CN107428805A

CN107428805A - 短合成肽及其治疗和/或预防干眼症的用途

Info

Publication number: CN107428805A
Application number: CN201580076909.8A
Authority: CN
Inventors: 何宗权; 曹友平
Original assignee: Ho Tsung Chuan; Tsao Yeou Ping
Current assignee: MacKay Memorial Hospital
Priority date: 2015-02-25
Filing date: 2015-02-25
Publication date: 2017-12-01
Anticipated expiration: 2035-02-25
Also published as: KR20170126468A; JP6503085B2; ES2772772T3; US10307456B2; CA2977562A1; AU2015384099B2; EP3262060A4; EP3262060A1; CN107428805B; CA2977562C; SG11201706819RA; JP2018508514A; EP3262060B1; KR102023827B1; US20180339010A1; AU2015384099A1; NZ734845A; WO2016134498A1

Abstract

在此公开一种合成肽及含所述肽的组合物，用以治疗和/或预防眼部疾病，特别是干眼症。本发明内容亦公开一种用以治疗和/或预防眼部疾病的方法，将含本发明内容合成肽的组合物施用至一有需要的个体。

Description

短合成肽及其治疗和/或预防干眼症的用途

技术领域

本发明是有关于发现一种短合成肽，及其用以治疗和/或预防眼部疾病的用途。

背景技术

干眼症(dry eye disease,DED)泛指泪液层异常的的各种状况，其可能肇因于角质层受损。干眼症的症状包含眼部沙质粗糙感(sandy-gritty feeling)、灼热感、刺痛感、异物感，且患者在白天会产生更严重的不适感。DED患者的症状严重程度不一，症状较严重的患者，会感受到眼部持续的刺痛，以及造成眼球表面上皮病变、破坏眼球无菌环境或造成细菌性角膜溃疡。现今可用以治疗干眼症的FDA核准处方药物仅有皮质类固醇(corticosteroids)和Restasis(0.05％环孢素)。然而，上述二种药物皆无法有效治愈受损的角膜组织，但经由长时间的治疗(约4-6个月)可显著减缓DED症状或使受损的角膜组织愈合。

因此，本领域急需一种改良的医药品和/或治疗和/或预防DED的方法。

发明内容

本发明内容有关于开发新颖化合物和/或用以治疗眼部疾病，尤其是干眼症(DED)，的方法。

因此，本发明内容的第一方面旨在提供一种用以治疗DED的短合成肽。所述短合成肽由7个连续氨基酸残基所组成，其序列为DLYRX₁X₂S(序列编号：1)，其中X₁和X₂分别为任一种氨基酸残基。

依据本发明内容其他实施方式，所述合成肽中的X₁和X₂分别为缬氨酸(valine)和精氨酸(arginine)，且该合成肽具有如序列编号：2所示的氨基酸序列。

依据本发明内容某些实施方式中，所述合成肽中的X₁和X₂分别为亮氨酸(leucine)和精氨酸，且该合成肽具有如序列编号3所示的氨基酸序列。

依据其他实施方式，所述合成肽中的X₁和X₂分别为谷氨酰胺(glutamine)和精氨酸，且该合成肽具有如序列编号：4所示的氨基酸序列。

依据进一步的实施方式，所述合成肽中的X₁和X₂分别为谷氨酰胺和赖氨酸(lysine)，且该合成肽具有如序列编号：5所示的氨基酸序列。

依据再一实施方式，所述序列编号1的合成肽中包含至少一个右旋氨基酸残基(D-form amino acid residue)。在某些实施例中，所述序列编号1的合成肽中包含至少二个右旋氨基酸残基。

本发明内容第二方面旨在提供一种治疗患有干眼症个体的方法。所述方法包含对该个体施用一有效量的合成肽，以减缓与DED相关的症状。所述合成肽由7个连续氨基酸残基所组成，其序列为DLYRX₁X₂S(序列编号：1)，其中X₁和X₂分别为任一种氨基酸残基。

依据本发明内容其他实施方式，所述合成肽中的X₁和X₂分别为缬氨酸和精氨酸，且该合成肽具有如序列编号：2所示的氨基酸序列。

依据本发明内容某些实施方式中，所述合成肽中的X₁和X₂分别为亮氨酸和精氨酸，且该合成肽具有如序列编号3所示的氨基酸序列。

依据其他实施方式，所述合成肽中的X₁和X₂分别为谷氨酰胺和精氨酸，且该合成肽具有如序列编号：4所示的氨基酸序列。

依据进一步的实施方式，所述合成肽中的X₁和X₂分别为谷氨酰胺和赖氨酸，且该合成肽具有如序列编号：5所示的氨基酸序列。

依据可任选的实施方式，本发明内容的方法更包含对所述个体施用一有效量的一种选自以下的药剂:抗发炎剂(anti-inflammatory agent)、神经钙调蛋白抑制剂(calcineurin inhibitor)、抗生素、烟碱乙酰胆碱受体激动剂(nicotinic acetylcholinereceptor agonist)和抗淋巴管生成剂(anti-lymphangiogenic agent)，以治疗所述干眼症。

