PT2196475E - Interferão alfa-2a modificado por polietilenoglicol, seu processo de síntese e aplicação - Google Patents

Interferão alfa-2a modificado por polietilenoglicol, seu processo de síntese e aplicação Download PDF

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Qingjiang Xiao
Li Sun
Tiebing Wang
Fenghong Yin
Lu Zhuang
Min Liu
Bin Liu
Song Lin
Lifang Lei
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Description

DESCRIÇÃO
INTERFERÃO ALFA-2a MODIFICADO POR POLIETILENOGLICOL, SEU PROCESSO DE SÍNTESE E APLICAÇÃO
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a interferão cx-2a modificado por polietilenoglicol (PEG), ramificado em forma de Y, num único resíduo aminoácido e a preparação do mesmo, assim como o uso do IFN-a2a peguilado preparado num único resíduo aminoácido no campo farmacêutico.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Os interferões (IFNs) são uma família de proteínas de molécula pequenas ou glicoproteínas produzidas por células eucarióticas em resposta a uma infecção vírica e outros estímulos antigénicos, que demonstram um amplo espectro antiviral antiproliferativo e efeitos imunomodulatórios. Os IFNs têm sido extensamente aplicados no tratamento de diversos estados de saúde e doenças, tais como infecções víricas, por ex., hepatite B, hepatite C e VIH; distúrbios inflamatórios e doenças, por ex., esclerose múltipla, artrite, asma, fibrose cistica e doença pulmonar intersticial; e tumores por ex., mielomas, linfoma, cancro hepático, cancro do pulmão, leucemia de células pilosas, etc. (Kenji Oritani, Paul W Kincade, et al. Type I interferon and limitin: a comparison of structures, receptors, and functions. Cytokine and Growth Factor Reviews, 12, 337-348, 2001; Yu-Sen Wang, Stephen Youngster, et al. Structural and biological characterization of PEGylated recombinant interferon alpha-2b and its therapeutic implications. Advance Drug Delivery Reviews, 54, 547-570, 2002).
Os IFNs são classificados em quatro tipos de acordo com as suas diferenças em propriedades biológicas, imunológicas e químicas: 1/32 interferão-α,β, γ e ε. Ο interferão-α (IFN-a) é segregado por leucócitos. Os IFN-a humanos são codificados por uma familia multigene que consiste em aproximadamente 20 genes, as proteínas codificadas que compartilham até aproximadamente 90% da homologia de sequência de aminoácidos (Henco K., Brosius F. J. , et al . J. Mol. Biol ., 185, 227-260, 1985). 0 IFN-a2a humano é um dos subtipos da subfamília a2 da família IFN-a humana , e é uma proteína de cadeia única com várias actividades biológicas. A proteína de cadeia única consiste em 165 resíduos de aminoácidos, como mostrado na SEQ ID n° 1, na qual o aminoácido N-terminal é Cys com um grupo a-NH2 livre, e os resíduos nas posições 23, 31, 49, 70, 83, 112, 121, 131, 133, 134 e 164 da sequência de aminoácidos são Lys, cada um dos quais contém um grupo ε-ΝΗ2 livre.
Os IFNs são normalmente administrados parenteralmente em tratamentos clínicos. A semi-vida in vivo curta (2-4h) e a imunogenicidade forte dos IFNs resultam num intervalo de dosagem mais curto e uma frequência de dosagem mais alta. Como os anticorpos gerados diminuem significativamente a eficácia terapêutica, é difícil obter a eficácia clínica ideal. A tecnologia de modificação do polietilenoglicol (PEG), desenvolvida nos últimos anos, tem provido uma possível solução para os problemas acima. O PEG é um polímero orgânico, inerte, não tóxico e biodegradável, e é importante nos campos da biotecnologia e farmacêutica. A técnica de modificação de PEG é ligar o PEG a uma proteína activa através de uma ligação covalente. Depois da peguilação, as propriedades da proteína podem ser significativamente aperfeiçoadas, por ex., o prolongamento da semi-vida metabólica do medicamento, a redução da imunogenicidade, o aumento da segurança, a melhora da eficácia terapêutica, a diminuição da frequência de dosagem, o aumento de solubilidade do medicamento/solubilidade da água, o aumento da resistência contra a proteólise, a facilitação da libertação 2/32 controlada do medicamento. Para informações adicionais, deve ser consultado Inada et al. J. Bioact. and Compatible Polymers, 5, 343, 1990, Delgado et al. Criticai Reviews in Therapeutic
Drug Carrier Systems, 9, 249, 1992, Katre. Advanced Drug
Delivery Systems, 10, 91, 1993, e publicação de Patente americana UP 4179337. É descrito na Patente americana N°. 4179337, depois de ligar o PEG a uma enzima ou insulina, a imunogenicidade da proteína foi reduzida, enquanto simultaneamente as actividades da proteína foram também reduzidas. Isto foi também descoberto em G-CSF (Satake-Ishikawa et al. Cell Structure and Function, 17, 157-160, 1992), IL-2 (Katre et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84, 1487, 1987), TNF-cx (Tsutsumi et al. Jpn. J. Câncer Res., 85, 9, 1994), IL-6 (Inoue et al. J. Lab. Clin. Med., 124, 529, 1994) and CD4-lgG (Chamow et al. Bioconj. Chem., 5, 133, 1994).
