DE3887445T2

DE3887445T2 - Verfahren zur herstellung von glukagonhomologen und deren verwendung.

Info

Publication number: DE3887445T2
Application number: DE88906276T
Authority: DE
Inventors: Robert Merrifield
Original assignee: Rockefeller University
Current assignee: Rockefeller University
Priority date: 1987-05-22
Filing date: 1988-05-19
Publication date: 1994-05-11
Anticipated expiration: 2008-05-20
Also published as: EP0314781A1; JPH02501219A; JP2565762B2; EP0314781B1; US4879273A; DE3887445D1; EP0314781A4; WO1988009341A1

Description

Glukagon ist ein Peptidhormon mit 29 Resten, das die Glukogenolyse und die Glukogenese reguliert. Die Struktur von Glukagon kann wie folgt dargestellt werden:
Die hier verwendeten Abkürzungen entsprechen den von IUPAC- IUB [siehe Eur. J. Biochem. 138, 9 (1984)] empfohlenen.
Wie bekannt, wird erhöhter Blutzucker rasch von Insulin vermindert.
Man glaubt, daß Diabetes beim Menschen nur beobachtet wird, wenn die Insulinspiegel niedrig und die Glukagonwerte erhöht sind. Die Abwesenheit von Insulin läßt die Blutglukose besonders nach einer Mahlzeit ansteigen, und die Anwesenheit von Glukagon verursacht ein weiteres Ansteigen der Blutglukose. Es sind große Mengen an Insulin erforderlich, den Glukosespiegel auf normale Werte zu reduzieren. Der Erhalt stabiler Werte ist schwierig und unterliegt erheblicher Fluktuation. Diese groBe Fluktuation ist zumindest teilweise für die klinischen Schwierigkeiten mit Diabetes verantwortlich.
Glukagon scheint eine Bindung an die Lebermembran zu bewirken, wodurch Adenylatcyclase aktiviert wird, die wiederum eine Reihe von Reaktionen auslöst, einschließlich der Produktion cyclischen Adenosin-monophosphats (cAMP), welches die Phosphorylase aktiviert und die Glykogensynthease inhibiert, was zu einem erhöhten Glukosespiegel im Blut beiträgt.
In jüngster Zeit sind beträchtliche Anstrengungen unternommen worden, Glukagon-Antagonisten zu entwickeln, die eine Bindung an die Lebermembran eingehen, jedoch nicht die Fähigkeit besitzen, das Signal zur Aktivierung von Adenylatcyclase zu übermitteln. Ein solches Produkt ist Nα-Trinitrophenyl{12- homoarginin]-glukagon. Dieses Produkt bindet an den Glukagon- Rezeptor ohne wesentliche Aktivierung von Adenylatcyclase. Leider aktiviert es ein anderes Bindungssystem in der Hepatozyt-Membran, was zur Produktion von Inosit-triphosphat und Kalziumionen führt. Ein geeigneter Antagonist blockiert die Aktion des endogenen Glukagons, indem es die Bindung an die Lebermembran-Rezeptoren verhindert, wodurch cAMP und Glukose in der Zelle produziert werden, was schließlich zu erhöhtem Blutzucker führt. Solche Produkte wären geeignet, den Bedarf an Injektionen oder Infusionen von Insulin bei einem Diabetiker zu reduzieren.
In J. Biol. Chem., Band 250, S 7031-7037, wird berichtet, daß ein charakteristisches Merkmal der Verbindungen (Phe¹)N-, (Ala¹)N- und (des-His¹)N-acetimidoglukagon in hohen Konzentrationen die Inhibierung der Adenylatcyclase-Aktivität ist. Ein idealer Glukagon-Antagonist wäre (1) vollständig inaktiv hinsichtlich einer Stimulation von Adenylatcyclase und der Produktion von cAMP, (2) würde - wie Glukagon selbst - an der Lebermembran binden, (3) würde mit Glukagon beim Binden an die Membran konkurrieren, (4) bei mäßigen Konzentrationen die Aktion von Glykagon zur Aktivierung von Adenylatcyclase vollständig inhibieren und (5) einen zufriedenstellenden Inhibitions-Index aufweisen.
Der Inhibitionsindex ist das Molverhältnis von Antagonist zu Agonist, der das biologische Ansprechen auf die Hälfte des Wertes für den Agonisten in Abwesenheit des Antagonisten reduziert. Dieses wird später noch genauer beschrieben werden.
