WO2020230869A1 - Ｐａｃａｐペプチド又はｐａｃａｐの安定化ペプチドを含む神経栄養性角膜炎の予防又は治療用組成物 - Google Patents

Ｐａｃａｐペプチド又はｐａｃａｐの安定化ペプチドを含む神経栄養性角膜炎の予防又は治療用組成物 Download PDF

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sequence
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amino acid
prophylactic
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毅 中嶋
麻実子 町田
脩平 山田
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千寿製薬株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for preventing or treating neurotrophic keratitis, which comprises a stabilizing peptide having a physiological activity of PACAP.
  • Corneal perception is important to prevent damage through the blink reflex and tear reflex and is controlled by the corneal nerve.
  • the corneal nerve not only mediates sensory, but also affects the corneal epithelial cell proliferation through the secretion of nerve mediators released from the corneal nerve endings and nerve growth factor. There is. It is known that when the corneal nerve is damaged, the metabolism of corneal epithelial cells is altered, proliferativeness is impaired, and malnutrition ulcers are caused.
  • Neurotrophic keratitis and neuroparalytic keratitis are degenerative corneal diseases caused by damage to the trigeminal nerve and cause damage to the corneal epithelium. The most severe form may result in corneal ulceration, melting and perforation, impairing the patient's visibility.
  • neurotrophic keratitis A variety of clinical conditions can cause neurotrophic keratitis, including viral infections such as herpes on the cornea, eye trauma, corneal surgery, and systemic symptoms such as diabetes. In particular, herpes infections have been reported to account for 27% of neurotrophic keratitis. Although the existence of neurotrophic keratitis has been known for a long time, no effective treatment method has been developed yet.
  • PACAP The pituitary adenylate cyclase activated polypeptide (PACAP) is a neuropeptide found in a sheep hypothalamic extract.
  • PACAP may have the activity of stimulating cAMP formation in anterior pituitary cells.
  • PACAP38 composed of 38 amino acid residues
  • PACAP27 composed of 27 amino acid residues exist, and both have the same action (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • PACAP belongs to the vasoactive intestinal polypeptide (VIP) / secretin / glucagon superfamily, and the sequence of human PACAP27 has 68% identity with the vasoactive intestinal polypeptide (VIP).
  • PACAP and VIP bind to the PAC1 receptor (PAC1R), VPAC1 receptor (VPAC1R) and VPAC2 receptor (VPAC2R), but differ in their affinity for these receptors.
  • PAC1R binds to PACAP with high selectivity, and its affinity for PACAP is more than 1000 times higher than that for VIP.
  • both VPAC1R and VPAC2R have similar affinities for PACAP and VIP.
  • PACAP has various physiological actions, and has physiological actions as a neuroprotective substance, an immunosuppressive factor, a vasodilator factor, an exocrine gland secretion promoting factor (Patent Document 3), and a neurite formation promoting factor (Patent Document 4). Is known to have.
  • PACAP protein astyrene-maleic anhydride
  • An object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating neurotrophic keratitis.
  • the present inventors have found that the PACAP peptide or its stabilizing peptide exerts an inhibitory effect on corneal injury in a neurotrophic keratitis model and promotes nerve axon elongation in a cultured neuronal cell model. It led to the invention. Furthermore, as a stabilizing peptide, we have found that the stability in an aqueous solution can be significantly enhanced by substituting the carboxy group of aspartic acid present in the PACAP peptide with tetrazole.
  • the present invention relates to the following: [1-1] Below: HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK (SEQ ID NO: 1), or HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL (SEQ ID NO: 2)
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating neurotrophic keratitis which comprises a peptide consisting of the sequence represented by, or a stabilized sequence thereof.
  • a peptide for use in the prevention or treatment of neurotrophic keratitis which is as follows: HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK (SEQ ID NO: 1), or HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL (SEQ ID NO: 2)
  • SEQ ID NO: 1 HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL
  • SEQ ID NO: 2 A peptide consisting of a sequence represented by or a stabilized sequence thereof.
  • a method for preventing or treating neurotrophic keratitis which is as follows: HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK (SEQ ID NO: 1), or HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL (SEQ ID NO: 2)
  • the method comprising administering to a subject in need of treatment or prevention of neurotrophic keratitis a peptide consisting of the sequence represented by, or a stabilizing sequence thereof.
  • HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK SEQ ID NO: 1
  • HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL SEQ ID NO: 2
  • the peptide consisting of the stabilized sequence is a sequence in which the carboxy group of the aspartic acid residue at the 3-position and / or 8-position is replaced with tetrazole in the sequence of SEQ ID NO: 1 or 2, or one of the sequences.
  • the peptide consisting of the stabilized sequence has binding property to PAC1R, VPAC1R and VPACR2.
  • the peptide consisting of the stabilized sequence has the following formula: HX 1 -DGIFTDX 2 -YX 3 -RYRX 4 -X 5 -X 6 -AX 7 -X 8 -X 9 -YLAAVX 10 (SEQ ID NO: 3) ⁇
  • X 1 is a neutral amino acid
  • X 2 is a neutral amino acid
  • X 3 is a neutral amino acid
  • X 4 is a basic amino acid
  • X 5 is a neutral amino acid or egTz
  • X 6 is a non-polar amino acid
  • X 8 is a basic amino acid
  • X 9 is a basic amino acid
  • X 10 is a neutral amino acid ⁇
  • the carboxy group of the aspartic acid residue at the 3-position and / or 8-position is a peptide consisting of a sequence substituted with tetrazole or a modified sequence thereof, and the
  • GKRYKQRVKNK SEQ ID NO: 37
  • GKRYKQRVKN SEQ ID NO: 38
  • GKRYKQRVK SEQ ID NO: 39
  • GKRYKQRV SEQ ID NO: 40
  • GKRYKQR SEQ ID NO: 41
  • GKRYKQ SEQ ID NO: 42
  • GKRYK SEQ ID NO: 43
  • GKRY SEQ ID NO: 44
  • GKR; GRR; GK; and GR G The prophylactic or therapeutic composition, peptide, method, or use according to any one of items 3 to 13, wherein one sequence selected from the group consisting of is added to the C-terminus of the peptide.
  • HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK SEQ ID NO: 1
  • HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL SEQ ID NO: 2
  • HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK SEQ ID NO: 1
  • HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL SEQ ID NO: 2
  • a method for promoting nerve axon elongation which comprises administering a peptide consisting of the sequence represented by, or a stabilizing sequence thereof, to a subject in need of promoting nerve axon elongation.
  • HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK SEQ ID NO: 1
  • HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL SEQ ID NO: 2
  • HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK SEQ ID NO: 1
  • HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL SEQ ID NO: 2
  • [17-1] A composition for treating nerve injury or for nerve regeneration, which comprises the nerve axon elongation promoter according to item 15-1 or 16.
  • [17-2] A method of treating a nerve injury or regenerating a nerve by the method of item 15-2 or 16.
  • [17-3] The use according to item [15-3], wherein the nerve axon elongation promoter is used for nerve injury treatment or nerve regeneration.
  • [18] A method of promoting nerve axon elongation in vitro or in vivo, wherein: HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK (SEQ ID NO: 1), or HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL (SEQ ID NO: 2)
  • the method for promoting nerve axon elongation in vitro according to item [18], which comprises culturing nerve cells in a culture medium supplemented with the peptide.
  • PACAP or stabilized PACAP can be used for the prevention or treatment of neurotrophic keratitis, or for the promotion of nerve axon elongation.
  • FIG. 1 shows the cAMP-inducing action of each peptide (peptides 1, 2, 6 to 9) in a PAC1R high-expressing cell line.
  • FIG. 2 shows the cAMP-inducing action of each peptide (peptides 1, 2, 6 to 9) in the VPAC1R high expression cell line.
  • FIG. 3 shows the tear secretion promoting action of each peptide (peptide 1 and peptide 9) in a neurotrophic keratitis model rat.
  • FIG. 4 shows the change in the score of corneal punctate superficial inflammation (SPK) by each peptide (peptide 1 and peptide 9) in a neurotrophic keratitis model rat.
  • FIG. 5 shows the effect of each peptide on promoting axon elongation in the cultured trigeminal nerve.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment or prevention of neurotrophic keratitis, which comprises a PACAP peptide or a stabilized PACAP peptide.
  • the invention relates to a nerve axon elongation promoter comprising a PACAP peptide or a stabilized PACAP peptide.
  • the invention relates to a method of promoting nerve axon outgrowth in vitro or in vivo, comprising applying a PACAP peptide or a stabilized PACAP peptide.
  • Stabilized PACAP peptide refers to a peptide in which amino acids have been modified to enhance stability while maintaining the physiological activity of PACAP.
  • the stabilized PACAP peptide is a sequence in which the carboxy group of the aspartic acid residue at the 3-position and / or 8-position is replaced with tetrazole in the amino acid sequence of the PACAP peptide, or a sequence in which a part of the sequence is modified.
  • the stabilized PACAP peptide according to the present invention has similar binding to PAC1R, VPAC1R, and / or VPAC2R as compared to PACAP.
  • the EC50 value of the peptide to each receptor may be 10 times or less, preferably 5 times or less, and more preferably 3 times or less as compared with PACAP.
  • the PACAP may be either PACAP38 consisting of 38 residues or PACAP27 consisting of 27 residues.
  • PACAP38 and PACAP27 have the following sequences:
  • a sequence in which a part of the sequence is modified means a sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, or added to the original sequence. More preferably, a partially modified sequence is a sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, or added to the original sequence.
  • Amino acid substitutions can occur anywhere as long as the binding of the peptide consisting of a partially modified sequence to PAC1R, VPAC1R, and / or VPAC2R is not altered.
  • a peptide consisting of a partially modified sequence from the viewpoint of maintaining binding, PACAP27 at positions 2, 9, 11, 15 to 17, 19 to 21, and 27.
  • amino acid substitutions can occur.
  • the following sequence HX 1 -DGIFTDX 2 -YX 3 -RYRX 4 -X 5 -X 6 -AX 7 -X 8 -X 9 -YLAAVX 10 (SEQ ID NO: 3)
  • the amino acids at the positions indicated by X 1 to X 10 can be replaced.
  • the amino acid substitution may be carried out by substituting one or more amino acids, but from the viewpoint of maintaining activity, any number from 1 to 10, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10 amino acids can be substituted. Of these, substitutions of 1 to 4 amino acids are particularly preferred, more preferably 3 amino acids are substituted, even more preferably 2 amino acids are substituted, and particularly preferably 1 amino acid is substituted.
  • Amino acid deletions can occur anywhere as long as the binding of the peptide consisting of a partially modified sequence to PAC1R, VPAC1R, and / or VPAC2R is not altered.
  • the number of amino acids deleted is chosen from any number from 1 to 10, for example 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10. Deletion of one or two amino acids is particularly preferred from the perspective of not altering binding.
  • Amino acid deletions may be deleted from the N-terminal side or C-terminal side of the original sequence, or from the inside of the sequence.
  • PACAP27 and PACAP38 have equivalent binding properties to PAC1R, VPAC1R, and / or VPAC2R, respectively, it is said that even if the amino acid present on the C-terminal side of PACAP38 is deleted, the binding property is not affected. Conceivable.
  • amino acids can occur anywhere as long as the binding of the peptide consisting of a partially modified sequence to PAC1R, VPAC1R, and / or VPAC2R is not altered.
  • the number of amino acids added is chosen from any number from 1 to 10, for example 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10.
  • Amino acids may be added to the N-terminal side or C-terminal side of the original sequence, or may be added to the inside of the sequence. Since PACAP27 and PACAP38 have equivalent binding properties to PAC1R, VPAC1R, and / or VPAC2R, respectively, it is considered that the binding property is not affected even if an arbitrary amino acid is added to the C-terminal of PACAP27. ..
  • One aspect of the present invention is the following formula: HX 1 -DGIFTDX 2 -YX 3 -RYRX 4 -X 5 -X 6 -AX 7 -X 8 -X 9 -YLAAVX 10 (SEQ ID NO: 3) ⁇
  • X 1 is a neutral amino acid
  • X 2 is a neutral amino acid
  • X 3 is a neutral amino acid
  • X 4 is a basic amino acid
  • X 5 is a neutral amino acid or egTz
  • X 6 is a non-polar amino acid
  • X 8 is a basic amino acid
  • X 9 is a basic amino acid
  • X 10 is a non-polar amino acid ⁇
  • the carboxy group of the aspartic acid residue at the 3-position and / or 8-position is a peptide consisting of a sequence substituted with tetrazole or a modified sequence thereof, and binding to PAC1R, V
  • amino acids represented by X 1 to X 10 can be conservatively replaced by amino acids having the same attributes.
  • conservative substitution refers to the substitution of amino acids within the following groups: 1 Non-polar amino acids: Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Nle, Ala 2 Neutral amino acids: Ala, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn, Gln, Gly Tribasic amino acids: Lys, Arg, His 4 Acidic amino acids: Asp, Glu
  • the neutral amino acids in X 1 , X 2 , and X 3 are Ala, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn, Gln, or Gly, more preferably Ala or Ser.
  • the basic amino acids at X 4 , X 8 , and X 9 are Lys, Arg, or His, more preferably Lys or Arg.
  • the neutral amino acid in X 5 is Ala, Ser, Thr, Tyr, Cys, Asn, Gln, or Gly, more preferably Ala, or Gln.
  • X 5 may also be an amino acid (egTz) in which the glutamine amide is replaced with tetrazole.
