DE69629949T2

DE69629949T2 - Aktivierte verbindungen und verfahren zur herstellung und reiningung

Info

Publication number: DE69629949T2
Application number: DE69629949T
Authority: DE
Inventors: N. Prabha IBRAHIM; A. Robert BAILE; Ervin James SEELY
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1996-03-06
Filing date: 1996-12-06
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2016-12-07
Also published as: US5747639A; CA2248006C; AU720399B2; WO1997032607A3; PT906122E; ES2206616T3; WO1997032607A2; AU1410897A; EP0906122A2; US5935564A; DK0906122T3; JP2000506851A; EP0906122B1; CA2248006A1; DE69629949D1; ATE249244T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung PEG-aktivierter Linker, insbesondere aktivierter Linker mit reaktiven Michael-Akzeptoren, und ein effizientes Verfahren zur Reinigung der aktivierten Linker und pegylierten biologischen aktiven Moleküle.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Polyethylenglykole ("PEGs") sind langkettige, lineare synthetische Polymere, die aus Ethylenoxid-Einheiten bestehen. Die Ethylenoxid-Einheiten können so variieren, daß PEG-Verbindungen mit Molekulargewichten erhalten werden können, die von 200 bis 100.000 reichen. PEG ist typischerweise farblos, geruchlos, löslich in Wasser, hitzestabil, hydrolysiert oder zersetzt sich nicht und ist ungiftig. Als solche sind PEGs ausführlich untersucht worden für die Verwendung in Pharmazeutika, auf künstlichen Implantaten und für andere Anwendungen, wo biologische Kompatibilität von Bedeutung ist.
Verschiedene Derivate von PEG mit einer aktiven Einheit, die ermöglicht, daß PEG an verschiedene Oberflächenmoleküle gebunden werden kann, sind bekannt. Zum Beispiel sind PEG-Derivate verwendet worden, um PEG an Oberflächen zu koppeln, um Benetzung, statische Aufladung und Bindung anderer Moleküle an die Oberfläche zu steuern. Spezifisch sind PEG-Derivate hergestellt worden durch Reaktion von PEGs mit einem Reagens, das eine reaktive Carbonyl-, Nitril- oder Sulfongruppe aufweist, um die Hydroxylgruppe in einen reaktiven Michael-Akzeptor umzuwandeln, wodurch ein "aktivierter Linker" gebildet wird, der nützlich ist bei der Modifizierung verschiedener Proteine, um verbesserte biologisch aktive Konjugate zu liefern.
Es ist gezeigt worden, daß die Bindung von PEG an Proteine ("PEGylierung"): (1) die Plasmahalbwertszeit der Proteine erhöht, siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,349,052, Delgado et al., erteilt am 20. September 1994; (2) die biochemischen und physikalischen Eigenschaften des Proteins verändert, einschließlich Erhöhung der Löslichkeit, Chen et al., Biochem. Biophys. Acta, 660: 293–298(1988), und den Schutz gegen Proteolyse verbessert, Sada et al., J. Fermentation Bioengineering 71: 137–139(1991); und (3) die Antigenizität verringert, Davis et al., "Biomedical Polymers. Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biomedical Use", (Hrg. Goldberg & Nakajima) S. 441–452, Academic Press, N. Y.(1980).
Bei der Bindung von PEG an Oberflächen und Moleküle ist man auf Probleme gestoßen. Die große Mehrheit von PEGylierten Reagentien reagieren mit freien primären Aminogruppen des Polypeptids und die meisten dieser freien Amine sind die ε-NH₂-Gruppe von Lysin-Aminosäureresten. Weil typische Proteine eine große Anzahl von Lysin-Resten besitzen, tritt oft eine statistische Bindung mehrerer PEG-Moleküle ein, d. h. nicht-spezifische PEGylierung. Nicht-spezifische PEGylierung kann zu Verlust von Proteinaktivität führen, und wenn das PEGylierte Protein für therapeutische Verwendung gedacht ist, führt die multiple Spezies, die aus der Verwendung nicht-spezifischer PEGylierung resultiert, zu Schwierigkeiten bei der Herstellung eines Produktes mit reproduzierbaren und charakterisierbaren Eigenschaften. Als solche macht es nicht-spezifische PEGylierung schwierig, Therapeutika zu bewerten und Wirksamkeits- und Dosisinformation zu etablieren. Die ortsselektive PEGylierung solcher Proteine könnte zu reproduzierbar modifizierten Materialien führen, die die gewünschten Attribute der PEGylierung ohne den Verlust von Aktivität erlangen.
Die veröffentlichte PCT-Veröffentlichung Nr. WO 95/13312 beschreibt u. a. wasserlösliche, Sulfon-aktivierte PEGs, die hoch selektiv sind für die Kopplung mit Thiol-Einheiten anstelle von Amino-Einheiten auf Molekülen und auf Oberflächen. Diese PEG-Derivate sind gegen Hydrolyse für längere Zeiträume in wäßrigen Umgebungen bei pHs von etwa 11 oder weniger stabil und können Bindungen mit Molekülen bilden, um Konjugate zu bilden, die ebenfalls hydrolytisch stabil sind. Die Bindung, durch die die PEGs und das biologisch aktive Molekül gekoppelt sind, schließt eine Sulfon-Einheit ein, gekoppelt an eine Thiol-Einheit, und hat die Struktur PEG-SO₂-CH₂-CH₂-S-W, wobei W das biologisch aktive Molekül darstellt und wobei die Sulfon-Einheit Vinylsulfon oder ein aktives Ethylsulfon ist.
Ein Beispiel eines biologisch aktiven Moleküls, das durch solche Sulfon-aktivierten Linker modifiziert werden kann, ist TNF-Bindungsprotein ("TNFbp")(auch bezeichnet als TNF-Inhibitor). TNFbp ist von therapeutischem Interesse bei der Behandlung von TNFvermittelten Erkrankungen, einschließlich rheumatoider Arthritis und septischem Schock. TNF-Bindungsproteine sind im Stand der Technik offenbart; siehe z. B. EP 308 378 , EP 393 438 , EP 422 339 , WO 90/13575, EP 398 327 , EP 412 486 , WO 91/03553, EP 418 014 , JP 127,800 /1991 EP 433 900 , U.S.-Patent Nr. 5,136,021, EP 512 528 , EP 526 905 , WO 93/07863, EP 568 928 , WO 93/21946, WO 93/19777, EP 417 563 , GB 2,246,569, U.S. Provisional Patent Application Nr. 60/021443, angemeldet am 9. Juli 1996; und U.S. Provisional Patent Application Nr...................., angemeldet 6. Dezember 1996.
PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/16221, hierin durch Bezugnahme mit einbezogen, beschreibt TNFbp-Formen, dargestellt durch die Formel R₁-X-R₂ (bezeichnet als eine "Hantel"-Verbindung), wobei R₁ und R₂ biologisch aktive TNFbp-Gruppen sind und X ein nicht-peptidischer polymerer Spacer ist mit wenigstens einer Michael-Akzeptor-Gruppe, z. B. ein Sulfon-aktiviertes PEG. Eine besondere Verbindung, bezeichnet als c105-TNFbp-Mutein-Hantel, ist eine Homo-Hantel-Verbindung, in der R₁ und R₂ ein c105-30kDa-TNFbp-Mutein sind, X ein 20 K-Polyethylenglykolbisvinylsulfon(20 kDa PEGbv) ist und in der R₁ und R₂ ortsspezifisch am Cystein-105-Rest an das PEGbv gebunden sind.
Ein Problem, auf das die Fachleute üblicherweise treffen, wenn sie mono-, di- oder polypegylierte Verbindungen herstellen, ist, daß die Verfahren, die verwendet werden, um das 20 kDa PEGbv, oder einen anderen aktivierten Linker, zu synthetisieren, mehrere Nachteile haben, in Abhängigkeit von dem verwendeten Syntheseverfahren. Zum Beispiel sind herkömmliche Verfahren zum Aktivieren von PEG mit einer funktionellen Gruppe, die nützlich ist als Linker, um an verschiedene Moleküle und Oberflächen zu binden, im allgemeinen arbeits- und zeitintensiv. Solche Verfahren erfordern oft ein mehrstufiges Reaktionsverfahren, um das gewünschte Produkt herzustellen. Demgemäß besteht ein Bedürfnis nach effizienten Verfahren zur Herstellung aktivierter Linker, die verwendet werden können, um gewünschte Konjugate zu bilden.
Ein weiterer besonders problematischer Nachteil ist, daß das resultierende 20 kDa PEGbv oft PEG-Verunreinigungen mit hohem Molekulargewicht und PEG-monovinylsulfon- und PEGbisvinylsulfon-Spezies enthalten wird. Diese Verunreinigungen können dann die Gesamtausbeute der gewünschten Verbindung nachteilig beeinflussen. Es besteht daher auch das Bedürfnis nach Verfahren, die das PEGbv, oder andere aktivierte Linker, weiter reinigen und dadurch die Gesamtreinheit und Ausbeute der gewünschten Verbindung erhöhen würden.
Eine Reihe von Gruppen hat über die Verwendung von Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (rpHPLC) berichtet, um PEGs mit niedrigem und mittlerem Molekulargewicht (< 5K) auf der Basis der Größe zu trennen; siehe z. B. Murphy et al., J. Chromat., 211: 160–165(1981); Lai et al., J. High Res. Chrom. & Chrom. Comm., 7: 494–496(1984); Barkas & Hoffman, J. Chromat., 389: 273–278(1987). Diese Techniken leiden, obgleich sie relativ effektiv sind, an ihrer Verwendung teurer Harze und organischer Lösungsmittel. Auch sind diese Verfahren eher analytische als präparative Verfahren. Es hat keine Berichte über die erfolgreiche Trennung von PEGs mit größerem Molekulargewicht unter Verwendung von HPLC gegeben. PEGs mit mittlerem und hohem Molekulargewicht (1K – 40K) sind durch Ausschlußchromatographie auf einer Vielzahl derivatisierter Silicaträger analysiert worden; Engelhardt & Mathes, J. Chromat., 185: 305(1979).
Hydrophobchromatographie (HIC) hat Akzeptanz als eine analytische und präparative Reinigungsmethode für biologische Moleküle erzielt. Die chemischen Prinzipien, die HIC zugrundeliegen, sind ähnlich zu denjenigen, die bei Salzausfällung involviert sind, und verwandt mit denjenigen, die mit Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie (RPLC) assoziiert sind, indem alle auf der Basis von Hydrophobie funktionieren. HIC ist gekennzeichnet durch Adsorption von Molekülen an eine schwach hydrophobe Oberfläche bei hohen Salzkonzentrationen, gefolgt von Elution mit einem sinkenden Salzgradienten. So kombiniert HIC die nicht-denaturierenden Merkmale von Salzausfällung und die Präzision der Chromatographie, um Ausbeuten mit exzellenter Aktivität zu liefern. Weil HIC überdies bei niedrigerer Bindungsenergie arbeitet, erfordert sie nicht die Verwendung teurer organischer Lösungsmittel in der mobilen Phase.
Bisher hat es keine Berichte gegeben, die die Verwendung von HIC-Harzen betreffen, um PEGs zu trennen, insbesondere PEGs mit hohem Molekulargewicht. Der Fachmann würde nicht erwarten, daß HIC bei der Trennung von PEGs auf der Basis der Größe effektiv ist, da PEGs, ungeachtet der Größe, dieselbe Hydrophobie auf einer relativen Basis haben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung liefert neuartige Verfahren zur Herstellung und Reinigung aktivierter Polyethylenglykol-Linker, die für eine Vielzahl von Zwecken nützlich sind.
Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines aktivierten Polyethylenglykol-Linkers zur Verfügung gestellt, welches die Schritte umfaßt:

(a) Erhalten eines Polyethylenglykol-Polymers (PEG) mit einer reaktiven Hydroxylgruppe;
(b) Umwandeln besagter Hydroxylgruppe in einen reaktiven Michael-Akzeptor, um wenigstens eine Form eines aktivierten Linkers zu erzeugen;
(c) Aufbringen besagten aktivierten Linkers auf eine Hydrophobchromatographie(HIC)-Säule, die polymeres Harz mit einer hydrophoben Seitengruppe, angeordnet auf der Oberfläche einer hydrophilen Vinyl-Copolymer-Hauptkette, verwendet, wobei besagte hydrophobe Seitengruppe ausgewählt ist aus Octyl, Butyl, Phenyl oder Ether; und
(d) selektives Isolieren einer aktivierten Linkerform durch Verwendung von Elutionsbedingungen, die Trennung verschiedener Formen auf der Grundlage von Größe und/oder Endgruppenfunktionalität ermöglichen.

Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines pegylierten biologisch aktiven Moleküls zur Verfügung gestellt, wobei besagtes Verfahren umfaßt:

(a) die Schritte (a) bis (d) oben;
(b) Umsetzen des HIC-gereinigten PEGs, erhalten gemäß den Schritten (a) bis (d) oben, mit einem biologisch aktiven Molekül, um ein pegyliertes, biologisch aktives Molekül herzustellen.

Vorzugsweise hat besagtes pegyliertes, biologisch aktives Molekül die Formel R₁-X-R₂, wobei: X ein HIC-gereinigtes PEG mit einer ersten reaktiven Gruppe und einer zweiten reaktiven Gruppe umfaßt und wobei besagte erste reaktive Gruppe ein Michael-Akzeptor ist; R₁ ein Molekül mit einer reaktiven Thiol-Einheit umfaßt, wobei besagte Thiol-Einheit kovalent an besagten Michael-Akzeptor gebunden ist; und R₂ ein Molekül oder eine biologisch nicht-aktive Gruppe umfaßt, die an besagtes PEG durch Reaktion mit besagter zweiten reaktiven Gruppe gebunden ist. Weiter bevorzugt ist X Polyethylenglykol-bisvinylsulfon und R₁ und R₂ c105-30kDa-TNF-Inhibitor.
Kurz gesagt können die Verfahren zur Herstellung der aktivierten Linker der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden, indem man ein PEG mit einer reaktiven Hydroxylgruppe erhält und die Hydroxylgruppe in einen reaktiven Michael-Akzeptor umwandelt, um einen aktivierten Linker zu bilden, mit der Verwendung von Tetrahydrofuran (THF) als dem Lösungsmittel für die Umwandlung. Das Verfahren zur Reinigung der aktivierten Linker verwendet HIC, um die Linker auf der Basis der Größe und Endgruppenfunktionalität zu trennen.
Genauer gesagt, ist die Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung und Reinigung von 20 kDa schwerem Polyethylenglykolbisvinylsulfon ("20 kDa PEGbv") gerichtet, das ein Butyloder Phenyl-HIC-Harz einsetzt, um PEG-Verunreinigungen mit hohem Molekulargewicht abzutrennen und PEG-monovinylsulfon vom PEG-bisvinylsulfon zu trennen. Dabei ist wichtig, daß die Reinigungen, die auf diese Weise durchgeführt werden, nicht die Zugabe von organischen Lösungsmitteln erfordern. Noch wichtiger ist dabei, daß die gereinigten aktivierten Linker verwendet werden können, um verschiedene Proteine zu modifzieren und biologisch aktive Konjugate mit dramatisch verbesserter Reinheit und Gesamtausbeute zu liefern, verglichen mit Konjugaten, die mit nicht-gereinigten aktivierten Linkern hergestellt sind.
Verbindungen mit einer reaktiven Hydroxygruppe sind Polyethylenglykol-Polymere (PEGs). Von diesen sind Polyethylenglykole mit einem Molekulargewicht im Bereich von 2 kDa bis 100 kDa besonders nützlich, insbesondere PEGs mit einem Molekulargewicht von 3,4 kDa, 5 kDa, 10 kDa oder 20 kDa. Solche PEGs können in der Form von PEG-Diolen vorliegen.
Nützliche Reagentien mit einer reaktiven Sulfongruppe, die in den Verfahren verwendet werden können, schließen, ohne Beschränkung, Vinylsulfon und Divinylsulfon ein. Wenn verwendet im Zusammenhang mit einem PEG mit einer oder zwei reaktiven Hydroxygruppen, erzeugen die Verfahren PEG-Vinylsulfon bzw. PEG-Bisvinylsulfon. Solche aktivierten Linker können verwendet werden, um monopegylierte Verbindungen herzustellen ebenso wie Hantel-Verbindungen und multimere Verbindungen, in denen die Linker sich an mehr als eine Einheit binden können. Die Zugabe von THF als dem Lösungsmittelm einem Verhältnis im Bereich von 1 : 10 bis 1 : 50 (Gewicht/Volumen) von PEG zu THF hat sich in den Verfahren der vorliegenden Erfindung als nützlich erwiesen. Ein Verhältnis von 1 : 30 hat sich als besonders nützlich erwiesen.
Das biologisch aktive Molekül, das zur Verwendung in Betracht gezogen wird, kann ein synthetisches, ein natürlich vorkommendes oder ein modifiziertes, natürlich vorkommendes Molekül sein.
In einem Aspekt der Erfindung wird ein aktivierter PEG-Linker, mit einem Molekulargewicht im Bereich von 2 kDa bis 100 kDa, auf ein HIC-Harz unter Verwendung herkömmlicher chromatographischer Verfahren aufgebracht und daraus eluiert. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Linker aus dem Harz unter Verwendung eines umgekehrt linearen Salzgradienten eluiert, so daß die verschiedenen Linkerformen auf der Basis von Größe und/oder Endgruppenfunktionalität getrennt werden. Vorzugsweise ist der Linker ein Sulfonaktivierter PEG-Linker und das HIC-Harz umfaßt ein Butyl- oder Phenyl-HIC-Harz. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Erfindung auf ein Verfahren zur Reinigung von 20 kDa schwerem Polyethylenglykolvinylsulfon oder -bisvinylbenzol ("20 kDa PEGbv") unter Verwendung eines Toyopearl^® Butyl-650M-HIC-Harzes gerichtet.
In noch einem weiteren Aspekt der Erfindung wird der HIC-gereinigte PEG-Linker mit einem biologisch aktiven Molekül umgesetzt, um eine Hantel-Verbindung mit verbesserter Gesamtreinheit und -ausbeute zu liefern, verglichen mit zuvor beschriebenen Verbindungen, die dasselbe Molekül enthalten. Vorzugsweise ist der HIC-gereinigte Polymerlinker ein Sulfon-aktiviertes PEG und das biologisch aktive Molekül ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus TNF-Inhibitoren, Interleukin-1-Rezeptor-Antagonisten ("IL-lra's"), Exon-Sechs-Peptid von aus Thrombozyten gewonnenem Wachstumsfaktor ("PDGF") und Interleukin-2("IL-2")-Inhibitoren und -rezeptoren ("IL-2r"). In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der HIC-gereinigte Polymerlinker ein 20 kDa schweres PEG-vinylsulfon oder PEGbv und ist das biologisch aktive Molekül TNFbp.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Verbindungen der vorliegenden Erfindung enthalten, sind ebenfalls im Schutzumfang der Erfindung eingeschlossen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt das Elutionsprofil verschiedener PEG-Diole aus einer ToyoPearl^® Butyl-650M-HIC-Säule. PEG-haltige Fraktionen wurden mit Nessler-Reagens nachgewiesen und die Molekulargewichte durch SEC-HPLC bestätigt, wie beschrieben in Beispiel 3.
2 zeigt das Elutionsprofil von 20 kDa PEGbv und PEGbv mit hohem Molekulargewicht aus einer ToyoPearl^® Phenyl-6505-HIC-Säule (2 mg/ml Bettvolumen Beladung). PEGbv-Konzentration wurde mit Nessler-Reagens bestimmt und die % Molekulargewichtsverunreinigung wurde mit SEC-HPLC bestimmt, wie beschrieben in Beispiel 3.
3 zeigt das Elutionsprofil von 20 kDa PEGbv (2 mg/ml Bettvolumen Beladung) aus einer ToyoPearl^® Butyl-650M-HIC-Säule. PEG-haltige Fraktionen wurden mit Nessler-Reagens bestimmt und die Trübheit bei 600 nm gemessen.
4 zeigt das Elutionsprofil von nicht-HIC-gereinigtem 20 kDa PEGbv aus einer SEC-HPLC-Säule. Vergleichsbeispiel.
5 zeigt das Elutionsprofil von HIC-gereinigtem 20 kDa PEGbv aus einer SEC-HPLC-Säule. Eine ToyoPearl^® Butyl-650M-HIC-Säule (8 mg/ml Bettvolumen Beladung) wurde für die HIC-Reinigung verwendet.
6 zeigt ein typisches POROS^® HS-Kationenaustausch-Elutionsprofil für eine TNFbp-PEGylierungsmischung (die Mischung verwendete nicht-HIC-gereinigtes 20 kDa PEGbv). Die verschiedenen TNFbp-Peaks sind dargestellt wie angegeben. Vergleichsbeispiel.
7 zeigt das POROS^® HS-Kationenaustausch-Elutionsprofil für eine TNFbp-PEGylierungsmischung (Vergleichsbeispiel). Die PEGylierungsmischung wurde hergestellt, wie beschrieben in Beispiel 5, und verwendete mit ToyoPearl^® Butyl 650M HIC gereinigtes 20kDa PEGbv.
8 beschreibt das POROS^® HS-Kationenaustausch-Elutionsprofil für eine TNFbp-PEGylierungsmischung. Die PEGylierungsmischung wurde hergestellt, wie beschrieben in Beispiel 5, und verwendete nicht-HIC-gereinigtes 20 kDa PEGbv. Vergleichsbeispiel.
9 zeigt das Elutionsprofil von c105-TNFbp-Mutein-Hantel aus einer SP-Sepharose-HP-Säule. A₂₈₀-Extinktion ist aufgetragen gegen die Zeit (Vergleichsbeispiel). Die c105-TNFbp-Mutein-Hantel wurde hergestellt unter Verwendung von mit ToyoPearl^® Butyl 650M HIC gereinigtem 20 kDa PEGbv.
10 zeigt das Elutionsprofil von c105-TNFbp-Mutein-Hantel aus einer SP-Sepharose-HP-Säule. A₂₈₀-Extinktion ist aufgetragen gegen die Zeit. Die c105-TNFbp-Mutein-Hantel wurde hergestellt unter Verwendung von nicht-HIC-gereinigtem 20 kDa PEGbv. Vergleichsbeispiel.
11 zeigt das POROS^® HS-Kationenaustausch-Elutionsprofil für eine "früh-eluierende" Fraktion aus einer ToyoPearl^® Butyl-650M-HIC-Reinigung von 20 kDa PEGbv. Die PEGylierungsmischung wurde hergestellt, wie beschrieben in Beispiel 6.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Die Verfahren zur Herstellung und Reinigung der aktivierten Polyethylenglykole sind detaillierter in der Diskussion unten beschrieben und werden durch die unten vorgelegten Beispiele veranschaulicht. Die Beispiele zeigen verschiedene Aspekte der Erfindung und schließen Ergebnisse der Verwendung eines "einstufigen" Verfahrens zur Herstellung eines Sulfon-aktivierten PEGs, 20 kDa schweres Polyethylenglykolvinylsulfon oder -bisvinylsulfon ("20 kDa PEGbv"), und der Verwendung von Butyl- und/oder Phenyl-HIC-Harzen, um PEG-Verunreinigungen mit hohem Molekulargewicht abzutrennen, ein. Die Ergebnisse waren insofern überraschend, als HIC auch PEG-monovinylsulfon vom 20 kDa PEGbv trennte, und das resultierende gereinigte 20 kDa PEGbv, wenn verwendet, um TNFbp zu PEGylieren, lieferte ein biologisch aktives Konjugat mit dramatisch verbesserter Gesamtausbeute und reinheit lieferte, verglichen mit Konjugaten, die unter Verwendung eines nicht-HICgereinigten 20 kDa PEGbv oder eines unter Verwendung eines mehrstufigen Verfahrens synthetisierten 20 kDa PEGbv hergestellt worden waren.
