CN101745098A

CN101745098A - 神经多肽pacap38在制备眼部疾病的治疗、损伤修复或再生药物中的应用

Info

Publication number: CN101745098A
Application number: CN201010103022A
Authority: CN
Inventors: 丁勇; 赵秀丽; 余榕捷; 陈建苏
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University; University of Jinan
Priority date: 2010-01-26
Filing date: 2010-01-26
Publication date: 2010-06-23

Abstract

本发明公开一种神经多肽PACAP38在制备眼部疾病的治疗、损伤修复或再生药物中的应用。与现有市场上针对角膜上皮修复或延缓泪液蒸发等对症治疗的人工泪液相比，本发明另辟蹊径，通过对PACAP38在兔准分子激光原位角膜磨镶术术后角膜神经的修复与再生作用，以及PACAP38对兔三叉神经节细胞增殖与分化作用的研究，发现一定浓度的PACAP38对LASIK术后角膜神经及体外培养的兔三叉神经节细胞有较明显的促生长作用，从而为LASIK术后干眼症的治疗、白内障、准分子激光屈光性角膜切削术及其它眼部及系统性疾病所致的角膜神经损伤的治疗提供新策略。

Description

神经多肽PACAP38在制备眼部疾病的治疗、损伤修复或再生药物中的应用

技术领域

本发明涉及眼部疾病的治疗领域，尤其涉及多肽类药物在眼部疾病治疗中的应用，具体涉及神经多肽PACAP38在制备眼部疾病的治疗、损伤修复或再生药物中的应用。

背景技术

准分子激光角膜屈光手术自1988年进入眼科临床，用于矫正屈光不正以来为无数患者摘下眼镜。LASIK仍是目前角膜屈光手术的主流术式，而术后干眼症是影响术后视觉质量及患者满意度的主要因素。

引起LASIK术后干眼症的主要原因是术中不同程度的损伤了角膜神经，影响了角膜的知觉，继而导致泪液分泌动力学异常和泪膜稳定性下降，并且LASIK术后角膜神经修复需要很长时间。因而近几年国内外针对促角膜神经修复与再生的研究很多，主要集中在生长因子如血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)、和神经生长因子(NGF)等，大部分报道这些因子有不同程度的促神经生长作用，但效果都不是很显著，而且有一定的副作用，临床应用甚少，技术也不成熟。

PACAP是1989年发现的人体脑垂体分泌的具有重要生物学功能的神经多肽，是促胰液素/高血糖素/VIP家族中的新成员。天然的PACAP有两种形式：PACAP27和PACAP38，PACAP27由PACAP38的N端27个氨基酸组成；PACAP38比PACAP27活性更高，也更稳定。

PACAP及其受体不仅分布在中枢神经系统和周围神经系统，而且在周围组织和器官也广泛分布，如胰腺、胰岛、消化道、生殖腺等。目前已证实PACAP及其衍生多肽具有多种生物功能，PACAP不仅作为一种神经递质/调质起作用，还作为一种神经营养因子在神经系统发育中起到重要作用。

Uddman(J Cereb Blood Metab，1993)等报道，在血管外膜及外膜一中膜交界处有PACAP免疫反应阳性神经纤维分布，PACAP在血管功能的调节上起着舒张血管、降低血压、增加局部血流等重要的作用。Dorner等(Naunyn-Sehiedeberg’s archives of Phannaeology，1998)研究提示眼和皮肤血管对PACAP的作用尤其敏感。

作为首个被发现同时在视神经和眼内其他组织中分布广泛的神经肽(JosefTroger，Brain research review，2007)，PACAP对眼部各组织的作用更为复杂和多样。MarianaS等(The journal of biological chemistry，2002)指出PACAP可通过激活cAMP依赖的蛋白激酶途径阻止视神经细胞凋亡，从而可将PACAP用于防治视神经病变(如视神经缺血性改变、视神经萎缩等)。

目前尚未见有将PACAP38应用于眼部疾病的治疗、眼部损伤的修复或再生中的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供神经多肽PACAP38在制备眼部疾病的治疗、损伤修复或再生药物中的应用。