  • the non-polar amino acid in X 6 is Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Nle, or Ala, more preferably Met, Nle, Leu, or Ala.
  • the non-polar amino acid in X 7 is Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Nle, or Ala, more preferably Val, or Ala.
  • the X 10 non-polar amino acid is Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Pro, Nle, or Ala, more preferably Leu or Ala.
  • the modified sequence means a sequence in which one or more amino acids are substituted, deleted, or added to the original sequence. More preferably, the modified sequence refers to a sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, or added to the original sequence.
  • the modified sequence of the sequence in which the carboxy group of the aspartic acid residue at the 3-position and / or 8-position is replaced with tetrazole is preferably the modified sequence of the sequence represented by SEQ ID NO: 3. It is a sequence in which one or more amino acids are deleted or added. More preferably, one or two amino acids may be deleted from the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and the following C-terminal addition sequence may be added to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. ..
  • PACAP27 and PACAP38 have equivalent binding properties to PAC1R, VPAC1R, and / or VPAC2R, respectively, and thus are amino acids toward the C-terminal side in PACAP27.
  • the addition does not affect the binding to PAC1R. Therefore, when the present invention relates to PACAP27 or a stabilized peptide thereof, a C-terminal addition sequence can be further included, and the C-terminal addition sequence may not be present.
  • the C-terminal addition sequence refers to a sequence consisting of any of 1 to 11 amino acids.
  • the C-terminal addition sequence preferably corresponds to the amino acids at positions 28 to 38 of PACAP38.
  • examples of the C-terminal sequence include the following sequences: GKRYKQRVKNK (SEQ ID NO: 37); GKRYKQRVKN (SEQ ID NO: 38); GKRYKQRVK (SEQ ID NO: 39); GKRYKQRV (SEQ ID NO: 40); GKRYKQR (SEQ ID NO: 41); GKRYKQ (SEQ ID NO: 42); GKRYK (SEQ ID NO: 43); GKRY (SEQ ID NO: 44) GKR; GRR; GK; and GR; G.
  • D-form or L-form amino acids can be used, or racemic amino acids may be used as long as the binding property to PAC1R, VPAC1R, and / or VPAC2R is not lost.
  • the peptide according to the present invention may be composed of an unnatural amino acid such as 2-aminoisobutyric acid or L-2-aminobutyric acid, and may be composed of an N-terminal amino group, a C-terminal carboxy group or the amino acid side. Derivatives in which the functional groups of the chain are optionally modified are included.
  • modifications include addition of protecting groups to amino groups (eg, acylation (formylation, acetylation, etc.), mesylation, urealation, carbamation, Bocation, Fmocization), esterification of carboxy groups (eg, esterification of carboxy groups). (Esterification, etc.) and the like. It also includes modifications that can normally occur in vivo, such as phosphorylation, amidation, methylation, esterification, acetylation, as well as modifications that occur during the synthetic process or facilitate purification, such as biotination. May be good. In addition, modifications such as PEGylation may be performed for the purpose of prolonging the in vivo half-life of the peptide.
  • the free amino group of the N-terminal amino acid can be protected by a protecting group (for example, an acyl group).
  • a protecting group for example, an acyl group
  • the free transamination of the N-terminal amino acid can be acetylated or mesylated. Stability is further improved by acetylation or mesylation of the N-terminus in the peptide consisting of a sequence in which the carboxy group of the aspartic acid residue at the 3- and / or 8-position of PACAP is replaced with tetrazole.
  • the C-terminus may be any of a carboxy group (-COOH), a carboxylate (-COO-), an amide (-CONH 2 ) or an ester (-COOR), and may be glycosylated (-COOR). See, for example, WO2017 / 027848).
  • the invention relates to peptides 3-34 having the sequences shown in Table 1 below, or modified sequences thereof:
  • Amino acids in which the carboxy group of aspartic acid is replaced with tetrazole have the following structure: Further, in the present specification, "Tz" is used as a notation in the sequence.
  • amino acid in which the glutamine amide is replaced with tetrazole has the following structure: Further, in the present specification, "egTz" is used as a notation in the sequence.
  • the peptide according to the present invention can be produced by any production method.
  • it can be produced by performing solid-phase synthesis or liquid-phase synthesis using the Boc method, Fmoc method, or the like.
  • the nucleic acid encoding the peptide of the present invention can be produced by introducing it into a host cell by a gene transfer method and synthesizing it by the host cell.
  • a tag peptide such as a polyhistidine tag
  • the peptide according to the present invention contains a pharmaceutically acceptable salt.
  • Pharmaceutically acceptable salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochlorides, hydrobromates, sulfates, phosphates, etc.) and salts with organic acids (eg, methanesulfonates, benzenesulfones).
  • Acid salt p-toluene sulfonate, formate, acetate, trifluoroacetate, oxalate, citrate, malonate, fumarate, maleate, tartrate, succinate, malic acid Salts and the like
  • salts with bases eg, ammonium salts, methylpyridinium salts, acetylpyridinium salts, etc.
  • the peptide according to the present invention also includes a hydrate or a solvate.
  • the N-terminal mesylated histidine can be produced by the method shown in Reaction Scheme 1 or a method similar thereto.
  • Trt represents a trityl group and Me represents a methyl group.
  • compound (II) is produced by reacting compound represented by general formula compound (I) with methanesulfonyl chloride in the presence of a base, and then compound (II) is prepared in methanol.
  • Compound (III) can be produced by hydrolysis using a base.
  • the base is used in an amount of 0.2 to 5 equivalents, preferably 1 to 3 equivalents, relative to compound (I).
  • the base used include triethylamine, N, N-diisopropylethylamine, pyridine and 4-dimethylaminopyridine, and preferably triethylamine can be mentioned.
  • Methanesulfonyl chloride is used in an amount of 0.1-5 equivalents, preferably 1-2 equivalents.
  • the solvent is not particularly limited as long as it does not affect the reaction, and examples thereof include tetrahydrofuran, dichloromethane, toluene and the like, preferably dichloromethane.
  • the reaction temperature is usually 1 ° C. to 30 ° C., preferably 15 ° C. to 25 ° C., and the reaction time is usually 0.5 hours to 12 hours, preferably 0.5 hours to 2 hours.
  • the base is used in an amount of 0.1 to 10 equivalents, preferably 1 to 3 equivalents, relative to compound (II).
  • the base lithium hydroxide, sodium hydroxide and potassium hydroxide can be mentioned, and potassium hydroxide can be preferably mentioned.
  • the solvent include a mixed solvent of an organic solvent (for example, methanol, ethanol, isopropanol, acetonitrile, 1,4-dioxane and tetrahydrofuran) and water, and preferably a mixed solvent of methanol and water.
  • the reaction time varies depending on the reagent or solvent used, but is usually 0.5 to 12 hours, preferably 0.5 to 3 hours.
  • the reaction temperature varies depending on the reagent or solvent used, but is usually 0 ° C to 100 ° C, preferably 60 ° C to 100 ° C.
  • the peptide according to the present invention can exhibit the same physiological activity as PACAP by binding to PAC1R, VPAC1R, and / or VPAC2R.
  • the prophylactic or therapeutic use of neurotrophic keratitis can be an action through binding to these receptors. More specifically, the peptide according to the present invention can suppress the decrease in tear volume caused by neurotrophic keratitis and can suppress corneal punctate superficial inflammation. Furthermore, the peptides of the invention promote nerve axon outgrowth. The axon elongation promoting action of the peptide according to the present invention can treat damage to the trigeminal nerve or regenerate the trigeminal nerve.
  • the peptides of the present invention can treat or prevent neurotrophic keratitis through these actions.
  • the peptides according to the present invention can promote nerve axon elongation in vivo or in vitro.
  • nerve cells are cultured in a medium containing the peptide according to the present invention.
  • the method for culturing nerve cells can be any method well known in the present technology, and a nerve cell culture medium widely known in the present technology can be used.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for treating or preventing neurotrophic keratitis, which comprises a therapeutically effective amount of the above peptide.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a patient to treat neurotrophic keratitis by the physiological action of PACAP, or to a patient who may suffer from such a disease. By doing so, neurotrophic keratitis can be prevented.
  • treatment means to prevent the deterioration of those conditions when a disorder or disease develops, delay the progression, and maintain, alleviate or eliminate the status quo, and "prevention" is a disorder. Or it means to prevent the onset of the disease before the onset.
  • Patients who may suffer from neurotrophic keratitis include, for example, patients suffering from viral infections such as herpes of the cornea, eye trauma, corneal surgery, and diabetes.
  • the peptide according to the present invention, or a pharmaceutical composition containing the peptide can be administered parenterally or orally depending on the disease to be treated.
  • Oral administration includes sublingual, oral, and oral administration.
  • Parenteral administration includes, for example, intravenous, intraarterial, subcutaneous, local, intraperitoneal, intramuscular, nasal, transdermal, transmucosal, intrameningeal, transrectal, intramuscular, intracerebral, intrameningeal, It can be administered by subdural, intradural, epidural, instillation, ear instillation, nasal instillation, and intraocular routes. More specifically, the intraocular route includes subconjunctival, subconjunctival, and intravitreal routes.
  • the pharmaceutical composition containing the peptide according to the present invention can be appropriately formulated according to the route of administration thereof, and can be any, for example, eye drops, injections, powders, infusion preparations, granules, tablets, suppositories and the like. However, from the viewpoint of parenteral administration, eye drops, injections, infusion preparations, powders for preparation at the time of use and the like are preferable.
  • Formulations for intraocular administration include, for example, intravitreal injections, subconjunctival injections, and subconjunctival injections.
  • these preparations may contain various pharmaceutically acceptable auxiliary agents, that is, additives such as carriers and other auxiliary agents, for example, stabilizers, preservatives, soothing agents, emulsifiers and the like. It can also be used in combination with another drug having a neuroprotective effect, an anti-inflammatory effect or an exocrine gland secretory effect.
  • auxiliary agents such as carriers and other auxiliary agents, for example, stabilizers, preservatives, soothing agents, emulsifiers and the like. It can also be used in combination with another drug having a neuroprotective effect, an anti-inflammatory effect or an exocrine gland secretory effect.
  • Example 1 Peptide synthesis 1 Synthesis of Ms-His (Trt) -OMe Dissolved in dichloromethane solution (40 mL) of N-im-trityl-L-histidine methyl ester hydrochloride (2.02 g, 4.5 mmol) in N, N-diisopropylethylamine (1.0 mL, 5.7 mmol) and dichloromethane (2.0 mL). Methanesulfonyl chloride (314.7 mg, 2.7 mmol) was added and reacted at 25 ° C for 2 hours and 40 minutes.
  • dichloromethane (15 mL) was added to the resulting residue, followed by a dichloromethane solution (1.0 mL) of triethylamine (1.0 mL, 7.2 mmol) and methanesulfonyl chloride (326.8 mg, 2.9 mmol). In addition, it was stirred at room temperature for 1 hour. Then, a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution was added to stop the reaction, and the mixture was extracted with ethyl acetate. The obtained organic layer was washed with a 10% aqueous solution of citric acid, a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution and a saturated saline solution, and the organic layer was anhydrous.
  • Example 2 Peptide Synthesis 2
  • the peptide used in the test was synthesized by a solid-phase synthesis method by the Fmoc method using a peptide synthesizer (model: PSSM-8 manufactured by Shimadzu Corporation).
  • the unnatural amino acids Fmoc-TZ-OH, Fmoc-TZ (trt) -OH, and Fmoc-egTZ (trt) -OH used in solid-phase synthesis were purchased from Astatech.
  • Peptides 1-34 having the following sequences were synthesized, and the molecular weight of the synthetic peptides was subjected to mass spectrometry (MALDI TOF). As shown in Table 2 below, all the measured values were in good agreement with the theoretical values.
  • Example 3 Peptide Stability Test 1 [Preparation of measurement sample] Peptides 1 and 3-5 synthesized in Example 2 were weighed and dissolved in phosphate buffer (pH 7.0) to prepare a 1.0 mM peptide solution. Further, a 1.0 mM peptide solution was diluted to 100 ⁇ M with phosphate buffer. The mixture was filtered through a chromatographic disc (Merck millipore Millex-GV, 0.22 ⁇ m), and the filtrate was dispensed into an LC vial (Waters Deactivated Qsert Vial). The prepared peptide solution was incubated in a constant temperature bath at 40 ° C. for 1 or 2 months to obtain a sample after storage. In addition, among the peptide solutions prepared at the same time, a sample not to be stored was used as a standard sample (initial sample). Standard samples and post-storing samples were stored at ⁇ 30 ° C. until sample analysis.
  • phosphate buffer pH 7.0
  • the peak area value of the peptide was obtained, and the residual rate (residual rate before water correction) was calculated by the formula (2). Further, the residual rate after moisture correction was calculated by taking into consideration the moisture permeability of the container with respect to the residual rate before moisture correction according to the formula (3).
  • Table 4 shows the water-corrected residual rate of the peptide in the sample after storage.
  • Peptide 1 (PACAP) had low stability of 37.4% after storage at 40 ° C. for 1 month and 21.3% after storage at 40 ° C. for 2 months.
  • Peptide 3 in which only the carboxy group of the aspartic acid side chain at the 3rd residue of peptide 1 was replaced with tetrazole with respect to peptide 1 showed higher stability than peptide 1 and aspartic acid at the 8th residue.
  • Peptide 4 in which only the carboxy group of the side chain was replaced with tetrazole also had improved stability as compared with peptide 1.