Die Verfahren zur Herstellung der aktivierten Linker der vorliegenden Erfindung werden durchgeführt, indem ein PEG mit einer reaktiven Hydroxylgruppe erhalten, und die Hydroxylgruppe in einen reaktiven Michael-Akzeptor umgewandelt wird, um einen aktivierten Linker zu bilden, unter Verwendung von Tetrahydrofuran (THF) als dem Lösungsmittel für die Umwandlung. Fakultativ kann das PEG mit einer reaktiven Hydroxylgruppe zunächst in Toluol gelöst und vor der Umwandlung der Hydroxylgruppe in einen Michael-Akzeptor getrocknet oder eingedampft werden. Der Umwandlungsschritt wird dann durchgeführt durch Hinzugeben von THF als dem Lösungsmittel zur getrockneten Verbindung. Obgleich eine Vielzahl von Lösungsmitteln, einschließlich Dichlormethan (DCM), Dimethylformamid (DMF) und DMSO, während des Umwandlungsschritts verwendet werden können, ist THF bevorzugt. Da THF ein Chelator von Kationen ist, hilft seine Verwendung als ein Lösungsmittel, das Basen-Kation während der Umwandlungsreaktion zu chelatisieren, was das negativ geladene Sauerstoff zur Reaktion mit Reagens übrigläßt, das eine Carbonyl-, Nitril- oder Sulfongruppe enthält, um den Michael-Akzeptor zu bilden. Geeignete Basen zur Verwendung in den Verfahren schließen z. B. Piperidin, Pyridin, Triethylamin, Benzyltrimethylammoniumhydroxid (Triton B) und Kaliumhydroxid ein. Starke Basen, die ein Kation enthalten, sind bevorzugt. Beispiele für solche starken Basen schließen Natrium- oder Kalium-tert-butoxid, Natrium- oder Kaliumalkoxide und Metallamide sowie Natrium- und Kaliumhydride ein.
Als nächstes wird ein Reagens mit einer reaktiven Carbonyl-, Nitril- oder Sulfongruppe zugegeben, gefolgt von der Zugabe einer Base. Die aktivierten Linker, die mit diesen Verfahren gebildet werden, können anschließend unter Verwendung eines geeigneten Lösungsmittels ausgefällt und mit irgendeinem aus dem Stand der Technik bekannten Mittel isoliert werden, einschließlich Filtration, um gereinigte aktivierte Linker zu erhalten. Geeignete Lösungsmittel schließen z. B. Ether, insbesondere Diethylether und Dipropylether, Alkohole, Hexan, Xylol und dergleichen ein.
Die Verfahren zur Herstellung der aktivierten Linker der vorliegenden Erfindung werden als "einstufige" Verfahren bezeichnet, verglichen mit den bekannten Verfahren, die mehrere Schritte erfordern. Das einstufige Verfahren kann z. B. wie folgt dargestellt werden:
Eine "reaktive Hydroxylgruppe" bedeutet eine -OH-Gruppe, in der der Wasserstoff die Base reduzieren kann, was den Sauerstoff frei zurückläßt, um mit einem Reagens mit einer Carbonyl-, Nitril- oder Sulfongruppe zu reagieren, um den Michael-Akzeptor zu bilden.
Das PEG kann jede Länge oder jedes Molekulargewicht aufweisen, aber diese Merkmale können die biologischen Eigenschaften beeinflussen. Nützliche durchschnittliche Molekulargewichte des Polymers zur Senkung der Ausscheidungsraten in pharmazeutischen Anwendungen liegen im Bereich von 2.000 bis 35.000 Daltons. Besonders nützliche PEG-Molekulargewichte schließen 3,4 kDa, 5 kDa, 10 kDa und 20 kDa ein.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Ausdruck "PEG" jedes von mehreren Kondensationspolymeren von Ethylenglykol. PEG ist auch bekannt als Polyoxyethylen, Polyethylenoxid, Polyglykol und Polyetherglykol. PEG kann auch hergestellt werden als Copolymere von Ethylenoxid und vielen anderen Monomeren. Die Endgruppen des PEG können in vielfältiger Weise derivatisiert werden, um Vinylsulfon-Einheiten, Aldehyd-Einheiten, Methoxygruppen oder andere Typen von reaktiven oder nicht-reaktiven Endgruppen einzuschließen. Für viele pharmazeutische oder biotechnologische Anwendungen wird im wesentlichen lineares, geradkettiges Vinylsulfon-aktiviertes PEG verwendet werden, das im wesentlichen, mit Ausnahme des Vinylsulfons, unsubstituiert ist.
Die Hydroxylgruppe solcher Verbindungen wird mit einem Reagens umgesetzt, das eine reaktive Carbonyl-, Nitril- oder Sulfongruppe aufweist, um die Hydroxylgruppe in einen Michael-Akzeptor umzuwandeln. Jedes Reagens mit einer reaktiven Carbonyl-, Nitril- oder Sulfongruppe, das den Fachleuten bekannt ist, wird zur Verwendung in den vorliegenden Verfahren in Betracht gezogen. "Reaktives Carbonyl, Nitril oder Sulfon" bedeutet eine Carbonyl-, Nitril- oder Sulfongruppe, an die eine Zwei-Kohlenstoff-Gruppe gebunden ist, mit einer reaktiven Stelle für Thiol-spezifische Kopplung auf dem zweiten Kohlenstoff von der Carbonyl-, Nitril- oder Sulfongruppe, bei pH 9 oder weniger.
In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung haben die polymeren Derivate der vorliegenden Erfindung aktive Sulfon-Einheiten. "Aktives Sulfon" bedeutet eine Sulfongruppe, an die eine Zwei-Kohlenstoff-Gruppe gebunden ist, mit einer reaktiven Stelle für Thiol-spezifische Kopplung auf dem zweiten Kohlenstoffatom von der Sulfongruppe.
Beispiele für aktive Sulfone schließen Vinylsulfon und aktiviertes Ethylsulfon ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Das Sulfon-aktivierte Polymer kann weiter substituiert sein, so lange die Thiol-spezifische Reaktivität am zweiten Kohlenstoff bei pH 9 oder weniger aufrechterhalten wird.
Nach der Zugabe solcher Reagentien wird die Hydroxylgruppe in einen reaktiven Michael-Akzeptor umgewandelt. "Michael-Akzeptoren" oder "Michael-ähnliche Akzeptoren" werden austauschbar verwendet und bedeuten funktionelle Gruppen, die für Michael-Addition empfänglich sind. "Michael-Addition" umfaßt einen nukleophilen Angriff auf ein elektrophiles Zentrum, das benachbart zu einem pi-System ist, mit einem elektronegativen Atom. Beispiele für pi-Systeme mit einem elektronegativen Atom schließen Sulfoxid, Sulfonyl, Carbonyl und heterocyclische Aromaten ein. Das Nukleophil addiert sich an das elektrophile Zentrum. Michael-Akzeptoren können dargestellt werden durch die Formel:
wobei E ein elektronegatives Atom ist. Addition findet statt an der 4-Position, um das folgende zu bilden:
wobei N_u das Nukleophil darstellt, das nun an das Atom an Position 4 gebunden ist. Michael-Akzeptor-funktionelle Gruppen schließen Maleimid und Vinylsulfon ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Der aktivierte Linker, der verwendet wird, um eine Hantel zu bilden, kann, muß aber nicht, eine Vinylsulfon-Spezies von Michael-Akzeptor enthalten.
Die aktivierten Linker der vorliegenden Erfindung können mehr als eine reaktive Gruppe besitzen. Die Derivate können monofunktionell, bifunktionell oder multifunktionell sein. Die reaktiven Gruppen können dieselben (hmofunktionell) oder unterschiedlich (heterofunktionell) sein, so lange es wenigstens eine aktive Sulfon-Einheit gibt. Zwei besonders nützliche homobifunktionelle Derivate sind PEG-bischlorsulfon und PEG-bisvinylsulfon.
Die resultierenden Linker, die mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellt werden, sind stabil, isolierbar und geeignet für Thiol-selektive Kopplungsreaktionen. PEGchlorethylsulfon ist z. B. in Wasser bei einem pH von 7 oder weniger stabil, kann aber nichtsdestoweniger mit Vorteil für Thiol-selektive Kopplungsreaktionen bei Bedingungen von basischem pH bis zu wenigstens pH 9 verwendet werden. Bei einem pH über 9 ist die Thiol-Selektivität vermindert und die Sulfon-Einheit wird etwas reaktiver mit Aminogruppen. Die bei Reaktion mit Thiol gebildete Bindung ist ebenfalls hydrolytisch stabil.
Wie hierin verwendet, bedeutet "hydrolytisch stabil", daß die Bindung zwischen dem Polymer und der Sulfon-Einheit und zwischen dem Sulfon-Thiol nach Konjugation bei einem pH von weniger als 11 für wenigstens drei Tage nicht mit Wasser reagiert. Hydrolytische Stabilität ist wünschenswert, weil, wenn die Hydrolysegeschwindigkeit signifikant ist, das Polymer desaktiviert werden kann, bevor die Reaktion zwischen Polymer und dem Thiol des biologisch aktiven Moleküls stattfindet.
Ein allgemeines Verfahren zum Reinigen der aktivierten PEG-Linker schließt die folgenden Schritte ein:

(1) Synthetisieren des aktivierten Linkers;
(2) Aufbringen des aktivierten Linkers auf ein HIC-Harz gemäß Anspruch 1; und
(3) Isolieren der gewünschten Linkerform durch Eluieren des Linkers aus dem HIC-Harz unter Verwendung von Bedingungen, z. B. umgekehrt linearer Salzgradient, die eine Trennung der verschiedenen Linkerformen auf der Basis von Größe und/oder Endgruppenfunktionalität erlauben.

