CN105418767A - 一种用于制备Aβ表位疫苗的融合蛋白及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于制备β-淀粉样蛋白肽(Amyloidβ-peptide,Aβ)多价表位疫苗的融合蛋白，它具有三个功能结构域，由N-端的大肠杆菌天门冬酰胺酶II，中部的辅助性T细胞表位多肽，及C-端的Aβ功能B细胞表位多肽组成。基于本发明所提供的融合蛋白制备构建的Aβ多价表位疫苗可以诱导很强的针对Aβ的体液免疫应答反应和细胞免疫应答反应，并且能诱导免疫反应向Th2方向偏移，体现出比传统抗原蛋白更好的有效性和安全性，为基于Aβ的阿尔茨海默病预防与治疗奠定基础。

Description

一种用于制备Aβ表位疫苗的融合蛋白及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种用于制备Aβ多价表位疫苗的重组融合蛋白及其制备方法。更具体地说，本发明提供了一种利用基因工程技术提高Aβ功能B细胞表位免疫原性、优化Aβ疫苗免疫特性的技术方法和应用。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)是一种致死性神经退行性疾病，是老年期痴呆的主要类型。其临床特点是隐袭起病，逐渐出现记忆力衰退、认知功能障碍、行为异常和社交障碍。随病情的进行性加重，患者逐渐丧失独立生活能力，在发病10～20年后因并发症而死亡。罹患AD不但严重影响患者自身的生活质量，而且还给家庭和社会带来沉重负担。随着社会老龄化的加速，AD患病率增加的可能性将达到近流行病的程度，已成为当今公认的医学和社会难题。

由于AD病因复杂、仍未阐明，迄今为止仍然没有成功预防和治愈AD的策略。目前临床应用的药物主要有：胆碱酯酶抑制剂(多奈呱齐、卡巴拉汀、加兰他敏等)、改善脑血流循环和脑细胞代谢的药物(如尼角麦林、吡拉西坦等)、神经保护剂(盐酸美金刚)、非甾体抗炎药、自由基清除剂和抗氧化剂(维生素E、维生素C、司来吉兰、褪黑素、姜黄素、辅酶Q)等。这些药物疗效不高，仅能在一定程度上缓解和改善AD患者的认知、精神行为和功能方面的症状。研究和开发AD防治药物已迫在眉睫。

近年来，β-淀粉样蛋白(Amyloidβ-peptide,Aβ)沉积学说被公认为AD的主要致病机制。Aβ是由39-43个氨基酸残基组成的内源性多肽，由淀粉样跨膜前体蛋白(Amyloidprescursorprotein,APP)依次经蛋白水解酶β和γ裂解得到。Aβ整体疏水，不同分子之间容易以β-折叠的构象相互聚集，形成不溶性纤维，并以此为核心沉积形成致病老年斑(Senileplaques,SP)。在大小不同的Aβ中，C-端包含有多个疏水性氨基酸残基的42肽Aβ(即Aβ₄₂)最易沉积，并通过多种途径损伤神经细胞及神经胶质细胞。减少Aβ₄₂产生、抑制Aβ₄₂聚集、清除脑内Aβ₄₂沉积已成为当前AD防治药物研发的重要策略和发展方向。

1999年Schenk用人工合成的人Aβ₄₂作为免疫原接种转基因AD模型小鼠，在体内成功诱导了针对Aβ₄₂的特异性免疫应答反应，并缓解和改善了模型小鼠的病理状况，开创了AD免疫防治的先河。此后，Elan公司用人Aβ₄₂混合QS21佐剂开发了第一个AD疫苗(AN-1792)。该疫苗的I期临床研究证实：作为自身抗原，人Aβ₄₂亦能诱导人体产生特异的抗Aβ₄₂体液免疫应答，能有效减轻患者脑内的淀粉样沉积，并在一定程度上促进认知的改善和记忆的恢复。然而，其IIa期临床试验的失败则揭示：Aβ₄₂诱导的细胞免疫反应能在部分患者脑内产生具有中枢神经毒性的致敏T细胞。鉴于此，以Aβ为靶标的免疫策略被广泛认为是有效预防和治疗AD的手段；去除Aβ₄₂的T细胞表位，以Aβ₄₂的B细胞表位为基础研究和开发Aβ表位疫苗是AD防治药物发展的重要趋势。

免疫学研究表明，N-端1-15氨基酸残基组成的多肽片段(Aβ_1-15)是Aβ₄₂的功能B细胞表位，能与具有AD防治功能的抗Aβ₄₂抗体发生特异性结合。然而，由于Aβ_1-15是缺乏辅助性T细胞(HelperTcell,Th)表位的小分子内源肽，因此强化其免疫原性并诱导免疫反应向利于体液免疫的Th2方向发展已成为当前Aβ表位疫苗制备和开发的关键技术问题，也是决定Aβ疫苗防治AD有效性和安全性的基础。