在某些实施例中，所述抗发炎剂为环孢素。所述神经钙调蛋白抑制剂为凡可斯伯灵(voclosporin)。所述抗生素选自以下：阿米卡星(amikacin)、庆大霉素(gentamycin)、卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)、奈替米星(netilmicin)、链霉素(streptomycin)、妥布霉素(tobramycin)、替考拉宁(teicoplanin)、万古霉素(vancomycin)、阿奇索霉素(azithromycin)、克拉霉素(clarithromycin)、地红霉素(dirithromycin)、红霉素(erythromycin)、罗红霉素(roxithromycin)、醋竹桃霉素(troleandomycin)、阿莫西林(amoxicillin)、氨比西林(ampicillin)、阿洛西林(azlocillin)、羧苄西林(carbenicillin)、氯唑西林(cloxacillin)、双氯西林(dicloxacillin)、氟氯西林(flucloxacillin)、美洛西林(mezlocillin)、奈夫西林(nafcillin)、盘尼西林(penicillin)、哌拉西林(piperacillin)、替卡西林(ticarcillin)、枯草菌素(bacitracin)、粘杆菌素(colistin)、多粘菌素B(polymyxin B)、环丙沙星(ciprofloxacin)、依诺沙星(enoxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、曲伐沙星(trovafloxacin)、磺胺米隆(mafenide)、磺胺醋酰(sulfacetamide)、磺胺甲二唑(sulfamethizole)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、磺胺异唑(sulfisoxazole)、甲氧苄啶(trimethoprim)、复方新诺明(cotrimoxazole)、地美环素(demeclocycline)、脱氧羟四环素(doxycycline)、米诺环素(minocycline)、氧四环素(oxytetracycline)和四环素(tetracycline)所组成的群组中。所述烟碱乙酰胆碱受体激动剂为毛果芸香碱(pilocarpine)、阿托品(atropine)、尼古丁(nicotine)、地棘蛙素(epibatidine)、洛贝林(lobeline)或吡虫啉(imidacloprid)。所述抗淋巴管生成剂为血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C；VEGF-C)抗体、VEGF-D抗体或VEGF-3抗体。

在所有的实施方式，所述个体为人类。

本发明内容第三方面关于一种合成肽的用途，该合成肽可制备治疗和/或预防干眼症(dry eye disease,DED)的医药品。所述合成肽由7个连续氨基酸残基所组成，其序列为DLYRX₁X₂S(序列编号：1)，且所述X₁和X₂分别为任一种氨基酸残基。

在参阅下文实施方式后，本发明所属技术领域中具有通常知识者当可轻易了解本发明的基本精神及其他发明目的，以及本发明所采用的技术手段与实施方式。

附图说明

本专利申请文件包含至少一张彩色图示。任何人均可经由给付主管机关一定费用后而自主管机关取得附有彩色图示的本专利公告本或公开本。为让本发明的上述与其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式的说明如下：

图1A为依据本发明内容一实施方式所示的小鼠角膜组织经由荧光染色的照片，以显示本发明合成肽对于干燥压力小鼠(desiccating stressed-mice)的预防效果；

图1B为图1A定量分析的柱形图；

图2为依据本发明内容一实施方式所示的本发明合成肽促进干燥压力小鼠产生泪液的能力；

图3A为依据本发明内容一实施方式所示的角膜组织荧光染色的照片，以显示本发明合成肽对于干燥压力小鼠的治疗效果；

图3B为图3A定量分析所示的柱形图；

图4A为依据本发明内容一实施方式所示，小鼠角膜切片经H&E染色的组织检查照片；

图4B为图4A定量分析的柱形图；

图5A为依据本发明内容一实施方式所示，结膜上皮经由PAS染色的照片，其中箭头所指为杯状细胞(粉红色；PAS染色阳性)；以及

图5B为图5A定量分析的柱形图。

具体实施方式

为了使本发明内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施方式与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。

1.名词定义

除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。

在此处“肽”(peptide)一词指氨基酸残基所组成的聚合物。“合成肽”(syntheticpeptide)一词则代表此肽并未包含存在于自然界的完整蛋白质分子。此种肽之所以是“合成的”，表示其乃是由人类利用技术手段所得，譬如化学合成、重组遗传技术或将整个抗原切段。于本说明书中，任何氨基酸残基于一肽中的位置由该肽的N端起算。

此处针对合成肽序列所述的“氨基酸同源性比”(Percent％amino acid sequenceidentity)指该候选合成肽的氨基酸残基与一参考多肽的氨基酸残基完全相同的百分比。于进行上述比对时，可将该候选合成肽与该参考多肽并排，并于必要时引入间隙，以使二序列形成最高的序列相似度，且在计算相似度时，并未将保守性置换的氨基酸残基纳入考虑。相关领域已有多种方法可供进行上述并排，譬如可公开取得的软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)等。本发明所属技术领域中具有通常知识者在进行并排时，可选择适当的参数与计算方式，以得到最佳的排列方式。在本说明书中，二氨基酸序列间的序列比较是采用美国生物科技信息中心(Nation Center for Biotechnology Information，简称NCBI)所提供的蛋白质-蛋白质BLAST分析软件Blastp来进行。候选氨基酸序列A相较于参考氨基酸序列B的氨基酸序列相似度(在本说明书中亦称之为序列A与序列B具有特定百分比(％)的氨基酸序列相似度)的计算方式如下:

其中X是利用Blastp软件对序列A、B进行排列后所得到的相同氨基酸残基数目(identical matches)，而Y是A、B二序列中较短者的氨基酸残基总数。

所述“治疗(treatment)”一词是指预防性(如，预防用药)、疗愈性或缓和性的处置，藉以达到所欲的药学和/或生理学效果；例如，减缓或治愈个体出现干眼症的症状。上述的效果是指能够部分或完全地治愈或预防个体出现所述疾病的症状。所述“治疗”包含预防、治疗或减缓一哺乳类的疾病，尤其是人类。所述治疗包含：(1)预防(如，预防用药)、治疗或减缓一个体的疾病或症状，其中所述个体可能患有疾病但尚未被诊断；(2)抑制一疾病(即，降低发展出与该疾病、异常和/或病症相关的病理变化的风险)；或(3)治愈一疾病(即，减少与所述疾病相关的症状)。

所述“施用(administered,administering,administration)”一词是指一种传递方式，用以将本发明的肽或组合物提供给个体。传递方式包含，但不限于，静脉内、肌肉内、腹膜内、动脉内、颅内或皮下注射传递方式。

在此处，“有效量(effective amount)”一词是指足以达成所欲反应或效果(即，能有效治疗疾病)的用量。举例而言，一种药剂(如，化合物、合成肽、编码治疗肽的核酸)能降低、预防、推迟或治愈干眼症相关症状的用量。药剂的有效量不必然能够治愈疾病或症状，但能推迟、阻碍或预防疾病或症状的发生，或推迟疾病或症状相关的病征。可以适当形式将所述治疗有效量分成一、二或更多剂量，并于指定期间内施用一次、二次或更多次。

