CN101547935B - 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物 - Google Patents

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Abstract

通过将现有的IFN-α分子的第85或86位的Tyr替换成Cys获得了IFN-α突变体。也提供了它们的聚乙二醇衍生物，这些衍生物具有高的体外抗病毒活性和延长的体内半衰期，其中聚乙二醇分子共价结合于IFN-α突变体的游离Cys残基。还提供了IFN-α突变体的聚乙二醇衍生物的制备方法以及含有衍生物的药物组合物。

Description

干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物
技术领域
本发明涉及干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物的制备方法及用途。具体地说，本发明涉及利用体外定点突变技术对α干扰素进行定点突变，将其85或86位的Tyr替换为Cys，并利用该位点与聚乙二醇共价结合。本发明还涉及利用半胱氨酸对干扰素特异性修饰的方法、干扰素α突变体聚乙二醇衍生物纯化提取及其在癌症和感染性疾病中的应用。 
背景技术
干扰素是一类重要的家族性细胞因子，具有广谱的抗病毒、抗细胞增殖和免疫调节作用。哺乳动物的干扰素可以分为α、β、γ、ω等几型，其中α干扰素又可分十余种亚型，经大量临床研究证明，α型干扰素是一种重要的抗病毒和抗肿瘤治疗药物。目前我国在临床使用最广泛的主要是重组人干扰素α1b、α2a和α2b。 
另外，研究显示，人α干扰素的I型家族有20多个基因成员，其中大部分编码功能蛋白，彼此在核苷酸水平上有大约90％的同源性。通过基因工程的手段可以产生相当数量的干扰素的衍生物或类似物。目前最引人注目的是美国Amgen公司根据13种α型干扰素的基因序列同源性，设计出的一种全新的蛋白质工程药物干复津( 
Figure GPA00000230111500011
IFN-Con1)，并经美国FDA批准1997年在美国上市，用于治疗丙型肝炎，其抗病毒活性是α2b干扰素的5-10倍。公开号为CN 1511849A的中国专利申请(申请人：北京三元基因工程公司)公开了用体外同源重组方法得到多种α族干扰素分子，其在活性和稳定性方面比干复津有更大优势。 
但是，无论是干扰素α1b、α2a、α2b还是干复津，作为蛋白质性药物，由于稳定性差，血浆清除率高，体内半衰期短，易产生抗原抗 体反应等，在临床治疗中受到很大的限制。基因工程技术使大规模合成人重组蛋白成为可能，很大程度上解决了异源蛋白引起的免疫原性问题，却仍然无法克服血浆清除快和生物利用度低等缺点，这些缺点造成的结果是：需频繁注射干扰素才能达到有效的血浆治疗浓度；而且，每次注射后均会导致血药浓度的较大波动，形成药物浓度的峰值与谷值。这样就可能增加了治疗费用以及给药不便和不良反应的风险。因此，人们试图采用各种药物传递技术(Drug DeliveryTechnology)，来提高蛋白质药物的疗效。而目前在药物传递技术中研究最为广泛的是聚乙二醇修饰技术(PEGNOLOGY)。 
聚乙二醇修饰蛋白质的技术是近十几年来发展起来的一种用于改进蛋白质类药物体内药动学性质的新技术。它是将活化的聚乙二醇分子[Poly(ethylene glycol)，PEG]键合到蛋白质分子表面上，从而影响蛋白质的空间结构，最终导致蛋白质各种生物化学性质的改变，如：化学稳定性增加，抵抗蛋白酶水解的能力提高，免疫原性和毒性降低或消失，体内半衰期延长，血浆清除率降低等等。 
PEG组分是由氧乙烯单体聚合而成的惰性长链的两性分子。现在已有多种不同的PEG分子可供利用。被活化的PEG其活性功能基团可以被联结到治疗分子的某特殊部位(比如胺、巯基或其他亲核物质)。在大多数情况下，PEG衍生物的共价键联结的是利用赖氨酸的氨基和多肽分子的N-末端作为修饰部位，每一个连接部位决定一种不同的同种型(isotype)。在药物研发过程中，PEG同种型的分布具有重要意义。由于产品的生物学活性与特定同种型分布的混合物有密切关系，产品必须按分布要求来定义。必须证明在整个药物开发过程中，包括生产过程改变和按比例放样时PEG同种型分布的一致性。在实际生产中，这给产品的工艺控制和质量评价带来很大困难。 
定点修饰则可以避免以上种种麻烦，在蛋白质特定位点进行修饰可获得高特异性修饰产物，可以有效控制修饰产物的纯度，使工艺更 简单并且产品质量也更易评价，因此受到越来越多的重视。利用分子内的半胱氨酸(Cys)位点可以对蛋白质进行高选择性修饰。带有游离巯基的蛋白质为数不多，但却是维持蛋白空间结构的重要共价键，在此位点的化学修饰常会导致分子结构的较大破坏，使蛋白活性丧失。采用基因工程的手段可以实现这一目的。值得注意的是，不同的蛋白质或多肽结构和性质不同，究竟能不能引进及在什麽位点引进存在差异。通过基因工程途径人为增加的Cys，会因形成分子内错配或分子间结合，导致分子不稳定或形成非正常聚合体。在这方面，全面的序列分析和准确的分子结构模拟将会提供思路。 
序列分析发现：包括干扰素α2a、α2b和IFN-con 1在内的绝大多数α干扰素分子内都有四个半胱氨酸，其中1和99位Cys、29和139位Cys之间形成二硫键。本申请人通过体外同源重组获得的新型干扰素(MIFN)也保持了这一特点。IFN-α1b在结构上和α族其他干扰素有明显不同，前者除了具有上述4个Cys形成正常二硫键之外，在第86位有第5个Cys，小试发现，利用该位点可以对干扰素进行定点修饰。因而，结合该特点，对其它α干扰素进行改造有望收到同样的效果。 
