JP2000506851A

JP2000506851A - 活性化リンカーとその製造及び精製方法

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Publication number: JP2000506851A
Application number: JP9531747A
Authority: JP
Inventors: イブラーヒーム，プラブハ・エヌ; ベイル，ロバート・エイ; シーリイ，ジエイムズ・アービン
Original assignee: アムジエン・インコーポレーテツド
Priority date: 1996-03-06
Filing date: 1996-12-06
Publication date: 2000-06-06
Also published as: US5747639A; PT906122E; DE69629949T2; WO1997032607A2; DE69629949D1; ATE249244T1; AU1410897A; AU720399B2; US5935564A; WO1997032607A3; EP0906122B1; DK0906122T3; EP0906122A2; CA2248006A1; ES2206616T3; CA2248006C

Abstract

(57)【要約】本発明は、活性化リンカー、特に反応性マイケルアクセプターを有する活性化リンカーの製造方法と、疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて活性化リンカーをその大きさ及び末端基官能性に基づき分離する、効率的な活性化リンカー精製方法とに係わる。精製した活性化リンカーを使用して、生物学的に活性な分子を改質することができ、更に該分子の総合的生産を改善することができる。

Description

【発明の詳細な説明】活性化リンカーとその製造及び精製方法発明の分野本発明は活性化リンカーの製造方法、特に反応性マイケルアクセプターを有する活性化リンカーの製造方法、及び、活性化リンカーの効率的な精製方法に関する。発明の背景ポリエチレングリコール（“ＰＥＧ”）はエチレンオキシド単位から成る長鎖直鎖状合成ポリマーである。エチレンオキシド単位は可変であり、従って、得られるＰＥＧ化合物は約２００〜１００，０００の範囲の分子量を有し得る。ＰＥＧは典型的には、無色無臭、水溶性、熱安定性であり、加水分解や劣化を生じることがなく、無毒性である。従って、医薬品、人工移植組織、及び、その他の生体親和性が重要な用途にＰＥＧを使用する研究は広範に行われてきた。種々の表面及び分子にＰＥＧを付着させ得る活性部分を有しているＰＥＧの種々の誘導体は公知である。例えば、表面の湿潤及び帯電並びに表面に対する他の分子の付着を制御するために表面にＰＥＧを結合させる目的でＰＥＧ誘導体が使用されている。より詳細には、反応性カルボニル基、ニトリル基またはスルホン基を有する試薬とＰＥＧとを反応させて、ヒドロキシル基を反応性マイケルアクセプター（Ｍｉｃｈａｅｌａｃｃｅｐｔｏｒ）に変換して“活性化リンカー”を形成させることによってＰＥＧ誘導体を形成する。“活性化リンカー”は、種々のタンパク質を修飾して改良された生物学的に活性のコンジュゲートを得るために有用である。タンパク質にＰＥＧを付着（“ＰＥＧ付加またはＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）”）させることによって、（１）タンパク質の血漿半減期の延長、１９９４年９月２０日付けのＤｅｌｇａｄｏらの米国特許第５，３４９，０５２号参照；（２）溶解度増加のようなタンパク質の生化学的特性及び物理的特性の改変、Ｃｈｅｎら，Ｂｉｏｃｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，６６０：２９３−２９８（１９８８）、及び、タンパク質分解に対する防御の強化、Ｓａｄａら，Ｊ．ＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ７１：１３７−１３９（１９９１）参照；並びに、（３）抗原性の低減、Ｄａｖｉｓら，“ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｏｌｙｍｅｒｓ．ＰｏｌｙｍｅｒｉｃＭａｔｅｒｉａｌｓａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓｆｏｒＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＵｓｅ”，（Ｅｄｓ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇ＆Ｎａｋａｊｉｍａ）ｐｐ４４１−４５２，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８０）参照、などが得られることは証明されている。表面及び分子にＰＥＧを付着させる際にいくつかの問題が生じた。ＰＥＧ付加用試薬の大半はポリペプチドの遊離一次アミノ基と反応する。これらの遊離アミンの多くはリシンアミノ酸残基のε−ＮＨ₂基である。典型的なタンパク質は多数のリシン残基を有しているので、多数のＰＥＧ分子のランダム付着、即ち、非特異的ＰＥＧ付加がしばしば生じる。非特異的ＰＥＧ付加はタンパク質活性を低下させる。従って、ＰＥＧ付加タンパク質を治療に使用する予定であっても、非特異的ＰＥＧ付加によって多数の種が生じ、再現及び特性決定が可能な性質の生成物が製造され難い。そのため、非特異的ＰＥＧ付加が生じると、治療方法を評価することや、治療の効果及び投薬情報を確定することが難しい。このようなタンパク質の部位選択的なＰＥＧ付加ができれば、活性低下を伴うことなく望ましいＰＥＧ付加だけが与えられるように再現可能に修飾された物質を得ることができよう。特に、国際特許公開ＷＯ９５／１３３１２は、分子及び表面のアミノ部分でなくチオール部分に極めて選択的に結合する水溶性スルホン活性化ＰＥＧを記載している。これらのＰＥＧ誘導体はｐＨ約１１以下の水性環境中で加水分解に対して長期間安定であり、分子と連鎖を形成して、同じく加水分解的に安定なコンジュゲートを形成し得る。ＰＥＧと生物学的活性分子とが結合した連鎖は、チオール部分に結合したスルホン部分を含み、式ＰＥＧ−ＳＯ₂−ＣＨ₂−ＣＨ₂−Ｓ− Ｗで示される構造を有しており、式中のＷは生物学的活性分子を表し、スルホン部分はビニルスルホンまたは活性エチルスルホンである。このようなスルホン活性化リンカーによって修飾され得る生物学的活性分子の一例は、ＴＮＦ結合タンパク質（“ＴＮＦｂｐ”）（ＴＮＦ阻害物質又はＴＮＦ抑制剤とも呼ばれる）である。ＴＮＦｂｐはリューマチ様関節炎及び敗血症ショックのようなＴＮＦ介在疾患を治療する治療薬として重要である。ＴＮＦ結合タンパク質は当業界で開示されている。例えば、ＥＰ３０８，３７８、ＥＰ３９３，４３８、ＥＰ４２２，３３９、ＷＯ９０／１３５７５、ＥＰ３９８，３２７、ＥＰ４１２，４８６、ＷＯ９１／０３５５３、ＥＰ４１８，０１４、ＪＰ１２７，８００／１９９１、ＥＰ４３３，９００、米国特許Ｎｏ．５，１３６，０２１、ＥＰ５１２，５２８、ＥＰ５２６，９０５、ＷＯ９３／０７８６３、ＥＰ５６８，９２８、ＷＯ９３／２１９４６、ＷＯ９３／１９７７７、ＥＰ４１７，５６３、ＧＢ２，２４６，５６９、１９９６年７月９日出願の米国特許仮出願Ｎｏ．６０／０２１４４３、１９９６年１２月６日出願の米国特許仮出願Ｎｏ．。これらの文献の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。参照によって本発明に含まれるＷＯ９２／１６２２１は、式Ｒ₁−Ｘ−Ｒ₂(“ ダンベル（ｄｕｍｂｂｅｌｌ）”化合物と呼ばれる）によって表される形態のＴＮＦｂｐを記載している。式中のＲ₁及びＲ₂は生物学的に活性のＴＮＦｂｐ基であり、Ｘは少なくとも１つのマイケルアクセプター基、例えばスルホン活性化ＰＥＧを有している非ペプチド性ポリマースペーサーである。ｃ１０５ＴＮＦｂｐムテインダンベルと呼ばれる１つの特定化合物は、式中のＲ₁及びＲ₂がｃ１０５３０ｋＤａＴＮＦｂｐムテインを表し、Ｘが２０Ｋのポリエチレングリコールビス−ビニルスルホン（２０ｋＤａのＰＥＧｂｖ）を表すホモダンベル化合物であり、Ｒ₁及びＲ₂がシステイン１０５残基でＰＥＧｂｖに部位特異的に結合している。モノ、ジまたはポリＰＥＧ付加化合物を製造するときに当業者がしばしば遭遇する問題は、２０ｋＤａＰＥＧｂｖまたは他の活性化リンカーの合成手順が、使用される合成手順次第ではいくつかの欠点を有することである。例えば、種々の分子及び表面に付着させるリンカーとして有用な官能基によってＰＥＧを活性化する慣用の方法は概して労働集約的及び時間集約的である。このような方法はしばしば、所望の生成物を製造するためにマルチステップ反応手順を必要とする。従って、所望のコンジュゲートを形成するために使用できる活性化リンカーの効率的な製造方法が要望されている。特に問題となる別の欠点は、得られた２０ｋＤａＰＥＧｂｖがしばしば、高分子量のＰＥＧ不純物とＰＥＧモノビニルスルホン種とＰＥＧビス−ビニルスルホン種とを含むことである。これらの不純物は所望の化合物の総収率に不利な影響を与える。従ってまた、ＰＥＧｂｖまたは他の活性化リンカーを更に精製し、これによって所望の化合物の純度及び総収率を改善する方法が要望されている。低及び中分子量（＜５Ｋ）のＰＥＧをサイズに基づいて分離する逆相高速液体クロマトグラフィー（ｒｐＨＰＬＣ）の使用に関しては多くの研究グループが報告している。