  • Example 4 Peptide Stability Test 2 Peptides 1, 2 and 6-9 synthesized in Example 2 were weighed and dissolved in Tris buffer (pH 7.0) to prepare a 1.0 mM peptide solution. This solution was filtered through a chromatographic disc (Millex-GV, 0.22 ⁇ m manufactured by Merckmillipore). The filtrate was diluted to 100 ⁇ M with Tris buffer (pH 7.0) and dispensed into a tube (Protein Lobind Tube manufactured by eppendorf). The prepared peptide solution was incubated in a constant temperature bath at 60 ° C. for 1 or 2 weeks to obtain a sample after storage. In addition, among the peptide solutions prepared at the same time, a sample not to be stored was used as a standard sample (initial sample). Standard samples and post-storing samples were stored at ⁇ 30 ° C. until sample analysis.
  • Tris buffer pH 7.0
  • Peptide 1 (PACAP) is extremely unstable at 26.6% after storage at 60 ° C. for 1 week and 15.8% after storage for 2 weeks, and peptide 2 having the N-terminal of PACAP acetylated is also equivalent. It was only the stability of.
  • peptides 6 and 7 in which the carboxy group of aspartic acid at positions 3 and 8 is replaced with tetrazole in peptide 6, methionine at position 17 is norleucine (“Nl” is used as the notation in the sequence).
  • Nl is used as the notation in the sequence.
  • methionine at position 17 is further replaced with leucine
  • Example 5 Peptide Stability Test 3 Peptides 12-25, 27 and 28 synthesized in Example 2 were weighed and dissolved in Tris buffer (pH 7.0) to prepare a 1.0 mM peptide solution. This solution was filtered through a chromatographic disc (Millex-GV, 0.22 ⁇ m manufactured by Merckmillipore). The filtrate was diluted to 100 ⁇ M with Tris buffer (pH 7.0) and dispensed into a tube (Protein Lobind Tube manufactured by eppendorf). The prepared peptide solution was incubated in a constant temperature bath at 60 ° C. for 1 or 2 weeks to obtain a sample after storage. In addition, among the peptide solutions prepared at the same time, a sample not to be stored was used as a standard sample (initial sample). The standard sample and the sample after storage were stored at -30 ° C until sample analysis.
  • Tris buffer pH 7.0
  • the water-corrected residual rate of the peptide in the sample after storage was calculated in the same manner as in Example 4, and the results are shown in Table 7.
  • Peptide 12 (a peptide in which the N-terminal acetyl group of peptide 9 was replaced with a mesyl group) showed the same stability as peptide 9, and also showed high stability even with N-terminal mesyl group substitution.
  • Peptide 13 (a peptide in which the glutamine side chain at the 16th residue of peptide 9 is replaced with tetrazole) shows the same stability as peptide 9, and the peptide in which the glutamine side chain is replaced with tetrazole also maintains high stability. Indicated. High stability was also maintained in peptides 14-25, peptide 27 and peptide 28, which were substituted or added to any residue of peptide 9 with alanine or arginine.
  • Example 5-2 Peptide stability test 3
  • the peptides 29 to 34 synthesized in Example 2 were weighed and dissolved in Tris buffer (pH 7.0) to prepare a 1.0 mM peptide solution.
  • This solution was filtered through a chromatographic disc (Millex-GV, 0.22 ⁇ m manufactured by Merckmillipore).
  • the filtrate was diluted to 100 ⁇ M with Tris buffer (pH 7.0) and dispensed into a tube (Protein Lobind Tube manufactured by eppendorf).
  • the prepared peptide solution was incubated in a constant temperature bath at 60 ° C. for 2 weeks to obtain a sample after storage.
  • a sample not to be stored was used as a standard sample (initial sample).
  • the standard sample and the sample after storage were stored at -30 ° C until sample analysis.
  • the water-corrected residual rate of the peptide in the sample after storage was calculated in the same manner as in Example 4, and the results are shown in Table 7-2.
  • Peptide 29 (a peptide in which the N-terminal acetyl group of peptide 15 was replaced with a mesyl group) showed the same stability as peptide 15, and also showed high stability even with N-terminal mesyl group substitution.
  • Peptide 30 (a peptide in which the N-terminal acetyl group of peptide 23 was replaced with a mesyl group) showed the same stability as peptide 23, and showed high stability even with N-terminal mesyl group substitution.
  • Peptides 32-34 also maintained high stability in peptides 32-34 in which any residue of peptide 9 was replaced with alanine.
  • Peptide 31 (a peptide in which the N-terminal acetyl group of peptide 32 was replaced with a mesyl group) showed the same stability as peptide 32.
  • Example 6 Peptide Stability Test 4 Peptides 10 and 11 synthesized in Example 2 were weighed and dissolved in phosphate buffer (pH 7.0) to prepare a 1.0 mM peptide solution. This solution was filtered through a chromatographic disc (Millex-GV, 0.22 ⁇ m manufactured by Merckmillipore). The filtrate was diluted to 100 ⁇ M with phosphate buffer (pH 7.0) and dispensed into a tube (Protein Lobind Tube manufactured by eppendorf). The prepared peptides were incubated in a constant temperature bath at 40 ° C. for 1 or 2 months to obtain samples after storage.
  • phosphate buffer pH 7.0
  • Example 7 Peptide stability test 5
  • the peptide 26 synthesized in Example 2 was weighed and dissolved in Tris buffer (pH 7.0) to prepare a 1.0 mM peptide solution. This solution was filtered through a chromatographic disc (Millex-GV, 0.22 ⁇ m manufactured by Merckmillipore). The filtrate was diluted to 100 ⁇ M with Tris buffer (pH 7.0) and dispensed into a tube (Protein Lobind Tube manufactured by eppendorf). The prepared peptide solution was incubated in a constant temperature bath at 60 ° C. for 1 or 2 weeks to obtain a sample after storage. In addition, among the peptide solutions prepared at the same time, a sample not to be stored was used as a standard sample (initial sample). The standard sample and the sample after storage were stored at -30 ° C until sample analysis.
  • Example 7 cAMP assay for PACAP27 and its stabilizing peptides
  • Cell culture Frozen CHO-K1 cells treated with mitomycin (PAC1 or VPAC1 receptor high-expressing cell line: purchased from DiscoverRx) with a Cell plating reagent (DiscoveRx) so as to have 1.35 ⁇ 10 4 cells / 100 ⁇ l / well. After preparation, seeds were seeded on 96-well culture plates. The cells were cultured in a 5% CO 2 incubator for 18-24 hours at 37 ° C. to adhere the cells to the plate.
  • mitomycin PAC1 or VPAC1 receptor high-expressing cell line: purchased from DiscoverRx
  • DiscoveRx Cell plating reagent
  • the cAMP assay was performed using the Hit Hunter cAMP assay for Biologics kit (DiscoveRx, Cat. No. 90-0075LM25) according to the instructions included with the kit.
  • a peptide-cAMP antibody mixed solution was prepared by mixing the cAMP antibody solution and diluted peptide 1, 2, 6-9 solutions at each concentration. Subsequently, the medium was removed from the culture plate of CHO-K1 cells, washed with PBS, the peptide-cAMP antibody mixture was added to the cells, and the cells were incubated in a 5% CO 2 atmosphere at 37 ° C. for 30 minutes. Next, a working detection solution was added, and the culture plate was shaded with aluminum foil and then incubated at 25 ° C.
  • Peptides 1, 2 and 6-9 synthesized are for each of the high expressing cells PAC1R and VPAC1R, shows a cAMP-inducing ability, their The EC 50 values, the native peptide (peptide 1: PACAP27) and to the same extent there were.
  • the peptides of the present invention have significantly improved stability in aqueous solution as compared to PACAP and have the same bioactivity as PACAP. To maintain. In particular, having a shelf life of more than 2 years at room temperature makes it possible to develop products such as liquid preparations such as vials, ampoules, and eye drops.
  • Example 8 cAMP assay 2 of PACAP27 stabilized peptide [Reagent preparation]
  • the powders of peptides 3 to 5 and 10 to 28 synthesized in Example 2 were dissolved in water to a concentration of 0.1 mM, respectively, and then cell assay buffer (manufactured by DiscoverRx) (0.5 mM IBMX) to a concentration of 20 ⁇ M. , 0.001% BSA included). From there, a 5-fold dilution series was made with the same Cell assay buffer and used in the assay. EC 50 values were calculated in peptide 3-5 and 10-28 in the same manner as in Example 7.
  • the peptides according to the present invention (peptides 3 to 5, 10 to 28) have extremely improved stability in an aqueous solution as compared with PACAP, and maintain the same physiological activity as PACAP.
  • Example 8-2 cAMP assay 2 of PACAP27 stabilized peptide [Reagent preparation]
  • the powders of peptides 29 to 34 synthesized in Example 2 were dissolved in water to a concentration of 0.1 mM, and then cell assay buffer (manufactured by DiscoveRx) (0.5 mM IBMX, 0.001) to a concentration of 20 ⁇ M. % BSA included). From there, a 5-fold dilution series was made with the same Cell assay buffer and used in the assay.
  • EC 50 values were calculated in the peptide 29-34 in the same manner as in Example 7.
  • the peptides (peptides 29 to 34) according to the present invention have extremely improved stability in an aqueous solution as compared with PACAP, and maintain the same physiological activity as PACAP.
  • Example 9 Evaluation of PACAP27 and its stabilizing peptide by a neurotrophic keratitis model
  • Administration of capsaicin subcutaneously to the back of a rat induces corneal neuropathy and diminished corneal perception, and is associated with tear volume.
  • SPK reduction and keratitis punctate
  • PACAP27 and its stabilizing peptide were instilled in the rat, and the inhibitory effect on corneal injury was examined.
  • the specific experimental method was as follows.
  • Capsaicin administration Capsaicin (manufactured by SIGMA) was dissolved in PBS containing 10% EtOH and 10% Tween80, and 50 mg / kg ⁇ b. w. It was administered subcutaneously to the back of 4-day-old male Wistar / ST rats.
  • Zone Quick (AYUMI Pharmaceutical Corporation) was inserted into the lower outer canthus of the rat, and 20 seconds later, the length of the red-stained part was measured with the attached scale.
  • the tear volume was measured 10 minutes and 5 minutes before instillation of the peptide, and the average value was taken as the tear volume before instillation.
  • the peptide was instilled and the tear volume was measured 5 minutes later to determine the difference in tear volume from that before instillation. The results are shown in FIG.
  • the cornea was divided into three regions, upper, central, and lower, and scores were given to each region according to the following criteria, and the sum of the scores of each of the three regions was taken as the SPK score.
  • Corneal perception is measured using a Cochet-Bonnet corneal sensory meter (Handa-ya Shoten).
  • the filament length of the corneal sensor is set to 60 mm, and the filament is brought into vertical contact with the center of the cornea to stimulate it. Observe the reaction of the eyelid and record the filament length if there is a reaction. If no reaction is observed, reduce the length by 5 mm and measure. The above operation is repeated three times, and the average value of the obtained filament lengths is defined as the corneal perception threshold (CST) of the individual.
  • CST corneal perception threshold
  • Example 10 Evaluation of axon elongation effect of PACAP27 and its stabilizing peptide on rat trigeminal nerve cells [isolation and culture of trigeminal nerve]
  • Rats (Slc: Sprague-Dawley 17 days old, including males and females) purchased from Nippon SLC Co., Ltd. were euthanized by inhalation of carbon dioxide gas, and the trigeminal ganglion was collected. The collected trigeminal ganglion was washed with Hanks' balanced salt solution (HBSS) and then treated with collagenase A (Roche) at 37 ° C. for 30 minutes. The nerve cell dispersion (Wako) was then used according to the protocol to disperse the cells.
  • HBSS Hanks' balanced salt solution
  • Debris removal solution (Miltenyi biotec) and Myelin removal beds II (Miltenyi biotec) were used according to the protocol to remove Debris and myelin.
  • the isolated trigeminal neurons were suspended in culture medium and then seeded on polylysine / laminin-coated 8-well chamber slides (Corning) to 2.5 ⁇ 103 cells / well.
  • As the culture medium Neurobasal-A containing B27 supplement (final concentration 2%), GlutaMAX (final concentration 2 mM) and penicillin / streptomycin (final concentration 1%) was used.
  • the culture conditions were carbon dioxide concentration 5%, air concentration 95%, humidity 100%, and temperature 37 ° C.
  • the cells were cultured for 24 hours and replaced with a culture medium containing peptide 1, peptide 9, peptide 12, peptide 18, and peptide 31 so as to have a final concentration of 1 ⁇ M.
  • the control was replaced with a peptide-free culture medium. After exchanging the medium, the cells were cultured for another 24 hours.
  • the medium was replaced with a culture medium containing a stained peptide, and rat trigeminal neurons after culturing for 24 hours were immersed in a 2% paraformaldehyde solution at room temperature for 20 minutes for fixation.
  • Cells were washed with PBS, 2% bovine serum albumin containing 0.1% Triton X-100 was added and allowed to react for 30 minutes.
  • a phosphor-neurofilament H antibody (Merk, MAB1592-C) that specifically recognizes neurofilaments constituting nerve cell bodies and neurites was reacted at room temperature for 1 hour.
  • a fluorescently labeled secondary antibody (Invitrogen, # A-11031) was reacted at room temperature for 1 hour to fluorescently stain the specimen, and the stained cells were observed under a fluorescence microscope.
  • the stained cell image was captured as an image on a computer from a fluorescence microscope.
