具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解,这些实施例仅用于说明本发明,而不能限制本发明的保护范围。
除非特殊定义,本文描述所用的术语是在有关技术领域中公知的术语。标准的化学符号及缩写符号可以与其全名互换使用。例如:“PEG”和“聚乙二醇”具有相同的含义;“干扰素α”、“IFN-α”及“α干扰素”含义也相同。
除非特殊指明,本文所用到但未明确阐述或简单阐述的技术和方法是指本技术领域通常使用的技术和方法,可以一般的按照本领域公知的技术和方法进行。试剂盒的使用是根据制造商或供应商提供的说明书进行。
本发明MIFN、IFN-Con 1、IFN α-2a及IFN α-2b四种蛋白的类似物可以通过氨基酸功能等效分子的取代、添加或缺失来获得,如在本技术领域公知,用性质类似的一个或多个氨基酸残基取代原序列内相应的氨基酸残基改变原蛋白质序列,形成沉默改变。
本发明中聚乙二醇衍生物的聚乙二醇部分,如本领域技术人员公知,可以具有直链或分支结构。其是一种巯基反应PEG化试剂,能够和半胱氨酸残基的巯基发生反应,包括来酰亚胺-PEG、乙烯砜-PEG、碘代乙酰胺-PEG及正吡啶基二硫化物-PEG等,其中优选马来酰亚胺-PEG。本发明尝试用分子量约5000、10000、12000、20000、30000和40000道尔顿的PEG对四种α干扰素突变体进行修饰,均可以获得PEG-干扰素的衍生物。资料显示:PEG化蛋白的半衰期随着PEG分子量的增大有不同程度延长。本发明实施例中用20000和40000道尔顿的PEG作为低、高分子量的代表具体阐述PEG-干扰素衍生物的制作纯化方法及药效、药代试验。
在优选的实施例中,PEG化试剂是Nektar Therapeutics及北京键凯科技有限公式提供的mPEG-MAL[也写做PEG-MAL(20KD)]或mPEG2-MAL[也写做PEG-MAL(40KD)],文中mPEG-MAL和mPEG2-MAL有时也一般性的简写为PEG-MAL或PEG。
本发明中MIFN、IFN-Con 1、IFN α-2a及IFN α-2b四种α干扰素的工程菌由北京三元基因工程有限公司提供。相应的工程菌名称分别为BL21(DE3)/pET23b-MIFN、BL21(DE3)/pET23b-IFN-Con1、BL21(DE3)/pET23b-IFN α-2a、BL21(DE3)/pET23b-IFN α-2b。
实施例1A MIFNCys86的基因构建和扩增
采用PCR体外定点突变技术(PCR-SDM),以重叠延伸的手段进行定点突变。定点突变技术已经比较成熟,程序比较固定。可以根据具体试验调整的是引物的位置长度和PCR的反应条件,在实际操作中可以有多种组合,都可以达到定点突变的目的,均涵盖在本发明的保护范围之内。本实施例所列为优选方案(同样原因,实施例1B~1D所列也为优选方案)。
设计两对引物,上游引物P1为T7promoterprimer(taatacgactcactataggg),P3序列为ggaaaaattctgcaccgaactgt;下游 引物P2为T7terminator primer(gctagttattgctcagcgg),P4序列为acagttcggtgcagaatttttcc。突变位点包含在P3和P4之中。
提取MIFN的质粒作为模板,首轮PCR包括两个反应体系:反应体系1引物为P1、P4,扩增突变位点及其上游的DNA序列;反应体系2引物为P2、P3,扩增突变位点及其下游的DNA序列。反应条件为94℃4min、94℃1min,然后55℃2min、72℃2min共30个循环。第二轮PCR为重叠延伸PCR,以首轮PCR的产物为模板,以P1、P2为引物进行PCR扩增。反应条件为94℃4min、94℃1min,然后56℃2min、72℃2min共30个循环。图1表示两轮PCR产物的琼脂糖电泳图谱。
第二轮PCR产物经琼脂糖电泳分析,选择720bp左右的DNA片段,用Nde I/EcoR I双酶切,电泳回收500bp左右的目的DNA片段备用。
实施例1B IFN-Con 1Cys86的基因构建和扩增
设计两对引物,上游引物P1为T7promoterprimer(taatacgactcactataggg),P3序列为ggataaattctgcaccgaactgt;下游引物P2为T7terminator primer(gctagttattgctcagcgg),P4序列为acagttcggtgcagaatttatcc。突变位点包含在P3和P4之中。