Actualmente, têm sido aplicados clinicamente muitos tipos de proteínas peguiladas. Em 1990, a adenosina deaminase bovina peguilada (Adagen), produzida por ENZON Inc., foi aprovada pela FDA, e usada para tratar uma doença de imunodeficiência combinada grave (pegfamg013102LB, http://www.fda.gov). Em 1994, outra proteína modificada de PEG para tratar leucemia linfoblástica aguda, a asparaginase peguilada (pegaspargase,
Oncaspar), foi também comercializada nos Estados Unidos (10341ls5052lbl, http://www.fda.gov) . O interferão-a2b modificado por PEG (PEG IFN-cx2b, PEG-intron) , desenvolvido pela
Schering-Plough foi aprovado pela FDA para comercialização em 2000 e o interferão-α peguilado (PEG IFN-a2a, Pegasis) foi produzido por Hoffman-la Roche Ltd. Foi também aprovado para comercialização em 2002, ambos são usados para tratar a hepatite (103964s50371bl, pegsche011901LB, http://www.fda.gov).
Em 2002, o factor de estimulação de colónia por granulócito humano modificado por PEG, produzido pela Amgen Inc. (PEG- filgrastim, Neulasta) foi também aprovado pela FDA, que é usado para tratar cancro da mama metastático (pegfamg013102LB, 3/32 http://www.fda.gov). A FDA também aceitou o pedido para o antagonista de factor de crescimento humano peguilado desenvolvido pela Pharmacia. 0 fragmento de anticorpo TNF-a combinado por PEG da Celltech e o receptor PEG-TNF da Amgen são testados nos ensaios clínicos avançados. 0 primeiro conjugado de molécula orgânica de PEG, camptotecina peguilada, também entrou na fase II do ensaio clínico. Em 2004, o oligonucleótido modificado por PEG (Pegaptanib, Macugen™) foi aprovado pela FDA. 0 metabolismo in vivo do PEG no medicamento (ou o PEG em si) já foram claramente compreendidos, e o PEG provou ser um bom modificador seguro do medicamento, sem gualguer efeito secundário.
Geralmente, uma molécula PEG modifica uma proteína ao ligar-se ao grupo a-amino ou ε-amino N-terminal de um resíduo Lys na molécula proteica. Normalmente existem três tipos de PEG para modificação proteica: uma molécula de cadeia linear (EP 0593868), uma molécula ramificada em forma de U (EP 0809996) e uma molécula ramificada em forma de Y (CN1243779C) . Até agora, não existem indicações acerca da preparação de IFN-cx2a modificado por PEG ramificado em forma de Y e a separação de diferentes IFN-a2a com uma única modificação de molécula PEG em diferentes posições de aminoácidos. Foi relatado que a proteína modificada por PEG ramificada demonstrou uma melhor tolerância ao pH, termoestabilidade e resistência contra proteólise do que as proteínas modificadas por PEG de cadeia linear (Monfardini et al. Bioconjugate Chem., 6, 62, 1995).
Os PEGs que podem ser ligados a um medicamento proteico necessitam normalmente de serem derivatizados, de modo que um ou dois grupos terminais das extremidades de PEGs podem ser quimicamente activados para possuir um grupo apropriado funcional que demonstra actividade, e assim possa formar uma ligação covalente estável com, pelo menos um grupo funcional do medicamento a ser ligado. Por exemplo, os PEGs podem ser ligados a ε-ΝΗ2 de um resíduo Lys dentro da cadeia peptídica da 4/32 proteína, ou para oí-NH2 do resíduo aminoácido N-terminal da cadeia peptídica da proteína. Na peguilação de IFN-oí, descrita na patente europeia EP0809996, o PEG é ligado através de substituição nucleofílica a oí-NH2 do aminoácido N-terminal ou ε-NH2 de Lys no IFN-α. 0 PEG-NHS mencionado na patente acima é um PEG ramificado em forma de U derivado (PEG2-NHS), a fórmula molecular do mesmo é como abaixo:
em que Re R' são independentemente um grupo alquil de baixo peso molecular, n e n' são de 600 a 1500, e o peso molecular médio dos PEGs é de 26KD a 66KD. A fórmula molecular do IFN-oí modificado por PEG2-NHS é como abaixo:
ROCHjjCiyOCÍVBjV—o-c-MH
Ah*
Em que uma ou mais moléculas PEG2-NHS são ligadas a oí-NH2 do aminoácido N-terminal ou ε-ΝΗ2 de Lys em IFN-α, os produtos obtidos são uma mistura de IFN-oí não peguilado, IFNs-a peguilados num único resíduo aminoácido, e IFNs-α peguilados em resíduos de múltiplos aminoácidos. O IFN-α peguilado num único resíduo aminoácido pode ser isolado dos produtos obtidos através de meios de purificação apropriados. O IFN-oí tem um aminoácido N-terminal e mais do que um resíduo Lys, nomeadamente vários lugares reactivos para PEG2-NHS, assim o IFNs-oí peguilados isolados num único resíduo aminoácido são uma mistura dos isómeros dos IFNs-α peguilados em diferentes resíduos aminoácidos únicos. 5/32
Na patente europeia EP 0593868, o PEG de cadeia linear é utilizado para modificar o IFN, a fórmula molecular do produto modificado como abaixo:
O
A nh— - interferco- α em que R é um grupo alquil de baixo peso molecular; Ri, R2, R3 θ R4 são H ou grupos alquil de baixo peso molecular; m é de 1 até ao número de possíveis posições de modificação PEG em IFN; W é O ou NH; X é de 1 a 1000, Y e z são de 0 a 1000, x+y+z é de 3 a 1000 e pelo menos um de Ri, R2, R3 e R4 é um grupo alquil de baixo peso molecular. Yu-Sen Wang et al (Yu-Sen Wang et al, Advanced Drug Delivery Reviews, 54: 547-570, 2002. Yu-Sen Wang et al, Biochemistry, 39, 10634-10640, 2000.) reportaram a modificação de rIFN-a2b com monometoxi-PEG linear 12KD (Peg-Intron) e mostrado que os produtos analisados por HPLC-IE são uma mistura de mais que 14 isómeros modificados por PEG em diferentes resíduos aminoácidos únicos. A fórmula molecular do PEG linear usada por Yu-Sen Wang et al é mostrada abaixo:
D em que o peso molecular médio do PEG é 12KD.