Alternativ könnte der HIC-Reinigungsschritt eingebaut werden in das "einstufige" Syntheseverfahren unmittelbar vor dem Konzentrations/Diafiltrations-Schritt.
HIC, das zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird, verwendet polymere Harze, in denen eine hydrophobe Seitengruppe, ausgewählt aus Octyl, Butyl, Phenyl oder Ether, auf der Oberfläche eines hydrophilen Harzes mit Vinyl-Copolymer-Hauptkette angeordnet ist, einschließlich einer Methacryl-, Agarose- oder Vinyl-Hauptkette, aber nicht hierauf beschränkt. Eine Hauptkette auf Siliciumdoxidbasis könnte ebenfalls verwendet werden. Bevorzugte HIC-Säulen werden entweder einen Butyl- oder Phenyl-Liganden auf einer Methacryl-Hauptkette besitzen.
Wie oben angegeben, können die HIC-gereinigten, Sulfon-aktivierten Linker an biologisch aktive Moleküle gebunden werden, die eine "reaktive Thiol-Einheit" besitzen, um biologisch aktive Konjugate zu liefern. Eine "reaktive Thiol-Einheit" bedeutet eine Sulfhydryl(-SH)-Gruppe, die mit den aktivierten Linkern, wie hierin beschrieben, reagieren kann.
Biologisch aktive Moleküle, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden, schließen Pharmazeutika, Vitamine, Nährstoffe, Nukleinsäuren, Aminosäuren, Polypeptide, Enzym-Cofaktoren, Steroide, Kohlehydrate, organische Spezies wie etwa Heparin, metallhaltige Agentien, Rezeptoragonisten, Rezeptorantagonisten, Bindungsproteine, Rezeptoren oder Teile von Rezeptoren, extrazelluläre Matrixproteine, Zelloberflächenmoleküle, Antigene, Haptene und Chelatbildner ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Im allgemeinen besitzt TNFbp, das in der vorliegenden Erfindung nützlich ist, die Sequenz von menschlichem TNFbp oder verkürzten Varianten oder Muteinen davon. Ein TNFbp, bezeichnet als ein 30 kDa TNFbp, ist der extrazelluläre Teil des p55-TNF-Rezeptors. In vivo ist der extrazelluläre Teil des Rezeptors abgeschirmt und zirkuliert im Blutstrom als ein 30 kDa schweres glykosyliertes Protein, das TNF bindet. Die Reinigung und die Aminosäureund Nukleinsäure-Sequenzen dieses TNFbp sind angegeben in EP 393 438 und EP 422 339 . Diese Entgegenhaltungen lehren auch die rekombinante Herstellung von glykosylierten und deglykosylierten Formen von 30 kDa TNFbp. Obgleich das tatsächliche Molekulargewicht der deglykosylierten Form dieses Inhibitors 18 kDa ist, schließt der Ausdruck " 30 kDa TNF-Inhibitor" die glykosylierten und deglykosylierten Formen ein.
Die Reinigung und die Aminosäure- und Nukleinsäuresequenzen eines weiteren TNF-Inhibitors, 40 kDa TNFbp genannt, ist ebenfalls angegeben in EP 393 438 und EP 422 339 . Dieser Inhibitor, in seiner natürlich vorkommenden Form, ist der glykosylierte extrazelluläre Teil des p75-TNF-Rezeptors. Obgleich das Molekulargewicht der glykosylierten Form nicht 40 kDa beträgt, werden sowohl die glykosylierten als auch deglykosylierten Formen dieses TNFbp als "40 kDa TNF-Inhibitor" bezeichnet. Diese Entgegenhaltungen lehren auch die rekombinante Produktion von glykosylierten und deglykosylierten Formen von 40 kDa TNFbp.
Eine reaktive Thiolgruppe kann in ein biologisch aktives Molekül eingeführt werden, wenn gewünscht. Thiolgruppen können auch in ein inaktives Molekül eingeführt werden, um ein biologisch aktives Molekül zu bilden, sofern die Thiol-Sulfon-Bindung die gewünschte Aktivität nicht im wesentlichen zerstört.
Reaktive Thiolgruppen können mit chemischen Mitteln, die in der Technik gut bekannt sind, eingeführt werden. Chemische Modifikation kann mit Polypeptiden oder nicht-peptidischen Molekülen verwendet werden und schließt die Einführung von Thiol allein oder als Teil einer größeren Gruppe, z. B. eines Cysteinrestes, in das Molekül ein. Ein Beispiel für die chemische Einführung von Thiol ist angegeben in Jue, R. et al., Biochemistry, 17: 5399–5406(1978). Man kann auch ein freies Cystein in einem Polypeptid erzeugen, indem Cystein mit z. B. DTT chemisch reduziert wird.
Um Cystein-Muteine zu schaffen, kann eine nicht-essentielle Aminosäure durch ein Cystein ersetzt werden oder ein Cysteinrest kann dem Polypeptid hinzugefügt werden. Folypeptide, die modifziert sind, um einen Aminosäurerest in einer Position zu enthalten, wo im nativen Protein vor der Modifikation keiner vorhanden war, wird ein "Mutein" genannt. Potentielle Stellen zur Einführung eines nicht-nativen Cysteins schließen Glykosylierungsstellen und den N- oder C-Terminus des Polypeptids ein. Die Mutation von Lysin zu Cystein ist ebenfalls geeignet, weil Lysinreste oft auf der Oberfläche eines Proteins in einer aktiven Konformation anzutreffen sind. Zusätzlich kann ein Fachmann jede bekannte Information über die Bindungsstelle oder aktive Stelle des Polypeptids bei der Auswahl von möglichen Mutationsstellen verwenden.
Ein Fachmann kann ebenfalls gut bekannte rekombinante DNA-Techniken verwenden, um Cystein-Muteine zu schaffen. Man kann die Nukleinsäure, die das native Polypeptid codiert, durch standardmäßige ortsgerichtete Mutagenese verändern, um das Mutein zu codieren. Beispiele von Standard-Mutagenesetechniken sind angegeben in Kunkel, T. A., Proc. Nat. Acad. Sci., 82: 488–492(1985) und Kunkel, T. A. et al., Methods Enzymol., 154: 67–382 (1987), die beide hierin durch Bezugnahme mit einbezogen sind. Alternativ kann man die Nukleinsäure, die das Mutein codiert, durch im Stand der Technik gut bekannte Techniken chemisch synthetisieren. DNA-Synthesemaschinen können verwendet werden und sind z. B. erhältlich von Applied Biosystems (Foster City, CA). Die Nukleinsäure, die das gewünschte Mutein codiert, kann in einer Vielzahl von Expressionssystemen exprimiert werden, einschließlich Tier-, Insekten- und Bakteriensystemen.
Die Bindung zwischen dem biologisch aktiven Molekül mit einer reaktiven Thiolgruppe und dem Sulfon-aktivierten polymeren Linker ist eine kovalente Bindung und das allgemeine Verfahren zur Herstellung solcher Konjugate schließt die folgenden Schritte ein:

(1) Auswählen des gewünschten biologisch aktiven Moleküls;
(2) Synthetisieren des gewünschten Sulfon-aktivierten polymeren Linkers;
(3) Reinigen des Sulfon-aktivierten polymeren Linkers unter Verwendung einer HIC-Chromatographie gemäß Anspruch 1;
(4) Umsetzen des HIC-gereinigten, Sulfon-aktivierten polymeren Linkers mit dem biologisch aktiven Molekül;
(5) Isolieren des Reaktionsproduktes unter Verwendung chromatographischer Techniken, die im Stand der Technik gut bekannt sind; und
(6) Bestimmen der biologischen Aktivität des gebildeten Konjugats unter Verwendung des relevanten Bioassays.