发明内容
本发明的目的在于提供一种干扰素α突变体，其氨基酸序列第85位或第86位的氨基酸突变为Cys，这种突变体的第85位或86位的Cys可以与聚乙二醇结合，形成聚乙二醇衍生物，其具有良好的稳定性、水溶性、抵抗原性以及高生物活性等优点。 
α干扰素的第85位或86位通常为酪氨酸(Tyr)，其位于一个相对保守的区段，本发明通过将Tyr突变为Cys对α干扰素进行改造，获得了一系列突变体，通过与聚乙二醇反应，获得了一些列聚乙二醇衍生物。 
下面就目前常用的四种α干扰素对本发明的技术方案作进一步 的说明： 
MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFN α-2aCys85及IFN α-2bCys85(氨基酸序列见附录SEQ ID NO.1-4)，系对四种现有的干扰素MIFN、IFN-Con 1、IFN α-2a及IFN α-2b进行定点突变，将86(MIFN和IFN-Con 1)或85(IFN α-2a和IFN α-2b)位氨基酸替换为Cys而得。利用体外定点突变的技术，分别对目的基因进行重组，将获得重组基因插入表达载体pET-23b中，获得了可编码重组蛋白的重组质粒。四种重组子分别在大肠杆菌BL21(DE3)受体细胞中高效稳定的表达，表达产物以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的30％以上。MIFNCys86及IFN-Con 1Cys86的纯化依次采用了疏水层析、DEAE阴离子交换层析和S-100凝胶排阻层析三步纯化工艺，可以得到高纯度的MIFNCys86及IFN-Con 1Cys86；IFN α-2aCys85及IFN α-2bCys85的纯化依次采用了DEAE阴离子交换层析、单抗亲和层析和S-100凝胶排阻层析三步纯化工艺，可以得到高纯度的IFN α-2aCys85及IFN α-2bCys85。 
尽管本发明描述的突变体是α干扰素第85或86位的Tyr突变为Cys，但是本领域技术人员应当理解，由于α干扰素的链长不完全一致，因而，这里的Tyr仅仅是用于说明突变的位置。本领域技术人员可能会对α干扰素进行各种改造，例如将某些位点进行突变，进而获得功能相同或相近的不同于现有α干扰素的氨基酸序列，然而，通过将本发明所述的相应位点进行相应的突变和修饰，从而获得性能的改善，因而，本发明所述的α干扰素突变体还包括这些序列。 
本发明提供多种干扰素α突变体聚乙二醇衍生物，其中聚乙二醇可以是直链的也可以是具有分支结构的，用5000～40000道尔顿的PEG对α干扰素突变体进行修饰，结果显示PEG化蛋白的半衰期随着PEG分子量的增大有不同程度延长。 
本发明还提供了干扰素α突变体聚乙二醇衍生物的制备和纯化方法。 
本发明最后提供了干扰素α突变体聚乙二醇衍生物体外药效和药代试验的方法和结果，表明其在治疗或预防免疫调节紊乱如肿瘤疾病或传染病方面的应用中有更好的技术参数。 
附图说明
图1：表示“MIFNCys86的基因构建和扩增”中两轮PCR产物的琼脂糖电泳图谱(实施例1A)。1泳道为DNA marker；2泳道为首轮PCR中反应体系1的产物；3泳道为首轮PCR中反应体系2的产物；4泳道为第二轮PCR产物； 
图2：表示“MIFNCys86重组质粒的构建、转化和鉴定”中阳性克隆作为模板PCR产物的琼脂糖电泳图谱(实施例2A)。1泳道为DNAmarker；2～8泳道分别为一个单菌落的PCR产物，其中2、4、5、6、7、8为阳性克隆； 
图3：表示四种突变体重组质粒的Nde I/EcoR I双酶切电泳图谱(实施例2A～2D)。1泳道为DNA marker；2泳道为pET-23b质粒载体；3、7泳道分别为Nde I/EcoR I酶切前后MIFNCys86的重组质粒；4、8泳道分别为Nde I/EcoR I酶切前后IFN-Con 1Cys86的重组质粒；5、9泳道分别为Nde I/EcoR I酶切前后IFN α-2aCys85的重组质粒；6、10泳道分别为Nde I/EcoR I酶切前后IFN α-2bCys85的重组质粒； 
图4：表示纯化的MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFN α-2aCys85及IFNα-2bCys85的SDS-PAGE图谱(实施例3A～3D)。1泳道为蛋白marker；2、3、4、5泳道分别为纯化的MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFN α-2aCys85及IFN α-2bCys85； 
图5：表示MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFN α-2aCys85及IFN α-2bCys85与PEG-MAL(20KD)偶联反应的SDS-PAGE图谱(实施例4)。1泳道为蛋白marker；2、3、4、5泳道分别为MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFNα-2aCys85及IFN α-2bCys85与PEG-MAL(20KD)偶联反应的产物； 
