆は健忘症とも言われ、短期間の記憶の消失以外には他の運動能力などにあまり障害が現れないため、介護に重い負担がかかり問題となっていて治療法の開発が急務となっている。このようにバックグラウンドや発症機構は未だ不明な点も多いが、治療薬の開発は活発に行われつつあり、臨床試験にまで進んでいるものもある。
【０００３】
プロリルエンドペプチダーゼ（以下、ＰＥＰということもある）（ＥＣ３．４．２１．２６）は、プロリンに特異性を持ち、そのカルボキシル基側でペプチドを切断するセリンプロテアーゼで、脳、睾丸、肝臓での活性が高いことが知られている（蛋白質核酸酵素、２５、５１３−５２３、（１９８０）、蛋白質核酸酵素、２９、１２７−１３３、（１９８４））。ＰＥＰは神経伝達物質サブスタンスＰや記憶に関係していると考えられるＴＨＲ（甲状腺刺激ホルモン）およびバソプレッシンを分解することが知られている。バソプレッシンは腎臓での水分再吸収に働くペプチドホルモンであるが、脳内で学習、記憶の過程にも関与しており、このホルモンの分解不活性化がおこると健忘症が進行するという事実がある。また、痴呆症患者のバソプレッシン量は、正常人のそれより少ないことがわかっている（ＢＩＯＩＮＤＵＳＴＲＹ、４、７８８−７９６、（１９８７））。
【０００４】
バソプレッシンのＰＥＰによる分解は、下記化１に示される。健康人では脳でのＰＥＰが正常に働いているが、何らかの理由で調節機構がはずれるとバソプレッシンが必要以上に分解され、記憶保持に傷害が現れる。したがって、この酵素の活性を阻害し痴呆症の治療をめざす研究がなされている。例えば、プロリルプロリナール誘導体（蛋白質核酸酵素、２９、１２７、（１９８４））、Ｎ−アシルピロリジン誘導体（特開昭６１−３７７６４、特開昭６１−１８３２９７、特開昭６１−２３８７７５、特開昭６１−２３８７９９、特開昭６２−１１４９５７）などがスクリーニングされている。
【０００５】
【化１】
しかし、これらは合成品のため安全性に問題があり、また構造が類似であるため既に構造活性相関が明らかとなっているのが現状である（ＡＢＣ、５５、３７−４３、（１９９１））。このような現状を打破するために、安全でしかも合成阻害剤にないユニークな構造を持った阻害物質が求められている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような業界のニーズに応えるためになされたものであって、特に安全性の高いすぐれたＰＥＰ阻害剤を開発する目的でなされたものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記目的を達成するためになされたものであって、本発明者らは、天然物質中に副作用のないプロリルエンドペプチダーゼ阻害物質を鋭意検索した結果、米蛋白中に本阻害物質の存在を認め、当該物質がペプチドＡ：Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ、ペプチドＢ：ｐＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、ペプチドＣ：ｐＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇという構造のペプチドであることを見いだし本発明を完成した。
本ペプチドの配列は蛋白質データーベースの検索から米蛋白のグリテリン上にあることが明らかとなった。すなわち、図１に示す、米蛋白グルテリンのアミノ酸配列において、Ａは白抜きの位置に、Ｃは枠で囲んだ位置に、Ｂは網かけの部分に示す位置に存在することが判明した。米は日本人が従来から主食とした食品であり、米に存在するペプチドは安全性からはなんら問題のないものである。
【０００９】
本発明のペプチドは、米蛋白質から得られるが、米蛋白質のほか、米蛋白質含有物質からも得ることができる。米蛋白質含有物質としては、玄米、白米、糠、また、米を原料とする醸造食品（清酒、味りん、味噌、醤油など）のほか、その副産物（糠、粕など）からも得ることができる。
【００１０】
本発明のペプチドは、米蛋白質（含有物質）を分解することによって製造し、酵素分解、化学的分解、物理的分解等既知の蛋白分解法が適宜使用される。酵素分解法はマイルドな条件で行われるので生成ペプチドの変性が低い等の利点があり、ペプシン、トリプシン、キモトリプシン、フイシンといった動植物起源の蛋白質分解酵素のほか、微生物起源の蛋白質分解酵素を用いて処理すればよい。
【００１１】
この場合、清酒等発酵が充分に行われたものを原料とする場合には、蛋白質分解酵素で処理する必要はなく、必要あれば濃縮した後、直ちに抽出工程に入ればよい。また、未処理の米蛋白質のように蛋白質分解が行われていないものを原料としたり、粕や糠といった発酵副産物であって分解が充分に行われていないものを原料とする場合には、酵素処理することが好適である。
【００１２】
本発明のペプチドは、米だけからでなく、その他の穀類、肉類、その他の天然物やその分解物から単離精製することや、加水分解酵素の逆反応を利用したペプチド合成法、遺伝子工学的手法、有機化学的手法でのペプチド合成法により製造することができる。
【００１３】