发明内容

有鉴于此，为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种用于制备Aβ表位疫苗的融合蛋白，基于此融合蛋白制备构建的Aβ多价表位疫苗可以诱导很强的针对Aβ的体液免疫应答反应和细胞免疫应答反应，并且能诱导免疫反应向Th2方向偏移，体现出比传统抗原蛋白更好的有效性和安全性，为基于Aβ的阿尔茨海默病预防与治疗奠定基础。

本发明具体技术方案如下：

一种用于制备Aβ多价表位疫苗的融合蛋白，所述融合蛋白具有三个功能片段：N-端的功能片段选自天门冬酰胺酶II(EcA)片段，中部的功能片段以及C-端的功能片段分别选自辅助性T细胞表位(ThE)多肽片段和人Aβ的B细胞表位片段中的一种，且中部的功能片段和C-端的功能片段不相同，即该融合蛋白可以是N-端为天门冬酰胺酶II(EcA)片段，中部为辅助性T细胞表位(ThE)多肽片段，C-端的为人Aβ的B细胞表位片段的蛋白，也可以是N-端为天门冬酰胺酶II(EcA)片段，中部为人Aβ的B细胞表位片段，C-端为辅助性T细胞表位(ThE)多肽片段的蛋白。

所述天门冬酰胺酶II片段包括但不限于大肠杆菌来源的天门冬酰胺酶II(EcA)；所述辅助性T细胞表位(ThE)为人工设计的通用型HLA-DR结合(PanHLA-DRbindingepitope,PADRE)多肽，该表位多肽包含但不限于PADRE多肽；所述人Aβ的B细胞表位片段为来源于β-淀粉样蛋白肽(Aβ)N-端1-15氨基酸残基组成的多肽片段(Aβ_1-15)。

优选的，所述天门冬酰胺酶II片段的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，辅助性T细胞表位多肽片段的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，所述人Aβ的B细胞表位片段的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。

本发明所述融合蛋白的N-端的功能片段、中部的功能片段以及C-端的功能片段可以直接相连或者通过连接肽相连。优选的，N-端的功能片段与中部的功能片段通过限制性内切酶直接相连，中部的功能片段与C-端的功能片段通过连接肽相连，优选连接肽的氨基酸序列如SEQIDNO:7所示。

本发明提供的一种优选的融合蛋白氨基酸序列如SEQIDNO:10所示。

本发明还进一步公开了编码本发明所述融合蛋白的基因，具有编码三个功能片段的基因：编码融合蛋白N-端的功能片段的基因选自天门冬酰胺酶II片段的基因，编码中部的功能片段以及C-端的功能片段的基因分别选自编码辅助性T细胞表位多肽片段的基因和编码人Aβ的B细胞表位片段的基因中的一种，且编码中部的功能片段和C-端的功能片段的基因不相同，编码融合蛋白N-端的功能片段的基因、编码中部的功能片段基因以及C-端点功能片段的基因可以直接相连，也可以通过连接肽基因相连。

优选的，所述编码天门冬酰胺酶II片段的基因序列如SEQIDNO:4所示，编码辅助性T细胞表位多肽片段的基因序列如SEQIDNO:5所示，编码人Aβ的B细胞表位片段的基因如SEQIDNO:6所示。

优选的，所述编码融合蛋白N-端的功能片段基因与编码中部的功能片段基因直接相连，编码中部的功能片段基因与编码C-端的功能片段的基因通过连接肽基因相连，所述连接肽基因序列如SEQIDNO:8所示。

优选的，编码本发明所述融合蛋白的基因，核苷酸序列如SEQIDNO:9所示。

本发明还公开了一种表达载体，含有本发明所述融合蛋白的编码基因，优选核苷酸序列如SEQIDNO:9所示，表达如SEQIDNO:10所示的氨基酸序列的融合蛋白。

本发明还公开了制备本发明所述的融合蛋白的方法，包括如下步骤：

(1)设计得到本发明所述的核苷酸序列，SEQIDNO:4-6，SEQIDNO:8-9；

(2)构建含上述的核苷酸序列表达载体并将表达载体转化入宿主细胞，形成可表达本发明所述的融合蛋白的重组细胞；

(3)培养步骤(2)重组细胞；优选采用IPTG在25℃条件下低温诱导所述融合蛋白的高效可溶性表达；

(4)分离纯化得到本发明所述的融合蛋白，优选的，包括将诱导表达后的重组细胞悬浮于非变性融合蛋白提取液中，经裂解后离心分离得到包含可溶性融合蛋白的上清溶液；对上清溶液进行镍离子亲和柱层析分离纯化，以咪唑浓度梯度溶液洗脱层析得到包含融合蛋白的洗脱峰；对上述洗脱峰经分子筛凝胶柱层析进一步纯化四聚体蛋白并除去其中多余盐，冻干保存用于制备Aβ多价表位疫苗的融合蛋白。