例えば、Ｍｕｒｐｈｙら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔ．，２１１；１６０ −１６５（１９８１）；Ｌａｉら，Ｊ．ＨｉｇｈＲｅｓ．Ｃｈｒｏｍ．＆Ｃｈｒｏｍ．Ｃｏｍｍ．,７：４９４−４９６（１９８４）；Ｂａｒｋａ＆Ｈｏｆｆｍａｎ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔ．，３８９：２７３−２７８（１９８７）参照。これらの技術は比較的有効ではあるが、高価な樹脂と有機溶媒とを使用するという欠点がある。また、これらの方法は、製造用手順ではなくむしろ分析用手順である。ＨＰＬＣを用いてより大きい分子量のＰＥＧの分離に成功したという報告はない。中及び高分子量（１Ｋ〜４０Ｋ）のＰＥＧは、誘導体化した種々のシリカ支持体を用いたサイズ排除クロマトグラフィーによって分析されていた。Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔ＆Ｍａｔｈｅｓ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔ．，１８５：３０５（１９７９）参照。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、生体分子の分析用及び製造用の精製方法として定評がある。ＨＩＣの基礎となる化学的原理は、すべての処理が疎水性に基づくという点で塩沈殿の原理と同様であり、逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰＬＣ）に関連する原理に近い。ＨＩＣは、高い塩濃度で弱い疎水性の表面に分子を吸着させ、次いで漸減する塩勾配を用いて溶出させる。従って、ＨＩＣの特徴は、高い活性回収率を得るために、塩沈殿の非変性的という特徴とクロマトグラフィーの精度とを結び付けたことにある。更に、ＨＩＣは低い結合エネルギーで作用できるので、移動相に高価な有機溶媒を使用する必要がない。ＰＥＧを分離するため、特に高分子量ＰＥＧを分離するためにＨＩＣ樹脂を使用することがこれまでに報告されたことはない。ＰＥＧはサイズに関わりなく相対的に同じ疎水性を有しているので、当業者はＨＩＣがサイズに基づくＰＥＧの分離に有効であるとは予想していなかった。発明の概要本発明は、種々の目的に有用な活性化リンカーの新規な製造及び精製方法を提供する。簡単に説明すると、本発明の活性化リンカーの製造方法は、反応性ヒドロキシル基を有する化合物を入手し、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を転換用溶媒として用いてヒドロキシル基を反応性マイケルアクセプターに変換することによって、活性化リンカーを形成する方法である。活性化リンカーの精製方法は、ＨＩＣを使用して、サイズ及び末端基の官能性に基づいてリンカーを分離する。より特定的には、本発明の目的は、２０ｋＤａのポリエチレングリコールビス −ビニルスルホン（“２０ｋＤａＰＥＧｂｖ”）を製造及び精製するために、ブチルまたはフェニルＨＩＣ樹脂を使用して、ＰＥＧビス−ビニルスルホンから高分子量ＰＥＧ不純物及びＰＥＧモノ−ビニルスルホンを分離する方法である。重要な点は、このような精製方法は有機溶媒の添加を必要としないことである。より重要な点は、精製された活性化リンカーは種々のタンパク質を修飾するために使用でき、非精製の活性化リンカーによって形成されたコンジュケートに比較して劇的に向上した純度及び総収率で生物学的に活性のコンジュゲートを与えることである。例えば、アルコール、及び特に−ＯＨ官能基をもつポリマーのような少なくとも１つの反応性ヒドロキシ基をもつ化合物を使用し得る。ホモポリマー、ランダムもしくはブロックコポリマーまたはターポリマーのようなポリマーが有用であり、特に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）類、ポリプロピレングリコール類、ポリアルキレンオキシド類、ポリオキシエチル化ポリオール類及びポリビニルアルコールが有用である。これらのうちで、２ｋＤａ〜１００ｋＤａダルトンの範囲の分子量をもつポリエチレングリコールが特に有用であり、なかでも、分子量３．４ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａまたは２０ｋＤａのＰＥＧが有用である。このようなＰＥＧはＰＥＧジオールの形態を有していてもよい。上記方法に使用できる反応性スルホン基を有する有用な試薬の非限定例は、ビニルスルホン及びジビニルスルホンである。１個または２個の反応性ヒドロキシ基を有するＰＥＧと共に使用されると、方法によってＰＥＧ−ビニルスルホン及びＰＥＧ−ビス−ビニルスルホンが夫々生成される。このような活性化リンカーは、モノＰＥＧ付加化合物の製造、並びに、リンカーが２つ以上の部分に付着し得るダンベル化合物及び多量体化合物の製造に使用できる。ＴＨＦを溶媒として用い１：１０〜１：５０（重量／容量）の範囲のＰＥＧ対ＴＨＦ比で添加すると本発明の方法に有用であることが判明した。１：３０の比が特に有用であることが判明した。使用できると考えられる生物学的活性分子は、合成分子、天然産生分子または修飾された天然産生分子のいずれでもよい。本発明の１つの特徴によれば、２ｋＤａ〜１００ｋＤａの範囲の分子量を有するＰＥＧまたは別の活性化リンカーを、慣用のクロマトグラフィー方法を用いてＨＩＣ樹脂に保持させ、ＨＩＣ樹脂から溶出させる。好ましい実施態様では、逆直線状塩勾配を用いてリンカーを樹脂から溶出させる。従って、サイズ及び／または末端基の官能性に基づいて種々の形態のリンカーが分離される。好ましくは、リンカーはスルホン活性化リンカーであり、ＨＩＣ樹脂はブチルまたはフェニルＨＩＣ樹脂から成る。ブチル−６５０ＭのＨＩＣ樹脂を用い、２０ｋＤａのポリエチレングリコールビニルスルホンまたはビス−ビニルスルホン（“２０ｋＤａＰＥＧｂｖ”）を精製する方法を提供する。本発明の更に別の特徴によれば、ＨＩＣ精製した非ペプチド性ポリマーリンカーを生物学的活性分子と反応させることによって、同じ分子を含有するこれまでに記載された化合物に比較して改良された総純度及び収率でダンベル化合物が得られる。好ましくは、ＨＩＣ精製されたポリマーリンカーがスルホン活性化ＰＥＧであり、生物学的活性分子は、ＴＮＦ阻害物質、インターロイキン１のレセプターアンタゴニスト（“ＩＬ−１ｒａ”）、血小板由来増殖因子（“ＰＤＧＦ”）のエキソン６ペプチド、インターロイキン２(“IL− ２”）の阻害物質及びレセプター（“ＩＬ−２ｒ”）から成るグループから選択される。特に好ましい実施態様では、ＨＩＣ精製されたポリマーリンカーが２０ｋＤａのビニルスルホンまたはＰＥＧｂｖであり、生物学的活性分子がＴＮＦｂｐである。本発明の化合物を含有する医薬組成物も本発明の範囲に包含される。図面の簡単な説明ムから溶出する種々のＰＥＧジオールの溶出プロフィルを示す。ＰＥＧ含有画分をネスラー試薬で検出し、ＳＥＣＨＰＬＣを用いて実施例３に記載の手順で分子量を確認した。ラム（ベッドボリューム１ｍｌあたり２ｍｇのローデイング）から溶出する２０ｋＤａのＰＥＧｂｖ及び高分子量ＰＥＧｂｖの溶出プロフィルを示す。ＰＥＧ濃度をネスラー試薬で測定し、ＳＥＣＨＰＬＣを用い実施例３に記載の手順で分子量不純物の％を測定した。ムから溶出する２０ｋＤａのＰＥＧｂｖ（ベッドボリューム１ｍｌあたり２ｍｇのローディング）の溶出プロフィルを示す。ＰＥＧ含有画分をネスラー試薬で検出し、６００ｎｍの混濁度を測定した。図４は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣカラムから溶出するＨＩＣ非精製の２０ｋＤａＰＥＧｂｖの溶出プロフィルを示す。図５は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣカラムから溶出するＨＩＣ精製した２０ｋＤａＰＥＧｂｖの溶出プロフィルを示す。ＨＩＣ精（ベッドボリューム１ｍｌあたり８ｍｇのローディング）を使用した。図６は、ＴＮＦｂｐのＰＥＧ付加混合物（ＨＩＣ非精製の２０ｋＤａＰＥＧｂｖを使用した混合物）の典型的なＰＯＲＯＳ^TMＨＳカチオン交換溶出プロフィルを示す。図示のような種々のＴＮＦｂｐピークが観察される。図７は、ＴＮＦｂｐのＰＥＧ付加混合物のＰＯＲＯＳ^TMＨＳカチオン交換溶出プロフィルを示す。ＰＥＧ付加混合物は、ｋＤａＰＥＧｂｖを使用し実施例５に記載の手順で調製した。図８は、ＴＮＦｂｐのＰＥＧ付加混合物のＰＯＲＯＳ^TMＨＳカチオン交換溶出プロフィルを示す。ＰＥＧ付加混合物は、ＨＩＣ非精製の２０ｋＤａＰＥＧｂｖを使用し実施例５に記載の手順で調製した。図９は、ＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムから溶出するｃ１０５ＴＮＦｂｖムテインダンベルの溶出プロフィルを示す。Ａ２８０吸光度を経時的にプロットする。ｃ１０５６５０ＭＨＩＣで精製した２０ｋＤａＰＥＧｂｖを用いて調製した。図１０は、ＳＰ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＨＰカラムから溶出するｃ１０５ＴＮＦｂｖムテインダンベルの溶出プロフィルを示す。Ａ₂₈₀吸光度を経時的にプロットする。ｃ１０５ＴＮＦｂｖムテインダンベルは、ＨＩＣ非精製の２０ｋＤａＰＥＧｂｖを用いて調製した。ブチル６５０ＭＨＩＣ精製によって得られた“初期溶出”画分のＰＯＲＯＳ^TMＨＳカチオン交換溶出プロフィルを示す。ＰＥＧ付加混合物は実施例６に記載の手順で調製した。