Muteine des 30 kDa TNFbp, die hergestellt worden sind, schließen ein: c105 30 kDa TNFbp; cl 30 kDa TNFbp; c14 30 kDa TNFbp; cl 11 30 kDa TNFbp; und c161 30 kDa TNFbp. "c" bedeutet Cystein und "c105" bedeutet, daß ein Cystein an Position 105 eingeführt wurde. Diese Muteine sind hergestellt worden, wie angegeben in der veröffentlichten PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/16221, und die Numerierung beruht auf der darin angegebenen Aminosäuresequenz.
GB 2,246,569 (lehrt ein " 3 Domänen" 30 kDa und/oder 40 kDa TNFbp, d. h. die vierte Domäne ist abgeschnitten); U.S. Provisional Patent Application Nr. 60/021443, eingereicht am 9. Juli 1996 (lehrt ein " 2,6 Domänen" 30 kDa TNFbp, d. h. ein Teil der dritten und die vierte Domäne sind abgeschnitten); und U.S. Provisional Patent Application Nr...................., eingereicht am 6. Dezember 1996, lehrt ein " 2,6 Domänen" 30 kDa und/oder 40 kTJa TNFbp, d. h. ein Teil der dritten und die vierte Domäne sind abgeschnitten.
Muteine von IL-lra, die ebenfalls hergestellt worden sind, schließen ein: cOs116 IL-lra; c84s116 IL-1ra; c8s116 IL-lra; c9s116 IL-lra; und C141s116 IL-lra. Die Herstellung und Reinigung von IL-Ira-Muteinen sind ebenfalls angegeben in der veröffentlichten PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 92/16221. Die Restenumerierung beruht auf der in dieser veröffentlichten Anmeldung angegebenen Sequenz, wobei "0" Addition einer Aminosäure am N-Terminus bezeichnet; "c" Cystein bedeutet und "s" Serin bedeutet. "cOs 116" bedeutet z. B., daß ein Cystein am N-Terminus eingeführt wurde und ein Serin an Position 116 eingeführt wurde. Natives IL-lra hat freie Cysteinreste an den Positionen 66, 69, 116 und 122.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die viele der Konjugate oder Verbindungen (zusammengenommen: die "Konjugate"), hergestellt gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung, enthalten, können hergestellt werden. Diese Konjugate können in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger vorliegen, um die pharmazeutischen Zusammensetzungen zu bilden. Der Ausdruck "pharmazeutisch annehmbarer Träger", wie hierin verwendet, bedeutet ein ungiftiges, im allgemeinen inertes Vehikel für den aktiven Inhaltsstoff, das den Inhaltsstoff oder den Patienten, dem die Zusammensetzung verabreicht wird, nicht nachteilig beeinflußt. Geeignete Vehikel oder Träger sind zu finden in pharmazeutischen Standardtexten, z. B. in "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16. Ausgabe, Mack Publishing Co., Easton, PA(1980). Solche Träger schließen z. B. wäßrige Lösungen, wie etwa Bicarbonat-Puffer, Phosphat-Puffer, Ringer-Lösung und physiologische Kochsalzlösung, ein. Zusätzlich kann der Träger weitere pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe zum Modifizieren oder Aufrechterhalten des pHs, der Osmolarität, der Viskosität, der Klarheit, der Farbe, der Sterilität, der Stabilität, der Lösungsgeschwindigkeit oder des Geruchs der Formulierung enthalten.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können mit im Stand der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden, einschließlich, beispielhaft, dem einfachen Vermischen von Reagentien. Die Fachleute werden wissen, daß die Auswahl des pharmazeutischen Trägers und die geeignete Zubereitung der Zusammensetzung von der beabsichtigten Verwendung und dem beabsichtigten Verabreichungsmodus abhängen.
In einem Beispiel wird in Betracht gezogen, daß der Träger und das Konjugat eine physiologisch kompatible Formulierung mit langsamer Freisetzung darstellen. Das primäre Lösungsmittel in solch einem Träger kann entweder wäßriger oder nicht-wäßriger Natur sein. Zusätzlich kann der Träger noch weitere pharmakologisch annehmbare Hilfsstoffe zum Modifizieren oder Aufrechterhalten der Stabilität, Lösungsgeschwindigkeit, Freisetzung oder Absorption des Konjugats enthalten. Solche Hilfsstoffe sind diejenigen Substanzen, die üblicherweise eingesetzt werden, um Dosierungen für parenterale Verabreichung in entweder Einheitsdosis- oder Mehrfachdosisform zu formulieren.
Nachdem die pharmazeutische Zusammensetzung formuliert worden ist, kann sie in sterilen Ampullen als eine Lösung, Suspension, Gel, Infusion, Feststoff oder dehydratisiertes oder lyophilisiertes Pulver gelagert werden. Solche Formulierungen können entweder in einer gebrauchsfertigen Form oder in einer Form, die unmittelbar vor Verabreichung eine Rekonstitution erfordert, gelagert werden. Die bevorzugte Lagerung solcher Formulierungen erfolgt bei Temperaturen, die wenigstens so niedrig wie 4°C sind, und vorzugsweise bei – 70°C. Es ist auch bevorzugt, daß solche Formulierungen, die die Konjugate enthalten, bei oder nahe dem physiologischen pH gelagert und verabreicht werden. Man glaubt derzeit, daß die Verabreichung in einer Formulierung bei einem hohen pH (d. h. höher als 8) oder bei einem niedrigen pH (d. h. niedriger als 5) nicht wünschenswert ist.
Die Art und Weise der Verabreichung der Formulierung, die die Konjugate enthalten, für systemische Zuführung kann über den subkutanen, intramuskulären, intravenösen, oralen, intranasalen Weg oder durch vaginales oder rektales Suppositorium erfolgen. Vorzugsweise ist die Verabreichungsweise der Formulierungen, die die Konjugate enthalten, für lokale Zuführung über den intraartikulären Weg, intratrachealen Weg oder Instillation oder Inhalationen über die Atemwege. Zusätzlich kann es wünschenswert sein, die Konjugate an spezifizierte Abschnitte des Ernährungskanals zu verabreichen, entweder durch orale Verabreichung der Konjugate in einer geeigneten Formulierung oder über eine Vorrichtung.
Für orale Verabreichung wird das Konjugat eingekapselt. Das eingekapselte Konjugat kann mit oder ohne pharmazeutisch annehmbare Träger, die üblicherweise beim Zusammenmischen von festen Dosisformen verwendet werden, formuliert werden. Vorzugsweise ist die Kapsel so konzipiert, daß der aktive Teil der Formulierung an dem Punkt im gastrointestinalen Trakt freigesetzt wird, wenn die biologische Verfügbarkeit maximiert und der präsystemische Abbau minimiert ist. Zusätzliche Hilfsstoffe können einbezogen werden, um die Absorption des Konjugats zu erleichtern. Verdünnungsstoffe, Geschmacksstoffe, Wachse mit niedrigem Schmelzpunkt, Pflanzenöle, Gleitmittel, Suspensionsmittel, Tablettendesintegrationsmittel und Bindemittel können ebenfalls eingesetzt werden.
Ungeachtet der Art und Weise der Verabreichung wird die spezifische Dosis gemäß dem ungefähren Körpergewicht des Patienten berechnet. Andere Faktoren bei der Bestimmung der geeigneten Dosierung können die (den) zu behandelnde(n) oder zu verhindernde(n) Erkrankung oder Zustand, den Verabreichungsweg und das Alter, das Geschlecht und den medizinischen Zustand des Patienten einschließen. In bestimmten Ausführungsformen ist die Dosierung und Verabreichung so konzipiert, daß ein vorgewählter Konzentrationsbereich des Konjugats im Blutstrom des Patienten geschaffen wird. Man glaubt z. B., daß die Aufrechterhaltung von Kreislaufkonzentrationen von TNF-Inhibitor und IL-1-Inhibitor von weniger als 0,01 ng pro ml Plasma nicht eine wirksame Zusammensetzung sein könnte, während die längere Aufrechterhaltung von Kreislaufspiegeln über 10 μg pro ml unerwünschte Nebenwirkungen haben könnte. Eine weitere Verfeinerung der Berechnungen, die notwendig sind, um die geeignete Dosierung für die Behandlung zu bestimmen, die jede der oben genannten Formulierungen involviert, wird routinemäßig von den Fachleuten durchgeführt und liegt innerhalb des Aufgabenbereiches, der routinemäßig von ihnen durchgeführt wird, ohne unzumutbare Experimente, insbesondere im Lichte der Dosierungsinformation und Tests, die hierin offenbart sind. Diese Dosierungen können durch die Verwendung der etablierten Tests zur Bestimmung von Dosierungen bestätigt werden, die im Zusammenhang mit geeigneten Dosis-Reaktionsdaten verwendet werden.
Es sollte angemerkt werden, daß die Konjugatformulierungen, die hierin beschrieben sind, für die Herstellung von Veterinär- sowie Human-Medikamenten verwendet werden können und daß der Ausdruck "Patient" nicht in einer beschränkenden An und Weise aufgefaßt werden sollte. Im Falle von Veterinäranwendungen sollten die Dosierungsbereiche dieselben sein, wie oben spezifiziert.
Die Konjugate der vorliegenden Erfindung können für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden, einschließlich in-vitro-Diagnosetests und der Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, aber nicht hierauf beschränkt. Konjugate, die TNFbp, IL-lra, allein oder in Kombination, enthalten, können verwendet werden, um solche Erkrankungen zu behandeln, wie posttraumatische Lungeninsuffizienz, Lungenfibrose, Arthritis, Psoriasis, myelogene und andere Leukämien, Ischämie/Reperfusion, Asthma, Kachexie/Anorexie, Diabetes, septischen Schock, entzündliche Darmerkrankung, multiple Sklerose, Schlaganfall, Crohn-Krankheit, Transplantatabstoßung und hämorrhagisches Trauma. Die Konjugate können auch für eine Vielzahl von in-vitro-Zwecken verwendet werden, einschließlich Affinitätschromatographie (Aufteilung) und diagnostischen Zwecken, die den Fachleuten ohne weiteres bekannt sind. Zum Beispiel können solche Konjugate an eine feste Oberfläche gebunden und verwendet werden, um Liganden zu reinigen oder nachzuweisen, die sich spezifisch an Rezeptoren binden, gekoppelt an die aktivierten Linker.
Die folgenden Beispiele werden die verschiedenen Aspekte der vorliegenden Erfindung in größerem Detail veranschaulichen.
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung des aktivierten Linkers, 20 kDa PEGbv, unter Verwendung des "einstufigen" Syntheseverfahrens.
"Einstufige" Synthese von 20 kDa PEGbv
Polyethylenglykol (PEG-DIOL^®) wurde bezogen von Shearwater Polymers Inc. (Birmingham, AL). Divinylbenzol, 1 M Kalium-t-butoxid (in Tetrahydrofuran (THF)), Toluol (wasserfrei, Sure Seal), Di-i-propylether(99 +%, inhibiert mit 25 ppm butyliertem Hydroxytoluol (BHT)) und Tetrahydrofuran (wasserfrei, enthaltend 0,025% BHT als Inhibitor, Sure Seal) wurden erhalten von Aldrich Chemical Company (Milwaukee, Wisconsin). Dichlormethan (Omni Solvent) und Diethylether (EM) wurden bezogen von VWR Scientific Company (Denver, Colorado). Wasserfreies Natriumsulfat-Pulver wurde bezogen von J. T. Baker (Phillipsburg, New Jersey).
Ein 22 l-Vierhals-Rundkolben (ein 45/50- und drei 24/40-Anschlüsse) wurde ausgestattet mit einem Thermometer, Kondensator, einem Gummiseptum und einem mechanischen Rührer mit variabler Geschwindigkeit und eingetaucht in ein Wasserbad, das einen Wassertaucherhitzer enthielt. Der Kolben wurde unter positivem Argondruck gehalten. Der Kondensator wurde mit einem Zweihals-Rundkolben verbunden, durch den eine Vakuumleitung angeschlossen wurde. Polyethylenglykol (20 kDa, 300 g, 15 mmol) wurde gewogen und in den 22 1-Kolben durch einen Trichter überführt und drei Liter wasserfreies Toluol wurden kanüliert, während die Mischung gerührt wurde. Die Wasserbadtemperatur wurde auf 45°C eingestellt und das Rühren fortgesetzt, bis die Lösung klar wurde (~1 h). Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum (7.999,3 Pa)(~60 mm Hg) bis zur Trockne eingedampft. Der feste Rückstand wurde in neun Litern wasserfreiem Tetrahydrofuran (über Kanüle zugegeben) gelöst. Die Wasserbadtemperatur wurde auf 25°C eingestellt. Rühren wurde fortgesetzt, bis die Temperatur der Lösung 25°C erreichte. Divinylsulfon (6 ml, 59,97 mmol) wurde aus einer Spritze über 15 min hinzugegeben. Die Mischung wurde für 10 min gerührt (75 UPM). Kalium-t-butoxid (1 M in THF, 3 ml, 3 mmol) wurde aus einem Tropftrichter über einen Zeitraum von 25 min zugegeben.