本发明的目的还在于提供本发明所述的融合蛋白在制备预防或治疗β-淀粉样蛋白沉积引起的疾病药物中的应用。所述β-淀粉样蛋白沉积引起的疾病包括但不限于阿尔茨海默病、淀粉样血管病等。

本发明的目的还在于提供一种药物组合物，含有本发明所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明通过长期而广泛的研究发现，将大肠杆菌天门冬酰胺酶(EcA)与辅助性T细胞表位(ThE)多肽和人Aβ₄₂功能B细胞表位(Aβ_1-15)多肽融合，可通过表位呈现方式、抗原聚集方式和免疫细胞活化方式的改变，从而可从根本上克服Aβ₄₂功能B细胞表位的免疫耐受，极大提高Aβ疫苗的体液免疫效果，显著诱导免疫反应向利于AD安全、有效防治的Th2方向发展。

Aβ_1-15表位是由人Aβ₄₂分子N-端1～15号氨基酸残基组成的多肽片段，该表位所激发的免疫反应能产生减少脑内Aβ₄₂沉积的特异性功能抗体，并避免具有神经炎性的自身免疫T细胞的产生，以Aβ_1-15为基础开发Aβ表位疫苗是当前国内外AD疫苗的发展趋势。而Aβ_1-15是免疫原性很弱的内源性小分子肽，克服免疫耐受、增强Aβ_1-15免疫原性、促进Th2型免疫反应、提升Aβ_1-15抗体产生是Aβ表位疫苗和AD疫苗开发的关键技术问题。故本发明以Aβ_1-15为功能表位，设计新颖融合蛋白抗原，解决当前Aβ表位疫苗的不足。

天门冬酰胺酶II(L-AspraginaseB,ASE)是一种对肿瘤细胞具有选择性抑制作用的药物，至今已有30多年的临床应用史，对急性淋巴细胞白血病的疗效最好，对急性粒细胞型淋巴细胞、急性单核细胞白血病、恶性淋巴瘤也有一定疗效。临床使用中，ASE显示出一定的免疫原性，会诱导部分反复使用该药的患者产生Th2免疫反应。在分子结构上，ASE是由四个相同亚基聚合形成的自聚化蛋白。大肠杆菌(Escherichiacoli)和欧文氏菌(Erwinia)是药用ASE的主要种属来源，两种来源的ASE理化性质接近、结构类似。大肠杆菌天门冬酰胺酶II(EscherichiacoliL-AspraginaseB,EcA)易于生产、免疫原性强。所以本发明选择EcA作为载体蛋白用于Aβ表位疫苗的制备。

辅助性T细胞表位(ThE)是特异性强化Th细胞活化、增殖和分化的多肽片段，能通过促进B细胞分化为浆细胞而提高B细胞表位的免疫原性，在表位疫苗的制备中广泛应用。当前常用的ThE主要有破伤风毒素Th表位(TetanusToxoidTh-cellepitope,TTe)和人为设计的通用型HLA-DR结合表位(PanHLA-DRbindingepitope,PADRE)等。因此本发明优选了表位PADRE作为空间肽连接EcA和Aβ_1-15，进一步提高Aβ表位免疫原性的同时也使新颖融合蛋白两个功能域之间的空间位阻减到最小程度。

因此，在本发明中，一个优选的方案，所述的用于制备Aβ表位疫苗的融合蛋白将大肠杆菌天门冬酰胺酶II(EcA)置于融合蛋白的N-端，作为疫苗的载体蛋白；将Aβ₄₂功能B细胞表位(Aβ_1-15)置于融合蛋白的C-端，作为疫苗的核心抗原部分；将PADRE表位置于融合蛋白的中部，不仅作为EcA和Aβ_1-15空间连接，同时也可作为疫苗的效应增强元件。

本发明将获得的EcA、PADRE和Aβ_1-15编码基因克隆入质粒，构建表达载体，通过原核或者真核细胞表达获得表达蛋白作为疫苗免疫原。

本发明的融合蛋白可以通过多种方式制备获得，包括但不限于：a)化学合成；b)将目的基因克隆入适当的载体，表达出目的融合蛋白。所述融合蛋白的三个功能片段之间可以是带有连接肽(Linker)的或直接相连接的；优选的，第一部分EcA和第二部分ThE之间可用直接相连，第二部分ThE和第三部分Aβ_1-15用连接肽(Linker)进行连接，在保证了各自功能基团的独立性的同时也有助于形成稳定的空间结构，帮助Aβ_1-15表位有效呈递到融合蛋白四聚分子的表面。

在本发明中，用于克隆入目的基因的载体包括任何原核细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞或昆虫细胞转化用载体，或病毒载体，尤其是各种市售的载体或病毒载体。包括但不限于：pET、pGEX、pcDNA、pVAX、pCI等。