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：

眼部疾病导致的角膜损伤，并引起干眼病，现有药物针对角膜神经方面治疗方面的很少，而且对于角膜神经损伤性干眼病治疗欠佳，存在较大副作用。

本发明人从角膜神经的损伤修复入手进行研究，通过对可行性药物的筛选，结果发现神经多肽PACAP38能够有效地修复角膜神经的损伤，且再生效果好。

基于这一研究发现，本发明人以神经多肽PACAP38为主要研究对象，重点对其在眼部疾病治疗、眼部神经损伤修复和再生方面的作用进行研究，结果如下：

1.通过研究，本发明人发现PACAP38可通过激活cAMP依赖的蛋白激酶途径阻止视神经细胞凋亡，因此PACAP38可用于防治视神经病变(如视神经缺血性改变、视神经萎缩等)；

2.现有资料表明PACAP对血管和神经具有双重调节作用，结合本发明人的发现——PACAP38可有效修复角膜神经的损伤，因此可将PACAP38用于眼底神经血管障碍(如黄斑疾病、视网膜血管病、糖尿病性视网膜病变等)行眼病，能够收到良好的效果；

3.PACAP可以促进胰腺β细胞分泌胰岛素，而不引起肝糖原合成增加，对2型糖尿病具有潜在的治疗作用，再结合本发明人的发现——PACAP38可有效修复角膜神经的损伤，因此可将PACAP38用于糖尿病性视网膜病变等眼部疾病的治疗。

本发明人采用PBS溶解稀释PACAP38，配制得到滴眼液，将其用于角膜神经损伤的修复以及三叉神经的修复，结果发现：当PACAP38的浓度为10μM/L时，对LASIK术后的神经损伤模型能得到很好的修复效果，因此当将神经多肽PACAP38用于制备治疗角膜神经损伤或再生的药物时，神经多肽PACAP38的有效浓度优选10μM/L；当PACAP38的浓度为1μM/L时，对体外培养的三叉神经节细胞起到很好的促增殖分化作用，因此当将神经多肽PACAP38用于制备治疗眼底神经病变、眼底神经损伤修复或再生的药物时，神经多肽PACAP38的有效浓度优选1μM/L。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.与现有市场上针对角膜上皮修复或延缓泪液蒸发等对症治疗的人工泪液相比，本发明另辟蹊径，从神经方面入手治疗干眼症，又因角膜组织没有血管，用PACAP只是更好的促进神经的修复再生，从而避免其他药物促角膜新生血管的副作用；

2.将本发明用于药物开发，其开发设计方案简单，作用明显，便于实现；

3.兔PACAP的cDNA序列95％与人类相同，而其PACAP38氨基酸序列100％与人类相同，因此更接近人的解剖生理状态，本发明首次将PACAP38用于诱导人工培养的兔三叉神经节细胞神经元的生长及兔LASIK术后促进神经元的生长和角膜敏感性的恢复；