詳細な説明活性化ポリエチレングリコール及びその他の活性化リンカーの製造及び精製方法を、より詳細に以下に検討し、実施例で説明する。実施例は本発明の種々の特徴を示しており、スルホン活性化ＰＥＧ、２０ｋＤａのポリエチレングルコールビニルスルホンまたはビス−ビニルスルホン（“２０ｋＤａＰＥＧｂｖ”）を製造する“ワンステップ”方法の使用、及び、高分子量ＰＥＧ不純物を分離するためのブチル及び／またはフェニルＨＩＣ樹脂の使用によって得られた結果を示している。これらの結果は意外にも、ＨＩＣもまた、２０ｋＤａＰＥＧｂｖからＰＥＧモノ−ビニルスルホンを分離し、得られた精製２０ｋＤａＰＥＧｂｖは、ＴＮＦｂｐのＰＥＧ付加に使用されたとき、ＨＩＣ非精製の２０ｋＤａＰＥＧｂｖまたはマルチステップ手順で合成された２０ｋＤａＰＥＧｂｖを用いて調製されたコンジュゲートに比較して劇的に向上した総収率及び純度で生物学的に活性のコンジュゲートを生成することを示した。本発明の活性化リンカーの製造方法では、反応性ヒドロキシル基を有する化合物を入手し、変換用溶媒としてテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）を用いてヒドロキシル基を反応性マイケルアクセプターに変換する。任意に、反応性ヒドロキシル基を有する化合物を先ずトルエンに溶解し、次いで、ヒドロキシル基をマイケルアクセプターに変換する前に乾燥または蒸発させてもよい。次に、乾燥した化合物に溶媒としてＴＨＦを添加することによって変換段階が完了する。変換段階では、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＤＭＳＯなどの種々の溶媒を使用できるが、ＴＨＦが好ましい。ＴＨＦはカチオンのキレート化剤であるため、これを溶媒として使用すると、変換反応中に塩基カチオンのキレート化が促進されて負電荷をもつ酸素が遊離され、この酸素が、カルボニル、ニトリルまたはスルホン基を含む試薬と反応してマイケルアクセプターを形成できる。上記方法で使用される適当な塩基は例えば、ピペリジン、ピリジン、トリエチルアミン、水酸化ベンジルトリメチルアンモニウム（トリトンＢ）、及び、水酸化カリウムである。カチオンを含む強塩基が好ましい。このような強塩基の例は、ナトリウムまたはカリウムのｔｅｒｔ−ブトキシド、ナトリウムまたはカリウムのアルコキシド、金属アミド、並びに、ナトリウムまたはカリウムの水素化物である。次に、反応性カルボニル、ニトリルまたはスルホン基を有している試薬を添加し、次いで塩基を添加する。これらの方法によって形成された活性化リンカーを次に、適当な溶媒を用いて沈殿させ、濾過などの当業者に公知の任意の手段によって単離して、精製された活性化リンカーを得る。適当な溶媒は例えば、エーテル類特にジエチルエーテル及びジプロピルエーテル、アルコール類、ヘキサン、キシレンなどである。本発明の活性化リンカーの製造方法を、マルチステップを要する公知の方法と対比して“ワンステップ”方法と呼ぶ。ワンステップ方法は例えば以下のように図示し得る。少なくとも１つの反応性ヒドロキシル基を有する任意の化合物は本発明方法に使用できると考えられる。“反応性ヒドロキシル基”なる用語は、塩基を還元し得る水素を含む−ＯＨ基を意味しており、この−ＯＨ基は、カルボニル、ニトリルまたはスルホン基を有する試薬と反応してマイケルアクセプターを形成し得る酸素を遊離する。本発明方法に有用なヒドロキシル含有化合物としては例えば、アルコール類、ポリマー類、ヌクレオチド類、ヌクレオシド類、オリゴヌクレオチド類、ペプチド類、制御ポアガラス及びクロマトグラフ物質など、数例を挙げることができる。有用なポリマーは例えば、ポリエチレングリコール（ “ＰＥＧ”）、ポリプロピレングリコール（“ＰＰＧ”）、ポリオキシエチル化グリセロール（“ＰＯＧ”）及びその他のポリオキシエチル化ポリオール類、ポリビニルアルコール（“ＰＶＡ”）及びその他のポリアルキレンオキシド類、ポリオキシエチル化ソルビトールまたはポリオキシエチル化グルコースである。ポリマーは、少なくとも１つの活性ヒドロキシ部分を有している限り、ホモポリマー、ランダムもしくはブロックコポリマー、ターポリマーのいずれでもよく、直鎖状または分枝状、置換または未置換のいずれでもよい。重合部分はいかなる鎖長または分子量でもよいが、これらの特性値が生物学的特性に影響を与えることもある。医薬用途におけるクリアランス速度を低下させるために有用なポリマーの平均分子量は、２，０００〜３５，０００ダルトンの範囲である。特に有用なＰＥＧの分子量は３．４ｋＤａ、５ｋＤａＮ１０ｋＤａ及び２０ｋＤａである。本文中で使用された“ＰＥＧ”なる用語は、エチレングリコールのいくつかの縮合ポリマーのいずれかを意味する。ＰＥＧはまた、ポリオキシエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリグリコール及びポリエーテルグリコールとして知られている。ＰＥＧはまた、エチレンオキシドと多くの別のモノマーとのコポリマーとして製造され得る。ＰＥＧの末端基は、ビニルスルホン部分、アルデヒド部分、メトキシ基またはその他の種類の反応性もしくは非反応性の末端基を含むように種々の方法で誘導体化され得る。医薬用またはバイオ技術用の多くの用途の場合、ビニルスルホン以外は実質的に未置換の実質的に線状の直鎖状ビニルスルホン活性化ＰＥＧが使用されるであろう。このような化合物のヒドロキシル基は、ヒドロキシル基をマイケルアクセプターに変換し得る反応性カルボニル、ニトリルまたはスルホン基を有する試薬と反応する。反応性カルボニル、ニトリルまたはスルホン基を有する当業者に公知のいかなる試薬も本発明方法に使用できると考えられる。“反応性カルボニル、ニトリルまたはスルホン”なる用語は、２つの炭素基が結合し、約９以下のｐＨでチオール特異的結合に好適な反応性部位をカルボニル、ニトリルまたはスルホン基の第二の炭素に有しているカルボニル、ニトリルまたはスルホン基を意味している。本発明の好ましい実施態様では、本発明のポリマー誘導体が活性スルホン部分を有している。“活性スルホン”なる用語は、２つの炭素原子が結合し、ｐＨ約以下でチオール特異的結合に好適な反応性部位をスルホン基の第二の炭素に有しているスルホン基を意味している。活性スルホンの非限定例は、ビニルスルホン及び活性化エチルスルホンである。スルホン活性化ポリマーは、約９以下のｐＨで第二の炭素のチオール特異的反応性が維持されている限り、更に別の置換基で置換されていてもよい。このような試薬を添加すると、ヒドロキシル基が反応性マイケルアクセプターに変換される。“マイケルアクセプター”または“マイケル様アクセプター”なる用語は、互換的に使用され、マイケル付加に感受性の官能基を意味する。“マイケル付加”では、電気陰性原子を有するパイシステムに隣接の求電子性中心に対して求核性攻撃が生じる。電気陰性原子を有するパイシステムの例は、スルホキシド、スルホニル、カルボニル及び複素環芳香族である。求核剤が求電子性中心に付加される。マイケルアクセプターは式：〔式中、Ｅは電気陰性原子を表す〕によって表される。４位に付加が生じて、式：〔式中、Ｎ_uは４位の原子に糸真合された求核剤を意味する〕が形成される。マイケルアクセプター官能基の非限定例は、マレイミド及びビニルスルホンである。ダンベルを形成するために使用される活性化リンカーはマイケルアクセプターのビニルスルホン種を含んでいてもよいが、必ずしも含んでいなくてもよい。本発明の活性化リンカーは２つ以上の反応性基を有し得る。誘導体は一官能価、二官能価または多官能価のいずれでもよい。少なくとも１つの活性スルホン部分が存在する限り、反応性基は同じでもよく（ホモ官能性）、または異なっていてもよい（ヘテロ官能性）。特に有用な２つのホモ官能性誘導体はＰＥＧ−ビス−クロロスルホン及びＰＥＧ−ビス−ビニルスルホンである。本発明方法によって製造されたリンカーはチオール選択的結合反応に好適な安定で単離可能なリンカーである。例えば、ＰＥＧクロロエチルスルホンは約７以下のｐＨで水に安定であるが、少なくともｐＨ約９までの塩基性ｐＨ条件でチオール選択的結合に有利に使用できる。ｐＨが約９よりも高いとき、チオール選択性が低下し、スルホン部分はアミノ基に対して多少反応性になる。チオールとの反応によって形成された連鎖はまた加水分解的に安定である。本文中で使用された“加水分解的に安定”なる用語は、ポリマーとスルホン部分との連鎖及びコンジュゲーション後のスルホン−チオール連鎖が、約１１よりも低いｐＨでは少なくとも３日間は水と反応しないことを意味する。有意な速度の加水分解が生じるとき、ポリマーと生物学的活性分子のチオールとの反応が生じる前にポリマーが失活することがあるので、加水分解的に安定であることは望ましい要件である。活性化リンカーの普遍的な精製方法は以下の段階を含む。（１）活性化リンカーを合成する、（２）活性化リンカーをＨＩＣ樹脂に保持させる、次いで、（３）種々のリンカー形態をサイズ及び／または末端基官能性に基づいて分離し得る条件、例えば逆直線状塩勾配を用いてＨＩＣ樹脂からリンカーを溶出させることによって所望のリンカー形態を単離する。あるいは、“ワンステップ”合成手順の濃縮／透析濾過段階の直前にＨＩＣ精製段階を組込んでもよい。本発明に使用できると考えられるＨＩＣは、メタクリル、アガロースまたはビニル主鎖を非限定例とする親水性ビニルコポリマー主鎖をもつ樹脂の表面に疎水性側基（例えば、オクチル、ブチル、フェニルまたはエーテル）が局在しているポリマー樹脂を使用する。シリカベースの主鎖も使用できる。好ましいＨＩＣカラムはメタクリル主鎖にブチルまたはフェニル配位子を有している。