在本发明中，可用于转化所述融合基因的载体的细胞为原核或真核生物细胞，比如E.coli、CHO、HEK293细胞等。

在本发明中，所述的融合蛋白在疫苗中的存在形式包括但不限于以下几类：a)大肠杆菌天门冬酰胺酶II(EcA)-辅助性T细胞表位(PADRE)-Aβ₄₂功能表位(Aβ_1-15)融合蛋白；b)包含大肠杆菌天门冬酰胺酶II(EcA)-辅助性T细胞表位(PADRE)-Aβ₄₂功能表位(Aβ_1-15)融合蛋白编码基因的载体；c)含有b)所述的载体并且可表达所述融合蛋白的细胞。在接种时，可直接给予a)、b)、c)任一所述的存在形式，以及药学上可接受的载体。

在本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应、有合理的效益/风险比的物质。

在本发明中，“药学上可接受的载体”是用于将具有活性的成分传送给动物或人的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或赋性剂。所述的载体可以是液体或固体。

本发明所构建的融合蛋白所制备的Aβ表位疫苗，经皮下注射免疫小鼠的方法，证实其可以突破免疫耐受、强化Aβ_1-15免疫原性，诱导很强的针对Aβ₄₂的特异性体液免疫，并诱导细胞免疫向利于抗体生成的Th2方向偏移，具有比传统疫苗更好的有效性和安全性。

附图说明

图1显示了融合蛋白ETA和EPA的结构模式图。A为融合蛋白ETA的结构模式图；B为融合蛋白EPA的结构模式图。

图2显示了融合蛋白ETA和EPA表达质粒pETA和pEPA的构建示意图。A为表达质粒pETA的结构模式图；B为表达质粒pEPA的结构模式图。

图3显示了表达质粒pETA和pEPA正、反向测序结果的拼接序列。下划线字母表示开放阅读框序列，黑体字表示限制性内切酶NcoI、BamHI和XhoI位点。A为融合蛋白EPA表达载体质粒pEPA测序结果；B为融合蛋白ETA表达载体质粒pETA测序结果。

图4显示了融合蛋白制备结果。A为融合蛋白EPA的表达、提取与分离纯化，M：蛋白质分子量标准，1：诱导表达EPA后的细菌总蛋白，2：细菌裂解上清总蛋白，3：Ni-sepharose^TMHP穿透峰，4-8：分别为20、80、100、300和500mmol/L咪唑洗脱峰；B为融合蛋白ETA的表达、提取与分离纯化。M：蛋白质分子量标准，1：宿主细菌BL21总蛋白，2：诱导表达ETA后的细菌总蛋白,3：细菌裂解上清总蛋白，4：细菌裂解沉淀总蛋白，5：洗涤后的包含体，6：Ni-sepharose^TMHP亲和纯化后的变性包含体蛋白，7：透析复性后的ETA蛋白，8：经过SephacrylS-200纯化后的复性蛋白。

图5显示了融合蛋白EPA的抗原性鉴定结果。A为融合蛋白与小鼠抗组氨酸标签(His·tag)抗体发生抗原-抗体反应的Western-blot检测结果，1：纯化后的融合蛋白EPA，2：纯化后的载体蛋白EP(EcA-PADRE)；B为融合蛋白与小鼠抗Aβ_1-15单克隆抗体(6E10)发生抗原-抗体反应的Western-blot检测结果，1：纯化后的融合蛋白EPA，2：纯化后的载体蛋白EP(EcA-PADRE)。

图6显示了融合蛋白EPA的聚集性鉴定结果。采用Native-PAGE检测，1：纯化后的融合蛋白EPA(上样缓冲液中含SDS和β-ME)，2：纯化后的天然EcA(上样缓冲液中含SDS和β-ME)，3：纯化后的EPA融合蛋白(上样缓冲液中不含SDS和β-ME)，4：纯化后的天然EcA(上样缓冲液中不含SDS和β-ME)。

图7显示了融合蛋白EPA中Aβ_1-15表位的表面可及性鉴定结果。

图8显示了融合蛋白针对Aβ₄₂的体液免疫应答强度的体内鉴定结果。

图9显示了融合蛋白EPA诱导的抗-Aβ₄₂抗体的表位特异性鉴定结果。

图10显示了融合蛋白EPA诱导产生的抗-Aβ₄₂抗体的亚类分布鉴定结果。

图11显示了融合蛋白EPA诱导产生的抗-Aβ₄₂抗体的功能性鉴定结果。A为融合蛋白免疫血清经Aβ₄₂预孵育后与AD模型小鼠脑切片进行的免疫组化检测结果；B为融合蛋白免疫血清与AD模型小鼠脑切片进行的免疫组化检测结果；C为Aβ₄₂标准抗体后与AD模型小鼠脑切片进行的免疫组化检测结果。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，所述的实施例是用于描述本发明的使用和用途，而不是限制本发明。

实施例中采用的质粒、菌种、动物及试剂如下：

质粒、菌种和动物：质粒pET28a(+)和pMD19T-EcA、菌种E.coliDH5α和BL21(DE3)为本实验室保存。4～6周龄雌性C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