  • Peptide 1, Peptide 9, Peptide 12, Peptide 18, and Peptide 31 showed an axon elongation promoting effect on trigeminal nerve cells.
  • Preparation Example A drug containing the peptide of the present invention as an active ingredient can be produced, for example, by the following formulation.
  • the agent of the present invention will be described in more detail with reference to formulation examples, but the present invention is not limited to these formulation examples.

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Abstract

神経栄養性角膜炎の予防又は治療用組成物の提供を目的とする。ＰＡＣＡＰペプチドが、神経栄養性角膜炎モデルにおいて、角膜傷害の抑制効果を発揮すること、並びに培養神経細胞モデルにおいて神経軸索伸長を促進することを見出した。さらに、ＰＡＣＡＰの配列中の３位及び/又は８位のアスパラギン酸のカルボキシ基をテトラゾールで置換することにより、安定性が有意に亢進し、ＰＡＣＡＰペプチド又は安定化されたＰＡＣＡＰペプチドを含む神経栄養性角膜炎の予防又は治療用組成物、並びに神経軸索伸長促進剤を提供する。

Description

ＰＡＣＡＰペプチド又はＰＡＣＡＰの安定化ペプチドを含む神経栄養性角膜炎の予防又は治療用組成物
　ＰＡＣＡＰの生理活性を有する安定化ペプチドを含む神経栄養性角膜炎の予防又は治療用組成物に関する。
　角膜の知覚は、瞬目反射および流涙反射を通して損傷を予防するために重要であり、角膜神経に支配されている。一方で、角膜神経は知覚を媒介するのみならず、角膜上皮に対して、角膜神経終末から放出された神経伝達物質や、神経成長因子の分泌を介して、角膜上皮細胞増殖に影響を及ぼしている。角膜神経が損傷を受けると、角膜上皮細胞の代謝が変化し、増殖性が損なわれ、栄養障害性潰瘍を引き起こすことが知られている。神経栄養性角膜炎や神経麻痺性角膜症は、三叉神経の損傷が原因の変性角膜疾患であり、角膜上皮の損傷を引き起こす。最重症型では角膜の潰瘍・融解・穿孔をもたらす場合があり、患者の視認能力が損なわれる。角膜のヘルペスのようなウイルス感染、眼外傷、角膜手術、さらに糖尿病といった全身症状など、さまざまな臨床症状が神経栄養性角膜炎の原因となり得る。特に、ヘルペスの感染は、神経栄養性角膜炎の27％を占めるという報告がある。神経栄養性角膜炎は、古くからその存在が知られていたもののその有効な治療方法はいまだ開発されていない。
　神経科学の発展により、各種の神経保護因子が発見されてきており、神経障害の予防又は治療薬としての開発が期待される。神経変性を引き起こすフリーラジカルや興奮性アミノ酸を減少させる薬剤や、神経細胞を保護及び/又は修復することができる薬剤（例えば神経栄養因子や免疫抑制剤などのイムノフィリンリガンドなど）が神経保護作用を有することが見いだされている一方で、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）、ＣＤ４４やヒト脳カルボキシペプチダーゼＢ（ＨＢＣＰＢ）などの生体内タンパク質が、神経保護作用を有することが見いだされてきている（特許文献１及び２）。
　下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ）は、ヒツジ視床下部抽出物から発見された神経ペプチドである。ＰＡＣＡＰは、下垂体前葉細胞においてｃＡＭＰ形成を刺激する活性を有しうる。ＰＡＣＡＰとしては、３８個のアミノ酸残基からなるＰＡＣＡＰ３８と、２７個のアミノ酸残基からなるＰＡＣＡＰ２７が存在しており、両者とも同等の作用を有する（非特許文献１及び２）。ＰＡＣＡＰは、血管作動性腸ポリペプチド（ＶＩＰ）／セクレチン／グルカゴンスーパーファミリーに属しており、ヒトＰＡＣＡＰ２７の配列は、血管作動性腸ポリペプチド（ＶＩＰ）と６８％の同一性を有する。ＰＡＣＡＰとＶＩＰは、ＰＡＣ１受容体（ＰＡＣ１Ｒ）、ＶＰＡＣ１受容体（ＶＰＡＣ１Ｒ）及びＶＰＡＣ２受容体（ＶＰＡＣ２Ｒ）に結合するが、これらの受容体に対する親和性の点で異なっている。ＰＡＣ１Ｒは、ＰＡＣＡＰに対して高い選択性を持って結合し、ＰＡＣＡＰに対する親和性は、ＶＩＰに対する親和性と比較して１０００倍以上高い。一方で、ＶＰＡＣ１Ｒ及びＶＰＡＣ２Ｒは共に、ＰＡＣＡＰとＶＩＰに対して同程度の親和性を有する。ＰＡＣＡＰは、多様な生理作用を有しており、神経保護物質、免疫抑制因子、血管拡張因子、外分泌線分泌促進因子（特許文献３）、神経突起形成促進因子（特許文献４）としての生理作用を有することが知られている。
　ＰＡＣＡＰの有する多様な生理活性を利用して、医薬品の開発が行われてきている。しかしながら、ＰＡＣＡＰのような比較的短いペプチドは、水溶液中において不安定であることが多く、またプロテアーゼ耐性を欠如することに起因して生体内での半減期が短いといった問題が知られている。
特表２０１４－５１０１０１号公報 特開２０１２－２３２９５２号公報 特開２００９－２６９８１８号公報 国際公開第２００５／１０２３７５号
S. Bourgault (2009) Current Medicinal Chemistry 16, 4462-4480 Louise Dickson (2009) Pharmacology & Therapeutics, 12, 294－316 Alessandro Lambiase (2012） Investigative Ophthalmology & Visual Science, vol. 53, No.13, p.8280-8287
　本発明は、神経栄養性角膜炎の予防又は治療用組成物を提供することを目的とする。
　本発明者らは、ＰＡＣＡＰペプチド又はその安定化ペプチドが、神経栄養性角膜炎モデルにおいて角膜傷害の抑制効果を発揮すること、並びに培養神経細胞モデルにおいて神経軸索伸長を促進することを見出し、本発明に至った。さらに、安定化ペプチドとして、ＰＡＣＡＰペプチド中に存在するアスパラギン酸のカルボキシ基をテトラゾールに置換することで、水溶液中での安定性を大幅に高めることができるものを見出した。
　そこで、本発明は以下のものに関する：
［１－１］以下の：
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK（配列番号１）、又は
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL（配列番号２）
　で表される配列、又はその安定化配列からなるペプチドを含む、神経栄養性角膜炎の予防又は治療用医薬組成物。
［１－２］神経栄養性角膜炎の予防又は治療において用いるためのペプチドであって、以下の：
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK（配列番号１）、又は
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL（配列番号２）
　で表される配列、又はその安定化配列からなるペプチド。
［１－３］神経栄養性角膜炎の予防又は治療方法であって、以下の：
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK（配列番号１）、又は
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL（配列番号２）
　で表される配列、又はその安定化配列からなるペプチドを、神経栄養性角膜炎の治療又は予防を必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
［１－４］神経栄養性角膜炎の治療用の医薬を製造するための、以下の：
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK（配列番号１）、又は
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL（配列番号２）
　で表される配列、又はその安定化配列からなるペプチドの使用。
［２］前記安定化配列からなるペプチドが、配列番号１又は２の配列において、３位及び／又は８位のアスパラギン酸残基のカルボキシ基が、テトラゾールに置換された配列、又は当該配列の一部が改変された配列であり、ここで前記安定化配列が、当該配列の一部が改変された配列である場合、安定化配列からなるペプチドがＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１ＲおよびＶＰＡＣＲ２への結合性を有する、項目１－１に記載の予防又は治療用組成物、項目１－２に記載のペプチド、項目１－３に記載の方法、又は項目１－４に記載の使用。
［３］前記安定化配列からなるペプチドが、下記の式：
　　 H-X1-D-G-I-F-T-D-X2-Y-X3-R-Y-R-X4-X5-X6-A-X7-X8-X9-Y-L-A-A-V-X10（配列番号３）
　　｛式中、Ｘ1は中性アミノ酸、Ｘ2は中性アミノ酸、Ｘ3は中性アミノ酸、Ｘ4は塩基性アミノ酸、Ｘ5は中性アミノ酸またはｅｇＴｚ、Ｘ6は非極性アミノ酸、Ｘ7は非極性アミノ酸、Ｘ8は塩基性アミノ酸、Ｘ9は塩基性アミノ酸、Ｘ10は中性アミノ酸である｝
　で表される配列において、３位及び／又は８位のアスパラギン酸残基のカルボキシ基が、テトラゾールに置換された配列又はその改変配列からなるペプチドであって、前記ペプチドがＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１ＲおよびＶＰＡＣＲ２への結合性を有し、前記改変配列が、配列番号３の配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失又は付加された配列である、前記ペプチドを含む、項目１－１若しくは項目２に記載の予防又は治療用組成物、項目１－２若しくは項目２に記載のペプチド、項目１－３若しくは項目２に記載の方法、又は項目１－４若しくは項目２に記載の使用。
［４］　X1、X2、及びX3における中性アミノ酸が、アラニン又はセリンである、項目１－１に記載の予防又は治療用組成物、項目３に記載の予防又は治療用組成物、ペプチド、方法、又は使用。
［５］　X4、X8、及びX9における塩基性アミノ酸が、リジン又はアルギニンである、項目３又は４に記載の予防又は治療用組成物、ペプチド、方法、又は使用。
［６］　X5が、グルタミン、アラニン、又は、egTzである、項目３～項目５のいずれか一項に記載の予防又は治療用組成物、ペプチド、方法、又は使用。
［７］　さらにX6がメチオニン、ノルロイシン、アラニン又はロイシンである、項目３～６のいずれか一項に記載の予防又は治療用組成物、ペプチド、方法、又は使用。
［８］　X7が、バリン又はアラニンである、項目３～項目７のいずれか一項に記載の予防又は治療用組成物、ペプチド、方法、又は使用。
［９］　X10が、ロイシン又はアラニンである、項目３～８のいずれか一項に記載の予防又は治療用組成物、ペプチド、方法、又は使用。
［１０］　配列番号３の３位及び８位のアスパラギン酸のカルボキシ基が、テトラゾールに置換される、項目３～９のいずれか一項に記載の予防又は治療用組成物、ペプチド、方法、又は使用。
［１１］　前記ペプチドにおいて、Ｎ末端がアセチル化又はメシル化されている、項目３～１０のいずれか一項に記載の予防又は治療用組成物、ペプチド、方法、又は使用。
［１２］　前記ペプチドにおいて、Ｎ末端がアセチル化されている、項目３～１１のいずれか一項に記載の予防又は治療用組成物、ペプチド、方法、又は使用。
［１３］　１又は２個のアミノ酸が、欠失される、項目３～１２のいずれか一項に記載の予防又は治療用組成物、ペプチド、方法、又は使用。
［１４］　以下の：
　　GKRYKQRVKNK（配列番号３７）；
　　GKRYKQRVKN（配列番号３８）；
　　GKRYKQRVK（配列番号３９）；
　　GKRYKQRV（配列番号４０）；
　　GKRYKQR（配列番号４１）；
　　GKRYKQ（配列番号４２）；
　　GKRYK（配列番号４３）；
　　GKRY（配列番号４４）；
　　GKR；
　　GRR；
　　GK；及び
　　GR
　　G；
　からなる群から選択される１の配列が、前記ペプチドのＣ末端に付加される、項目３～項目１３のいずれか一項に記載の予防又は治療用組成物、ペプチド、方法、又は使用。
［１５－１］
　以下の：
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK（配列番号１）、又は
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL（配列番号２）
　で表される配列、又はその安定化配列からなるペプチドを含む、神経軸索伸長促進剤。
［１５－２］
　以下の：
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK（配列番号１）、又は
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL（配列番号２）
　で表される配列、又はその安定化配列からなるペプチドを、神経軸索伸長の促進を必要とする対象に投与することを含む、神経軸索伸長を促進する方法。
［１５－３］
　神経軸索伸長促進剤の製造のための、以下の：
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK（配列番号１）、又は
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL（配列番号２）
　で表される配列、又はその安定化配列からなるペプチドの使用。
［１５－４］
　神経軸索伸長促進を介して、神経栄養性角膜炎、神経損傷治療用又は神経再生治療において使用するための、以下の：
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK（配列番号１）、又は
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL（配列番号２）
　で表される配列、又はその安定化配列からなるペプチド。
［１６］
　前記ペプチドが、三叉神経の軸索を伸長する、項目１５－１に記載の神経軸索伸長促進剤、項目１５－２に記載の方法、項目１５－３に記載の使用、或いは項目１５－４に記載のぺプチド。
［１７－１］
　項目１５－１又は１６に記載の神経軸索伸長促進剤を含む、神経損傷治療用又は神経再生用組成物。
［１７－２］
　項目１５－２又は１６に記載の方法により、神経損傷を治療するか、又は神経を再生する方法。
［１７－３］
　前記神経軸索伸長促進剤が、神経損傷治療用又は神経再生用に用いられる、項目［１５－３］に記載の使用。
［１８］
　インビトロ又はインビボにおける神経軸索伸長を促進する方法であって、以下の：
