TWI540141B - 短合成胜肽及其治療和／或預防乾眼症之用途 - Google Patents

Description

短合成胜肽及其治療和/或預防乾眼症之用途

本發明是有關於發現一種短合成胜肽，及其治療和/或預防眼部疾病的用途。

乾眼症(dry eye disease,DED)泛指淚液層異常的的各種狀況，其可能肇因於角質層受損。乾眼症的症狀包含眼部沙質粗糙感(sandy-gritty feeling)、灼熱感、刺痛感、異物感，且患者在白天會產生更嚴重的不適感。DED患者的症狀嚴重程度不一，症狀較嚴重的患者，會感受到眼部持續的刺痛，以及造成眼球表面上皮病變、破壞眼球無菌環境或造成細菌性角膜潰瘍。現今可用以治療乾眼症的FDA核准處方藥物僅有皮質類固醇(corticosteroids)和Restasis(0.05%環孢素)。然而，上述二種藥物皆無法有效治癒受損的角膜組織，但經由長時間的治療(約4-6個月)可顯著減緩DED症狀或使受損的角膜組織癒合。

因此，本領域亟需一種改良的醫藥品和/或治 療和/或預防DED的方法。

發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

本揭示內容係有關於發展新穎化合物和/或用以治療眼部疾病的方法，尤其是乾眼症(DED)。

本揭示內容的第一態樣係提供一種能用以治療DED的短合成胜肽。所述短合成胜肽係由7個連續胺基酸殘基所組成，其序列為DLYRX₁X₂S(序列編號：1)，且所述X₁和X₂分別為任一胺基酸殘基。

依據本揭示內容其他實施方式，所述合成胜肽中的X₁和X₂分別為纈胺酸和精胺酸，如序列編號：2所示之胺基酸序列。

再者，在某些實施方式中，所述合成胜肽中的X₁和X₂分別為白胺酸和精胺酸，如序列編號3所示之胺基酸序列。

依據一實施方式，所述合成胜肽中的X₁和X₂分別為麩胺酸和精胺酸，如序列編號：4所示之胺基酸序列。

依據其他實施方式所揭示的內容，所述合成胜肽中的X₁和X₂分別為麩胺酸和賴胺酸，如序列編號：5所示之胺基酸序列。

依據又一實施方式，所述序列編號1的合成胜肽中包含至少一右旋胺基酸殘基。在部分實施例中，所述序列編號1的合成胜肽中包含至少二右旋胺基酸殘基。

本揭示內容的第二態樣為一種治療一患有乾眼症個體的方法。所述方法包含施用一有效量的一合成胜肽至所述個體，以減緩DED相關的症狀。所述合成胜肽由7個連續胺基酸殘基所組成，其序列為DLYRX₁X₂S(序列編號：1)，其中X₁和X₂分別為任一胺基酸殘基。

依據其他實施方式，所述合成胜肽中的X₁和X₂分別為纈胺酸和精胺酸，如序列編號2所示之胺基酸序列。

依據部分實施方式，所述合成胜肽中的X₁和X₂分別為白胺酸和精胺酸，如序列編號3所示之胺基酸序列。

依據一實施方式，所述合成胜肽中的X₁和X₂分別為麩胺酸和精胺酸，如序列編號4所示之胺基酸序列。

依據又一實施方式，所述合成胜肽中的X₁和X₂分別為麩胺酸和賴胺酸，如序列編號5所示之胺基酸序列。

依據其他實施方式，本揭示內容序列編號1的合成胜肽包含至少一右旋胺基酸殘基。在部分實施例中，序列編號1的合成胜肽包含至少二右旋胺基酸殘基。

依據可任選的實施方式，本揭示內容的方法 更包含施用一有效量的藥劑至所述個體，以治療所述乾眼症，其中所述藥劑係選自一抗發炎劑、一鈣調磷酸酶(calcineurin inhibitor)、一抗生素、一菸鹼乙醯膽鹼受體促效劑和一抗淋巴管生成劑所組成的群組中。

在某些實施例中，所述抗發炎劑為環孢素。所述鈣調磷酸酶為凡可斯伯靈(voclosporin)。所述抗生素係選自：阿米卡星(amikacin)、健他黴素(gentamycin)、卡那徽素(kanamycin)、新黴素(neomycin)、奈替米星(netilmicin)、鏈黴素(streptomycin)、妥布黴素(tobramycin)、替考拉寧(teicoplanin)、萬古黴素(vancomycin)、亞茲索黴素(azithromycin)、克拉黴素(clarithromycin)、地紅黴素(dirithromycin)、紅黴素(erythromycin)、羅紅黴素(roxithromycin)、桃黴素(troleandomycin)、阿莫西林(amoxicillin)、安比西林(ampicillin)、阿洛西林(azlocillin)、卡本西林(carbenicillin)、氯坐西林(cloxacillin)、二氯坐西林(dicloxacillin)、氟氯西林(flucloxacillin)、美洛西林(mezlocillin)、奈夫西林(nafcillin)、盤尼西林(penicillin)、必倍西林(piperacillin)、替卡西林(ticarcillin)、枯草桿菌素(bacitracin)、柯利黴素(colistin)、多黴素B(polymyxin B)、塞普沙辛(ciprofloxacin)、依諾沙星(enoxacin)、加替沙星(gatifloxacin)、左旋氧氟沙星(levofloxacin)、洛美沙星(lomefloxacin)、莫西沙星(moxifloxacin)、諾氟沙星(norfloxacin)、氧氟沙星(ofloxacin)、曲伐沙星 (trovafloxacin)、磺胺米隆(mafenide)、乙醯磺胺(sulfacetamide)、磺胺甲二唑(sulfamethizole)、磺胺塞拉金(sulfasalazine)、異坐磺胺(sulfisoxazole)、曲美普林(trimethoprim)、複方新諾明(cotrimoxazole)、地美環素(demeclocycline)、去氧羥四環素(doxycycline)、米諾四環素(minocycline)、氧四環素(oxytetracycline)和四環素(tetracycline).所組成的群組中。所述菸鹼乙醯膽鹼受體促效劑為毛果芸香鹼(pilocarpine)、阿托品(atropine)、尼古丁(nicotine)、棘蛙素(epibatidine)、洛貝林(lobeline)或吡蟲啉(imidacloprid)。所述抗淋巴管生成劑為血管內皮生長因子C(vascular endothelial growth factor C；VEGF-C)抗體、VEGF-D抗體或VEGF-3抗體。