试剂：限制性内切酶NcoI、BamHI、XhoI，DNA聚合酶ExTaq、rTaq，dNTP，以及DNA分子量标准购自TaKaRa公司；T4DNA连接酶、蛋白质分子量标准，及预染蛋白质Marker为Fementas公司产品；胰蛋白胨和酵母提取物购自OXOID公司；质粒抽提试剂盒为OMEGA公司产品；PCR产物纯化试剂盒和琼脂糖胶回收试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司；Ni-sepharose^TMHP填料，SephacrylS-200凝胶，以及层析柱为GEHealthcare公司产品；小鼠抗组氨酸标签抗体购自Invitrogen公司；小鼠抗Aβ_1-15单克隆抗体(6E10)为Covance公司产品；HRP标记的羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a^b、IgG2b二抗均购自Pierce公司；Aβ_1-15和Aβ₄₂多肽由上海强耀生物科技有限公司合成并鉴定；其他化学试剂均符合分子生物学实验要求。

实施例1：融合蛋白的设计

本发明所设计的用于制备Aβ表位疫苗的融合蛋白EcA-PADRE-Aβ_1-15(简称EPA)由N-端的大肠杆菌天门冬酰胺酶EcA、中部的辅助性T细胞表位PADRE和C-端的人Aβ₄₂功能B细胞表位Aβ_1-15三个部分构成。其中，第一部分EcA和第二部分PADRE直接相连，第二部分PADRE和第三部分Aβ_1-15中间加Linker连接，以减少空间位阻，利于表位多肽的有效呈现。融合蛋白EPA的结构模式图如图1B所示。

此外，在实施过程中本发明还以来源于破伤风毒素的T辅助表位TTe(氨基酸序列如SEQIDNO:17，基因编码序列如SEQIDNO:18，替换PADRE设计了另一融合蛋白EcA-TTe-Aβ_1-15(简称ETA)，其结构模式图如图1A所示。

实施例2：融合蛋白EPA表达载体的构建和鉴定

1.EcA、PADRE-Aβ_1-15融合基因的扩增

EcA编码基因以质粒pMD19T-EcA为模板，进行PCR扩增，采用的引物(见表1)SEQIDNO:11和SEQIDNO:12，在设计引物的同时引入酶切位点NcoI和BamHI。

PADRE-Aβ_1-15融合基因通过引物直接PCR扩增，首先采用引物(见表1)SEQIDNO:13和SEQIDNO:14互为模板扩增PCR产物，随后又采用引物(见表1)SEQIDNO:15和SEQIDNO:16以回收纯化的上述PCR产物为模板最终扩增PADRE-Aβ_1-15融合基因，在设计引物(见表1)SEQIDNO:15和SEQIDNO:16的同时引入酶切位点BamHI和XhoI，

表1：引物设计

2.融合蛋白表达载体的构建

如图2所示，将EcA编码基因以限制性内切酶切的方式克隆至载体pET-28a(+)的相应位点上，构成质粒pET-EcA，再将PADRE-Aβ_1-15融合基因以限制性内切酶切的方式克隆至质粒pET-EcA的相应位点上，构成质粒pET-EcA-PADRE-Aβ_1-15，简写为质粒pEPA。

具体地，将上述扩增得到的基因产物EcA以胶回收试剂盒回收纯化，并用NcoI和BamHI双酶切，同时将载体pET-28a(+)双酶切，酶切后经电泳回收纯化，以T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于卡那霉素抗性平板，阳性克隆质粒进行酶切及测序鉴定。

经鉴定构建成功的质粒pET-EcA和融合基因PADRE-Aβ_1-15的PCR产物用BamHI和XhoI双酶切，酶切后经电泳回收纯化，以T4连接酶连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于卡那霉素抗性平板，阳性克隆质粒经酶切及测序鉴定，鉴定构建成功的质粒pEPA包含编码新颖融合蛋白EcA-PADRE-Aβ_1-15(简称EPA)的融合基因(SEQIDNO:9)。

pEPA的以T7启动子引物正向测序及以T7终止子引物反向测序的拼接结果如图3A所示。

实施例3：融合蛋白EPA在E.coli中的诱导表达、提取、分离纯化及鉴定

1.融合蛋白在E.coli中的诱导表达

将构建好的包含pEPA质粒的阳性BL21(DE3)菌株接种于含Kan^r的2YT液体培养基(1.6％胰蛋白胨、1％酵母提取物、0.5％NaCl，pH＝7.0)中，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6～1.0时，用浓度为1mmol/L的IPTG于25℃诱导培养14h。取1mL菌液离心收集菌体，并将菌体重悬于蛋白质电泳上样缓冲液中，煮沸5min后进行SDS-PAGE检测，然后用考马斯亮兰R-250染色观察目的，结果(如图4A所示)分子量约为42kDa的融合蛋白(理论分子量为41657.79Da)成功表达。

