ES2246506T3 - Procedimiento de purificacion de una proteina que fija la eritropoyetina. - Google Patents
Procedimiento de purificacion de una proteina que fija la eritropoyetina.Info
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Abstract
EL CAMPO EXTRACELULAR DEL RECEPTOR DE LA ERITROPOYETINA HUMANA (PROTEINA DE FIJACION DE LA EPO, EBP) HA SIDO EXPRESADO Y SUPERPRODUCIDO EN LA E. COLI. EL CONTROL DE LOS NIVELES DE OXIGENO Y DEL PH DURANTE LA FERMENTACION A GRAN DENSIDAD PERMITE LA PRODUCCION DE LA UNICA VARIANTE DE LA PROTEINA CON EL TERMINO AMINO NATIVO. SE EXPONEN PROCEDIMIENTOS QUE PERMITEN LA EFICIENTE RECUPERACION DE EBP PURIFICADO, QUE FIJA CUANTITATIVAMENTE LA EPO. LA PROTEINA ACTIVA PURIFICADA COMPITE CON EL RECEPTOR DE LA EPO ASOCIADO A LA MEMBRANA PARA FIJACION DE LA EPO [I 125 ] Y NEUTRALIZA LA ESTIMULACION DEPENDIENTE DE LA EPO EN UN ENSAYO DE PROLIFERACION BASADO EN LA CELULA. ADEMAS, SE HA DETERMINADO LA CONSTANTE DE FIJACION EN EQUILIBRIO DEL RADIOLIGANDO PARA ESTA INTERACCION, POR INMOVILIZACION DE LA EBP SOBRE GEL DE AGAROSA A TRAVES DE UNA CISTEINA LIBRE. LA EBP DE LA PRESENTE INVENCION TIENE MUCHOS USOS, INCLUIDA LA DETERMINACION ESTRUCTURAL DE LA PROTEINA POR NMR (RESONANCIA MAGNETICA) O CRISTALOGRAFIA,EN EL DISEÑO Y DESCUBRIMIENTO DEL FARMACO, Y COMO TERAPIA. SE HAN PRODUCIDO TAMBIEN UNA PROTEINA DE FUSION DE LA PROTEINA EBP Y UNA CADENA PESADA DE INMUNOGLOBULINA. ESTA PROTEINA, DENOMINADA EBP IG, ES UNA PLANTILLA DE DIMERIZACION PREFORMADA Y ES IGUALMENTE UTIL EN LOS PROCEDIMIENTOS DE DISEÑO Y DESCUBRIMIENTO DE FARMACOS.
Description
Procedimiento de purificación de una proteína que
fija la eritropoyetina.
El procedimiento hematológico que conduce a la
producción y maduración de los glóbulos rojos está bajo el control
de la eritropoyetina (EPO) (revisado en Krantz, S.B. (1991)
Erythropoietin. Blood 77, 419-434), una hormona
glicoproteica sintetizada principalmente en el riñón. La EPO humana
asequible comercialmente es producida por medio de mecanismos de ADN
recombinante y es conocida como EPO humana recombinante (rhEPO). La
rhEPO tiene una masa molecular de aproximadamente 36.000 daltons,
como se determina mediante SDS-PAGE. La masa
molecular del esqueleto de la proteína es de 18.398 daltons, lo que
indica que la molécula completa está densamente glicosilada. Los
restos carbohidratados son importantes para la actividad biológica
in vivo.
En contraste con muchos otros factores de
crecimiento, la especificidad de la EPO por las células eritroides
ha conducido a su desarrollo como proteína terapéutica segura y
eficaz. Los beneficios médicos de la EPO han sido bien establecidos
en el tratamiento de la anemia asociada con la insuficiencia renal
crónica, la quimioterapia del cáncer, y la predonación autóloga de
sangre. Debido a la naturaleza crónica de la terapia con EPO, sería
deseable tener una molécula "de segunda generación"
administrada oralmente.
Un conocimiento de la base estructural de la
interacción de la EPO con su receptor ayudará al diseño de nuevos
fármacos, tales como un fármaco para la anemia oral. Los métodos
tradicionales de descubrimiento de fármacos están siendo suplidos
por enfoques de diseño racionales que intentan hacer uso de la
información sobre la base estructural de las interacciones
receptor-ligando para desarrollar modelos
moleculares. Estos modelos, a su vez, se utilizan para diseñar
moléculas con potencial terapéutico. Los dos enfoques son
complementarios y cuentan con la capacidad de obtener información
sobre la estructura tridimensional de la diana terapéutica. La
capacidad para producir EPO y su receptor y para evaluar el impacto
de los cambios estructurales sobre la función de la proteína
proporciona un medio para someter a ensayo modelos moleculares
hipotéticos y contribuye al establecimiento de una base de datos de
la relación estructura-actividad para el diseño de
fármacos.
El efecto biológico de la EPO parece estar
mediado, en parte, a través de la interacción con un receptor unido
a la membrana, que ha sido clonado previamente (Jones, S.S.,
D'Andrea, A.D., Haines, L.L., y Wong, G.G. (1990), Human
erythropoietin receptor: Cloning, expression, and biological
characterization, Blood 76, 31-35; Noguchi, C.T.,
Kyung, S.B., Chin, K., Wada, Y., Schecter, A.N. y Hankins, W.D.
(1991) Cloning of the human erythropoietin receptor gene, Blood 78,
2548-2556; Maouche, L., Tournamile C., Hattab, C.,
Boffa, G., Carton J.-P. Y Chretein, S. (1991) Cloning of the gene
encoding the human erythropoietin receptor. Blood 78,
2557-2563). En la actualidad existe un considerable
interés en la naturaleza física de la asociación de EPO con el
receptor de EPO (EPOR) y una técnica emergente para el análisis de
este tipo de interacción es la generación de receptores solubles,
también denominados proteínas de unión a hormonas (Langer, J.A.
(1990) Soluble ligand-binding fragments of
polypeptide receptors in basic and applied research, Pharmaceutical
Technology 14, 46-66). El procedimiento implica el
diseño genético de vectores de expresión adecuados que codifican el
dominio extracelular del receptor y la posterior producción y
purificación de la proteína. Una vez obtenida una forma activa,
estos fragmentos receptores solubles son útiles en numerosos
formatos de análisis y tienen una utilidad mejorada en estudios
biofísicos tales como RMN o cristalografía de rayos X, ya que pueden
ser empleados en condiciones libres de los detergentes requeridos
para solubilizar los receptores unidos a la membrana. Algunos
fragmentos de receptores de este tipo, incluyendo la
IL-1 y la IL-4, funcionan
neutralizando los efectos biológicos de la hormona y parecen tener
potencial terapéutico (Maliszewski, C.R. y Fanslow, W.C. (1990)
Soluble receptors for IL-1 and
IL-4: Biological activity and therapeutic potential,
Trends in Biotech 8,
324-329).
324-329).
Los informes previos esbozan el desarrollo de
sistemas para la producción y purificación de proteínas de unión a
EPO humana y murina (EBP) utilizando la expresión de las proteínas
en células eucarióticas y bacterias pero con modestos rendimientos
(Harris, K.W., Mitchell, R.A., y Winkleman, J.C. (1992) Ligand
Binding Properties of the Human Erythropoietin Receptor
Extracellular Domain Expressed in E. coli. J. Biol. Chem.
267, 15205-15209; Yet, M.- G. y and Jones, S.S.
(1993) The Extracytoplasmic Domain of the Erythropoietin Receptor
Forms a Monomeric Complex with Erythropoietin. Blood 82,
1713-1719; Nagao, M., Masuda, S., Abe, S., Ueda, M.
and Sasaki, R. (1992) Production and ligand-binding
characteristics of a soluble form of the murine erythropoietin
receptor, Biochem. Biophys. Res. Comm. 188,
888-897).
Se ha sugerido que el mecanismo de activación del
receptor de EPO reside en la dimerización de dos moléculas
receptoras de EPO que da como resultado las siguientes etapas de
transducción de la señal [Watowich, S.S.,
Yoshimura, A., Longmore, G.D., Hilton, D.J., Yoshimura, y Lodish, H.F., Homodimerización and constitutive activation of the erythropoietin receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences 89, 2140-2144 (1992)]. Si bien el receptor soluble de EPO [Johnson, D.L., Middleton, S.A., McMahon, F., Barbone, F., Kroon, D., Tsao, E., Lee, W.H., Mulcahy, L.S. y Jolliffe, L.K., Refolding, Purification and Characterization of Human Erythropoietin Binding Protein Produced in Escherichia coli, Protein Expression and Purification 7 104-113 (1996)] tiene ventajas relacionadas con la determinación de la estructura y la facilidad de producción, probablemente no representa un molde preformado para la dimerización del receptor. En la investigación de los péptidos o las moléculas pequeñas que se podrían unir al receptor de EPO y activarlo semejante molde de dimerización preformado es una herramienta altamente valiosa para el descubrimiento, la detección, y la descripción de moléculas con semejante actividad. El uso de moléculas de fusión receptor-Ig proporciona semejantes moldes y dependiendo del formato del análisis proporcionan información sobre la capacidad de una molécula o compuesto dado para detectar complejos de dimerización tanto no productivos como productivos.
Yoshimura, A., Longmore, G.D., Hilton, D.J., Yoshimura, y Lodish, H.F., Homodimerización and constitutive activation of the erythropoietin receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences 89, 2140-2144 (1992)]. Si bien el receptor soluble de EPO [Johnson, D.L., Middleton, S.A., McMahon, F., Barbone, F., Kroon, D., Tsao, E., Lee, W.H., Mulcahy, L.S. y Jolliffe, L.K., Refolding, Purification and Characterization of Human Erythropoietin Binding Protein Produced in Escherichia coli, Protein Expression and Purification 7 104-113 (1996)] tiene ventajas relacionadas con la determinación de la estructura y la facilidad de producción, probablemente no representa un molde preformado para la dimerización del receptor. En la investigación de los péptidos o las moléculas pequeñas que se podrían unir al receptor de EPO y activarlo semejante molde de dimerización preformado es una herramienta altamente valiosa para el descubrimiento, la detección, y la descripción de moléculas con semejante actividad. El uso de moléculas de fusión receptor-Ig proporciona semejantes moldes y dependiendo del formato del análisis proporcionan información sobre la capacidad de una molécula o compuesto dado para detectar complejos de dimerización tanto no productivos como productivos.
Se describe aquí un nuevo procedimiento para la
producción de una proteína de unión a EPO humana altamente pura
(EBP) a partir de fermentaciones de células huésped recombinantes.
El procedimiento de la presente invención descrito produce una EBP
no glicosilada altamente pura que conserva la propiedad biológica
del receptor de EPO de unirse a la EPO (ligando). La EBP altamente
pura también es útil en una amplia variedad de mecanismos de
descubrimiento de fármacos, incluyendo pero no limitados a, el
diseño, el descubrimiento y la producción de miméticos de ligandos,
el diseño, el descubrimiento y la producción de inhibidores de la
unión de ligandos, el diseño, el descubrimiento y la producción de
agonistas, antagonistas y otros moduladores de la unión a ligandos,
y la producción de estructuras cristalinas que permiten la
caracterización precisa de uno o varios sitios de interacción
EBP-ligando. La caracterización precisa de uno o
varios sitios de interacción EBP-ligando también es
útil para el diseño, el descubrimiento y la producción de miméticos
de ligandos, el diseño, el descubrimiento y la producción de
inhibidores de la unión a ligandos, y el diseño, el descubrimiento
y la producción de agonistas, antagonistas y otros moduladores de
la unión al ligando.
