CN101547935A - 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物 - Google Patents

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Abstract

通过将现有的IFN－α分子的第85或86位的Tyr替换成Cys获得了IFN－α突变体。也提供了它们的聚乙二醇衍生物，这些衍生物具有高的体外抗病毒活性和延长的体内半衰期，其中聚乙二醇分子共价结合于IFN－α突变体的游离Cys残基。还提供了IFN－α突变体的聚乙二醇衍生物的制备方法以及含有衍生物的药物组合物。

Description

干扰素 α突变体及其聚乙二醇衍生物 技术领域
本发明涉及干扰素 α 突变体及其聚乙二醇衍生物的制备方法及 用途。 具体地说， 本发明涉及利用体外定点突变技术对 a干扰素进行 定点突变， 将其 85或 86位的 Tyr替换为 Cys, 并利用该位点与聚乙 二醇共价结合。本发明还涉及利用半胱氨酸对干扰素特异性修饰的方 法、干扰素 α突变体聚乙二醇衍生物纯化提取及其在癌症和感染性疾 病中的应用。 背景技术
干扰素是一类重要的家族性细胞因子， 具有广谱的抗病毒、 抗细 胞增殖和免疫调节作用。 哺乳动物的干扰素可以分为 α、 β、 γ、 ω等 几型， 其中 α干扰素又可分十余种亚型， 经大量临床研究证明， α型 亍扰素是一种重要的抗病毒和抗肿瘤治疗药物。 目前我国在临床使用 ,最广泛的主要是重组人干扰素 alb、 0123和01213。
另外， 研究显示， 人 a干扰素的 I型家族有 20多个基因成员， 其中大部分编码功能蛋白， 彼此在核苷酸水平上有大约 90%的同源 性。通过基因工程的手段可以产生相当数量的干扰素的衍生物或类似 物。 目前最引人注目的是美国 Amgen公司根据 13种 a型干扰素的基 因序列同源性， 设计出的一种全新的蛋白质工程药物干复津 (INFERGEN®, IFN-Con 1)， 并经美国 FDA批准 1997年在美国上市， 用于治疗丙型肝炎， 其抗病毒活性是 a2b干扰素的 5-10倍。 公开号 为 CN 1511849A的中国专利申请（申请人： 北京三元基因工程公司） 公开了用体外同源重组方法得到多种 a族干扰素分子，其在活性和稳 定性方面比干复津有更大优势。
但是， 无论是干扰素 alb、 a2a、 a2b还是干复津， 作为蛋白质性 药物， 由于稳定性差， 血浆清除率高， 体内半衰期短， 易产生抗原抗 体反应等， 在临床治疗中受到很大的限制。基因工程技术使大规模合 成人重组蛋白成为可能，很大程度上解决了异源蛋白引起的免疫原性 问题， 却仍然无法克服血浆清除快和生物利用度低等缺点， 这些缺点 造成的结果是： 需频繁注射干扰素才能达到有效的血浆治疗浓度； 而 且， 每次注射后均会导致血药浓度的较大波动，形成药物浓度的峰值 与谷值。 这样就可能增加了治疗费用以及给药不便和不良反应的风 险。 因此， 人们试图釆用各种药物传递技术 （ Drug Delivery Technology ), 来提高蛋白质药物的疗效。 而目前在药物传递技术中 研究最为广泛的是聚乙二醇修饰技术 (PEGNOLOG Y)。
聚乙二醇修饰蛋白质的技术是近十几年来发展起来的一种用于 改进蛋白质类药物体内药动学性质的新技术。它是将活化的聚乙二醇 分子 [Polyethylene glycol), PEG]键合到蛋白质分子表面上， 从而影 响蛋白质的空间结构，最终导致蛋白质各种生物化学性质的改变，如： 化学稳定性增加， 抵抗蛋白酶水解的能力提高， 免疫原性和毒性降低 或消失， 体内半衰期延长， 血浆清除率降低等等。
PEG组分是由氧乙烯单体聚合而成的惰性长链的两性分子。 现在 已有多种不同的 PEG分子可供利用。 被活化的 PEG其活性功能基团 可以被联结到治疗分子的某特殊部位（比如胺、 巯基或其他亲核物 质）。 在大多数情况下， PEG衍生物的共价键联结的是利用赖氨酸的 氨基和多肽分子的 N-末端作为修饰部位， 每一个连接部位决定一种 不同的同种型 （isotype )。 在药物研发过程中， PEG同种型的分布具 有重要意义。由于产品的生物学活性与特定同种型分布的混合物有密 切关系， 产品必须按分布要求来定义。 必须证明在整个药物开发过程 中， 包括生产过程改变和按比例放样时 PEG同种型分布的一致性。 在实际生产中， 这给产品的工艺控制和质量评价带来很大困难。
定点修饰则可以避免以上种种麻烦， 在蛋白质特定位点进行修饰 可获得高特异性修饰产物， 可以有效控制修饰产物的纯度， 使工艺更 简单并且产品质量也更易评价， 因此受到越来越多的重视。利用分子 内的半胱氨酸（Cys )位点可以对蛋白质进行高选择性修饰。 带有游 离巯基的蛋白质为数不多， 但却是维持蛋白空间结构的重要共价键， 在此位点的化学修饰常会导致分子结构的较大破坏， 使蛋白活性丧 失。 采用基因工程的手段可以实现这一目的。 值得注意的是， 不同的 蛋白质或多肽结构和性质不同，究竟能不能引进及在什麽位点引进存 在差异。 通过基因工程途径人为增加的 Cys, 会因形成分子内错配或 分子间结合， 导致分子不稳定或形成非正常聚合体。 在这方面， 全面 的序列分析和准确的分子结构模拟将会提供思路。