在所有的實施方式，所述個體為人類。

本揭示內容第三態樣為一種合成胜肽之用途，其係用以製備治療和/或預防乾眼症(dry eye disease,DED)之醫藥品。所述合成胜肽係由7個連續胺基酸殘基所組成，其序列為DLYRX₁X₂S(序列編號：1)，且所述X₁和X₂分別為任一胺基酸殘基。

依據其他實施方式，所述合成胜肽中的X₁和X₂分別為纈胺酸和精胺酸，如序列編號2所示之胺基酸序列。

依據部分實施方式，所述合成胜肽中的X₁和X₂分別為白胺酸和精胺酸，如序列編號3所示之胺基酸序列。

依據一實施方式，所述合成胜肽中的X₁和 X₂分別為麩胺酸和精胺酸，如序列編號4所示之胺基酸序列。

依據又一實施方式，所述合成胜肽中的X₁和X₂分別為麩胺酸和賴胺酸，如序列編號：5所示之胺基酸序列。

依據其他實施方式，本揭示內容序列編號：1的合成胜肽包含至少一右旋胺基酸殘基。在部分實施例中，序列編號：1的合成胜肽包含至少二右旋胺基酸殘基。

在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1A圖為依據本揭示內容一實施方式所示之小鼠角膜組織經由螢光染色的照片，以顯示本發明合成胜肽對於乾燥壓力小鼠(desiccating stressed-mice)的預防效果；第1B圖為第1A圖定量分析之直條圖；第2圖為依據本揭示內容一實施方式所示之本發明合成胜肽促進乾燥壓力小鼠產生淚液的能力；第3A圖為依據本揭示內容一實施方式所示之角膜組織螢光染色的照片，以顯示本發明合成胜肽對於 乾燥壓力小鼠的治療效果；第3B圖為第3A圖定量分析所示之直條圖；第4A圖為依據本揭示內容一實施方式所示，小鼠角膜切片經H&E染色的組織檢查照片；第4B圖為第4A圖定量分析的直條圖；第5A圖為依據本揭示內容一實施方式所示，結膜上皮經由PAS染色的照片，其中箭頭所指為杯狀細胞(粉紅色；PAS染色陽性)；以及第5B圖為第5A圖定量分析的直條圖。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

1.名詞定義

除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。

在此處「胜肽」(peptide)一詞係指胺基酸殘基所組成的聚合物。「合成胜肽」(synthetic peptide)一詞則代表此胜肽並未包含存在於自然界的完整蛋白質分 子。此種胜肽之所以是「合成的」，表示其乃是由人類利用技術手段所得，譬如化學合成、重組遺傳技術或將整個抗原切段。於本說明書中，任何胺基酸殘基於一胜肽中的位置係由該胜肽的N端起算。

此處針對合成胜肽序列所述的「胺基酸序列相似度百分比」(Percent % amino acid sequence identity)係指該候選合成胜肽之胺基酸殘基與一參考多胜肽之胺基酸殘基完全相同的百分比。於進行上述比對時，可將該候選合成胜肽與該參考多胜肽並排，並於必要時引入間隙，以使二序列形成最高的序列相似度，且在計算相似度時，並未將保守性置換之胺基酸殘基納入考量。相關領域已有多種方法可供進行上述並排，譬如可公開取得的軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)等。本發明所屬技術領域中具有通常知識者在進行並排時，可選擇適當的參數與計算方式，以得到最佳的排列方式。在本說明書中，二胺基酸序列間的序列比較是採用美國國家生物科技資訊中心(Nation Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI)所提供的蛋白質-蛋白質BLAST分析軟體Blastp來進行。一候選胺基酸序列A相較於一參考胺基酸序列B的胺基酸序列相似度(在本說明書中亦稱之為序列A與序列B具有特定百分比(%)的胺基酸序列相似度)的計算方式如下：

其中X是利用Blastp軟體對序列A、B進行 排列後所得到的相同胺基酸殘基數目(identical matches)，而Y是A、B二序列中較短者的胺基酸殘基總數。

所述「治療(treatment)」一詞係指預防性(如，預防用藥)、療癒性或緩和性的處置，藉以達到所欲的藥學和/或生理學效果；例如，減緩或治癒個體出現乾眼症的癥狀。上述的效果是指能夠部分或完全地治癒或預防個體出現所述疾病的症狀。所述「治療(Treatment)」包含預防、治療或減緩一哺乳類的疾病，尤其是人類。所述治療包含：(1)預防(如，預防用藥)、治療或減緩一個體的疾病或症狀，其中所述個體可能患有疾病但尚未被診斷；(2)抑制一疾病(即，降低發展出與該疾病、異常和/或病症相關之病理變化的風險)；或(3)治癒一疾病(即，減少與所述疾病相關的症狀)。