上述のように、ＨＩＣ精製したスルホン活性化リンカーは、 “反応性チオール部分”を有する生物学的活性分子に付着して、生物学的に活性のコンジュゲートを形成し得る。“反応性チオール部分”なる用語は、本文中に記載のような活性化リンカーと反応し得るスルフヒドリル（−ＳＨ）基を意味する。本発明に使用できると考えられる生物学的活性分子の非限定例は、医薬、ビタミン、栄養素、核酸、アミノ酸、ポリペプチド、酵素補因子、ステロイド、糖質、ヘパリンのような有機種、金属含有物質、レセプターアゴニスト、レセプターアンタゴニスト、結合タンパク質、レセプターまたはレセプターの部分、細胞外マトリックスタンパク質、細胞表面分子、抗原、ハプテン及びキレート化剤である。一般に、本発明に有用なＴＮＦｂｐは、ヒトＴＮＦｂｐの配列またはその先端欠失変異体（ｔｒｕｎｃａｔｅｄｖａｒｉａｎｔｓ）またはムテイン（ｍｕｔｅｉｎｓ）の配列を有している。３０ｋＤａのＴＮＦｂｐと命名された１つのＴＮＦｂｐは、ｐ５５ＴＮＦレセプターの細胞外部分である。ｉｎｖｉｖｏではレセプターの細胞外部分が脱落し、ＴＮＦに結合する３０ｋＤａのグリコシル化タンパク質として血流中を循環する。このＴＮＦｂｐの精製及びそのアミノ酸と核酸との配列に関しては、ＥＰ３９３４３８及びＥＰ４２２３３９に記載されている。これらの特許の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。これらの文献はまた、３０ｋＤａＴＮＦｂｐのグリコシル化形態及び脱グリコシル化形態の組換え産生を教示している。この阻害物質の脱グリコシル化形態の実際の分子量はほぼ１８ｋＤａであるが、“３０ｋＤａＴＮＦ阻害物質”なる用語は、グリコシル化形態と脱グリコシル化形態との双方を包含する。４０ｋＤａＴＮＦｂｐと呼ばれる別のＴＮＦ阻害物質の精製及びアミノ酸と核酸配列との配列もＥＰ３９３４３８及びＥＰ４２２３３９に記載されている。この阻害物質はその天然産生形態ではｐ７５ＴＮＦレセプターのグリコシル化細胞外部分である。脱グリコシル化形態の分子量は４０ｋＤａではないが、このＴＮＦｂｐのグリコシル化形態と脱グリコシル化との双方を“４０ｋＤａＴＮＦ阻害物質”と呼ぶ。これらの参考文献はまた、４０ｋＤａＴＮＦｂｐのグリコシル化形態と脱グリコシル化形態との組換え産生を教示している。反応性チオール基は必要なときに生物学的活性分子に導入され得る。チオール基はまた、チオール−スルホンの連結が所望の活性を実質的に破壊しない限り、不活性分子に導入されて生物学的活性分子を形成し得る。反応性チオール基は当業界で公知の化学的手段によって導入され得る。化学的修飾はポリペプチドまたは非ペプチド分子と共に使用でき、チオールを単独でまたは例えばシステイン残基のようなより大きい基の一部分として分子に導入する。チオールの化学的導入の一例がＪｕｅ，Ｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７：５３９９−５４０６（１９７８）に記載されている。また、システインを例えばＤＴＴで化学的に還元することによってポリペプチド中に遊離システインを生じさせてもよい。システインを含むムテインを産生するためには、必須でないアミノ酸をシステインで置換してもよくまたはポリペプチドにシステイン残基を付加してもよい。修飾前の天然型タンパク質には存在しなかった位置にアミノ酸残基を含むように修飾されたポリペプチドを“ムテイン（ｍｕｔｅｉｎ）”と命名する。非天然型システインの導入可能部位は、ポリペプチドのグリコシル化部位及びＮ末端またはＣ末端である。リシン残基はしばしば活性コンホメーションのタンパク質の表面に見出されるので、リシンからシステインへの突然変異も好適である。当業者は更に、可能な突然変異部位を選択するために、ポリペプチドの結合部位または活性部位に関する公知のいかなる情報も利用できる。当業者はまた、システインを含むムテインを製造するために公知の組換えＤＮＡ技術を使用し得る。標準的な部位特異的突然変異誘発によって天然型ポリペプチドをコードする核酸をムテインをコードするように改変し得る。標準突然変異誘発技術の例は、Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８２：４８８−４９２（１９８５）及びＫｕｎｋｅｌ，Ｔ．Ａ．ら，ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ．，１５４：６７−３８２（１９８７）に記載されている。双方の文献の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。あるいは、当業界で公知の技術によってムテインをコードする核酸を化学的に合成し得る。ＤＮＡ合成機を使用することができ、これは例えばＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）から入手し得る。所望のムテインをコードする核酸を、動物、昆虫及び細菌系のような種々の発現系において発現させ得る。反応性チオール基を有する生物学的活性分子とスルホン活性化ポリマーリンカーとの連鎖は共有結合であり、このようなコンジュゲートの普遍的な製造方法は以下の段階を含む。（１）所望の生物学的活性分子を選択する、（２）所望のスルホン活性化ポリマーリンカーを合成する、（３）ＨＩＣクロマトグラフィーを用いてスルホン活性化ポリマーリンカーを精製する、（４）ＨＩＣ精製したスルホン活性化ポリマーリンカーを生物学的活性分子と反応させる、（５）当業界で公知のクロマトグラフィー技術を用いて反応生成物を単離する、次いで、（６）形成されたコンジュゲートの生物学的活性を適切なバイオアッセイを用いて測定する。既に製造されている３０ｋＤａＴＮＦｂｐのムテインとしては、ｃ１０５３０ｋＤａＴＮＦｂｐ；ｃ１３０ｋＤａＴＮＦｂｐ；ｃ１４３０ｋＤａＴＮＦｂｐ；ｃ１１１３０ｋＤａＴＮＦｂｐ；及びｃ１６１３０ｋＤａＴＮＦｂｐがある。“ｃ”はシステインを意味しており、“ｃ１０５”はシステインが１０５位に挿入されたことを意味する。これらのムテインは参照によって本発明に含まれる国際特許公開ＷＯ９２／１６２２１に記載の手順で製造され、アミノ酸番号も該特許に記載のアミノ酸配列に基づく。ＧＢ２，２４６，５６９は、“３ドメイン”の３０ｋＤａ及び／または０ｋＤａのＴＮＦｂｐ、即ち、第４ドメインが欠失したものを教示している。１９９５年７月９日出願の米国特許仮出願Ｎｏ．６０／０２１４４３は、“２．６ドメイン”の３０ｋＤａのＴＮＦｂｐ、即ち、第３ドメイン及び第４ドメインの一部が欠失したものを教示している。また、１９９６年１２月６日出願の米国特許仮出願Ｎｏ．は、“２．６ドメイン”の３０ｋＤａ及び／または４０ｋＤａのＴＮＦｂｐ、即ち、第３ドメイン及び第４ドメインの一部が欠失したものを教示している。同じく既に製造されているＩＬ−１ｒａのムテインとしては、ｃ０s１１６ＩＬ−１ｒａ；ｃ８４ｓ１１６ＩＬ−Ｉｒａ；ｃ８ｓ１１６ＩＬ−１ｒａ；ｃ９ｓ１１６ＩＬ−１ｒａ及びｃ１４１ｓ１１６ＩＬ−１ｒａがある。ＩＬ −１ｒａムテインの製造及び精製も国際特許公開ＷＯ９２／１６２２１に開示されている。残基の番号はこの公開出願に記載された配列に基づく。“Ｏ”はアミノ酸のＮ末端に対する付加を表す。“ｃ”はシステイン、“ｓ”はセリンを表す。例えば、“ｃ０ｓ１１６”は、システインがＮ末端に付加され、セリンが１１６位に挿入されたことを意味する。天然型のＩＬ−１ｒａは６６、６９、１１６及び１２２位に遊離システイン残基を有している。本発明の多くのコンジュゲートまたは化合物（まとめて“コンジュゲート”と呼ぶ）を含有する医薬組成物を調製し得る。これらのコンジュゲートは、本発明の医薬組成物を形成するために医薬として許容される担体中に存在し得る。本文中で使用された“医薬として許容される担体”なる用語は、有効成分または組成物の投与を受ける患者に副作用を生じない無毒性で通常は不活性の有効成分用ビヒクルを意味する。適当なビヒクルまたは担体は、標準医薬文献、例えば、“Re mington'ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ”，１６ｔｈＥｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｎｇＣｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９８０）に見出される。この文献の記載内容は参照によって本発明に含まれるものとする。このような担体は例えば、炭酸塩バッファ、燐酸塩バッファ、リンゲル液及び生理的食塩水のような水溶液である。更に、担体は、製剤のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、清澄度、色、無菌性、安定性、溶解速度または臭味を矯正または維持するための医薬として許容される他の賦形剤を含有し得る。医薬組成物は、例えば試薬の単なる混合のような当業界で公知の方法によって調製できる。医薬担体の選択及び組成物の適正な調製が予定の用途及び投与形態に依存することは当業者に理解されよう。１つの実施態様によれば、担体及びコンジュゲートが生理的親和性の徐放性製剤を構成する。このような担体中の一次溶媒は水性または非水性のいずれでもよい。更に、担体は、コンジュゲートの安定性、溶解、放出または吸収の速度を矯正または維持するために生理学的に許容される他の賦形剤を更に含有し得る。このような賦形剤は、一回投与量または多数回投与量の形態の非経口投与剤形の薬剤を調製するために常用されている慣用の物質である。