天然物中からの分離精製は、有姿のままか必要ならば酸、アルカリ、または酵素により分解したものを、必要ならば抽出、濃縮したのち種々の吸着剤に対する吸着親和性の差、種々の溶剤に対する溶解性の差、分子篩効果による溶出速度の差などの通常分離精製に用いられる方法や、それらを適宜組み合わせておこなえばよい。
【００１４】
例えば、米蛋白質から本ペプチドを分離精製するには、液化液による清酒醸造法（今安聰ら：農化，６３，９７１（１９８９））により米から醸造した清酒を、減圧濃縮した濃縮液を原材料とするか、そのときの酒粕を蛋白源とし、それを蛋白分解酵素で分解、濃縮しプロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を指標とし、種々のクロマトグラフィー、例えば、ＳＰ−セファデックスＣ−２５（ファルマシア社製）、ＳＰ−トヨパール６５０Ｓ（東ソー社製）によるイオン交換クロマトグラフィー、セファデックスＧ−１５（ファルマシア社製）、トヨパールＨＷ−４０（東ソー社製）によるゲル濾過、ＣＡＰＣＥＬＬ ＰＡＫＣ１８（資生堂製）、ＣｏｓｍｏｓｉｌＣ１８（ナカライテスク社製）などによる逆相クロマトグラフィーなどにより実施することができる。
【００１５】
このようにして得られたペプチドは、後記する実施例からも明らかなように、卓越したＰＥＰ阻害能を有し、しかも天然物由来であって安全であり、現にウィスター系マウス１０匹を用いた１０日間の急性毒性試験においても、１０００ｍｇ／ｋｇの経口投与でも死亡例は認められず、高い安全性が確認された。
したがって、本ペプチドは、ＰＥＰ阻害剤、ヒトの痴呆症の予防、治療剤としてきわめて有用である。
また本発明においては、上記ペプチドのほか、上記ペプチドを基本骨格とし、このペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端から任意のアミノ酸を除いたり、及び／又は、別のアミノ酸等他の物質に置換してなるペプチド誘導体も、上記ペプチドと同様に使用することができる。
【００１６】
上記目的のために、本ペプチドは非経口的又は経口的に投与すればよいが、それらの投与方法に適した形態に製剤することができる。注射剤としての形態は本ペプチドを製薬補助剤（ｐＨ調節剤、等張剤、保存剤など）と共に無菌的に溶解すればよい。経口投与剤は製薬補助剤と共に薬剤の形態（錠剤、カプセル、顆粒剤など）をとれば良い。その他、吸入剤、外用剤としての利用も可能である。また本ペプチドは天然型のアミノ酸のみを含むので安定性が極めて高く、継続的に経口摂取可能であることから、既存の食品に含有させて痴呆症の予防、または治療の機能を持たせた機能性食品、特定保健用食品、栄養剤、または健康食品として食してもよい。
【００１７】
本ペプチドをヒトに対して適用するには、静脈、筋肉、又は経口投与するのが好ましい。本ペプチドの薬学的に有効な投与量は、患者の年令および個人個人の症状等によって異なるが、通常、静脈投与の場合はヒト１人当り１日に本ペプチドを０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ投与し、筋肉投与の場合はヒト１人当り１日に本ペプチドを０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ投与し、経口投与の場合はヒト１人当り１日に本ペプチドを０．５〜２０００ｍｇ／ｋｇ、望ましくは１〜１０００ｍｇ／ｋｇ投与する。
【００１８】
【実施例１】
プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性の測定と阻害ペプチドの精製を次のようにして行った。
【００１９】
１）ＰＥＰ阻害活性測定法
下記表１の手法にしたがい、ＰＥＰの阻害活性を測定した。
【００２０】
【表１】
すなわち、ＰＥＰ（フラボバクテリウム属菌由来）溶液、緩衝液、サンプルを混合した（３０℃、５分間）。次いでジオキサンにとかした合成基質（Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ｐＮＡ、Ｚ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｚ−ＮＮａｐ、及び／又はＺ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ＭＣＡ）を加えて、３０℃で１０分間反応させた。そして塩酸を加えた後、ＯＤ４１０ｎｍで吸光度を測定した。
【００２２】
２）ＰＥＰ阻害ペプチドの精製（１）：酒粕起源
液化液による清酒醸造法により米から清酒を醸造したときの酒粕（水分３６％）を１００ｇを２ｌの水に懸濁しペプシン（１：６０，０００、シグマ社製）を４０ｍｇ加え、３７℃、ｐＨ１．５で１時間反応させ、中和した後、沸騰水浴中で１０分間加熱し、反応を停止した。５０００回転１０分間の遠心分離により溶解物を得て凍結乾燥により分解物５．８ｇを得た。次に、０．１％ＴＦＡ含有２０％アセトニトリルで平衡化したフジシリシア製クロマトレックスＯＤＳ（ＤＭ１０２０Ｔ）に、同様のバッファーに溶解した液化粕ペプシン分解物（凍結乾燥品）を吸着させた。その後、アセトニトリル６０％で溶出させた。
