CN115850435A - 非天然氨基酸取代il-15的突变体、偶联物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物制药领域，尤其涉及非天然氨基酸取代IL‑15的突变体、偶联物及应用。本发明提供了经非天然氨基酸取代的IL‑15的突变体。本发明通过基因密码子扩展技术在白细胞介素15定点引入非天然氨基酸，并且通过定点的反应实现白细胞介素15的长效化。本发明还提供了对突变体定点的聚乙二醇化修饰，通过使用非天然氨基酸偶联水溶性聚合物的方式得到了在血清中半衰期延长、稳定均一的白细胞介素‑15，优化其药代动力学性质，并应用于抗肿瘤治疗中。本发明还提供了长效化白细胞介素15的应用，如可用于多种肿瘤单独用药进行治疗或者和抗体及免疫细胞联合用药用于抗肿瘤治疗。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，尤其涉及非天然氨基酸取代IL-15的突变体、偶联物及应用。
背景技术
白细胞介素-15(IL15)是多种免疫细胞产生的一类功能多样的细胞因子，通过细胞膜表面的受体(IL15R)发挥生物学功能。其能以高亲和力结合NK细胞膜表面或内环境中游离的IL15α受体(IL15Rα/s IL15Rα)，并以中等亲和力与T细胞表面的IL2Rβ/IL2Rγ受体二聚体，分别激活其下游信号转导通路。因此，IL15可以激活获得性免疫和固有免疫系统中的多种细胞，特别是CD8+T细胞和NK细胞，在抗肿瘤和抗病毒感染中具有重要作用。
由于上述作用，在过去的多年中，IL15被尝试应用到抗肿瘤和抗感染的治疗中，但是其很短的半衰期，很低的生物利用度以及单独用药时较高的不良反应发生率限制了其在临床上的应用。近年来，随着肿瘤免疫治疗的兴起，细胞因子与抗体和细胞治疗联用能够很大提高肿瘤治疗的响应率。因此，目前IL15主要应用于和抗体及细胞治疗联合用药治疗多种血液瘤和实体瘤。
IL15和抗体联合用药用于肿瘤治疗目前有多个临床试验正在进行，然而这些非长效化的IL15的临床试验，用药方案一般都是每天连续静脉注射或者是每天连续皮下注射，这种用药方案病人依从性差，副反应发生率高，所以非长效化的IL15的临床试验的发起者一般是研究机构，用以评价IL15在联合用药中的安全性和有效性。
在一些披露的数据中，IL15能有效激活NK细胞，提高对肿瘤的杀伤效果，在和一些抗体联合用药的临床试验中，能够将治疗响应率提高10％。但是由于其半衰期短，用药方式病人依从性不好，并且其毒性主要是由大剂量用药时最高的药物浓度引起的。所以开发长效化IL15具有重要的临床意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了非天然氨基酸取代IL-15的突变体、偶联物及应用。本发明通过基因密码子扩展技术在白细胞介素15定点引入非天然氨基酸，并且通过定点的反应实现白细胞介素15的长效化。本发明还提供了对突变体定点的聚乙二醇化修饰，通过使用非天然氨基酸偶联水溶性聚合物的方式得到了在血清中半衰期延长、稳定均一的白细胞介素-15，优化其药代动力学性质，并应用于抗肿瘤治疗中。本发明还提供了长效化白细胞介素15的应用，如可用于多种肿瘤单独用药进行治疗或者和抗体及免疫细胞联合用药用于抗肿瘤治疗。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了经非天然氨基酸取代的IL-15的突变体。
在本发明的一些实施方案中，上述突变体中所述非天然氨基酸取代的位点包括第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116位或羧基端中的一种或两种以上的组合；
作为优选，所述非天然氨基酸取代的位点包括：第18位的丝氨酸、第20位的组氨酸、第26位的酪氨酸、第46位的谷氨酸、第79位的天冬酰胺氨酸、第80位的缬氨酸、第81位的苏氨酸、第83位的丝氨酸和/或第84位的甘氨酸的一种或两种以上的组合。
在本发明的一些实施方案中，上述突变体中所述非天然氨基酸取代的位点为第79位的天冬酰胺氨酸。
在本发明的一些实施方案中，上述突变体中所述非天然氨基酸带有正交反应活性基团；所述正交反应活性基团包括：羰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基、四嗪基、环丙烯或炔基中的一种或多种；
所述非天然氨基酸带有叠氮基、四嗪基、炔基、醛基、酮基和/或环丙烯的一种或多种；
所述非天然氨基酸选自：
在本发明的一些实施方案中，上述突变体中所述非天然氨基酸选自：
在本发明的一些实施方案中，上述突变体具有：
(1)、如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或
(2)、在如(1)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
(3)、与(1)或(2)所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。
在本发明的一些实施方案中，上述突变体中所述SEQ ID NO:1的序列为：NWVNVISDLKKIEDLIQ*MHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS。
在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:1为SEQ ID NO:10第18位Ser由非天然氨基酸Tet2.0取代。
在本发明的一些实施方案中，上述突变体中所述SEQ ID NO:2的序列为：NWVNVISDLKKIEDLIQSM*IDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS。
在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:2为SEQ ID NO:10第20位His由非天然氨基酸Tet2.0取代。
在本发明的一些实施方案中，上述突变体中所述SEQ ID NO:3的序列为：NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATL*TESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS。