所述「施用(administered)(administering)(administration)」一詞係指將本發明之胜肽或組合物提供給個體。所述傳遞方式包含，但不限於，靜脈內、肌肉內、腹膜內、動脈內、顱內或皮下傳遞方式。

在此處，「有效量(effective amount)」一詞係指一成分的用量足以招致所欲的反應或效果，即，能有效治療疾病。舉例而言，一藥劑(如，化合物、合成胜肽、編碼治療胜肽的核酸)，其能用以降低、預防、延緩或治癒乾眼症的相關症狀。一藥劑的有效量不必然能夠治癒一疾病或症狀，但能延緩、阻礙或預防疾病或症狀的發 生，或延緩疾病或症狀相關的病徵。所術治療有效量可分成一、二或更多劑量於單一施用劑量型式，且可於一指定期間內施用一次、二次或更多次。

所述「哺乳類(mammal)」一詞涵蓋哺乳綱的所有成員，包含：人類、靈長類動物、家畜和農畜。舉例而言，所述家畜或農畜可以是兔子、豬、羊和牛。所述哺乳類亦可涵蓋動物園或競賽用動物、寵物，以及齧齒類(如，小鼠和大鼠)。所述「非人類哺乳類」一詞係指除了人類以外，哺乳類綱下的所有動物。

所述「個體(subject)」或「患者(patient)」一詞可交互使用，且在此係指可接受本揭示內容之合成胜肽和/或方法的動物(包含，人類)。除非另有指明，「個體」或「患者」一般包含雄性與雌性。再者，所述「個體」或「患者」包含可從本揭示內容的治療方法得到良好治療效果的動物。舉例而言，所述「個體」或「患者」包含，但不限於，人類、大鼠、小鼠、天竹鼠、豬、猴子、豬、羊、牛、馬、狗、貓、鳥和禽類。在一實例中，所述患者為人類。

「藥學上可接受載體(pharmaceutically acceptable carrier)、賦形劑(excipient)或安定劑(stabilizer)」一詞，係指一適合施用於眼睛的載體、藥劑或化合物。「眼用組合物(ophthalmic composition)」一詞係指可施用於眼睛的組合物，或者可用以處理與眼睛接觸的裝置(例如，隱形眼鏡)。

所述「乾眼症(DED)」一詞係指結膜持續性 的乾澀和角膜混濁等症狀，且該些症狀係由淚液分泌量減少、淚液過度蒸發、黏液異常產生或於淚液層中出現脂質等原因所造成。DED的成因，包含，但不限於，暴露於乾燥環境(如，飛機和工作場所)、維生素A缺乏、乾燥綜合症(Sjögren’s syndrome)、類風溼性關節炎和其他類風濕性疾病、化合物、熱灼傷或藥物。所述藥物為阿替洛爾(atenolol)、氯菲安明(chlorpheniramine)、氫氯苯噻噠嗪(hydrochlorothiazide)、異維甲酸(isotretinoin)、酮咯酸(ketorolac)、酮替芬(ketotifen)、左卡巴斯汀(levocabastin)、左旋氧氟沙星、奧昔布寧(oxybutynin)和托特羅定(tolterodine)。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已儘可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0。5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的 有效位數與套用一般進位法所得到的數值。

在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型。

2.實施方式

本發明至少一部份係基於發現一短合成胜肽，其能用以治療和/或預防一個體眼部疾病的發展；例如，乾眼症(DED)。再者，本發明提供一用以治療和/或預防乾眼症方法和組合物，其中所述組合物包含新發現的合成胜肽。

2.1本發明之合成胜肽

本揭示內容之短合成胜肽係由7個連續胺基酸殘基所組成，其序列為DLYRX₁X₂S(序列編號：1)，且所述X₁和X₂分別為任一胺基酸殘基。

在一實施方式中，所述X₁為白胺酸，X₂為精胺酸。

在其他實施方式中，所述X₁和X₂分別為纈胺酸和精胺酸。

在另一其他實施方式中，所述X₁和X₂分別為麩胺酸和精胺酸。

在又一實施方式，所述X₁和X₂分別為麩胺酸和賴胺酸。

在其他可任選的實施方式中，序列編號：1之合成胜肽包含至少一右旋胺基酸殘基。在某些實施例中，序列編號：1之合成胜肽包含二右旋胺基酸殘基。

本發明之合成胜肽可藉由先前技術所述之任 一標準胜肽合成方法所製成。在一實施方式中，本發明之合成胜肽係以一固相胜肽合成器(ABI433A胜肽合成器；Applied Biosystems Inc.；Life Technologies Corp.；Foster City,CA,USA)並依據操作手冊所合成。本揭示內容的合成胜肽為7-mer(X₁、X₂)(序列編號：1)、7-rner(序列編號：2)、7-mer(V→L)(序列編號：3)、7-mer(V→Q)(序列編號：4)或7-mer(VR→QK)(序列編號：5)，各該合成胜肽序列如表1所示。