2.融合蛋白的提取与分离纯化

收集诱导表达后的菌液，于4℃条件下4000r/min离心15min收集菌体，按10mL/g将菌体重悬于pH＝7.4的PBS缓冲液中，洗菌体1次，8000r/min离心10min收集菌体，按8mL/g将菌体重悬于含20mmol/L咪唑的pH＝7.4PBS缓冲液中，加入80μg/mL的溶菌酶在于冰上温和消化1h后冰浴中超声破菌。超声条件为：功率200W，超声时间30s，间隔时间60s，全程工作时间为30min。超声裂解液在4℃条件下12000r/min离心30min，收集上清液。经0.45μm滤膜过滤后以1ml/min的流速上样Ni-Sepharose^TMHP亲和层析柱，上样结束并充分洗涤后，用含梯度浓度(80、100、300、500mmol/L)咪唑的pH＝7.4PBS缓冲液阶段洗脱层析柱。收集各洗脱峰，SDS-PAGE分析纯化蛋白，结果(如图4A)显示目的融合蛋白在非变性的生理条件下能够牢固结合到Ni亲和介质上，仅被高浓度(≥100mmol/L)的咪唑特异性竞争洗脱，薄层灰度扫描结果显示纯化后的融合蛋白纯度均大于95％。合并含高纯度融合蛋白的洗脱峰(100、300和500mmol/L)，经SephacrylS-200凝胶柱层析纯化四聚体蛋白并脱盐处理后，以BCA法测定融合蛋白含量，并保存备用。

3.融合蛋白的纯度分析和亚基分子量鉴定

将上述制备所得的融合蛋白进行SDS-PAGE分析(如图4A所示)，薄层灰度扫描结果显示纯化后的融合蛋白纯度为97.3％，单亚基的相对分子量约为42kDa。

4.融合蛋白的抗原性鉴定

将上述制备所得的融合蛋白进行SDS-PAGE后的凝胶用半干法转印至PVDF膜上，37℃封闭2h，分别加入小鼠抗组氨酸标签抗体和小鼠抗Aβ_1-15单克隆抗体(6E10)于37℃孵育2h，洗膜后加HRP标记的羊抗小鼠IgG37℃温育1h，洗去二抗后用化学发光底物检测两种一抗与融合蛋白的反应情况。结果显示(如图5)，融合蛋白既能够与抗组氨酸标签抗体和抗Aβ_1-15表位抗体特异性识别、结合，表明融合蛋白不仅化学结构(氨基酸顺序)正确，并且很好的保留了其C-端抗原表位的免疫学性质，保证了其用于表位疫苗开发和应用的可行性。

5.融合蛋白的聚集性鉴定

将上述制备所得的融合蛋白进行Native-PAGE分析(如图6所示)，结果融合蛋白与天然EcA具有相似的四亚基聚集特征，变性和还原处理(处理样品时加入SDS和β巯基乙醇)后的融合蛋白以分子量较小的单亚基形式存在，非变性和非还原处理(处理样品时不加入SDS和β巯基乙醇)的融合蛋白以分子量较大的四亚基形式存在。表明融合蛋白能够以同源四聚体的形式存在，有利于增加融合蛋白中Aβ_1-15表位的递呈价数、提高Aβ_1-15表位的免疫原性。

6.融合蛋白的Aβ_1-15表位可及性鉴定

将上述制备所得的融合蛋白用pH＝7.4的PBS缓冲液配制成梯度浓度(0-20480ng/mL)溶液，并分别与固定浓度的小鼠抗Aβ_1-15单克隆抗体(6E10)混合，37℃温育1h后加入到预先包被有人Aβ₄₂的96孔酶标板中，37℃孵育2h，洗板后加HRP标记的羊抗小鼠IgG37℃温育1h，洗去二抗后用TMB底物检测抗原-抗体反应。结果(如图7)显示，在生理溶液中游离的融合蛋白能够与人Aβ₄₂竞争结合小鼠抗Aβ_1-15单克隆抗体，表明以四价形式融合在融合蛋白C-端的Aβ_1-15具有良好的空间可及性，利于免疫分子或细胞的识别、结合。

实施例4：融合蛋白ETA表达载体的构建以及在E.coli中的诱导表达、提取及分离纯化

1.融合蛋白ETA表达载体的构建

融合蛋白ETA表达载体的构建参照实施例2的方法实施(如图2B)。DNA测序结果(如图3B)表明，表达载体pETA构建成功，其中包含编码参比融合蛋白EcA-TTe-Aβ_1-15(简称ETA)的融合基因(SEQIDNO:20)。pETA能在T7启动子的指导下诱导表达ETA融合蛋白(SEQIDNO:19)。

2.融合蛋白ETA在E.coli中的诱导表达

融合蛋白ETA在E.coli中的诱导表达参照实施例3中1-2的方法实施。结果(如图4B所示)显示：分子量约为44kDa的融合蛋白ETA(理论分子量为43208.59Da)成功表达，但绝大多数以错误折叠的不溶性包涵体形式表达(图4B)。