4.本发明针对PACAP38的实际使用，优化出其最有效的剂量浓度，可专门有效地针对角膜神经再生及干眼病防治；

5.本发明利用PACAP38对血管神经的双重调节作用，可在眼底神经血管性病变(如黄斑疾病、视网膜血管病、糖尿病性视网膜病变等)中发挥双重积极作用；

6.本发明针对目前市场药物缺陷，充分利用PACAP在神经修复再生方面的营养及促进作用，打破传统的人工泪液对症治疗的局限，从源头着手，促神经恢复从而改善干眼症状。

附图说明

图1为实施例2中组内因素和交互作用示意图；

其中，1为10μM/L滴眼液组，2为5μM/L滴眼液组，3为PBS组；

图2为PBS组兔LASIK术后4周角膜神经硝酸银染色图；

图3为5μM/L滴眼液组兔LASIK术后4周角膜神经硝酸银染色图；

图4为10μM/L滴眼液组兔LASIK术后4周角膜神经硝酸银染色图；

图5为PBS组兔LASIK术后8周角膜神经免疫荧光染色图；

图6为5μM/L滴眼液组兔LASIK术后8周角膜神经免疫荧光染色图；

图7为10μM/L滴眼液组兔LASIK术后8周角膜神经免疫荧光染色图；

图8为实施例4中各组荧光经生物图像分析系统荧光度值比较统计柱状图；

图9为PBS组1周三叉神经节细胞免疫荧光染色图；

图10为浓度0.1μM/L的PACAP38组1周三叉神经节细胞免疫荧光染色图；

图11为浓度1μM/L的PACAP38组1周三叉神经节细胞免疫荧光染色图；

图12为实施例5中各组荧光经生物图像分析系统荧光度值比较统计图柱状图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。

实施例1LASIK手术兔子模型制备

兔子用3％戊巴比妥耳缘静脉注射麻醉(15～30mg/kg)后，固定适当体位，剪掉眼睑周围较长睫毛，常规铺巾，75％酒精及0.5％碘伏消毒眼睑及眶周皮肤。

术前局麻：右眼，0.4％表麻滴瞳剂盐酸妥布卡因，结膜囊，固定后1次，开睑后1次。左眼不做手术。

角膜瓣制定：开睑器开睑，负压固定环吸附眼球，滴生理盐水湿润角膜。角膜刀做厚约130μm，直径约6mm的角膜瓣(蒂位于上方)。术前后用BSS冲洗角膜瓣(消除散落残片)。显微镜下角膜瓣复位，不缝合。干燥5分钟，以利于其粘合。术后抗生素滴眼液，左氧氟沙星0.3％，4次/天，用到术后7天。大部分术后1周角膜光滑透明，只有少数兔有少量新生血管，一个月后新生血管也全部消退。

实施例2PACAP38滴眼液及角膜敏感度测定

PACAP38为市售产品，其分子量为4356.8，每瓶含PACAP38量0.1mg(0.23×10^-4mmol)，用注射器将PBS注入装有PACAP38的瓶中，稀释成两种规格的滴眼液：

(1)5μM/L的滴眼液：该滴眼液中PACAP38的浓度为5μM/L，PBS的用量为0.0046L；

(2)10μM/L的滴眼液：该滴眼液中PACAP38的浓度为10μM/L，PBS的用量为0.0023L。

将滴眼液过滤后除去细菌，分装放入4℃冰箱中备用。

本实施例分三个实验组：

a.PBS组：5只兔，1滴PBS用于各组兔子右眼，4次/天，自LASIK术后第1天起用至术后8周。各兔左眼不滴；

b.5μM/L滴眼液组：5只兔，1滴5μM/L规格的滴眼液用于各组兔子右眼，4次/天，自LASIK术后第1天起用至术后8周。各兔左眼不滴；

c.10μM/L滴眼液组：5只兔，1滴10μM/L规格的滴眼液用于各组兔子右眼，4次/天，自LASIK术后第1天起用至术后8周。各兔左眼不滴。

角膜敏感度测定：用Luneau ophthalmologie角膜触觉测量器。从术后1周开始，每周1次，至术后8周。标记方法：以出现瞬目反射时所需的测量计纤维丝长度作为触觉敏感度，尼龙纤维垂直接触角膜中央，就立刻引起闭睑反应记为有效。每个角膜用每个尼龙长度测3次(长度从60毫米开始递减，每次减5毫米)最长一次为阈值。

采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。三个实验组的兔角膜敏感度的总体比较采用重复测量设计的方差分析。三个实验组的两两比较采用Dunnett(2-side)检验。P＜0.05为差异有统计学意义。组内因素和交互作用示意图如图1所示。

结果显示(重复测量设计的方差分析)：角膜敏感度测量值分析中，10μM滴眼液组与PBS组比较，差异有统计学意义(P＝0.006＜0.05)；5μM滴眼液组与PBS组比较，差异有统计学意义(P＝0.049＜0.05)。