所述“哺乳类(mammal)”一词涵盖哺乳纲的所有成员，包含：人类、灵长类动物、家畜和农畜。举例而言，所述家畜或农畜可以是兔子、猪、羊和牛。所述哺乳类亦可涵盖动物园或竞赛用动物、宠物，以及啮齿类(如，小鼠和大鼠)。所述“非人类哺乳类”一词是指除了人类以外，哺乳类纲下的所有动物。

所述“个体(subject)”或“患者(patient)”彼此可交替使用，且在此是指可接受本发明内容的合成肽和/或方法的动物(包含，人类)。除非另有指明，“个体”或“患者”一般包含雄性与雌性。再者，所述“个体”或“患者”包含可从本发明内容的治疗方法得到良好治疗效果的动物。举例而言，所述“个体”或“患者”包含，但不限于，人类、大鼠、小鼠、天竹鼠、猪、猴子、猪、羊、牛、马、狗、猫、鸟和禽类。在一实例中，所述患者为人类。

“药学上可接受载体(pharmaceutically acceptable carrier)、赋形剂(excipient)或稳定剂(stabilizer)”一词，是指适合施用于眼睛的载体、药剂或化合物。“眼用组合物(ophthalmic composition)”一词是指可施用于眼睛的组合物，或者可用以处理与眼睛接触的装置(例如，隐形眼镜)。

所述“干眼症(DED)”一词是指结膜持续性的干涩和角膜混浊等症状，且该些症状是由泪液分泌量减少、泪液过度蒸发、黏液异常产生或于泪液层中出现脂质等原因所造成。DED的成因，包含，但不限于，暴露于干燥环境(如，飞机和工作场所)、维生素A缺乏、干燥综合症(syndrome)、类风湿性关节炎和其他类风湿性疾病、化合物、热灼伤或药物。所述药物为阿替洛尔(atenolol)、扑尔敏(chlorpheniramine)、氢氯噻嗪(hydrochlorothiazide)、异维甲酸(isotretinoin)、酮咯酸(ketorolac)、酮替芬(ketotifen)、左卡巴斯汀(levocabastin)、左旋氧氟沙星、奥昔布宁(oxybutynin)和托特罗定(tolterodine)。

虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考虑而定。除了实验例之外，或除非另有明确的说明，当可理解此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随申请专利范围所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。

在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数定冠词(a,an,the)涵盖其复数形式。

2.较佳实施方式的详细说明

本发明至少一部份是基于发现一种短合成肽能用以治疗和/或预防一个体的眼部疾病(例如，干眼症(DED))而发展出来的。因此，本发明也提供一种用以治疗和/或预防干眼症方法和组合物，所述组合物包含前述新发现的合成肽。

2.1本发明的合成肽

本发明内容的短合成肽由7个连续氨基酸残基所组成，其序列为DLYRX₁X₂S(序列编号：1)，且所述X₁和X₂分别为任一种氨基酸残基。

在一实施方式中，所述X₁为亮氨酸，X₂为任一种氨基酸。

在另一实施方式中，所述X₁和X₂分别为缬氨酸和精氨酸。

在再一实施方式中，所述X₁和X₂分别为谷氨酰胺和赖氨酸。

依据其他非必要或可任选的实施方式，序列编号：1的合成肽包含至少一个右旋氨基酸残基。在某些实施例中，序列编号：1的合成肽包含二个右旋氨基酸残基。

可藉由先前技术中任一种标准肽合成方法来合成本发明的短肽。在一实施方式中，本发明合成肽依据操作手册以固相肽合成器(ABI433A肽合成器；Applied BiosystemsInc.；Life Technologies Corp.；Foster City,CA,USA)合成。本发明内容的合成肽包括7-mer(X₁、X₂)(序列编号：1)、7-mer(序列编号：2)、7-mer(V→L)(序列编号：3)、7-mer(V→Q)(序列编号：4)或7-mer(VR→QK)(序列编号：5)，各该合成肽序列如表1所示。

表1：本发明合成肽

X₁,X₂分别为任一种氨基酸

所属技术领域中具有通常知识者可藉由常规方法(如，计算机仿真程序)修饰所述合成肽，且该些方法可预测肽序列构形改变对于活性的影响。再者，可基于本发明内容“设计”或“修饰”本发明合成肽(如，7-mer)；即，基于教示和测试一修饰后合成肽，以确定经修饰的合成肽是否具有预期的功能或构型。本发明合成肽(如，7-mer)可经由修饰以改变肽特征且不影响其生理活性。举例而言，改变和/或删除特定的氨基酸，且不影响本发明内容所示的生理活性(即，治疗DED的功效)。依据某些实施方式，7-mer肽序列上的第五个和第六个氨基酸残基(分别为缬氨酸和精氨酸)可以被任一种氨基酸取代，而不影响其治疗和/或预防DED的能力。因此，本发明涵盖与(序列编号：2的较佳合成肽具有均等功能的衍生物，包含带有氨基酸保留性置换的肽。

依据其他实施方式，将位于序列编号：2的N-端的天冬氨酸(D)和C-端上的丝氨酸(S)删除后，所得到的修饰肽序列分别命名为7-mer-ΔD(LYRVRS；序列编号：6)和7-mer-ΔS(DLYRVR；序列编号：7)，结果显示此二条肽序列不具有与DED相关的生物活性。因此，位于序列编号：2肽序列N-端的天冬氨酸(D)和C-端的丝氨酸(S)对于维持本发明合成肽治疗DED活性具有重要性，因此，在本发明揭示范畴内，此二个位置的氨基酸残基仅能被保留性氨基酸残基取代。