Figura 1. Se muestra el vector plasmídico
utilizado para la expresión de EBP en E. coli.
Figura 2 Paneles A y B. Se muestran las
SDS-PAGE al 10-20% reductora (Panel
A) y no reductora (Panel B) de muestras de la expresión de EBP y
estudios de purificación.
Figura 3, Paneles A, B, C, y D. Se muestra la
demostración de la detección de la forma "activa" de EBP.
Figura 4, Paneles A, B, C, y D. Se muestra la
demostración de la pureza de EBP y la actividad tras la
purificación mediante HIC y cromatografía de exclusión por tamaños
preparativa.
Figura 5, Paneles A y B. Se muestra la
determinación de la estequiometría del complejo
EPO-EBP mediante HPLC en fase reversa
C-4.
Figura 6, Paneles A y B. Se muestra la unión de
EPO en equilibrio a EBP inmovilizada y el análisis espectral de
masas.
Figura 7, Paneles A y B. Se muestra la
competencia de EBP por la unión a EPO[I^{125}] para
receptores de EPO nativos asociados con células.
Figura 8, Paneles A y B. Se muestra el
entrecruzamiento de las proteínas EBP que estaban dimerizadas por
diferentes ligandos peptídicos mediante SDS-PAGE en
condiciones no reductoras (Panel A) y en condiciones reductoras
(Panel B).
La presente invención está dirigida a un
procedimiento para la purificación de la proteína de unión a
eritropoyetina (EBP) a partir de fermentaciones microbianas. La EBP
purificada mediante el procedimiento de la presente invención
también es útil como agente terapéutico puesto que se une a la
eritropoyetina, dejándola no disponible para la interacción con el
receptor asociado a las células.
El término EBP según se utiliza aquí hace
referencia a una forma del receptor de EPO que carece de una
porción sustancial del dominio de anclaje a la membrana y del
dominio citoplásmico, conserva todavía el dominio de unión al
ligando y la capacidad de unirse a la eritropoyetina. El término
EBP-Ig según se utiliza aquí hace referencia a una
proteína de fusión producida recombinantemente que comprende una
cadena pesada de inmunoglobulina que incluye la región bisagra, y
EBP, una forma del receptor de EPO que carece de una porción
sustancial del dominio de anclaje a la membrana y del dominio
citoplásmico, todavía conserva el dominio de unión al ligando y la
capacidad para unirse a la eritropoyetina. El término mimético de
EPO según se utiliza aquí hace referencia a un compuesto que se une
al receptor de EPO y conduce a etapas posteriores de la transducción
de la señal mediada por el receptor de
EPO.
EPO.
El procedimiento de la presente invención es
adecuado para su uso con fermentaciones microbianas en general. Es
fácilmente evidente para los expertos en la técnica que son
adecuadas una amplia variedad de células microbianas para su uso en
el procedimiento de la presente invención, incluyendo pero no
limitadas a, células fúngicas incluyendo levaduras, y células
bacterianas, incluyendo E. coli. Una fermentación microbiana
preferida es una fermentación bacteriana de células que contienen el
plásmido que codifica la EBP o una proteína de fusión a EBP que va
a ser aislada y purificada. Una fermentación bacteriana preferida
es una fermentación de E. coli que expresa la EBP o la
proteína de fusión a EBP que va a ser aislada y purificada. Es
fácilmente evidente para los expertos en la técnica que las
fermentaciones bacterianas distintas de las fermentaciones en
E.coli son adecuadas para su uso en la presente invención.
La fermentación microbiana puede ser desarrollada en cualquier
medio líquido que sea adecuado para el crecimiento de la bacteria
que esté siendo utilizada.
La EBP que va a ser aislada y purificada mediante
el procedimiento de la presente invención puede ser expresada a
partir de cualquier secuencia de ADN que codifique EBP adecuada. La
secuencia de ADN que codifica la EBP puede derivar de ADN que
codifica un receptor de EPO que a su vez deriva de una línea celular
o tipo celular que expresa el receptor de EPO.
La secuencia de ADN que codifica la EBP puede
estar contenida en una variedad de plásmidos que pueden tener
elevado número de copias por célula o de bajo número de copias por
célula. Los plásmidos también pueden ser virtualmente de cualquier
tamaño. Es fácilmente evidente para los expertos en la técnica que
se puede utilizar en el procedimiento de la presente invención
virtualmente cualquier plásmido que contenga la secuencia de ADN que
codifica la EBP que conduzca a la expresión de la EBP en las
células huésped recombinantes.
El ADN que codifica la EBP clonada obtenida por
medio de los métodos descritos aquí puede ser expresado
recombinantemente mediante clonación molecular en un vector de
expresión que contenga un promotor adecuado y otros elementos
reguladores de la transcripción apropiados, y transferido a células
huésped procarióticas o eucarióticas para producir la proteína
recombinante. Los mecanismos para tales manipulaciones están
completamente descritos en Maniatis T., Fritsch, E.F., Sambrook, J.;
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989), y
son bien conocidos en la técnica.
Los vectores de expresión se definen aquí como
las secuencias de ADN que son necesarias para la transcripción de
las copias clonadas de genes y la traducción de sus ARNm en un
huésped apropiado. Tales vectores pueden ser utilizados para
expresar genes eucarióticos en una variedad de huéspedes tales como
bacterias incluyendo E. coli, algas verdeazuladas, células
vegetales, células de insectos, células fúngicas, incluyendo
células de levadura, y células animales.
Los vectores diseñados específicamente permiten
el transporte de ADN entre huéspedes tales como
bacteria-levadura o
bacteria-células de animales o
bacteria-células fúngicas o
bacteria-células de invertebrados. Un vector de
expresión construido apropiadamente debe contener: un origen de
replicación para la replicación autónoma en células huésped,
marcadores seleccionables, un número limitado de sitios para enzimas
de restricción útiles, un potencial para un elevado número de
copias, y promotores activos. Un promotor se define como una
secuencia de ADN que dirige la ARN polimerasa a unirse con el ADN e
iniciar la síntesis de ARN. Un promotor fuerte es aquél que hace que
los ARNm se inicien con una elevada frecuencia. Los vectores de
expresión pueden incluir, pero no están limitados a, vectores de
clonación, vectores de clonación modificados, plásmidos diseñados
específicamente o virus.
Se puede utilizar una variedad de vectores de
expresión bacterianos para expresar la EBP recombinante en células
bacterianas. Entre los vectores de expresión bacteriana asequibles
comercialmente que pueden ser adecuados para la expresión de EBP
recombinante se incluyen, pero no están limitados a, vectores pET
(Novagen), vectores pRSET, pTrcHis, y pTrxFus (Invitrogen),
vectores pQE (Qiagen), vectores pFLAG (Eastman Kodak, International
Biotechnologies Inc.), pPROEX^{B1}-1 (Life
Technologies, Inc.), vectores pKK (Clonetech), vectores
pP_{L}-Lambda (Pharmacia), y pCa1
(Stratagene).
Se puede utilizar una variedad de vectores de
expresión de células fúngicas para expresar la EBP recombinante en
células fúngicas tales como levadura. Entre los vectores de
expresión de células fúngicas asequibles comercialmente que pueden
ser adecuados para la expresión de EBP recombinante se incluyen,
pero no están limitados a, pYES2 (Invitrogen), vectores de expresión
de Pichia (Invitrogen), y pYEUra3 (Clonetech).
Se puede utilizar una variedad de vectores de
expresión de células de insectos para expresar la EBP recombinante
en células de insectos. Entre los vectores de expresión de células
de insectos asequibles comercialmente que pueden ser adecuados para
la expresión recombinante de EBP se incluyen, pero no están
limitados a, los vectores pBlueBacII (Invitrogen), pFastBac1 (Life
Technologies, Inc.), pBacPAK (Clonetech), y vectores pAc
(PHARMINGEN).
Se puede utilizar una variedad de vectores de
expresión de mamíferos para expresar la EBP recombinante en células
de mamíferos. Entre los vectores de expresión de mamíferos
asequibles comercialmente que pueden ser adecuados para la expresión
de EBP recombinante, se incluyen, pero no están limitados a, pMAMneo
(Clontech), pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pXT1
(Stratagene), pSG5 (Stratagene),
EBO-pSV2-neo(ATCC 37593),
pBPV-1(8-2) (ATCC 37110),
pdBPV-MMTneo (342-12) (ATCC 37224),
pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198),
pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), 1ZD35
(ATCC 37565), y pEe12 (CellTech). Entre las líneas celulares
derivadas de especies de mamíferos que pueden ser adecuadas para la
expresión y que son asequibles comercialmente, se incluyen, pero no
están limitadas a, CV-1 (ATCC CCL 70),
COS-1 (ATCC 1650), COS-7 (ATCC CRL
1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92),
NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), HeLa (ATCC CCL 2), C127I (ATCC CRL 1616),
BS-C-1 (ATCC CCL 26),
MRC-5 (ATCC CCL 171), células L,
HEK-293 (ATCC CRL1573), y NSO (ECACC85110503).
\newpage
El ADN que codifica EBP puede ser clonado en un
vector de expresión en una célula huésped recombinante. Las células
recombinantes pueden ser procarióticas o eucarióticas, incluyendo,
pero no limitadas a, bacterias tales como E. coli, células
fúngicas tales como levadura, células de insectos, incluyendo pero
no limitadas a, líneas celulares derivadas de drosófila y gusano de
seda, y células y líneas celulares de mamíferos.
El vector de expresión puede ser introducido en
las células huésped por medio de cualquiera de las numerosas
técnicas incluyendo pero no limitadas a, transformación,
transfección, fusión de protoplastos, lipofección, y
electroporación. Las células que contienen el vector de expresión
son propagadas clónicamente y analizadas individualmente para
determinar si producen la proteína EBP. La identificación de los
clones de las células huésped que expresan EBP se puede realizar
mediante numerosos métodos, incluyendo pero no limitados a,
reactividad inmunológica con anti-EBP, y la
presencia de actividad EBP asociada con la célula huésped. Del mismo
modo, la identificación los clones de la célula huésped que expresan
la proteína de fusión de EBP se puede realizar mediante numerosos
métodos, incluyendo pero no limitados a, reactividad inmunológica
con anticuerpos anti-EBP, y la presencia de
actividad EBP asociada a la célula huésped, así como reactividad
inmunológica con anticuerpos específicos para la porción distinta de
EBP de la proteína de fusión, y las otras actividades de la porción
distinta de EBP de la proteína de fusión asociadas con la célula
huésped.