RESUMO DA INVENÇÃO
Os derivados PEG usados na presente invenção são derivados de PEG ramificados em forma de Y, de ramificação inovadora, e as suas estruturas são diferentes daquelas dos PEGs ramificados em forma de U. A grande diferença entre estes dois tipos de PEGs é que: cadeias de PEG de duas ramificações dos derivados de PEG em forma de Y de acordo com a presente invenção são ligadas através do átomo N, enquanto as cadeias de PEG de duas ramificações dos derivados de PEG em forma de U em EP0809996 6/32 são ligadas através do átomo C. A composição molecular dos derivados de PEG em forma de Y, de acordo com a presente invenção, é mostrada como abaixo:
Pa-X
Pb-X3
F em que, Pa e Pb são PEGs diferentes ou iguais; j é um número inteiro de 1 a 12; Ri é H, um grupo alquil C1-C12 substituído ou não substituído, um arilo substituído, um aralquilo ou um heteroalquilo; Xi e X2 são grupos de ligação independentes, em que Xi é (CH2)n, e X2 é seleccionado do grupo que é composto por (CH2) nr (CH2)nOCO, (CH2)nNHCO, e (CH2)nCO; n é um número inteiro de 1 a 10 e f é um grupo terminal seleccionado do grupo que é composto por um grupo hidroxil, um grupo carboxil, um grupo éster, cloreto de acilo, hidrazida, maleimida, dissulfeto de piridina, capaz de reacção com um grupo amino, um grupo hidroxil ou um grupo mercapto de um agente terapêutico ou um substrato para formar ligação covalente.
Numa forma de realização preferencial da presente invenção, a molécula derivada de PEG em forma de Y é mostrada como abaixo: roch2 ch2 (OCH2 ch2 ) m-o - 0½¾
(CHRj)j—F
ROCH2CH3(OCH2CH2 )m..0 CH,—C
w II em que, R e R' são independentemente um grupo alquil C1-C4, preferencialmente metilo; m e m' indicam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; m+m' é preferencialmente de 600 a 1500; R2 é H, um alquilo C1-C12 substituído ou não substituído, um arilo substituído, um aralquilo, ou um grupo heteroalquilo; j é um número inteiro de 1 a 12; e f é um grupo terminal seleccionado do grupo que é composto por um grupo hidroxil, um grupo carboxil, um grupo éster, cloreto de ácido carboxílico, hidracida, maleimida, 7/32 dissulfeto de piridina, capaz de reacção com um grupo amino, um grupo hidroxil ou um grupo mercapto de um agente terapêutico ou um substrato para formar uma ligação covalente. Preferencialmente, o peso molecular médio total do PEG é de aproximadamente 10000 a aproximadamente 60000 Dalton, mais preferivelmente aproximadamente 40000 Dalton.
Numa forma de realização preferencial da presente invenção, uma fórmula estrutural possível, a molécula derivada de PEG em forma de Y é mostrada como fórmula (I): ROCHjC^pCHjCHiJm-o-CUsCHb, f\ Η
—C—N—O—ff 1 (D R0CH2CH3(0CH3CH2)rn'-O—C«}—tf O tf em que R e R' são independentemente um grupo alquil C1-C4, preferencialmente metilo; m e m' indicam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; m+m' é preferencialmente de 600 a 1500; j é um número inteiro de 1 a 12; e o peso molecular médio total do PEG é aproximadamente 40000 Dalton.
Os presentes inventores usaram os derivados de PEG ramificados em forma de Y (YPEG) para modificar o interferão-a2a (IFN-a2a), e isolar o YPEG-IFNs-a2a, modificado por YPEG num único resíduo aminoácido, por cromatografia de troca iónica em Q-Sepharose FF. Além disso, o YPEG-IFNs-a2a isolado, modificado num único resíduo aminoácido, foi ainda mais separado por cromatografia em SP-Sepharose FF para obter YPEG-IFN-a2a, em que o YPEG está principalmente ligado à cadeia lateral ε-ΝΗ2 de Lys na posição 134 na SEQ. ID n°.l, que é denominado YPEG-IFN-a2a (134). Depois da medição, foi descoberto que a actividade in vitro do YPEG-IFN-a2a (134) era significativamente superior do que aquela do YPEG-IFN-a2a no qual o YPEG está ligado a outra posição de aminoácido, e a semi-vida do YPEG-IFN-a2a (134) em 8/32 soro é significativamente mais longa do que aquela do IFN-a2a não modificado.