Nach Zugabe der Base wurde die Reaktionsmischung bei 25°C für 6 Stunden gerührt. Das Wasserbad wurde anschließend auf 40°C erhitzt und das THF wurde verdampft (4,67 10⁴ Pa) (350 mm Hg). Ein Liter 1 : 1-Mischung aus Dichlormethan und Tetrahydrofuran wurde zum festen Rückstand zugegeben und gerührt, bis sich eine klare Lösung gebildet hatte. Die Lösung wurde auf 25°C abgekühlt und abgeschreckt (~20°C). Di-i-propylether (1 × 5 Liter) wurde aus einem Tropftrichter zur Lösung zugegeben, während das Rühren fortgesetzt wurde. Die Kondensatorverbindung wurde vom Kolben entfernt. Ein Druckfiltertrichter wurde mit dem Kolben durch eine flexible Nadel verbunden und der Niederschlag über die flexible Nadel überführt und durch den Filtertrichter (1 l, 70–100 μ) unter Vakuum filtriert. Der Niederschlag wurde in zwei Teile aufgespalten, in 2 l-Erlenmeyerkolben überführt und mit einem Liter (jeweils) i-Propylether für 3 Stunden rührengelassen (Magnetrührer). Der Niederschlag wurde filtriert (2 l, 70–100 μ), mit 800 ml Diethylether gewaschen und unter Vakuum (1.199,9 Pa)(5 mm Hg) in einem Exsikkator für 72 h getrocknet. Die Ausbeute wurde zu 278,6 g bestimmt (91,6% Rückgewinnung, bezogen auf das Gewicht des Polyethylenglykols).
Das Produkt wurde in einen Erlenmeyerkolben (2 l) überführt und ein Liter Dichlormethan (Omni Solvent) zugegeben. Nachdem das gesamte Produkt sich gelöst hatte, wurde die Lösung (in Sirupform) in einen 5 l-Tropfenkolben, ausgestattet mit einem mechanischen Rührer, überführt. Der Erlenmeyerkolben wurde mit weiteren 500 ml Dichlormethan gespült und die Lösung zum Tropfenkolben zugegeben. Die Lösung wurde dann für 5 min gerührt (65 UPM). Gesättigtes Natriumchlorid (1 l) wurde zugegeben und für 5 min gerührt (75 UPM).
Die Mischung ließ man absetzen, bis die zwei Schichten unterscheidbar wurden. Die organische Schicht wurde abgezogen und in einem getrennten Behälter gehalten. Dieses Verfahren wurde dreimal wiederholt und alle organischen Schichten wurden vereinigt.
Die Lösung wurde dann in zwei Teile (jeweils 3 l) aufgespalten und in zwei Erlenmeyerkolben (4 l) überführt und für 16 Stunden mit 500 g wasserfreiem Natriumsulfat-Pulver (J. T. Baker, Phillipsburg, New Jersey) bei Raumtemperatur unter Verwendung eines Magnetrührers gerührt (während dieses Vorgangs war jeder Kolben vollständig mit Aluminiumfolie umhüllt). Die Lösung wurde durch einen Filtertrichter (2 l, 70–100 μ) filtriert und das Filtrat in einen 22 l-Vierhalskolben überführt, wobei der Kolben in einem Wasserbad (40°C) angebracht war. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum (285–360 mbar) verdampft und der Rückstand (sehr viskose Flüssigkeit) in einer 1 : 1-Mischung aus Dichlormethan und THF (1 l) erneut gelöst. Die Lösung wurde dann ausgefällt, filtriert und getrocknet, wie zuvor beschrieben. Die Ausbeute wurde zu 221,0 g bestimmt (72,67% Rückgewinnung, bezogen auf das Gewicht des Polyethylenglykols).
BEISPIEL 2
Dieses Beispiel beschreibt eine Reihe von Beladungs- und Elutionsexperimenten, die konzipiert worden sind, um die Fähigkeit von Butyl-, Phenyl- und Ether-HIC-Harzen zu testen, 20 kDa PEGbv zu binden.
Verwendete Tests
1. PEG-Test
PEG-haltige Fraktionen wurden mit Nessler-Reagens (Sigma/Aldrich) nachgewiesen. Typischerweise werden 0,01 ml Nessler-Reagens zu einem 0,25 ml-Aliquot einer Säulenfraktion in einem Glasteströhrchen zugegeben. PEG-haltige Fraktionen bildeten bei Zugabe des Nessler-Reagens einen milchigen Niederschlag.
2. Quantitative PEG-Analyse
Nessler-Reagens (1,5 ml) wurde zu einem Glasteströhrchen zugegeben, gefolgt von 18,75 Mikrolitern der zu testenden Probe. Die Teströhrchen wurden verwirbelt, für 10 bis 15 Minuten stehengelassen und die Trübheit bei 600 mm gegen eine Blindprobe, die Nessler-Reagens allein enthielt, abgelesen (Beckman DU 70 Spectrophotometer). PEG wurde dann aus einer Standardkurve quantifiziert, erstellt von 1,5, 1,0, 0,75, 0,50 und 0,25 mg/ml PEG-Standard.
Experimentelle Durchläufe
5 ml vorgepackte ToyoPearl^® Butyl-, Phenyl- und Ether-650C-HIC-Säulen (TosoHaas, Montgomeryville, PA) wurden verwendet. Die Säulen wurden mit 10 mg (2 mg/ml Bettvolumen) 20 kDa PEGbv in verschiedenen Konzentrationen von NaCl oder Natriumsulfat beladen und anschließend mit Wasser durch Schwerkraft eluiert. Alle Experimente wurden bei Raumtemperatur durchgeführt und 0,5–1,0 ml-Fraktionen wurden von Hand in 13 × 100 mm-Glasteströhrchen gesammelt. PEG wurde mit dem Nessler-Test bestimmt. Tabelle 1 gibt die Salzkonzentrationen an, die für vollständige Bindung (d. h. kein PEGbv im Durchlauf nachweisbar) von 20 kDa PEGbv an die verschiedenen HIC-Harzen notwendig waren an.
Tabelle 1
Wie in Tabelle 1 angegeben, hat das Butyl-650C-HIC-Harz eine leicht größere Affinität für PEG als das Phenyl-650C-HIC-Harz, während das Ether-650C-HIC-Harz keinerlei PEG band, wenn beladen mit entweder 2 M NaCl oder 0,5 M Natriumsulfat.
BEISPIEL 3
Dieses Beispiel beschreibt ein Experiment, das konzipiert ist, um die Fähigkeit eines Butyl-HIC-Harzes zu testen, verschiedene PEG-Diole auf der Basis der Größe zu trennen. PEGhaltige Fraktionen wurden unter Verwendung des PEG-Tests, der oben beschrieben ist, bestimmt und das Molekulargewicht der PEGs wurde durch SEC-HPLC bestätigt.
Verwendete Tests
1. Ausschlußchromatographie(SEC)-HPLC-Test
Ausschlußchromatographie der HIC-gereinigten PEG-Fraktionen wurde unter Verwendung einer TosoHaas G3000_swx1-Säule(Synchrom, Inc., Linden, NJ) durchgeführt. Eine 100–200 μl-Probe wird mit 0,5–1,0 mg/ml injiziert. Die Säule wird bei Raumtemperatur betrieben und in 10 mM Natriumphosphatpuffer, 150 mM NaCl, 0,004% Natriumdodecylsulfat (SDS), pH 6,5, äquilibriert. Das PEG wurde aus der Säule unter Verwendung eines Puffers eluiert, der 10 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl und 0,004% SDS, pH 6,5, enthielt. In einigen Experimenten wurde ein Brechungsindexdetektor (BioRad, Hercules, CA) verwendet, um die PEG-Elution zu überwachen. In anderen Experimenten wurde das PEG zunächst mit o-Thiobenzoesäure derivatisiert, so daß das Eluat durch UV-Extinktion bei 254 nm überwacht werden konnte.
Experimentelle Durchläufe
Eine ToyoPearl^® Butyl-650M-HIC-Säule (1,5 × 11 cm) wurde mit insgesamt 3 mg PEG-Diol pro ml Säulenbettvolumen beladen. Die Säule wurde in 4 M NaCl äquilibriert. Das Beladungsvolumen betrug 9,7 ml und enthielt 2,97 kDa, 11,9 kDa, 20 kDa und 50 kDa PEG-Diol, jeweils mit 1,5 mg/ml (die 2,97 kDa und 11,9 kDa PEG-Diole wurden von Polymer Laboratories bezogen und die 20 kDa und 50 kDa PEG-Diole wurden von Shearwater Polymers bezogen). Nach Beladung wurde die Säule mit 2 Säulenvolumina 4 M NaCl gewaschen und mit einem linearen 15-Säulenvolumina-Gradienten von 3 M bis 1 M NaCl eluiert. Der Durchfluß für die Beladungs-, Wasch- und Elutionsschritte betrug 2,5 ml/min. Drei-Minuten(7,5 ml)-Fraktionen wurden gesammelt und die Fraktionen wurden auf PEG analysiert. Das Elutionsprofil ist in 1 dargestellt. Die Molekulargewichte der Peaks wurden durch Ausschluß-HPLC-Chromatographie bestätigt und sind dargestellt, wie angegeben.
Um diese Anfangsexperimente abzuschließen, wurde das PEGbv, das im 2 M NaCl-Durchlauf und Wassereluat der Phenyl-650C-Säule, beschrieben in Beispiel 2, eluierte, im SEC-HPLC-Test analysiert. Die SEC-HPLC-Daten zeigten, daß das Material im 2 M NaClμrial im Wassereluat überwiegend PEGbv mit hohem Molekulargewicht enthielt. Diese Daten bestätigen, daß HIC, insbesondere Phenyl- und/oder Butyl-HIC, verwendet werden kann, um PEG-Diole und 20 kDa PEGbv auf der Basis der Größe zu trennen.
BEISPIEL 4
Dieses Beispiel beschreibt eine Reihe von HIC-Experimenten, in denen verschiedene 20 kDa PEGbv-Beladungszustände getestet wurden und in denen verschiedene lineare NaCl-Gradienten verwendet wurden, um das PEGbv aus den Butyl- und Phenyl-HIC-Harzen zu eluieren. Alle Experimente wurden bei Raumtemperatur vorgenommen und im allgemeinen durchgeführt, wie beschrieben in Beispiel 2.
Durchlauf 1
Durchlauf 1 verwendete eine ToyoPearl^® Phenyl-6505-HIC-Säule (1,5 × 6,5 cm). Das 6505-Harz unterschied sich vom 650C-Harz darin, daß die Teilchengröße 20 bis 50 μm (20 bis 50 Mikrons) statt 50 bis 150 μm (50 bis 150 Mikrons) beträgt. Die Säule wurde in 3 M NaCl äquilibriert und 2 mg/ml Bettvolumen PEGbv wurden auf die Säule geladen. Das PEGbv wurde unter Verwendung eines 10 Säulenvolumina großen linearen NaCl-Gradienten (3 M NaCl bis 0 M NaCl) und einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,5 ml/Minute eluiert. Zwei-Minuten(3,0 ml)-Fraktionen wurden gesammelt und das Elutionsprofil ist in 2 dargestellt. Die% Ausbeute an 20 kDa PEGbv wurden anschließend unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Tests bestimmt (siehe Tabelle 2).
Durchlauf 2
Durchlauf 2 verwendete eine ToyoPearl^® Butyl-650M-HIC-Säule (1,5 × 11,4 cm). Das 650M-Harz unterscheidet sich vom 650C-Harz darin, daß die Teilchengröße 40 bis 90 μm (40 bis 90 Mikrons) statt 50 bis 150 μm (50 bis 150 Mikrons) beträgt. Die Säule wurde in 2 M NaCl äquilibriert und 2 mg/ml Bettvolumen PEGbv wurden auf die Säule geladen. Das PEGbv wurde unter Verwendung eines 10 Säulenvolumina großen linearen NaCl-Gradienten (2 M NaCl bis 0 M NaCl) und einer Durchflußgeschwindigkeit von 1,5 ml/Minute eluiert. Drei- Minuten(4,5 ml)-Fraktionen wurden gesammelt und das Elutionsprofil ist in 3 dargestellt. Die% Ausbeute an 20 kDa PEGbv wurden anschließend unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Tests bestimmt (siehe Tabelle 2).
Durchlauf 3.
Durchlauf 3 verwendete eine ToyoPearl^® Butyl-650M-HIC-Säule (3,2 × 18,0 cm). Die Säule wurde in 2,5 M NaCl äquilibriert und 1,8 mg/ml Bettvolumen PEGbv wurden auf die Säule geladen. Das PEGbv wurde unter Verwendung eines 10 Säulenvolumina großen linearen NaCl-Gradienten (2 M NaCl bis 0,5 M NaCl) und einer Durchflußgeschwindigkeit von 9,6 ml/Minute eluiert. 2,5-Minuten(24 ml)-Fraktionen wurden gesammelt. Die% Ausbeute an 20 kDa PEGbv wurden anschließend unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Tests bestimmt (siehe Tabelle 2).
Durchlauf 4.
Durchlauf 4 verwendete eine ToyoPearl^® Butyl-650M-HIC-Säule (1,52 × 11,5 cm). Die Säule wurde in 5 M NaCl äquilibriert und 8 mg/ml Bettvolumen PEGbv wurden auf die Säule geladen. Die erhöhte Bettvolumenbeladung wurde durchgeführt, um sich enger an Betriebsbedingungen im Großmaßstab anzunähern. Wegen der erhöhten Beladung war eine höhere NaCl-Konzentration (5 M gegenüber 2 M) für die komplette Bindung für PEGbv an die Säule erforderlich. Das PEGbv wurde unter Verwendung eines 10 Säulenvolumina großen linearen NaCl-Gradienten (3,5 M NaCl bis 1 M NaCl) und einer Durchflußgeschwindigkeit von 2,0 ml/Minute eluiert. 1,5-Minuten (3 ml)-Fraktionen wurden gesammelt. Die% Ausbeute an 20 kDa PEGbv wurden anschließend unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Tests bestimmt (siehe Tabelle 2).
Durchlauf 5.
Durchlauf 5 verwendete eine ToyoPearl^® Butyl-650M-HIC-Säule (1,52 × 11,5 cm). Die Säule wurde in 5 M NaCl äquilibriert und 8 mg/ml Bettvolumen PEGbv wurden auf die Säule geladen. Das PEGbv wurde unter Verwendung eines 15 Säulenvolumina großen linearen NaCl-Gradienten (2 M NaCl bis 0,5 M NaCl) und einer Durchflußgeschwindigkeit von 2,1 ml/Minute eluiert. Fraktionen wurden gesammelt und das Elutionsprofil ist in 3 dargestellt. Das Auflösungsprofil war nicht so gut für diesen Lauf wie dasjenige, das unter Verwendung einer 2 mg/ml-Beladung erhalten wurde; die SEC-HPLC-Reinheit, die aus dem Durchlauf erhalten wurde, wurde jedoch bestimmt und ist in den 4 und 5 dargestellt. Die Daten der 4 und 5 zeigen, daß trotz der schlechteren Auflösung eine angemessene Entfernung des PEGbv mit hohem Molekulargewicht erreicht wurde.
Durchlauf 6.