另外，也可利用重组技术来制备本发明的合成肽。举例而言，可利用重组技术将编码本发明肽的核酸序列嵌入至一表现载体中，并与一调控序列连结，以便在宿主细胞内表现出本发明肽。接着，可将所述载体送入一合适的宿主细胞内表现本发明肽。可再藉由硫酸铵沉淀法和管柱分划色层分析法纯化表现出来的重组肽，并依据本发明内容各实施例所示的方法进行活性测试。

可利用已知的生物降解聚合物微粒或微囊将上述核酸或多核苷酸传递至预定接收的生物体内。亦可利用常规方法以脂质体包复核酸使易于被宿主吸收。所述多核苷酸可单独加载或与其他组织专一性抗体共同并入至上述传递载体中。此外，也可由质体或其他载体以静电或共价连结聚-L-赖氨酸后制成一种分子接合物(molecular conjugate)。此外，本发明亦可利用已知的组织专一性转录调节组件(tissue-specific transcriptionalregulatory elementst)，专一性地标定组织。将“裸露的DNA(naked DNA)(即，无传递载体)”传递至肌肉内、皮内或皮下的位置，并利用其他方法达成活体内表达(vivoexpression)。

2.2治疗和/或预防DED的组合物

本发明合成肽可用以治疗罹患干眼症的个体，或预防个体罹患干眼症。

本发明内容的另一方面旨在提供一种用以治疗DED的医药品，其包含本发明所述的合成肽。于制造所述医药品时，可取适量的本发明合成肽与药学上可接受载体、赋形剂或稳定剂混合，而得到适于眼睛施用的组合物，例如，一冻干制剂或一水溶液。在特定的实施方式中，所述合成肽序列为序列编号：2-5中任一序列或其组合。

所述组合物中本发明肽的含量随着使用的肽而有所不同。所述组合物中的肽含量约为0.001％至10％(重量百分比)；例如，约0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2.、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.9、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0％。在一较佳实施方式中，所述肽的含量约为0.001％至5％(重量％)；例如，约0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2.、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.9、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0％。

所属技术领域中已知有多种药学可接受载体、赋形剂或稳定剂均能够与本发明的合成肽一起使用。举例而言，适用的缓冲液为磷酸(phosphate)、柠檬酸盐(citrate)和其他有机酸；抗氧化剂包含抗坏血酸(ascorbic acid)和甲硫氨酸(methionine)；防腐剂(如，十八烷基二甲基苯基氯化铵(octadecyldimethylbenzy ammonium chloride)、氯化六烃季铵(hexamethonium chloride)、氯化苯甲烃铵(benzalkonium chloride)、氯化苄乙氧氨(benzethonium chloride)、酚醇(phenol alcohol)、丁醇(butyl alcohol)、苯甲醇(benzyl alcohol)、烷基对羟基苯甲酸酯(alkyl parabens)(如：甲基对羟基苯甲酸酯或丙基对羟基苯甲酸酯)、儿茶酚(catechol)、间苯二酚(resorcinol)、环己醇(cyclohexanol)、3-戊醇(3-pentanol)和间甲酚(m-cresol))；低分子量肽(小于约10个氨基酸残基)；蛋白质，如：血清白蛋白(serum albumin)、明胶(gelatin)或免疫球蛋白(immunoglobulins)；亲水性聚合物(hydrophilic polymers)，如：聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)；氨基酸，如：甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺，组氨酸，精氨酸，或赖氨酸；单醣(monosaccharides)、双醣(disaccharides)和其他碳水化合物，包含：葡萄糖(glucose)、甘露醣(mannose)或糊精(dextrins)；螯合剂(chelating agents)，如：乙二胺四醋酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)；糖类(sugars)，如：蔗糖(sucrose)、甘露醇(mannitol)、海藻糖(trehalose)或山梨糖醇(sorbitol)；成盐抗衡离子(salt-forming counter-ions)，如：钠；金属复合物(如，Zn-蛋白复合物)和/或非离子表面活性剂，如：聚山梨醇酯(polysorbates)(即，)、泊洛沙姆(poloxamers)(即，)或聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)。

在一特定实施方式，可将本发明所提供的组合物制成适于局部施用的配方。局部施用的配方通常为液状，且其具有生理可接受的pH值，且通常被制造成可分多次使用的形式。因此，在一具体实施方式中，所述组合物为局部眼用组合物，其包含一治疗有效量的合成肽(即，7-mer、7-mer(V→L)、7-mer(V→Q)或7-mer(VR→QK)以及一药学可接受载体，且所述药学可接受载体为一适于眼部局部施用的载体。此外，亦可使用所属技术领域中具有通常知识者所孰知的各种型式的载体。再者，所述载体通常为液状。基于方便配制和患者使用上的便利性，通常优先选择水溶液进行配方。具体而言，患者眼睛感染时，通常会滴用1-2滴所述组合物至眼部。然而，本发明合成肽亦可与其他类型的组合物并用；例如，悬浮液、黏性或半黏性凝胶或其他固体或半固体的组合物。亦可将对水溶解度相对较低的肽配制成悬浮液配方。本发明眼用组合物亦包含多种其他成分；例如，缓冲液、防腐剂、助溶剂和增稠剂(viscosity building agents)。

在较佳情形下，本发明任一实施方式所述的组合物可包含一有效量的缓冲液，以将pH值维持在约6至8之间；较佳为，pH值7。所述缓冲液可以是所属技术领域习知的缓冲液；例如，醋酸盐(acetate)缓冲液、抗坏血酸盐(ascorbate)缓冲液、硼酸盐(borate)缓冲液、碳酸氢盐(bicarbonate)缓冲液、碳酸盐(carbonate)缓冲液、柠檬酸盐(citrate)缓冲液和磷酸盐缓冲液(phosphate buffers)。在一较佳实施方式中，所述缓冲液包含硼酸盐。本发明所属领域具有通常知识者可藉由一般常规技术确定本发明缓冲液的有效量。以包含硼酸盐的缓冲液为例，其其中硼酸盐的浓度较佳为约0.6％。