Consequentemente, a presente invenção providencia IFNs-cx2a peguilado num único resíduo aminoácido, a estrutura do qual é como abaixo:
Pa-X|^ Π H —(CHRj);-C —N—IFN-a2a
Pb-ΧΓ em que, Pa e Pb são PEGs diferentes ou iguais; j é um número inteiro de 1 a 12; Ri é H, um grupo alquil C1-C12 substituído ou não substituído, um arilo substituído, um aralquilo ou um heteroalquilo; Xi e X2 são grupos de ligação independentes, em que Xi é (CH2) n» e X2 é seleccionado do grupo que é composto por (CH2)n, (CH2) n0C0, (CH2) nNHCO, e (CH2)nCO; em que n é um número inteiro de 1 a 10.
Numa forma de realização preferencial da presente invenção, a fórmula estrutural do IFN-a2a peguilado da presente invenção é como abaixo:
BOCH2CH2(OCH2CHj)m-o-CHjCHs, π H ^ N -(CH2) j —c —N — IFN-aSa RiOCHaCHjffJC^CH, — CHa—</
O ¢10 em que, R e R' são independentemente um grupo alquil C1-C4, preferencialmente metilo; j é um número inteiro de 1 a 12; me m' indicam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro igual ou diferente; m+m' é preferencialmente de 600 a 1500. Nesta estrutura, uma molécula PEG ramificada em forma de Y é ligada a uma molécula IFN-a2a através de um único resíduo aminoácido. O peso molecular médio do YPEG-IFNs-a2a na fórmula (II) depende principalmente do grau de polimerização, m e m' .
Em que m+m' é preferencialmente de 600 a 1500, o peso molecular médio correspondente do YPEG é de aproximadamente 26000 a 9/32 aproximadamente 66000 Dalton. Em que m+m' é preferencialmente de 795 a 1030, o peso molecular médio correspondente do YPEG é de aproximadamente 35000 a aproximadamente 45000 Dalton. Em que m+m' é preferencialmente de 885 a 1030, o peso molecular médio correspondente do YPEG é de aproximadamente 39000 a aproximadamente 45000 Dalton. Em que m+m' é mais preferivelmente 910, o peso molecular médio correspondente do YPEG é 40000 Dalton. O rácio de m e m' pode ser um que varia de 0,5 a 1,5, preferencialmente de 0,8 a 1,2.
Numa forma de realização preferencial, no IFN-cx2a peguilado da presente invenção, uma molécula PEG é ligada a IFN-a2a através de uma ligação amido formada por um grupo α-amino do aminoácido N-terminal ou o grupo ε-amino grupo de cadeia lateral do resíduo Lys de IFN-a2a correspondente à posição 23, 31, 49, 70,
83, 112, 121, 131, 133, 134 ou 164, como mostrado na SEQ. ID n° . 1.
Numa outra forma de realização preferencial, no IFN-a2a peguilado da presente invenção, uma molécula PEG é ligada a IFN-cx2a através de uma ligação amido, principalmente formada pelo grupo ε-amino de cadeia lateral de resíduo Lys de IFN-cx2a que corresponde à posição 134 como mostrado na SEQ. ID n°.l.
Opcionalmente, o IFN-a2a da presente invenção pode ser extraído de fontes naturais ou obtido pela biotecnologia recombinante. Preferencialmente, o IFN-cx2a é IFN-a2a humano (hIFN-cx2a) com a sequência de aminoácidos da SEQ. ID n°.l, que é extraída de fontes naturais ou obtida pela biotecnologia recombinante. Mais preferencialmente, o IFN-a2a humano é IFN-a2a humano recombinante (rhIFN-a2a) . O rhIFN-o(2a pode ser artificialmente sintetizado, ou ser expressado de sistemas de expressão procarióticos tais como E. coli, ou ser expressado de sistemas de expressão de leveduras eucarióticas tais como Pichia, ou ser expressado de sistemas de expressão de células de insecto ou sistemas de expressão de células mamíferas tais como CHO. Os 10/32 métodos de preparação do IFN-a2a natural ou recombinante e os testes de actividade de IFN-a2a e IFN-a2a modificado por YPEG são conhecidos na técnica anterior.
Similarmente ao IFN-a2a, o YPEG-IFN-a2a da presente invenção pode também ser usado clinicamente para tratar tumores e infecções virais, tais como hepatite, leucemia de células pilosas, linfólise mediada por células, sarcoma de Kaposi etc. Na clinica, o YPEG-IFN-a2a da presente invenção é claramente aperfeiçoado, em comparação com IFN-a2a, em estabilidade, solubilidade, semi-vida em soro e eficácia de terapêutica clínica. Para o modo de administração, o YPEG-IFN-a2a da presente invenção pode ser administrado aos pacientes na forma de uma composição que compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz do YPEG-IFN-a2a e um suporte ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Deste modo, a presente invenção, em outro aspecto, também providencia uma composição que compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz do IFN-a2a peguilado da presente invenção e um suporte ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Preferencialmente, a composição compreende manitol, um aminoácido, cloreto de sódio e acetato sódico, caracterizado por o aminoácido ser preferencialmente seleccionado do grupo que é composto por ácido aspártico, asparagina e glicina.
Em outro aspecto, a presente invenção também providencia o uso do IFN-a2a peguilado da invenção ou a composição que compreende IFN-a2a peguilado da invenção na preparação de um medicamento para tratar uma doença que necessite de tratamento com IFN-a2a.