【００２３】
吸着画分をＰｒｅｐ Ｎｏｖａ−Ｐａｋ ＨＲＣ１８（６μｍ６０Ａ２５×１００ｍｍ×２）によりＴＦＡ、アセトニトリル系（Ａ：１０％ＣＨ3ＣＮ ｉｎ０．１％ＴＦＡ、Ｂ：６０％ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ０．１％ＴＦＡ ５ｍｌ／ｍｉｎ Ｂ．ｃｏｎｃ ２０−５０％／２０ｍｉｎ）で分画した。
次に、活性画分を更にＳｈｏｄｅｘ Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＳ ３２０ ２Ｆ２１．５×３００ｍｍにより分画した。（Ａ：ｗａｔｅｒ、Ｂ：ＣＨ3ＣＮ ５ｍｌ／ｍｉｎ Ｂ．ｃｏｎｃ．１０％）
【００２４】
続いてμＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ ５μｍＣ４，１００Ａ １９×１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）により精製を進めた。（Ａ：１０％ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ０．１％ＴＦＡ、Ｂ：６０％ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ０．１％ＴＦＡ ５ｍｌ／ｍｉｎ，Ｂ．ｃｏｎｃ．４０−７０％／２０ｍｉｎ）
ついで、Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ Ｃ１８ ５μｍ，ＡＧ １２０Ａ １５×２５０ｍｍ（Ｓｈｉｓｅｉｄｏ）によって、アルカリ性（Ａ：５％ＣＨ3ＣＮ ｉｎ １０ｍＭ（ＮＨ4）2ＣＯ3，Ｂ：３５％ＣＨ3ＣＮ ｉｎ １０ｍＭ（ＮＨ4）2ＣＯ3 ３ｍｌ／ｍｉｎ，Ｂ．ｃｏｎｃ．２０−８０％／２０ｍｉｎ）における逆相ＨＰＬＣにより精製をおこなった。
最後に先の活性画分をμＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ ５μｍＣ４，１００Ａ １９×１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ）により再度分画し（Ａ：１０％ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ０．０２％ＴＦＡ、Ｂ：６０％ＣＨ3ＣＮ ｉｎ ０．０２％ＴＦＡ ５ｍｌ／ｍｉｎ，Ｂ．ｃｏｎｃ．６０−７０％／２０ｍｉｎ）、阻害物質のピークを単離した。
【００２５】
次に、阻害ペプチドのアミノ酸シーケンスをおこなった。その結果阻害ペプチドの配列は以下のようであった。
Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ａｌａ
【００２６】
３）ＰＥＰ阻害ペプチドの精製（２）：清酒起源
清酒は当社醸造の純米酒（Ｂｅ ＋３．０、アルコール分 １９．４％、酸度１．８０、アミノ酸度 １．８７）を用いた。ＴＦＡを０．１％加えた清酒をフジシリシア製クロマトレックスＯＤＳ（ＤＭ１０２０Ｔ）に直接吸着させ、６０％メタノールで洗浄後、１００％メタノールで溶出させた。吸着画分をＣａｐｃｅｌｌｐａｋ Ｃ １８ ５ｍｍ，ＡＧ １２０オングストローム（溶出条件：１０ｍＭ（ＮＨ4）2ＣＯ3、アセトニトリル １１−２９％／２０ｍｉｎ、５ｍｌ／ｍｉｎ．）、更にＰｕｒｅｓｉｌ Ｃ １８、（Ｗａｔｅｒｓ）（溶出条件：０．１％ ＴＦＡ、アセトニトリル ２０−３５％／２０ｍｉｎ、５ｍｌ／ｍｉｎ．）、Ａｓａｈｉｐａｋ ＧＳ ３２０（Ｓｈｏｄｅｘ）（溶出条件：蒸留水、５ｍｌ／ｍｉｎ．）で更に精製した。最後にＤｅｌｔａｐａｋ Ｃ４により（溶出条件：０．０２％ ＴＦＡ、アセトニトリル３０−６０％／２０ｍｉｎ、５ｍｌ／ｍｉｎ．）、２個の阻害ペプチドＢ、Ｃを単離した。
【００２７】
精製したペプチドをアミノ酸シーケンサーにより配列分析をおこなったが、配列を確認することは出来なかった。そこで、本ペプチドのＮ末端アミノ酸は何らかの官能基で保護されていると考え、脱保護を試みた。種々検討の結果、ピログルタミン酸アミノペプチダーゼ処理により、本ペプチドは脱保護され配列分析が可能となった。阻害ペプチドは以下の条件で３７℃で２４時間処理をした（５ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＵ Ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍａｔｅ Ａｍｉｎｏｐｅｐｔｉｄａｓｅ，１００ｍＭ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ）。反応液を凍結乾燥後、Ｎ末端が脱保護されたペプチドを逆相ＨＰＬＣで分取した。脱保護したペプチドを分取した後（それぞれＢ′、Ｃ′）、アミノ酸配列を次のように決定した。Ｂ′：Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｃ′：Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ。
【００２８】