图6：表示MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFN α-2aCys85及IFN α-2bCys85与PEG-MAL(40KD)偶联反应的SDS-PAGE图谱(实施例4)。1泳道为蛋白marker；2、3、4、5泳道分别为MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFN α-2aCys85及IFN α-2bCys85与PEG-MAL(40KD)偶联反应的产物； 
图7：表示纯化的4种干扰素α突变体的PEG-MAL(20KD)衍生物的SDS-PAGE图谱(实施例5)。1泳道为蛋白marker；2、3、4、5分别泳道为mPEG(20KD)-MIFNCys86、mPEG(20KD)-IFN-Con 1Cys86、mPEG(20KD)-IFN α-2aCys85及mPEG(20KD)-IFN α-2bCys85； 
图8：表示纯化的4种干扰素α突变体的PEG-MAL(40KD)衍生物的SDS-PAGE图谱(实施例5)。1泳道为蛋白marker；2、3、4、5分别泳道为mPEG(40KD)-MIFNCys86、mPEG(40KD)-IFN-Con 1Cys86、mPEG(40KD)-IFN α-2aCys85及mPEG(40KD)-IFN α-2bCys85。 
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。 
除非特殊定义，本文描述所用的术语是在有关技术领域中公知的术语。标准的化学符号及缩写符号可以与其全名互换使用。例如：“PEG”和“聚乙二醇”具有相同的含义；“干扰素α”、“IFN-α”及“α干扰素”含义也相同。 
除非特殊指明，本文所用到但未明确阐述或简单阐述的技术和方法是指本技术领域通常使用的技术和方法，可以一般的按照本领域公知的技术和方法进行。试剂盒的使用是根据制造商或供应商提供的说明书进行。 
本发明MIFN、IFN-Con 1、IFN α-2a及IFN α-2b四种蛋白的类似物可以通过氨基酸功能等效分子的取代、添加或缺失来获得，如在本技术领域公知，用性质类似的一个或多个氨基酸残基取代原序列内相应的氨基酸残基改变原蛋白质序列，形成沉默改变。 
本发明中聚乙二醇衍生物的聚乙二醇部分，如本领域技术人员公知，可以具有直链或分支结构。其是一种巯基反应PEG化试剂，能够和半胱氨酸残基的巯基发生反应，包括来酰亚胺-PEG、乙烯砜-PEG、碘代乙酰胺-PEG及正吡啶基二硫化物-PEG等，其中优选马来酰亚胺-PEG。本发明尝试用分子量约5000、10000、12000、20000、30000和40000道尔顿的PEG对四种α干扰素突变体进行修饰，均可以获得PEG-干扰素的衍生物。资料显示：PEG化蛋白的半衰期随着PEG分子量的增大有不同程度延长。本发明实施例中用20000和40000道尔顿的PEG作为低、高分子量的代表具体阐述PEG-干扰素衍生物的制作纯化方法及药效、药代试验。 
在优选的实施例中，PEG化试剂是Nektar Therapeutics及北京键凯科技有限公式提供的mPEG-MAL[也写做PEG-MAL(20KD)]或mPEG2-MAL[也写做PEG-MAL(40KD)]，文中mPEG-MAL和mPEG2-MAL有时也一般性的简写为PEG-MAL或PEG。 
本发明中MIFN、IFN-Con 1、IFN α-2a及IFN α-2b四种α干扰素的工程菌由北京三元基因工程有限公司提供。相应的工程菌名称分别为BL21(DE3)/pET23b-MIFN、BL21(DE3)/pET23b-IFN-Con1、BL21(DE3)/pET23b-IFN α-2a、BL21(DE3)/pET23b-IFN α-2b。 
实施例1A MIFNCys86的基因构建和扩增 
采用PCR体外定点突变技术(PCR-SDM)，以重叠延伸的手段进行定点突变。定点突变技术已经比较成熟，程序比较固定。可以根据具体试验调整的是引物的位置长度和PCR的反应条件，在实际操作中可以有多种组合，都可以达到定点突变的目的，均涵盖在本发明的保护范围之内。本实施例所列为优选方案(同样原因，实施例1B～1D所列也为优选方案)。 
设计两对引物，上游引物P1为T7promoterprimer(taatacgactcactataggg)，P3序列为ggaaaaattctgcaccgaactgt；下游 引物P2为T7terminator primer(gctagttattgctcagcgg)，P4序列为acagttcggtgcagaatttttcc。突变位点包含在P3和P4之中。 
提取MIFN的质粒作为模板，首轮PCR包括两个反应体系：反应体系1引物为P1、P4，扩增突变位点及其上游的DNA序列；反应体系2引物为P2、P3，扩增突变位点及其下游的DNA序列。反应条件为94℃4min、94℃1min，然后55℃2min、72℃2min共30个循环。第二轮PCR为重叠延伸PCR，以首轮PCR的产物为模板，以P1、P2为引物进行PCR扩增。反应条件为94℃4min、94℃1min，然后56℃2min、72℃2min共30个循环。图1表示两轮PCR产物的琼脂糖电泳图谱。 
第二轮PCR产物经琼脂糖电泳分析，选择720bp左右的DNA片段，用Nde I/EcoR I双酶切，电泳回收500bp左右的目的DNA片段备用。 
实施例1B IFN-Con 1Cys86的基因构建和扩增 