PCR反应程序同实施例1A,不同之处是本实施例中首轮PCR反应模板为IFN-Con 1的质粒。第二轮PCR产物经琼脂糖电泳分析,选择720bp左右的DNA片段,用Nde I/EcoR I双酶切,电泳回收500bp左右的目的DNA片段备用。
实施例1C IFN α-2aCys85的基因构建和扩增
引物设计同实施例1B,PCR反应程序同实施例1A,不同之处是本实施例中首轮PCR反应模板为IFN α-2a的质粒。第二轮PCR产物经琼脂糖电泳分析,选择720bp左右的DNA片段,用Nde I/EcoR I双酶切,电泳回收500bp左右的目的DNA片段备用。
实施例1D IFN α-2bCys85的基因构建和扩增
引物设计同实施例1B,PCR反应程序同实施例1A,不同之处是本实施例中首轮PCR反应模板为IFN α-2b的质粒。第二轮PCR产物经琼脂糖电泳分析,选择720bp左右的DNA片段,用Nde I/EcoR I双酶切,电泳回收500bp左右的目的DNA片段备用。
实施例2A MIFNCys86重组质粒的构建、转化和鉴定
在重组质粒的构建和转化中,内切酶往往可以有多种选择,连接反应的条件也可以有所变化,都可以完成重组质粒的构建;本实施例中宿主细胞选择了实验室常用的JM109和DH5α,并不排斥用其他宿主进行转化。本着科学、方便和快捷的原则,本实施例所列重组质粒的构建、转化和鉴定方案为优选方案(同样原因,实施例2B~2D所列也为优选方案)。
将pET-23b质粒载体用Nde I/EcoR I双酶切,经琼脂糖电泳回收并和实施例1A中最后回收的目的DNA片段连接。连接反应条件为:2×Rapid buffer 4~5μl、T4DNA Ligase 1μl、目的片段1~2μl、载体3μl,4℃过夜连接。
制备JM109或DH5α感受态细胞,转化上述连接产物,涂布氨苄平板,37℃过夜培养。
挑取单菌落作为模板,用本发明实施例1A中设计的引物P1、P2进行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖电泳(电泳图谱如图2所示),阳性克隆应在720bp左右出现特异条带。取阳性克隆小量培养,提取质粒用Nde I/EcoR I双酶切,分别在3kb左右和500bp左右出现特异的条带(琼脂糖电泳图谱如图3所示),与预计情况相符,初步说明重组质粒构建成功。为了进一步确认其序列,以T7通用引物通过ABI377测序仪进行全自动序列测定,结果表明所获得的序列与目标序列相一致。
实施例2B IFN-Con 1Cys86重组质粒的构建、转化和鉴定
本实施例中连接的基因片段为实施例1B回收的目的基因片段。连接、转化及鉴定操作中用到的技术和方法与实施例2A完全相同。Nde I/EcoR I酶切鉴定电泳图谱如图3所示。为确认序列,同样以T7通用引物通过ABI377测序仪进行全自动序列测定,结果表明所获得的序列与目标序列相一致。
实施例2C IFN α-2aCys85重组质粒的构建、转化和鉴定
本实施例中连接的基因片段为实施例1C回收的目的基因片段。连接、转化及鉴定操作中用到的技术和方法与实施例2A完全相同。Nde I/EcoR I酶切鉴定电泳图谱如图3所示。为确认序列,同样以T7通用引物通过ABI377测序仪进行全自动序列测定,结果表明所获得的序列与目标序列相一致。
实施例2D IFN α-2bCys85重组质粒的构建、转化和鉴定
本实施例中连接的基因片段为实施例1D回收的目的基因片段。连接、转化及鉴定操作中用到的技术和方法与实施例2A完全相同。Nde I/EcoR I酶切鉴定电泳图谱如图3所示。为确认序列,同样以T7通用引物通过ABI377测序仪进行全自动序列测定,结果表明所获得的序列与目标序列相一致。
实施例3A MIFNCys86的表达和纯化
将实施例2A中得到的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)或其他适宜宿主,诱导表达。以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主时表达的MIFNCys86约占菌体总蛋白的30~50%,主要以包涵体形式存在。
粗纯:将发酵收集的菌体以TE溶解,超声破菌后收集包涵体,然后用6~8mol/L的Gu·HCl或尿素溶解,室温搅拌或4℃放置过夜,再用浓度为0.05~0.2mol/L、pH 8.0~10.5的硼酸复性,复性液置4℃过夜。4℃离心取上清,即为粗纯的MIFNCys86。