また、確認のためＮ末端保護ペプチドの分子量はレーザー緩衝飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ）島津−ＫＲＯＴＯＳ ＫＯＭＰＡＣＴ ＭＡＬＤＩ III．により測定した。ペプチドＢ、Ｃの分子量（ｍ＋Ｈ）+はＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳによりそれぞれ１６６４、１６６１という値で得られた。ペプチドＢの分子量は配列より得られた、Ｂ′の分子量とピログルタミン酸残基である１１１の和と一致した。これらの関係は、ＣとＣ′の間にも成り立った。従って我々は元のペプチドのアミノ酸配列を以下のように決定した。Ｂ：ｐＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ、Ｃ：ｐＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ。
【００２９】
【実施例２】
プロリルエンドペプチダーゼ阻害ペプチドの合成を次のようにして行った。
【００３０】
酒粕から得たペプチドとそのペプチドのＮ末から、Ｌｅｕを１又は２残基除いたペプチドをペプチド合成機（ベガ社製、ペプチカプラー２２００）により合成し、ＨＰＬＣにより精製した。プロリルエンドペプチダーゼ阻害活性を測定した。阻害率は次の式により算出し、得られた結果は、下記表２に示した。
阻害率＝（Ａ−Ｂ）×１００／Ａ
Ａ＝阻害剤を含まない場合の４１０ｎｍ吸収値
Ｂ＝阻害剤を含む場合の４１０ｎｍ吸収値
【００３１】
【表２】
【発明の効果】
本発明によって、すぐれたＰＥＰ阻害剤が得られる。本阻害剤は、ＰＥＰ阻害能にすぐれているだけでなく、天然物由来であってきわめて安全性が高いため、長期間に亘って投与することが可能であり、特に痴呆症の予防、治療に有用である。
【００３３】
また、本発明においては、ペプチドＡ、Ｂ、Ｃにおいて、これらを基本骨格とし、このペプチドのＮ末及び／又はＣ末から任意のアミノ酸を除くか、他の物質に置き換えることによって得られる新規物質も、すぐれたＰＥＰ阻害能を有し、本発明に係るＰＥＰ阻害剤として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】グルテリンのアミノ酸組成を示す。図中、網かけした部分は、ペプチドＡ、枠で囲んだ部分はペプチドＢ、白抜きの部分はペプチドＣをそれぞれ示す。
また、これらの配列において、ａ、ｂ、ｃは、それぞれ次の文献から得たものである。
ａ：ｐＲＥＥ７７，Ｆ．Ｔａｋａｉｗａ，Ｓ．Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｋ．ａｎｄ Ｏｏｎｏ，ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ ２０６， ３３−３５，（１９８６）
ｂ：λＲＧ２１，Ｔ．Ｍａｓｕｍｕｒａ，Ｋ．Ｋｉｄｚｕ，Ｙ．Ｓｕｇｉｙａｍａ，Ｎ．Ｍｉｔｓｕｋａｗａ，Ｔ．Ｈｉｂｉｎｏ，Ｋ．Ｔａｎａｋａ，ａｎｄＳ．Ｆｕｊｉｉ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２，７２３−７２５，（１９８９）
ｃ：ｐＲＥＥ Ｋ１，Ｆ．Ｔａｋａｉｗａ，Ｓ．Ｋｉｋｕｃｈｉ，Ｋ．ａｎｄＯｏｎｏ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１７，３２８９，（１９８９）
Claims (4)
- 清酒をクロマトグラフィー処理することにより、下記するプロリルエンドペプチダーゼ阻害ペプチドＢ、及び／又はＣを分離、採取すること、を特徴とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤の製造方法。
（ベプチドＢ）
ｐＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
（ベプチドＣ）
ｐＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ - 下記の配列を有する新規ペプチドＢ及び／又はＣ。
（ペプチドＢ）
ｐＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ
（ペプチドＣ）
ｐＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ - ペプチドＢ： ｐＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを有効成分とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
- ペプチドＣ： ｐＧｌｕ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇを有効成分とするプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤。
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