Es ist jetzt eine Klasse von Glukagon-Antagonisten entdeckt worden, die im wesentlichen die obigen Kriterien erfüllt, und dies mit minimalen Nebenwirkungen. Überrraschender Weise scheinen die Verbindungen dieser Klasse auch die Insulinabgabe von den B-Zellen der Pankreas-Inseln zu stimulieren, wodurch der Bedarf bezüglich der therapeutischen Verabreichung von Insulin weiter verringert wird.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen stellt man sich am besten als Analoge von Glukagon vor, bei denen die erste Histidingruppe entfernt und die neunte, die Asparaginsäure, durch Glutaminsäure ersetzt wurden. Eine mehr bevorzugte Untergattung der Verbindungsklasse besitzt die gleichen Unterschiede, und zusätzlich ist die endständige Carboxylgruppe an dem Threonin in ein Amid umgewandelt. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind:
des-His¹-(Glu&sup9;)-glukagon,
des-His¹-(Glu&sup9;)-glukagonamid,
des-His¹-(Glu&sup9;-Lys17,18Glu²¹)-glukagon
und die entsprechenden Amide. Die letztgenannten 2 Verbindungen besitzten eine etwas geringere Membran-Bindungsaktivität, sind jedoch im wesentlichen bei den Adenylatcyclase-Assays inaktiv.
Die erfindungsgemäßen Produkte wurden mit bekannten Festphasentechniken synthetisiert; siehe z. B. Barany and Merrif ield (1979) in The Peptides, herausg. von Gross and Meienhofer (Academic Press, New York) Bd. 2A, S 1 bis 284. Die Produkte können mit manuellen Verfahren oder z. B. in einer Peptid-Synthese-Vorrichtung wie dem "Applied Biosystems 430 unit" hergestellt werden.
Die Analogen mit einem freien, C-endständigen Carboxyl wurden auf Phenylacetamidomethyl-Harz-Trägern erzeugt, und die C- endständigen Amide wurden auf einem Methylbenzhydryl-amin- Harz erzeugt. Die geschützten Seitenketten waren Arg(Tos), Asp(OcHx), Glu(OcHx), His(Tos), Lys(CIZ), Ser(Bzl), Thr(Bzl) Trp(For) und Tyr(BrZ). Doppelverknüpfungen mit vorgeformten symmetrischen Anhydriden in Dimethylformamid wurden für alle tert.-Butyloxycarbonyl-geschützten Aminosäsuren verwendet, mit Ausnahme von Tosyl-arginin, Glutamin und Asparagin, wo Ester in Dimethylforinamid erforderlich waren [Konig, W. & Geiger, R., Chem. Ber. 103, 788 (1970)]. Die erhaltenen geschützten Peptid-Harze wurden mit der "low/high HF"-Technik (Tam, J.P., Heath, W.F. & Merrifield, R.B. J. Am. Chem. Soc. 105, 6442 (1983), gespalten, die entwickelt worden war, um eine Anzahl möglicher Nebenreaktionen zu vermeiden. Nach dem Verdampfen von HF und Waschen mit Ether wurde das freie Roh-Peptid mit 10% Essigsäure extrahiert und gefriergetrocknet. Die Reinigung der synthetischen Peptide erfolgte durch präparative Niederdruck-Umkehrphasen-Flüssigchromatographie an C&sub1;&sub8;- Siliziumdioxid, wie dies bereits beschrieben wurde [Andreu, D. & Merrifield, R.B. in Peptides: Structure and Function, Herausg. Deber, C.M., Hruby, V.J. & Kopple, K.D. (Pierce Chem. Co, Rockford, IL), S. 595-598]. Die Gesamtausbeute betrug zwischen 35 und 40%. Die Homogenität wurde durch analytische HPLC nachgewiesen, und die Identität wurde durch Aminosäure- Analyse bestätigt.
Die Aminosäure-Analyse aller hergestellten Verbindungen stinmte mit der Theorie innerhalb ± 5% überein.
Die tert.-Butyloxycarbonyl-(Boc)-geschützten Aminosäuren stammten von Peninsula Laboratories, (San Carlos, A.), die p- Methylbenzhydrylamin-Harze (0,45 mMol/g) stammten von United States Biochemical (Cleveland, Ohio) und Boc-Thr-(Bzl)-4- oxymethyl-phenylacetamidomethyl-copoly (styrol-1% divinylbenzol) wurde hergestellt, wie dies von Mitchell et al, J. Org. Chem. 43, 2845 (1978) beschrieben worden ist. ¹²&sup5;I-markiertes Glukagon von New England Nuclear wurde ohne weitere Reinigung für Zeiträume bis zu 1 Monat nach dessen Herstellung verwendet. Kreatin-phosphat, Kreatin-kinase, Rinderserum-albumin, Dithiothreit, GTP und ATP stammten von Sigma. Ein cAMP-Assay-Kit mit [8-³H]cAMP ist von Amersham erhältlich. Nuflow -Membran-Filter (0,45 um) wurde von Oxoid (Basingstoke, England) bezogen.
Es wurden verschiedene Tests durchgeführt, um die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Produkte zu bestimmen. Diese umfaßten den Membran-Bindungs-Assay und die Adenylcyclase-Assays.