精纯:依次采用了疏水层析、DEAE阴离子交换层析和S-100凝胶排阻层析三步纯化工艺。具体步骤如下:将复性液稀释成含10%~30%(NH4)2SO4的溶液上样到Phenyl Sepharose层析柱,用两个柱体积的10%~30%(NH4)2SO4冲洗,然后用15%~35%乙二醇进行洗脱,收集洗脱峰组分用A液(10~80mmol/L Tris-HCl pH7.5~10.5)充分透析;将透析后的洗脱液上样到用A液充分平衡的DEAESepharose FF层析柱,然后用B液(含0.2~0.4mol/L NaCl的A液)进行洗脱,收集洗脱峰组分;将DEAE Sepharose FF离子交换层析的洗脱峰组分上样到用C液(20~40mmol/L PB+20~40mmol/LNaCl Ph6.5~7.5)充分平衡好的Sephacryl S-100层析柱,用C液冲洗,收集洗脱峰组分。经以上纯化流程后,最后得到的MIFNCys86纯度在95%以上(SDS-PAGE图谱如图4所示)。
实施例3B IFN-Con 1Cys86的表达和纯化
将实施例2B中得到的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)或其他适宜宿主,诱导表达。以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主时表达的IFN-Con 1Cys86约占菌体总蛋白的30~50%,主要以包涵体形式存在。
本实施例纯化方法和步骤与实施例3A完全相同。最后得到的IFN-Con 1Cys86纯度在95%以上(SDS-PAGE图谱如图4所示)。实施例3C IFN α-2aCys85的表达和纯化
将实施例2C中得到的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)或其他适宜宿主,诱导表达。以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主时表达的IFN α-2aCys85约占菌体总蛋白的30~50%,主要以包涵体形式存在。
粗纯:本实施例所用到的粗纯方法与实施例3A相同。
精纯:依次采用了DEAE阴离子交换层析、单抗亲和层析和S-100凝胶排阻层析三步纯化工艺。具体方法:将复性液以30mmol/LTris-HCl(pH8.0)稀释10倍上样到DEAE Sepharose FF离子交换层析 柱,用含0.3mol/L NaCl的30mmol/L Tris-HCl(pH7.0)溶液洗脱,收集洗脱峰;将上一步洗脱样品经PBS(pH7.0)3倍稀释,上样到IFNα-2a单抗层析柱,以含100mmol/L NaCl的0.3mol/L Gly溶液(pH2.5)洗脱,收集洗脱峰;再将上一步洗脱样品上样到SephacrylS-100层析柱,以PBS(pH7.0)洗脱。最后得到的IFN α-2aCys85纯度在95%以上(SDS-PAGE图谱如图4所示)。
实施例3D IFN α-2bCys85的表达和纯化
将实施例2D中得到的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)或其他适宜宿主,诱导表达。以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主时表达的IFN α-2bCys85约占菌体总蛋白的30~50%,主要以包涵体形式存在。
粗纯:本实施例所用到的粗纯方法与实施例3A相同。
精纯:依次采用了DEAE阴离子交换层析、单抗亲和层析和S-100凝胶排阻层析三步纯化工艺。具体方法:将复性液以30mmol/LTris-HCl(pH8.0)稀释10倍上样到DEAE Sepharose FF离子交换层析柱,用含0.3mol/L NaCl的30mmol/L Tris-HCl(pH7.0)溶液洗脱,收集洗脱峰;将上一步洗脱样品经PBS(pH7.0)3倍稀释,上样到IFNα-2b单抗层析柱,以含100mmol/L NaCl的0.3mol/L Gly溶液(pH2.5)洗脱,收集洗脱峰;再将上一步洗脱样品上样到SephacrylS-100层析柱,以PBS(pH7.0)洗脱。最后得到的IFN α-2bCys85纯度在95%以上(SDS-PAGE图谱如图4所示)。
实施例4MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFN α-2aCys85及IFN α-2bCys85的PEG偶联
本发明四种干扰素α突变体可以和各种分子量的PEG偶联,在优选实施例中,PEG有两种mPEG-MAL和mPEG2-MAL,平均分子量分别约为20KD、40KD。
1)MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFN α-2aCys85及IFN α-2bCys85的浓 缩