序列分析发现： 包括干扰素 a2a、 a2b和 IFN-con 1在内的绝大多 数 a干扰素分子内都有四个半胱氨酸，其中 1和 99位 Cys、 29和 139 位 Cys之间形成二硫键。本申请人通过体外同源重组获得的新型干扰 素 （MIFN )也保持了这一特点。 IFN-alb在结构上和 a族其他干扰 素有明显不同， 前者除了具有上述 4个 Cys形成正常二硫键之外，在 第 86位有第 5个 Cys, 小试发现， 利用该位点可以对干扰素进行定 点修饰。 因而， 结合该特点， 对其它 a干扰素进行改造有望收到同样 的效果。 发明内容
本发明的目的在于提供一种干扰素 a突变体， 其氨基酸序列第 85位或第 86位的氨基酸突变为 Cys, 这种突变体的第 85位或 86位 的 Cys可以与聚乙二醇结合，形成聚乙二醇衍生物，其具有良好的稳 定性、 水溶性、 抵抗原性以及高生物活性等优点。
a干扰素的第 85位或 86位通常为酪氨酸（Tyr ), 其位于一个相 对保守的区段， 本发明通过将 Tyr突变为 Cys对. a干扰素进行改造， 获得了一系列突变体， 通过与聚乙二醇反应， 获得了一些列聚乙二醇 衍生物。
下面就目前常用的四种 a干扰素对本发明的技术方案作进一步 的说明：
MIFNCys86、 IFN-Con lCys86、 IFN a-2acys85及 IFN a-2bCys85 (氨基 酸序列见附录 SEQ ID NO.1-4 ), 系对四种现有的干扰素 MIFN、 IFN-Con 1、 IFN a-2a及 IFN a-2b进行定点突变， 将 86 ( MIFN和 IFN-Con 1 )或 85 ( IFN a-2a和 IFN a-2b )位氨基酸替换为 Cys而得。 利用体外定点突变的技术， 分别对目的基因进行重组， 将获得重组基 因插入表达载体 pET-23b中， 获得了可编码重组蛋白的重组质粒。 四 种重组子分别在大肠杆菌 BL21 ( DE3 )受体细胞中高效稳定的表达， 表达产物以包涵体形式存在， 表达量占菌体总蛋白的 30%以上。 MIFNCys86及 IFN-Con lCys86的纯化依次釆用了疏水层析、 DEAE阴离 子交换层析和 S-100凝胶排阻层析三步纯化工艺， 可以得到高纯度的 MIFNCyS86及 IFN-Con lCys86; IFN a-2acys85及 IFN a-2bCys85的纯化依次 釆用了 DEAE阴离子交换层析、单抗亲和层析和 S-100凝胶排阻层析 三步纯化工艺， 可以得到高纯度的 IFN a-2aCys85及 IFN a-2bCys85。
尽管本发明描述的突变体是 a干扰素第 85或 86位的 Tyr突变为 Cys, 但是本领域技术人员应当理解， 由于 α干扰素的链长不完全一 致， 因而， 这里的 Tyr仅仅是用于说明突变的位置。 本领域技术人员 可能会对 α干扰素进行各种改造，例如将某些位点进行突变， 进而获 得功能相同或相近的不同于现有 α干扰素的氨基酸序列， 然而， 通过 将本发明所述的相应位点进行相应的突变和修饰，从而获得性能的改 善， 因而， 本发明所述的 α干扰素突变体还包括这些序列。
本发明提供多种干扰素 α突变体聚乙二醇衍生物， 其中聚乙二 醇可以是直链的也可以是具有分支结构的， 用 5000〜40000道尔顿的 PEG对 α干扰素突变体进行修饰， 结果显示 PEG化蛋白的半衰期随 着 PEG分子量的增大有不同程度延长。
本发明还提供了干扰素 α突变体聚乙二醇衍生物的制备和纯化 方法。 本发明最后提供了干扰素 α突变体聚乙二醇衍生物体外药效和 药代试验的方法和结果，表明其在治疗或预防免疫调节紊乱如肿瘤疾 病或传染病方面的应用中有更好的技术参数。 附图说明
图 1 :表示" MIFNCys86的基因构建和扩增"中两轮 PCR产物的琼脂 糖电泳图谱（实施例 1A )。 1泳道为 DNA marker; 2泳道为首轮 PCR 中反应体系 1的产物； 3泳道为首轮 PCR中反应体系 2的产物； 4泳 道为第二轮 PCR产物；
图 2: 表示" MIFNCys86重组质粒的构建、 转化和鉴定"中阳性克隆 作为模板 PCR产物的琼脂糖电泳图谱（实施例 2A )。 1泳道为 DNA marker; 2 ~ 8泳道分别为一个单菌落的 PCR产物， 其中 2、 4、 5、 6、 7、 8为阳性克隆；
图 3: 表示四种突变体重组质粒的 Nde I / EcoR I 双酶切电泳 图谱（实施例 2A ~ 2D )。 1 泳道为 DNA marker; 2泳道为 pET-23b 质粒载体； 3、 7泳道分别为 Nde I / EcoR I酶切前后 MIFNCys86的重 组质粒； 4、 8泳道分别为 Nde I / EcoR I酶切前后 IFN-Con lCys86的 重组质粒； 5、 9泳道分别为 Nde 1 1 EcoR I酶切前后 IFN a-2aCys85 的重组质粒； 6、 10泳道分别为 Nde I / EcoR I酶切前后 IFN a-2bCys85 的重组质粒；