在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:3为SEQ ID NO:10第26位Tyr由非天然氨基酸Tet2.0取代。
在本发明的一些实施方案中，上述突变体中所述SEQ ID NO:4的序列为：NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLL*LQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS。
在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:4为SEQ ID NO:10第46位Glu由非天然氨基酸Tet2.0取代。
在本发明的一些实施方案中，上述突变体中所述SEQ ID NO:5的序列为：NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNG*VTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS。
在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:5为SEQ ID NO:10第79位Asn由非天然氨基酸Tet2.0取代。
在本发明的一些实施方案中，上述突变体中所述SEQ ID NO:6的序列为：NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGN*TESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS。
在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:6为SEQ ID NO:10第80位Val由非天然氨基酸Tet2.0取代。
在本发明的一些实施方案中，上述突变体中所述SEQ ID NO:7的序列为：NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNV*ESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS。
在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:7为SEQ ID NO:10第81位Thr由非天然氨基酸Tet2.0取代。
在本发明的一些实施方案中，上述突变体中所述SEQ ID NO:8的序列为：NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTE*GCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS。
在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:8为SEQ ID NO:10第83位Ser由非天然氨基酸Tet2.0取代。
在本发明的一些实施方案中，上述突变体中所述SEQ ID NO:9的序列为：NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTES*CKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS。
在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:9为SEQ ID NO:10第84位Gly由非天然氨基酸Tet2.0取代。
在本发明的一些实施方案中，上述突变体中所述SEQ ID NO:10的序列为：NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS。
本发明还提供了上述突变体的核酸分子；
作为优选，其具有：
(4)、如SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:19任一项所示的核苷酸序列；或
(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(4)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(6)、与(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:11的序列为：AATTGGGTTAATGTGATTAGTGATCTGAAAAAAATCGAGGATCTGATTCAGTAGATGCATATTGATGCAACCCTGTATACCGAAAGCGATGTGCATCCGAGCTGTAAAGTGACCGCAATGAAATGCTTCCTGCTGGAACTGCAGGTGATTAGCCTGGAAAGCGGTGATGCCAGTATTCATGATACCGTGGAAAATCTGATTATTCTGGCCAATAATAGTCTGAGCAGTAATGGCAATGTTACCGAAAGTGGCTGTAAAGAATGTGAAGAACTGGAAGAAAAAAACATTAAGGAATTCCTGCAGAGCTTCGTTCATATTGTTCAGATGTTCATTAACACCAGC。
在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:12的序列为：AATTGGGTTAATGTGATTAGTGATCTGAAAAAAATCGAGGATCTGATTCAGAGTATGTAGATTGATGCAACCCTGTATACCGAAAGCGATGTGCATCCGAGCTGTAAAGTGACCGCAATGAAATGCTTCCTGCTGGAACTGCAGGTGATTAGCCTGGAAAGCGGTGATGCCAGTATTCATGATACCGTGGAAAATCTGATTATTCTGGCCAATAATAGTCTGAGCAGTAATGGCAATGTTACCGAAAGTGGCTGTAAAGAATGTGAAGAACTGGAAGAAAAAAACATTAAGGAATTCCTGCAGAGCTTCGTTCATATTGTTCAGATGTTCATTAACACCAGC。