医薬組成物を調製した後、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または、脱水もしくは凍結乾燥された粉末のような無菌バイアル中で医薬組成物を保存し得る。このような製剤は、そのままで使用できる形態で保存されてもよく、または、投与直前に再構成を要する形態で保存されてもよい。このような製剤の好ましい保存温度は少なくとも４℃以下、好ましくは−７０℃である。また、コンジュゲートを含有するこのような製剤は生理的ｐＨまたはこれに近いｐＨで保存及び投与されるのが好ましい。現在では、高ｐＨ（即ち８を上回る値）または低ｐＨ（即ち５未満の値）での製剤の投与は望ましくないと考えられている。コンジュゲートを含有する製剤を全身デリバリーの目的で投与する方法には、皮下、筋肉内、静脈内、経口、鼻孔内などの経路、または膣内もしくは直腸内投与する座薬剤がある。コンジュゲートを含有する製剤を局部デリバリーの目的で投与する方法には、関節内、気管内、点滴、または、気道内吸入がある。更に、適当な製剤中のコンジュゲートの経口投与またはデバイスによって消化管の特定部分にコンジュゲートを投与することも望ましい。経口投与のためには、コンジュゲートをカプセル封入する。固体剤形の調製に使用される慣用の医薬として許容される担体を添加するかまたは非添加でカプセル封入コンジュゲートを製剤化し得る。好ましくは、生物学的利用態が最大であり且つ浸透以前の（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ）分解が最小となる様な胃腸管の箇所に製剤の有効部分が放出されるようにカプセルを設計する。コンジュゲートの吸収を促進する追加の賦形剤を混入してもよい。希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤及び結合剤も使用し得る。投与形態にかかわりなく、個々の投薬用量はほぼ患者の体重に基づいて計算する。適正な投薬用量を決定する他の要因は、治療または予防すべき疾病または障害の種類、投与経路、患者の年齢、性別及び病状である。いくつかの実施態様では、投薬用量及び投与形態は、患者の血流中でコンジュゲートが予め選択された濃度範囲になるように計画される。例えば、血漿１ｍｌあたり０．０１ｎｇ未満の濃度のＴＮＦ阻害物質またはＩＬ−１阻害物質の循環を維持しても有効な組成物にはなり得ないと考えられる。逆に、１ｍｌあたり１０μｇを上回るレベルの循環を長期間維持すると望ましくない副作用を生じるであろう。上記製剤の各々を用いる治療の適正投薬用量を決定するために必要な計算をより精密に行う方法は平均的な当業者の常套的な作業であり、特に本文中に開示された投薬用量に関する情報及びアッセイを参考にして特別な実験を要せずに当業者が常套的に実施し得る作業の範囲に包含される。これらの投薬用量は、確立した投薬用量決定アッセイを適当な容量−応答データと共に使用することによって確認され得る。本文に記載のコンジュゲート製剤が獣医薬及びヒト医薬の双方の用途に使用できること、また、“患者”なる用語を限定的に解釈してはならないことに留意されたい。獣医薬として使用する場合にも、投薬用量の範囲は上記と同様である。本発明のコンジュゲートは、ｉｎｖｉｔｒｏ診断アッセイ、医薬組成物の製造、などを非限定例とする種々の用途に使用できる。ＴＮＦｂｐ、ＩＬ−１ｒａを含有するコンジュゲートは単独形態または複数のコンジュゲートを組合せた形態で、成人呼吸障害症候群、肺線維症、関節炎、乾癬、骨髄性及びその他の白血病、虚血／再潅流、喘息、悪液質／無食欲、糖尿病、敗血症ショック、炎症性腸疾患、多発性硬化症、卒中、クローン病、移植拒絶、出血性外傷のような疾病の治療に使用され得る。コンジュゲートはまた、アフィニティクロマトグラフィー（分配）のような多くのｉｎｖｉｔｒｏの使用目的及び当業者に周知の診断目的で使用され得る。例えば、このようなコンジュゲートを固体表面に付着させ、活性化リンカーに結合したレセプターに特異的に結合するリガンドの精製または検出に使用できる。以下の実施例は本発明の種々の特徴をより詳細に説明する。実施例１この実施例は、“ワンステップ”合成手順を用いる活性化リンカー２０ｋＤａＰＥＧｂｖの製造を記載する。２０ｋＤａＰＥＧｂｖの“ワンステップ”合成ポリエチレングリコール（ＰＥＧ−ＤＩＯＬ^TM）は、ＳｈｅａｒｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓＩｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から購入した。ジビニルスルホン、１Ｍのカリウムｔ−ブトキシド（テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中）、トルエン（無水物、ｓｕｒｅｓｅａｌ）、ジ−ｉ−プロピルエーテル（９９＋％、２５ｐｐｍのブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）で阻害した）、及びテトラヒドロフラン（０．０２５％のＢＨＴを阻害物質として含有する無水物、ｓｕｒｅｓｅａｌ）は、ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から得られた。ジクロロメタン（ＯｍｎｉＳｏｌｖｅｎｔ）及びジエチルエーテル（ＥＭ）はＶＷＲＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｏｍｐａｎｙ（Ｄｅｎｖｅｒ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ）から購入した。無水硫酸ナトリウム粉末はＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ（Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）から購入した。２２リットル容の４つ口（１つの口には４５／５０）３つの口には２４／４０のジョイント）の丸底フラスコに、温度計、凝縮器、ゴム隔壁、機械的変速撹拌器を取付け、水の浸漬ヒーターを入れた水浴に浸漬させた。フラスコを正のアルゴン圧力下に維持した。凝縮器を２つ口の丸底フラスコに接続し、このフラスコから真空ラインを接続した。ポリエチレングリコール（２０ｋＤａ、３００ｇ、１５ミリモル）を計量し、漏斗を介して２２リットル容のフラスコに移入し、混合物を撹拌しながら３リットルの無水トルエンをカニューレから導入した。水浴の温度を４５℃に設定し、溶液が透明になるまで（〜１時間）撹拌を継続した。真空下（〜６０ｍｍのＨｇ）に溶媒を蒸発させて乾固した。固体残渣を９リットルの無水テトラヒドロフラン（カニューレから添加）に溶解した。水浴の温度を２５℃に設定した。溶液の温度が２５℃になるまで撹拌を継続した。ジビニルスルホン（６ｍｌ、５９．９７ミリモル）をシリンジから１５分間で添加した。混合物を１０分間撹拌した（７５ｒｐｍ）。カリウムｔ−ブトキシド（ＴＨＦ中に１Ｍ、３ｍｌ、３ミリモル）を滴下漏斗から２５分間で添加した。塩基の添加後、反応混合物を２５℃で６時間撹拌した。次に水浴を４０℃に加熱し、ＴＨＦを蒸発させた（３５０ｍｍのＨｇ）。ジクロロメタンとテトラヒドロフランとの１：１混合物１リットルを固体残渣に添加し、透明溶液が形成されるまで撹拌した。溶液を２５℃に冷却し、急冷（−２０℃)した。撹拌を継続しながらジ−ｉ−プロピルエーテル（１×５リットル）を滴下漏斗から溶液に添加した。凝縮器をフラスコからはずした。濾過用圧力漏斗を可撓針でフラスコに接続し、沈殿物を可撓針から移入して真空下の濾過用漏斗で濾過した（１リットル、７０〜１００μ）。沈殿物を２つの分量に分け、２リットルのエルレンマイヤーフラスコに移入し、１リットル（各々）のｉ−プロピルエーテルと共に撹拌（磁気撹拌器）を３時間継続した。沈殿物を濾過し（２リットル、７０〜１００μ ）、８００ｍｌのジエチルエーテルで洗浄し、乾燥器に入れて真空下（５ｍｍのＨｇ）で７２時間乾燥した。測定収量は２７８．６ｇであった（ポリエチレングリコールの重量を基準として９１．６％の回収率）。生成物をエルレンマイヤーフラスコ（２リットル）に移入し、１リットルのジクロロメタン（ＯｍｎｉＳｏｌｖｅｎｔ）を添加した。生成物が完全に溶解した後、機械的撹拌器を取付けた５リットル容のドロップボトムフラスコに溶液（シロップ形態）を移入した。エルレンマイヤーフラスコを別の５００ｍｌのジクロロメタンで洗浄し、溶液をドロップボトムフラスコに添加した。次に、溶液を５分間撹拌（６５ｒｐｍ）した。飽和塩化ナトリウム（１リットル）を添加し、５分間撹拌（７５ｒｐｍ）した。２層の分離が明瞭になるまで混合物を静置した。有機層を取出し、別の容器に保存した。このプロセスを３回繰返し、全部の有機層を一緒にした。次に、溶液を２つの分量に分け（各３リットル）、２つのエルレンマイヤーフラスコ（４リットル）に移入し、５００ｇの無水硫酸ナトリウム粉末（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）と共に磁気撹拌器で室温で１６時間撹拌した（このプロセス中は終始フラスコをアルミホイルで完全に被覆しておく）。溶液を濾過用漏斗で濾過し（２リットル、７０〜１００μ）、水浴（４０℃）に維持しておいた２２リットル容の４つ口フラスコに濾液を移入した。真空下（２８５〜３６０ミリバール）で溶媒を蒸発させ、残渣（高度に粘性の液体）をジクロロメタンとＴＨＦとの１：１混合物（１リットル）に再溶解した。次に、前記と同様に溶液を沈殿させ、濾過し、乾燥した。測定収量は２２１．０ｇであった（ポリエチレングリコールの重量を基準として７２．