图 4:表示纯化的 MIFNCys86、 IFN-Con lCys86、 IFN a-2aCys85及 IFN a-2bCyS85的 SDS-PAGE图谱（实施例 3 A ~ 3D )。 1泳道为蛋白 marker; 2、 3、 4、 5泳道分别为纯化的 MIFNCys86、 IFN-Con lCys86、 IFN a-2acys85 及 IFN a-2bCys85;
图 5：表示 MIFNCys86、 IFN-Con 1 Cys86、 IFN a-2acys85及 IFN a-2bCys85 与 PEG-MAL ( 20KD )偶联反应的 SDS-PAGE图谱（实施例 4 )。 1 泳道为蛋白 marker; 2、3、4、5泳道分别为 MIFNCys86、IFN-Con lCys86、 IFN a-2acys85及 IFN a-2bCys85与 PEG-MAL ( 20KD )偶联反应的产物； 图 6:表示 MIFNCys86、 IFN-Con lCys86、 IFN a-2aCys85及 IFN a-2bCys85 与 PEG-MAL ( 40KD )偶联反应的 SDS-PAGE图谱（实施例 4 )。 1 泳道为蛋白 marker; 2、3、4、5泳道分别为 MIFNCys86、 IFN-Con lCys86、 IFN a-2acyS85及 IFN a-2bCys85与 PEG-MAL ( 40KD )偶联反应的产物； 图 7: 表示纯化的 4种干扰素 a突变体的 PEG-MAL ( 20KD )衍 生物的 SDS-PAGE图谱（实施例 5 )。 1泳道为蛋白 marker; 2、 3、 4、 5分别泳道为 mPEG(20KD)-MIFNCys86、 mPEG(20KD)-IFN-Con lCys86、 mPEG(20KD)-IFN a-2aCys85及 mPEG(20KD)-IFN a-2bCys85;
图 8: 表示纯化的 4种干扰素 α突变体的 PEG-MAL ( 40KD )衍 生物的 SDS-PAGE图谱（实施例 5 )。 1泳道为蛋白 marker; 2、 3、 4、 5分别泳道为 mPEG(40KD)-MIFNCys86、 mPEG(40KD)-IFN-Con lCys86、 mPEG(40KD)-IFN a-2aCys85及 mPEG(40KD)-IFN a-2bCys85。 具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。 应当理解， 这些实 施例仅用于说明本发明， 而不能限制本发明的保护范围。
除非特殊定义， 本文描述所用的术语是在有关技术领域中公知 的术语。 标准的化学符号及缩写符号可以与其全名互换使用。 例如： "PEG"和"聚乙二醇" 具有相同的含义； "干扰素 a"、 "IFN-a"及" a干 扰素"含义也相同。
除非特殊指明， 本文所用到但未明确阐述或简单阐述的技术和 方法是指本技术领域通常使用的技术和方法，可以一般的按照本领域 公知的技术和方法进行。试剂盒的使用是根据制造商或供应商提供的 说明书进行。
本发明 MIFN、 IFN-Con 1、 IFN a-2a及 IFN a-2b四种蛋白的类 似物可以通过氨基酸功能等效分子的取代、 添加或缺失来获得， 如在 本技术领域公知，用性质类似的一个或多个氨基酸残基取代原序列内 相应的氨基酸残基改变原蛋白质序列， 形成沉默改变。 本发明中聚乙二醇衍生物的聚乙二醇部分， 如本领域技术人员 公知， 可以具有直链或分支结构。 其是一种巯基反应 PEG化试剂， 能够和半胱氨酸残基的巯基发生反应， 包括来酰亚胺 -PEG、 乙烯砜 -PEG, 碘代乙酰胺 -PEG及正吡啶基二硫化物 -PEG 等， 其中优选马 来酰亚胺 -PEG。本发明尝试用分子量约 5000、 10000、 12000、 20000、 30000和 40000道尔顿的 PEG对四种 α干扰素突变体进行修饰，均可 以获得 PEG-干扰素的衍生物。 资料显示： PEG化蛋白的半衰期随着 PEG 分子量的增大有不同程度延长。 本发明实施例中用 20000 和 40000道尔顿的 PEG作为低、 高分子量的代表具体阐述 PEG-干扰素 衍生物的制作纯化方法及药效、 药代试验。
在优选的实施例中， PEG化试剂是 Nektar Therapeutics及北京键 凯科技有限公式提供的 mPEG-MAL [也写做 PEG-MAL ( 20KD ) ]或 mPEG2-MAL [也写做 PEG-MAL ( 40KD ) ]， 文中 mPEG-MAL 和 mPEGrMAL有时也一般性的简写为 PEG-MAL或 PEG。