实施例3角膜神经改良Bielschowsky法硝酸银染和免疫组化染色及观察

改良Bielschowsky法硝酸银染：

本实施例分三个实验组：

a.PBS组：5只兔，1滴PBS用于各组兔子右眼，4次/天，自LASIK术后第1天起用至术后4周。各兔左眼不滴；

b.5μM/L滴眼液组：5只兔，1滴5μM/L规格的滴眼液(制备方法同实施例2)用于各组兔子右眼，4次/天，自LASIK术后第1天起用至术后4周。各兔左眼不滴；

c.10μM/L滴眼液组：5只兔，1滴10μM/L规格的滴眼液(制备方法同实施例2)用于各组兔子右眼，4次/天，自LASIK术后第1天起用至术后4周。各兔左眼不滴。

角膜瓣制定术(LASIK)4周后，动物用0.5％戊巴比妥钠，耳缘静脉注射处死。剥离角膜，在显微镜下分离出角膜基质层，并固定于10％中性甲醛7d以上，15％和30％蔗糖溶液顺序脱水，各过一夜。冰冻切片厚20～25um，裱在涂有明胶的载玻片上，自然凉干后入蒸馏水浸1～2h。入20％硝酸银水溶液(20℃)浸染1h。入5％甲醛液中还原，装有5％甲醛溶液适量的小染色缸4～6个，切片依次经这些染色缸，共浸约4～6min，但切片在第一缸甲醛中浸的时间不得少于1min，切片入第一缸甲醛中会立即呈现白色雾状，随即变黑。直接入氨银液中，并在显微镜下观察，神经钎维呈褐色为止。

氨银液配制方法：据标本量取适量20％硝酸银溶液于三角烧瓶中，用注射器缓慢逐渐加入氨水，加瓶盖摇晃溶液至黑色沉淀溶解，氨银液恰好澄清为止。若组织切片染色较淡，可再酌加20％硝酸银液，同时在镜下掌握着色程度。

入5％氨水浸洗1min，终止氨银液继续作用及洗去多余的银。入蒸馏水洗，常规脱水，树胶封片。

三个实验组的硝酸银染色结果如图2～4所示，神经纤维及轴索呈深褐色或褐黑色，背景淡黄色，图2～4中箭头标注出断端，可见各组断端4周时，PBS组断端稍膨大，但未见明显出芽，5μM/L滴眼液组短端见少量出芽；10μM/L滴眼液组短端稍膨大，并见出芽。由此可以看出，PACAP38对角膜神经的再生与修复起到积极促进作用。

本实施例中的百分比均为质量百分比。

实施例4角膜神经免疫荧光染色

本实施例分三个实验组：

b.5μM/L滴眼液组：5只兔，1滴5μM/L规格的滴眼液(制备方法同实施例2)用于各组兔子右眼，4次/天，自LASIK术后第1天起用至术后8周。各兔左眼不滴；

c.10μM/L滴眼液组：5只兔，1滴10μM/L规格的滴眼液(制备方法同实施例2)用于各组兔子右眼，4次/天，自LASIK术后第1天起用至术后8周。各兔左眼不滴。

角膜瓣制定术8周后，动物用0.5％戊巴比妥钠，耳缘静脉注射处死。剥离角膜，在显微镜下分离出角膜基质层，多聚甲醛固定过夜(4C)，固定组织冲洗后，15％、20％、30％蔗糖缓冲液脱水直沉底。冰冻切片20～25um，裱在涂有明胶的载玻片上，自然凉干后入PBS洗3次，每次3～5分钟，吸尽液体。用含0.3％Triton-X-100的PBS在室温通透化处理15分钟。10％胎牛血清封闭60分钟，一抗NF200(1∶500)，4℃过夜。洗涤：洗涤5次，每次5分钟。每次洗涤时都可以在摇床上轻轻摇动。

去除洗涤液，加入1毫升稀释好的二抗(羊抗鼠IgG H+L)(1∶70)，室温作用60分钟。PBS洗涤5次，每次5分钟。加入DAPI染色液室温作用15分钟以上，吸除DAPI染色液，PBS洗涤2-3次，每次3-5分钟。甘油封片，指甲油封片子的四周。荧光显微镜观察照相。