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK（配列番号１）、又は
HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL（配列番号２）
　で表される配列、又はその安定化配列からなるペプチドを適用する、前記方法。
［１９］
　前記ペプチドを添加された培養培地で、神経細胞を培養することを含む、項目［１８］に記載のインビトロにおける神経軸索伸長を促進する方法。
　本発明により、ＰＡＣＡＰ又は安定化されたＰＡＣＡＰを、神経栄養性角膜炎の予防又は治療用途、又は神経軸索伸長促進用途へ用いることができる。
図１は、ＰＡＣ１Ｒ高発現細胞株における、各ペプチド（ペプチド１、２、６～９）によるｃＡＭＰ誘導作用を示す。 図２は、ＶＰＡＣ１Ｒ高発現細胞株における、各ペプチド（ペプチド１、２、６～９）によるｃＡＭＰ誘導作用を示す。 図３は、神経栄養性角膜炎モデルラットにおける、各ペプチド（ペプチド１及びペプチド９）による涙液分泌促進作用を示す。 図４は、神経栄養性角膜炎モデルラットにおける、各ペプチド（ペプチド１及びペプチド９）による角膜点状表層炎（ＳＰＫ）のスコアの変化を示す。 図５は、各ペプチドによる培養三叉神経における軸索伸長の促進作用を示す。
　本発明は、ＰＡＣＡＰペプチド又は安定化ＰＡＣＡＰペプチドを含む神経栄養性角膜炎の治療又は予防用医薬組成物に関する。本発明の別の態様では、本発明は、ＰＡＣＡＰペプチド又は安定化ＰＡＣＡＰペプチドを含む神経軸索伸長促進剤に関する。さらに別の態様では、本発明は、ＰＡＣＡＰペプチド又は安定化ＰＡＣＡＰペプチドを適用することを含む、インビトロ又はインビボにおける神経軸索伸長を促進する方法に関する。安定化ＰＡＣＡＰペプチドは、ＰＡＣＡＰの生理活性を維持しつつ、安定性を高めるようにアミノ酸が改変されたペプチドをいう。具体的に安定化ＰＡＣＡＰペプチドは、ＰＡＣＡＰペプチドのアミノ酸配列において、３位及び／又は８位のアスパラギン酸残基のカルボキシ基が、テトラゾールに置換された配列又はその配列の一部が改変された配列ととからなるペプチドに関する。本発明にかかる安定化ＰＡＣＡＰペプチドは、ＰＡＣＡＰと比較して、ＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへの同程度の結合性を有する。同程度の結合性とは、ペプチドのそれぞれの受容体へのＥＣ５０値がＰＡＣＡＰと比較して、１０倍以内であればよく、好ましくは５倍以内、より好ましくは３倍以内である。ＰＡＣＡＰは、３８の残基からなるＰＡＣＡＰ３８、又は２７残基からなるＰＡＣＡＰ２７のいずれであってもよい。ＰＡＣＡＰ３８及びＰＡＣＡＰ２７は、下記の配列を有する：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　本発明において、配列の一部が改変された配列とは、元の配列に対して１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加された配列のことをいう。より好ましくは、配列の一部が改変された配列とは、元の配列に対して１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加された配列のことをいう。
　アミノ酸の置換は、配列の一部が改変された配列からなるペプチドのＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへの結合性を変更しない限りにおいて、任意の場所で生じうる。配列の一部が改変された配列からなるペプチドにおいて、結合性を維持する観点から、ＰＡＣＡＰ２７の、２位、９位、１１位、１５位～１７位、１９位～２１位、及び２７位の位置において、アミノ酸置換が生じうる。特に好ましい態様では、下記の配列：
H-X1-D-G-I-F-T-D-X2-Y-X3-R-Y-R-X4-X5-X6-A-X7-X8-X9-Y-L-A-A-V-X10（配列番号３）
　において、X1～X10で示される位置のアミノ酸が置換されうる。
　アミノ酸置換は、１又は複数個のアミノ酸が置換されていてもよいが、活性を維持する観点から、１～１０の任意の数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個のアミノ酸が置換されうる。なかでも、１～４個のアミノ酸の置換が特に好ましく、より好ましくは３個のアミノ酸が置換され、さらにより好ましくは２個のアミノ酸が置換され、特に好ましくは１のアミノ酸が置換される。
　アミノ酸の欠失は、配列の一部が改変された配列からなるペプチドのＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへの結合性を変更しない限りにおいて、任意の場所で生じうる。欠失されるアミノ酸の数は、１～１０の任意の数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０から選ばれる。結合性を変化させない観点から、１又は２個のアミノ酸の欠失が特に好ましい。アミノ酸の欠失は、元の配列のＮ末端側又はＣ末端側から欠失されてもよいし、配列の内部から欠失されてもよい。ＰＡＣＡＰ２７とＰＡＣＡＰ３８は、それぞれ同等のＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへの結合性を有していることから、ＰＡＣＡＰ３８のＣ末端側に存在するアミノ酸は欠失されても結合性に影響が少ないと考えられる。
　アミノ酸の付加は、配列の一部が改変された配列からなるペプチドのＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへの結合性を変更しない限りにおいて、任意の場所で生じうる。付加されるアミノ酸の数は、１～１０の任意の数、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０から選ばれる。アミノ酸は、元の配列のＮ末端側又はＣ末端側に付加されてもよいし、配列の内部に付加されてもよい。ＰＡＣＡＰ２７とＰＡＣＡＰ３８は、それぞれ同等のＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへの結合性を有していることから、ＰＡＣＡＰ２７のＣ末端に任意のアミノ酸を付加されても結合性に影響が少ないと考えられる。
　本発明の１の態様は、下記の式：
　　H-X1-D-G-I-F-T-D-X2-Y-X3-R-Y-R-X4-X5-X6-A-X7-X8-X9-Y-L-A-A-V-X10（配列番号３）

　　｛式中、X1は中性アミノ酸、X2は中性アミノ酸、X3は中性アミノ酸、X4は塩基性アミノ酸、X5は中性アミノ酸またはegTz、X6は非極性アミノ酸、X7は非極性アミノ酸、X8は塩基性アミノ酸、X9は塩基性アミノ酸、X10は非極性アミノ酸である｝
の配列において、３位及び／又は８位のアスパラギン酸残基のカルボキシ基が、テトラゾールに置換された配列、又はその改変配列からなるペプチドであって、ＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへの結合性を有するペプチドに関する。
　X1～X10で表されるアミノ酸は、同じ属性を有するアミノ酸によって、保存的に置換されうる。一例として、保存的置換は、下記のグループの内のアミノ酸の置換をいう：
１非極性アミノ酸：Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro、Nle、Ala
２中性アミノ酸：Ala、Ser、Thr、Tyr、Cys、Asn、Gln、Gly
３塩基性アミノ酸：Lys、Arg、His
４酸性アミノ酸：Asp、Glu
　X1、X2、及びX3における中性アミノ酸は、Ala、Ser、Thr、Tyr、Cys、Asn、Gln、又はGlyであり、より好ましくは、Ala又はSerである。
　X4、X8、及びX9における塩基性アミノ酸は、Lys、Arg、又はHisであり、より好ましくはLys又はArgである。
　X5における中性アミノ酸は、Ala、Ser、Thr、Tyr、Cys、Asn、Gln、又はGlyであり、より好ましくは、Ala、又はGlnである。X5は、さらにグルタミンのアミドがテトラゾールに置換されたアミノ酸（egTz）であってもよい。
　X6における非極性アミノ酸は、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro、Nle、又はAlaであり、より好ましくは、Met、Nle、Leu、又はAlaである。
　X7における非極性アミノ酸は、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro、Nle、又はAlaであり、より好ましくは、Val、又はAlaである。
　X10非極性アミノ酸は、Val、Leu、Ile、Met、Phe、Trp、Pro、Nle、又はAlaであり、より好ましくは、Leu又はAlaである。
　本発明において、改変配列とは、元の配列に対して１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加された配列のことをいう。より好ましくは、改変配列とは、元の配列に対して１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加された配列のことをいう。
　配列番号３の配列において、３位及び／又は８位のアスパラギン酸残基のカルボキシ基が、テトラゾールに置換された配列の改変配列とは、好ましくは、配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して１又は複数個のアミノ酸が欠失又は付加された配列である。より好ましくは、配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して１又は２個のアミノ酸が欠失されうるし、配列番号３で表されるアミノ酸配列に対して下記のＣ末端付加配列が付加されうる。
　理論によって限定されることを意図するものではないが、ＰＡＣＡＰ２７とＰＡＣＡＰ３８は、それぞれ同等のＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへの結合性を有していることから、ＰＡＣＡＰ２７においてＣ末端側へのアミノ酸付加は、ＰＡＣ１Ｒへの結合性に影響しない。したがって、本発明がＰＡＣＡＰ２７又はその安定化ペプチドに関する場合、さらにＣ末端付加配列を含むことができるし、Ｃ末端付加配列は存在しなくてもよい。Ｃ末端付加配列は、１～１１の任意のアミノ酸からなる配列をいう。Ｃ末端付加配列は、ＰＡＣＡＰ３８の２８位～３８位のアミノ酸に対応することが好ましい。したがって、Ｃ末端配列としては下記の配列が挙げられる：
　　GKRYKQRVKNK（配列番号３７）；
　　GKRYKQRVKN（配列番号３８）；
　　GKRYKQRVK（配列番号３９）；
　　GKRYKQRV（配列番号４０）；
　　GKRYKQR（配列番号４１）；
　　GKRYKQ（配列番号４２）；
　　GKRYK（配列番号４３）；
　　GKRY（配列番号４４）
　　GKR；
　　GRR；
　　GK；及び
　　GR；
　　G。
　本発明に係るペプチドは、ＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び／又はＶＰＡＣ２Ｒに対する結合性が失われない限りにおいて、Ｄ体またはＬ体のアミノ酸を用いることができ、あるいはラセミ体のアミノ酸を用いてもよい。また、同様に本発明に係るペプチドは、２－アミノイソ酪酸やＬ－２－アミノ酪酸のような非天然アミノ酸で構成されていてもよく、Ｎ末端のアミノ基、Ｃ末端のカルボキシ基又はアミノ酸側鎖の官能基が任意に修飾された誘導体が含まれる。修飾の例としては、アミノ基への保護基の付加（例えば、アシル化（ホルミル化、アセチル化等）、メシル化、ウレア化、カルバメート化、Ｂｏｃ化、Ｆｍｏｃ化）、カルボキシ基のエステル化（エチル化など）などが挙げられる。また、通常生体内で生じうる修飾、例えばリン酸化、アミド化、メチル化、エステル化、アセチル化などの他、合成過程で生じるか、又は精製を容易にする修飾、例えばビオチン化が含まれてもよい。また、ペプチドの生体内半減期を延長する目的で、ＰＥＧ化などの修飾が行われてもよい。特に、安定性を高める観点から、Ｎ末端のアミノ酸の遊離アミノ基が保護基（例えばアシル基）により保護されうる。例えば、Ｎ末端のアミノ酸の遊離アミノ基はアセチル化またはメシル化されうる。ＰＡＣＡＰの３位及び／又は８位のアスパラギン酸残基のカルボキシ基が、テトラゾールに置換された配列からなるペプチドにおいて、Ｎ末端がアセチル化またはメシル化されることにより、安定性が更に向上する。Ｃ末端はカルボキシ基（－ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（－ＣＯＯ－）、アミド（－ＣＯＮＨ2）またはエステル（－ＣＯＯＲ）の何れであってもよく、さらには、糖鎖付加されていてもよい（例えば、ＷＯ２０１７／０２７８４８を参照）。
　本発明の具体的な態様では、本発明は下記表１に示される配列を有するペプチド３～３４、又はその改変配列に関する：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　アスパラギン酸のカルボキシ基が、テトラゾールに置換されたアミノ酸は下記の構造を有する：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 　また、本明細書中において、配列中の表記として「Tz」を用いるものとする。
　さらに、グルタミンのアミドがテトラゾールに置換されたアミノ酸は下記の構造を有する：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 　また、本明細書中において、配列中の表記として「egTz」を用いるものとする。
　本発明に係るペプチドは、任意の製造方法により製造することができる。例えば、Ｂｏｃ法又はＦｍｏｃ法等を用いて固相合成又は液相合成を行うことにより製造することができる。また、別法では、本発明のペプチドをコードする核酸を遺伝子導入法により、宿主細胞に導入し、宿主細胞により合成させることにより製造することができる。この場合ペプチドの末端にポリヒスチジンタグ等のタグペプチドを付加するように設計することで、発現後に精製を容易にすることができる。
　本発明に係るペプチドは、医薬上許容される塩が含まれる。医薬上許容される塩としては、無機酸との塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等）、有機酸との塩（例えば、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩等）、又は塩基との塩（例えば、アンモニウム塩、メチルピリジニウム塩、アセチルピリジニウム塩等）が挙げられる。本発明に係るペプチドは、水和物、又は溶媒和物も含まれる。
　Ｎ末端がメシル化されたヒスチジンは反応式１に示される方法又はこれに準じた方法により製造することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ｛式中、Ｔｒｔはトリチル基、Ｍｅはメチル基を表す。｝