Debido a que el código genético es degenerado, se
puede utilizar más de un codón para codificar un aminoácido
concreto, y por lo tanto, la secuencia de aminoácidos puede ser
codificada por cualquiera de los grupos de oligonucleótidos de ADN
similares. Sólo un miembro del grupo será idéntico a la secuencia de
EBP pero será capaz de hibridar con el ADN de EBP incluso en
presencia de oligonucleótidos de ADN con desemparejamientos en
condiciones apropiadas. En condiciones alternativas, los
oligonucleótidos de ADN desemparejados todavía pueden hibridar con
el ADN de EBP para permitir la identificación y el aislamiento del
ADN que codifica la EBP.
Se sabe que existe una cantidad sustancial de
redundancia en los diversos codones que codifican aminoácidos
específicos. Por lo tanto, el procedimiento de esta invención
también está dirigido a aquellas secuencias de ADN que codifican la
EBP que contienen codones alternativos que codifican la traducción
eventual del aminoácido idéntico. Para los fines de esta memoria,
una secuencia que porte uno o más codones remplazados será definida
como variación degenerada. También están incluidas las mutaciones en
la secuencia de ADN o en la proteína traducida que no alteren
sustancialmente las propiedades físicas últimas de la proteína
expresada. Por ejemplo, la sustitución de valina por leucina,
arginina por lisina, o asparragina por glutamina, no ocasionan un
cambio en la funcionalidad del polipéptido. Además, la alteración de
los sitios de glicosilación de origen natural por mutagénesis
dirigida al sitio utilizando mecanismos bien conocidos en la técnica
puede dar como resultado la producción de una proteína que no sea
glicosilada más en un sitio concreto. Es fácilmente evidente para
los expertos en la técnica que una EBP modificada de semejante
manera es una variante de EBP que puede ser purificada mediante el
procedimiento de esta invención.
Se sabe que las secuencias de ADN que codifican
un péptido pueden ser alteradas de manera que codifiquen un péptido
que tenga propiedades que sean diferentes de las del péptido de
origen natural. Entre los métodos para alterar las secuencias de ADN
se incluye, pero no están limitados a, la mutagénesis dirigida al
sitio. Entre los ejemplos de las propiedades alteradas se incluyen
pero no están limitados a cambios en la afinidad de una enzima por
un sustrato o un receptor por un ligando.
Según se utiliza aquí, un "derivado
funcional" de EBP es una proteína que posee una actividad
biológica (ya sea funcional o estructural) que sea sustancialmente
similar a la actividad biológica de EBP de unión a la EPO. Se
pretende que el término "derivados funcionales" incluya los
"fragmentos", "variantes", "variantes degeneradas",
"análogos" y "homólogos" o "derivados químicos" de
EBP. Se pretende que el término "fragmento" haga referencia a
cualquier subgrupo polipeptídico de EBP. Se pretende que el término
"variante" haga referencia a una molécula sustancialmente
similar en estructura y función a cualquier molécula de EBP completa
o a un fragmento de la misma. Una molécula es "sustancialmente
similar" a EBP si ambas moléculas tienen estructuras
sustancialmente similares o si ambas moléculas poseen una actividad
biológica similar. Por lo tanto, si las dos moléculas poseen una
actividad sustancialmente similar, se considera que son variantes
incluso si la estructura de una de las moléculas no se encuentra en
la otra o incluso si las dos secuencias de aminoácidos no son
idénticas. El término "análogo" hace referencia a una molécula
sustancialmente similar en función a la molécula de EBP completa o a
un fragmento de la misma.
La EBP purificada mediante el procedimiento de la
presente invención es útil en una amplia variedad de mecanismos para
el descubrimiento de fármacos, incluyendo pero no limitados a, el
diseño, el descubrimiento y la producción de miméticos de ligandos,
el diseño, el descubrimiento y la producción de inhibidores de la
unión al ligando, el diseño, el descubrimiento y la producción de
agonistas, antagonistas y otros moduladores de la unión al ligando,
y la producción de estructuras cristalinas que permitan la
caracterización precisa del sitio o los sitios de interacción
EBP-ligando. Los compuestos que son miméticos de EPO
pueden ser ADN, ARN, péptidos, proteínas, o moléculas orgánicas no
proteináceas.
Las composiciones farmacéuticamente útiles que
contienen EBP pueden ser formuladas según los métodos conocidos
tales como la mezcla de un portador farmacéuticamente aceptable. Los
ejemplos de tales portadores y métodos pueden ser encontrados en
Remington's Pharmaceutical Sciences. Para formar una composición
farmacéuticamente aceptable adecuada para la administración eficaz,
tales composiciones contendrán una cantidad eficaz del péptido o
proteína, ADN, ARN, o modulador.
Tras la expresión de EBP en una célula huésped
recombinante, se puede recuperar la EBP para proporcionar EBP en
forma activa. Las células microbianas que contienen el plásmido de
expresión de EBP son cosechadas del medio de fermentación para
proporcionar una pasta celular, o una suspensión. Cualquiera de los
métodos convencionales para cosechar células de un medio líquido es
adecuado, incluyendo, pero no limitados a, centrifugación o
microfiltración.
Las células cosechadas son lisadas en un tampón
de lisis adecuado. Las proteínas insolubles se separan de las
proteínas solubles mediante métodos convencionales conocidos en la
técnica, tales como centrifugación y microfiltración. La EBP puede
estar presente en cualquiera o en ambas fracciones de proteína
solubles e insolubles del producto lisado celular.
La EBP producida en el sistema descrito más abajo
se acumula en forma de una proteína insoluble que después es
recuperada y replegada para obtener una forma activa de la proteína.
Es fácilmente evidente para los expertos en la técnica que se puede
utilizar una amplia variedad de vectores de expresión y células
huésped en el presente método y que la EBP que va a ser expresada
puede ser diseñada para que contenga una secuencia señal o carezca
de ella. Además, el procedimiento de purificación de la presente
invención puede ser utilizado para purificar la EBP de una mezcla de
las EBP expresadas que comprendan EBP con y sin una secuencia
señal.
La fracción de proteína insoluble es recogida y
solubilizada en un tampón de solubilización adecuado. Las proteínas
solubilizadas son separadas de nuevo de las proteínas insolubles
como se ha descrito antes, y la fracción de proteína EBP soluble es
recogida. La EBP solubilizada es replegada mediante incubación
durante un período de tiempo adecuado en un tampón de replegado
adecuado, mediante métodos convencionales conocidos en la técnica.
La EBP replegada es sometida después a cromatografía de interacción
hidrófoba utilizando una matriz cromatográfica de interacción
hidrófoba adecuada. Entre los ejemplos de las matrices
cromatográficas de interacción hidrófoba adecuadas se incluyen, pero
no están limitadas a, resinas con una base silícica o polimérica
sustituidas con sustituyentes alquílicos o aromáticos tales como
Octil-Sepharose, Butil-Sepharose,
Fenil-Sepharose (Pharmacia); agarosa en cuentas
sustituida con Etilo, Propilo, Butilo, Pentilo, Hexilo, Octilo,
Decilo, Dodecilo, Fenilbutilamina o Fenilo (Supleco)o Fenil o
Butil Toyopearl prefiriéndose Fenil-Toyopearl 650 M.
Las proteínas son eluidas de la columna de interacción hidrófoba
utilizando un tampón de elución adecuado. Las fracciones que
contienen EBP activa determinada mediante los métodos descritos
aquí, son recogidas. La EBP activa se encuentra principalmente en el
primer pico de proteína principal de la columna. Las fracciones de
la columna que contienen la EBP activa son reunidas y sometidas a
cromatografía de exclusión por tamaños de alta resolución
(HP-SEC) utilizando una matriz de
HP-SEC adecuada. Entre las matrices de
HP-SEC adecuadas se incluyen, pero no están
limitadas a, sílice porosa y medios de filtración en gel polimérico
incluyendo Sephacryl, Sepharose, Superdex y Sephadex Sized Resins;
Toyopearl HW, Progel TSK (Supelco) siendo preferidas
Bio-Sil SEC 250 (BioRad) o TosoHaas G3000SW. Las
fracciones de la columna de HP-SEC que contienen
actividad EBP son reunidas y representan una EBP extremadamente pura
que se une a EPO. Esta EBP extremadamente pura es adecuada para los
usos descritos aquí. Es fácilmente evidente para los expertos en la
técnica que variando el nivel de pureza de EBP se proporcionará una
EBP que puede ser adecuada para los usos descritos aquí.
La recuperación inicial de EBP de la mezcla de
replegado también puede ser completada utilizando cromatografía de
intercambio aniónico. La aplicación de un gradiente de concentración
salina creciente en un tampón adecuado produce en la elución dos
picos de absorbancia de proteína principales conteniendo el primer
pico principal EBP activa. Entre los medios de intercambio aniónico
adecuados se incluyen, pero no están limitados a, resinas
poliméricas o no porosas sustituidas con modificaciones funcionales
de DEAE o QAE incluyendo
TSK-5w-DEAE,
DEAE-Sepharose, QAE Sepharose o DEAE Sepharose
siendo preferida DEAE Sepharose FastFlow. La EBP activa recuperada
de esta manera puede ser purificada adicionalmente mediante
cromatografía de exclusión por tamaños de alta resolución
(HP-SEC).
El replegado de la EBP producida en E.
coli utilizando el procedimiento descrito aquí ha identificado
un intermedio de plegado de la proteína de larga vida pero
transitorio que finalmente se relaja en la forma activa de la
proteína. La proteína activa purificada a partir de mezclas de
replegado durante 24 horas parecían idénticas a la replegada durante
siete días en las determinaciones de unión al ligando apoyando la
conclusión de que sólo una forma activa de la proteína,
independiente de la duración del replegado, era purificada mediante
estos métodos. Los estudios de HP-SEC han demostrado
que el intermedio parece tener un mayor volumen hidrodinámico que la
forma activa de la proteína con un tiempo de retención
correspondiente a una proteína con una masa aproximadamente dos
veces la de la forma activa de la proteína. Esto puede indicar la
participación de un intermedio de plegado dimérico o un intermedio
en el que sólo uno de los dos dominios pronosticados de la proteína
está plegado dando como resultado un volumen hidrodinámico
incrementado.
El dominio de unión al ligando soluble descrito
aquí neutraliza las propiedades proliferativas de la EPO detectada
mediante la neutralización dependiente de la dosis de una línea
celular sensible a la EPO. Una molécula con la capacidad de
neutralizar la EPO, tal como la EBP purificada mediante el
procedimiento de la presente invención, puede tener utilidad en el
tratamiento de los trastornos proliferativos sensibles a la EPO
tales como la eritroleucemia y la policitemia. La EBP también puede
ser útil para neutralizar la EPO in vivo.
El procedimiento de la presente invención permite
la producción de EBP no glicosilada, activa potencialmente adecuada
para una variedad de usos, incluyendo pero no limitados a, diseño y
descubrimiento de fármacos, como agente terapéutico, y para las
investigaciones estructurales mediante RMN y cristalografía. La
producción de la proteína en bacterias permite la fácil
incorporación de isótopos de carbono y nitrógeno estables requeridos
para los estudios de RMN heteronuclear y limita el factor
potencialmente complicado de la heterogeneidad inducida por la
glicosilación de la proteína si es producida mediante cultivo de
células de mamíferos. En particular, el procedimiento para la
purificación de EBP de la presente invención produce una proteína
que es adecuadamente pura para la propagación de cristales,
permitiendo de ese modo estudios de cristalografía.