所屬技術領域中具有通常知識者可藉由常規的方法(如，電腦模擬程式)修飾所述合成胜肽，且該些方法可預測胜肽序列構形改變對於活性的影響。再者，可基於在此所揭示的內容，「設計」或「修飾」本發明合成胜肽(如，7-mer)；即，基於教示和測試一修飾後合成胜 肽，以確定經修飾的合成胜肽是否具有預期的功能或構型。本發明合成胜肽(如，7-mer)可經由修飾以改變胜肽特徵且不影響其生理活性。舉例而言，改變和/或刪除特定的胺基酸，且不影響本揭示內容所示之生理活性(即，治療DED的功效)。依據某些實施方式，7-mer胜肽序列上的第五個和第六個胺基酸殘基(分別為纈胺酸和精胺酸)可以被任一胺基酸取代，不影響其治療和/或預防DED的能力。因此，本發明涵蓋與較佳合成胜肽(序列編號：2)有均等功能的衍生物，包含帶有胺基酸保留性置換之胜肽。

依據其他實施方式，將位於序列編號：2的N-端的天門冬胺酸(D)和C-端上的絲胺酸(S)刪除後，所得到的修飾胜肽序列分別命名為7-mer-△D(LYRVRS；序列編號：6)和7-mer-△S(DLYRVR；序列編號：7)，且此二胜肽序列不具有與DED相關的生物活性。因此，位於序列編號2胜肽序列N-端的天門冬胺酸(D)和C-端的絲胺酸(S)對於維持本發明合成胜肽治療DED活性具有重要性，此二胺基酸殘基僅能被保留性胺基酸殘基取代。

另外，本發明的合成胜肽可利用重組技術製備。舉例而言，可利用重組技術將編碼本發明胜肽的核酸序列嵌入至一表現載體中，且其中所述核酸序列可與一調控序列連結，以在宿主細胞內表現本發明胜肽。接著，可將所述載體送入一合適的宿主細胞內表現本發明之胜肽。經表現的重組胜肽可以藉由硫酸銨沈澱法和管柱分劃色層分析法純化，並依據本揭示內容各實施例所 示之方法進行活性測試。

上述核酸或多核苷酸可利用已知的生物降解聚合物微粒或微囊傳遞裝置傳送。另外，亦可利用常規方法以脂質體包覆核酸，以將所述核酸供宿主吸收。所述多核苷酸可單獨載入或與其他組織專一性抗體共同載入至所述傳遞載體中。此外，可製備一分子接合物(molecular conjugate)，其係由質體或其他載體以靜電或共價力連結poly-L-賴胺酸。此外，本發明亦可利用已知的組織專一性轉錄調節元件(tissue-specific transcriptional regulatory elementst)，進行組織專一性標定。將「裸DNA(naked DNA)(即，無傳遞載體)」傳遞至肌肉內、皮內或皮下的位置，並利用其他方法以進行胞內表現(vivo expression)。

2.2治療和/或預防DED的組合物

本發明合成胜肽可用以治療罹患乾眼症的個體，或預防個體罹患乾眼症。

本揭示內容的另一態樣提供一種用以治療DED的醫藥品，其包含本發明所述的合成胜肽。於製造所述醫藥品時，可取一適當量的本發明合成胜肽與一藥學上可接受載體、賦形劑或安定劑混合，而得到一適用於眼睛施用的組合物，例如，一凍乾製劑或一水溶液。在特定的實施方式中，所述合成胜肽序列為序列編號：2-5或其組合。

所述組合物中本發明胜肽的含量隨著使用的胜肽而有所不同。所述組合物中的胜肽含量約為0.001% 至10%(重量%)；例如，約0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2.、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.9、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9或10.0%。在一較佳的實施方式中，所述胜肽的含量約為0.001%至5%(重量%)；例如，約0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2.、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.9、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9或5.0%。

所屬技術領域中已知有多種藥學可接受載體、賦形劑或安定劑能夠適用於本發明之合成胜肽。舉例而言，適用的緩衝液為磷酸(phosphate)、草酸鹽(citrate)和其他有機酸；抗氧化劑包含抗壞血酸(ascorbic acid)和甲硫氨酸(methionine)；防腐劑(如，十八烷基二甲基苯基氯化銨(octadecyldimethylbenzy ammonium chloride)、氯 化六羥季銨(hexamethonium chloride)、氯化苯甲烴銨(benzalkonium chloride)、氯化苯索(benzethonium chloride)、酚醇(phenol alcohol)、丁醇(butyl alcohol)、苯甲醇(benzyl alcohol)、烷基對羥基苯甲酸酯(alkyl parabens)(如：甲基對羥基苯甲酸酯或丙基對羥基苯甲酸酯)、兒茶酚(catechol)、苯二酚(resorcinol)、六氫苯酚(cyclohexanol)、3-戊醇(3-pentanol)和間甲酚(m-cresol))；低分子量胜肽(小於約10個胺基酸殘基)；蛋白質，如：血清蛋白(serum albumin)、明膠(gelatin)或免疫球蛋白(immunoglobulins)；親水性聚合物(hydrophilic polymers)，如：聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)；胺基酸，如：甘胺酸、麩胺酸、天門冬醯胺，組胺酸，精胺酸，或賴胺酸；單醣(monosaccharides)、雙醣(disaccharides)和其他碳水化合物，包含：葡萄糖(glucose)甘露醣(mannose)或糊精(dextrins)；螯合劑(chelating agents)，如：乙二胺四醋酸(ethylenediaminotetraacetic acid,EDTA)；糖類(sugars)，如：蔗糖(sucrose)、甘露醇(mannitol)、海藻糖(trehalose)或山梨糖醇(sorbitol)；鹽形成抗衡離子(salt-forming counter-ions)，如：鈉；金屬複合物(如，Zn-蛋白複合物)和/或非離子表面活性劑，如：聚山梨醇酯(polysorbates)(即，TWEEN^®)、異丙基丙烯醯胺(poloxamers)(即，PLURONICS^®)或聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)。