　反応式１の方法では、一般式化合物（Ｉ）で表される化合物を塩基存在下、塩化メタンスルホニルを反応させることにより、化合物（ＩＩ）を製造し、次いで、化合物（ＩＩ）をメタノール中、塩基を用いた加水分解により化合物（ＩＩＩ）を製造することができる。
　化合物（ＩＩ）の製造において、塩基は化合物（Ｉ）に対して０．２～５当量、好ましくは１～３当量使用される。用いる塩基はトリエチルアミン、Ｎ,Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、４－ジメチルアミノピリジンが挙げられ、好ましくはトリエチルアミンを挙げることができる。塩化メタンスルホニルは０．１～５当量、好ましくは１～２当量使用される。溶媒は反応に影響を及ぼさない限り特に限定されず、例えば、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、トルエン等が挙げられ、好ましくはジクロロメタンを挙げることができる。反応温度は、通常１℃～３０℃、好ましくは１５℃～２５℃であり、反応時間は、通常０．５時間～１２時間、好ましくは０．５時間～２時間である。
　化合物（ＩＩＩ）の製造において、塩基は化合物（ＩＩ）に対して、０．１～１０当量、好ましくは１～３当量使用される。塩基として、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムが挙げることができるが、好ましくは水酸化カリウムを挙げることができる。溶媒は有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、１、４－ジオキサンおよびテトラヒドロフラン）と水との混合溶媒が挙げられ、好ましくはメタノールおよび水との混合溶媒を挙げることができる。反応時間は、用いる試薬又は溶媒により異なるが、通常０．５時間～１２時間、好ましくは０．５時間～３時間である。反応温度は、用いる試薬又は溶媒により異なるが、通常０℃～１００℃、好ましくは６０℃～１００℃である。
　本発明にかかるペプチドは、ＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ、及び/又はＶＰＡＣ２Ｒへ結合することで、ＰＡＣＡＰと同様の生理活性を発揮することができる。理論に限定されることを意図するものではないが、神経栄養性角膜炎の予防又は治療用途は、これらの受容体への結合を介した作用でありうる。より具体的に、本発明にかかるペプチドは、神経栄養性角膜炎により引き起こされる涙液量の減少を抑制し、また角膜点状表層炎を抑制することができる。さらには、本発明にかかるペプチドは、神経の軸索伸長を促進する。本発明にかかるペプチドの軸索伸長促進作用により、三叉神経の損傷を治療するか又は三叉神経を再生することができる。本発明に係るペプチドは、これらの作用を介して、神経栄養性角膜炎を治療又は予防することができる。また、本発明にかかるぺプチドは、インビボ又はインビトロにおいて神経の軸索伸長を促進することができる。インビトロにおいて軸索伸長を促進する場合、本発明にかかるぺプチドを含む培地中で神経細胞を培養する。神経細胞の培養方法は、本技術分野に周知の任意の方法で行うことができ、本技術分野に広く知られている神経細胞培養培地を使用することができる。
　本発明は、上記のペプチドの治療有効量を含む神経栄養性角膜炎の治療又は予防用医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、患者に対して投与することで、ＰＡＣＡＰの生理作用により神経栄養性角膜炎を治療することができるし、或いはこのような疾患を患う可能性のある患者に対し投与することで、神経栄養性角膜炎を予防することができる。また、「治療」とは、障害又は疾患が発症した際にそれらの状態の悪化を防止し、進行を遅らせ、それらの状態を現状維持、軽減又は消退させることをいい、「予防」とは障害又は疾患の発症をその発症前に防止することをいう。神経栄養性角膜炎を患う可能性のある患者とは、例えば角膜のヘルペスのようなウイルス感染、眼外傷、角膜手術、さらに糖尿病などを患う患者が挙げられる。
　本発明にかかるペプチド、又は当該ペプチドを含む、医薬組成物は、治療対象疾患に応じて非経口投与又は経口投与されうる。経口投与としては、舌下、口腔内、内服投与が挙げられる。非経口投与としては、例えば、静脈内、動脈内、皮下、局所、腹腔内、筋肉内、経鼻、経皮、経粘膜、髄膜内、経直腸、筋肉内、脳内、髄膜内、くも膜下、硬膜内、硬膜外、点眼、点耳、点鼻、眼内の経路で投与することができる。眼内経路としては、さらに具体的に、結膜下、テノン嚢下、硝子体内の経路が挙げられる。本発明にかかるペプチドを含む医薬組成物は、その投与経路に応じて適宜剤形することができ、例えば点眼剤、注射剤、粉末剤、輸液製剤、顆粒剤、錠剤、坐剤等いかなるものでもよいが、非経口投与する観点では、点眼剤、注射剤、輸液製剤、用時調製用の粉末剤等が好ましい。眼内投与用の製剤として、例えば硝子体内注射剤、結膜下注射剤、及びテノン嚢下注射剤が挙げられる。また、これらの製剤は製薬上許容される種々の補助剤、即ち、担体やその他の助剤、例えば、安定剤、防腐剤、無痛化剤、乳化剤等の添加剤を含有していてもよい。また、神経保護効果、炎症抑制効果又は外分泌線分泌効果を有する別の薬剤と組み合わせて使用することもできる。
　本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
実施例１：ペプチド合成１
Ms-His(Trt)-OMeの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 　N-im-トリチル-L-ヒスチジンメチルエステル塩酸塩（2.02 g、 4.5 mmol）のジクロロメタン溶液（40 mL）に、N，N－ジイソプロピルエチルアミン（1.0 mL, 5.7 mmol）とジクロロメタン（2.0 mL）に溶解したメタンスルホニルクロリド（314.7mg，2.7mmol）を加えて25℃2時間40分反応させ、さらに，ジクロロメタン（1.0 mL）に溶解したメタンスルホニルクロリド（174.7mg，1.5mmol）を加え，25℃1時間反応させた。その後，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止させ、酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を１０％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。反応が完全に進行していなかったため，得られた残渣にジクロロメタン（15ｍL）を加え，次いでトリエチルアミン（1.0 mL、 7.2 mmol）およびメタンスルホニルクロライド（326.8 mg、 2.9 mmol）のジクロロメタン溶液（1.0 mL）を加え、室温下で1時間撹拌した。その後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて反応を停止させ、酢酸エチルで抽出し、得られた有機層を１０％クエン酸水溶液、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧留去し、淡黄色の固体を得た（2.35 g, >100%）。得られた固体はさらに精製することなく次の反応に用いた。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.38 (1H, d, J = 1.2 Hz), 7.34-7.31 (9H, m), 7.12-7.08 (6H, m), 6.57 (1H, d, J = 2.4 Hz), 6.30 (1H, d, J = 8.4 Hz), 4.40 (1H, dt, J = 8.4, 5.2 Hz), 3.65 (3H, s), 3.05 (2H, d, J = 5.2 Hz), 2.97 (3H, s).
Ms-His(Trt)-OHの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 　Ms-His-OMe（2.21 g, 4.5 mmol）のメタノール溶液（15 mL）に、1 Mの水酸化カリウム水溶液（9.0 mL, 9.0 mmol）を加え、１．５時間還流した。反応溶液を室温まで冷却し、１０％クエン酸水溶液でｐＨ５まで酸性にし、ジクロロメタンで抽出をした。得られた有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶液を減圧留去した後、残渣にジクロロメタンとヘキサンを加え、白色固体を析出させ、ろ取した（2.32 g, >100%）。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.84 (1H, s), 7.31-7.33 (9H, m), 7.12-7.09 (6H, m), 6.82 (1H, s), 4.13 (1H, m), 3.34 (1H, dd, J = 14.8, 3.6 Hz), 3.17 (1H, dd, J = 14.8, 6.8 Hz), 2.90 (3H, s).
実施例２：ペプチド合成２
　ペプチドシンセサイザー（モデル：PSSM-8　島津製作所製）を用いてＦｍｏｃ法による固相合成法により試験に用いたペプチドを合成した。固相合成で用いる非天然アミノ酸であるＦｍｏｃ－ＴＺ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ-ＴＺ（ｔｒｔ）-ＯＨ、およびＦｍｏｃ－ｅｇＴＺ（ｔｒｔ）－ＯＨはAstatech社より購入した。下記の配列を有するペプチド１～３４を合成し、合成ペプチドの分子量は質量分析（MALDI TOF）を実施した。下記表２に示すように、いずれの測定値も理論値によく一致した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
実施例３：ペプチドの安定性試験１
［測定サンプルの調製］
　実施例２で合成したペプチド１および３～５を秤量し、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、１．０ｍＭのペプチド溶液を調製した。さらに、１．０ｍＭのペプチド溶液をリン酸緩衝液で１００μＭに希釈をした。クロマトディスク（Merck　millipore社製 Millex-GV，０．２２μｍ）でろ過し、ろ液をＬＣバイアル（Waters Deactivated Qsert Vial）に分注した。調製したペプチド溶液について、４０℃の恒温槽内で１か月または２か月間インキュベートして、保存後サンプルを得た。また、同時に調製したペプチド溶液のうち保存に供さないサンプルを標準サンプル（イニシャルサンプル）とした。標準サンプル及び保存後サンプルを試料分析まで－３０℃で保存した。
［水分透過率］
　ペプチド水溶液と保存容器の合計重量を検体重量とし、保存前の検体重量を秤量し、各条件の保存後にも同様に保存後の検体重量を秤量した。また、保存容器の空重量を秤量し、下記の式に基づいて水分透過率を求めた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000009
　標準サンプル及び保存後サンプルをボルテックスミキサーで撹拌後、ＨＰＬＣバイアル（Waters社製　Deactivated Qsert vial）にペプチド溶液を移した。逆相ＨＰＬＣ（ＨＰＬＣシステム：島津製作所製 Prominence）を下記表３の条件で作動して、ペプチド溶液の分析を行い、クロマトグラムを得た。
[HPLC分析条件１]
カラム：Waters社製　XSelect CSH C18、5 μm、4.6×250 mm
ガードカラム：Waters社製　XSelect CSH C18、5 μm、4.6×20 mm Guard Cartridge
検出波長：２２０ｎｍ
移動相Ａ：０．１％ギ酸水溶液
移動相Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル溶液
測定時間：３０分間
測定サンプル注入量：５０ μL
流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ
サンプルクーラー：４℃
カラム温度４０℃
移動相の送液：移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を、下記表３のように変えて直線濃度勾配制御した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　クロマトグラムにおいて、ペプチドのピーク面積値を求め、式（２）により残存率（水分補正前残存率）を算出した。また、水分補正前残存率に対し、式（３）にしたがって、容器の水分透過率を考慮に入れることで水分補正後残存率を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000012
　保存後サンプル中におけるペプチドの水分補正後残存率を表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
 　ペプチド１（ＰＡＣＡＰ）は４０℃で１か月保存後において、３７．４％、４０℃で２か月保存後において、２１．３％と安定性が低かった。ペプチド１に対し、ペプチド１の３残基目のアスパラギン酸側鎖のカルボキシ基のみをテトラゾールに置換したペプチド３においては、ペプチド１よりも高い安定性を示し、また、８残基目のアスパラギン酸側鎖のカルボキシ基のみをテトラゾールに置換したペプチド４でも、ペプチド１に比べて安定性が向上していた。しかしながら、ペプチド１の３および８残基目のアスパラギン酸側鎖のカルボキシ基のみをテトラゾールに置換したペプチド５では、ペプチド３およびペプチド４よりも安定性がさらに向上し、ＰＡＣＡＰの安定性向上に、一つのテトラゾール置換よりも二つのテトラゾール置換がより有効であることを示した。
実施例４：ペプチドの安定性試験２
　実施例２で合成したペプチド１、２および６～９を秤量し、トリス緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、１．０ｍＭのペプチド溶液を調製した。この溶液をクロマトディスク（Merckmillipore社製 Millex-GV，０．２２μｍ）でろ過した。ろ液をトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で１００μＭに希釈し、チューブ（eppendorf社製のProtein Lobind Tube）に分注した。調製したペプチド溶液を、６０℃の恒温槽内で１週間または２週間インキュベートして、保存後サンプルを得た。また、同時に調製したペプチド溶液のうち保存に供さないサンプルを標準サンプル（イニシャルサンプル）とした。標準サンプル及び保存後サンプルを試料分析まで－３０℃で保存した。
　保存後サンプルを下記のHPLC分析条件２にて測定し、実施例３と同様に保存後サンプル中におけるペプチドの水分補正後残存率を算出した。その結果を表６に示した。
[HPLC分析条件２]
カラム：Waters社製　XSelect CSH C18、5 μm、4.6×250 mm
ガードカラム：Waters社製　XSelect CSH C18、5 μm、4.6×20 mm Guard Cartridge
検出波長：２２０ｎｍ
移動相Ａ：０．１％ギ酸水溶液
移動相Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル溶液