本发明任一实施方式所述的组合物可包含一张度剂(tonicity agent)。在眼用组合物加入张度剂通能够将溶解物质的浓度调整至所欲的等张范围。张度剂可以是眼部领域中具有通常知识者已知的张度剂，包含，但不限于，甘油(glycerin)、甘露醇(mannitol)、山梨醇(sorbitol)、氯化钠(sodium chloride)或其它电解质。在一较佳的实施方式中，所述张度剂为氯化钠。

通常会将眼用配方包装成多剂的形式。因此，通常需添加防腐剂，以预防使用过程不受微生物污染。在特定情形下，即使是单次使用的组合物也可能会添加防腐剂。所述“防腐剂”是指眼科领域中习知的防腐剂。防腐剂通常添加在可多次使用的眼部配方，以预防细菌污染。所述防腐剂包含，但不限于，氯化苯甲烃铵、硫柳汞(thimerosal)、氯丁醇(chlorobutanol)、甲基对羟基苯甲酸酯、丙基对羟基苯甲酸酯、苯乙醇(phenylethylalcohol)、乙二胺四乙酸二钠(edetate disodium)、山梨酸(sorbic acid)、聚季铵盐-1(polyquaternium-1)、稳定氧氯复合物(stabilized oxychloro complexes)(如，))、醋酸苯汞(phenylmercuric acetate)、氯丁醇、苯甲醇或其他已知的药剂。在组合物中，所述防腐剂的浓度为约0.001至1.0％(wt％)。

在特定情况下，可利用表面活性剂或其他合适的助溶剂与本发明的组合物进行配方。所述“表面活性剂”和“助溶剂”为相关领域习知的试剂。表面活性剂用以帮助组合物中的治疗活性剂或其他不溶成分溶解。在一非限制性实例中，所述化合物包含聚乙氧基化蓖麻油(polyethoxylated castor oils)、聚山梨醇酯20、60和80；F-68、F-84和P-103(BASF Corp.,Parsippany N.J.,USA)；环糊精(cyclodextrins)；或其他已知的药剂。阴离子、阳离子、两性离子(zwitterionicc和amphoteric)和非离子表面活性剂皆适用于本发明。为了达到本发明所述的目的，在一较佳的实施方式中，所述表面活性剂可以是非离子表面活性剂，例如：聚山梨醇酯、泊洛沙姆、脂肪醇聚氧乙烯醚(alcohol ethoxylates)、乙二醇-丙二醇嵌段共聚物(ethylene glycol-propylene glycol block copolymers)、脂肪酸酰胺、烷基酚乙氧基化物或磷脂质(phospholipids)。所述表面活性剂和助溶剂的浓度为约0.01至2％(重量％)。

为了增加眼部吸收活性成分的效率、降低配方配制过程的变异并降低一悬浮液配方或乳液配方物理分离特性，和/或改善所述眼用配方其他事项，可调整配方的黏性，使其大于一般的水溶液。所述增稠剂包含：聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)、聚乙烯氢吡咯酮(polyvinyl pyrrolidone)、甲基纤维素(methyl cellulose)、羟丙基甲基纤维素(hydroxypropyl methylcellulose)、羟乙基纤维素(hydroxyethyl cellulose)、羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose)、羟丙基纤维素(hydroxypropyl cellulose)或其他已知的药剂。上述药剂的浓度为约0.01至2％(重量％)。

另一种可添加于本发明组合物中的化合物是螯合剂。所述螯合剂是能够和金属螯合的化合物。添加螯合剂至眼用组合物中，可增强防腐的效果。在非限制的实施方式中，适用于本发明的螯合剂为乙二胺四乙酸盐(edetate salts)；如，乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸钙二钠(edetate calcium disodium)、乙二胺四乙酸钠(edetate sodium)、乙二胺四乙酸三钠(edetate trisodium)或乙二胺四乙酸二钾(edetate dipotassium)。

在一具体实施方式中，可将所述合成肽制成适用于眼部局部施用型式(即，眼用组合物)。所述局部施用的配方可以是眼药水、凝胶、软膏或乳液等。

本发明组合物可局部施用至眼部。随着患者疾病的严重程度不一，本发明合成肽的施用剂量为约1微克/公斤体重至约50毫克/公斤体重(如，0.1-20毫克/公斤体重)。每日或每周的施用剂量为约1微克/公斤至约20毫克/公斤或更高。为达到上述任一局部施用的目的，所述局部施用量为约0.01至约100毫克/公斤体重(毫克/公斤)，每日施用一次至数次(如，每日施用4、6、8或更多次)。

在一特定实施方式中，本发明所提供的组合物包含二或更多本发明的合成肽，其中至少一合成肽为7-mer或其衍生物(如，7-mer(V→L)、7-mer(V→Q)或7-mer(VR→QK))，且其具有治疗或预防DED的能力。在此实施方式中，所述合成肽依据施用的方式(例如，各别施用、同时施用或连续施用)可配制成不同的剂型。

本发明所提供的组合物可以是一套组。可以理解的是本发明所述套组是作为一产品，其包含本发明合成肽和/或其他治疗性化合物，经包装而形成所述组合物，以利运送、储存和同时或连续施用。因此，本发明所述套组可包含一或多个包含本发明合成肽的悬浮液、注射器及其类似物，以将本发明肽制成单一剂量或多剂量形式。所述套组更包含一载体，用以溶解本发明合成肽；例如，水溶液介质物，即盐溶液、林格氏溶液(Ringer's solution)、葡萄糖和氯化钠。水溶性介质，如，乙醇、聚乙二醇(polyethylene glycol)、丙基乙二醇(propylethylene glycol)。若有必要，亦可使用非水溶性载体。本套组的其他对象为一包装盒，用以包装本发明各组成物。适用于本发明的包装盒的材料可以是玻璃、塑料(聚乙烯，聚丙烯，聚碳酸酯及其类似物)、瓶子、小罐子、纸、束袋或其类似物。