设计两对引物，上游引物P1为T7promoterprimer(taatacgactcactataggg)，P3序列为ggataaattctgcaccgaactgt；下游引物P2为T7terminator primer(gctagttattgctcagcgg)，P4序列为acagttcggtgcagaatttatcc。突变位点包含在P3和P4之中。 
PCR反应程序同实施例1A，不同之处是本实施例中首轮PCR反应模板为IFN-Con 1的质粒。第二轮PCR产物经琼脂糖电泳分析，选择720bp左右的DNA片段，用Nde I/EcoR I双酶切，电泳回收500bp左右的目的DNA片段备用。 
实施例1C IFN α-2aCys85的基因构建和扩增 
引物设计同实施例1B，PCR反应程序同实施例1A，不同之处是本实施例中首轮PCR反应模板为IFN α-2a的质粒。第二轮PCR产物经琼脂糖电泳分析，选择720bp左右的DNA片段，用Nde I/EcoR I双酶切，电泳回收500bp左右的目的DNA片段备用。 
实施例1D IFN α-2bCys85的基因构建和扩增 
引物设计同实施例1B，PCR反应程序同实施例1A，不同之处是本实施例中首轮PCR反应模板为IFN α-2b的质粒。第二轮PCR产物经琼脂糖电泳分析，选择720bp左右的DNA片段，用Nde I/EcoR I双酶切，电泳回收500bp左右的目的DNA片段备用。 
实施例2A MIFNCys86重组质粒的构建、转化和鉴定 
在重组质粒的构建和转化中，内切酶往往可以有多种选择，连接反应的条件也可以有所变化，都可以完成重组质粒的构建；本实施例中宿主细胞选择了实验室常用的JM109和DH5α，并不排斥用其他宿主进行转化。本着科学、方便和快捷的原则，本实施例所列重组质粒的构建、转化和鉴定方案为优选方案(同样原因，实施例2B～2D所列也为优选方案)。 
将pET-23b质粒载体用Nde I/EcoR I双酶切，经琼脂糖电泳回收并和实施例1A中最后回收的目的DNA片段连接。连接反应条件为：2×Rapid buffer 4～5μl、T4DNA Ligase 1μl、目的片段1～2μl、载体3μl，4℃过夜连接。 
制备JM109或DH5α感受态细胞，转化上述连接产物，涂布氨苄平板，37℃过夜培养。 
挑取单菌落作为模板，用本发明实施例1A中设计的引物P1、P2进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖电泳(电泳图谱如图2所示)，阳性克隆应在720bp左右出现特异条带。取阳性克隆小量培养，提取质粒用Nde I/EcoR I双酶切，分别在3kb左右和500bp左右出现特异的条带(琼脂糖电泳图谱如图3所示)，与预计情况相符，初步说明重组质粒构建成功。为了进一步确认其序列，以T7通用引物通过ABI377测序仪进行全自动序列测定，结果表明所获得的序列与目标序列相一致。 
实施例2B IFN-Con 1Cys86重组质粒的构建、转化和鉴定 
本实施例中连接的基因片段为实施例1B回收的目的基因片段。连接、转化及鉴定操作中用到的技术和方法与实施例2A完全相同。Nde I/EcoR I酶切鉴定电泳图谱如图3所示。为确认序列，同样以T7通用引物通过ABI377测序仪进行全自动序列测定，结果表明所获得的序列与目标序列相一致。 
实施例2C IFN α-2aCys85重组质粒的构建、转化和鉴定 
本实施例中连接的基因片段为实施例1C回收的目的基因片段。连接、转化及鉴定操作中用到的技术和方法与实施例2A完全相同。Nde I/EcoR I酶切鉴定电泳图谱如图3所示。为确认序列，同样以T7通用引物通过ABI377测序仪进行全自动序列测定，结果表明所获得的序列与目标序列相一致。 
实施例2D IFN α-2bCys85重组质粒的构建、转化和鉴定 
本实施例中连接的基因片段为实施例1D回收的目的基因片段。连接、转化及鉴定操作中用到的技术和方法与实施例2A完全相同。Nde I/EcoR I酶切鉴定电泳图谱如图3所示。为确认序列，同样以T7通用引物通过ABI377测序仪进行全自动序列测定，结果表明所获得的序列与目标序列相一致。 
实施例3A MIFNCys86的表达和纯化 
将实施例2A中得到的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)或其他适宜宿主，诱导表达。以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主时表达的MIFNCys86约占菌体总蛋白的30～50％，主要以包涵体形式存在。 
粗纯：将发酵收集的菌体以TE溶解，超声破菌后收集包涵体，然后用6～8mol/L的Gu·HCl或尿素溶解，室温搅拌或4℃放置过夜，再用浓度为0.05～0.2mol/L、pH 8.0～10.5的硼酸复性，复性液置4℃过夜。4℃离心取上清，即为粗纯的MIFNCys86。 
精纯：依次采用了疏水层析、DEAE阴离子交换层析和S-100凝胶排阻层析三步纯化工艺。具体步骤如下：将复性液稀释成含10％～30％(NH4)2SO4的溶液上样到Phenyl Sepharose层析柱，用两个柱体积的10％～30％(NH4)2SO4冲洗，然后用15％～35％乙二醇进行洗脱，收集洗脱峰组分用A液(10～80mmol/L Tris-HCl pH7.5～10.5)充分透析；将透析后的洗脱液上样到用A液充分平衡的DEAESepharose FF层析柱，然后用B液(含0.2～0.4mol/L NaCl的A液)进行洗脱，收集洗脱峰组分；将DEAE Sepharose FF离子交换层析的洗脱峰组分上样到用C液(20～40mmol/L PB+20～40mmol/LNaCl Ph6.5～7.5)充分平衡好的Sephacryl S-100层析柱，用C液冲洗，收集洗脱峰组分。经以上纯化流程后，最后得到的MIFNCys86纯度在95％以上(SDS-PAGE图谱如图4所示)。 