Durchlauf 6 verwendete eine ToyoPearl^® Butyl-650M-HIC-Säule (7,0x 14,0 cm). Die Säule wurde in 4,5 M NaCl äquilibriert und 8 mg/ml Bettvolumen PEGbv wurden auf die Säule geladen. Das PEGbv wurde unter Verwendung eines 17 Säulenvolumina großen linearen NaCl-Gradienten (3,5 M NaCl bis 1,0 M NaCl) und einer Durchflußgeschwindigkeit von 55 ml/Minute eluiert.
Tabelle 3
Wie durch die obigen Daten angezeigt, ist die Verwendung von linearen NaCl-Gradienten in den Phenyl- und/oder Butyl-HIC-Trennungen darin wirksam, PEGbv mit hohem Molekulargewicht vom 20 kDa PEGbv zu trennen. Überdies wurde eine Ausbeute von ungefähr 65% bis 75% unter Verwendung einer Beladung von 2 mg/ml Bettvolumen oder einer Beladung von 8 mg/ml Bettvolumen unter geeigneten Bedingungen erreicht. Schließlich zeigen die Daten, daß, obgleich das Auflösungsprofil nicht so gut für die Durchläufe mit einer Beladung von 8 mg/ml war, verglichen mit den Durchläufen mit einer Beladung von 2 mg/ml, die Beladung mit 8 mg/ml angemessene Entfernung des PEGbv mit hohem Molekulargewicht erzielte.
BEISPIEL 5
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung eines biologisch aktiven Konjugats (Homohantel), das TNFbp und HIC-gereinigtes 20 kDa PEGbv umfaßt. Die Gesamtausbeute, Reinheit und biologische Aktivität des Konjugats wird verglichen mit zuvor beschriebenen TNFbp-Konjugaten.
Konjugat-Herstellung
Das 30 kDa c105-TNFbp-Mutein, das in diesem Beispiel verwendet wurde, kann hergestellt werden, wie beschrieben in der veröffentlichten PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/16221. Alternativ wird das c105-Mutein wie folgt hergestellt. E. coli-Zellen, die das c105-Mutein exprimieren, werden durch Zentrifugation geerntet. Der Zellschlamm wird auf ungefähr 40% Naßgewicht Feststoffe durch Zugabe von gereinigtem Wasser eingestellt. Die Mischung wird anschließend weiter mit einem gleichen Volumen Aufbrechpuffer (50 mM Tromethamin, 4 mM EDTA, pH 7,2) verdünnt, um eine Suspension mit ungefähr 20% Naßgewicht Feststoffe zu ergeben. Der Zellschlamm wird fünfmal durch einen Hochdruckhomogenisator geleitet, der bei 55.158 kPa (8.000 psi) arbeitet, um das Zellhomogenat zu erzeugen. Das Homogenat wird auf weniger als oder gleich 10°C vor jeder Durchleitung durch den Homogenisator abgekühlt. Das Homogenat wurde zentrifugiert und die Feststofffraktion, die das c 105 enthält, wird zurückbehalten. Die Feststoffe werden verdünnt und erneut zentrifugiert, um gewaschene Einschlußkörperchen zu ergeben.
Die gewaschenen Einschlußkörperchen werden dann durch Zugabe von 8 M Harnstoff und 150 mM Cystein in 50 mM Tris, pH 9,5, gelöst. Diese Mischung läßt man vor der Rückfaltung für 2 Stunden bei Raumtemperatur rühren. Unter diesen Bedingungen wird das c105-Mutein denaturiert und reduziert.
Das reduzierte denaturierte c105-Mutein wird durch Verdünnung mit 1,1 M Harnstoff, 50 mM Tris rückgefaltet, um eine endgültige Rückfaltungslösung zu ergeben, die aus 200 μg/ml c105-Mutein, 1,5 M Harnstoff, 7,5 mM Cystein, 50 mM Tris, pH 9,7, bestand. Die Rückfaltungsmischung wird bei 6 bis 10°C für 2 Tage gehalten. Rückfaltungseffizienz wird überwacht durch Umkehrphasen-HPLC und Kationenaustausch-HPLC.
Die Rückfaltungsmischung wird dann durch Zugabe von Essigsäure und HCl auf pH 5,0 gebracht. Die Rückfaltungsmischung wird auf eine Kationenaustauschsäule (S-Sepharose- Harz mit großen Perlen) geladen, die vorher in 25 mM Natriumacetat, 65 mM NaCl, pH 5, bei 4°C äquilibriert worden war. Nach der Beladung wird die Säule mit demselben Äquilibrationspuffer gewaschen. Die Säule wird mit einem Gradienten von 65 bis 350 mM NaCl in 25 mM Natriumacetat, pH 5, eluiert. Das c105-Mutein wird bei etwa 200 mM NaCl eluiert und wird in einem Pool gesammelt.
Der gesammelte Pool, der das c105-Mutein enthält, wird mit 1,5 Volumina 5 M NaCl, 40 mM Natriumphosphat, eingestellt auf pH 6, verdünnt und auf eine Säule mit hydrophober Wechselwirkung (Toyo Butyl-650M-Säule) geladen, die vorher in 3 M NaCl, 20 mM Natriumphosphat, pH 6, äquilibriert worden war. Am Ende der Beladung wird die Säule mit Äquilibrationspuffer gewaschen. Das c105-Mutein wird unter Verwendung eines linearen, 8 Säulenvolumina großen, sinkenden Salzgradienten, der von 3 M bis 1 M NaCl lief, in 20 mM Natriumphosphat bei pH 6 eluiert. Das c 105-Mutein wird in einem Pool gesammelt. Der Pool wird anschließend auf ungefähr 3 g/l c105-Mutein konzentriert und anschließend gegen 20 mM Natriumphosphat, pH 6,0, diafiltriert, bis die endgültige Leitfähigkeit geringer ist als 4 mmho (ungefähr sechs Volumina).
Der diafiltrierte Pool wird auf eine SP-Sepharose-Hochleistungssäule geladen, äquilibriert mit 20 mM Natriumphosphat, pH 6,0. Nach der Beladung wird die Säule mit zusätzlichem Äquilibrationspuffer gewaschen und mit einem Kombinations-pH/Salz-Gradienten von 20 mM Natriumphosphat, 50 mM NaCl, pH 6,0, bis 20 mM Natriumphosphat, 50 mM NaCl, pH 6,5, eluiert. Das c105-Mutein eluiert in der letzteren Hälfte des Gradienten bei ungefähr 35 mM NaCl. Das c 105-Mutein kann an diesem Punkt eingefroren gelagert werden.
Das 20 kDa PEGbv, das im Beispiel verwendet wurde, wurde unter Verwendung des "einstufigen" Verfahrens synthetisiert, das beschrieben ist in Beispiel 1 oben. Ein Teil des synthetisierten 20 kDa PEGbv wurde anschließend HIC-gereinigt, wie beschrieben in Beispiel 4, Durchlauf 5. Sowohl nicht-HIC-gereinigtes als auch HIC-gereinigtes 20 kDa PEGbv wurde dann verwendet, um PEGbv : TNFbp-Konjugate herzustellen. Die Konjugate wurden wie folgt hergestellt: das 30 kDa c105-TNFbp-Mutein wurde einem 1,3-fachen molaren Überschuß DTT in 20 mM Phosphat, pH 7,6, für 4 bis 6 Stunden bei 15°C ausgesetzt, um ein Extra-Cystein, das sich während des Rückfaltungsprozesses an c105 gebunden hat, zu entfernen. Der pH wurde auf 6,0 eingestellt und die Probe auf eine S-Sepharose-Fast-Flow-Säule (bei 4– 6 mg/ml Bettvolumen) geladen, mit 3 Säulenvolumina 20 mM Phosphatpuffer, pH 6,0, (um das DTT zu entfernen) gewaschen und mit 20 mM Phosphat, 70 mM NaCl, pH 6,0, eluiert.
Die reduziertes 30 kDa c105-TNFbp-Mutein enthaltende Lösung (~4,7 mg/ml) wurde anschließend mit 1 M NaOH auf pH 7,4 bis 7,5 eingestellt. HIC-gereinigtes oder nicht-HICgereinigtes 20 kDa PEGbv (0,9 mg pro mg TNFbp) wurde zum reduzierten c105-TNFbp unter Mischen zugegeben. Nach dem Mischen ließ man die Lösung für 12 bis 18 Stunden bei Raumtemperatur stehen.
Konjugatanalyse
PEGylierungs-Test
Die Umwandlung von TNFbp zu 20 kDa PEGbv : TNFbp-Hantel wurde unter Verwendung einer POROS^® HS/H-4.6/50-Kationenaustausch-HPLC-Säule (Perseptive Biosystems, Cambridge, MA) quantifiziert. Eine 50 μl-Probe wurde auf die Säule geladen und ein 10-Minuten-Gradient, 20 mM Natriumacetat, pH 3,75, 0 bis 1 M NaCl, verwendet, um die Probe aus der Säule zu eluieren. Ein repräsentatives Elutionsprofil für eine 30 kDa c105-TNFbp-Mutein-Hantel, d. h. PEGbv mit 30 kDa c105-TNFbp, gebunden an nur einem Ende, 30 kDa c105-TNFbp-Mutein-Hantel und eine nicht-PEgylierte 30 kDa c105-TNFbp-Muteinprobe, wurde dargestellt in 6. 30 kDa c105-TNFbp-Mutein-Halbhantel eluierte zuerst, gefolgt von der 30 kDa c105-TNFbp-Mutein-Hantel und nicht-PEGyliertem 30 kDa c105-TNFbp-Mutein.
Ergebnisse
Die prozentuale Umwandlung zu TNFbp-Hantel für das HIC-gereinigte Material betrug 66,7 %, mit keinem nachweisbaren "Vorpeak" (siehe 7). Nicht-HIC-gereinigtes PEGbv aus derselben Charge ergab nur 52,9% Umwandlung und hatte 6,7% "Vorpeak" (siehe 8). Dieser unterscheidbare "Vorpeak" ist TNFbp-Hantel, die mit PEGbv-Verunreinigungen mit hohem Molekulargewicht erzeugt ist.
Die PEGylierungsmischungen wurden anschließend auf 1,5 × 10 cm SP-Sepharose-HP-Säulen (4 mg/ml Bettvolumen) geladen, äquilibriert in 50 mM Natriumphosphat, pH 3,1. Nach der Beladung wurde die Säule mit Äquilibrationspuffer gewaschen und dann die TNFbp-Hantel unter Verwendung von 20 Säulenvolumina eines Gradienten mit 50 mM Natriumphosphat, 0,2 m NaCl, pH 3,1–50 mM Natriumphosphat, 0,5 M NaCl, pH 3,1, eluiert. Die Elutionsprofile sind in den 9 und 10 dargestellt. Pooling wurde für jeden Durchlauf auf mehrere unterschiedliche Weisen durchgeführt. Tabelle 3 zeigt die% Ausbeute an TNFbp-Hantel und% Reinheit für die verschiedenen Pooling-Kriterien, die verwendet wurden.
Tabelle 3
Die Daten von Tabelle 3 zeigen einen klaren Vorteil der HIC-Reinigung von PEGbv auf die anschließende Reinheit der TNFbp-Hantel und die Ausbeuten. Um z. B. 97% Reinheit mit dem nicht-HIC-gereinigten PEGbv zu erhalten, konnten nur 37% der TNFbp-Hantel auf SP-Sepharose HP rückgewonnen werden; wohingegen soviel wie 58% mit dem HIC-gereinigten Material zurückgewonnen werden konnten, d. h. HIC-Reinigung von 20 kDa PEGbv kann die Rückgewinnung von TNFbp-Hantel um soviel wie das 1,5- bis 1,6-fache erhöhen.
BEISPIEL 6
In diesem Beispiel wurde die Fähigkeit des HIC-Harzes bewertet, PEGs auf der Basis von Endgruppenfunktionalität zu trennen.
Das "früh eluierende" Material aus Beispiel 4, Durchlauf 3, wurde im PEGylierungs-Test getestet. Das "früh eluierende" Material waren diejenigen Fraktionen, die unmittelbar vor den Fraktionen eluierten, die gepoolt wurden, um das 20 kDa PEGbv zu liefern. Und, wie gezeigt in 11, erzeugte dieses Material, wenn es verwendet wurde, um Konjugate herzustellen, primär TNFbp-Halbhantel. Dies zeigt an, daß das "früh eluierende" Material überwiegend 20 kDa PEG-monovinylsulfon enthält, und dies zeigt die Fähigkeit des Butyl-HIC-Harzes, 20 kDa PEGbv auf der Basis von Endgruppenfunktionalität zu trennen.
BEISPIEL 7
In diesem Beispiel wurde die Stabilität der Bindung zwischen dem c105-TNFbp-Mutein und PEG-bisvinylsulfon untersucht. Bekannte Mengen der c105-TNFbp-Hantel wurden in PBS, pH 7,4, bei 37°C für bis zu einer Woche inkubiert, wobei in Intervallen für Analyse durch SDS-PAGE Aliquote entnommen wurden. Im wesentlichen wurde keine Zersetzung der c105-TNFbp-Hantel beobachtet. Bei pH 10 bei 37°C für 1 Woche wurden nur 5–10% Zersetzung des Konjugats beobachtet. In weiteren Stabilitätsstudien wurden die aktivierten PEG-Linker, hergestellt mit den einstufigen Verfahren von Beispiel 1, mit den aktivierten PEG-Linkern verglichen, die mit dem mehrstufigen Verfahren hergestellt worden waren, wie beschrieben in PCT/LJS95/07555.
Zunächst wurden die einstufig und mehrstufig aktivierten Linker mit 2-Mercaptobenzoesäure derivatisiert, um die Stabilität der Linker unter Verwendung von UV zu bestimmen. 3,0 ml einer 1 mM 3-Mercaptobenzoesäure (Orthothiolbenzoeäsure) wurden zu 0,5 ml jeder Linker-Lösung (20 mg Linker wurden in 0,5 ml 50 mM Natriumphosphat, pH 7,5, gelöst) zugegeben und kurz durch Verwirbeln gemischt. Die Lösung wurde dann bei Raumtemperatur für ein Minimum von 18 Stunden inkubiert. Längere Inkubationszeiten bei Raumtemperatur (bis zu 48 Stunden) sind akzeptabel.
Die derivatisierten Linker-Lösungen wurden dann 1 : 10 in PBS verdünnt und bei 90°C für 1 Stunde wärmebehandelt. Die wärmebehandelten Linker-Lösungen wurden aus der Wärme entfernt und 100 μl bis 200 μl der Lösungen wurden auf eine BIO-SIL^®-250-5-Säule (BioRad, Hercules, Kalifornien) eingespritzt und bei 10 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, 0,004% SDS, pH 6,5, bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 0,5 ml/min laufengelassen. Die gesammelten Proben wurden durch UV bei einer O. D. von 254 nm gemessen. Tabellen 4 und 5 liefern die Ergebnisse der UV-Messungen. In diesen Tabellen werden die% Veränderung im Produkt-UV-Peak auf der Basis der UV-Reinheit des Standards, der nicht wärmebehandelt wurde, minus der Reinheit der bei 90°C wärmebehandelten Probe berechnet. Reinheit wurde berechnet als die mittlere Peakfläche, dividiert durch die Gesamtpeakfläche. Die Variabilität des Tests betrug 2%.