在一特定實施方式，可將本發明所提供的組合物製成局部施用的配方。局部施用的配方通常為液 狀，且其具有一生理可接受pH值，通常可多次分注使用。因此，在一具體的實施方式，所述組合物為一局部眼用組合物，其包含一治療有效量之合成胜肽(即，7-mer、7-mer(V→L)、7-mer(V→Q)或7-mer(VR→QK)以及一藥學可接受載體，且所述藥學可接受載體為一適用於眼部局部施用的載體。此外，所屬技術領域中具有通常知識者已知的各種型式的載體亦適用之。再者，所述載體通常為液狀。基於方便配製和患者使用上的便利性，通常優先選擇水溶液進行配方。具體而言，患者眼睛感染時，通常會滴用1-2滴所述組合物至眼部。然而，本發明合成胜肽亦可與其他類型的組合物併用；例如，懸浮液、黏性或半黏性凝膠或其他固體或半固體的組合物。亦可將對水溶解度相對較低的胜肽配製成懸浮液配方。本發明眼用組合物亦包含多種其他成分；例如，緩衝液、防腐劑、助溶劑和黏性構建劑。

在較佳的情形中，本發明任一實施方式所述之組合物可包含一有效量的緩衝液，以將pH值維持在約6至8之間；較佳為，pH值7。所述緩衝液可以是所屬技術領域習知的緩衝液；例如，醋酸(acetate)、抗壞血酸鹽(ascorbate)、硼酸鹽(borate)、碳酸氫鹽(bicarbonate)、碳酸鹽(carbonate)、檸檬酸鹽(citrate)和磷酸鹽緩衝(phosphate buffers)。在一較佳的實施方式中，所述緩衝液包含硼酸鹽。本發明所屬領域具有通常知識者可藉由一般常規技術確定本發明緩衝液的有效量。以包含硼酸鹽的緩衝液為例，其其中硼酸鹽的濃度較佳為約0.6%。

在較佳的情形中，本發明任一實施方式所述之組合物可包含一等滲劑(tonicity agent)。在眼用組合物加入等滲劑通能夠將溶解物質的濃度調整至所欲的等張範圍。等滲劑可以是眼部領域中具有通常知識者已知的等滲劑，包含，但不限於甘油(glycerin)、甘露醇(mannitol)、山梨醇(sorbitol)、氯化鈉(sodium chloride)或其它電解質。在一較佳的實施方式中，所述等滲劑為氯化鈉。

通常會將眼用配方包裝成多劑的形式。因此，通常需添加防腐劑，以預防使用過程中發生微生物汙染。在特定情形下，即使是單次使用的組合物中，也可能會添加防腐劑。所述「防腐劑」係指眼科領域中習知的防腐劑。防腐劑通常係添加至多次使用的眼部配方，以預防細菌汙染。所述防腐劑包含，但不限於，氯化苯甲烴銨、硫柳汞(thimerosal)、氯丁醇(chlorobutanol)、甲基對羥基苯甲酸酯、丙基對羥基苯甲酸酯、苯乙醇(phenylethyl alcohol)、乙二胺四乙酸二鈉(edetate disodium)、山梨酸(sorbic acid)、聚季銨鹽-1(polyquaternium-1)、穩定氧氯複合物(stabilized oxychloro complexes)(如，Purite^®))、醋酸苯汞(phenylmercuric acetate)、苯甲醇或其他已知的藥劑。在組合物中，所述防腐劑的濃度為約0.001至1.0%(wt%)。

在特定的情況下，可利用表面活性劑或其他合適的助溶劑與本發明之組合物進行配方。所述「表面活性劑」和「助溶劑」為相關領域習知的試劑。表面活 性劑係用以幫助組合物中的治療活性劑或其他不溶成分溶解。在一非限制性的實例中，所述化合物包含聚蓖麻油(polyethoxylated castor oils)、聚山梨醇酯20、60和80；Pluronic^® F-68、F-84和P-103(BASF Corp.,Parsippany N.J.,USA)；環糊精(cyclodextrins)；或其他已知的藥劑。陰離子、陽離子、兩性離子(zwitterionicc和amphoteric)和非離子表面活性劑皆適用於本發明。為了達到本發明所述之目的，在一較佳的實施方式中，所述表面活性劑可以是非離子表面活性劑，例如：聚山梨醇酯、異丙基丙烯醯胺、乙醇、乙氧酸鹽(ethoxylates)、乙二醇-丙二醇嵌段共聚物(ethylene glycol-propylene glycol block copolymers)、脂肪酸、烷基酚(alkylphenol)或磷脂質(phospholipids)。所述表面活性劑和助溶劑的濃度為約0.01至2%(重量%)。

為了增加眼部吸收活性成分的效率、降低配方配製過程的變異並降低一懸浮液配方或乳液配方物理分離特性，和/或改善所述眼用配方其他事項，可調整配方的黏性，使其大於一般的水溶液。所述增稠劑包含：聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)、聚乙烯氫吡咯酮(polyvinyl pyrrolidone)、甲基纖維素(methyl cellulose)、羥丙基甲基纖維素(hydroxypropyl methylcellulose)、羥乙基纖維素(hydroxyethyl cellulose)、羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose)、羥丙基纖維素(hydroxypropyl cellulos)或其他已知的藥劑。上述藥劑的濃度為約0.01至2%(重量%)。