在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:13的序列为：AATTGGGTTAATGTGATTAGTGATCTGAAAAAAATCGAGGATCTGATTCAGAGTATGCATATTGATGCAACCCTGTAGACCGAAAGCGATGTGCATCCGAGCTGTAAAGTGACCGCAATGAAATGCTTCCTGCTGGAACTGCAGGTGATTAGCCTGGAAAGCGGTGATGCCAGTATTCATGATACCGTGGAAAATCTGATTATTCTGGCCAATAATAGTCTGAGCAGTAATGGCAATGTTACCGAAAGTGGCTGTAAAGAATGTGAAGAACTGGAAGAAAAAAACATTAAGGAATTCCTGCAGAGCTTCGTTCATATTGTTCAGATGTTCATTAACACCAGC。
在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:14的序列为：AATTGGGTTAATGTGATTAGTGATCTGAAAAAAATCGAGGATCTGATTCAGAGTATGCATATTGATGCAACCCTGTATACCGAAAGCGATGTGCATCCGAGCTGTAAAGTGACCGCAATGAAATGCTTCCTGCTGTAGCTGCAGGTGATTAGCCTGGAAAGCGGTGATGCCAGTATTCATGATACCGTGGAAAATCTGATTATTCTGGCCAATAATAGTCTGAGCAGTAATGGCAATGTTACCGAAAGTGGCTGTAAAGAATGTGAAGAACTGGAAGAAAAAAACATTAAGGAATTCCTGCAGAGCTTCGTTCATATTGTTCAGATGTTCATTAACACCAGC。
在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:15的序列为：AATTGGGTTAATGTGATTAGTGATCTGAAAAAAATCGAGGATCTGATTCAGAGTATGCATATTGATGCAACCCTGTATACCGAAAGCGATGTGCATCCGAGCTGTAAAGTGACCGCAATGAAATGCTTCCTGCTGGAACTGCAGGTGATTAGCCTGGAAAGCGGTGATGCCAGTATTCATGATACCGTGGAAAATCTGATTATTCTGGCCAATAATAGTCTGAGCAGTAATGGCTAGGTTACCGAAAGTGGCTGTAAAGAATGTGAAGAACTGGAAGAAAAAAACATTAAGGAATTCCTGCAGAGCTTCGTTCATATTGTTCAGATGTTCATTAACACCAGC。
在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:16的序列为：AATTGGGTTAATGTGATTAGTGATCTGAAAAAAATCGAGGATCTGATTCAGAGTATGCATATTGATGCAACCCTGTATACCGAAAGCGATGTGCATCCGAGCTGTAAAGTGACCGCAATGAAATGCTTCCTGCTGGAACTGCAGGTGATTAGCCTGGAAAGCGGTGATGCCAGTATTCATGATACCGTGGAAAATCTGATTATTCTGGCCAATAATAGTCTGAGCAGTAATGGCAATTAGACCGAAAGTGGCTGTAAAGAATGTGAAGAACTGGAAGAAAAAAACATTAAGGAATTCCTGCAGAGCTTCGTTCATATTGTTCAGATGTTCATTAACACCAGC。
在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:17的序列为：AATTGGGTTAATGTGATTAGTGATCTGAAAAAAATCGAGGATCTGATTCAGAGTATGCATATTGATGCAACCCTGTATACCGAAAGCGATGTGCATCCGAGCTGTAAAGTGACCGCAATGAAATGCTTCCTGCTGGAACTGCAGGTGATTAGCCTGGAAAGCGGTGATGCCAGTATTCATGATACCGTGGAAAATCTGATTATTCTGGCCAATAATAGTCTGAGCAGTAATGGCAATGTTTAGGAAAGTGGCTGTAAAGAATGTGAAGAACTGGAAGAAAAAAACATTAAGGAATTCCTGCAGAGCTTCGTTCATATTGTTCAGATGTTCATTAACACCAGC。
在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:18的序列为：AATTGGGTTAATGTGATTAGTGATCTGAAAAAAATCGAGGATCTGATTCAGAGTATGCATATTGATGCAACCCTGTATACCGAAAGCGATGTGCATCCGAGCTGTAAAGTGACCGCAATGAAATGCTTCCTGCTGGAACTGCAGGTGATTAGCCTGGAAAGCGGTGATGCCAGTATTCATGATACCGTGGAAAATCTGATTATTCTGGCCAATAATAGTCTGAGCAGTAATGGCAATGTTACCGAATAGGGCTGTAAAGAATGTGAAGAACTGGAAGAAAAAAACATTAAGGAATTCCTGCAGAGCTTCGTTCATATTGTTCAGATGTTCATTAACACCAGC。在本发明的一些实施方案中，上述SEQ ID NO:19的序列为：AATTGGGTTAATGTGATTAGTGATCTGAAAAAAATCGAGGATCTGATTCAGAGTATGCATATTGATGCAACCCTGTATACCGAAAGCGATGTGCATCCGAGCTGTAAAGTGACCGCAATGAAATGCTTCCTGCTGGAACTGCAGGTGATTAGCCTGGAAAGCGGTGATGCCAGTATTCATGATACCGTGGAAAATCTGATTATTCTGGCCAATAATAGTCTGAGCAGTAATGGCAATGTTACCGAAAGTTAGTGTAAAGAATGTGAAGAACTGGAAGAAAAAAACATTAAGGAATTCCTGCAGAGCTTCGTTCATATTGTTCAGATGTTCATTAACACCAGC。