本发明中 MIFN、 IFN-Con 1、 IFN a-2a及 IFN a-2b四种 a干扰 素的工程菌由北京三元基因工程有限公司提供。相应的工程菌名称分 别为 BL21 ( DE3 ) I pET23b-MIFN、 BL21 ( DE3 ) / pET23b- IFN-Con 1、 BL21 ( DE3 ) / pET23b-IFN a-2a、 BL21 ( DE3 ) / pET23b-IFN a-2b。 实施例 1A MIFNCys86的基因构建和扩增
釆用 PCR体外定点突变技术 (PCR-SDM),以重叠延伸的手段进行 定点突变。定点突变技术已经比较成熟， 程序比较固定。 可以根据具 体试验调整的是引物的位置长度和 PCR的反应条件， 在实际搡作中 可以有多种组合，都可以达到定点突变的目的， 均涵盖在本发明的保 护范围之内。 本实施例所列为优选方案 （同样原因， 实施例 1B - 1D 所列也为优选方案）。
设 计 两 对 引 物 ， 上 游 引 物 P1 为 T7 promoter primer(taatacgactcactataggg) , Ρ3序列为 ggaaaaattctgcaccgaactgt; 下游 ■引物 P2 为 T7 terminator primer(gctagttattgctcagcgg) , P4 序歹1 J为 acagttcggtgcagaatttttcc。 突变位点包含在 P3和 P4之中。
提取 MIFN的质粒作为模板， 首轮 PCR包括两个反应体系： 反 应体系 1引物为 Pl、 P4, 扩增突变位点及其上游的 DNA序列； 反应 体系 2引物为 P2、 P3， 扩增突变位点及其下游的 DNA序列。 反应条 件为 94°C 4min、 94 °C lmin, 然后 55°C 2min、 72°C 2min共 30个循 环。 第二轮 PCR为重叠延伸 PCR, 以首轮 PCR的产物为模板， 以 Pl、 P2为引物进行 PCR扩增。 反应条件为 94°C 4min、 94 °C lmin, 然后 56°C 2min、 72°C 2min共 30个循环。 图 1表示两轮 PCR产物的 琼脂糖电泳图谱。
第二轮 PCR产物经琼脂糖电泳分析， 选择 720bp左右的 DNA 片段， 用 Nde I / EcoR I双酶切， 电泳回收 500bp左右的目的 DNA 片段备用。
实施例 IB IFN-Con lCys86的基因构建和扩增
设 计 两 对 引 物 ， 上 游 引 物 P1 为 T7 promoter primer(taatacgactcactataggg) , Ρ3序列为 ggataaattctgcaccgaactgt; 下游 引物 P2 为 T7 terminator primer(gctagttattgctcagcgg) , P4 序歹1 J为 acagttcggtgcagaatttatcc。 突变位点包含在 P3和 P4之中。
PCR反应程序同实施例 1A，不同之处是本实施例中首轮 PCR反 应模板为 IFN-Con 1的质粒。 第二轮 PCR产物经琼脂糖电泳分析， 选择 720bp左右的 DNA片段， 用 Nde I / EcoR I双酶切， 电泳回收 500bp左右的目的 DNA片段备用。
实施例 1C IFN a-2aCys8S的基因构建和扩增
引物设计同实施例 1B， PCR反应程序同实施例 1A, 不同之处是 本实施例中首轮 PCR'反应模板为 IFN a-2a的质粒。第二轮 PCR产物 经琼脂糖电泳分析，选择 720bp左右的 DNA片段，用 Nde I / EcoR I 双酶切， 电泳回收 500bp左右的目的 DNA片段备用。 实施例 ID IFN a-2bCys8S的基因构建和扩增
引物设计同实施例 1B， PCR反应程序同实施例 1A， 不同之处是 本实施例中首轮 PCR反应模板为 IFN a-2b的质粒。第二轮 PCR产物 经琼脂糖电泳分析，选择 720bp左右的 DNA片段，用 Nde I / EcoR I 双酶切， 电泳回收 500bp左右的目的 DNA片段备用。 实施例 2A MIFNCys86重组质粒的构建、 转化和鉴定
在重组质粒的构建和转化中， 内切酶往往可以有多种选择， 连接 反应的条件也可以有所变化，都可以完成重组质粒的构建； 本实施例 中宿主细胞选择了实验室常用的 JM109和 DH5a,并不排斥用其他宿 主进行转化。 本着科学、 方便和快捷的原则， 本实施例所列重组质粒 的构建、 转化和鉴定方案为优选方案（同样原因， 实施例 2B ~ 2D所 列也为优选方案）。
将 pET-23b质粒载体用 Nde I / EcoR I双酶切， 经琼脂糖电泳回 收并和实施例 1A中最后回收的目的 DNA片段连接。 连接反应条件 为： 2x Rapid buffer 4 ~ 5μ1、 Τ4 DNA Ligase 1 μ1、 目的片段 1 ~ 2μ1、 载体 3μ1， 4°C过夜连接。
制备 JM109或 DH5a感受态细胞， 转化上述连接产物， 涂布氨苄 平板， 37°C过夜培养。