实施例3B IFN-Con 1Cys86的表达和纯化 
将实施例2B中得到的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)或其他适宜宿主，诱导表达。以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主时表达的IFN-Con 1Cys86约占菌体总蛋白的30～50％，主要以包涵体形式存在。 
本实施例纯化方法和步骤与实施例3A完全相同。最后得到的IFN-Con 1Cys86纯度在95％以上(SDS-PAGE图谱如图4所示)。实施例3C IFN α-2aCys85的表达和纯化 
将实施例2C中得到的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)或其他适宜宿主，诱导表达。以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主时表达的IFN α-2aCys85约占菌体总蛋白的30～50％，主要以包涵体形式存在。 
粗纯：本实施例所用到的粗纯方法与实施例3A相同。 
精纯：依次采用了DEAE阴离子交换层析、单抗亲和层析和S-100凝胶排阻层析三步纯化工艺。具体方法：将复性液以30mmol/LTris-HCl(pH8.0)稀释10倍上样到DEAE Sepharose FF离子交换层析 柱，用含0.3mol/L NaCl的30mmol/L Tris-HCl(pH7.0)溶液洗脱，收集洗脱峰；将上一步洗脱样品经PBS(pH7.0)3倍稀释，上样到IFNα-2a单抗层析柱，以含100mmol/L NaCl的0.3mol/L Gly溶液(pH2.5)洗脱，收集洗脱峰；再将上一步洗脱样品上样到SephacrylS-100层析柱，以PBS(pH7.0)洗脱。最后得到的IFN α-2aCys85纯度在95％以上(SDS-PAGE图谱如图4所示)。 
实施例3D IFN α-2bCys85的表达和纯化 
将实施例2D中得到的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)或其他适宜宿主，诱导表达。以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主时表达的IFN α-2bCys85约占菌体总蛋白的30～50％，主要以包涵体形式存在。 
粗纯：本实施例所用到的粗纯方法与实施例3A相同。 
精纯：依次采用了DEAE阴离子交换层析、单抗亲和层析和S-100凝胶排阻层析三步纯化工艺。具体方法：将复性液以30mmol/LTris-HCl(pH8.0)稀释10倍上样到DEAE Sepharose FF离子交换层析柱，用含0.3mol/L NaCl的30mmol/L Tris-HCl(pH7.0)溶液洗脱，收集洗脱峰；将上一步洗脱样品经PBS(pH7.0)3倍稀释，上样到IFNα-2b单抗层析柱，以含100mmol/L NaCl的0.3mol/L Gly溶液(pH2.5)洗脱，收集洗脱峰；再将上一步洗脱样品上样到SephacrylS-100层析柱，以PBS(pH7.0)洗脱。最后得到的IFN α-2bCys85纯度在95％以上(SDS-PAGE图谱如图4所示)。 
实施例4MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFN α-2aCys85及IFN α-2bCys85的PEG偶联 
本发明四种干扰素α突变体可以和各种分子量的PEG偶联，在优选实施例中，PEG有两种mPEG-MAL和mPEG2-MAL，平均分子量分别约为20KD、40KD。 
1)MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFN α-2aCys85及IFN α-2bCys85的浓 缩 
以上四种干扰素α突变体可以分别用DEAE Sepharose FF层析柱进行浓缩。具体方法如下：将实施例3A～3D其中之一纯化的蛋白样品以10～80mmol/L Tris-HCl pH7.5～8.5溶液稀释2倍或以上，上样到DEAE层析柱，然后用20mmol/L PB缓冲液(pH 7.6)+300mmol/L NaCl的洗脱得到目的蛋白的浓缩液。 
2)MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFN α-2aCys85及IFN α-2bCys85与mPEG-MAL的偶联 
MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFN α-2aCys85及IFN α-2bCys85与mPEG(20KD)-MAL偶联反应，其单PEG衍生物分别写做：mPEG(20KD)-MIFNCys86、mPEG(20KD)-IFN-Con  1Cys86、mPEG(20KD)-IFN α-2aCys85及mPEG(20KD)-IFN α-2bCys85。 
MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFN α-2aCys85及IFN α-2bCys85与mPEG(40KD)-MAL偶联反应，其单PEG衍生物分别写做：mPEG(40KD)-MIFNCys86、mPEG(40KD)-IFN-Con  1Cys86、mPEG(40KD)-IFN α-2aCys85及mPEG(40KD)-IFN α-2bCys85。 
偶联反应步骤具体如下： 
取本实施例步骤1中适量体积的浓缩液，调整蛋白浓度到8～12mg/ml，加入摩尔比为1∶1的PEG粉末，轻轻摇动使粉末溶解后于4℃反应过夜，即反应时间应超过10小时。SDS-PAGE检测反应的偶联程度(图5-6所示)。 
实施例5干扰素α突变体衍生物的纯化 
采用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析对修饰产物进行纯化，具体条件如下：采用25mmol pH8.0Tris缓冲体系将反应液稀释20～30倍后，以流速为3～4ml/min上样于平衡过的DEAE柱，待基线平衡后，用含NaCl浓度为80mM的25mM pH8.0Tris洗脱液洗脱得到目的蛋白的洗脱峰。最后得到的重组蛋白纯度都在95％以上 (SDS-PAGE图谱如图7-8所示)。 
实施例6通过WISH-VSV系统测定4种α干扰素、突变体及突变体聚乙二醇衍生物的体外抗病毒活性 
采用细胞病变抑制法通过WISH-VSV系统测定干扰素的体外抗病毒活性，是本技术领域公知的方法，具体参照2005版《中华人民共和国药典》三部附录X C“干扰素的生物活性测定”。 
本实施例测定了16种干扰素(或衍生物)的体外抗病毒活性，具体包括： 
4种α干扰素：MIFN、IFN-Con 1、IFN α-2a和IFN α-2b； 
4种α干扰素的突变体：MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFN α-2aCys85及IFN α-2bCys85(本发明实施例3A～3D制备)； 
还有8种聚乙二醇衍生物：mPEG(20KD)-MIFNCys86、mPEG(20KD)-IFN-Con 1Cys86、mPEG(20KD)-IFN  α-2aCys85、mPEG(20KD)-IFNα-2bCys85、mPEG(40KD)-MIFNCys86、mPEG(40KD)-IFN-Con  1Cys86、mPEG(40KD)-IFN  α-2aCys85及mPEG(40KD)-IFN α-2bCys85(本发明实施例5制备)。 
其体外抗病毒活性测定结果见下述表1～4。 
表1：MIFN、MIFNCys86、mPEG(20KD)-MIFNCys86及mPEG(40KD)-MIFNCys86的体外抗病毒活性 
名称                    比活性(IU/mg)      活性保留(％) 
MIFN                    5.57±0.38×108    - 
MIFNCys86               5.68±0.29×108    100 
mPEG(20KD)-MIFNCys86    5.84±0.35×106    1.03 
mPEG(40KD)-MIFNCys86    4.12±0.31×106    0.73 
表2：IFN-Con 1、IFN-Con 1Cys86、mPEG(20KD)-IFN-Con 1Cys86及mPEG(40KD)-IFN-Con 1Cys86的体外抗病毒活性 
名称        比活性(IU/mg)     活性保留(％) 
IFN-Con 1    5.18±0.24×108  - 
IFN-Con 1Cys86            5.13±0.30×108    100 
mPEG(20KD)-IFN-Con 1Cys86 5.24±0.27×106    1.02 
mPEG(40KD)-IFN-Con 1Cys86 4.05±0.25×106    0.79 
表3：IFNα-2a、IFNα-2aCys85、mPEG(20KD)-IFN α-2aCys85及mPEG(40KD)-IFNα-2aCys85的体外抗病毒活性 
名称                      比活性(IU/mg)      活性保留(％) 
IFN α-2a                 1.09±0.20×108    - 
IFN α-2aCys85            1.06±0.23×108    100 
mPEG(20KD)-IFN α-2aCys85 1.79±0.30×106    1.69 
mPEG(40KD)-IFN α-2aCys85 1.28±0.21×106    1.21 
表4：IFN α-2b、IFN α-2bCys85、mPEG(20KD)-IFN α-2bCys85及mPEG(40KD)-IFN α-2bCys85的体外抗病毒活性 
名称                      比活性(IU/mg)      活性保留(％) 
IFN α-2b                 1.10±0.20×108    - 
IFN α-2bCys85            1.12±0.27×108    100 
mPEG(20KD)-IFN α-2bCys85 1.64±0.33×106    1.46 
mPEG(40KD)-IFN α-2bCys85 1.20±0.26×106    1.07 
实施例7大鼠药代动力学研究 