本发明还提供了野生型的核酸分子，具有如SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列；上述SEQ ID NO:29的序列为：ATGGGTAATTGGGTTAATGTGATTAGTGATCTGAAAAAAATCGAGGATCTGATTCAGAGTATGCATATTGATGCAACCCTGTATACCGAAAGCGATGTGCATCCGAGCTGTAAAGTGACCGCAATGAAATGCTTCCTGCTGGAACTGCAGGTGATTAGCCTGGAAAGCGGTGATGCCAGTATTCATGATACCGTGGAAAATCTGATTATTCTGGCCAATAATAGTCTGAGCAGTAATGGCAATGTTACCGAAAGTGGCTGTAAAGAATGTGAAGAACTGGAAGAAAAAAACATTAAGGAATTCCTGCAGAGCTTCGTTCATATTGTTCAGATGTTCATTAACACCAGCCTCGAGCACCACCACCACCACCACTGA。
本发明还提供了表达载体，包括上述核酸分子。
本发明还提供了宿主，转化和/或转染上述表达载体。
本发明还提供了偶联物，经生物活性分子、细胞毒性药剂、水溶性聚合物、免疫刺激剂或免疫抑制剂中的一种或多种偶联上述突变体；
作为优选，所述偶联采用的接头包括可断裂接头或不可断裂接头；
作为优选，所述偶联采用如下方式：
其中R1选自上述突变体的所述位点-1位氨基残基，R2选自上述突变体的所述位点+1位氨基残基；R3选自所述生物活性分子、所述细胞毒性药剂、所述水溶性聚合物、所述免疫刺激剂或所述免疫抑制剂中的一种或多种功能分子；所述R1到所述R2位为上述突变体的所述氨基酸序列由N端到C端；
作为优选，所述水溶性聚合物包括聚乙二醇；
作为优选，所述聚乙二醇的分子量为10～60kDa；
作为优选，所述聚乙二醇包括：直链聚乙二醇或分支聚乙二醇；
作为优选，所述偶联物包括：
由所述非天然氨基酸取代所述第18位的丝氨酸和所述20KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第18位的丝氨酸和所述40KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第18位的丝氨酸和所述60KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第20位的组氨酸和所述20KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第20位的组氨酸和所述40KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第20位的组氨酸和所述60KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第26位的酪氨酸和所述20KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第26位的酪氨酸和所述40KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第26位的酪氨酸和所述60KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第46位的谷氨酸和所述20KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第46位的谷氨酸和所述40KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第46位的谷氨酸和所述60KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第79位的天冬酰胺氨酸和所述20KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第79位的天冬酰胺氨酸和所述40KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第79位的天冬酰胺氨酸和所述60KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第80位的缬氨酸和所述20KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第80位的缬氨酸和所述40KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第80位的缬氨酸和所述60KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第81位的苏氨酸和所述20KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第81位的苏氨酸和所述40KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第81位的苏氨酸和所述60KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第83位的丝氨酸和所述20KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第83位的丝氨酸和所述40KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第83位的丝氨酸和所述60KDa聚乙二醇组成。
本发明还提供了上述突变体、上述核酸分子、上述表达载体、上述宿主或如上述偶联物在制备抗肿瘤和/或病毒感染药物或制剂中的应用。