Membran-Bindungs-Assay

Es wurden Leberplasma-Membrane von männlichen Sprague-Dawley- Ratten (Charles River Breeding Laboratories) nach dem Neville- Verfahren präpariert, wie es von Pohl beschrieben wurde [Pohl, S.L. (1976) in Methods in Receptor Research, Hrsg. Blecher, M. (Marcel Dekker, New York) S. 160-164]. Der Rezeptor- Bindungs-Assay erfolgte nach Wright und Rodbell [Wright, D.E. & Rodbell, M. (1979) J. Biol. Chem. 254, 268-269], worin die Konkurrenz an Glukagon-Rezeptoren zwischen ¹²&sup5;I-markiertem natürlichem Gukagon (1,6 nM) und dem unmarkierten synthetischen Analogen gemessen wurde. Nach einer Korrektur bezüglich des Blindwerts wurde der Prozentsatz von Verdrängung der Markierung mit einem gereinigten Glukagon-Standard verglichen, und die relative Bindungsaffinität wurde errechnet.

Adenylatcyclase-Assay

Der Assay an Lebermembranen wurde nach Salomon et al durchgeführt [Salomon, Y., Londos, C. & Rodbell, M., Anal. Biochem. 58, 541, 548 (1974)]. Das freigesetzte cAMP wurde mit [8- ³H]cAMP gemischt, gemessen mit cAMP-Bindungsprotein von hoher Aff inität.
Der Zweck des Membran-Bindungs-Assays ist die Messung der Fähigkeit von Analogen von Glukagon, an Leberplasmaprotein zu binden, im Vergleich mit der von Glukagon.
Wenn Glukagon-Analoge getestet werden, wird natürliches Glukagon gleichzeitig als Standardsubstanz untersucht, um die Möglichkeit von Ungenauigkeiten aufgrund der Heterogenität der Membranpräparate auszuschalten. Die relative Bindungs- Affinität eines bestimmten Analogen wird angegeben als:
(halbe maximale Verdrängungskonzentration von Glukagon)/(halbe maximale Verdrängungskonzentration des Analogen) x 100
Der Zweck des Adenylatcyclase-Assays ist die Messung der Fähigkeit der Testverbindung, die Aktivität von Adenylatcyclase zu stimulieren. Die Assays werden zur Messung der relativen Wirksamkeit, der maximalen Aktivität und des Inhibitions- Index verwendet.
Der Inhibitions-Index, wie oben definiert, wurde mit Adenylatcyclase-Assays nach zwei verschiedenen Protokollen bestimmt.
1. Es wurde eine Glukagon-Standardkurve für cAMP- gegenüber der Glukose-Konzentration erstellt. Dann wurde eine andere Glukagonassay-Kurve in Anwesenheit einer konstanten Menge von Antagonist gemessen. Sodann wurde die Konzentration an Glukagon, dessen Aktivität durch diese Konzentration des Inhibitors auf 50% reduziert worden war, bestimmt.
2. Es wurde ein Reihe von Röhrchen aufgestellt, die eine solche Menge an Glukagon enthielten, daß 90% des maximalen Ansprechwertes erzeugt wurde. Dann wurden ansteigende Mengen des Antagonisten zugegeben; es wurde die Konzentration bestimmt, die das Ansprechen auf 45% des maximalen Wertes reduzierte.