通过本实施例表5所示的药代动力学研究方案测定了12种干扰素(或衍生物)的体外抗病毒活性，具体包括： 
4种α干扰素的突变体：MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFN α-2aCys85及IFNα-2bCys85(本发明实施例3A～3D制备)； 
8种聚乙二醇衍生物：mPEG(20KD)-MIFNCys86、mPEG(20KD)-IFN-Con  1Cys86、mPEG(20KD)-IFN  α-2aCys85、mPEG(20KD)-IFN    α-2bCys85、mPEG(40KD)-MIFNCys86、mPEG(40KD)-IFN-Con  1Cys86、mPEG(40KD)-IFN  α-2aCys85及mPEG(40KD)-IFN α-2bCys85(本发明实施例5制备)。 
表5：药代动力学研究方案： 
在上述试验方案中，从大鼠眼底收集血样，然后离心分离收集血清，用CPE法(WISH/VSV系统)检测血清样品中干扰素含量。 
表6：MIFNCys86及其PEG衍生物的药代动力学参数表 
Figure GPA00000230111500162
经3P87软件拟合发现MIFNCys86及其PEG衍生物在SD大鼠体内的代谢规律符合一级吸收的一房室模型。PEG化可显著改善MIFNCys86的药代动力学性质，与MIFNCys86相比，mPEG-MIFNCys86的吸收半衰期、达峰时间、消除半衰期显著延长；药时曲线下面积显著增加；清除率显著降低。可见，PEG化可以延长MIFNCys86的体内平均存留时间，降低清除率。 
在IFN-Con 1Cys86及其PEG衍生物、IFN α-2aCys85及其PEG衍生物、IFN α-2bCys85及其PEG衍生物的药代动力学试验中也有同样发现， 即：与修饰前相比，PEG化的干扰素的吸收半衰期、达峰时间、消除半衰期显著延长；药时曲线下面积显著增加；清除率显著降低。 
由此证明，PEG化可以延长干扰素的体内平均存留时间，降低清除率。 
至此，已经对本发明进行了较为充分的描述。优选的实施例只能阐述而不限制本发明，对于本领域的技术人员来说，实现本发明的方法和手段可以变化和改进，均应涵盖在本发明的保护范围之内。 
工业实用性 
动物实验表明本发明干扰素突变体的聚乙二醇衍生物可以延长干扰素的体内平均存留时间，降低清除率，并且具有较高的抗病毒活性，因而，可以按照本发明所述的方法或本领域技术人员所知的方法，通过制备本发明所述干扰素突变体，并进一步与聚乙二醇共价结合，并开发成药物，用于免疫调节紊乱如肿瘤疾病或传染病的预防和治疗。 
附序列表： 
后面附氨基酸和核苷酸的序列表，其中IFN-Con 1、IFN α-2a和IFN α-2b的核苷酸序列为公知序列，在本发明的具体实施例中只是把相应位点的密码子突变成tgc，因此本发明未附IFN-Con 1、IFN α-2a和IFN α-2b的DNA序列。 
SEQ ID NO：1为MIFNCys86的氨基酸序列； 
SEQ ID NO：2为IFN-Con 1Cys86的氨基酸序列； 
SEQ ID NO：3为IFN α-2aCys85的氨基酸序列； 
SEQ ID NO：4为IFN α-2bCys85的氨基酸序列； 
SEQ ID NO：5为MIFNCys86的DNA序列； 
SEQ ID NO：6～9分别为引物P1～P4的核苷酸序列。 

Claims (9)

1.干扰素α突变体，其序列为序列表1～4任一所述的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述干扰素α突变体的核苷酸序列。
3.权利要求1所述干扰素α突变体的聚乙二醇衍生物。
4.根据权利要求3所述的干扰素α突变体的聚乙二醇衍生物，其特征在于，聚乙二醇修饰于干扰素α突变体的第85或86位的Cys位点。
5.根据权利要求3或4所述的干扰素α突变体的聚乙二醇衍生物，其是由聚乙二醇巯基修饰剂与干扰素α突变体的第85或86位的Cys反应获得，所述聚乙二醇巯基修饰剂选自马来酰亚胺-PEG、乙烯砜-PEG、碘代乙酰胺-PEG及正吡啶基二硫化物-PEG。
6.根据权利要求3或4所述的干扰素α突变体的聚乙二醇衍生物，其特征在于聚乙二醇的平均分子量为5000道尔顿～60000道尔顿。
7.一种制备权利要求3所述的干扰素α突变体的聚乙二醇衍生物的方法，包括以下步骤：
a)制备浓缩的干扰素α突变体溶液；
b)聚乙二醇与步骤(a)所述干扰素α突变体偶联反应；
c)干扰素α突变体的聚乙二醇衍生物的纯化提取。
8.药物组合物，其含有根据权利要求3～6任一项所述的干扰素α突变体的聚乙二醇衍生物。
9.权利要求8所述的药物组合物在制备治疗或预防病毒性感染药物中的应用。
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CL2008002399A1 (es) 2007-08-16 2009-01-02 Pharmaessentia Corp Conjugado sustancialmente puro que posee una porcion polimerica, una porcion proteica (interferon alfa 2b) y un ligante alifatico de 1 a 10 atomos de carbono, util en el tratamiento de las hepatitis b o c.