本发明套组可更包含说明书，其中记载本发明各种配方的施用方式(如，同时施用、连续施用、个别施用)。因此，本发明套组可更包含如何施用(如，同时施用、连续施用、个别施用)本发明中不同成分的说明书。所述说明书可以是纸张或为可被读取的电子媒介物，例如，电子储存媒体(磁盘、磁带或其类似物)、光学媒体(CD-ROM，DVD)及其类似物。所述媒体可额外或非必要的附加网络页面，以提供上述说明信息。

2.3治疗和/或预防DED的方法

如上所述，本发明所揭示的内容能有效预防和/或治疗DED。

因此，本发明关于一种预防和/或治疗DED的方法，其包含局部施用一种包含本发明合成肽及一药学可接受载体的医药品或组合物至一有需要的个体，其中所述合成肽由7个连续氨基酸残基所组成，其序列为DLYRX₁X₂S(序列编号：1)，且其中X₁和X₂分别为任一种氨基酸残基。

在一具体实施方式中，所述合成肽为组合物的形式，其中所述组合物包含一或多个本发明合成肽。在另一具体实施方式中，所述合成肽为序列编号：2-5的任一肽或其组合。

在可任选的实施方式中，所述方法更包含对所述个体施用一有效量的药剂，以治疗DED。所述药剂选自于：抗发炎剂、神经钙调蛋白抑制剂抑制剂、抗生素、烟碱乙酰胆碱受体激动剂和抗淋巴管生成剂所组成的群组中。

在某些实施方式中，所述抗发炎剂为环孢素。所述神经钙调蛋白抑制剂为凡可斯伯灵。所述抗生素选自于：阿米卡星、庆大霉素、卡那霉素、新霉素、奈替米星、链霉素、妥布霉素、替考拉宁、万古霉素、阿奇索霉素、克拉霉素、地红霉素、红霉素、罗红霉素、醋竹桃霉素、阿莫西林、氨比西林、阿洛西林、羧苄西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林、美洛西林、奈夫西林、盘尼西林、哌拉西林、替卡西林、枯草菌素、粘杆菌素、多粘菌素B、环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、左氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、曲伐沙星、磺胺米隆、磺胺醋酰、磺胺甲二唑、柳氮磺胺吡啶、磺胺异唑、甲氧苄啶、复方新诺明、地美环素、脱氧羟四环素、米诺环素、氧四环素和四环素所组成的群组中。所述烟碱乙酰胆碱受体激动剂为毛果芸香碱、阿托品、尼古丁、地棘蛙素、洛贝林和吡虫啉所组成的群组中。所述抗淋巴管生成剂可以是血管内皮生长因子C(VEGF-C)抗体、VEGF-D抗体或VEGF-3抗体。在所有实施方式中，适用于本发明治疗方法的个体均为人类。

下文提出多个实验例来说明本发明的某些方式，以利本发明所属技术领域中具有通常知识者实作本发明，且不应将这些实验例视为对本发明范围的限制。

实施例

材料与方法

材料

羧甲基纤维素钠(Carboxymethylcellulose sodium；CMC)、过碘酸雪夫试剂(period acid Schiff；PAS)和地塞米松(dexamethasone)皆购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。CMC(1％w/v)溶于平衡盐溶液，作为7-mer载体使用。所有肽由GenScript(Piscataway,NJ,USA)公司合成，其中每一肽的N端及C端分别经乙酰化和胺基化修饰，以改善其稳定性，接着以质谱仪定性(纯度：>95％)。

实验动物

本实验采用七至八周龄的C57BL/6小鼠(每只体重约18至25克)。实验过程经马偕纪念医院审查委员会同意并遵循视觉及眼科学学术研究会议(ARVO)所订定的动物实验眼科和视觉研究相关规定。

干眼症动物模式

将小鼠置入于人工环境室(controlled environment chamber；CEC)中，并依据Barabino等人(IVOS(2005)46(8),2766-2771)所揭示的实验步骤，诱导小鼠产生干眼症。置入CEC的小鼠暴露在相对湿度较低的环境下，相对湿度(RH)<25％；温度为20至22℃；空气流量为15L/分；每日12小时。对照组的小鼠置于正常的环境(RH>50％；空气流量为0；温度为21–23℃)并经过相同的期间。

角膜荧光染色

实验动物以腹腔注射的方式，注入一混合物，其包含舒泰(zoletil)(6毫克/公斤)和甲苯噻嗪(Xylazine)(3毫克/公斤)，以进行麻醉。以局部荧光染色(Fluor-I-Strip,Ayerst Laboratories,Philadelphia,PA)测定角膜损伤。角膜荧光染色以裂隙灯生物显微镜(slit-lamp biomicroscope)，于钴蓝色光(cobalt blue ligh下观察，并以数字相机撷取影像。数据以平均值±标准偏差(mean±SD)。根据标准化5分量表(0点，为第零级；1-5点，为第一级；6-15点，为第二级；16-30点，为第三级；30点为第四级)，将每一眼睛1-mm中心角膜区域的荧光染色点进行分级。再者，若染色结果中，具有一全满染色区域，则额外加一分，且若具有二个或以上的全满染色区域则额外加二分(Li J et al.,Mole Visions 2012,18,317)。

泪液分泌量测定

泪液产量以酚红检测棉线测定(Zone-Quick；Oasis,Glendora,CA)。本小鼠试验的有效性是依据前述Dursun等人文献(IVOS(2002)43,632-638)所揭示的步骤执行。以镍子夹取棉线将其置放于小鼠的外眦部，静置60秒。棉线经泪液沾湿后，湿润处转变成红色，再以公厘表示泪液分泌量。

角膜上皮组织病理学检查

以Pflugfelder等人(2005,Am J Pathol 166,61-71)所揭示的方法评估角膜上皮的损伤。简言之，所述顶端细胞剥落数量的计算方式，是由二名各自独立操作的检验人员，以20目镜分别进行镜检，计算显微镜下一完整视野内的细胞总量，并观察三个不同组织切片。