挑取单菌落作为模板， 用本发明实施例 1A中设计的引物 Pl、 P2 进行 PCR扩增， 扩增产物经琼脂糖电泳（电泳图谱如图 2所示）， 阳 性克隆应在 720 bp左右出现特异条带。 取阳性克隆小量培养， 提取 质粒用 Nde I / EcoR I双酶切， 分别在 3kb左右和 500bp左右出现 特异的条带 （琼脂糖电泳图谱如图 3所示）， 与预计情况相符， 初步 说明重组质粒构建成功。 为了进一步确认其序列， 以 T7通用引物通 过 ABI377测序仪进行全自动序列测定， 结果表明所获得的序列与目 标序列相一致。 实施例 2B IFN-Coii lCys86重组质粒的构建、 转化和鉴定
本实施例中连接的基因片段为实施例 1B回收的目的基因片段。 连接、 转化及鉴定操作中用到的技术和方法与实施例 2A完全相同。 Nde I / EcoR I酶切鉴定电泳图谱如图 3所示。 为确认序列， 同样以 T7通用引物通过 ABI377测序仪进行全自动序列测定，结果表明所获 得的序列与目标序列相一致。
实施例 2C IFN a-2aCys8S重组质粒的构建、 转化和鉴定
本实施例中连接的基因片段为实施例 1C回收的目的基因片段。 连接、 转化及鉴定搡作中用到的技术和方法与实施例 2A完全相同。 Nde I / EcoR I酶切鉴定电泳图谱如图 3所示。 为确认序列， 同样以 T7通用引物通过 ABI377测序仪进行全自动序列测定，结果表明所获 得的序列与目标序列相一致。
实施例 2D IFN a-2bCys85重组质粒的构建、 转化和鉴定
本实施例中连接的基因片段为实施例 1D回收的目的基因片段。 连接、 转化及鉴定操作中用到的技术和方法与实施例 2A完全相同。 Nde I / EcoR I酶切鉴定电泳图谱如图 3所示。 为确认序列， 同样以 T7通用引物通过 ABI377测序仪进行全自动序列测定，结果表明所获 得的序列与目标序列相一致。 实施例 3A MIFNCys86的表达和纯化
将实施例 2A中得到的重组质粒转化大肠杆菌 BL21 ( DE3 )或其 他适宜宿主， 诱导表达。 以大肠杆菌 BL21 ( DE3 )作为宿主时表达 的 MIFNCys86约占菌体总蛋白的 30 ~ 50%， 主要以包涵体形式存在。
粗纯： 将发酵收集的菌体以 TE溶解， 超声破菌后收集包涵体， 然后用 6 ~ 8mol/L的 Gu*HCl或尿素溶解，室温搅拌或 4Ό放置过夜， 再用浓度为 0.05 ~ 0.2mol/L、 pH 8.0 ~ 10.5的硼酸复性，复性液置 4°C 过夜。 4°C离心取上清， 即为粗纯的 MIFNCys86。 精纯： 依次釆用了疏水层析、 DEAE阴离子交换层析和 S-100凝 胶排阻层析三步纯化工艺。具体步骤如下： 将复性液稀释成含 10% ~ 30% (NH4)2S04的溶液上样到 Phenyl Sepharose层析柱， 用两个柱体 积的 10% ~ 30%(NH4)2SO4冲洗，然后用 15% ~ 35%乙二醇进行洗脱， 收集洗脱峰组分用 A液（10 - 80 mmol I L Tris-HCl pH7.5― 10.5 ) 充分透析； 将透析后的洗脱液上样到用 A 液充分平衡的 DEAE Sepharose FF层析柱，然后用 B液（含 0.2 ~ 0.4 mol I L NaCl 的 A液） 进行洗脱， 收集洗脱峰组分； 将 DEAE Sepharose FF离子交换层析的 洗脱峰组分上样到用 C液 （ 20 ~ 40 mmol / L PB + 20 ~ 40 mmol I L NaCl Ph6.5 - 7.5 )充分平衡好的 Sephacryl S-100层析柱， 用 C液冲 洗， 收集洗脱峰组分。 经以上纯化流程后， 最后得到的 MIFNCys86纯 度在 95%以上（ SDS-PAGE图谱如图 4所示）。
实施例 3B IFN-Con lCys86的表达和纯化
将实施例 2B中得到的重组质粒转化大肠杆菌 BL21 ( DE3 )或其 他适宜宿主， 诱导表达。 以大肠杆菌 BL21 ( DE3 )作为宿主时表达 的 IFN-Con lCyS86约占菌体总蛋白的 30 ~ 50%, 主要以包涵体形式存 在。
本实施例纯化方法和步骤与实施例 3A 完全相同。 最后得到的 IFN-Con lCys86纯度在 95%以上（ SDS-PAGE图谱如图 4所示）。
实施例 3C IFN a-2aCys85的表达和纯化
将实施例 2C中得到的重组质粒转化大肠杆菌 BL21 ( DE3 )或其 他适宜宿主， 诱导表达。 以大肠杆菌 BL21 ( DE3 )作为宿主时表达 的 IFN a-2acys85约占菌体总蛋白的 30 ~ 50%,主要以包涵体形式存在。
粗纯： 本实施例所用到的粗纯方法与实施例 3A相同。