另一種可添加於本發明之組合物中的化合物 是螯合劑。所述螯合劑是能夠和金屬螯合的化合物。添加螯合劑至眼用組合物中，可增強防腐的效果。在非限制的實施方式中，適用於本發明的螯合劑為乙二胺四乙酸鹽(edetate salts)；如，乙二胺四乙酸二鈉、乙二胺四乙酸鈣二鈉(edetate calcium disodium)、乙二胺四乙酸鈉(edetate sodium)、乙二胺四乙酸三鈉(edetate trisodium)或乙二胺四乙酸二鉀(edetate dipotassium)。

在一具體的實施方式中，可將所述合成胜肽製成適用於眼部的局部施用型式(即，眼用組合物)。所述局部施用的配方可以是眼藥水、凝膠、軟膏或乳液等。

本發明的組合物可局部施用至眼部。隨著患者疾病的嚴重程度不一，本發明合成胜肽的施用劑量為約1微克/公斤體重至約50毫克/公斤體重(如，0.1-20毫克/公斤體重)。每日或每週的施用劑量為約1微克/公斤至約20毫克/公斤或更高。為達到上述任一局部施用之目的，所述局部施用量為約0.01至約100毫克/公斤體重(毫克/公斤)，每日施用一次至數次(如，每日施用4、6、8或更多次)

在一實施方式中，本發明所提供的組合物包含二或更多合成胜肽，其中至少一合成胜肽為7-mer或其衍生物(如，7-mer(V→L)、7-mer(V→Q)或7-mer(VR→QK))，且其具有治療或預防DED的能力。在此實施方式中，所述合成胜肽依據施用的方式(例如，各別施用、同時施用或連續施用)可配製成不同的劑型。

本發明所提供的組合物可以是一套組。可以 理解的是本發明所述之套組係作為一產品，其包含本發明合成胜肽和/或其他治療性化合物，經包裝而形成所述組合物，以利組合物的運送、儲存和同時或連續施用。因此，本發明所述之套組可包含一或多個含本發明之合成胜肽懸浮液、注射器及其類似物，以將本發明之胜肽製成單一劑量或多劑量形式。所述套組更包含一載體，用以溶解本發明所述合成胜肽；例如，水溶液介質物，即生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)、葡萄糖和氯化鈉。水溶性介質，如，乙醇、聚乙二醇(polyethylene glycol)、丙基乙二醇(propylethylene glycol)。若有必要，非水溶性載體亦可適用本發明。本套組的其他物件為一包裝盒，用以包裝本發明之各組成物。適用於本發明之包裝盒的材料可以是玻璃、塑膠(聚乙烯，聚丙烯，聚碳酸酯極其類似物)、瓶子、小罐子、紙、束袋或其類似物。

本發明之套組可更包含說明書，其中記載本發明各種配方的施用方式(如，同時施用、連續施用、個別施用)。因此，本發明之套組可更包含如何施用(如，同時施用、連續施用、個別施用)本發明中不同成分的說明書。所述說明書可以是紙張或為可被讀取的電子媒介物，例如，電子儲存媒體(磁碟、磁帶或其類似物)、光學媒體(CD-ROM，DVD)及其類似物。所述媒體可額外或非必要的附加網路頁面，以提供上述說明資訊。

2.3治療和/或預防DED的方法

如上所述，本發明所揭示的內容能有效的預防和/或治療DED。

因此，本發明係關於一種預防和/或治療DED的方法，其包含局部施用一包含本發明之合成胜肽的一醫藥品或組合物及一藥學可接受載體至一有需要的個體，其中所述合成胜肽係由7個連續胺基酸殘基司所組成，其序列為DLYRX₁X₂S(序列編號：1)，且其中X₁和X₂分別為任一胺基酸殘基。

在一具體的實施方式，所述合成胜肽為一組合物的形式，其中所述組合物包含一或多個合成胜肽。在另一具體的實施方式中，所述合成胜肽為序列編號：2-5任一所示之胜肽序列或其組合。

在可任選的實施方式中，所述方法更包含施用所述個體一有效量的藥劑，以治療DED。所述藥劑係選自於：抗發炎劑、鈣調磷酸酶抑制劑、抗生素、菸鹼乙醯膽鹼受體促效劑和抗淋巴管生成劑所組成之群組中。

在某些實施方式中，所述抗發炎劑為環孢素。所述鈣調磷酸酶為凡可斯伯靈。所述抗生素係選自於：阿米卡星、健他黴素、卡那徽素、新黴素、奈替米星、鏈黴素、妥布黴素、替考拉寧、萬古黴素、亞茲索黴素、克拉黴素、地紅黴素、紅黴素、羅紅黴素、桃黴素、阿莫西林、安比西林、阿洛西林、卡本西林、氯坐西林、二氯坐西林、氟氯西林、美洛西林、奈夫西林、盤尼西林、必倍西林、替卡西林、枯草桿菌素、柯利黴素、多黴素B、塞普沙辛、依諾沙星、加替沙星、左旋氧氟沙星、洛美沙星、莫西沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、 曲伐沙星、磺胺米隆、乙醯磺胺、磺胺甲二唑、磺胺塞拉金、異坐磺胺、曲美普林、複方新諾明、地美環素、去氧羥四環素、米諾四環素、氧四環素和四環素所組成的群組中。所述菸鹼乙醯膽鹼受體促效劑為毛果芸香鹼、阿托品、尼古丁、棘蛙素、洛貝林和吡蟲啉所組成之群組中。所述抗淋巴管生成劑可以是一血管內皮生長因子C(VEGF-C)抗體、一VEGF-D抗體或一VEGF-3抗體。