杯状细胞PAS染色

将实验动物安乐死后，以手术摘除眼睛，将其以10％甲醛固定，再以石蜡包埋，并进行切片(厚度为：5μm)。所述切片以PAS(Sigma-Aldrich)试剂染色，以检验于小鼠上、下结膜中的杯状细胞，并在显微镜下观察并以数字相机拍摄照片。

结果以平均值±标准误(mean±standard error,SEM)表示。以单因子变异数分析(1-way ANOVA)进行统计分析。P<0.05为具有显著性。

实施例1本发明合成肽可预防干燥压力诱发的干眼症

依据“材料与方法”所述的步骤，将小鼠置入CEC中诱导其产生干眼症(DED)。治疗的第一天，将小鼠置入于CEC中，局部施用本发明合成肽(即，7-mer；100μM)、肽载体(1％CMC)或衍生自7-mer的肽(即，7-mer-ΔD、7-mer-ΔS、7-mer(V→L)或7-mer(VR→QK)；100μM)至小鼠眼部，施用频率：每日三次，并持续施用14天。7-mer-ΔD肽(LYRVRS；序列编号：6)和7-mer-ΔS肽(DLYRVR；序列编号：7)是分别删除7-mer的N端(D；天冬氨酸)和C端(S；丝氨酸)上一氨基酸残基后所得的序列，此二肽序列是作为阴性对照肽。此外，7-mer肽序列中单一个和二个氨基酸经置换的肽(即，7-mer(V→L)和7-mer(VR→QK))，皆具有治疗干眼症的活性。

以荧光染色评估角膜上皮的完整性，结果示于图1A和图1B。图1A为干眼症小鼠分别经1％CMC载体、7-mer及其衍生物处理的结果。图1B为图1A定量分析的结果。

如图1A所示，以1％CMC处理的角膜上皮，产生显著的荧光染色。因此，可以得知经载体处理的角膜上皮，无法预防干燥压力诱导的角膜上皮损伤。相反地，以7-mer处理的小鼠，其荧光染色强度较载体组显著降低(3.8±0.31v.s 1.3±0.21)，其显示以7-mer处理的小鼠其角膜相对较为完整，此结果亦显示所述7-mer合成肽能够保护和/或预防小鼠发展DED。以7-mer(即，7-mer(V→L)或7-mer(VR→QK))衍生物处理的小鼠亦具有类似的保护效果。此外，以所述7-mer(ΔD)和7-mer(ΔS)处理的小鼠，则不具有任何保护或预防效果。

测量实验动物泪液分泌量，以评估本发明7-mer和其衍生物对于DED的保护效果，结果示于图2。

检测置于CEC内(期间：14天)小鼠的泪液分泌量。结果显示，相较于健康的小鼠未置于CEC和未接受任何处置的小鼠，以1％CMC载体处理的小鼠经干燥压力其泪液分泌量显著的降低(P<0.05)。相对地，相较于载体对照组，经7-mer、7-mer(V→L)或7-mer(VR→QK)处理的小鼠，其保持较高量的泪液分泌能力(3.7±0.25v.s.5.1±0.21,5.0±0.16和4.9±0.15；图2)。此外，7-mer(ΔD)或7-mer(ΔS)肽不具有相关功效。

此实施例的结果证实7-mer合成肽可预防动物发展干燥压力诱导产生的DED。

实施例2本发明合成肽具有治疗干燥压力诱导干眼症的功效

依据前述“治疗与方法”所示的步骤，将动物置入CEC中14天，以产生干眼症。以荧光染色确认DED的病征后(图3A；上排；14天)，将动物移出CEC并将其置于一般环境中(第15天)，接着施用眼药水，持续治疗7天(图3A；下排；第21天；和图3B)，其中所述眼药水分别含1％CMC、1％地塞米松(Dex)、7-mer(100μM)或7-mer(ΔS)。

定量结果示于图3B，结果显示0.1％地塞米松和对照组肽7-mer(ΔS)无法有效治疗DED。相对地，相较于对照组的小鼠(1％CMC)，本发明内容的7-mer合成肽能显著降低所述角膜荧光染色的分数(3.6±0.26v.s.1.5±0.18；图3B)。

经1％CMC载体、0.1％Dex和对照组肽7-mer(ΔS)处理的小鼠，分别将角膜组织切片以H&E染色，鉴定各检体中剥离的角膜表层顶端细胞(图4A)。在正常健康小鼠(未处置)和7-mer处理后的小鼠的角膜组织中，不具有剥离的细胞。相较于对照组(1％CMC)或7-mer(ΔS)处理组的小鼠，本发明内容所述7-mer合成肽能显著降低顶端细胞的剥离(14±1.06和13.8±1.03v.s.2.1±0.37；图4B)。

杯状细胞为结膜上皮层中的细胞，用以分泌黏蛋白。所述黏蛋白为泪液层组成份之一，用以使角膜处于含水的环境。PAS染色切片的结果显示，在干燥条件(14天)下的小鼠，以及施用1％CMC或7-mer(ΔS)的干燥压力小鼠，其杯状细胞的数量显著降低(图5A；下排)。而施用7-mer合成肽的小鼠其杯状细胞量与正常健康小鼠(未处置)相同(图5A；上排)。因此，相较于施用1％CMC的小鼠，本发明的7-mer合成肽能显著的诱导杯状细胞生长(7.5±0.96v.s.2.7±1.28；图5B)。

综合以上实验结果，证实本发明内容的短合成肽具有一新颖的功能，能治疗和/或预防干眼症。

虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不悖离本发明的原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此本发明的保护范围当以附随申请专利范围所界定者为准。