Además, la EBP recombinante puede ser separada de
otras proteínas celulares mediante el uso de una columna de
inmunoafinidad elaborada con anticuerpos monoclonales o policlonales
específicos para EBP.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para
ilustrar la presente invención.
Para la expresión directa al espacio
periplásmico, la secuencia señal pelB (Lei, S-P.,
Lin, H-C., Wang, S.S.,
Callaway, J., y Wilcox, G. (1987), Characterization of the Erwina carotovora pelB gene and its product pectate
lyase, J. Bact. 164, 4379-12; Studier, F.W., Rosenberg, A.H. Dunn, J.J., & Dubendorff, J.W. (1.990) Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 185: 60-89) fue fusionada al extremo N de
hEPOR madura (Jones, S.S., D'Andrea, A.D., Haines, L.L., and Wong, G.G. (1990). Human erythropoietin receptor: Cloning, expression, and biological characterization, Blood 76, 31-35) mediante PCR por prolongación del solapamiento (Horton, R.M., Hunt, H.D., Ho, S.N., Pullen, J.K., and Pease, L.R. (1.989) Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension, Gene 77, 61-68). Se generaron mediante PCR dos fragmentos de ADN separados, uno que codificaba la secuencia señal pelB y uno que codificaba los aminoácidos 1-225 del dominio extracelular de hEPOR maduro. Los 16 nucleótidos terminales del fragmento de PCR pelB fueron diseñados para que fueran idénticos a los primeros 16 nucleótidos del fragmento de PCR pelB de manera que los dos fragmentos pudieran ser utilizados como moldes para la PCR de prolongación del solapamiento. Los cebadores 5' y 3' utilizados para la PCR de prolongación del solapamiento fueron diseñados pata introducir los sitios de restricción Nde I y BamHI, respectivamente, para la posterior clonación en el plásmido de expresión bacteriana. Además, el cebador 3' introducía un codón de terminación en el lugar del aminoácido 226 de hEPOR maduro. El fragmento de PCR pelB-EBP fue ligado en los sitios NdeI y BamHI del vector de expresión del promotor T7 pET11a (Novagen, Inc., Madison, WI) y su secuencia confirmada mediante secuenciación de ADN. Para la expresión bacteriana, el constructo resultante, denominado pSAM3 (Figura 1), fue transformado en la cepa de E.coli BL21(DE3)pLysS, que portaba la ARN polimerasa de T7 en el cromosoma bajo el control del promotor lac inducible por IPTG (Studier, F.W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J., & Dubendorff, J.W. (1990) Use of T7 RNA polymerase to direct expression of clones genes, Methods Enzimol. 185: 60-89). La EBP es expresada a partir del promotor T7 bajo la regulación del operador lac. Los genes que codifican el represor lac (lacI) y la resistencia a la ampicilina (bla) también están presentes en el plásmido. Típicamente, los cultivos fueron desarrollados hasta una DO_{600} de 0,6 a 0,9 en medio M9ZB (Studier, F.W. y col., (1990) supra) conteniendo 100 \mug/ml de ampicilina y 25 \mug/ml de cloranfenicol momento en el cual se indujo la expresión de la proteína con una concentración final de IPTG 1 mM. Tras una incubación de 2 a 3 horas más, las células fueron cosechadas y la EBP fue aislada y purificada como se describe aquí.
Callaway, J., y Wilcox, G. (1987), Characterization of the Erwina carotovora pelB gene and its product pectate
lyase, J. Bact. 164, 4379-12; Studier, F.W., Rosenberg, A.H. Dunn, J.J., & Dubendorff, J.W. (1.990) Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes, Methods Enzymol. 185: 60-89) fue fusionada al extremo N de
hEPOR madura (Jones, S.S., D'Andrea, A.D., Haines, L.L., and Wong, G.G. (1990). Human erythropoietin receptor: Cloning, expression, and biological characterization, Blood 76, 31-35) mediante PCR por prolongación del solapamiento (Horton, R.M., Hunt, H.D., Ho, S.N., Pullen, J.K., and Pease, L.R. (1.989) Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension, Gene 77, 61-68). Se generaron mediante PCR dos fragmentos de ADN separados, uno que codificaba la secuencia señal pelB y uno que codificaba los aminoácidos 1-225 del dominio extracelular de hEPOR maduro. Los 16 nucleótidos terminales del fragmento de PCR pelB fueron diseñados para que fueran idénticos a los primeros 16 nucleótidos del fragmento de PCR pelB de manera que los dos fragmentos pudieran ser utilizados como moldes para la PCR de prolongación del solapamiento. Los cebadores 5' y 3' utilizados para la PCR de prolongación del solapamiento fueron diseñados pata introducir los sitios de restricción Nde I y BamHI, respectivamente, para la posterior clonación en el plásmido de expresión bacteriana. Además, el cebador 3' introducía un codón de terminación en el lugar del aminoácido 226 de hEPOR maduro. El fragmento de PCR pelB-EBP fue ligado en los sitios NdeI y BamHI del vector de expresión del promotor T7 pET11a (Novagen, Inc., Madison, WI) y su secuencia confirmada mediante secuenciación de ADN. Para la expresión bacteriana, el constructo resultante, denominado pSAM3 (Figura 1), fue transformado en la cepa de E.coli BL21(DE3)pLysS, que portaba la ARN polimerasa de T7 en el cromosoma bajo el control del promotor lac inducible por IPTG (Studier, F.W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J., & Dubendorff, J.W. (1990) Use of T7 RNA polymerase to direct expression of clones genes, Methods Enzimol. 185: 60-89). La EBP es expresada a partir del promotor T7 bajo la regulación del operador lac. Los genes que codifican el represor lac (lacI) y la resistencia a la ampicilina (bla) también están presentes en el plásmido. Típicamente, los cultivos fueron desarrollados hasta una DO_{600} de 0,6 a 0,9 en medio M9ZB (Studier, F.W. y col., (1990) supra) conteniendo 100 \mug/ml de ampicilina y 25 \mug/ml de cloranfenicol momento en el cual se indujo la expresión de la proteína con una concentración final de IPTG 1 mM. Tras una incubación de 2 a 3 horas más, las células fueron cosechadas y la EBP fue aislada y purificada como se describe aquí.
La cepa de E. coli parental
BL21(DE3)pLysS (Studier, F.W. y col., (1990) supra)
transformada con el plásmido pSAM3 (designado SM4) fue mantenida en
medio M9ZB amp/cap [medio M9ZB amp/cap por litro: 10 g de
N-Z-Amina A, 100 ml de Sales Mínimas
M9 10X (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO), 5 g de NaCl, MgSO_{4} 1
mM, D-glucosa al 2%, 100 mg de ampicilina y 25 mg de
cloranfenicol] en forma de soluciones de partida en glicerol al 8%
de un cultivo con DO_{600} = 1,0. La fermentación a elevada
densidad se llevó a cabo en un Fermentador CF-3000
(Chemap Inc., South Plainfield, NJ) equipado con un tanque de
agitado de 10 litros. Se preparó un medio M9ZB enriquecido que
contenía (por litro) 20 g de
N-Z-Amina, 5 g de NaCl, 10 g de
Sales Mínimas M9, 0,12 g de MgSO_{4}, 0,2 g de glucosa, 100 mg de
ampicilina y 25 mg de cloranfenicol, se filtró a través de un
dispositivo Milli-Pak 40 de 0,22 \mum (Millipore
Corp.) y se bombeó en el fermentador. Tras el equilibrado del medio
a 37ºC y con un 20% de oxígeno disuelto a pH 6,8 el fermentador fue
inoculado con 50 ml de la provisión de partida de glicerol con E.
coli transformada (ver arriba). Antes de la inducción, el pH fue
mantenido por medio de la glucosa introducida (400 g de glucosa a 1
litro de medio M9ZB enriquecido). Cuando se obtenía un valor de
DO_{600} de 25,0, se inducía la sobreexpresión de la proteína
mediante la adición de IPTG a una concentración final de 1 mM y el
pH se reducía a 6,1 mediante la adición de HCl. Se dejó que la fase
de inducción procediera durante la noche. En la recogida el valor
DO_{600} era de 36 y se recogían 445 g de pasta celular mediante
centrifugación. El pH final de 6,1 ralentiza enormemente el tiempo
de multiplicación y el pH final requerido para limitar la velocidad
de crecimiento celular depende del control de pH fiable y de la
calibración de la sonda.
El vector de expresión construido codifica los
225 restos N-terminales iniciales del receptor de
eritropoyetina humana madura e incluyen una secuencia señal pelB
que, se preveía, dirigiría la proteína expresada al espacio
periplásmico de E. coli para rendir EBP apropiadamente
plegada, soluble. El análisis de transferencia Western de las
preparaciones de proteína periplásmica soluble y los medios de
crecimiento demostraba niveles bajos de proteína presente en estas
preparaciones tras la inducción. Los extractos hervidos de los
cultivos analizados mediante SDS-PAGE demostraron
dos intensas bandas de proteína presentes en los cultivos inducidos
que estaban ausentes en los cultivos desarrollados en condiciones
idénticas excepto por la inducción con IPTG. El peso molecular
aparente de las especies más pequeñas fue estimado en 27 kDa
mientras las especies que migraban más despacio eran aproximadamente
1,5 kDa más grandes. La recuperación de proteína insoluble a escala
analítica conducía a preparaciones de proteína que parecían ser
principalmente estas dos especies. El análisis de la secuencia
N-terminal de esta proteína, tras la solubilización,
el replegado y el cambio de tampón a PBS, indicaba dos secuencias de
proteínas; una que correspondía a los primeros seis aminoácidos
esperados para la secuencia N-terminal madura del
receptor de EPO, y una segunda que constituye los primeros seis
aminoácidos de la secuencia señal pelB N-terminal.
Estos datos, tomados juntos, muestran que el sistema de expresión
conduce a la producción de dos formas de proteína, ambas insolubles
y presumiblemente localizadas en cuerpos de inclusión, una que
corresponde a EBP que tiene un extremo amino apropiadamente
elaborado y una que conserva la secuencia señal pelB codificada.
Parece requerirse una secuencia señal para la producción de la EBP
en este sistema de expresión, puesto que una versión del plásmido
pSAM3 que carecía de la secuencia señal pelB no expresaba EBP en la
cepa de E. coli BL21(DE3)pLysS. Se pueden
construir otros constructos plasmídicos u otras cepas de E.
coli que no requieran la presencia de una secuencia señal para
la producción a elevado nivel de la EBP. Se observó que un
constructo alternativo en el que se empleaba la secuencia señal ompT
también generaba cantidades considerables de EBP insoluble
sobreexpresada.