６７％の回収率）。実施例２この実施例は、Ｂｕｔｙｌ、Ｐｈｅｎｙｌ及びＥｔｈｅｒＨＩＣ樹脂の２０ｋＤａＰＥＧｂｖに対する結合能力を試験するように設計した一連のローディング及び溶出実験を記載する。使用アッセイ１．ＰＥＧアッセイＰＥＧ含有画分をネスラー試薬（Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈ）によって検出した。典型的には、ガラス試験管に入れたカラム画分の０．２５ｍｌアリコートに０．０１ｍｌのネスラー試薬を添加する。ネスラー試薬を添加すると、ＰＥＧ含有画分は乳状沈殿物を形成した。２．ＰＥＧ定量分析ガラス試験管にネスラー試薬（１．５ｍｌ）を添加し、次いで１８．７５マイクロリットルの被験サンプルを添加した。試験管を回転させ、１０〜１５分間静置し、ネスラー試薬だけを入れたブランクに比較して６００ｎｍの混濁度を読取った（ＢｅｃｋｍａｎＤＵ７０分光光度計）。次に、１．５、１．０、０．７５、０．５０及び０．２５ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ標準から作成した標準曲線からＰＥＧを定量した。実験手順Ｐｈｅｎｙｌ及びＥｔｈｅｒ６５０ＣＨＩＣカラム（ＴｏｓｏＨａａｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）を使用した。種々の濃度のＮａＣｌまたは硫酸ナトリウム中の１０ｍｇ（ベッドボリューム１ｍｌあたり２ｍｇ）の２０ｋＤａＰＥＧｂｖをカラムに保持させ、重力を利用して水で溶出させた。全部の実験を室温で実施し、手動操作によって０．５〜１．０ｍｌの画分を１３×１００ｍＭのガラス試験管に集めた。ネスラーのアッセイでＰＥＧを測定した。表１は、種々のＨＩＣ樹脂に２０ＫＰＥＧｂｖを完全結合（即ち、フロースルー液中に検出可能なＰＥＧｂｖが存在しない）させるために必要な塩濃度を示す。表１樹脂ＮａＣｌ濃度硫酸ナトリウム濃度 Phenyl ６５０Ｃ２．２５Ｍ０．３５Ｍ Butyl ６５０Ｃ１．７５Ｍ０．２５Ｍ Ether ６５０Ｃ＞＞２Ｍ＞＞０．５Ｍ表１に示すように、Ｂｕｔｙｌ６５０ＣＨＩＣ樹脂は、Ｐｈｅｎｙｌ６５０ＣＨＩＣ樹脂よりもＰＥＧに対する親和性がやや大きい。また、Ｅｔｈｅｒ６５０ＣＨＩＣ樹脂は２ＭのＮａＣｌまたは０．５Ｍの硫酸ナトリウムの濃度で保持されたＰＥＧに全く結合しなかった。実施例３この実施例では、ＢｕｔｙｌＨＩＣ樹脂の、様々なＰＥＧジオールを大きさに基づき分離する能力を試験するべく計画された実験について説明する。ＰＥＧ含有画分を先に述べたＰＥＧアッセイを用いて確定し、ＰＥＧの分子量をＳＥＣＨＰＬＣによって確認した。用いたアッセイ：１．サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）ＨＰＬＣアッセイＨＩＣ精製したＰＥＧ画分のサイズ排除クロマトグラフィーを、Ｔｏｓｏ−ＨａａｓＧ３０００_swxlカラム（Ｓｙｎｃｈｒｏｍ，Ｉｎｃ．，Ｌｉｎｄｅｎ，ＮＪ）を用いて実施した。１００〜２００μｌ試料を０．５〜１．０ｍｇ／ｍｌで注入する。カラムは室温で管理し、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．００４％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ｐＨ６．５中で平衡させた。カラムからＰＥＧを、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、及び０．００４％ＳＤＳ、ｐＨ６．５を含有する緩衝液を用いて溶離した。幾つかの実験ではＲｅｆｒａｃｔｉｖｅＩｎｄｅｘ検出器（ｄｅｔｅｃｔｏ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いてＰＥＧの溶離を監視した。他の実験ではまずＰＥＧをｏ−チオ安息香酸で誘導体化し、それによって２５４ｎｍでのＵＶ吸光度により溶出液を監視できるようにした。実験操作：ム（１．５×１１ｃｍ）に、カラム床体積（ベッドボリュウム）１ｍｌ当たり合計で３ｍgのＰＥＧジオールを導入（ローディング）した。カラムは４ＭＮａＣｌ中で平衡させた。導入物は体積９．７ｍｌで、２．９７ｋＤａ、１１．９ｋＤａ、２０ｋＤａ及び５０ｋＤａＰＥＧジオールを各１．５ｍｇ／ｍｌの量で含有した（２．９７ｋＤａ及び１１．９ｋＤａＰＥＧジオールはＰｏｌｙｍｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、２０ｋＤａ及び５０ｋＤａＰＥＧジオールはＳｈｅａｒｗａｔｅｒＰｏｌｙｍｅｒｓから購入した）。導入後、カラムをカラム容量の２倍量の４ＭＮａＣｌで洗浄し、カラム容量の１５倍量の、線形濃度勾配３→１ＭのＮａＣｌで溶離した。導入、洗浄及び溶離ステップで、流量は２．５ｍｌ／分とした。３分（７．５ｍｌ）画分を回収し、該画分をＰＥＧに関して分析した。溶離プロフィールを図１に示す。サイズ排除ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって確認した四つのピークの分子量は、図中に示したとおりである。上述の初期実験を完成するべく、２ＭＮａＣｌフロースルー液（ｆｌｏｗ− ｔｈｒｏｕｇｈ）中に溶出したＰＥＧｂｖ及び実施例２に述べたＰｈｅｎｙｌ６５０Ｃカラムの水溶出液中に溶出したＰＥＧｂｖをＳＥＣＨＰＬＣアッセイで分析した。ＳＥＣＨＰＬＣデータから、２ＭＮａＣｌフロースルー液中の物質は２０ｋＤａＰＥＧｂｖに富み、一方水溶出液中の物質は主として高分子量ＰＥＧｂｖを含有することか判明した。このようなデータによって、ＨＩＣ、特にＰｈｅｎｙｌ及び／またはＢｕｔｙｌＨＩＣを用いてＰＥＧジオール及び２０ｋＤａＰＥＧｂｖを大きさに基づき分離し得ることが確認される。実施例４この実施例では、様々な２０ｋＤａＰＥＧｂｖ導入条件を試験し、かつＢｕｔｙｌまたはＰｈｅｎｙｌＨＩＣ樹脂からのＰＥＧｂｖの溶離に様々な線形ＮａＣｌ濃度勾配を用いた一連のＨＩＣ実験について説明する。いずれの実験も室温で、かつ通常は実施例２に述べたようにして行なった。第１実験：ＳＨＩＣカラム（１．５×６．５ｃｍ）を用いた。６５０Ｓ樹脂は６５０Ｃ樹脂と、粒径が５０〜１５０μｍではなく２０〜５０μｍである点で相違する。カラムを３ＭＮａＣｌ中で平衡させ、このカラムに床体積１ｍｌ当たり２ｍｇのＰＥＧｂｖを導入した。カラム容量の１０倍量の線形濃度勾配ＮａＣｌ（３→０ＭＮａＣｌ）を用い、流量を１．５ｍｌ／分としてＰＥＧｂｖを溶離した。２分（３．０ｍｌ）画分を回収した。溶離プロフィールを図２に示す。その後、２０ｋＤａＰＥＧｂｖの収率（％）を、実施例３に述べたアッセイを用いて測定した（表２参照）。第２実験：ＨＩＣカラム（１．５×１１．４ｃｍ）を用いた。６５０Ｍ樹脂は６５０Ｃ樹脂と、粒径が５０〜１５０μｍではなく４０〜９０μｍである点で相違する。カラムを２ＭＮａＣｌ中で平衡させ、このカラムに床体積１ｍｌ当たり２ｍｇのＰＥＧｂｖを導入した。カラム容量の１０倍量の線形濃度勾配ＮａＣｌ（２→０ＭＮａＣｌ）を用い、流量を１．５ｍｌ／分としてＰＥＧｂｖを溶離した。３分（４．５ｍｌ）画分を回収した。溶離プロフィールを図３に示す。その後、２０ｋＤａＰＥＧｂｖの収率（％）を、実施例３に述べたアッセイを用いて測定した（表２参照）。第３実験：ＨＩＣカラム（３．２×１８．０ｃｍ）を用いた。カラムを２．５ＭＮａＣｌ中で平衡させ、このカラムに床体積１ｍｌ当たり１．８ｍｇのＰＥＧｂｖを導入した。カラム容量の１０倍量の線形濃度勾配ＮａＣｌ（２→０．５ＭＮａＣｌ）を用い、流量を９．６ｍｌ／分としてＰＥＧｂｖを溶離した。２．５分（２４ｍｌ）画分を回収した。その後、２０ｋＤａＰＥＧｂｖの収率（％）を、実施例３に述べたアッセイを用いて測定した（表２参照）。第４実験：ＨＩＣカラム（１．５×１１．５ｃｍ）を用いた。カラムを５ＭＮａＣｌ中で平衡させ、このカラムに床体積１ｍｌ当たり８ｍｇのＰＥＧｂｖを導入した。単位床体積当たりの導入量の増大は、大規模操作条件により近付けることを目的として行なった。導入量が増加するため、ＰＥＧｂｖが完全にカラムに結合するのにより高いＮａＣｌ濃度（２Ｍに対して５Ｍ）が必要となった。カラム容量の１０倍量の線形濃度勾配ＮａＣｌ（３．５→１ＭＮａＣｌ）を用い、流量を２．０ｍｌ／分としてＰＥＧｂｖを溶離した。１．５分（３ｍｌ）画分を回収した。その後、２０ｋＤａＰＥＧｂｖの収率（％）を、実施例３に述べたアッセイを用いて測定した（表２参照）。第５実験：ＨＩＣカラム（１．５×１１．５ｃｍ）を用いた。カラムを５ＭＮａＣｌ中で平衡させ、このカラムに床体積１ｍｌ当たり８ｍｇのＰＥＧｂｖを導入した。カラム容量の１５倍量の線形濃度勾配ＮａＣｌ（２→０．５ＭＮａＣｌ）を用い、流量を２．１ｍｌ／分としてＰＥＧｂｖを溶離した。画分を回収した。溶離プロフィールを図３に示す。この実験の分離度プロフィールは２ｍｇ／ｍｌ導入を用いて得られたプロフィールほど優れていなかった。しかし、この実験から得られた、測定したＳＥＣＨＰＬＣ純度は図４及び５に示したとおりである。図４及び５のデータは、分離度が低いにもかかわらず高分子量ＰＥＧｂｖが適宜除去されたことを証明している。第６実験：ＨＩＣカラム（７．０×１４ｃｍ）を用いた。カラムを４．５ＭＮａＣｌ中で平衡させ、このカラムに床体積１ｍｌ当たり８ｍｇのＰＥＧｂｖを導入した。カラム容量の１７倍量の線形濃度勾配ＮａＣｌ（３．５→１．０ＭＮａＣｌ）を用い、流量を５５ｍｌ／分としてＰＥＧｂｖを溶離した。上記データが示すように、Ｐｈｅｎｙｌ及び／またはＢｕｔｙｌＨＩＣ分離において線形濃度勾配ＮａＣｌを用いることは、２０ｋＤａＰＥＧｂｖから高分子量ＰＥＧｂｖを分離する上で有効である。