Preferencialmente, a doença que necessita de tratamento com IFN-a2a é seleccionada do grupo que é composto por infecções virais, por ex., hepatite B, hepatite C, hepatite D e condiloma acuminatum, tumores por ex., leucemia de células pilosas, leucemia crónica mielóide, leucemia não Hodgkin de baixo grau de malignidade, linfólise mediada por células, sarcoma de
Kaposi, mieloma múltiplo, melanoma maligno, linfoma cutâneo de 11/32 células T, papiloma laríngeo, carcinoma de células renais recorrente ou metastático, doenças inflamatórias e doenças por ex. esclerose múltipla, artrite, asma, fibrose cística e doença pulmonar intersticial, e trombocitémia relacionada com doenças mieloproliferativas.
Para obter o IFN-a2a modificado por YPEG, numa forma de realização da presente invenção, inicialmente a metade PEG dos derivados YPEG activados, tais como éster succinimidil N-hidroxilo do PEG (YPEG-NHS) é ligada de forma covalente a um grupo amino (-NH2) da proteína através de substituição nucleofílica, em que o grupo amino inclui um grupo α-amino N-terminal e um grupo ε-amino de resíduo Lys da proteína. A equação de reacção para a geração de YPEG-IFN-cx2a de IFN-a2a e YPEG é como abaixo: ÍH K N-(CH3)j-C-N-0-N r ♦ H2N-ÍFN-02a ROCH2CH2(OCHsCH2 )m’Q-CHgCHs^ ROCH5 CH2(QCH3CH2
II o i
flOChj CHjfOCHjCHj Sm*0_ChfjCKj U H ^W-(CH2)j-c-N-IFN-a2a
II
O
As condições de reacção são suaves, o pH é um que varia entre 4,5 e 9,5, a temperatura é entre 0-25 °C, e é necessário agitar ou outras acções de mistura. Para condições detalhadas é necessário consultar os Exemplos em DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO. Todos os YPEGs com pesos diferentes moleculares podem ser ligados a IFN-a2a usando o método acima. Os produtos incluem IFNs-a2a modificados num único resíduo aminoácido (YPEG-IFN-a2a) , IFNs-a2a modificados em dois resíduos aminoácidos (YPEG2-IFN-a2a) e IFNs-a2a modificados em múltiplos resíduos aminoácidos (YPEGn-IFN-a2a), em que os produtos modificados num único resíduo aminoácido podem ser os produtos predominantes para ajustar a condição de reacção. 12/32
Posteriormente, o YPEG-IFNs-a2a, modificado por PEG num único resíduo aminoácido, pode ser isolado da mistura de todos os tipos de IFNs-cx2a modificado por YPEG usando um método tal como a cromatografia de troca catiónica, cromatografia de troca aniónica, ou cromatografia de exclusão, e de seguida o IFNs-a2a modificado por PEG em diferentes resíduos de aminoácidos únicos pode ser adicionalmente resolvido para obter o YPEG-IFN-cx2a, no qual o YPEG está ligado numa posição específica. Os métodos de purificação convencionais incluem cromatografia de troca catiónica, cromatografia de troca aniónica, cromatografia de interacção hidrofóbica e cromatografia de exclusão. A análise característica pode ser realizada por um método conhecido na matéria, por ex., a espectroscopia de massas, a electroforese em gel de polipoliacrilamida e a cromatografia de exclusão líquida de alta performance podem ser utilizadas para analisar o peso molecular dos produtos, para distinguir os produtos modificados por PEG num único resíduo aminoácido daqueles modificados por PEG, em dois ou múltiplos resíduos aminoácidos e IFN-a2a não modificado. Os métodos de purificação anteriormente mencionados podem também ser usados para adicionalmente resolver os produtos modificados por PEG num único resíduo aminoácido para obter isómeros diferentes com a modificação PEG em diferentes posições únicas. As actividades biológicas in vitro de todos os tipos de produtos modificados por PEG podem ser medidas de acordo com qualquer ensaio conhecido para actividade-IFN, por ex., inibição de efeito citopático. Para IFNs modificados por PEG num único resíduo aminoácido, as fracções PEG nos diferentes isómeros têm efeitos diferentes ao manter os domínios activos de IFNs, resultando em grandes diferenças nas actividades biológicas dos diferentes isómeros. No geral, as actividades in vitro de IFNs sao notavelmente diminuídas depois de modificação por PEG. No entanto, de acordo com a presente invenção, foi medida a actividade específica in vitro dos isolados de três picos obtidos por cromatografia de troca iónica, e os resultados indicam que o isolado do pico 3 (SP2) tem actividade específica 13/32 significativamente mais elevada do que o isolado de outros picos e Pegasis (Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland) , e tem significativamente uma semi-vida mais longa em soro do que IFN-cx2a não modificado.
Numa forma de realização adicional, o péptido ligado por PEG ramificado em forma de Y do SP2 foi ordenado usando degradação Edman, e os resultados mostraram que o componente principal de SP2 foi YPEG-IFN-a2a (134).
Deste modo, em outro aspecto, a presente invenção também providencia a preparação e métodos de purificação para YPEG-IFN-cx2a, que compreende: (a) sob uma condição alcalina, preferencialmente em pH 9.0, que permite PEG ramificado em forma de Y como mostrado na fórmula (I) abaixo para reagir com IFN-a2a, e obter o IFN-a2a peguilado; ROQH^CHítOCHjCHí ROCHj CHjCOCH; BHj )nV-0—Crt»— I!