Se realizaron fermentaciones adicionales que
variaban la distribución de las formas de la secuencia señal
"on" y la secuencia señal "off" de EBP. Los estudios de
fermentación controlada iniciales revelaron cultivos inducidos con
una cantidad mayor de EBP elaborada que tenían un pH final más bajo.
Con posterioridad se desarrolló un protocolo experimental para la
producción de EBP completamente elaborada. El procedimiento de
fermentación final ofrece un nivel de oxígeno cuidadosamente
controlado y una reducción regulada en el pH del cultivo tras la
inducción de la expresión de la proteína. Esto produce la expresión
de una especie de proteína que tiene un peso molecular aparente de
aproximadamente 27 kDa tras el análisis mediante
SDS-PAGE (Figura 2, panel A, calle B versus
calle C). Las muestras del Panel A (reducido) fueron las siguientes:
A. Pharmacia LMWM; B. Antes de la inducción; C. Después de la
inducción; D. Mezcla de replegado; E. Reserva HIC; F. Reserva
HP-SEC (2,5 \mug); G. Reserva
HP-SEC (5,0 \mug). Las muestras del Panel B (no
reducido) fueron las siguientes: A. Pharmacia LMWM; B. Mezcla de
replegado; C. Reserva HIC; D. Reserva HP-SEC (2,5
\mug); E. Reserva HP-SEC (5,0 \mug).
La fermentación bajo un control menos riguroso
también puede ser utilizada para obtener EBP que aparece en forma de
una mezcla de material de "secuencia señal on" y "secuencia
señal elaborada" como se ha descrito antes. La EBP insoluble
obtenida a partir de estas fermentaciones también puede ser
replegada y purificada mediante los métodos descritos aquí para
rendir una proteína activa con un extremo amino apropiadamente
elaborado. El replegado y la purificación dan como resultado la
separación de la forma de la proteína que conserva la secuencia
señal no elaborada.
Dado el elevado nivel de expresión de la proteína
insoluble los autores de la presente invención buscaron condiciones
para la recuperación y el replegado de los cuerpos de inclusión para
obtener la proteína activa. Las condiciones fueron desarrolladas
basándose en el número de factores que se iban a considerar en el
replegado de las proteínas recombinantes (Marston, F.A.O., (1986)
The purification of eucaryotic polypeptides synthesized in
Escherichia coli. Biochemical Journal 240,
1-12; Light, A. (1985) Protein Solubility, protein
modifications and protein folding, BioTechniques 3,
298-306; Schein, C.H. (1990) Solubility as a
function of protein structure and solvent components,
Bio/Technologie 8, 308-317). La centrifugación se
demostró adecuada para la recuperación de los cuerpos de inclusión
que se encontró que estaban óptimamente solubilizados a una
concentración de urea 3,5 M. Esta concentración de urea solubilizaba
eficazmente >90% de la EBP pero dejaba numerosas proteínas
contaminantes en la fracción insoluble. Los primeros experimentos
sobre las condiciones de replegado sugirieron que el procedimiento
podía estar seguido de una cromatografía de exclusión por tamaños de
alta resolución (HP-SEC). El uso de
HP-SEC se basaba en la noción de que si la ruta de
replegado de la proteína prosigue o bien hacia un producto activo
correctamente plegado o bien a diversos tipos de agregados de
proteínas, el uso de una técnica analítica que discrimine basándose
en el volumen molecular debe predecir la eficacia de un protocolo de
replegado solo. Por lo tanto, el procedimiento de replegado de la
proteína fue controlado mediante cromatografía de exclusión por
tamaños de alta resolución (HP-SEC) en un sistema
Waters 625 HPLC equipado con un detector Waters 991. Las
separaciones fueron realizadas a la temperatura ambiente en una
columna BioSil SEC-250 (7,8 x 300 mm) (BioRad) o una
columna G-3000 SWXL (7,8 x 300 mm) (Supleco,
Bellfonte, PA) que proporciona una resolución comparable. La columna
analítica fue equilibrada en fosfato de sodio 10 mM, pH 7,2, NaCl
150 mM, a una velocidad de flujo de 1 ml/min y fue controlada a 220
nm. La forma activa de la proteína fue detectada mediante análisis
de desplazamiento del pico por medio de la adición de 10 \mug de
EPO humana recombinante purificada (1,7 mg/ml, actividad específica
120 unidades/\mug) a una alícuota de 100 \mul de la solución de
replegado a granel seguido de análisis mediante
HP-SEC. Este cromatograma fue comparado después con
la resolución cromatográfica de una alícuota de 100 \mul de la
mezcla de replegado a granel realizada en ausencia de EPO.
Parte de la pasta celular (74,3 g) de la
fermentación controlada antes fue sometida a lisis en 0,3 litros de
tampón de lisis de EBP (TRIS-HCl 10 mM, pH 7,5, NaCl
150 mM) conteniendo 51 mg de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 600 mg
de lisozima de clara de huevo (Calbiochem), MgCl_{2} 1 mM, y
12.500 unidades de Benzonase (EM Science) y en total denominado
Tampón de Lisis de EBP. Esta mezcla fue incubada a la temperatura
ambiente durante 1,5 horas con agitación ocasional. El producto
lisado resultante fue centrifugado a 12.000 x g durante 15 minutos a
4ºC. El sobrenadante fue descartado y el sedimento dispersado
mediante la aplicación de una ráfaga de sonicación de un minuto tras
la adición de 0,3 litros de tampón TE (Tampón TE:
TRIS-HCl 10 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM,
NP-40 al 3% [calidad de proteína, Calbiochem]). La
suspensión resultante fue centrifugada a 8.000 x g durante 15
minutos a 4ºC. El sobrenadante fue descartado y las proteínas
insolubles lavadas con 0,3 litros de agua. El sedimento fue
resuspendido mediante sonicación (20 seg). La proteína insoluble fue
recuperada mediante centrifugación (12.00 x g, 15 minutos, 4ºC). El
peso húmedo de la proteína recuperada era de aproximadamente 3,5 g
tras la decantación del sobrenadante del lavado.
El sedimento de la proteína insoluble fue
resuspendido en 9 ml de tampón de solubilización por gramo de
proteína (tampón de solubilización: TRIS-HCl 0,1 M,
pH 8,5, urea 3,5 M, lisina 10 mM, ditiotreitol 10 mM) y centrifugado
a 12.000 x g durante 15 minutos a 4ºC. Se añadió lisina para que
actuara como captador de los cianatos reactivos de amina
posiblemente presentes en la urea (Marston, F.A.O and Hartley, D.L.
(1990) Solubilization of protein aggregates, Methods Enzymol. 182,
264-276). En este punto, el sobrenadante recuperado
puede ser incubado a 4ºC durante la noche como punto de parada
conveniente o llevado a la etapa de replegado. La DO_{280} de la
proteína solubilizada fue determinada frente a tampón de
solubilización (21.7 U.A./ml) y 30 ml de la proteína solubilizada
fueron diluidos hasta 1.020 ml en tampón de replegado (tampón de
replegado: TRIS-HCl 0,05M, pH 8,5, EDTA 3 mM,
lisina 10 mM, glutatión reducido 2 mM, glutatión oxidado 0,2 mM) y
almacenada a 4ºC. La DO_{280} final de la mezcla replegada era de
0,64.
Era posible una estimación cualitativa de la
actividad de unión al ligando realizando dos experimentos de
HP-SEC con la mezcla de replegado, uno con ligando
añadido y uno sin (Figura 3). La EBP insoluble fue solubilizada como
se ha descrito aquí e incubada a 4ºC durante seis días (Figura 3,
Paneles A y B). Como se muestra en la Figura 3, Panel A, cuando la
mezcla de replegado sola era inyectada en una columna SEC analítica
se observaba un pico de absorbancia a aproximadamente 9,5 minutos
que corresponde a un peso molecular calibrado patrón de
aproximadamente 25.000 Daltons. Este valor está en buena
concordancia con la masa molecular de 24.724 pronosticada de la EBP.
Tras la adición de 8,5 \mug de EPO a la mezcla y la posterior
resolución cromatográfica, se detectó un pico de complejo
EPO-EBP a aproximadamente 8,1 min y un pico de EPO a
aproximadamente 8,5 min (Figura 3, Panel B, sobrepuesta sobre el
experimento mostrado en la Figura 3, Panel A). El pico de
absorbancia a aproximadamente 9,5 minutos está casi completamente
agotado demostrando la presencia de una forma de EBP que puede
interaccionar con EPO para crear una especie con una masa molecular
de la fase en solución aparente mayor. Sólo el pico de 9,5 min
parece interaccionar con EPO indicando una única especie activa. Los
picos que eluyen al cabo de 10 minutos tienen masas moleculares
calibradas de menos de 3.000 Daltons. La Figura 3, Panel C, muestra
una cantidad significativa de proteína apropiadamente replegada
inmediatamente después de la dilución de la solución
desnaturalizante de urea 3,5 M a urea 0,1 M como evidencia el pico
en el tiempo de elución de 9,5 minutos (pico 2). Al cabo de 24 horas
de incubación a 4ºC, se observa un incremento tanto en la forma de
proteína activa a los 9,5 min (Pico 2) como en una especie que eluye
a 8,2 min (Pico 1) como se muestra en la Figura 3, Panel D. La
apariencia de estas formas parece ser a expensas de formas de
proteína de peso molecular superior con tiempos de retención de
6-8 minutos y de la proteína insoluble en la mezcla
de replegado. Como se muestra en la Figura 3, Panel A la forma de la
proteína de 8,2 minutos decae gradualmente y la absorbancia aparece
en el pico de la proteína activa. Estos experimentos producen claros
desplazamientos de una proteína de M_{r} = 25.000 tras la adición
de EPO a una alícuota de la mezcla de replegado (Figura 3, Panel A y
B). Solo el pico de M_{r} = 25.000 parece desplazarse tras la
adición de EPO indicando la presencia de una única especie activa en
estas condiciones de análisis.
El estudio de HP-SEC de la mezcla
de replegado a lo largo del tiempo producía la observación de que
una especie de M_{r} = 52.000 se convertía lentamente en la
especie M_{r} = 25.000 activa. (Figura 3, Panel C, picos 1 y 2 en
comparación con la Figura 3, Panel A [al cabo de 6 días de tiempo de
replegado]). La solución de replegado permanecía ligeramente turbia
y se presumía que la proteína insoluble que daba lugar a la solución
opaca estaba entrando lentamente en solución dando lugar a especies
de proteína activa e inactiva adicionales a lo largo de las 24 horas
iniciales de replegado (Figura 3, Paneles C y D). Se observó que
esta especie metaestable era de larga duración y parecía no estar
relacionada con una especie unida por puentes disulfuro, ya que a lo
largo del transcurso del larguísimo procedimiento de replegado los
experimentos de SDS-PAGE no reductores no
demostraban diferencias con el tiempo. Este estudio sugirió que la
incubación continuada a 4ºC producía la acumulación de producto
activo adicional a expensas de la sustancia inactiva denominada pico
#1 (Figura 3, Panel A) y por tanto el procedimiento de replegado se
llevaba a cabo típicamente durante 5-7 días (Figura
3, Panel C vs. Panel A). La proteína con un tiempo de elución en la
HP-SEC analítica de 8,2 minutos (Figura 3, pico 1)
fue aislada mediante HP-SEC preparativa y analizada
mediante SDS-PAGE. Tanto en condiciones reductoras
como no reductoras la proteína parecía ser monomérica. Puesto que
este pico disminuye por último en relación con el pico de 9,5
minutos (Figura 3, pico 2) tras un tiempo de replegado de varios
días (Figura 3, Panel A) se sugirió que esta especie podría
representar un intermedio de replegado.