CN101525381B (zh) * 2008-03-04 2012-04-18 北京百川飞虹生物科技有限公司 一种重组复合干扰素及其表达载体的构建和表达
CN101768205A (zh) * 2010-03-01 2010-07-07 安徽安科生物工程（集团）股份有限公司 一种聚乙二醇修饰干扰素反应液中回收干扰素的方法
CN101921329B (zh) * 2010-04-19 2013-01-23 北京三元基因工程有限公司 α干扰素突变体及其聚乙二醇衍生物
CN101921330B (zh) * 2010-06-02 2013-07-17 北京三元基因工程有限公司 重组人干扰素α1b突变体及其制备方法
CN102507824B (zh) * 2011-11-01 2013-10-09 北京三元基因工程有限公司 聚乙二醇修饰蛋白质的修饰位点分析方法
CN102584980B (zh) * 2012-02-23 2013-11-20 北京三元基因工程有限公司 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物
CN103467592B (zh) * 2012-02-23 2014-11-19 北京三元基因工程有限公司 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物
CN103113465B (zh) * 2012-02-23 2014-04-02 北京三元基因工程有限公司 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物
CN102532300B (zh) * 2012-02-23 2013-07-17 北京三元基因工程有限公司 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物
CN102532299B (zh) * 2012-02-23 2013-07-17 北京三元基因工程有限公司 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物
CN103145826B (zh) * 2012-02-23 2014-05-28 北京三元基因工程有限公司 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物
CN103554246B (zh) * 2012-02-23 2015-04-01 北京三元基因工程有限公司 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物
CN102558337B (zh) * 2012-02-23 2013-08-28 北京三元基因工程有限公司 干扰素α突变体及其聚乙二醇衍生物
SI3215193T1 (sl) 2014-11-06 2024-02-29 Pharmaessentia Corporation Dozirna shema za pegiliran interferon
CN107556376B (zh) * 2017-09-08 2018-09-28 上海华新生物高技术有限公司 一种干扰素α-2b突变体及其制备方法和应用
KR102663626B1 (ko) 2023-12-29 2024-05-08 엠함안 주식회사 로터리 피더

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020067105A (ko) * 2001-02-15 2002-08-22 선바이오(주) 변형된 인터페론-알파 2ａ 및 2ｂ, 그리고 이들과 ＰＥＧ유도체와의 배합체
CN1511849A (zh) * 2002-12-30 2004-07-14 北京三元基因工程有限公司 新型α干扰素突变体及其制备方法
CN1738640A (zh) * 2002-11-18 2006-02-22 马克西根公司 干扰素－α多肽和偶联物
CN1754889A (zh) * 2004-06-30 2006-04-05 深圳科兴生物工程有限公司 PEG化干扰素α－1b

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1144613B2 (en) 1999-01-14 2020-05-06 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
AU2003297285A1 (en) * 2002-11-18 2004-06-15 Maxygen, Inc. Interferon-alpha polypeptides and conjugates
US7314613B2 (en) * 2002-11-18 2008-01-01 Maxygen, Inc. Interferon-alpha polypeptides and conjugates
JP2008509889A (ja) * 2004-06-30 2008-04-03 イージェン コーポレーション ペグ化インターフェロンα−１ｂ

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020067105A (ko) * 2001-02-15 2002-08-22 선바이오(주) 변형된 인터페론-알파 2ａ 및 2ｂ, 그리고 이들과 ＰＥＧ유도체와의 배합체
CN1738640A (zh) * 2002-11-18 2006-02-22 马克西根公司 干扰素－α多肽和偶联物
CN1511849A (zh) * 2002-12-30 2004-07-14 北京三元基因工程有限公司 新型α干扰素突变体及其制备方法
CN1754889A (zh) * 2004-06-30 2006-04-05 深圳科兴生物工程有限公司 PEG化干扰素α－1b

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