精纯:依次采用了 DEAE阴离子交换层析、单抗亲和层析和 S-100 凝胶排阻层析三步纯化工艺。 具体方法： 将复性液以 30 mmol I L Tris-HCl (pH8.0)稀释 10倍上样到 DEAE Sepharose FF离子交换层析 柱，用含 0.3mol / L NaCl 的 30 mmol / L Tris-HCl (pH7.0) 溶液洗脱， 收集洗脱峰； 将上一步洗脱样品经 PBS(pH7.0)3倍稀释， 上样到 IFN a-2a单抗层析柱， 以含 100 mmol I L NaCl 的 0.3 mol I L Gly溶液 (pH2.5)洗脱， 收集洗脱峰； 再将上一步洗脱样品上样到 Sephacryl S-100层析柱， 以 PBS(pH7.0)洗脱。 最后得到的 IFN a-2aCys85纯度在 95%以上（ SDS-PAGE图谱如图 4所示）。
实施例 3D IFN a-2bCys85的表达和纯化
将实施例 2D中得到的重组质粒转化大肠杆菌 BL21 ( DE3 )或其 他适宜宿主， 诱导表达。 以大肠杆菌 BL21 ( DE3 )作为宿主时表达 的 IFN a-2bCyS85约占菌体总蛋白的 30 ~ 50%,主要以包涵体形式存在。
粗纯： 本实施例所用到的粗纯方法与实施例 3A相同。
精纯:依次釆用了 DEAE阴离子交换层析、单抗亲和层析和 S-100 凝胶排阻层析三步纯化工艺。 具体方法： 将复性液以 30 mmol I L Tris-HCl (pH8.0)稀释 10倍上样到 DEAE Sepharose FF离子交换层析 柱，用含 0.3mol / L NaCl 的 30 mmol / L Tris-HCl (pH7.0) 溶液洗脱， 收集洗脱峰； 将上一步洗脱样品经 PBS(pH7.0)3倍稀释， 上样到 IFN a-2b单抗层析柱， 以含 100 mmol I L NaCl 的 0.3 mol I L Gly溶液 (pH2.5)洗脱， 收集洗脱峰； 再将上一步洗脱样品上样到 Sephacryl S-100层析柱， 以 PBS(pH7.0)洗脱。 最后得到的 IFN a-2bCys85纯度在 95%以上（ SDS-PAGE图谱如图 4所示）。 实施例 4 MIFNCys86、 IFN-Con lCys86、 IFN a-2aCys85及 IFN a-2bCys85 的 PEG偶联
本发明四种干扰素 a突变体可以和各种分子量的 PEG偶联， 在 优选实施例中， PEG有两种 mPEG-MAL和 mPEG2-MAL， 平均分子 量分别约为 20KD、 40KD。
1 ) MIFNCys86、 IFN-Con lCys86、 IFN a-2aCys85及 IFN a-2bCys85的浓 缩
以上四种干扰素 α突变体可以分别用 DEAE Sepharose FF层析柱 进行浓缩。 具体方法如下： 将实施例 3A - 3D其中之一纯化的蛋白样 品以 10 ~ 80 mmol I L Tris-HCl pH7.5 ~ 8.5溶液稀释 2倍或以上，上 样到 DEAE层析柱， 然后用 20 mmol / L PB缓冲液 （pH 7.6 ) + 300 mmol / L NaCl的洗脱得到目的蛋白的浓缩液。
2 ) MIFNCys86、 IFN-Con lCys86、 IFN a-2acys85及 IFN a-2bCys85与 mPEG-MAL的偶联
MIFNCys86、 IFN-Con lCys86、 IFN a-2acys85及 IFN a-2bCys85 与 mPEG(20KD)-MAL 偶联反应， 其单 PEG 衍生物分别写做： mPEG(20KD)-MIFNCyS86 、 mPEG(20KD)-IFN-Con lCys86 、 mPEG(20KD)-IFN a-2acys85及 mPEG(20KD)-IFN a-2bCys85。
MIFNCys86、 IFN-Con lCys86、 IFN a-2acys85及 IFN a-2bCys85与 mPEG(40 D)-MAL 偶联反应， 其单 PEG 衍生物分别写做： mPEG(40KD)-MIFNCys86 、 mPEG(40KD)-IFN-Con lCys86 、 mPEG(40KD)-IFN a-2aCys85及 mPEG(40KD)-IFN a-2bCys85。
偶联反应步骤具体如下：
取本实施例步骤 1 中适量体积的浓缩液， 调整蛋白浓度到 8 ~ 12mg/ml, 加入摩尔比为 1 : 1的 PEG粉末， 轻轻摇动使粉末溶解后 于 4°C反应过夜， 即反应时间应超过 10小时。 SDS-PAGE检测反应 的偶联程度 （图 5-6所示）。
实施例 5 干扰素 α突变体衍生物的纯化
釆用 DEAE Sepharose Fast Flow 离子交换层析对修饰产物进行 纯化， 具体条件如下： 釆用 25mmol pH8.0 Tris 缓冲体系将反应液稀 释 20~30倍后， 以流速为 3~4ml/min上样于平衡过的 DEAE柱，待基 线平衡后， 用含 NaCl浓度为 80mM的 25mM pH8.0 Tris 洗脱液洗脱 得到目的蛋白的洗脱峰。 最后得到的重组蛋白纯度都在 95%以上 ( SDS-PAGE图谱如图 7-8所示）。