3.融合蛋白ETA的提取、分离纯化及复性

收集诱导表达后的菌液，于4℃条件下4000r/min离心15min收集菌体，按10mL/g将菌体重悬于pH＝7.4的PBS缓冲液中，洗菌体1次，8000r/min离心10min收集菌体，按8mL/g将菌体重悬于含1mmol/LEDTA的Tris-HCl缓冲液(pH＝8.5)中，加入1mg/mL的溶菌酶在于冰上温和消化1h后冰浴中超声破菌。超声条件为：功率200W，超声时间30s，间隔时间60s，全程工作时间为30min。超声裂解液在4℃条件下12000r/min离心30min，收集包涵体沉淀。经1％脱氧胆酸钠和去离子水分别洗涤两次后，将干净的包涵体溶解于含8M尿素的Tris-HCl(pH＝8.5)缓冲液中充分溶解。在4℃条件下12000r/min离心30min，收集上清液，经0.45μm滤膜过滤后以1ml/min的流速上样Ni-Sepharose^TMHP亲和层析柱，上样结束并充分洗涤后，用咪唑梯度浓度(80、100、300、500mmol/L)阶段洗脱层析柱。收集包含目的融合蛋白的洗脱峰，并采用尿素梯度(8→0M)透析法复性融合蛋白。最后经分子筛凝胶柱层析(SephacrylS-200)纯化复性蛋白，收集洗脱峰，SDS-PAGE分析纯化蛋白。结果(如图4B)显示目的纯化后的复性融合蛋白纯度均大于95％。比较融合蛋白EPA，由于ETA多以无生物活性的包涵体形式表达，在纯化制备和生物活性等方面不及本发明公布的目标融合蛋白EPA。

实施例5：融合蛋白的免疫接种

用无菌生理盐水配制融合蛋白溶液，与佐剂等体积混合后，皮下多点注射5～6周龄的C57BL/6雌性小鼠，一次接种量为100μL(含100μg的融合蛋白)，共接种4次，两次接种之间间隔2周，并于首次接种前1周及每次接种后1周眼眶取血，分离血清，-20℃保存，供抗体及其它生化检测。

实施例6：融合蛋白EPA可以诱导较强的体液免疫应答

1.融合蛋白诱导的抗体水平检测

采用常规ELISA检测免疫小鼠血清中抗Aβ₄₂特异性抗体水平。具体地说，以人工合成并鉴定正确的人Aβ₄₂(2μg/mL，100μL/孔)包被96孔酶标板，4℃过夜；用PBST(pH＝7.4，0.05％Tween-20)洗板三次，加入封闭液(含3％BSA的PBST)于37℃孵育1h；用PBST洗涤三次后，将以封闭液适当稀释的小鼠血清加入孔中，37℃作用1h；三次洗板后加入HPR标记的羊抗小鼠IgG于37℃孵育1h；用PBST和去离子水分别洗涤三次，加入TMB避光显色，1mol/LH₂SO₄终止反应，于酶标仪检测450nm吸光值OD450。同时，以商品化的小鼠抗Aβ_1-15单克隆抗体(6E10)为标准一抗，绘制“OD₄₅₀-抗体浓度”标准曲线，进而定量计算小鼠血清中抗Aβ₄₂特异性抗体的含量(μg/mL)。结果(如图8)显示融合蛋白EPA免疫组同Aβ₄₂免疫组一样，可以诱导小鼠产生强烈的抗Aβ₄₂体液免疫应答反应，随着免疫次数的增加血清中特异性抗体的水平稳步上升，在第四次免疫后达到34.46μg/mL，显著提高了Aβ_1-15表位的免疫原性(*p<0.05)。相比较，ETA免疫组产生的抗Aβ₄₂体液免疫应答相应显著低于本发明所公布的融合蛋白EPA。

2.融合蛋白EPA诱导的抗体特异性鉴定

采用竞争ELISA检测小鼠血清中抗体的特异性。简单地说，将人工合成的Aβ_1-15表位多肽上述封闭液配制成梯度浓度(0-20μg/mL)溶液，并分别与融合蛋白四次免疫后的小鼠血清重复混合，37℃温育1h后加入到包被有Aβ₄₂的96孔酶标板；随后用HPR标记的羊抗小鼠IgG为二抗、TMB-H₂SO₄为显色系统检测Aβ_1-15表位多肽对融合蛋白免疫血清与Aβ₄₂结合的竞争效力。结果(如图9)显示，随着游离型Aβ_1-15表位多肽含量的增加，融合蛋白免疫血清与Aβ₄₂抗原结合的能力不断降低，呈现出显著的“浓度-竞争效力”关系，表明融合蛋白诱导产生的抗Aβ₄₂抗体特异性的针对与功能表位Aβ_1-15。