以上四种干扰素α突变体可以分别用DEAE Sepharose FF层析柱进行浓缩。具体方法如下:将实施例3A~3D其中之一纯化的蛋白样品以10~80mmol/L Tris-HCl pH7.5~8.5溶液稀释2倍或以上,上样到DEAE层析柱,然后用20mmol/L PB缓冲液(pH 7.6)+300mmol/L NaCl的洗脱得到目的蛋白的浓缩液。
2)MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFN α-2aCys85及IFN α-2bCys85与mPEG-MAL的偶联
MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFN α-2aCys85及IFN α-2bCys85与mPEG(20KD)-MAL偶联反应,其单PEG衍生物分别写做:mPEG(20KD)-MIFNCys86、mPEG(20KD)-IFN-Con 1Cys86、mPEG(20KD)-IFN α-2aCys85及mPEG(20KD)-IFN α-2bCys85。
MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFN α-2aCys85及IFN α-2bCys85与mPEG(40KD)-MAL偶联反应,其单PEG衍生物分别写做:mPEG(40KD)-MIFNCys86、mPEG(40KD)-IFN-Con 1Cys86、mPEG(40KD)-IFN α-2aCys85及mPEG(40KD)-IFN α-2bCys85。
偶联反应步骤具体如下:
取本实施例步骤1中适量体积的浓缩液,调整蛋白浓度到8~12mg/ml,加入摩尔比为1∶1的PEG粉末,轻轻摇动使粉末溶解后于4℃反应过夜,即反应时间应超过10小时。SDS-PAGE检测反应的偶联程度(图5-6所示)。
实施例5干扰素α突变体衍生物的纯化
采用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析对修饰产物进行纯化,具体条件如下:采用25mmol pH8.0Tris缓冲体系将反应液稀释20~30倍后,以流速为3~4ml/min上样于平衡过的DEAE柱,待基线平衡后,用含NaCl浓度为80mM的25mM pH8.0Tris洗脱液洗脱得到目的蛋白的洗脱峰。最后得到的重组蛋白纯度都在95%以上 (SDS-PAGE图谱如图7-8所示)。
实施例6通过WISH-VSV系统测定4种α干扰素、突变体及突变体聚乙二醇衍生物的体外抗病毒活性
采用细胞病变抑制法通过WISH-VSV系统测定干扰素的体外抗病毒活性,是本技术领域公知的方法,具体参照2005版《中华人民共和国药典》三部附录X C“干扰素的生物活性测定”。
本实施例测定了16种干扰素(或衍生物)的体外抗病毒活性,具体包括:
4种α干扰素:MIFN、IFN-Con 1、IFN α-2a和IFN α-2b;
4种α干扰素的突变体:MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFN α-2aCys85及IFN α-2bCys85(本发明实施例3A~3D制备);
还有8种聚乙二醇衍生物:mPEG(20KD)-MIFNCys86、mPEG(20KD)-IFN-Con 1Cys86、mPEG(20KD)-IFN α-2aCys85、mPEG(20KD)-IFNα-2bCys85、mPEG(40KD)-MIFNCys86、mPEG(40KD)-IFN-Con 1Cys86、mPEG(40KD)-IFN α-2aCys85及mPEG(40KD)-IFN α-2bCys85(本发明实施例5制备)。
其体外抗病毒活性测定结果见下述表1~4。
表1:MIFN、MIFNCys86、mPEG(20KD)-MIFNCys86及mPEG(40KD)-MIFNCys86的体外抗病毒活性
名称 比活性(IU/mg) 活性保留(%)
MIFN 5.57±0.38×108 -
MIFNCys86 5.68±0.29×108 100
mPEG(20KD)-MIFNCys86 5.84±0.35×106 1.03
mPEG(40KD)-MIFNCys86 4.12±0.31×106 0.73
表2:IFN-Con 1、IFN-Con 1Cys86、mPEG(20KD)-IFN-Con 1Cys86及mPEG(40KD)-IFN-Con 1Cys86的体外抗病毒活性
名称 比活性(IU/mg) 活性保留(%)
IFN-Con 1 5.18±0.24×108 -
IFN-Con 1Cys86 5.13±0.30×108 100