本发明还提供了药物、药物组合或制剂，包括上述突变体、上述核酸分子、上述表达载体、上述宿主或上述偶联物以及可接受的辅料；
作为优选，所述药物组合包括上述突变体及其他任意有效成分。
本发明提供了经非天然氨基酸取代的IL-15的突变体。
本发明的有益效果：
(1)本发明通过聚乙二醇修饰，提高了IL15的分子量，使其不会快速地被肾清除。
(2)本发明运用蛋白变复性，可在原核生物大肠杆菌中表达蛋白，生产成本极低，与真核细胞表达相比，原核细胞表达时所使用的的培养基的成本是真核细胞培养基的约1/100，且蛋白产量高，可达10-20mg/L。同时氨基酸易于合成，可大规模地表达制备蛋白。此外，本发明中所提供的IL15修饰平台，可用于修饰不同分子量大小的聚乙二醇分子，通过改变聚乙二醇分子量大小可调节蛋白的半衰期，根据需求可选用不同大小的聚乙二醇分子，更满足精准医疗需求。
(3)本发明通过基因密码子扩展技术实现了定点均一的IL15修饰，有利于提高有效性与安全性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示技术路线图；
图2示Tet2.0(second tetrazine amino acid generated by Ryan A.Mehl)合成路线；
图3示m-TetBzK(间位四嗪苯甲酰赖氨酸)合成路线；
图4示IL15突变位点选择；
其中：突变位点以棍棒模型显示，从下到上依次为：Ser18,His20,Glu46,Tyr26Asn79,Val80,Ser83,Thr81,Gly84；各位点残基已标注在对应位置处；
图5示IL-15突变体蛋白的聚乙二醇化修饰；
其中：左一：蛋白marker；左二：聚乙二醇化修饰的IL-15；左三：未经修饰的IL-15突变体蛋白对照；
图6示SPR验证IL15突变蛋白N81-Tet2.0与IL15Rα受体结合；从上到下依次为：Curve:Protein 250nM；Fitted Curve:Protein 250nM；Curve:Protein 125nM；FittedCurve:Protein 125nM；Curve:Protein 62.5nM；Fitted Curve:Protein 62.5nM；Curve:Protein 31.2nM；Fitted Curve:Protein 31.2nM；Curve:Protein 15.6nM；Fitted Curve:Protein 15.6nM；Curve:Protein 7.81nM；Fitted Curve:Protein 7.81nM；Curve:Protein3.91nM；Fitted Curve:Protein 3.91nM；
图7示细胞增殖实验验证蛋白及蛋白修饰物活性。
具体实施方式
本发明公开了非天然氨基酸取代IL-15的突变体、偶联物及应用。
应该理解，表述“……中的一种或多种”单独地包括每个在所述表述后叙述的物体以及所述叙述的物体中的两者或更多者的各种不同组合，除非从上下文和用法中另有理解。与三个或更多个叙述的物体相结合的表述“和/或”应该被理解为具有相同的含义，除非从上下文另有理解。
术语“包括”、“具有”或“含有”，包括其语法同义语的使用，通常应该被理解为开放性和非限制性的，例如不排除其他未叙述的要素或步骤，除非另有具体陈述或从上下文另有理解。
应该理解，只要本发明仍可操作，步骤的顺序或执行某些行动的顺序并不重要。此外，两个或更多个步骤或行动可以同时进行。
本文中的任何和所有实例或示例性语言如“例如”或“包括”的使用，仅仅打算更好地说明本发明，并且除非提出权利要求，否则不对本发明的范围构成限制。本说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于本发明的实践是必不可少的。
此外，用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。因此，除非另有明确的说明，应当理解本公开所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。
本发明氨基酸的合成、可修饰位点的选择及含有四嗪基团的白介素-15蛋白的表达纯化、突变体蛋白的聚乙二醇化修饰及后续验证试验中，所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1氨基酸的合成
(1)四嗪环的构建
称取5g叔丁氧羰基对氰基-L-苯丙氨酸(17.24mmol)，加入5.65g乙腈(138mmol)和1.83g 3-巯基丙酸(17.24mmol)，冰浴。冷却至0℃后滴加一水合肼13.8g(276mmol)，氩气保护，25℃反应4h。反应液转入烧杯，冷却至0℃，加入17.8g亚硝酸钠(溶于水加入)。冰浴滴加2M盐酸(HCl)调节pH至3～4，注意不要过酸避免叔丁氧羰基(Boc)基团脱保护，pH调节过程中有红棕色气体生成。用乙酸乙酯进行萃取，饱和食盐水洗涤至乙酸乙酯相澄清，无水硫酸钠干燥。抽滤，柱层析分离(二氯甲烷DCM：甲醇MeOH＝150:1)，浓缩后可得紫红色固体。
(2)脱保护
将上述(1)获得的产物全部溶于二氯甲烷溶剂，加入1/4体积的三氟乙酸，25℃反应约1h，将三氟乙酸旋干，加入乙醚析晶，抽滤可得紫红色固体，上述步骤如图2所示。
实施例2氨基酸的合成
(1)活性酯中间体合成
称取2g 3-氰基苯甲酸溶于150mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入5.2g的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和2.34gN-羟基丁二酰亚胺(NHS)。氩气保护，25℃反应过夜。反应16h后，将反应导入装有水的烧杯中，用乙酸乙酯萃取三次。用饱和食盐水洗三次，无水硫酸钠干燥。抽滤后旋蒸，干燥，投下一步反应。
(2)酰胺缩合
将上述步骤(1)得到的产物称重(4g)，加入4g Nα-(叔丁氧基羰基)-L-赖氨酸和2.46g的无水三乙胺，溶于100mL DMF中，氩气保护，25℃反应过夜。反应后先旋蒸除去绝大部分的DMF，再倒入200mL水中，调节pH至4～5，用乙酸乙酯萃取，饱和食盐水洗涤三次，无水硫酸钠干燥。抽滤后旋蒸，干燥，柱层析(DCM：MeOH＝100:1)，得棕黄色油状液体。