实施例7：融合蛋白EPA诱导的Th免疫反应检测

同样采用上述常规ELISA检测小鼠血清中抗Aβ₄₂特异性抗体的IgG亚类分布。特别地，作为一抗加入的小鼠血清选用第4次免疫后1周收集样本，二抗则分别加入HRP标记的羊抗小鼠IgG1、IgG2a^b、IgG2b和IgG3抗体，通过计算OD450比值比较各组小鼠血清中IgG1亚类含量与IgG2a含量的比值(IgG1/IgG2a^b)。结果(如图10)显示融合蛋白能够诱导小鼠产生的抗Aβ₄₂抗体主要以IgG1的亚类形式存在，其IgG1/IgG2a^b比值高达6.045，较Aβ₄₂免疫组(IgG1/IgG2a^b＝0.707)有极显著性提高(**p<0.01)。

实施例8：融合蛋白EPA诱导的抗体功能性研究

APP/PS1转基因AD模型小鼠的脑切片被用于评价融合蛋白诱导产生的抗Aβ₄₂抗体的功能性。简单来讲，将AD模型小鼠大脑切片经90％甲酸和0.5％H₂O₂预处理后分别与融合蛋白免疫组血清、PBS免疫组血清(阴性对照)和Aβ₄₂抗体6E10(阳性对照)孵育，最后经苏木精染色后用显微镜观察淀粉样板块染色情况。结果(如图11)显示，融合蛋白免疫组小鼠血清与对照抗体(6E10)一样能够与AD模型小鼠脑内的重要病理特征——老年斑特异性结合，显示出通过干预Aβ沉积途径干预AD病程的应用可行性。

Claims (11)

1.一种用于制备Aβ多价表位疫苗的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白具有三个功能片段：N-端的功能片段选自天门冬酰胺酶II片段，中部的功能片段以及C-端的功能片段选自辅助性T细胞表位多肽片段和人Aβ的B细胞表位片段中的一种，且中部的功能片段和C-端的功能片段不相同，所述N-端的功能片段、中部的功能片段以及C-端的功能片段可以直接相连或者通过连接肽相连，所述天门冬酰胺酶II片段包括但不限于大肠杆菌来源的天门冬酰胺酶II；所述辅助性T细胞表位为人工设计的通用型HLA-DR结合多肽；所述人Aβ的B细胞表位片段为来源于β-淀粉样蛋白肽N-端1-15氨基酸残基组成的多肽片段。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述天门冬酰胺酶II片段的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，辅助性T细胞表位多肽片段的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，所述人Aβ的B细胞表位片段的氨基酸序列如SEQIDNO:3所示。

3.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述N-端的功能片段与中部的功能片段直接相连，中部的功能片段与C-端的功能片段通过连接肽相连，所述连接肽氨基酸序列如SEQIDNO:7所示。

4.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白氨基酸序列如SEQIDNO:9所示。

5.编码如权利要求1所述融合蛋白的基因，其特征在于具有编码三个功能片段的基因：编码融合蛋白N-端的功能片段的基因选自天门冬酰胺酶II片段的基因，编码中部的功能片段以及C-端的功能片段的基因选自编码辅助性T细胞表位多肽片段的基因和编码人Aβ的B细胞表位片段的基因中的一种，且编码中部的功能片段以及C-端的功能片段的基因不相同，编码融合蛋白N-端的功能片段的基因、编码中部的功能片段基因以及C-端点功能片段的基因可以直接相连，也可以通过连接肽基因相连。

6.根据权利要求5所述的融合蛋白的基因，其特征在于所述编码天门冬酰胺酶II片段的基因序列如SEQIDNO:4所示，编码辅助性T细胞表位多肽片段的基因序列如SEQIDNO:5所示，编码人Aβ的B细胞表位片段的基因如SEQIDNO:6所示。

7.根据权利要求6所述的融合蛋白的基因，其特征在于所述编码融合蛋白N-端的功能片段基因与编码中部的功能片段基因直接相连，编码中部的功能片段基因与编码C-端的功能片段的基因通过连接肽基因相连，所述连接肽基因序列如SEQIDNO:8所示。

8.编码如权利要求4所述融合蛋白的基因，其特征在于所述核苷酸序列如SEQIDNO:10所示。

9.制备权利1-4任一项所述的融合蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)设计得到如权利要求5-8任一项所述的核苷酸序列；

(2)构建含如权利要求5-8任一项所述的核苷酸序列表达载体，并将表达载体转化入宿主细胞，形成可表达如权利要求1-4任一项所述的融合蛋白的重组细胞；

(3)培养步骤(2)重组细胞；

(4)分离纯化得到如权利要求1-4任一项所述的融合蛋白。

10.根据权利要求1-4任一项所述的融合蛋白在制备预防或治疗β-淀粉样蛋白沉积引起的疾病药物中的应用。

11.一种药物组合物，其特征在于含有根据权利要求1-4任一项所述的融合蛋白以及药学上可接受的载体或赋形剂。