O
O
O
,N—(CKj)j —Ç —N— O—N
d) em que R e R' são independentemente um grupo alquil C1-C4, preferencialmente metilo; j é um número inteiro de 1 a 12; me m' indicam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; e m+m' é preferencialmente de 600 a 1500; (b) capturando os produtos de reacção na fase (A) com uma resina de troca aniónica, preferencialmente Q-Sepharose FF, e eluindo os produtos num gradiente de anião, preferencialmente num gradiente de ião cloreto, para obter produtos modificados; (c) eluindo os produtos de reacção capturados na fase (B) com uma resina de troca catiónica, preferencialmente SP-Sepharose FF, num gradiente de catião, preferencialmente num gradiente de ião sódio, e recolhendo cada pico separadamente: 14/32 (d) determinando a actividade do produto de cada pico, e seleccionando o pico correspondente ao produto de reacção com a actividade mais elevada.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS FIG.l: Electroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) de 3 lotes de IFN-a2a modificado por YPEG (4 OKD) . A concentração do gel de separação foi de 12%, e foi usado coloração azul brilhante Coomassie R-250. Pistas 1-2: 20060804; Pistas 3-4: 20060807 de 20060807; Pistas 5-6: 20060807-2 . FIG.2: Perfil de resolução dos isómeros de modificação YPEG-IFN-a2a por SP-Sepharose FF. FIG.3: SDS-PAGE de coloração prata (12%) das amostras de YPEG-IFN-a2a purificadas através de SP-Sepharose FF. Pista 1: marcador do peso molecular; Pistas 2, 4, 6, 8, vazias; Pistas 3, 5, 7, 9, correspondendo respectivamente aos picos 1 a 4 no perfil de eluição. FIG.4: Pesos moleculares aparentes dos isómeros de modificação YPEG-IFN-a2a no SDS-PAGE de coloração prata. Pista 1: marcador do peso molecular (GE Lifesciences); Pista 2: YPEG-IFN-a2a SP3, 0,4 pg; Pista 3: YPEG-IFN-a2a SP2, 0,4 pg; Pista 4: YPEG-IFN- a2a SP1, 0,4 pg. FIG. 5: Pesos moleculares das amostras YPEG-IFN-a2a purificadas através de SP-Sepharose FF por MALDI-TOF MS. O YPEG-IFN-a2a SP1 I corresponde à amostra na Pista 4 da FIG.4; o YPEG-IFN-a2a SP2 corresponde à amostra na Pista 3 da FIG. 4, e o YPEG-IFN-cx2a SP3 corresponde à amostra na Pista 2 da FIG.4. FIG. 6: Peso molecular de YPEG-NHS (40KD) por MALDI-TOF MS. FIG. 7: Concentração de soro do medicamento e a concentração 2', 5'-A, após uma única injecção s.c. de 30 pg.kg-1 de YPEG- rhIFN-a2a SP2 em Macaco caranguejeiro (Macaca fascicularis) . FIG. 8: Análise de Mapeamento de Péptidos com Tripsinase da amostra de YPEG-IFN-cx2a SP2 digerido por tripsina (Oh) por HPLC-RP Cie. O tempo de retenção de YPEG-IFN-a2a SP2 foi 62.105 15/32 min., o pico de eluição a 71.882 min. foi o solvente, e os picos de eluição aos 2-3 min. correspondiam à tripsina. FIG. 9: Análise de Mapeamento de Péptido com Tripsinase da amostra de YPEG-IFN-a2a SP2 digerido por tripsina (48h) por HPLC-RP Ci8- 0 pico de solvente aos 71.581 min. foi detectado, correspondente ao pico de solvente aos 71.882 min. na amostra digerida por tripsina (Oh). Não foi detectado qualquer pico de proteina de substrato (62.105 min.) os 59.5 min. e 62.5 min., que demonstra que a amostra foi substancial e completamente digerida. FIG. 10: Perfil de separação Sephacryl S-100 HR dos péptidos modificados por YPEG da amostra YPEG-IFN-a2a SP2 completamente digerida por tripsina.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção será adicionalmente descrita pelos exemplos seguintes, mas qualquer exemplo ou combinação dos mesmos não deverão ser compreendidos como limitativos do âmbito ou forma de realização da invenção. O âmbito da invenção é limitado apenas pelas reivindicações anexas. Em combinação com a descrição e técnica anterior, os especialistas na matéria compreenderão facilmente o âmbito limitado pelas reivindicações.