(3)四嗪环的构建
将上述步骤(2)得到的产物称重(1.5g)，加入1.31g乙腈和0.42g 3-巯基丙酸。冷却至0℃后滴加一水合肼2.94g，氩气保护，25℃反应4h。反应液转入烧杯，冷却至0℃，加入4.14g亚硝酸钠(溶于水加入)。冰浴滴加2M HCl调节pH至3～4，注意不要过酸避免Boc基团脱保护，pH调节过程中有红棕色气体生成。用乙酸乙酯进行萃取，饱和食盐水洗涤至乙酸乙酯相澄清，无水硫酸钠干燥。抽滤，柱层析分离(DCM：MeOH＝150:1)，浓缩后可得紫红色固体。
(4)脱保护
将上述步骤(3)得到的产物全部溶于二氯甲烷中，加入1/4体积的三氟乙酸，25℃反应约1h，将三氟乙酸旋干，加入乙醚析晶，抽滤可得紫红色固体，上述步骤如图3所示。
实施例3可修饰位点的选择及含有四嗪基团的白介素-15蛋白的表达纯化
根据IL-15及其与受体三聚体互作的晶体结构，如图4所示选取了第Ser18,His20,Tyr26,Glu46,Asn79,Val80,Thr81,Ser83,Gly84位为非天然氨基酸引入位点，将其密码子突变为TAG。
针对每个位点，选用将对应位点氨基酸密码子突变为琥珀密码子的引物(引物如表1)，以pET22B-IL15-WT为模板，利用KOD One酶(TOYOBO，Catalog#KM-101)进行定点突变，PCR产物用DpnI酶(NEB,Catalog#R0176S)处理后转入大肠杆菌DH5α菌株，复苏后涂于带有氨苄青霉素抗性的平板，次日挑菌送测序，分别得到上述9个突变体质粒。
将上述带有氨苄青霉素抗性的突变体质粒与带有壮观霉素抗性的辅助质粒共同转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，经双抗性平板筛选得到共转了两种质粒的阳性菌株，挑菌用于后续表达。将阳性菌株挑至含有氨苄青霉素与壮观霉素的2×YT培养基中培养，37℃培养过夜后1:50转接至所需的蛋白表达体积，扩增至菌液OD为0.6～0.8时，加入终浓度1mM的IPTG及1mM的实施例1获得的Tet2.0或实施例2获得的m-TetBzK，37℃表达6-8小时后离心收集菌体。
以表达体积1/10体积的PBS重悬菌体，利用超声破碎仪破碎菌体，高速离心弃上清，蛋白沉淀用Precipitate WashBuffer(2M尿素,50mMpH8.0Tris-HCl,500Mm NaCl,1mMEDTA,0.5％Triton-X)重悬，离心弃上清；沉淀用ddH2O重悬，离心弃上清，重复两次。洗涤后的蛋白沉淀用Solution Buffer(6M盐酸胍,50mM Tris,500mM NaCl,2mM DTT)溶解至澄清，25℃孵育1小时后高速离心取上清，与Ni-NTA纯化介质孵育30分钟。
孵育后的混合物流过重力空柱，残留Ni-NTA纯化介质用Wash Buffer 1(4M盐酸胍,50mM pH8.0 Tris-HCl,500mM NaCl,2mM DTT)孵育10分钟后洗涤；后转移至WashBuffer 2(2M盐酸胍,50mM pH8.0 Tris-HCl,500mM NaCl,2mM DTT)中，孵育10分钟后流干；再用Wash Buffer 3(pH8.0 Tris-HCl,500mM NaCl,2mM DTT)孵育10分钟后洗涤。洗涤后不含盐酸胍的Ni-NTA纯化介质用Ni-NTA Wash Buffer(50mM pH8.0 Tris-HCl,500mM NaCl,20mM咪唑,1mM DTT)充分洗涤，最后用Ni-NTA Elution Buffer(50mM pH8.0Tris-HCl,500mM NaCl,300mM咪唑)进行洗脱。
对洗脱下的蛋白进行透析，透析缓冲液含50mM Tris,150mM NaCl,10mM GSH,1mMGSSG，换液透析2～3次，每次6～8小时；透析完成后的蛋白超滤浓缩，换液至PBS中。
表1蛋白突变体构建引物
实施例4突变体蛋白的聚乙二醇化修饰
纯化得到的含有实施例1获得的四嗪基团非天然氨基酸的突变位点为N79的IL-15突变体蛋白与mPEG20K-TCO(货号BGNH-45-100mg，西安康福诺)以摩尔比1:3加入体系反应，25℃反应过夜后，用AKTA自动蛋白纯化仪(Superdex 75GL10/300,Cytiva)进行分离纯化，得到纯度>85％的聚乙二醇修饰的IL-15蛋白，如图5所示，可见PEG修饰后蛋白分子量变大。
实施例5分子水平验证突变体蛋白与受体的结合
IL15能够独立地以高亲和力(Kd＝10-11nM)与IL15Rα(CD215)结合，以中等亲和力(Kd＝10-9nM)与IL2β/γ(CD122/CD132)二聚体结合，并分别介导下游信号转导通路。
采用表面等离子共振(SPR)及生物膜层干涉(BLI)的方法，对实施例3得到的突变位点为N79的突变体蛋白及实施例4得到的聚乙二醇化修饰的突变体蛋白与IL15Rα及IL2Rβ亲和力进行测定。
(1)SPR
表面等离子共振(SPR)是一种物理现象，当入射光以共振角(SPR角)入射到两种不同的介质表面时，若光的频率和波数与金属表面自由电子(即等离子)一致时，等离子能吸收光发生共振，使反射光的强度在一定角度内大幅下降。SPR通过捕捉受体与配体互作过程中SPR角的动态变化，获取生物分子结合、解离、亲和性、反应速率等互作动力学参数。本方案采用氨基偶联方式，将Fc融合的IL15Rα或IL2β固定在芯片上(pH4.5)，平衡后以不同浓度梯度流过突变体蛋白及实施例4获得的聚乙二醇修饰的IL-15蛋白，不同浓度间以pH2.5醋酸缓冲液进行再生，结合180s，解离180s。用软件拟合Kd值，结果如图6和表2所示，所得KD＝3.81×10-11M，与现有技术亲和力相近，说明在IL15上引入该突变不影响其与受体亲和力。
表2
(2)BLI
生物膜层干涉(BLI)通过检测传感器上分子的结合与解离导致的生物膜层厚度变化产生的干涉光波的相对位移来获得分析物的亲和力、动力学常数等信息。
采用氨基偶联的方式，将Fc融合的IL15Rα或IL2β固定在AR2G传感器上(pH4.5)，平衡后以不同浓度梯度流过实施例3获得的突变位点为N79的突变体蛋白及实施例4获得的聚乙二醇修饰的IL-15蛋白，结合180s，解离180s。用软件拟合Kd值。
实施例6利用细胞增殖验证蛋白活性