Tabelle 4 "Einstufige Synthese"

	Prozent Veränderung
Probe I.D.	in Produkt-UV-Peak
1	–1,91
2	1,70
3	0, 82
5	1,59
6	0,71
7	0,04
8	–0,51
9	0,30
10	1,09
11	1,61
12	3,72
Mittelwert	0,83
Standardabweichung	1,43

Tabelle 5 "Mehrstufige Synthese"

Prozent Veränderung

Probe I.D. in Produkt-UV-Peak

002 9,28

006 10,75

007 13,33

008 13,95

009 20,58

010 14,41

014 11,37

015 9,8

Mittelwert 12,94

Standardabweichung 3,62
Wie gezeigt durch Vergleich der Ergebnisse der Tabellen 4 und 5, ist der einstufige Linker stabiler als der mehrstufige Linker. Die Ergebnisse zeigen auch, daß die Veränderung der Stabilität des einstufigen Linkers innerhalb der 2% Testvariabilität liegt, wohingegen die Veränderung der Stabilität des vierstufigen Linkers größer ist als die 2% Testvariabilität.
Die vorstehende Beschreibung der Erfindung ist beispielhaft für Zwecke der Veranschaulichung und Erläuterung.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines aktivierten Polyethylenglykol-Linkers, welches die Schritte umfaßt: (a) Erhalten eines Polyethylenglykol-Polymers (PEG) mit einer reaktiven Hydroxylgruppe; (b) Umwandeln besagter Hydroxylgruppe in einen reaktiven Michael-Akzeptor, um wenigstens eine Form eines aktivierten Linkers zu erzeugen; (c) Aufbringen besagten aktivierten Linkers auf eine Hydrophobchromatographie(HIC)-Säule, die polymeres Harz mit einer hydrophoben Seitengruppe, angeordnet auf der Oberfläche einer hydrophilen Vinyl-Copolymer-Hauptkette, verwendet, wobei besagte hydrophobe Seitengruppe ausgewählt ist aus Octyl, Butyl, Phenyl oder Ether; und (d) selektives Isolieren einer aktivierten Linkerform durch Verwendung von Elutionsbedingungen, die Trennung verschiedener Formen auf der Grundlage von Größe und/oder Endgruppenfunktionalität ermöglichen.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (b) umfaßt: (i) Zugeben von THF als dem Lösungsmittel zur Verbindung mit einer reaktiven Hydroxygruppe; (ii) Zugeben eines Reagens mit einer reaktiven Carbonyl-, Nitril- oder Sulfongruppe; und (iii) Zugeben einer Base, um den reaktiven Michael-Akzeptor zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Elutionsbedingungen die Verwendung eines linearen 5–0 M Natriumchlorid-Gradienten umfassen.
Verfahren nach den Ansprüchen 1–3, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes PEG ein Molekulargewicht im Bereich von 2 kDa bis 100 kDa hat.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes PEG ein Molekulargewicht von 3,4 kDa, 5 kDa, 10 kDa oder 20 kDa hat.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes PEG ein Molekulargewicht von 20 kDa hat.
Verfahren nach den Ansprüchen 1–6, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes PEG PEG-Diol ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß THF in einem Verhältnis von 1 : 10 bis 1 : 50 Gewicht/Volumen von PEG zu THF zugegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Verhältnis 1 : 30 ist.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens mit einer reaktiven Sulfongruppe Vinylsulfon ist.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß besagte Base Kalium-tertbutoxid ist.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Reagens mit einer reaktiven Sulfongruppe Divinylsulfon ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es nach Schritt (a) weiter umfaßt: Lösen des PEGs mit einer reaktiven Hydroxygruppe in Toluol; und Trocknen besagter Toluol-Lösung vor Schritt (b).
Verfahren nach den Ansprüchen 1–13, dadurch gekennzeichnet, daß besagte HIC einen Butyl- oder Phenyl-Liganden auf einer Methacryl-Hauptkette umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines pegylierten, biologisch aktiven Moleküls, wobei besagtes Verfahren umfaßt: (a) die Schritte (a) bis (d) von Anspruch 1; (b) Umsetzen des HIC-gereinigten PEGs von Schritt (a) in diesem Anspruch mit einem biologisch aktiven Molekül, um ein pegyliertes, biologisch aktives Molekül herzustellen.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß besagter Reaktionsschritt umfaßt: Mischen besagten HIC-gereinigten PEGs mit besagtem biologisch aktiven Molekül; und Stehenlassen besagter Mischung bei Raumtemperatur für 12–18 Stunden.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes Molekül ein Tumornekrosefaktor(TNF)-Inhibitor ist.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß besagter TNF-Inhibitor ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus einem 30kDa-TNF-Inhibitor, einem 40-kDa-TNF-Inhibitor oder verkürzten Varianten oder Muteinen derselben besteht.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß besagter TNF-Inhibitor ein TNF-Inhibitor-Mutein ist.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes TNF-Inhibitor-Mutein c105-30kDa-TNF-Inhibitor ist.
Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß besagtes pegyliertes, biologisch aktives Molekül die Formel R₁-X-R₂ hat, wobei: X ein HIC-gereinigtes PEG mit einer ersten reaktiven Gruppe und einer zweiten reaktiven Gruppe umfaßt, und wobei besagte erste reaktive Gruppe ein Michael-Akzeptor ist; R₁ ein biologisch aktives Molekül mit einer reaktiven Thiol-Einheit ist, wobei besagte Thiol-Einheit kovalent an besagten Michael-Akzeptor gebunden ist; und R₂ ein Molekül oder eine biologisch nicht-aktive Gruppe umfaßt, die an besagtes PEG durch Reaktion mit besagter zweiten reaktiven Gruppe gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß X Polyethylenglykol-bisvinylsulfon ist und R₁ und R₂ c105-30kDa-TNF-Inhibitor ist.