JP5643624B2

JP5643624B2 - 記憶増強剤および記憶力を増強する方法

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Publication number: JP5643624B2
Application number: JP2010270649A
Authority: JP
Inventors: 吉川　正明; 正明吉川
Original assignee: Nippon Supplement Inc
Current assignee: Nippon Supplement Inc
Priority date: 2010-12-03
Filing date: 2010-12-03
Publication date: 2014-12-17
Anticipated expiration: 2030-12-03
Also published as: JP2012116819A

Description

本発明は、記憶増強剤および記憶力を増強する方法に関する。

近年、高齢化社会の進展とともに高齢化に伴う痴呆症が大きな社会問題となっており、これを治療し、または予防する物質の開発が望まれている。痴呆症を治療し、または予防することが期待される学習促進剤として、本発明者らは、Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｔｙｒで表されるペプチドが有効であることを報告している（特許文献１）。しかし、痴呆症はその病態や発現態様、程度に個人差が大きいため、それらに応じて症状を改善することができる活性物質の開発がさらに求められている。

特開２００６−８５７２号公報

本発明者らは鋭意研究を重ねた結果、Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａで表されるペプチドが、優れた記憶増強作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、記憶増強作用を示すペプチドを含有する記憶増強剤および該記憶増強剤を用いて記憶力を増強する方法を提供することを目的とする。

本発明は、Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａで表されるペプチドを含有することを特徴とする記憶増強剤に関し、さらには、この記憶増強剤を有効成分として含有する機能性食品または栄養補助食品に関する。また、本発明の記憶力を増強する方法は、Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａで表されるペプチドを用いることを特徴としている。

本発明の記憶増強剤は、アミノ酸残基が少なく特殊なアミノ酸も含まれていないため、調製が容易である。にもかかわらず、優れた記憶増強作用を示し、経口投与で有効な記憶増強剤である。

実施例１、２および比較例１におけるＬＲＰＶＡペプチドの腹腔内投与による受動的回避実験の結果を示したグラフであり、＊はｐ＜０．０５の有意差を示す。比較例２〜６におけるＬＲＰペプチドの腹腔内投与による受動的回避実験の結果を示したグラフである。実施例３，４および比較例７におけるＬＲＰＶＡペプチドの経口投与による受動的回避実験の結果を示したグラフであり、＊はｐ＜０．０５の有意差を示す。

本発明のペプチドは、Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａで表されるペプチドである。ここでいうＬｅｕはロイシン、Ａｒｇはアルギニン、Ｐｒｏはプロリン、Ｖａｌはバリン、Ａｌａはアラニンを意味し、これらのアミノ酸はいずれもＬ−体である。このペプチドを、以下ＬＲＰＶＡペプチドという。

ＬＲＰＶＡペプチドは、つぎに説明するようなペプチド合成法で製造することができる。ペプチドの合成は液相法または固相法で行われ、いずれの場合もペプチド結合の任意の位置で二分される２種のフラグメントの一方に相当する反応性カルボキシル基を有する原料と、他方のフラグメントに相当する反応性アミノ基を有する原料とを２−（１Ｈ−Ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ−１−ｙｌ）−１，１，３，３−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｕｒｏｎｉｕｍｈｅｘａｆｌｕｏｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＨＢＴＵ）などの活性エステルを用いた方法またはカルボジイミドを用いた方法などで縮合させる。

この縮合において反応に関与すべきでない官能基は、保護基により保護される。アミノ基の保護基としては、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｂｚ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｐ−ビフェニルイソプロピロオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）などがあげられる。カルボキシル基の保護基としては例えばアルキルエステル、ベンジルエステルなどを形成し得る基があげられるが、固相法の場合は、ペプチドＣ末端のカルボキシル基はクロロトリチル樹脂、クロルメチル樹脂、オキシメチル樹脂、Ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂などの担体に結合している。縮合反応は、カルボジイミドなどの縮合剤の存在下に、Ｎ−保護アミノ酸活性エステルまたはペプチド活性エステルを用いて行う。

縮合反応終了後、保護基は除去されるが、固相法の場合はさらにペプチドのＣ末端と樹脂との結合を切断し、通常の方法に従い精製される。精製方法としては、例えば逆相液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの方法があげられる。