Mo7e为人巨细胞白血病细胞株，源于6个月龄患有急性巨核细胞白血病(AMLM7)女婴的外周血，是M-07细胞系的亚系，GM-CSF、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-15、NGF、SCF、TNF-α、TPO可促进细胞增殖。选择利用Mo7e细胞系来评价IL-15蛋白的生物活性，具体操作步骤如下：
(1)细胞铺板
加蛋白前一个晚上换液至无GM-CSF的RPMI 1640(+10％FBS+1×PS)培养基中，平底透明96孔板中每个孔加入5×105个细胞，每孔100μL。37℃静置过夜，饥饿处理。
(2)蛋白配置
1)取一块平底透明的96孔板，在第一排分别用培养基RPMI1640(+10％FBS+1×PS)重悬配制IL-15蛋白、实施例3获得的Asn79位点引入Tet2.0获得的突变体蛋白、实施例4获得的Asn79位点引入Tet2.0获得的聚乙二醇修饰的IL-15蛋白各400μL，终浓度为20μg/mL用排枪吹打混匀；
2)在2-5横排，每孔中加入360μL的培养基RPMI1640(+10％FBS+1×PS)，将第一排的蛋白溶液吸出40μL，混入第二排；第二排的蛋白溶液吸出40μL，混入第三排；第三排的蛋白溶液吸出40μL，混入第四排；第四排的蛋白溶液吸出40μL，混入第五排；即每排之间的蛋白溶液稀释10倍；
3)第六排中每孔仅加入400μL的相同培养基；
4)即同一种蛋白由上到下的浓度依次为：20、2、0.2、0.02、0.002、0μg/mL；
(3)细胞与蛋白的孵育
将配制的蛋白溶液100μL分别依次加入到含有100μL Mo7e细胞的平底透明96孔板中，设置3个复孔，在37℃，5％CO2细胞培养箱中静置孵育72h。
(4)细胞增殖情况检测
1)48h后，补加1×PS；
2)2h后，配制5mg/mL的MTT溶液作为母液，10×加入孔中吹打混匀，37℃继续培养4h；
3)1000g离心8min让产生的formazan沉淀完全贴壁，吸除培养基；
4)每孔加入100μLDMSO溶解沉淀，吹打混匀37℃显色10min；
5)放入酶标仪，在570nm检测吸光度。
表3
表4统计学分析
实验结果如图7和表3、表4所示，证明变复性得到的IL15野生型蛋白具有活性，可刺激细胞因子依赖的MO7e细胞增殖。将原生糖基化位点Asn79突变为Tet2.0后蛋白仍具有活性，修饰PEG20K后亦然，但活性相比起野生型蛋白有所下降。
实施例7利用健康人外周血单核细胞受刺激后磷酸化水平变化评估蛋白突变体及偶联物活性及功能
利用淋巴细胞分离试剂盒(达科为，Catalog#7111011)分离健康人外周血单核细胞(PBMC)，操作按照说明书进行。分离得到的PBMC静息2小时后，用待测样品刺激45分钟，固定透化后，用抗体染色：anti-pStat5-pacific blue，anti-human-CD3+-APC/Cy7，anti-human-CD4+-PE/Cy7，anti-human-CD16+CD56+-PE，anti-human-CD8+-FITC，anti-human-CD69-APC，后用多色流式进行检测。
实施例8IL-15修饰物在小鼠体内的药代动力学及药效动力学评估
在SPF级别的动物房中，三只一组购买BALB/c雌鼠，8-10周龄，稳定2天将IL-15蛋白、实施例4获得的各位点的聚乙二醇修饰的IL-15蛋白使用BCA定量后，用PBS配制为5μg/125μL以备用；在注射蛋白的前一天，取三只小鼠的眼内眦血样，300g，5分钟离心，取血清部分保存在-80℃，作为0小时样品；在小鼠的后颈部皮下注射使用胰岛素注射器，每只5μg/125μL；在蛋白注射后的30分钟，2、8、24、48、72、96小时后分别从小鼠的眼内眦用0.5mm直径的毛细管取血，每次50-100μL，放入抗凝紫管中，保证小鼠的活力；将血样从抗凝管中转移入Ep管中，300g，5分钟离心，将血清转移入新的Ep管中，标记，放在-80℃保存以备用；ELISA检测血清中蛋白浓度。
同时，对注射了蛋白的小鼠分别在0.03,0.17,0.5,1,2,4,8,12,24,48,72,96and120h取400μL血，对其进行流式分析，分析指标为：激活pSTAT5,pAKT,增殖(Ki67),granzymeB以及IL-2Rβ在CD3-,NKp46+NK细胞和CD3+,CD8+T细胞的表达。
实施例9IL15修饰物在B16-F10黑色素瘤模型中的应用
50,000/0.1mL B16-F10细胞皮下注射至C57BL6小鼠侧翼；肿瘤体积每周测量三次。当肿瘤体积达到50mm3时，小鼠被随机分组，分别静脉给药1mg/kg,3mg/kg,6mg/kg，7天后重复给药。从Day 0开始，每隔3天记录一次肿瘤体积，每次4个点，Day 14处死小鼠，测量肿瘤体积和质量，绘制肿瘤体积曲线。
第3,5,7和10天，处死小鼠，取肿瘤组织和脾脏，处理得到单细胞，用于流式分析，每个时间点每组取4只小鼠。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.经非天然氨基酸取代的IL-15的突变体。
2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述非天然氨基酸取代的位点包括第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116位或羧基端中的一种或两种以上的组合；
作为优选，所述非天然氨基酸取代的位点包括：第18位的丝氨酸、第20位的组氨酸、第26位的酪氨酸、第46位的谷氨酸、第79位的天冬酰胺氨酸、第80位的缬氨酸、第81位的苏氨酸、第83位的丝氨酸和/或第84位的甘氨酸的一种或两种以上的组合。
3.如权利要求1或2所述的突变体，其特征在于，所述非天然氨基酸带有正交反应活性基团；所述正交反应活性基团包括：羰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基、四嗪基、环丙烯或炔基中的一种或多种；
作为优选，所述非天然氨基酸带有叠氮基、四嗪基、炔基、醛基、酮基和/或环丙烯的一种或多种；
更优选的，所述非天然氨基酸选自：
4.如权利要求1至3任一项所述的突变体，其特征在于，其具有：