Da die normalen Zirkulationswerte von Glukagon etwa 10&supmin;¹&sup0; Mol betragen, müßte ein Produkt mit einem Inhibitionsindex von 12 in vivo nur in einer Konzentration von 0,4 ug/ml Blut vorhanden sein, um die Aktion von Glukagon vollständig zu verhindern. Die erfindungsgemäßen Verbindungen haben einen Inhibitionsindex von bis zu etwa 35, vorzugsweise jedoch bis zu 15, verbunden mit einer Membran-Bindungsaktivität von wenigstens 10%. Ein Inhibitionsindex von 12 oder weniger wird mehr bevorzugt.
Die folgende Tabelle zeigt die Meßergebnisse mit Glukagon und drei erfindungsgemäßen Verbindungen. Konkurrierende Inhibition von Glukagon durch Synthese-Analoge Art der Ersetzung Membran-Bindung Adenylcyclase-Assays Wegfall Analoge Zugabe Amid relativ % relative Wirksamkeit Inhib. Index des His¹ GLUCAGON
Es fällt auf, daß die Verbindung der zweiten Reihe, die ein Amid ist, eine viel höhere Bindungsaktivität aufweist als die entsprechende Carboxylverbindung.
Die erfindungsgemäßen Produkte werden im allgemeinen in der gleichen Weise wie Insulin verabreicht, d. h. parenteral oder durch Infusion. Da deren chemische Struktur und Aktivität dem Insulin sehr ähnlich ist, werden sie im allgemeinen mit der gleichen Art pharmazeutisch geeigneter Träger wie bei Insulin verabreicht. Sie können neben dem Insulin in den gleichen Dosierungseinheiten verabreicht werden. Sie können auch gleichzeitig mit Insulin verabreicht werden, jedoch nicht in der gleichen Zusammensetzung.
Da die erfindungsgemäßen Produkte amphoter sind, können sie als freie Basen, als Säureadditionssalze oder als Metallsalze verwendet werden. Die Salze müssen natürlich pharmazeutisch geeignet sein, was Metallsalze, insbesondere Alkali- und Erdalkalimetallsalze, zweckmäßige Kalium- oder Natriumsalze einschließt. Es ist eine große Vielzahl pharmazeutisch verwendbarer Säureadditionsalze verfügbar. Diese umfassen solche, die sowohl aus organischen als auch anorganischen Säuren, vorzugsweise Mineralsäuren, hergestellt wurden. Typische Säuren, die beispielhaft erwähnt werden sollen, umfassen Zitronensäure, Bernsteinsäure, Milchsäure, Chlorwasserstoff- und Bromwasserstoffsäure. Solche Produkte können mit dem Fachmann bekannten Verfahren leicht hergestellt werden.
Die erf indungsgemäßen Produkte werden normalerweise als parenterale Zusammensetzungen zur Injektion oder Infusion zur Verfügung gestellt. Sie können z. B. in einem inerten Öl suspendiert sein, zweckmäßiger Weise einem Pflanzenöl wie Sesamöl, Erdnußöl oder Olivenöl. Alternativ können sie in einer wässrigen isotonischen Pufferlösung mit einem pH-Wert von etwa 5,6 bis 7,4 suspendiert sein. Geeignete Puffer umfassen Natriumcitrat-Zitronensäure und Natriumphosphat- Phosphorsäure.