在所有實施方式中，適用於本發明治療方法的個體為人類。

下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。

實施例

材料與方法

材料

羧甲基纖維素鈉(Carboxymethylcellulose sodium；CMC)、過碘酸雪夫試劑(period acid Schiff；PAS)和地塞米松(dexamethasone)皆購自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。CMC(1% w/v)溶於平衡鹽溶液，作為7-mer載體使用。所有肽係以GenScript(Piscataway,NJ,USA)合成，其中每一胜肽的N端及C端分別經乙醯化和 胺基化修飾，以改善其穩定性，接著以質譜儀定性(純度：>95%)。

實驗動物

本實驗採用七至八週齡的C57BL/6小鼠(每隻體重約18至25克)。實驗過程經馬偕紀念醫院審查委員會同意並遵循視覺及眼科學學術研究會議(ARVＯ)所訂定的動物實驗眼科和視覺研究相關規定。

乾眼症動物模式

將小鼠置入於人工環境室(controlled environment chamber；CEC)中，並依據Barabino等人(IVOS(2005)46(8),2766-2771)所揭示的實驗步驟，誘導小鼠產生乾眼症。置入CEC的小鼠暴露在一濕度相對較低的環境下，相對濕度(RH)<25%；溫度為20至22℃；空氣流量為15L/分；每日12小時。控制組的小鼠置於正常的環境(RH>50%；空氣流量為0；溫度為21-23°C)並經過相同的期間。

角膜螢光染色

實驗動物以腹腔注射的方式，注入一混合物(舒泰(zoletil)(6毫克/公斤)和甲苯噻嗪(Xylazine)(3毫克/公斤))以進行麻醉。以局部螢光染色(Fluor-I-Strip,Ayerst Laboratories,Philadelphia,PA)測定角膜損傷。角膜螢光染色以裂隙燈顯微鏡(slit-lamp biomicroscope)，於鈷藍光(cobalt blue ligh下觀察，並以數位相機纈取影像。數據以平均值±標準差(mean±SD)。根據標準化5分量表(0點，為第零級；1-5點，為第一級；6-15點，為 第二級；16-30點，為第三級；30點為第四級)，將每一眼睛1-mm中心角膜區域的螢光染色點進行分級。再者，若染色結果中，具有一全滿染色區域，則額外加一分，且若具有二個或以上的全滿染色區域則額外加二分(Li J et al.,Mole Visions 2012,18,317)。

淚液分泌量測定

淚液產量以酚紅檢測棉線測定(Zone-Quick；Oasis,Glendora,CA)。本小鼠試驗的有效性係依據前述Dursun et al.(IVOS(2002)43,632-638)所揭示的步驟執行。以鎳子夾取棉線將其置放於小鼠的外眥部，靜置60秒。棉線經淚液沾濕後，濕潤處轉變成紅色，再以公釐表示淚液分泌量。

角膜上皮組織病理學檢查

以前述方法(Pflugfelder等人；2005,Am J Pathol 166,61-71)評估角膜上皮的損傷。簡言之，所述頂端細胞剝落數量的計算方式，係以二位各自獨立操作的檢驗人員，以20目鏡進行鏡檢，計算顯微鏡下一完整視野的細胞量，並觀察三個不同組織切片。

杯狀細胞PAS染色

將實驗動物安樂死後，以手術摘除眼睛，將其以10%甲醛固定，再以石蠟包埋，並進行切片(厚度為：5μm)。所述切片以PAS(Sigma-Aldrich)試劑染色，以檢驗於小鼠上、下結膜中的杯狀細胞，並在顯微鏡下觀察並以數位相機拍攝照片。

統計

結果以平均值±標準誤(mean±standard error,SEM)表示。以單因子變異數分析(1-way ANOVA)進行統計分析。P<0.05為具有顯著性。

實施例1 本發明合成胜肽可預防乾燥壓力誘發的乾眼症

依據「材料與方法」所述的步驟，將小鼠置入CEC中誘導其產生乾眼症(DED)。治療的第一天，將小鼠置入於CEC中，局部施用本發明合成胜肽(即，7-mer；100μM)、胜肽載體(1% CMC)或衍生自7-mer的胜肽(即，7-mer-△D、7-mer-△S、7-mer(V→L)和7-mer(VR→QK)；100μM)至小鼠眼部，施用頻率：每日三次，並持續施用14天。7-mer-△D胜肽(LYRVRS；序列編號：6)和7-mer-△S胜肽(DLYRVR；序列編號：7)是分別於7-mer的N端(D；天門冬胺酸)和C端(S；絲胺酸)刪除一胺基酸殘基，且此二胜肽序列係作為陰性對照胜肽。此外，7-mer胜肽序列中單一和二個胺基酸經置換的胜肽(即，7-mer(V→L)和7-mer(VR→QK))，皆具有治療乾眼症的活性。

以螢光染色評估角膜上皮的完整性，結果示於第1A圖和第1B圖。第1A圖為乾眼症小鼠分別經1% CMC載體、7-mer及其衍生物處理的結果。第1B圖為第1A圖定量分析的結果。