また、ＬＲＰＶＡペプチドは、該ペプチドの配列を含むタンパク質または（ポリ）ペプチドをペプチターゼなどの開裂試剤で切断することによっても製造することができる。

合成したペプチドの分析は、エドマン分解法でＣ−末端からアミノ酸配列を読み取るプロテインシークエンサー、ＬＣ−ＭＳなどの方法で行われる。

本発明の記憶増強剤の投与経路としては、経口投与、血管内投与、直腸内投与のいずれでもよいが、経口投与が好ましい。記憶増強剤のヒトに対する投与量は、投与方法、患者の症状・年令などにより一概に言えないが、通常は１回０.０１〜１０００ｍｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇを１日当たり１〜３回とすることが好ましい。このように、ＬＲＰＶＡペプチドを含有する記憶増強剤を、上述した種々の投与手段によって患者に投与することにより、記憶力を増強する方法が提供される。

記憶増強剤は、通常製剤の形で投与される。製剤に用いられる担体や助剤としては、製剤分野において常用され、かつＬＲＰＶＡペプチドと反応しない物質が用いられる。

具体的には、例えば乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、庶糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン界面活性剤、プロピレングリコールなどがあげられる。

剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、坐剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤、注射剤などがあげられる。これらの製剤は常法に従って調製される。

具体的には、経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分、例えば乳糖、デンプン、結晶セルロース、乳酸カルシウム、無水ケイ酸などとを混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式または乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤および顆粒剤をそのままで、またはステアリン酸マグネシウム、タルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒または錠剤はヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸−メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、またはエチルセルロース、カルナウバロウ、硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤または顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのままで、またはグリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油、オリーブ油などに溶解した後ゼラチン膜で被覆し軟カプセルとすることができる。

経口投与用の液体製剤を製造するには、有効成分と白糖、ソルビトール、グリセリンなどの矯味剤とを水に溶解して透明なシロップ剤、さらに、精油、エタノールなどを加えてエリキシル剤とするか、アラビアゴム、トラガント、ポリソルベート８０、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどを加えて乳剤または懸濁剤としてもよい。また、水に替えて他の適当な媒体に溶解または懸濁する形であってもよい。これらの液体製剤には所望により着色剤、保存剤などを加えてもよい。

血管内投与用の注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウム、ブドウ糖などの等張化剤、緩衝剤、保存剤などと共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、さらにマンニトール、デキストリン、シクロデキストリン、ゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化させて注射剤用乳剤とすることもできる。

直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジおよびモノグリセリド、ポリエチレングリコールなどの坐剤用基材と共に加湿して溶解し型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコール、大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜で被覆すればよい。

さらに、本発明の記憶増強剤を、機能性食品や栄養補助食品（いわゆるサプリメント）の形で投与することもできる。本発明の記憶増強剤は、一般に飲食されている物や調味料などの中に配合することが可能であり、そのような飲食物は通常の方法で製造されるものであって特に限定されるものではない。

これらの製剤や機能性食品、栄養補助食品は、ＬＲＰＶＡペプチドを０．０１重量％以上、さらには０．５〜７０重量％の割合で含有することが好ましい。これらの製剤などはまた、治療上価値のある他の成分を含有していてもよい。

以下、実施例をあげて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。なお、試験群はコントロール群に対して有意水準５％で有意な場合はＰ＜０．０５と表記した。

合成例１〔ＬＲＰＶＡペプチドの合成〕
市販のＦｍｏｃ−Ａｌａ−Ｗａｎｇ樹脂（置換率０．５ｍｅｑ／ｇ）０．６ｇをＰＳ３型ペプチド合成機（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）の反応槽に分取し、以下のようにＬＲＰＶＡペプチドの合成を行った。

まず、上記の樹脂を反応槽に入れて、２０容量％ピペリジンを含むジメチルホルムアミド２０ｍｌ中で該樹脂のＦｍｏｃ基を除去し、１ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｖａｌと、活性化剤として１ｍｍｏｌのＨＢＴＵを１０ｍｌの０．４ＭＮ−メチルモルホリンを含むジメチルホルムアミドに溶解したものを反応槽に加え、室温にて２０分撹拌反応させることにより、該樹脂にＦｍｏｃ−Ｖａｌをカップリングさせた。得られた樹脂をジメチルホルムアミドで洗浄した後、２０容量％ピペリジンを含むジメチルホルムアミド２０ｍｌ中で再びＦｍｏｃ基を除去し、ついで上記のＦｍｏｃ−Ｖａｌをカップリングさせた方法と同様の方法によりＣ末端から順次Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、およびＦｍｏｃ−Ｌｅｕをカップリングさせて、Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ樹脂を得た。該樹脂を１０ｍｌの脱保護液（８２容量％トリフルオロ酢酸、５容量％チオアニソール、３容量％エタンジチオール、２容量％エチルメチルスルフィド、３容量％フェノール、５容量％水の混合液）中で室温にて４時間撹拌し、ペプチドを樹脂から遊離させた。