Exemplo 1
Preparação de IFN-a2a humano recomblnante modificado por PEG, ramificado em forma de Y
(1) Preparação em pequena escala de IFN-a2a humano recombinante modificado por PEG, ramificado em forma de Y
Foram pesados e dissolvidos 166,3 mg de YPEG (fórmula (I), peso molecular médio 40KD, braço igual, número de lote RD010P041,
Beijing JenKem Technology Co., Ltd.) em 1 ml de 2mM HC1 16/32 (Guangdong Guanghua Chemical Factory Co., Ltd.). foram adicionados 40 mg de IFN-a2a (Xiamen Amoytop Biotech Co., Ltd.) e 50 mM de solução-tampão bórax de ácido bórico (pH 9.0, Sinopharm Shanghai Chemical Reagent Co., Ltd.) a um volume de reacção final de 10 ml. Neste sistema de reacção, a concentração final de IFN-cx2a foi 4 mg/ml, e o rácio da reacção molar de IFN-cx2a e YPEG foi 1:2. O sistema de reacção foi mantido abaixo de 0-25 °C durante 2h com agitação. O IFNs-a2a peguilado foi então gerado, e a reacção foi parada ao adicionar ácido acético glacial (Shantou Xilong Chemical Co., Ltd.) para tornar o pH <4.0. Uma amostra foi submetida ao sistema de diluição simples por SDS-PAGE. O sistema de reacção foi diluído 50 vezes com água e, de seguida, 0,2 ym foram filtrados antes de serem armazenados a 4 °C para uso adicional. A Cromatografia Q-Sepharose FF foi usada para separar o PEG restante e hidrolatos de PEG, IFNs-a2a modificado por YPEG em múltiplos resíduos aminoácidos, IFNs-a2a modificados por YPEG num único resíduo aminoácido e IFN-cx2a não modificado. A coluna Q-Sepharose FF (GE Healthcare) ((t>2mmx90mm, lCV=10ml) foi regenerada com 3 volume de coluna (CV) de 20mM de ácido bórico/solução-tampão bórax (pH9,0)-lM NaCl (BBI), e de seguida equilibrada com 5CV de 20mM ácido bórico/solução-tampão bórax (pH9.0). O comprimento de onda de detecção UV foi estabelecido em 280nm. A amostra inteira armazenada a 4 °C foi carregada. Depois de carregada, a coluna foi equilibrada com 3CV de ácido bórico/solução-tampão bórax (pH9,0), e de seguida 20mM de ácido bórico/solução-tampão bórax (pH9,0)-12mM NaCl foram usados para eluição até o primeiro pico ter sido completamente eluído, cujo pico era o restante PEG 20mM de ácido bórico/solução-tampão bórax (pH9,0)-60mM NaCl foi usado para eluição, e a amostra recolhida neste pico de eluição foi principalmente o YPEG-IFNs-cx2a, modificado por PEG num único resíduo aminoácido. E de seguida, 20mM de ácido bórico/solução-tampão bórax (pH9,0)-500mM NaCl foram usados para eluição e o pico de eluição foi o IFN-a2a não modificado. 17/32
Os produtos alvo eram principalmente os produtos modificados por PEG num único resíduo aminoácido, YPEG-IFNs-a2a, com um nível de produção de 20-40.
(2) Preparação em grande escala de IFN-cx2a humano recombinante modificado por PEG, ramificado em forma de Y
Foram pesados e dissolvidos 4989,6 mg de YPEG (fórmula (I), peso molecular médio 40KD, braço igual, número de lote RD010P041, Beijing JenKem Technology Co., Ltd.) em 25 ml de 2mM HC1. E foram adicionados 1200 mg de IFN-a2a e 50mM de ácido bórico/solução-tampão bórax (pH 9.0) a um volume de reacção final de 200 ml. Neste sistema de reacção, a concentração de reacção final de IFN-a2a foi 6 mg / ml, e o rácio de reacção molar de IFN-a2a e YPEG foi 1:2. O sistema de reacção foi mantido abaixo de 0-25 °C durante 2h com agitação. A reacção foi parada ao adicionar ácido acético glacial para tornar o pH <4.0. Uma amostra foi submetida ao sistema de diluição simples por SDS-SAGE. O sistema de reacção foi diluído 50 vezes com água e de seguida 0,2 ym foram filtrados antes de serem armazenados a 4 °C para uso adicional.
Foi usada Cromatografia Q-Sepharose FF para separar o PEG restante e hidrolatos de PEG, IFNs-cx2a modificado por YPEG em múltiplos resíduos de aminoácidos, IFNs-a2a modificados por
YPEG num único resíduo aminoácido e o IFN-a2a não modificado. A coluna (038mmx265mm; lCV=300ml) Q-Sepharose FF (GE Healthcare) foi regenerada com 3 CV de 20mM de ácido bórico/solução-tampão
bórax (pH9,0)-lM NaCl, e de seguida equilibrada com 5CV de 20mM de ácido bórico/solução-tampão bórax (pH9.0). O comprimento de onda de detecção UV foi estabelecido em 280nm. Toda a amostra armazenada a 4 °C foi carregada. Depois de carregada, a coluna foi equilibrada com 3CV de 20mM de ácido bórico/solução-tampão bórax (pH9,0), e de seguida 20mM de ácido bórico/solução-tampão bórax (pH9,0)-12mM NaCl foram usados para eluição até o 18/32 primeiro pico ter sido completamente eluído, cujo pico foi o restante PEG. 20mM de ácido bórico/solução-tampão bórax (pH9,0)-60mM NaCl foram de seguida usados para eluição, e a amostra recolhida neste pico de eluição foi principalmente o YPEG-IFNs-a2a, modificado por PEG num único resíduo aminoácido. E de seguida, 20mM de ácido bórico/solução-tampão bórax (pH9, 0)-500mM NaCl foram usados para eluição e o pico de eluição foi o IFN-a2a não modificado.
Os produtos alvo eram principalmente os produtos modificados por PEG num único resíduo aminoácido, YPEG-IFNs-cx2a, com um nível de produção de 35-50. A Fig. 1 mostra os resultados do SDS-PAGE para 3 lotes de IFNs- a2a modificados com YPEG (40KD). Pode ser visto na figura 1 que sob a condição, o nível de modificação PEG de rhIFN-cx2a foi entre 35-50% e manteve-se estável. Os produtos primários modificados eram modificados por PEG num único resíduo aminoácido, e existiram também alguns produtos modificados por PEG em múltiplos resíduos de aminoácidos.