更に、適当な条件下に床体積１ｍｌ当たり２ｍｇまたは８ｍｇの導入量を用いることによって約６５〜７５％の収率が得られた。最後に、上記データは、導入量を８ｍｇ／ｍｌとした実験では導入量２ｍｇ／ｍｌの実験の時ほど優れた分離度プロフィールは得られないものの、高分子量ＰＥＧｂｖを適宜除去することはできることを示している。実施例５この実施例では、ＴＮＦｂｐ及びＨＩＣ精製２０ｋＤａＰＥＧｂｖを含む生物学的に活性なコンジュゲート（ホモダンベル）の製造を説明する。上記コンジュゲートの総収率、純度及び生物学的活性を従来のＴＮＦｂｐコンジュゲートのものと比較する。コンジュゲートの製造：この実施例で用いたｃ１０５３０ｋＤａＴＮＦｂｐムテインは、本明細書に参考として含まれる国際特許出願公開第９２／１６２２１号に開示されたようにして製造し得る。あるいはまた、上記ｃ１０５ムテインは次のように製造する。ｃ１０５ムテインを発現させる大陽菌細胞を遠心によって回収する。細胞スラッジを精製水の添加によって約４０湿潤重量％の固体に調節する。次に、混合物を等量の破壊（ｂｒｅａｋｉｎｇ）緩衝液（５０ｍＭトロメタミン、４ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）で更に稀釈し、それによって約２０湿潤重量％の固体を含有する懸濁液を得る。細胞スラッジを、約８，０００ｐｓｉで作動する高圧ホモジナイザーに５回通して細胞ホモジネートを製造する。ホモジナイザーに通す際、毎回事前にホモジネートを１０℃以下に冷却する。ホモジネートを遠心し、ｃ１０５を含有する固体画分を得る。固体を稀釈し、かつ再度遠心して、洗浄された封入体を得る。次に、洗浄された封入体を５０ｍＭトリス、ｐＨ９．５中の８Ｍ尿素及び１５０ｍＭシステインの添加によって溶解させる。この混合物を再生前に室温で２時間撹拌する。前記条件下にｃ１０５ムテインは変性し、還元される。還元された変性ｃ１０５ムテインを１．１Ｍ尿素、５０ｍＭトリスでの稀釈によって再生させ、それによって２００μｇ／ｍｌのｃ１０５ムテインと、１．５Ｍ尿素と、７．５ｍＭシステインと、５０ｍＭトリス、ｐＨ９．７とから成る最終再生溶液を得る。再生混合物を２日間６〜１０℃に維持する。再生効率を逆相ＨＰＬＣ及びカチオン交換ＨＰＬＣによって監視する。次に、再生混合物を酢酸及びＨＣＩの添加によってｐＨ５．０とする。再生混合物を、４℃において２５ｍＭ酢酸ナトリウム、６５ｍＭＮａＣｌ中で予め平衡させたカチオン交換カラム（Ｓ−セファロース大型ビーズ樹脂）に導入する。導入後、カラムを上記と同じ平衡緩衝液で洗浄する。カラムを、２５ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５中の濃度勾配６５→３５０ｍＭのＮａＣｌで溶離する。ＮａＣｌ濃度約２００ｍＭにおいてｃ１０５ムテインが溶出し、これを一つのプールに回収する。ｃ１０５ムテインを含有する回収プールを１．５倍量の５ＭＮａＣｌ、４０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６に調節）で稀釈し、これを３ＭＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６中で予め平衡させた疎水的相互作用カラム（ＴｏｙｏＢｕｔｙｌ６５０Ｍカラム）に導入する。導入終了後、カラムを平衡緩衝液で洗浄する。２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６中の線形塩濃度低下勾配３→ １ＭのＮａＣｌをカラム容量の８倍量で用いてｃ１０５ムテインを溶離する。ｃ１０５ムテインを一つのプールに回収する。プールをｃ１０５ムテイン約３ｇ／１に濃縮し、その後最終的に導電率が４ｍｍｈｏ未満となるまで２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６に対して膜濾過する（約６倍量）。膜濾過したプールを、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６中で平衡させたＳＰ −セファロース高速カラムに導入する。導入後、カラムを追加の平衡緩衝液で洗浄し、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．０から２０ｍＭリン酸ナトリウム、５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．５までのｐＨ／塩濃度勾配の組み合わせを有する溶離剤で溶離する。前記勾配の後半、ＮａＣｌ濃度約３５ｍＭにおいてｃ１０５ムテインが溶出する。この時点で、ｃ１０５ムテインを冷凍貯蔵し得る。この実施例で用いた２０ｋＤａＰＥＧｂｖは、先の実施例１に述べた「ワンステップ」操作を用いて合成した。合成した２０ｋＤａＰＥＧｂｖの一部を、実施例４の第５実験に述べたようにしてＨＩＣ精製した。次に、ＨＩＣ精製しなかった２０ｋＤａＰＥＧｂｖとＨＩＣ精製した２０ｋＤａＰＥＧｂｖとの両方を用いてＰＥＧｂｖ：ＴＮＦｂｐコンジュゲートを製造した。コンジュゲートの製造は次のように行なった。ｃ１０５３０ｋＤａＴＮＦｂｐムテインを１５℃で５〜６時間、２０ｍＭリン酸塩、ｐＨ７．６中の１．３倍モル過剰量のＤＴＴに曝露し、それによって再生過程の間にｃ１０５に結合した余分なシステインを除去した。ｐＨを６．０に調節し、試料を（４〜６ｍｇ／ｍｌ床体積の量で）Ｓ−セファロースＦａｓｔＦｌｏｗカラムに導入し、カラム容量の３倍量の２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．０で洗浄し（それによってＤＴＴを除去し）、２０ｍＭリン酸塩、７０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ６．０で溶離した。次に、還元ｃ１０５３０ｋＤａＴＮＦｂｐムテイン溶液（〜４．７ｍｇ／ｍｌ）を１ＭＮａＯＨでｐＨ７．４〜７．５に調節した。この還元ｃ１０５ＴＮＦｂｐにＨＩＣ精製または非ＨＩＣ精製２０ｋＤａＰＥＧｂｖ（０．９ｍｇ／ｍｇＴＮＦｂｐ）を攪拌下に添加した。攪拌混合後、溶液を周囲温度で１２〜１８時間放置した。コンジュゲートアッセイ：ＰＥＧ化アッセイＴＮＦｂｐの２０ｋＤａＰＥＧｂｖ：ＴＮＦｂｐダンベルへの変換を、ＰＯＲＯＳ^TM ＨＳ／Ｈ４．６／５０カチオン交換ＨＰＬＣカラム（ＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いて定量した。５０μｌ試料をカラムに導入し、かつ２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．７５中の１０分濃度勾配０→１ＭのＮａＣｌを用いてカラムから溶離した。ｃ１０５３０ｋＤａＴＮＦｂｐムテインモノベル（ｍｏｎｏｂｅｌｌ）、即ち一端にのみｃ１０５３０ｋＤａＴＮＦｂｐが結合したＰＥＧｂｖ、ｃ１０５３０ｋＤａＴＮＦｂｐムテインダンベル、及び非ＰＥＧ化ｃ１０５３０ｋＤａＴＮＦｂｐムテイン試料に関する代表的溶離プロフィールを図６に示した。ｃ１０５３０ｋＤａＴＮＦｂｐムテインモノベルが最初に溶出し、次いでｃ１０５３０ｋＤａＴＮＦｂｐムテインダンベル及び非ＰＥＧ化ｃ１０５３０ｋＤａＴＮＦｂｐムテインが溶出した。結果ＨＩＣ精製物質を用いた場合、ＴＮＦｂｐダンベルへの変化率は６６．７％であり、その際検出可能な「プレピーク」は存在しなかった（図７参照）。同一ロットから得た非ＨＩＣ精製ＰＥＧｂｖは５２．９％の変換率しかもたらさず、かつ６．７％の「プレピーク」を有した（図８参照）。際立ったこの「プレピーク」は、高分子量ＰＥＧｂｖ不純物によって発生したＴＮＦｂｐダンベルを示している。次に、ＰＥＧ化混合物を、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ３．１中で平衡させた１．５×１０ｃｍＳＰ−セファロースＨＰカラムに導入した（４ｍｇ／ｍｌ床体積）。導入後、カラムを平衡緩衝液で洗浄し、その後５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．２５ＭＮａＣｌ、ｐＨ３．１から５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ３．１までの勾配を有する溶離剤をカラム容量の２０倍量で用いてＴＮＦｂｐダンベルを溶離した。溶離プロフィールを図９及び１０に示す。各溶出物毎に幾つか異なる方法でプールを形成した。表３に、用いた様々なプール形成規準毎のＴＮＦｂｐダンベルの収率（％）及び純度（％）を示す。表３のデータは、ＰＥＧｂｖのＨＩＣ精製が後に得られるＴＮＦｂｐダンベルの純度及び収率にとって明らかに有益であることを示している。例えば９７％の純度を達成しようとすると、非ＨＩＣ精製ＰＥＧｂｖを用いた場合はＳＰ−セファロースＨＰカラム上で３７％のＴＮＦｂｐダンベルしか回収できなかったが、ＨＩＣ精製物質を用いれば５８％もが回収でき、即ち２０ｋＤａＰＥＧｂｖのＨＩＣ精製によってＴＮＦｂｐダンベルの回収量を１．５〜１．６倍にも増加させることか可能となる。実施例６この実施例ではＨＩＣ樹脂の、ＰＥＧを末端基官能性に基づき分離する能力を評価した。実施例４の第３実験で得られた「早期溶出」物質をＰＥＧ化アッセイにおいて試験した。「早期溶出」物質とは、２０ｋＤａＰＥＧｂｖを得るべくプールした画分の直前に溶出した画分のことである。この物質は、図１１に示したように、コンジュゲートの製造に用いると主にＴＮＦｂｐモノベルをもたらした。