測定時間：２０分間
測定サンプル注入量：５０ μL
流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度４０℃
サンプルクーラー：２５℃
移動相の送液：移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を、下記表５のように変えて直線濃度勾配制御した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
 　ペプチド１（ＰＡＣＡＰ）は、６０℃で１週間保存後には、２６．６％、２週間保存後には１５．８％と極めて安定性が悪く、またＰＡＣＡＰのＮ末端をアセチル化したペプチド２も同等の安定性でしかなかった。一方で、３位と８位のアスパラギン酸のカルボキシ基をテトラゾールに置換したペプチド６及び７（ペプチド６では、さらに１７位のメチオニンがノルロイシン（配列中の表記として「Nl」を用いるものとする）に置換されており、ペプチド７では１７位のメチオニンがさらにロイシンに置換されている）では、６０℃で１週間保存後には、９１．３％及び９１．７％、２週間保存後には８２．４％及び８４．８％と安定性が大幅に向上した。さらにペプチド６及び７のＮ末端をアセチル化されたペプチド８及び９では、６０℃で１週間保存後には、９８．１％及び９８．４％、２週間保存後には９２．９％及び９２．８％とさらに安定性が向上した。ここで、６０℃における１週間および２週間の加速試験は、室温（２５℃）における、約１年および約２年に相当する。したがって、ペプチド８及び９は、室温で２年間（９０％以上の残存率）安定であると期待される。
実施例５：ペプチドの安定性試験３
　実施例２で合成したペプチド１２～２５、２７および２８を秤量し、トリス緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、１．０ｍＭのペプチド溶液を調製した。この溶液をクロマトディスク（Merckmillipore社製 Millex-GV，０．２２μｍ）でろ過した。ろ液をトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で１００μＭに希釈し、チューブ（eppendorf社製のProtein Lobind Tube）に分注した。調製したペプチド溶液を、６０℃の恒温槽内で１週間または２週間の間インキュベートして、保存後サンプルを得た。また、同時に調製したペプチド溶液のうち保存に供さないサンプルを標準サンプル（イニシャルサンプル）とした。試料分析まで標準サンプルおよび保存後サンプルは－３０℃で保存した。
　保存後サンプル中におけるペプチドの水分補正後残存率を実施例４と同様に算出し、その結果を表７に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
 　ペプチド１２（ペプチド９のＮ末端アセチル基をメシル基に置換したペプチド）はペプチド９と同等の安定性を示し、Ｎ末端メシル基置換でも高い安定性を示した。ペプチド１３（ペプチド９の１６残基目のグルタミン側鎖をテトラゾールに置換したペプチド）はペプチド９と同等の安定性を示し、グルタミン側鎖をテトラゾールに置換したペプチドも高い安定性を維持することを示した。ペプチド９の任意の残基にアラニン又はアルギニンで置換又は付加したペプチド１４－２５、ペプチド２７およびペプチド２８においても、高い安定性を維持した。
実施例５－２：ペプチドの安定性試験３
　実施例２で合成したペプチド２９～３４を秤量し、トリス緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、１．０ｍＭのペプチド溶液を調製した。この溶液をクロマトディスク（Merckmillipore社製 Millex-GV，０．２２μｍ）でろ過した。ろ液をトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で１００μＭに希釈し、チューブ（eppendorf社製のProtein Lobind Tube）に分注した。調製したペプチド溶液を、６０℃の恒温槽内で２週間の間インキュベートして、保存後サンプルを得た。また、同時に調製したペプチド溶液のうち保存に供さないサンプルを標準サンプル（イニシャルサンプル）とした。試料分析まで標準サンプルおよび保存後サンプルは－３０℃で保存した。
　保存後サンプル中におけるペプチドの水分補正後残存率を実施例４と同様に算出し、その結果を表７－２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
 　ペプチド２９（ペプチド１５のＮ末端アセチル基をメシル基に置換したペプチド）はペプチド１５と同等の安定性を示し、Ｎ末端メシル基置換でも高い安定性を示した。ペプチド３０（ペプチド２３のＮ末端アセチル基をメシル基に置換したペプチド）はペプチド２３と同等の安定性を示し、Ｎ末端メシル基置換でも高い安定性を示した。ペプチド３２～３４は、ペプチド９の任意の残基にアラニンで置換したペプチド３２～３４においても、高い安定性を維持した。ペプチド３１（ペプチド３２のＮ末端アセチル基をメシル基に置換したペプチド）はペプチド３２と同等の安定性を示した。
実施例６：ペプチドの安定性試験４
　実施例２で合成したペプチド１０および１１を秤量し、リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、１．０ｍＭのペプチド溶液を調製した。この溶液をクロマトディスク（Merckmillipore社製 Millex-GV，０．２２μｍ）でろ過した。ろ液をリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で100 μMに希釈し、チューブ（eppendorf社製のProtein Lobind Tube）に分注した。調製したペプチドについて、４０℃の恒温槽内で１か月または２か月間インキュベートして、保存後サンプルを得た。また、同時に調製したペプチド溶液のうち保存に供さないサンプルを標準サンプル（イニシャルサンプル）とした。標準サンプル及び保存後サンプルを試料分析まで－３０℃で保存した。
　保存後サンプル中におけるペプチドの水分補正後残存率を実施例４と同様に測定し、その結果を表８に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
 　Ｎ末端がアセチル基のペプチド１０とＮメシル基のペプチド１１の結果より、Ｎ末端置換基がアセチル基およびＮメシル基のいずれの場合であってもペプチドは同程度に安定化されることが明らかとなった。
実施例７：ペプチドの安定性試験５
実施例２で合成したペプチド２６を秤量し、トリス緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して、１．０ｍＭのペプチド溶液を調製した。この溶液をクロマトディスク（Merckmillipore社製 Millex-GV，０．２２μｍ）でろ過した。ろ液をトリス緩衝液（ｐＨ７．０）で１００μＭに希釈し、チューブ（eppendorf社製のProtein Lobind Tube）に分注した。調製したペプチド溶液を、６０℃の恒温槽内で１週間または２週間の間インキュベートして、保存後サンプルを得た。また、同時に調製したペプチド溶液のうち保存に供さないサンプルを標準サンプル（イニシャルサンプル）とした。試料分析まで標準サンプルおよび保存後サンプルは－３０℃で保存した。
　保存後サンプルを下記のHPLC分析条件３で測定し、実施例３と同様に保存後サンプル中におけるペプチドの水分補正後残存率を算出した。その結果を表１０に示した。
[HPLC分析条件３]
カラム：Waters社製　XSelect CSH C18、5 μm、4.6×250 mm
ガードカラム：Waters社製　XSelect CSH C18、5 μm、4.6×20 mm Guard Cartridge
検出波長：２２０ｎｍ
移動相Ａ：０．１％ギ酸水溶液
移動相Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル溶液
測定時間：２０分間
測定サンプル注入量：５０ μL
流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ
カラム温度４０℃
サンプルクーラー：２５℃
移動相の送液：移動相Ａ及び移動相Ｂの混合比を、下記表９のように変えて直線濃度勾配制御した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
 　ペプチド２６も同様に高い安定性を示した。
実施例７：ＰＡＣＡＰ２７及びその安定化ペプチドのｃＡＭＰアッセイ
[細胞培養]
　マイトマイシン処理済みの凍結したＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＰＡＣ１またはＶＰＡＣ１レセプター高発現細胞株：DiscoveRx社から購入）を、１．３５×１０4ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ウェルになるようCell plating reagent（DiscoveRx社製）で調製後、９６ウェル培養プレートに播種した。細胞を、５％ＣＯ2インキュベーター内で１８～２４時間、３７℃で培養して、プレートに細胞を接着させた。
[試薬調製]
　実施例２で合成したペプチド１、２および６～９の粉末を０．１ｍＭになるように水に溶解した後、２０μＭになるようにCell assay buffer（DiscoveRx社製）（０．５ｍＭのＩＢＭＸ、０．００１％ＢＳＡを含む）で希釈した。そこから同じCell assay bufferで５倍希釈系列を作製し、アッセイに使用した。
[ｃＡＭＰアッセイ]
　ｃＡＭＰアッセイは、Hit Hunter cAMP assay for Biologicsキット（DiscoveRx社製、Cat. No.90-0075LM25）を用いて、キット付属の説明書に従って行った。ｃＡＭＰ抗体溶液と希釈した各濃度のペプチド１、２、６～９溶液を混合し、ペプチド－ｃＡＭＰ抗体混合液を作製した。続いて、ＣＨＯ－Ｋ１細胞の培養プレートから培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、ペプチド－ｃＡＭＰ抗体混合液を細胞に添加し、３７℃の５％ＣＯ2雰囲気下で３０分間インキュベートした。次にWorking detection solutionを添加し、培養プレートをアルミホイルで遮光後、２５℃で１時間インキュベートした。インキュベート後、Solution Aを添加し、培養プレートをアルミホイルで遮光後、２５℃で３時間インキュベートした。最後に、化学発光シグナルを、ＧｌｏＭａｘ検出器（Promega社製）を用いて、Luminescence, Integration time(1 sec)の条件で検出した。得られたRelative luminescence unit（ＲＬＵ）値をGraphPad Prism Ver 6.05（Graph Pad社製）にて解析し、各ペプチドにおけるＥＣ50値を算出した。各ペプチドのＰＡＣ１ＲまたはＶＰＡＣ１Ｒ高発現細胞株でのｃＡＭＰ誘導作用のＥＣ50値の結果を図１、図２及び表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
　合成したペプチド１、２および６～９は、ＰＡＣ１ＲとＶＰＡＣ１Ｒのそれぞれの高発現細胞に対して、ｃＡＭＰ誘導能を示し、それらのＥＣ50値は、ネイティブペプチド（ペプチド１：ＰＡＣＡＰ２７）と同程度であった。
　表６及び表１１の結果をまとめると、本発明にかかるペプチド（ペプチド６～９）は、ＰＡＣＡＰと比較して、水溶液中での極めて改善された安定性を有するとともに、ＰＡＣＡＰと同等の生理活性を維持する。特に、室温において２年を超える貯蔵寿命を有することにより、液体製剤、例えばバイアル、アンプル、点眼剤などの製品として開発が可能となる。
実施例８：ＰＡＣＡＰ２７安定化ペプチドのｃＡＭＰアッセイ２
[試薬調製]
　実施例２で合成したペプチド３～５および１０～２８の粉末をそれぞれ０．１ｍＭになるように水に溶解した後、２０μＭになるようにCell assay buffer（DiscoveRx社製）(０．５ｍＭのＩＢＭＸ、０．００１％ＢＳＡを含む）で希釈した。そこから同じCell assay bufferで５倍希釈系列を作製し、アッセイに使用した。
　実施例７と同様の方法でペプチド３～５および１０～２８におけるＥＣ50値を算出した。各ペプチドのＰＡＣ１又はＶＰＡＣ１高発現細胞株でのｃＡＭＰ誘導作用のＥＣ50値の結果を表１２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
 　本発明にかかるペプチド（ペプチド３～５、１０～２８）は、ＰＡＣＡＰと比較して、水溶液中での極めて改善された安定性を有するとともに、ＰＡＣＡＰと同等の生理活性を維持する。
実施例８－２：ＰＡＣＡＰ２７安定化ペプチドのｃＡＭＰアッセイ２
[試薬調製]
　実施例２で合成したペプチド２９～３４の粉末をそれぞれ０．１ｍＭになるように水に溶解した後、２０μＭになるようにCell assay buffer（DiscoveRx社製）（０．５ｍＭのＩＢＭＸ、０．００１％ＢＳＡを含む）で希釈した。そこから同じCell assay bufferで５倍希釈系列を作製し、アッセイに使用した。
　実施例７と同様の方法でペプチド２９～３４におけるＥＣ50値を算出した。各ペプチドのＰＡＣ１又はＶＰＡＣ１高発現細胞株でのｃＡＭＰ誘導作用のＥＣ50値の結果を表１２－２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
 　本発明にかかるペプチド（ペプチド２９～３４）は、ＰＡＣＡＰと比較して、水溶液中での極めて改善された安定性を有するとともに、ＰＡＣＡＰと同等の生理活性を維持する。
実施例９：ＰＡＣＡＰ２７及びその安定化ペプチドの神経栄養性角膜炎モデルによる評価
　ラットの背部皮下にカプサイシンを投与することにより、角膜神経障害および角膜知覚の減弱を誘発し、それに伴い、涙液量の減少、角膜点状表層炎（以下、ＳＰＫ）が誘発されるモデルラットを作成した(非特許文献３：Investigative Ophthalmology & Visual Science（2012）, vol. 53, No.13, p.8280-8287)。当該ラットにＰＡＣＡＰ２７及びその安定化ペプチドを点眼し、角膜傷害の抑制効果を検討した。具体的な実験方法は以下の通り行った。
［カプサイシン投与］
カプサイシン（ＳＩＧＭＡ社製）を１０％ＥｔＯＨ、１０％Ｔｗｅｅｎ８０含有ＰＢＳに溶解し、５０ｍｇ／ｋｇ・ｂ．ｗ．となるように４日齢の雄性Ｗｉｓｔａｒ／ＳＴラットの背部皮下に投与した。
［点眼液の調製］
　基剤は、滅菌水１００ｍＬに０．３ｇのトリスヒドロキシメチルアミノメタン（ナカライテスク社製）及び４．４ｇのＤ（－）－マンニトール（ナカライテスク社製）を溶解し、１Ｎ・ＨＣｌを加えｐＨを７に調製した。ペプチド１及びペプチド９は、０．１％となるように基剤に溶解した。各点眼液は、室温で保存した。点眼は、カプサイシンを投与して３週間後から開始し、１日に３回、毎日、１０μＬずつ、両眼に点眼した。
［涙液量の測定］