如第1A圖所示，以1% CMC處理的角膜上皮，產生顯著的螢光染色。因此，可以得知經載體處理的角膜上皮，無法預防乾燥壓力誘導的角膜上皮損傷。 相反地，以7-mer處理的小鼠，其螢光染色強度較載體組顯著降低(3.8±0.31 v.s 1.3±0.21)，其顯示以7-mer處理的小鼠其角膜相對較為完整，此結果亦顯示所述7-mer合成胜肽能夠保護和/或預防小鼠發展DED。以7-mer(即，7-mer(V→L)或7-mer(VR→QK))衍生物處理的小鼠亦具有類似的保護效果。此外，以所述7-mer(△D)和7-mer(△S)處理的小鼠，則不具有任何保護或預防效果。

測量實驗動物淚液分泌量，以評估本發明7-mer和其衍生物對於DED的保護效果，結果示於第2圖。

檢測置於CEC內(期間：14天)小鼠的淚液分泌量。結果顯示，相較於健康的小鼠未置於CEC和未接受任何處置的小鼠，以1% CMC載體處理的小鼠經乾燥壓力其淚液分泌量顯著的降低(P<0.05)。相對地，相較於載體控制組，經7-mer、7-mer(V→L)或7-mer(VR→QK)處理的小鼠，其保持較高量的淚液分泌能力(3.7±0.25 v.s.5.1±0.21,5.0±0.16和4.9±0.15；第2圖)。此外，7-mer(△D)或7-mer(△S)胜肽不具有相關功效。

此實施例的結果證實7-mer合成胜肽可預防動物發展乾燥壓力誘導產生的DED。

實施例2 本發明合成胜肽具有治療乾燥壓力誘導乾眼症之功效

依據前述「治療與方法」所示的步驟，將動物置入CEC中14天，以產生乾眼症。以螢光染色確認DED的病徵後(第3A圖；上排；14天)，將動物移出CEC 並將其置於一般環境中(第15天)，接著施用眼藥水，持續治療7天(第3A圖；下排；第21天；和第3B圖)，其中所述眼藥水分別含1% CMC、1%地塞米松(Dex)、7-mer(100μM)或7-mer(△S)。

定量結果示於第3B圖，結果顯示0.1%地塞米松和控制組胜肽7-mer(△S)無法有效治療DED。相對地，相較於控制組的小鼠(1% CMC)，本揭示內容之7-mer合成胜肽能顯著降低所述角膜螢光染色的分數(3.6±0.26 v.s.1.5±0.18；第3B圖)。

經1% CMC載體、0.1% Dex和控制組胜肽7-mer(△S)處理的小鼠，分別將角膜組織切片以H&E染色，鑑定各檢體中剝離的角膜表層頂端細胞(第4A圖)。在正常健康小鼠(未處置)和7-mer處理後的小鼠的角膜組織中，不具有剝離的細胞。相較於控制組(1% CMC)或7-mer(△S)處理組的小鼠，本揭示內容所述7-mer合成胜肽能顯著降低頂端細胞的剝離(14±1.06和13.8±1.03 v.s.2.1±0.37；第4B圖)。

杯狀細胞為結膜上皮層中的細胞，用.以分泌黏蛋白。所述黏蛋白為淚液層組成份之一，用以使角膜處於含水的環境。PAS染色切片的結果顯示，在乾燥條件(14天)下的小鼠，以及施用1% CMC或7-mer(△S)的乾燥壓力小鼠，其杯狀細胞的數量顯著降低(第5A圖；下排)。而施用7-mer合成胜肽的小鼠其杯狀細胞量與正常健康小鼠(未處置)相同(第5A圖；上排)。因此，相較於施用1% CMC的小鼠，本發明之7-mer合成胜肽能顯 著的誘導杯狀細胞生長(7.5±0.96 v.s.2.7±1.28；第5B圖)。

綜合以上實驗結果，證實本揭示內容的短合成胜肽具有一新穎的功能，能治療和/或預防乾眼症。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

<110> 財團法人臺灣基督長老教會馬偕紀念社會事業基金會馬偕紀念醫院

<120> 短合成胜肽及其治療和/或預防乾眼症之用途

<130> P2861-TW

<160> 7

<170> BiSSAP 1.3

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<220>

<221> VARIANT

<222> 5..6

<223> Xaa為任一胺基酸

<400> 1

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 2

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 3

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 4

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 6

<210> 7

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成建構體

<400> 7

Claims (6)

1. 一種由7個連續胺基酸殘基所組成之合成胜肽，其序列為DLYRX₁X₂S(序列編號：1)；其中該X₁為白胺酸(leucine)、纈胺酸(valine)、麩胺酸(glutamine)或甲硫胺酸(methionine)；且該X₂為精胺酸(arginine)、麩胺酸或賴胺酸(lysine)。
2. 如請求項1所述之合成胜肽，其中該序列編號：1之胺基酸序列中的至少一胺基酸殘基為右旋(D-form)胺基酸。
3. 如請求項2所述之合成胜肽，其中該序列編號：1之胺基酸序列中的至少二胺基酸殘基為右旋胺基酸。
4. 一種合成胜肽之用途，其係用以製備治療乾眼症(dry eye disease，DED)之醫藥品，其中該合成胜肽係由7個連續胺基酸殘基所組成，其序列為DLYRX₁X₂S(序列編號：1)；其中該X₁為白胺酸、纈胺酸、麩胺酸或甲硫胺酸；且 該X₂為精胺酸、麩胺酸或賴胺酸。
5. 如請求項4所述之用途，其中該序列編號：1之胺基酸序列中的至少一胺基酸殘基為右旋胺基酸。
6. 如請求項5所述之用途，其中該序列編號：1之胺基酸序列中的至少二胺基酸殘基為右旋胺基酸。