このことは、「早期溶出」物質が主としてＰＥＧ２０ｋＤａモノビニルスルホンを含有することを示しており、即ちＢｕｔｙｌＨＩＣ樹脂の、２０ｋＤａＰＥＧｂｖを末端基官能性に基づき分離する能力を証明している。実施例７この実施例では、ｃ１０５ＴＮＦｂｐムテインとＰＥＧ−ビス−ビニルスルホンとの連結の安定性を試験した。既知量のｃ１０５ＴＮＦｂｐダンベルをＰＢＳ、ｐＨ７．４中で、３７℃で１週間インキュベートし、その間に時々ＳＤＳＰＡＧＥによる分析用にアリコートを取り出した。ｃ１０５ＴＮＦｂｐダンベルの分解は実質的に観察されなかった。ｐＨ１０において３７℃で１週間インキュベートしても、５〜１０％のコンジュゲート分解が観察されただけであった。別の安定性試験では、実施例１のワンステップ法で製造した活性化ＰＥＧリンカーを、特に本明細書に参考として含まれる国際特許出願公開第９５／０７５５５号に開示されたマルチステップ法で製造した活性化ＰＥＧリンカーと比較した。まず、ワンステップ及びマルチステップ活性化リンカーを２−メルカプト安息香酸で誘導体化し、それによってリンカーの安定性をＵＶを用いて測定した。各０．５ｍｌのリンカー溶液（２０ｍｇのリンカーを０．５ｍｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５に溶解させて製造）に１ｍＭ２−メルカプト安息香酸（オルトチオール安息香酸）を３．０ｍｌずつ添加し、渦流発生によって短時間混合した。その後、溶液を室温で１８時間以上インキュベートした。室温でのインキュベーションの時間は比較的長くすることが可能である（４８時間まで）。次に、誘導体化リンカー溶液をＰＢＳで１：１０に稀釈し、９０℃で１時間熱処理した。熱処理したリンカー溶液を熱から遠ざけ、１００〜２００μｌの該溶液をＢＩＯＳＩＬ^TM ２５０−５カラム（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に注入し、流量０．５ｍｌ／分で１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．００４％ＳＤＳ、ｐＨ６．５中へ流入させた。回収した試料を２５４ｎｍのＯ．Ｄ．においてＵＶで測定した。表４及び５にＵＶ測定結果を示す。これらの表中、生成物ＵＶピーク変化率（％）は、熱処理を施さなかった標準のＵＶ純度から９０℃熱処理試料の純度を減じた差に基づいて計算してある。純度は、平均ピーク面積を総ピーク面積で除した商として算出した。このアッセイの変動率は約２％であった。表４ワンステップ合成表５マルチステップ合成表４及び５に示した結果の比較から明らかなように、ワンステップリンカーはマルチステップリンカーより安定である。上記結果は、ワンステップリンカーの安定性の変化が２％のアッセイ変動率の範囲内である一方で、４ステップリンカーの安定性の変化は前記アッセイ変動率を越えることも示している。本発明についてのここまでの記述は、例解及び説明のための一例である。本発明をその思想及び範囲を逸脱することなく変更及び変形し得ることは、当業者には明らかであろう。そのような変更及び変形はいずれも以下の請求の範囲各項に包含されると解釈するものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 14/48 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者シーリイ，ジエイムズ・アービンアメリカ合衆国、コロラド・80027、ルイビル、フーバー・アベニユー・203

Claims

【特許請求の範囲】１．活性化されたリンカーを製造する方法であって、（a）反応性ヒドロキシル基を有する化合物を得るステップ、及び（b）前記ヒドロキシル基を反応性マイケルアクセプターに変換するステップを含み、前記変換において（ＴＨＦ）を溶媒として用い、それによって少なくとも一つの形態の活性化リンカーを製造する方法。２．ステップ(b)が（i）反応性ヒドロキシル基を有する化合物にＴＨＦを溶媒として添加すること、 (ii)反応性カルボニル、ニトリルまたはスルホン基を有する試薬を添加すること、及び（iii）塩基を添加して反応性マイケルアクセプターを形成させることを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。３．（c）前記活性化リンカーを疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムに適用するステップ、及び（d）活性化リンカーの様々な形態をその大きさ及び／または末端基官能性に基づき分離することを可能にする溶離条件を用いることによって所与の形態の活性化リンカーを選択的に単離するステップをも更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。４．溶離条件に線形５Ｍ−０Ｍ塩化ナトリウム濃度勾配が含まれることを特徴とする請求項３に記載の方法。５．反応性ヒドロキシル基を有する化合物がポリマーであることを特徴とする請求項３に記載の方法。６．ポリマーがホモポリマー、ランダムもしくはブロックコポリマー、またはターポリマーであることを特徴とする請求項５に記載の方法。７．ポリマーがポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリアルキレンオキシド、ポリオキシエチル化ポリオール、またはポリビニルアルコールであることを特徴とする請求項６に記載の方法。８．ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることを特徴とする請求項５に記載の方法。９．ＰＥＧが２ｋＤａ〜１００ｋＤａの分子量を有することを特徴とする請求項８に記載の方法。１０．ＰＥＧが約３．４ｋＤａ、５ｋＤａ、１０ｋＤａまたは２０ｋＤａの分子量を有することを特徴とする請求項９に記載の方法。１１．ＰＥＧが約２０ｋＤａの分子量を有することを特徴とする請求項１０に記載の方法。１２．ＰＥＧがＰＥＧジオールであることを特徴とする請求項８に記載の方法。１３．ＴＨＦを１：１０から１：５０のＰＥＧ対ＴＨＦ（重量／体積比）で添加することを特徴とする請求項８に記載の方法。１４．前記比が１：３０であることを特徴とする請求項１３に記載の方法。１５．反応性スルホン基を有する試薬がビニルスルホンであることを特徴とする請求項２に記載の方法。１６．塩基がカリウムｔ−ブトキシドであることを特徴とする請求項２に記載の方法。１７．反応性スルホン基を有する試薬がジビニルスルホンであり、反応性ヒドロキシル基を有する化合物はポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項２に記載の方法。１８．ステップ(a)の後に、反応性ヒドロキシル基を有する化合物をトルエンに溶解させ、得られたトルエン溶液をステップ(b)の前に乾燥することをも更に含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。１９．ＨＩＣでメタクリル酸主鎖上のブチルまたはフェニルリガンドを用いることを特徴とする請求項３に記載の方法。２０．ＰＥＧ化分子を製造する方法であって、（a）疎水的相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて活性化ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を精製し、（b）ＨＩＣ精製したＰＥＧを前記分子と反応させてＰＥＧ化分子を製造することを含む方法。２１．前記反応ステップが、ＨＩＣ精製したＰＥＧを前記分子と混合し、得られた混合物を室温で１２〜１８時間放置することを含むことを特徴とする請求項２０に記載の方法。２２．前記分子が腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）抑制剤であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。２３．ＴＮＦ抑制剤を、３０ｋＤａＴＮＦ抑制剤、４０ｋＤａＴＮＦ抑制剤、及びこれらの先端欠失変異体またはムテインの中から選択することを特徴とする請求項２２に記載の方法。２４．ＴＮＦ抑制剤がＴＮＦ抑制剤ムテインであることを特徴とする請求項２３に記載の方法。２５．ＴＮＦ抑制剤ムテインがｃ１０５３０ｋＤａＴＮＦ抑制剤であることを特徴とする請求項２４に記載の方法。２６．反応生成物が式Ｒ₁−Ｘ−Ｒ₂〔式中、Ｘは第一の反応性基及び第二の反応性基を有するＨＩＣ精製ＰＥＧを含み、ここで、前記第一の反応性基はマイケルアクセプターであり、Ｒ₁は反応性チオール部分を有する分子を含み、ここで、前記チオール部分は前記マイケルアクセプターと共有結合しており、Ｒ₂は前記第二の反応性基との反応によって前記ＰＥＧに結合した分子または生物学的非活性基を含む〕を有することを特徴とする請求項２０に記載の方法。２７．Ｘがポリエチレングリコール−ビス−ビニルスルホンであり、Ｒ₁及びＲ₂はｃ１０５３０ｋＤａＴＮＦ抑制剤であることを特徴とする請求項２６に記載の方法。２８．請求項１に記載の方法によって製造した、実質的に均質の活性化リンカー。２９．請求項２０に記載の方法によって製造した、実質的に均質なＰＥＧ化分子。３０．請求項２０に記載の方法によって製造した実質的に均質なＰＥＧ化分子と、医薬に許容可能な稀釈剤、佐剤またはキャリヤとを含有する医薬組成物。３１．請求項２０に記載の方法によって製造した実質的に均質なＰＥＧ化ＴＮＦ抑制剤と、医薬に許容可能な稀釈剤、佐剤またはキャリヤとを含有する医薬組成物。