Die gewünschte Isotonie kann durch Verwendung von Natriumchlorid oder anderen, pharmazeutisch geeigneten Mitteln wie Dextrose, Borsäure, Natriumtartrat, Propylenglykol oder anderen anorganischen oder organischen gelösten Stoffen erreicht werden. Natriumchlorid wird für Puffer bevorzugt, die Natriumionen enthalten.
Gegebenenfalls können die Lösungen mit einem Verdickungsmittel wie Methylzellulose eingedickt werden. Sie können in emulgierter Form, entweder als Wasser-in-Öl- oder Öl-in- Wasser-Emulsion hergestellt werden. Jedes pharmazeutisch geeignete Emulgierungsmittel kann aus der vorhandenen großen Vielzahl verwendet werden, einschließlich z. B. Akazienpulver, oder ein Alkarylpolyetheralkoholsulfat oder Sulfonat wie Triton .
Die erfindungsgemäßen, pharmazeutisch geeigneten Zusammensetzungen werden durch Mischen der Bestandteile nach allgemein bekannten Verfahren hergestellt. Zum Beispiel können die ausgewählten Bestandteile einfach in einem Mixer oder einer anderen Standardvorrichtung zur Herstellung einer konzentrierten Mischung vermischt werden, wobei die endgültige Konzentration und Viskosität durch Zugabe von Wasser oder Verdickungsmittel und gegebenenfalls Puffer zur Einstellung des pH-Wertes oder von einem zusätzlich gelösten Stoff zur Regelung der Tonie eingestellt werden.
Für die Verwendung durch den Arzt werden die Zusammensetzungen in Dosierungseinheiten zur Verfügung gestellt, die eine Menge an Glukogan-Analogen enthalten, die in einer oder mehrfacher Dosierung zur Steuerung der Glukogenese und des Blutzuckers auf den gewählten Wert wirksam sind, normalerweise in Anwesenheit von Insulin. Dem Fachmann ist bekannt, daß eine wirksame Menge des therapeutischen Mittels mit vielen Faktoren variieren kann wie Alter und Gewicht des Patienten, der Menge an Insulin, die gleichzeitig verabreicht wird, dem angestrebten Blutzuckerwert, dem Inhibitionsindex des gewählten Analogen sowie anderen Faktoren. Typische Dosierungseinheiten enthalten von 0,2 bis 0,8 ug/ml, obwohl große Abweichungen von diesem Bereich möglich sind, womit auch geeignete Ergebnisse erzielt werden können.

Claims

1. Glukagon-Analoge, gekennzeichnet durch Entfernen des Amino-terminalen Histidins und Ersetzen der Einheit Nr. 9, der Aspariginsäure, durch eine Glutaminsäure-Einheit, und zwar

des-His¹-[Glu9]-glukagon,

des-His¹-[Glu9]-glukagonamid,

des-His¹-[Glu&sup9;-Lys17,18Glu²¹]-glukagon und

des-His¹-[Glu&sup9;-Lys17,18Glu²¹]-glukagonamid

sowie die pharmazeutisch geeigneten Metall- oder Säureadditionssalze der genannten Verbindungen.

2. Parenterale Zusammensetzung, die einen pharmazeutisch geeigneten Träger und eine Verbindung nach Anspruch 1 umfaßt.

3. Parenterale Zusammensetzung nach Anspruch 2 in Form von Dosierungseinheiten, die von etwa 0,2 bis 0,8 ug/ml der Verbindung nach Anspruch 1 enthalten.