序列表

<110> 曹友平

何宗权

<120> 短合成肽及其治疗和/或预防干眼症的用途

<130> P2861-TW

<160> 7

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建构体

<220>

<221> VARIANT

<222> 5..6

<223> Xaa为任一氨基酸

<400> 1

Asp Leu Tyr Arg Xaa Xaa Ser

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建构体

<400> 2

Asp Leu Tyr Arg Val Arg Ser

1 5

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建构体

<400> 3

Asp Leu Tyr Arg Leu Arg Ser

1 5

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建构体

<400> 4

Asp Leu Tyr Arg Gln Arg Ser

1 5

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建构体

<400> 5

Asp Leu Tyr Arg Gln Lys Ser

1 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建构体

<400> 6

Leu Tyr Arg Val Arg Ser

1 5

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建构体

<400> 7

Asp Leu Tyr Arg Val Arg

1 5

Claims

1.一种由7个连续氨基酸残基所组成的合成肽，其序列为DLYRX₁X₂S，其序列编号为1，且所述X₁和X₂分别为任一种氨基酸残基。

2.如权利要求1所述的合成肽，其中X₁和X₂分别为亮氨酸(leucine)和精氨酸(arginine)。

3.如权利要求1所述的合成肽，其中所述X₁和X₂分别为缬氨酸(valine)和精氨酸。

4.如权利要求1所述的合成肽，其中所述X₁和X₂分别为谷氨酰胺(glutamine)和精氨酸。

5.如权利要求1所述的合成肽，其中所述X₁和X₂分别为谷氨酰胺和赖氨酸(lysine)。

6.如权利要求1所述的合成肽，其中所述序列编号：1的氨基酸序列中至少一个氨基酸残基为右旋(D-form)氨基酸残基。

7.如权利要求6所述的合成肽，其中所述序列编号：1的氨基酸序列中至少二个氨基酸残基为右旋氨基酸残基。

8.一种合成肽的用途，其是用以制备治疗干眼症(dry eye disease，DED)的医药品，其中所述合成肽由7个连续氨基酸残基所组成，其序列为DLYRX₁X₂S，且其序列编号为1，且所述X₁和X₂分别可为任一种氨基酸残基。

9.如权利要求8所述的用途，其中所述X₁和X₂分别为亮氨酸和精氨酸。

10.如权利要求8所述的用途，其中所述X₁和X₂分别为缬氨酸和精氨酸。

11.如权利要求8所述的用途，其中所述X₁和X₂分别为谷氨酰胺和精氨酸。

12.如权利要求8所述的用途，其中所述X₁和X₂分别为谷氨酰胺和赖氨酸。

13.如权利要求8所述的用途，其中所述序列编号：1的氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基为右旋氨基酸残基。

14.如权利要求13所述的用途，其中所述序列编号：1的氨基酸序列中的至少二氨基酸残基为右旋氨基酸残基。

15.一种治疗罹患干眼症(dry eye disease，DED)的个体的方法，包含对所述个体施用一有效量之一合成肽，其中所述合成肽由7个连续氨基酸残基所组成，其序列为DLYRX₁X₂S(序列编号：1)，且所述X₁和X₂分别可为任一种氨基酸残基。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述X₁和X₂分别为亮氨酸和精氨酸。

17.如权利要求15所述的方法，其中所述X₁和X₂分别为缬氨酸和精氨酸。

18.如权利要求15所述的方法，其中所述X₁和X₂分别为谷氨酰胺和精氨酸。

19.如权利要求15所述的方法，其中所述X₁和X₂分别为谷氨酰胺和赖氨酸。

20.如权利要求15所述的方法，其中所述序列编号：1的氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基为右旋氨基酸右旋。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述序列编号：1的氨基酸序列中的至少二个氨基酸残基为右旋氨基酸残基。

22.如权利要求15所述的方法，还包含对所述个体施用一有效量的以下任一种药剂：抗发炎剂、神经钙调蛋白抑制剂、抗生素、烟碱乙酰胆碱受体激动剂或抗淋巴管生成剂。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述抗发炎剂是为环孢素。

24.如权利要求22所述的方法，其中所述神经钙调蛋白抑制剂为凡可斯伯灵(voclosporin)。

25.如权利要求22所述的方法，其中所述抗生素选自以下：阿米卡星(amikacin)、庆大霉素(gentamycin)、卡那霉素(kanamycin)、新霉素(neomycin)、奈替米星(netilmicin)、链霉素(streptomycin)、妥布霉素(tobramycin)、替考拉宁(teicoplanin)、万古霉素(vancomycin)、阿奇索霉素(azithromycin)、克拉霉素(clarithromycin)、地红霉素(dirithromycin)、红霉素(erythromycin)、罗红霉素(roxithromycin)、醋竹桃霉素(troleandomycin)、阿莫西林(amoxicillin)、氨比西林(ampicillin)、阿洛西林(azlocillin)、羧苄西林(carbenicillin)、氯唑西林(cloxacillin)、双氯西林(dicloxacillin)、氟氯西林(flucloxacillin)、美洛西林(mezlocillin)、奈夫西林(nafcillin)、盘尼西林(penicillin)、哌拉西林(piperacillin)、替卡西林(ticarcillin)、枯草菌素(bacitracin)、粘杆菌素(colistin)、多粘杆菌B(polymyxin B)、环丙沙星(ciprofloxacin)、依诺沙星(enoxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、左氧氟沙星(levofloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、诺氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、曲伐沙星(trovafloxacin)、磺胺米隆(mafenide)、磺胺醋酰(sulfacetamide)、磺胺甲二唑(sulfamethizole)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、磺胺异唑(sulfisoxazole)、甲氧苄啶(trimethoprim)、复方新诺明(cotrimoxazole)、地美环素(demeclocycline)、脱氧羟四环素(doxycycline)、米诺环素(minocycline)、氧四环素(oxytetracycline)和四环素(tetracycline)所组成的群组中。

26.如权利要求22所述的方法，其中所述烟碱乙酰胆碱受体激动剂为毛果芸香碱(pilocarpine)、阿托品(atropine)、尼古丁(nicotine)、地棘蛙素(epibatidine)、洛贝林(lobeline)或吡虫啉(imidacloprid)。

27.如权利要求22所述的方法，其中所述抗淋巴管生成剂为血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C,VEGF-C)抗体、VEGF-D抗体或VEGF-3抗体。

28.如权利要求15所述的方法，其中所述个体为人类。