(1)、如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:9任一项所示的氨基酸序列；或
(2)、在如(1)所示的氨基酸序列的基础上经取代、缺失、添加和/或替换1个或多个氨基酸的序列；或
(3)、与(1)或(2)所示的氨基酸序列同源性90％以上的序列。
5.编码如权利要求1至4任一项所述突变体的核酸分子；
作为优选，其具有：
(4)、如SEQ ID NO:11至SEQ ID NO:19任一项所示的核苷酸序列；或
(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与(4)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
(6)、与(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有80％同一性的核苷酸序列。
6.表达载体，其特征在于，包括如权利要求5所述的核酸分子。
7.宿主，其特征在于，转化和/或转染如权利要求6所述的表达载体。
8.偶联物，其特征在于，经生物活性分子、细胞毒性药剂、水溶性聚合物、免疫刺激剂或免疫抑制剂中的一种或多种偶联如权利要求1至4任一项所述的突变体；
作为优选，所述偶联采用的接头包括可断裂接头或不可断裂接头；
作为优选，所述偶联采用如下方式：
其中R1选自如权利要求2所述突变体的所述位点-1位氨基残基，R2选自如权利要求2所述突变体的所述位点+1位氨基残基；R3选自所述生物活性分子、所述细胞毒性药剂、所述水溶性聚合物、所述免疫刺激剂或所述免疫抑制剂中的一种或多种功能分子；所述R1到所述R2位为如权利要求1至4任一项所述突变体的所述氨基酸序列由N端到C端；
作为优选，所述水溶性聚合物包括聚乙二醇；
作为优选，所述聚乙二醇的分子量为10～60kDa；
作为优选，所述聚乙二醇包括：直链聚乙二醇或分支聚乙二醇；
作为优选，所述偶联物包括：
由所述非天然氨基酸取代所述第18位的丝氨酸和所述20KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第18位的丝氨酸和所述40KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第18位的丝氨酸和所述60KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第20位的组氨酸和所述20KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第20位的组氨酸和所述40KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第20位的组氨酸和所述60KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第26位的酪氨酸和所述20KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第26位的酪氨酸和所述40KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第26位的酪氨酸和所述60KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第46位的谷氨酸和所述20KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第46位的谷氨酸和所述40KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第46位的谷氨酸和所述60KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第79位的天冬酰胺氨酸和所述20KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第79位的天冬酰胺氨酸和所述40KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第79位的天冬酰胺氨酸和所述60KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第80位的缬氨酸和所述20KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第80位的缬氨酸和所述40KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第80位的缬氨酸和所述60KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第81位的苏氨酸和所述20KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第81位的苏氨酸和所述40KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第81位的苏氨酸和所述60KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第83位的丝氨酸和所述20KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第83位的丝氨酸和所述40KDa聚乙二醇组成；或
由所述非天然氨基酸取代所述第83位的丝氨酸和所述60KDa聚乙二醇组成。
9.如权利要求1至4任一项所述突变体、如权利要求5所述的核酸分子、如权利要求6所述的表达载体、如权利要求7所述的宿主或如权利要求8所述的偶联物在制备抗肿瘤和/或病毒感染药物或制剂中的应用。
10.药物、药物组合或制剂，其特征在于，包括如权利要求1至4任一项所述突变体、如权利要求5所述的核酸分子、如权利要求6所述的表达载体、如权利要求7所述的宿主或如权利要求8所述的偶联物以及可接受的辅料；
作为优选，所述药物组合包括如权利要求1至4任一项所述突变体及其他任意有效成分。
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