实施例 6 通过 WISH-VSV系统测定 4种 α干扰素、 突变体及突变 体聚乙二醇衍生物的体外抗病毒活性
釆用细胞病变抑制法通过 WISH-VSV系统测定干扰素的体外抗 病毒活性， 是本技术领域公知的方法， 具体参照 2005版《中华人民 共和国药典》 三部附录 X C "干扰素的生物活性测定"。
本实施例测定了 16种干扰素 （或衍生物） 的体外抗病毒活性， 具体包括：
4种 α干扰素： Μ顾、 IFN-Con l、 IFN a-2a和 IFN a-2b;
4种 a干扰素的突变体： MIFNCys86、 IFN-Con lCys86、 IFN a-2aCys85 及 IFN a-2bCys85 (本发明实施例 3 A - 3D制备）；
还有 8 种聚乙二醇衍生物： mPEG(20KD)-MIFNCys86 、 mPEG(20KD)-IFN-Con lCys86 、 mPEG(20KD)-IFN a-2aCys85 、 mPEG(20KD)-IFN a-2bCys85 、 mPEG(40KD)-MIFNCys86 、 mPEG(40KD)-IFN-Con lCys86 、 mPEG(40KD)-IFN a-2acys85 及 mPEG(40KD)-IFN a-2bCys85 (本发明实施例 5制备）。
其体外抗病毒活性测定结果见下述表 1 - 4。
表 1 : MIFN. MIFNCys86、 mPEG(20KD)-MIFNCyS86及 mPEG(40KD)-MIFNCys86 的体外抗病毒活性
名 称 比活性 （IU/mg ) 活性保留(％)
MIFNcys86 5.68士 0.29X 101 100
mPEG(20KD)-MIFNcys86 5.84±0.35χ10' 1.03
mPEG(40KD)-MIFNcys86 4.12±0.31χ10' 0.73 表 2： IFN-Con 1 、 IFN-Con lCys86、 mPEG(20KD)-IFN-Con lCy mPEG(40KD)-IFN-Con lCys86的体外抗病毒活性
名 称 比活性 （IU/mg ) 活性保留(％)
IFN-Con 1 5.18±0.24χ 108 IFN-Con lCys86 5.13±0.30xl08 100 mPEG(20KD)-IFN-Con lCys86 5.24±0.27><106 1.02
mPEG(40KD)-IFN-Con lCyS86 4.05士 0.25xl06 0.79
表 3: IFN a-2a、IFN a-2acys85、mPEG(20KD)-IFN a-2acys85及 mPEG(40KD)-IFN a-2acys85的体外抗病毒活性
名 称 比活性 （IU/mg ) 活性保留(％)
IFN a-2a 1.09±0.20^108 -
IFN a-2acys85 1.06±0.23>< 108 100
mPEG(20KD)-IFN a-2acys85 1.79±0.30> 106 1.69
mPEG(40KD)-IFN a-2acys85 1.28士 0.21 x 106 1.21
表 4 : IFN a-2b 、 IFN a-2bCys85 、 mPEG(20KD)-IFN a-2bCys85 及 mPEG(40KD)-IFN a-2bCys85的体外抗病毒活性
名 称 比活性 （IU/mg ) 活性保留(％)
IFN a-2b 1.10±0.20 108 -
IFN a-2bCyS85 1.12±0.27 <108 100
mPEG(20KD)-IFN a-2bCyS85 1.64±0.33^106 1.46
mPEG(40KD)-IFN a-2bCys85 1.20±0.26><106 1.07
实施例 7 大鼠药代动力学研究
通过本实施例表 5所示的药代动力学研究方案测定了 12种干扰 素 （或衍生物） 的体外抗病毒活性， 具体包括：
4种 a干扰素的突变体： MIFNCys86、 IFN-Con lCys86、 IFN a-2acys85 及 IFN a-2bCyS85 (本发明实施例 3A ~ 3D制备）；
8 种 聚 乙 二 醇 衍 生 物 ： mPEG(20KD)-MIFNCys86 、 mPEG(20KD)-IFN-Con lCys86 、 mPEG(20KD)-IFN a-2aCys85 、 mPEG(20KD)-IFN a-2bCys85 、 mPEG(40KD)-MIFNCys86 、 mPEG(40KD)-IFN-Con lCys86 、 mPEG(40KD)-IFN a-2acyS85 及 mPEG(40KD)-IFN a-2bCys85 (本发明实施例 5制备）。 表 5: 药代动力学研究方案: α干扰素的突变体 α干扰素突变体的 PEG衍生物 大鼠 6只 6只
给药途径 皮下 皮下
给药方式 单次 单次
给药剂量 3.3MIU 5.4MIU
取血时间点 0,0.2,0.5 ,0.75,1,2,4,8,12,16,24 0,0.5,2,4,8,12,16,24,48,72,96,168 测定方法 WISH/VSV WISH/VSV