Tras un tiempo de replegado de seis días, la
mezcla de replegado final se templó a 37ºC y se ajustó a
(NH_{4})_{2}SO_{4} 1 M mediante la adición de
(NH_{4})_{2}SO_{4} 3,5 M en TRIS-HCl 20
mM, pH 7,5 y TRIS-HCl 20 mM, pH 7,5. El volumen
ajustado final de la mezcla de replegado con
(NH_{4})_{2}SO_{4} 1 M era de 1,5 litros. El análisis
mediante HP-SEC analítica de la solución reveló que,
en parte, las formas de peso molecular superior de la mezcla de
replegado precipitaban de la solución. Tras filtrar a través de un
filtro de 0,45 \mum, esta solución fue aplicada a una columna (5
cm x 16 cm) de Phenyl-Toyopearl TSK 650 M (Supelco)
a una velocidad de flujo de 8 ml/min a la temperatura ambiente. La
columna se había equilibrado previamente con
(NH_{4})_{2}SO_{4} 1 M/TRIS-HCl 20 mM,
pH 7,5 (Tampón A). Una vez completada la carga de la columna, la
absorbancia (280 nm) del eluyente de la columna se redujo hasta la
línea base lavando con Tampón A. La proteína unida a la columna se
hizo eluir con un gradiente lineal de 2.000 ml de
TRIS-HCl 20 mM, pH 7,5 (Tampón B), partiendo de
Tampón A al 100%, seguido de 1.000 ml de Tampón B. Se mantuvo una
velocidad de flujo de 8 ml/min en el transcurso del experimento. Se
recogieron fracciones de una duración de 2 minutos. Se hicieron
eluir dos picos principales de absorbancia: uno alrededor del 80% de
Tampón B y otro después de aproximadamente 200 ml de Tampón B al
100% Figura 4A. La HP-SEC analítica de las
fracciones de la columna (100 \mul) indicaban que el primer pico
de absorbancia contenía la proteína activa y las fracciones
85-102 fueron reunidas y concentradas mediante
ultrafiltración (Amicon membrana YM-10). La
sustancia recuperada fue filtrada a través de un filtro de 0,45
\mum antes de la siguiente etapa cromatográfica.
La reserva recuperada (22 ml, 60 mg de proteína)
fue sometida a HP-SEC sobre una columna
Bio-Sil SEC-250 (21,5 x 600 mm,
BioRad) equipada con una precolumna Bio-Sil (7,5 x
21,5 mm) equilibrada con PBS, pH 7,5 a 4 ml/min. Se realizaron
inyecciones de 4,5 ml y la reserva completa fue resuelta en cinco
experimentos cromatográficos. Las fracciones de un minuto fueron
recogidas y las fracciones activas de cada ronda (fracciones
40-42) fueron reunidas y concentradas mediante
ultrafiltración en dispositivos Centriprep 10 (Amicon) [Figura 4B].
La reserva recuperada (23 ml, 2,04 mg/ml, 46 mg) se analizó en
cuanto a la actividad mediante análisis de unión a EPO
HP-SEC (ver más abajo) y en cuanto a la pureza
mediante SDS-PAGE no reductora y reductora (ver la
Figura 2). Los geles de SDS-PAGE (placas de
SDS-PAGE en gradiente 10-20%, 84 x
70 x 1,0 mm, Integrated Separation Systems, Natick, MA) fueron
teñidos con Azul Brillante de Coomasie R-250.
Tras la HP-SEC analítica esta
proteína aparece como un especie única con un tiempo de elución de
9,5 minutos sin trazas de agregados de elevado peso molecular
(Figura 4, Panel C). Cuando se mezcla con un exceso de EPO antes de
la resolución cromatográfica, la EBP observada a 9,5 minutos es
convertida en un complejo con un tiempo de retención de
aproximadamente 8,2 minutos (Figura 4, Panel D sobrepuesto con el
experimento mostrado en la Figura 4, Panel C). Si se añadía EPO a un
nivel por debajo del exceso se observaba el agotamiento completo del
pico de EPO a 8,5 minutos y el pico del complejo a 8,2 min
permanecía. Se ha observado un rendimiento de recuperación de EBP
final de aproximadamente 0,6 mg de proteína activa por gramo de peso
celular húmedo con un rendimiento global del 33% desde la fase de
replegado hasta la proteína aparentemente homogénea. En la Tabla 1
se muestra el resultado de la purificación de EBP replegada a partir
de E. coli.
| Fracción | Proteína Total | EBP Activa^{1} | Rendimiento |
| (mg) | (mg) | (%) | |
| Mezcla de Replegado | 195 | 138 | 100 |
| HIC | 60 | 58 | 42 |
| SEC | 46 | 46 | 33 |
| Nota: Partiendo de 74,3 gramos de células (peso húmedo). | |||
| 1 - calculado a partir del área del pico SEC, basándose en el % de proteína activa |
Se examinó adicionalmente la estequiometría de
EBP y EPO en el complejo de unión mediante aislamiento de complejo
EPO-EBP por HP-SEC, y la estimación
de la proporción de proteína dentro de esta mezcla mediante
cromatografía en fase reversa C-4 como se describe
más abajo. Se generó una curva patrón de respuesta al detector para
EPO y EBP (Figura 5, Panel A) que demostraba una respuesta al
detector lineal con un bajo nivel de error repetitivo (D.T. 1,0) a
lo largo de tres diferentes rondas analíticas en cada cantidad de
analito como indicaban las barras de error. La Figura 5, Panel B
contiene los resultados del análisis de dos lotes diferentes de
complejo HP-SEC antes del análisis con
C-4. Estos datos, combinados con los datos de la
HP-SEC descrita aquí, demuestran una proporción 1:1
para el complejo EPO-EBP.
El complejo fue obtenido como sigue. Una solución
que contenía 5 mg de EPO y 12 ml de EBP (EBP en exceso) fue
sometida a HP-SEC preparativa mediante el método
descrito antes. El primer pico de elución de proteína (complejo
EPO-EBP) fue recogido y sometido a análisis
mediante HPLC en fase reversa C-4. En resumen, se
equilibró una columna de 4,6 x 250 mm (YMC-PACK,
C4-AP, 300A) con agua/acetonitrilo (80%/20%)
conteniendo ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1% y una alícuota de
complejo EPO-EBP se inyectó a una velocidad de
flujo de 1 ml/min. Tras un lavado de 5 minutos, se aplicó un
gradiente lineal de acetonitrilo al 20-100%
conteniendo TFA al 0,1% a lo largo de 20 minutos y el experimento
se controló a 220 nm. En estas condiciones, EBP y EPO eluyen a 14,1
y 15,1 minutos, respectivamente, con la resolución en la línea
base. Se estableció una curva patrón de cada proteína que
demostraba que la respuesta al detector era lineal a lo largo del
intervalo de 50 a 500 pmoles. El área del pico para cada proteína en
el complejo fue comparada con la curva patrón para determinar la
proporción de EPO y EBP en el complejo.
Se realizó el análisis de aminoácidos de una
solución de EBP purificada mediante mecanismos normalizados en un
hidrolizador 420H (Applied Biosystems, Foster City, CA) y se estimó
el contenido de aminoácidos utilizando un patrón interno. Estos
datos fueron utilizados para calcular un coeficiente de extinción
molar de 57.500 para EBP a 280 nm (2,3 unidades de absorbancia/mg)
basándose en la absorbancia de la solución de proteína utilizada
para el análisis de aminoácidos. Este valor fue utilizado con
posterioridad para estimar las concentraciones de EBP.
Originalmente se empleó un coeficiente de extinción (Gill, S.C. y
von Hippel, P.H. (1989) Calculation of protein extinction
coefficients form amino acid sequence data. Anal. Biochem. 182,
319-326) de 42.760 pero se demostró con
posterioridad que era incorrecto en experimentos de titulación de
la unión.
La secuencia amino terminal de EBP fue
determinada en un 2090E Integrated Micro-Sequencing
System (Porton Instruments, Fullerton, CA) utilizando la química de
degradación de Edman en fase gaseosa normalizada. Los rendimientos
repetitivos eran mayores del 85%.
Para el mapeo peptídico, se añadieron
aproximadamente 50 \mug de EBP en PBS a 300 \mul de tampón TRIS
0,05 M, pH 8,5. A esta solución se añadieron 2 \mul de
TPCK-tripsina de 1 mg/ml (Worthington, Freehold, NJ)
en agua y la mezcla se incubó a 37ºC durante 16 horas. La digestión
se sofocó con 25 \mul de ácido trifluoroacético y la mezcla se
filtró a través de un filtro de membrana de 0,45 \mum. El producto
digerido fue analizado mediante HPLC sobre una columna Dynamax
C-18 5 micras 300A (Rainin Instrument Co., Woburn,
MA) que se hizo eluir con un gradiente de acetonitrilo del
0-42%/TFA al 0,1% a lo largo de 50 minutos seguido
del 42-70% del mismo tampón a lo largo de 10 minutos
a 1,0 ml/minuto. Las fracciones de la sustancia que eluía en forma
de picos de absorbancia a 215 nm fueron recogidas y el disolvente
fue evaporado en un Speedvac. Los péptidos fueron secuenciados como
antes.
Para determinar la capacidad de unión de la
sustancia recuperada y confirmar la identidad y la integridad
estructural de la proteína se acometieron numerosos estudios
adicionales. Entre estos se incluían un análisis de la secuencia
N-terminal, una espectrometría de masas TOF y
formatos de análisis diseñados para determinar la capacidad de
unión al ligando de EBP. El análisis de la secuencia
N-terminal sólo demostró que la secuencia
N-terminal esperada para diez ciclos (ver arriba)
confirmaba la identidad de la proteína. El análisis de la secuencia
de numerosos péptidos del tratamiento con tripsina internos también
confirmó la secuencia lineal esperada de la proteína y un patrón de
enlace disulfuro principal de 1-2,
3-4.
Para confirmar la masa de la proteína recuperada,
se realizó un espectrometría de masas TOF de ionización por
desorción láser ayudada por una matriz en un aparato LaserMAT
(Finnigan-MAT, San José, CA) utilizando una matriz
de ácido sinapínico y un patrón de masa de anhidrasa carbónica. La
Figura 6, Panel B demuestra el espectro de masas MALDI/TOF de EBP
mostrando el ión molecular (MH+) a 24.732 Dalton. El centroide de
la masa del ión de la anhidrasa carbónica (CA+) fue utilizado para
calibrar el aparato. También eran evidentes en el espectro iones
descargados (MH2++) y anhidrasa carbónica (CA++). La masa molecular
en el centroide 24.732 para EBP se puede comparar bien con la masa
media calculada de 24.724 apoyando tanto la identidad como el
apropiado truncamiento carboxi-terminal de la
proteína.