mPEG(20KD)-IFN-Con 1Cys86 5.24±0.27×106 1.02
mPEG(40KD)-IFN-Con 1Cys86 4.05±0.25×106 0.79
表3:IFNα-2a、IFNα-2aCys85、mPEG(20KD)-IFN α-2aCys85及mPEG(40KD)-IFNα-2aCys85的体外抗病毒活性
名称 比活性(IU/mg) 活性保留(%)
IFN α-2a 1.09±0.20×108 -
IFN α-2aCys85 1.06±0.23×108 100
mPEG(20KD)-IFN α-2aCys85 1.79±0.30×106 1.69
mPEG(40KD)-IFN α-2aCys85 1.28±0.21×106 1.21
表4:IFN α-2b、IFN α-2bCys85、mPEG(20KD)-IFN α-2bCys85及mPEG(40KD)-IFN α-2bCys85的体外抗病毒活性
名称 比活性(IU/mg) 活性保留(%)
IFN α-2b 1.10±0.20×108 -
IFN α-2bCys85 1.12±0.27×108 100
mPEG(20KD)-IFN α-2bCys85 1.64±0.33×106 1.46
mPEG(40KD)-IFN α-2bCys85 1.20±0.26×106 1.07
实施例7大鼠药代动力学研究
通过本实施例表5所示的药代动力学研究方案测定了12种干扰素(或衍生物)的体外抗病毒活性,具体包括:
4种α干扰素的突变体:MIFNCys86、IFN-Con 1Cys86、IFN α-2aCys85及IFNα-2bCys85(本发明实施例3A~3D制备);
8种聚乙二醇衍生物:mPEG(20KD)-MIFNCys86、mPEG(20KD)-IFN-Con 1Cys86、mPEG(20KD)-IFN α-2aCys85、mPEG(20KD)-IFN α-2bCys85、mPEG(40KD)-MIFNCys86、mPEG(40KD)-IFN-Con 1Cys86、mPEG(40KD)-IFN α-2aCys85及mPEG(40KD)-IFN α-2bCys85(本发明实施例5制备)。
表5:药代动力学研究方案:
在上述试验方案中,从大鼠眼底收集血样,然后离心分离收集血清,用CPE法(WISH/VSV系统)检测血清样品中干扰素含量。
表6:MIFNCys86及其PEG衍生物的药代动力学参数表
经3P87软件拟合发现MIFNCys86及其PEG衍生物在SD大鼠体内的代谢规律符合一级吸收的一房室模型。PEG化可显著改善MIFNCys86的药代动力学性质,与MIFNCys86相比,mPEG-MIFNCys86的吸收半衰期、达峰时间、消除半衰期显著延长;药时曲线下面积显著增加;清除率显著降低。可见,PEG化可以延长MIFNCys86的体内平均存留时间,降低清除率。
在IFN-Con 1Cys86及其PEG衍生物、IFN α-2aCys85及其PEG衍生物、IFN α-2bCys85及其PEG衍生物的药代动力学试验中也有同样发现, 即:与修饰前相比,PEG化的干扰素的吸收半衰期、达峰时间、消除半衰期显著延长;药时曲线下面积显著增加;清除率显著降低。
由此证明,PEG化可以延长干扰素的体内平均存留时间,降低清除率。
至此,已经对本发明进行了较为充分的描述。优选的实施例只能阐述而不限制本发明,对于本领域的技术人员来说,实现本发明的方法和手段可以变化和改进,均应涵盖在本发明的保护范围之内。
工业实用性
动物实验表明本发明干扰素突变体的聚乙二醇衍生物可以延长干扰素的体内平均存留时间,降低清除率,并且具有较高的抗病毒活性,因而,可以按照本发明所述的方法或本领域技术人员所知的方法,通过制备本发明所述干扰素突变体,并进一步与聚乙二醇共价结合,并开发成药物,用于免疫调节紊乱如肿瘤疾病或传染病的预防和治疗。
附序列表:
后面附氨基酸和核苷酸的序列表,其中IFN-Con 1、IFN α-2a和IFN α-2b的核苷酸序列为公知序列,在本发明的具体实施例中只是把相应位点的密码子突变成tgc,因此本发明未附IFN-Con 1、IFN α-2a和IFN α-2b的DNA序列。
SEQ ID NO:1为MIFNCys86的氨基酸序列;
SEQ ID NO:2为IFN-Con 1Cys86的氨基酸序列;
SEQ ID NO:3为IFN α-2aCys85的氨基酸序列;
SEQ ID NO:4为IFN α-2bCys85的氨基酸序列;
SEQ ID NO:5为MIFNCys86的DNA序列;
SEQ ID NO:6~9分别为引物P1~P4的核苷酸序列。