三个实验组的角膜神经的免疫荧光染色结果如图5～7所示，各组荧光再经生物图像分析系统(image pro plus软件)测各组图荧光灰度值，用统计图显示最终结果如图8所示。

从各图中可以看出，5μM/L滴眼液组和10μM/L滴眼液组均比PBS组角膜神经荧光度值高，由此说明PACAP38对角膜神经的修复或再生能力较强。

本实施例中的百分比均为质量百分比。

实施例5三叉神经培养及免疫荧光染色观察

1、三叉神经培养

取新西兰白兔(约2kg)三叉神经节组织，取时放入PBS，完成取材后用PBS冲洗三遍，放入加有庆大霉素的PBS放置30分钟。神经组织放入消毒培养皿中剪碎后加入0.25％胰蛋白酶消化约五分钟，再倒置显微镜下看到透明小气泡样细胞，即可停止消化，加入胎牛血清去胰蛋白酶液，用细口吸管吹打细胞悬液，使其充分分散，如此多次。离心机1000rmp，10min离心，细胞计数后放入铺有载玻片的六孔板，每个孔约含4000个细胞，并添加DMEM(含葡萄糖600mg/100ml、NaHCO33.7g/L)及10％胎牛血清，再置标本于36℃、10％CO₂培养箱中培养。接种24小时后，将1μM/L的PACAP38和0.1μM/L的PACAP38分别加入两个实验组(A和B组)培养基，PBS加入对照组(C组)培养基。接种第3d，在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2′-脱氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml，作用48h后更换新鲜饲养培养液，以后每周换液两次，每次更换一半新鲜饲养培养液。

2、三叉神经节细胞免疫荧光染色观察

上述方法制定细胞1周后，取出爬有细胞的载玻片，放到35mm或60mm用过的细胞培养皿里，PBS洗三遍，用4％的多聚甲醛PBS在室温固定20分钟。PBS在室温漂洗三次，每次10分钟。用含0.5％Triton-X-100的PBS在室温通透化处理15分钟。PBS在室温漂洗三次，每次10分钟。与二抗相同宿主的血清封闭30分钟，PBS洗三遍。一抗(鼠抗兔NF200)(1∶500)4℃湿盒内过夜(不少于16小时)，PBS洗三遍。二抗(羊抗鼠CY3)(1∶70)室温2小时(避光)，或者37℃1半小时，PBS洗三遍。去除二抗，加入DAPI染色液室温作用15分钟以上。吸除DAPI染色液，用TBST、PBS或生理盐水洗涤2～3次，每次3～5分钟。蒸馏水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周。

荧光显微镜下观察，各组角膜神经免疫荧光染色结果如图9～11所示，图9为PBS组，从图中可见有少量三叉神经节细胞伸出触角；图10为0.1μM/L的PACAP38组，从图中可见有稍多三叉神经节细胞伸出突触，并少量交织成网；图11为1μM/L的PACAP38组，从图中可见有较多三叉神经节细胞生长，伸出突触并交织呈网状。

经生物图像分析系统(image pro plus软件)测各组图荧光灰度值，用统计图显示最终结果如图12所示，从图中可看出，0.1μM/L的PACAP38组和1μM/L的PACAP38组均比PBS组的三叉神经荧光度值高，说明PACAP38促进三叉神经节细胞的生长。

本实施例中的百分比均为质量百分比。

Claims

1.神经多肽PACAP38在制备眼部疾病的治疗、损伤修复或再生药物中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于所述药物为治疗角膜神经损伤或再生的药物。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于所述治疗角膜神经损伤或再生的药物中，神经多肽PACAP38的浓度为10μM/L。

4.根据权利要求1所述应用，其特征在于所述药物为治疗眼底神经病变、眼底神经损伤修复或再生的药物。

5.根据权利要求1所述应用，其特征在于所述治疗眼底神经病变、眼底神经损伤修复或再生的药物中，神经多肽PACAP38的浓度为1μM/L。