La EBP producida mediante el método anterior
contiene un grupo sulfhidrilo libre que puede ser modificado sin
afectar a la unión del ligando en fase de solución. Con el fin de
inmovilizar la EBP para el análisis de unión en equilibrio se amplió
esta observación para el anclaje covalente de EBP a cuentas de
agarosa. La química de activación de yodoacetilo de cuentas de
Sulfolink (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) es específica para los
tioles libres y asegura que la conexión no sea fácilmente
reversible. Las cuentas de EBP-Sulfolink fueron
elaboradas como sigue: Se mezcló una suspensión en gel de Sulfolink
(10 ml) con tampón de acoplamiento (40 ml; TRIS 50 mM, pH 8,3, EDTA
5 mM) y se dejó que el gel se sedimentara. El sobrenadante fue
eliminado y la EBP que se iba a unir (0,3-1 mg/ml
en tampón de acoplamiento) fue añadida directamente a las cuentas
lavadas. La mezcla se sacudió suavemente durante 30 minutos a la
temperatura ambiente, y se dejó que las cuentas se sedimentaran
durante 1 hora a la temperatura ambiente. El sobrenadante se separó
y se reservó, y las cuentas se lavaron dos veces con 20 ml de tampón
de acoplamiento. Los lavados también se conservaron. Las cuentas
fueron tratadas después con 20 ml de cisteína 0,05 M durante 30
minutos a la temperatura ambiente para bloquear los sitios no
unidos. Finalmente, las cuentas se lavaron con 50 ml de NaCl 1 M,
después con 30 ml de PBS, y se resuspendieron en 20 ml de PBS y se
almacenaron a 4ºC. La cantidad de EBP que se había unido
covalentemente a las cuentas fue determinada comparando la
DO_{280} de la solución de EBP original con la DO_{280} total
recuperada en el sobrenadante de reacción y los dos lavados de 20
ml. Típicamente, el 40-60% de la EBP aplicada
permanece asociada con las cuentas.
Se iniciaron análisis de unión mediante la
adición de las cuentas de EBP (50 \mul) a tubos de reacción
individuales. La unión total fue medida en tubos que contenían
EPO[I^{125}] 0,3-30 nM (NEN Research
Products, Boston MA, 100 \muCi/\mug). Para la determinación de
la unión no específica, se añadió EPO no marcada a un nivel de 1.000
veces más que la correspondiente concentración de
EPO[I^{125}]. Cada volumen de reacción se llevó a 500
\mul con tampón de unión (PBS/BSA al 0,2%). Los tubos fueron
incubados durante cinco horas (un período de tiempo determinado
experimentalmente como adecuado para el establecimiento del
equilibrio) a la temperatura ambiente con sacudimiento suave. Al
cabo de cinco horas, cada mezcla de reacción se hizo pasar a través
de una punta de pipeta de 1 ml taponada con lana de vidrio. Los
tubos se lavaron con 1 ml de tampón de lavado (PBS/BSA al 5%) y
este volumen así como dos lavados más de 1 ml se hicieron pasar a
través de la punta de la pipeta y se recogieron para la
determinación de la concentración de EPO libre. La unión no
específica fue determinada a partir del experimento de EPO fría en
exceso a cada concentración de marca radiactiva y restada de la
unión total para calcular la unión específica. La Figura 6, Panel A
representa los datos de unión en equilibrio y el recuadro es la
transformación lineal (Scatchard) del grupo de datos del Panel A e
indica una Kd de 5 nM \pm 2.
Se realizó un análisis de unión basado en células
completas mediante la adición de cantidades crecientes de EBP
purificada a una cantidad constante de EPO[I^{125}] y
células que portaban EPOR. Se determinó la unión no específica
mediante la adición de un exceso de EPO (1 \muM) y se restó antes
del análisis de los datos. Se determinó que la CI_{50} y la
K_{i} estimadas a partir de cinco análisis eran de 1,7 \pm 1 nM
y 0,94 \pm 0,5 nM, respectivamente. La competencia de EBP por la
unión a EPO[I^{125}] con los receptores de EPO de la
superficie celular intactos rindió una CI_{50} de aprox. 1,7 nM
\pm 1 (Figura 7, Panel A). En resumen, el experimento se realizó
como sigue: Se mantuvieron células TF-1 (Kitamura,
T., Tange T., Teraswa, T., Chiba S., Kuwaki, T. Miyagawa, K., Piao,
Y.-F., Miyazono, K., Urabe, A. y Tagaku, F. (1989) Establishment
and characterization of a unique human cell line that proliferates
dependently on GM-CSF, IL-3
or erithropoietin. J. Cell Physiol. 140, 323-334) en RPMI 1640, suero de ternera fetal al 10%, L-glutamina al 1%, penicilina al 1%, estreptomicina al 0,1% y 1 unidad/ml de IL-3 (Genzyme, Cambridge, MA). Se obtuvo EPO[I^{125}] de NEN Research Products como se ha descrito antes. Los estudios de unión competitiva se realizaron utilizando un método de análisis de unión al receptor de una fase. En resumen, el medio que contenía las células TF-1 en fase semi-log fue centrifugado y los sedimentos celulares resuspendidos en tampón de unión (RPMI 1640, BSA al 0,2%, azida de sodio al 0,02%) a 4 x 10^{7} células/ml. Para analizar la unión de EPO a las células intactas, con o sin la competencia de EBP, se mezclaron 4 x 10^{6} células, EPO[I^{125}] (típicamente 80 pM) y EBP y se incluyeron en un volumen final de 150 \mulitros, por duplicado. Las incubaciones se realizaron en tubos de polipropileno de 1,5 ml a 10ºC durante la noche. Al final del período de incubación se dispusieron en capas alícuotas de 120 \mul de las mezclas de unión sobre un colchón de 300 \mul de sacarosa al 10% en tubos de RIA Sarstedt. Las células fueron sedimentadas en una microcentrífuga durante un minuto y los tubos fueron colocados inmediatamente en un baño de hielo seco para congelar rápidamente los contenidos. Las células y el ligando unido fueron recogidos recortando la punta de la base del tubo y fueron transferidos a tubos de ensayo de 12 x 75 mm para la cuantificación de la radiactividad en un contador gamma. Se empleó Lundon-2 (Lundon Software, Chagrin Falls, OH) para la reducción de los datos.
or erithropoietin. J. Cell Physiol. 140, 323-334) en RPMI 1640, suero de ternera fetal al 10%, L-glutamina al 1%, penicilina al 1%, estreptomicina al 0,1% y 1 unidad/ml de IL-3 (Genzyme, Cambridge, MA). Se obtuvo EPO[I^{125}] de NEN Research Products como se ha descrito antes. Los estudios de unión competitiva se realizaron utilizando un método de análisis de unión al receptor de una fase. En resumen, el medio que contenía las células TF-1 en fase semi-log fue centrifugado y los sedimentos celulares resuspendidos en tampón de unión (RPMI 1640, BSA al 0,2%, azida de sodio al 0,02%) a 4 x 10^{7} células/ml. Para analizar la unión de EPO a las células intactas, con o sin la competencia de EBP, se mezclaron 4 x 10^{6} células, EPO[I^{125}] (típicamente 80 pM) y EBP y se incluyeron en un volumen final de 150 \mulitros, por duplicado. Las incubaciones se realizaron en tubos de polipropileno de 1,5 ml a 10ºC durante la noche. Al final del período de incubación se dispusieron en capas alícuotas de 120 \mul de las mezclas de unión sobre un colchón de 300 \mul de sacarosa al 10% en tubos de RIA Sarstedt. Las células fueron sedimentadas en una microcentrífuga durante un minuto y los tubos fueron colocados inmediatamente en un baño de hielo seco para congelar rápidamente los contenidos. Las células y el ligando unido fueron recogidos recortando la punta de la base del tubo y fueron transferidos a tubos de ensayo de 12 x 75 mm para la cuantificación de la radiactividad en un contador gamma. Se empleó Lundon-2 (Lundon Software, Chagrin Falls, OH) para la reducción de los datos.
Se hizo crecer la línea celular
FDC-P1/ER, una línea dependiente de EPO que expresa
el receptor de EPO murino, y se mantuvo como se ha descrito
previamente (Carroll, M.P., Spivak, J.L., McMahon, M., Weich, N.,
Rapp, U.R. y May, W.S. 1991. Erythropoietin induces
Raf-1 activation and Raf-1 is
required for erythropoietin mediated proliferation. J. Biol. Chem.
266, 14964-14969). Las células fueron mantenidas en
medio RPMI 1640 (Gibco) conteniendo suero de ternera fetal
inactivado con calor al 10% y 10 unidades/ml de EPO humana
recombinante. Para la inhibición del análisis de proliferación, se
hicieron crecer células FDC-P1/ER hasta la fase
estacionaria, se centrifugaron, se lavaron con medio RPMI 1640 (no
EPO), y se cultivaron en placa en medio que carecía de EPO durante
la noche. Los análisis fueron establecidos en placas para el
cultivo de tejidos con fondo en U de 96 pocillos con cada punto del
análisis por triplicado. Cada pocillo contenía 4 x 10^{4}
células, 0,5 unidades/ml de EPO, y diversas cantidades de EBP (en
medio) en un volumen final de 0,2 ml. Las placas fueron incubadas a
37ºC durante aprox. 48 horas después de lo cual las células
sometidas a pulsos con 1 \muCi/pocillo de timidina[H^{3}]
(20 Ci/mmol, Dupont-NEN) durante 6 horas a 37ºC.
Las células fueron cosechadas sobre filtros de fibra de vidrio
utilizando un cosechador celular Tomtec. Los filtros fueron
sometidos a recuento mediante centelleo utilizando un contador de
centelleo LKB Betaplate 1205. El dominio de unión al ligando
soluble descrito aquí neutralizaba las propiedades proliferativas de
la EPO detectadas por medio de la neutralización dependiente de la
dosis de la respuesta proliferativa de EPO en la línea celular
sensible a EPO, FDC-1/ER. La Figura 7, Panel B
muestra: La inhibición de la proliferación celular dependiente de
EPO por EBP. Se estimó que la CI_{50} era de 5 nM \pm 1.
Tomados juntos, los ejemplos mostrados aquí,
sugieren que la EBP replegada producida de la misma manera descrita
aquí es altamente activa y se corresponde bien con la constante de
unión en equilibrio de EBP producida en las células CHO de 1 nM
(Yet, M.-G and Jones, S.S. (1993) The extracytoplasmic Domain of the
Erythropoietin Receptor Forms a Monomeric Complex with
Erythropoietin. Blood 82, 1713-1719) y la pequeña
cantidad de proteína de fusión EBP-GST expresada
bacterianamente correctamente plegada de un sistema de expresión
bacteriano alternativo (Harris, K.W., Mitchell, R.A., and
Winkleman, J.C. (1992) Ligand Binding Properties of the Human
Erythropoietin Receptor Extracelular Domain Expressed in E.
coli. J. Biol. Chem. 267, 15205-15209) pero
tiene ventajas que incluyen que tiene una elevada pureza, que no
es una proteína de fusión, que no está glicosilada, y que es
producida y purificada con un elevado rendimiento.