在上述试验方案中， 从大鼠眼底收集血样， 然后离心分离收集血 清， 用 CPE法 （WISH/VSV系统）检测血清样品中干扰素含量。
表 6: MIFNCys86及其 PEG衍生物的药代动力学参数表
PK参数 MIFNCys86 mPEG(20KD)-MIFNcys86 mPEG(40KD)-MIFNCys86 tl/2Ka ( h ) 0.25 15.0 17.1 tl/2Ke ( h ) 1.57 18.0 24.8
Tpeak ( h ) 0.78 24.3 26.5
Cpeak
23823.7 26941.7 30628.6
( ru/mi )
AUC
76230.8 1744758.0 2815579.3 ( IU-h/ml )
经 3P87软件拟合发现 MIFNCys86及其 PEG衍生物在 SD大鼠体 内的代谢规律符合一级吸收的一房室模型。 PEG 化可显著改善 MIFNCys86的药代动力学性质， 与 MIFNCys86相比， mPEG- MIFNCys86 的吸收半衰期、 达峰时间、 消除半衰期显著延长； 药时曲线下面积显 著增加； 清除率显著降低。 可见， PEG化可以延长 MIFNCys86的体内 平均存留时间， 降低清除率。
在 IFN-Con 1 CyS86及其 PEG衍生物、 IFN a-2aCys85及其 PEG衍生 物、 IFN a-2bCyS85及其 PEG衍生物的药代动力学试验中也有同样发现, 即： 与修饰前相比， PEG化的干扰素的吸收半衰期、 达峰时间、 消除 半衰期显著延长； 药时曲线下面积显著增加； 清除率显著降低。
由此证明， PEG化可以延长干扰素的体内平均存留时间， 降低清 除率。
至此， 已经对本发明进行了较为充分的描述。优选的实施例只能 阐述而不限制本发明， 对于本领域的技术人员来说， 实现本发明的方 法和手段可以变化和改进， 均应涵盖在本发明的保护范围之内。
工业实用性 动物实验表明本发明干扰素突变体的聚乙二醇衍生物可以延长 干扰素的体内平均存留时间， 降低清除率， 并且具有较高的抗病毒活 性，因而，可以按照本发明所述的方法或本领域技术人员所知的方法， 通过制备本发明所述干扰素突变体， 并进一步与聚乙二醇共价结合， 并开发成药物， 用于免疫调节紊乱如肿瘤疾病或传染病的预防和治 疗。
附序列表：
后面附氨基酸和核苷酸的序列表， 其中 IFN-Con l、 IFN a-2a和 IFN a-2b 的 核苷酸序列为公知序列，在本发明的具体实施例中只是把相应位点的密码子突变 成 tgc, 因此本发明未附 IFN-Con lCys86、 IFN a-2acys85和 IFN a-2bCys85的 DNA序 列。
SEQ ID NO: 1为 MIFNCys86的氨基酸序列；
SEQ ID NO:2为 IFN-Con lCys86的氨基酸序列；
SEQ ID NO:3为 IFN a-2acys85的氨基酸序列；
SEQ ID NO:4为 IFN a-2bCys85的氨基酸序列；
SEQ ID NO:5为 MIFNCys86的 DNA序列；
SEQ ID NO:6~9分别为引物 P1~P4的核苷酸序列。

Claims (10)

  1. 权利要求书
    1、 干扰素 α突变体， 其特征在于干扰素 α氨基酸序列的第 85位 或 86的 Tyr突变为 Cys。
  2. 2、 根据权利要求 1 所述的干扰素 a突变体， 其具有序列表 1~4 任一所述的氨基酸序列。
  3. 3、 编码权利要求 1或 2所述干扰素 α突变体的核苷酸序列。
  4. 4、 权利要求 1或 2所述干扰素 α突变体的聚乙二醇衍生物。
  5. 5、 根据权利要求 4所述的干扰素 α突变体的聚乙二醇衍生物，其 特征在于， 聚乙二醇修饰于干扰素 α突变体的第 85或 86位的 Cys 位点。
  6. 6、 根据权利要求 4或 5所述的干扰素 α突变体的聚乙二醇衍生 物，其是由聚乙二醇巯基修饰剂与干扰素 α突变体的第 85或 86位的 Cys反应获得， 所述聚乙二醇巯基修饰剂选自马来酰亚胺 -PEG、 乙烯 砜 -PEG、 碘代乙酰胺 -PEG及正吡啶基二硫化物 -PEG。
  7. 7、 根据权利要求 4或 5所述的干扰素 α突变体的聚乙二醇衍生 物， 其特征在于聚乙二醇的平均分子量为 5000道尔顿〜 60000道尔 顿。
  8. 8、 一种制备干扰素 α突变体的聚乙二醇衍生物的方法，包括以下' 步骤：
    a) 制备浓缩的干扰素 α突变体溶液；
    b) 聚乙二醇与步骤（a )所述干扰素 α突变体偶联反应；
    c) 干扰素 α突变体的聚乙二醇衍生物的纯化提取。
  9. 9、 药物组合物， 其含有根据权利要求 4~7任一项所述的干扰素 α 突变体的聚乙二醇衍生物。
  10. 10、 权利要求 9所述的药物组合物在治疗或预防病毒性感染或 肿瘤中的应用。
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