これに４０ｍｌの冷エーテルを添加し、ペプチドを沈殿させ、さらに冷エーテルにて３回洗浄して粗ペプチドを得た。これをＯＤＳカラム（Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ₁₈−ＡＲII、４．６×１５０ｍｍ）による高速液体クロマトグラフィーにより０．１重量％トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの直線的濃度勾配にて展開、精製し、Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａの配列を有するペプチドを得た。なお、本品をプロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズ社製「４９２型」）により分析して、上記の配列であることを確認した。

合成例２〔ＬＲＰペプチドの合成〕
Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｗａｎｇ樹脂（置換率０．５ｍｅｑ／ｇ）を用いたほかは、基本的に合成例１と同様の方法によりＣ末端から順次Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、およびＦｍｏｃ−Ｌｅｕをカップリングさせて、Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｍｃ）−Ｐｒｏ樹脂を得た後、ペプチドを樹脂から遊離させた。合成例１と同様の方法により得られた粗ペプチドを精製し、Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏの配列を有するペプチド（以下、ＬＲＰペプチドという）を得た。なお、合成例１と同様にプロテインシーケンサーにより分析して、上記の配列であることを確認した。

実施例１〜２および比較例１〜６
上記で得られたペプチドを用いて、以下の方法により学習記憶増強作用に関する試験を行った。

（学習記憶増強作用）
学習記憶能に対する効果を、ステップスルー装置を用いた受動的回避実験により検討した。ｄｄｙマウス（オス、体重２８±１ｇ）を明暗２室に分かれた装置の明室に入れると、マウスは暗いところを好むことから暗室に入る。暗室に入ると床から電気ショック（０．２５ｍＡ，５秒間）を与えて暗室が危険なことを教育する（訓練試行）。訓練試行直後にＬＲＰＶＡペプチドまたはＬＲＰペプチドを図１および図２に示す投与量で腹腔内投与し、２４時間後にテスト試行を行った。すなわちマウスを再び同じ装置に入れ、明室に止まっている時間（秒）を測定することにより、ペプチドの有無におけるマウスの学習記憶能を比較した。結果を図１および図２に示す。

実施例３〜４および比較例７
図３に示す投与量の経口投与で試験を行ったほかは、実施例１と同様の方法により学習記憶増強作用に関する試験を行った。結果を図３に示す。

図１および図３に示されるように、ＬＲＰＶＡペプチドを投与することにより、明室滞在時間は延長され、マウスの学習記憶能が増強されたことがわかる。なお、実施例および比較例においてｎ＝１２であり、６００秒を本実験におけるカットオフ値とした。マンアンドホイットニー（ＭａｎｎａｎｄＷｈｉｔｎｅｙ）法によりＵ検定を行ったところ、ＬＲＰＶＡペプチドを１５０μｇ/ｋｇ腹腔内投与した群（実施例２）は、コントロール群（比較例１）と比べて５％の危険率で有意差が認められた（Ｐ＜０．０５）。また、５０μｇ/ｋｇ投与（実施例１）では有意差はないものの同様の傾向が認められた。１５ｍｇ/ｋｇの経口投与を行った群（実施例４）も、コントロール群（比較例７）と比べて５％の危険率で有意差が認められ（Ｐ＜０．０５）、１．５ｍｇ/ｋｇ投与（実施例３）でも有意差はないものの同様の傾向が認められた。

一方、ＬＲＰペプチドは、図２に示されるように、学習記憶増強作用を有しなかった（比較例２〜６）。ＬＲＰＶＡペプチドが学習記憶増強作用を有する理由は現時点ではわかっておらず、その解明にはさらなる研究が必要である。

本発明の記憶増強剤は、学習記憶増強作用に優れており、痴呆症治療や予防だけでなく、記憶力の改善が必要とされる様々な用途に有用であり、医療用途や、医療用途を除く例えば特定保健用食品に代表される健康食品用として有用である。

Claims

Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａで表されるペプチドを含有することを特徴とする記憶増強剤。
請求項１記載の記憶増強剤を有効成分として含有する機能性食品。
請求項１記載の記憶増強剤を有効成分として含有する栄養補助食品。
Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａで表されるペプチドを用いて記憶力を増強する方法（ヒトを対象とする場合を除く）。