　涙液量の測定はゾーンクイック（あゆみ製薬）をラットの下外眼角に挿入し、２０秒後、赤く染色された部分の長さを付属の目盛りで計測した。ペプチドを点眼する１０分前、５分前に涙液量を測定し、平均した値を点眼前の涙液量とした。ペプチドを点眼し、５分後の涙液量を測定し、点眼前との涙液量の差を求めた。結果を図３に示す。
　神経栄養性角膜炎を誘発したラットにおいて、ペプチド１及びペプチド９の点眼は同程度の涙液分泌作用を示した。
［ＳＰＫの観察］
　点眼開始２週間後のＳＰＫを評価した。イソフルラン吸入麻酔下で、ＰＢＳに溶解した１％フルオレセインナトリウム（和光純薬社製）水溶液を１μＬ眼表面に点眼し、１分間強制閉眼させた後、生理食塩水で余分なフルオレセイン染色液を洗い流した。その後、細隙灯顕微鏡で眼表面を観察し、あたらしい眼科　２１　（１）：８７－９０　（２００４）の村上らの方法に準じて、角膜障害の程度を評価した。具体的には、角膜を上部・中央部・下部の３領域に分け、各領域について下記の基準に従いスコアを付け、３領域の各スコアを合計した値を、ＳＰＫスコアとした。〈基準〉０：点状染色がない，１：疎（点状のフルオレセイン染色が離れている），２：中間（１，３の中間），３：密（点状のフルオレセイン染色のほとんどが隣接している）。結果を図４に示す。
　ペプチド１及びペプチド９の点眼はカプサイシン投与によるＳＰＫスコアの上昇を改善した。
［角膜知覚の測定］
角膜知覚は、Cochet-Bonnet角膜知覚計（半田屋商店）を用いて測定する。角膜知覚計のフィラメント長を６０ｍｍに設定し、フィラメントを角膜中央に垂直に接触させて刺激する。眼瞼の反応を観察し、反応があった場合はそのフィラメント長を記録する。反応がみられないときは５ｍｍずつ長さを短くして測定する。上記の操作を３回繰り返し、得られたフィラメント長の平均値をその個体の角膜知覚閾値（ＣＳＴ）とする。
　ペプチド１及びペプチド９の点眼はカプサイシン投与による角膜知覚の低下を改善する。
［角膜神経染色］
　ラットを安楽死させた後、眼球を摘出し、ザンボニ液（和光純薬社製）に浸漬し、室温で１５分間静置する。眼球から角膜を採取し、ザンボニ液に再度浸漬し、室温で４５分間静置する。その後、３０％スクロース含有０．１Ｍリン酸バッファーに置換する。角膜組織の沈降を確認後、はさみで切れ込みを挿入し、０．１％ＥＤＴＡ、０．０１％タイプＩＶ－Ｓヒアルロニダーゼ（シグマ社製）含有０．１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ５．３）に浸漬し、３７℃で一晩静置する。０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００含有ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ－Ｔに浸漬し、室温で２時間ブロッキングする。Alexa Fluor 488結合マウス抗β-チューブリン, ClassIII抗体 (BD社製)を室温で一晩反応させる。ＰＢＳ－Ｔで洗浄後、角膜組織をスライドガラスに貼り付け、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ　ｈａｒｄ　ｓｅｔ　ｍｏｕｎｔｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍで封入する。封入したサンプルを共焦点顕微鏡で観察し、角膜上皮下神経叢の画像を取得した。神経層の渦状構造の神経密度は、画像解析ソフト （Image J）でショール解析を行うことにより定量する。
　ペプチド１及びペプチド９の点眼はカプサイシン投与による神経密度の低下を改善する。
実施例１０：ラット三叉神経細胞に対するＰＡＣＡＰ２７及びその安定化ペプチドの軸索伸長効果の評価
［三叉神経の単離・培養］
　日本エスエルシー株式会社より購入したラット（Ｓｌｃ：　Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ　１７日齢、雌雄を含む）を炭酸ガス吸入により安楽死させ、三叉神経節を採取した。採取した三叉神経節をＨａｎｋｓ’　ｂａｌａｎｃｅｄ　ｓａｌｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　（ＨＢＳＳ）で洗浄後、コラゲナーゼＡ（Ｒｏｃｈｅ）で３７℃、３０分間処理した。その後、神経細胞分散液（Ｗａｋｏ）をプロトコルに従って使用し、細胞を分散させた。さらに、Ｄｅｂｒｉｓ　ｒｅｍｏｖａｌ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　ｂｉｏｔｅｃ）及びＭｙｅｌｉｎ　ｒｅｍｏｖａｌ　ｂｅａｄｓ　ＩＩ　（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　ｂｉｏｔｅｃ）をプロトコルに従って使用し、Ｄｅｂｒｉｓとミエリンを除去した。単離した三叉神経細胞を培養液で懸濁後、ポリリジン／ラミニンコーティング済みの８ウェルチャンバースライド（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に２．５×１０３細胞／ウェルとなるよう播種した。培養液は、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ－ＡにＢ２７サプリメント（終濃度２％）およびＧｌｕｔａＭＡＸ（終濃度２ｍＭ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（終濃度１％）を含むものを用いた。培養条件は、二酸化炭素濃度５％、空気濃度９５％、湿度１００％、温度３７℃とした。播種した後、２４時間培養し、終濃度１μＭとなるように、ペプチド１、ペプチド９、ペプチド１２、ペプチド１８、ペプチド３１を含む培養液に交換した。コントロールはペプチドを含まない培養液に交換した。培地交換後、さらに２４時間培養した。
２．染色
　ペプチドを含む培養液に培地交換し、２４時間培養後のラット三叉神経細胞を、２％パラホルムアルデヒド液に、室温にて２０分浸して固定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含む２％　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎを添加し、３０分間反応させた。ＰＢＳで洗浄後、神経細胞体および神経突起を構成するニューロフィラメントを特異的に認識するｐｈｏｓｐｈｏ－ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ　Ｈ抗体（Merk, MAB1592-C）を室温で１時間反応させた。１時間反応後、蛍光標識二次抗体（インビトロジェン、#A-11031）を室温で１時間反応させて標本を蛍光染色し、染色された細胞を蛍光顕微鏡下で観察した。染色された細胞像は蛍光顕微鏡からコンピュータに画像として取り込んだ。
３．画像解析
　ラット三叉神経細胞の神経突起形成の程度を評価するために、コンピュータに取り込んだ染色細胞の画像において細胞体直径の２倍以上長さの神経突起を有する細胞を神経突起形成細胞として、その細胞数の全細胞数に占める比率（％）を算出した（Ｏｔｏｒｉ　Ｙ，　Ｗｅｉ　ＪＹ，　Ｂａｒｎｓｔａｂｌｅ　ＣＪ．　Ｉｎｖｅｓｔ．　Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ　Ｖｉｓ　Ｓｃｉ　（１９９８）　３９，　９７２－９８１）。結果を図５に示す（Ｎ＝８）。コントロールに対する有意差をＤｕｎｎｅｔｔ検定により決定した（Ｐ＜０．００１）。
ペプチド１、ペプチド９、ペプチド１２、ペプチド１８、ペプチド３１は三叉神経細胞の軸索伸長促進効果を示した。
製剤例
　本発明のペプチドを有効成分として含有する医薬は、例えば、次のような処方によって製造することができる。製剤例を挙げて本発明の薬剤をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの製剤例にのみ限定されるものではない。
１．カプセル剤
（１）ペプチド５ 　　　　　　　　　　　　４０ｍｇ
（２）ラクトース 　　　　　　　　　　　　７０ｍｇ
（３）微結晶セルロース 　　　　　　　　　　９ｍｇ
（４）ステアリン酸マグネシウム 　　　　　　１ｍｇ
１カプセル 　　　　　　　　　　　　　　１２０ｍｇ
　（１）、（２）、（３）の全量、および（４）の１／２を混和した後、顆粒化する。これに残りの（４）を加えて全体をゼラチンカプセルに封入する。
２．錠剤
（１）ペプチド６ 　　　　　　　　　　　　４０ｍｇ
（２）ラクトース 　　　　　　　　　　　　５８ｍｇ
（３）コーンスターチ 　　　　　　　　　　１８ｍｇ
（４）微結晶セルロース 　　　　　　　　３．５ｍｇ
（５）ステアリン酸マグネシウム 　　　　０．５ｍｇ
１錠 　　　　　　　　　　　　　　　　　１２０ｍｇ
（１）、（２）、（３）の全量、（４）の２／３および（５）の１／２を混和した後、顆粒化する。残りの（４）および（５）をこの顆粒に加えて錠剤に加圧成型する。
３．硝子体注射液
 　１ｍｌ中
（１）ペプチド５　　　　　　　　　　　　　４０ｍｇ
（２）精製白糖　　　　　　　　　　　　　　５０ｍｇ
（３）塩化ナトリウム　　　　　　　　　２．３４ｍｇ
（４）ポリソルベート８０　　　　　　　　　適量
（５）リン酸水素二ナトリウム　　　　　　　適量
（６）リン酸二水素ナトリウム　　　　　　　適量
（７）滅菌精製水　　　　　　　　　　　　　適量
　（１）～（６）を、（７）滅菌精製水に溶解して硝子体注射液を調製する。
４．目薬
１００ｍL中
（１）ペプチド６　　　　　　　　　　　　１００ｍｇ
（２）トロメタモール　　　　　　　　　　３００ｍｇ
（３）塩化ナトリウム　　　　　　　　　　９００ｍｇ
（４）塩化ベンザルコニウム　　　　　　　　　適量
（５）滅菌精製水　　　　　　　　　　　　　　適量
（１）～（４）を、（５）滅菌精製水に溶解して、pHを調整し、点眼液を調製する。

Claims (18)

  1. 　以下の：
    HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK（配列番号１）、又は
    HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL（配列番号２）
    　で表される配列、又はその安定化配列からなるペプチドを含む、神経栄養性角膜炎の予防又は治療用医薬組成物。
  2. 　前記安定化配列からなるペプチドが、配列番号１又は２の配列において、３位及び／又は８位のアスパラギン酸残基のカルボキシ基が、テトラゾールに置換された配列、又は当該配列の一部が改変された配列であり、ここで前記安定化配列からなるペプチドがＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ及び／又はＶＰＡＣＲ２への結合性を有する、請求項１に記載の予防又は治療用医薬組成物。
  3. 　前記安定化配列からなるペプチドが、下記の式：
    　　 H-X1-D-G-I-F-T-D-X2-Y-X3-R-Y-R-X4-X5-X6-A-X7-X8-X9-Y-L-A-A-V-X10（配列番号３）
    　　｛式中、Ｘ1は中性アミノ酸、Ｘ2は中性アミノ酸、Ｘ3は中性アミノ酸、Ｘ4は塩基性アミノ酸、Ｘ5は中性アミノ酸またはｅｇＴｚ、Ｘ6は非極性アミノ酸、Ｘ7は非極性アミノ酸、Ｘ8は塩基性アミノ酸、Ｘ9は塩基性アミノ酸、Ｘ10は中性アミノ酸である｝
    　で表される配列において、３位及び／又は８位のアスパラギン酸残基のカルボキシ基が、テトラゾールに置換された配列又はその改変配列からなるペプチドであって、前記ペプチドがＰＡＣ１Ｒ、ＶＰＡＣ１Ｒ及び／又はＶＰＡＣＲ２への結合性を有し、前記改変配列が、配列番号３の配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失又は付加された配列である、前記ペプチドを含む、請求項１又は２に記載の予防又は治療用組成物。
  4. 　X1、X2、及びX3における中性アミノ酸が、アラニン又はセリンである、請求項３に記載の予防又は治療用組成物。
  5. 　X4、X8、及びX9における塩基性アミノ酸が、リジン又はアルギニンである、請求項３又は４に記載の予防又は治療用組成物。
  6. 　X5が、グルタミン、アラニン、又は、egTzである、請求項３～５のいずれか一項に記載の予防又は治療用組成物。
  7. 　さらにX6がメチオニン、ノルロイシン、アラニン又はロイシンである、請求項３～６のいずれか一項に記載の予防又は治療用組成物。
  8. 　X7が、バリン又はアラニンである、請求項３～７のいずれか一項に記載の予防又は治療用組成物。
  9. 　X10が、ロイシン又はアラニンである、請求項３～８のいずれか一項に記載の予防又は治療用組成物。
  10. 　配列番号３の３位及び８位のアスパラギン酸のカルボキシ基が、テトラゾールに置換される、請求項３～９のいずれか一項に記載の予防又は治療用組成物。
  11. 　前記ペプチドにおいて、Ｎ末端がアセチル化又はメシル化されている、請求項３～１０のいずれか一項に記載の予防又は治療用組成物。
  12. 　前記ペプチドにおいて、Ｎ末端がアセチル化されている、請求項３～１１のいずれか一項に記載の予防又は治療用組成物。
  13. 　１又は２個のアミノ酸が、欠失される、請求項３～１２のいずれか一項に記載の予防又は治療用組成物。
  14. 　以下の：
    　　GKRYKQRVKNK（配列番号３７）；
    　　GKRYKQRVKN（配列番号３８）；
    　　GKRYKQRVK（配列番号３９）；
    　　GKRYKQRV（配列番号４０）；
    　　GKRYKQR（配列番号４１）；
    　　GKRYKQ（配列番号４２）；
    　　GKRYK（配列番号４３）；
    　　GKRY（配列番号４４）；
    　　GKR；
    　　GRR；
    　　GK；及び
    　　GR
    　　G；
    　からなる群から選択される１の配列が、前記ペプチドのＣ末端に付加される、請求項３～１３のいずれか一項に記載の予防又は治療用組成物。
  15. 　以下の：
    HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK（配列番号１）、又は
    HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL（配列番号２）
    　で表される配列、又はその安定化配列からなるペプチドを含む、神経軸索伸長促進剤。
  16. 　前記神経軸索伸長促進剤が、三叉神経の軸索を伸長する、請求項１５に記載の神経軸索伸長促進剤。
  17. 　請求項１５又は１６に記載の神経軸索伸長促進剤を含む、神経損傷治療用又は神経再生用組成物。
  18. 　インビトロにおける神経軸索伸長促進方法であって、以下の：
    HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVLGKRYKQRVKNK（配列番号１）、又は
    HSDGIFTDSYSRYRKQMAVKKYLAAVL（配列番号２）
    　で表される配列、又はその安定化配列からなるペプチドが添加された培地中で神経細胞を培養することを含む、前記方法。
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