Genéricamente, todos los péptidos miméticos de
EPO cíclicos descritos aquí fueron sintetizados utilizando la
metodología de síntesis de péptidos en fase sólida de Merrifield en
Applied Biosystems Models 430A y 431A Peptide Synthesizers. Los
derivados de aminoácidos protegidos con BOC
(t-butoxicarbonilo) fueron acoplados en forma de
ésteres de hidroxibenzotriazol tras las etapas de desprotección con
ácido (Acido trifluoroacético al 50%/diclorometano al 50%) y
neutralización (diisopropiletilamina al
5%/N-metilpirrolidona). Las etapas de desprotección
con ácido, neutralización y acoplamiento fueron repetidas hasta
obtener la resina peptídica completa. El péptido unido a la resina
completo fue tratado con TFA al 50% para rendir la resina con el
péptido N-terminal libre. Los grupos protectores de
las cadenas laterales fueron separados y el péptido escindido de la
resina mediante tratamiento con HF-anisol líquido
(10% en volumen) durante 90 minutos a -6ºC. El péptido libre se
hizo precipitar después con éter etílico frío. Se emplearon lavados
con éter adicionales para separar el captador residual (anisol). El
péptido-resina seco fue extraído después en HOAc al
50%, diluido con agua y liofilizado. Las cisteínas fueron oxidadas
suspendiendo el péptido bruto en TFA al 0,1%/acetonitrilo seguido
de dilución con agua hasta una concentración de péptido de 1 mg/ml,
lo que rendía una solución clara (típicamente AcN/agua
30-50%). Se añadió bicarbonato de amonio sólido a la
solución del péptido hasta obtener un pH de aprox. 8,0. Se añadió
gota a gota ferricianuro de potasio (0,1 M) a la solución de
péptido agitada hasta que persistía una solución de color amarillo
claro. Esta solución del péptido se controló mediante HPLC en fase
reversa analítica en cuanto a la formación de producto oxidado. Los
péptidos cíclicos eluían típicamente tras la sustancia de partida
reducida en una columna Vydac C18. El tiempo de la reacción de
ciclación variaba de 20 minutos a 18 horas a la temperatura
ambiente, dependiendo de la secuencia peptídica concreta. Antes de
la purificación, se añadió resina de intercambio aniónico
Bio-Rad AG 2-X8 (forma cloruro) a
la solución de péptido de color amarillo para separar el agente
oxidante (hierro). La resina de intercambio aniónico fue separada
mediante filtración y lavada con un volumen de agua igual al
volumen de la solución peptídica. Los productos filtrados combinados
fueron cargados sobre una columna de HPLC preparativa (Vydac C18) y
el péptido diana con una pureza del 90-95% fue
aislado utilizando un gradiente de agua-acetonitrilo
con TFA al 0,1%. Si también se obtenía un péptido lineal
significativo (típicamente el péptido reducido eluía próximo al
péptido cíclico deseado) durante la cromatografía, la etapa de
oxidación con ferricianuro de potasio se repetía para maximizar el
rendimiento global del péptido diana reducido. Las fracciones
recogidas de la cromatografía preparativa que contenían el péptido
de elevada pureza deseado eran reunidas y liofilizadas. El producto
final de cada síntesis fue caracterizado mediante HPLC analítica en
cuanto a la pureza (normalmente >95%), mediante espectroscopia de
masas por pulverización de iones en cuanto al peso molecular y
mediante análisis de aminoácidos en cuanto al contenido peptídico.
Todas las preparaciones del péptido cíclico eran negativas con
respecto a los grupos sulfhidrilo libres utilizando Reactivo de
Ellman. Los péptidos utilizados para los estudios descritos aquí se
muestran en la Tabla 2.
| RWJ# | (X) | Secuencia Peptídica* |
| 61233 | \hskip0,8cm GGTYSCHFGPLTWVCKPQGG [SEC ID NUM: 1] | |
| 61279 | \hskip0,8cm YSCHFGPLTWVCK [SEC ID NUM: 2] | |
| 61177 | \hskip0,8cm SCHFGPLTWVCK [SEC ID NUM: 3] | |
| 62021 | 3,5-dibromo-tyr | \hskip0,8cm GGTXSCHFGPLTWVCKPQGG [SEC ID NUM: 4] |
| 61718 | \hskip0,8cm GGLYACHMGPMTWVCQPLRG [SEC ID NUM: 5] | |
| * todos los péptidos son cíclicos por medio de un enlace disulfuro intramolecular y amidados en el extremo C. |
Los análisis de unión competitivos de los
péptidos fueron transformados como se ha descrito aquí. Se
disolvieron los péptidos individuales en DMSO para preparar una
solución de partida 1 mM. Todos los tubos de reacción (por
duplicado) contenían 50 \mul de cuentas de EBP,
EPO[I^{125}] 0,5 nM (NEN Research Products, Boston, 100
\muCi/\mug) y péptido 0-500 \muM en un total
de 500 \mul de tampón de unión (PBS/BSA al 0,2%). La concentración
final de DMSO fue ajustada al 2,5% en todos los tubos de análisis
peptídico, un valor sin efecto detectable ya que un examen de la
sensibilidad del análisis para DMSO demostró que las concentraciones
de DMSO de hasta el 25% (V/V) no tenían efecto deletéreo sobre la
unión. La unión no específica fue medida en cada análisis individual
mediante inclusión de tubos que contenían un gran exceso de EPO no
marcada (1.000 nM). Los puntos de análisis iniciales sin péptido
añadido fueron incluidos en cada análisis para determinar la unión
total. Las mezclas de unión fueron incubadas durante la noche a la
temperatura ambiente con sacudimiento suave. Las cuentas fueron
recogidas después utilizando Microcolumns (Isolab, Inc.) y lavadas
con 3 ml de tampón de lavado (PBS/BSA al 5%). Las columnas que
contenían las cuentas lavadas fueron colocadas en tubos de vidrio de
12 x 75 mm y los niveles de radiactividad unida fueron determinados
en un contador gamma. La cantidad de EPO[I^{125}] unida fue
expresada como el porcentaje de unión de control (total = 100%) y
trazada versus la concentración de péptido tras la corrección para
la unión no específica. La CI_{50} fue definida como la
concentración del analito que reducía la unión de
EPO[I^{125}] a las cuentas de EBP en un 50%.
Se utilizó la línea celular
FDC-P1/hER, una línea dependiente de EPO que
expresaba el receptor de EPO humano nativo para determinar la
actividad mimética de EPO de los péptidos candidatos. La línea
celular muestra una proliferación celular dependiente de EPO y el
análisis fue realizado como sigue. Las células fueron mantenidas en
medio RPMI 1640 (Gibco/BRL) conteniendo suero de ternera fetal
inactivado con calor al 10% y 10 unidades/ml de EPO humana
recombinante. Para el análisis de proliferación celular, las células
se hicieron crecer hasta la fase estacionaria, y se cultivaron en
placa en medio sin EPO durante 24 horas.
A las 24 horas, se contaron las células, se
resuspendieron a 800.000 células/ml y se dispensaron a 40.000
células/pocillo. Las soluciones de partida de los respectivos
péptidos (10 mM en DMSO) fueron preparadas y dispensadas por
triplicado a concentraciones finales de 1 x 10^{-10} M a 1 x
10^{-5} M y ajustadas a un volumen final de 0,2 ml. Se demostró
que concentraciones finales de DMSO del 0,1% (V/V, máximo) o menos
no tenían toxicidad celular o efectos estimuladores. Se generó una
curva dosis respuesta con EPO normalizada con cada serie de
análisis. Al cabo de 42 horas de incubación a 37ºC (aproximadamente
2 multiplicaciones celulares) se añadió 1 \muCi/pocillo de
timidina[H^{3}] y la incubación continuó durante 6 horas
momento en el cual las células fueron cosechadas y contadas para
evaluar la incorporación de timidina[H^{3}] como medida de
la proliferación celular. Los resultados fueron expresados como la
cantidad de péptido necesaria para rendir la mitad de la actividad
máxima obtenida con EPO recombinante, y se muestran en la Tabla
3.
La dimerización del receptor mediada por el
péptido fue estabilizada para el estudio utilizando el reactivo de
entrecruzamiento reactivo con sulfhidrilo homobifuncional no soluble
en agua DPDPB
(1,4-di-[2'-piridilditio)-propionamido]butano,
Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Se incubó EBP (22 \muM) en
presencia o ausencia de DPDPB (1,1 mM), ligando peptídico 400
\muM, 75 \mul de PBS, pH 7,5 conteniendo todas las reacciones y
controles una concentración final de DMSO al 4,4% y TFA al 0,007%.
Estas muestras fueron incubadas durante 4 horas a la temperatura
ambiente y almacenadas a 4ºC durante 12 horas antes del análisis en
condiciones reductoras y no reductoras mediante
SDS-PAGE (geles en gradiente 10-20%,
Integrated Separations Systems, Natick, MA).
Claims (4)
1. Un procedimiento para la purificación de una
proteína de unión a eritropoietina a partir de fermentaciones en
células microbianas, que comprende:
- a)
- Cosechar células microbianas de una fermentación;
- b)
- añadir a las células microbianas cosechadas una cantidad suficiente de tampón de lisis para producir un producto lisado bruto;
- c)
- recoger las proteínas insolubles del producto lisado bruto;
- d)
- solubilizar las proteínas insolubles en un tampón de solubilización;
- e)
- replegar las proteínas solubilizadas de la etapa d) en un tampón de replegado adecuado que produce una proteína replegada;
- f)
- unir la proteína replegada de la etapa e) con una matriz de cromatografía de interacción hidrófoba;
- g)
- hacer eluir y recoger la proteína de unión a eritropoyetina activa de la matriz de cromatografía de interacción hidrófoba;
- h)
- poner en contacto la proteína de unión a eritropoyetina activa de la etapa g) con una matriz de cromatografía de exclusión por tamaños;
- i)
- hacer eluir y recoger la proteína de unión a eritropoyetina activa de la matrix de cromatografía de exclusión por tamaños de la etapa h) que produce proteína de unión a eritropoyetina pura;
- j)
- opcionalmente concentrar y/o diafiltrar el producto de la etapa i) en un portador farmacéuticamente aceptable; y
- k)
- opcionalmente esterilizar el producto proteico.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, donde
la solución de lisis de la etapa b) es Tris-HCl 10
mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, conteniendo 51 mg de fluoruro de
fenilmetilsulfonilo, 600 mg de lisozima de clara de huevo,
MgCl_{2} 1 mM y 12.500 unidades de Benzonase.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, donde la matriz de cromatografía interacción
hidrófoba es fenil-toyopearl 650 M.
4. El procedimiento de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, donde la matriz de cromatografía
interacción hidrófoba es una matrix de cromatografía de exclusión
por tamaños de alta resolución, tal como Bio-Sil
SEC-25 o TosoHaas G3000 SW.
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