Exemplo 2
Resolução de YPEG-IFNs-a2a por SP-Sepharose FF A amostra YPEG-IFN-a2a recolhida por Q-Sepharose FF foi ajustada para pH 5.0 com 20% de ácido acético, de seguida diluída 15 vezes com 5mM NaAc/HAc (pH5,0, Shantou Xilong
Chemical Co., Ltd.). A amostra foi carregada em 0,5 mg/ml de capacidade de carga para a coluna (018mmx394mm) de 100 ml de SP-Sepharose FF (GE Healthcare). A coluna foi equilibrada com 3CV de 5mM NaAc/HAc (pH5,0), e de seguida eluída com 2,5CV do gradiente de 0%-30% de 5mM NaAc/HAc-70mM NaCl (pH5,0), de
seguida com 50CV do gradiente de 30%-100% de 5mM NaAc/HAc-7OmM
NaCl (pH5, 0) . O YPEG-IFN-0í2a foi resolvido como 4 picos de eluição por 100 ml de SP-Sepharose FF. As amostras foram 19/32 recolhidas de acordo com estes picos e de seguida testadas pelo sistema de diluição simples por SDS-PAGE com coloração prata, respectivamente. De acordo com os resultados do SDS-PAGE, pode ser visto que o pico 1 resolvido por SP-Sepharose FF foi principalmente os produtos modificados por YPEG em múltiplos resíduos de aminoácidos (YPEGn-IFN-a2a) . 0 pico 2 por SP-Sepharose FF foi principalmente os produtos modificados por PEG num único resíduo aminoácido (YPEG-IFN-oí2a) , e também continha alguns produtos modificados por PEG em múltiplos resíduos de aminoácidos. 0 pico 3 e pico 4 por SP-Sepharose FF eram ambos os produtos modificados por PEG num único resíduo aminoácido. Os picos 2-4 resolvidos por SP-Sepharose FF eram isómeros modificados com YPEG em diferentes posições únicas, e eram denominados respectivamente como YPEG-IFN-a2a SP1; YPEG-IFN-a2a SP2 e YPEG-IFN-a2a SP3. 0 perfil de resolução e resultados de SDS-PAGE prata são mostrados na Fig. 2 e Fig. 3, respectivamente.
Cada amostra de YPEG-IFN-cx2a SP1-3 foi completada com cloreto de sódio, acetato sódico, manitol, ácido aspártico e foi esterilizada com 0,22 ym de filtro antes de ser armazenada a 4 °C para uso adicional.
Exemplo 3
Análise caracteristica de isómeros de modificação YPEG-IFN-<x2a (1) Concentração proteica por método Kjeldahl
As concentrações de isómeros de modificação YPEG-IFN-a2a foram determinadas pelo método Kjeldahl. (2) Peso molecular proteico aparente
Os pesos moleculares aparentes dos isómeros de modificação YPEG-IFN-a2a foram determinados por SDS-PAGE. O método foi de 20/32
acordo com Laemmli et al (Nature 227: 680, 1970) . A concentração do gel foi de 7,5%, e o gel foi visualizado por coloração prata. Os pesos moleculares aparentes dos isómeros de modificação YPEG-IFN-a2a foram guase os mesmos, aproximadamente 120KD (Fig. 4).
(3) Peso molecular determinado por MALDI-TOF MS
Foi usado o MALDI-TOF MS (Autoflex TOF/TOFsystem, Bruker Daltonics, Germany) para determinar os pesos moleculares dos isómeros de modificação YPEG-rHuIFN-a2a. Foi usado ácido sinapinico (SA, Cu H12 05, M.W. 224.22, número de lote: 2006 236870 002, Bruker Daltonics, Germany) como matriz. Foi usada a calibração de proteína padrão II (n° de série 207234, Bruker Daltonics, Germany) como padrão de peso molecular proteico, e o software para análise de dados foi o FlexAnalysis Ver.3.0.54.0. Os pesos moleculares MS dos isómeros de modificação YPEG-IFN-a2a eram quase os mesmos, aproximadamente 59000 Dalton (FIG. 5) . (4) Pureza proteica A pureza dos isómeros de modificação YPEG-IFN-a2a foi determinada por HPLC-SE. A coluna de HPLC foi TSK G4000 SWXL (Φ7,8 mm x 300 mm, TOSOH) , o volume de carregamento da amostra foi 20 μΐ (aproximadamente 10 yg de proteína), a fase móvel foi 0,1M PBNa-0,1M NaCl (pH7), a velocidade de fluxo foi 0,8 ml/min, e o comprimento de onda de detecção foi estabelecido em 280nm. O YPEG-IFN-a2a SP2 foi um pico principal único, com uma pureza de mais de 99%. (5) Teste do teor de endotoxina
Com base no ensaio limulus (Pharmacopoeia of the People's Republic of China, 2005, Volume 3, Appendix X C) , o teor de 21/32 endotoxina de cada amostra de YPEG-IFN-cx2a foi menor do que 5,0 EU/mg. (6) Actividade in vivo e farmacocinética de YPEG-IFN-cx2a SP2 em animais □ Actividade in vivo de YPEG-IFN-cx2a SP2 em animais. O mecanismo de acção de IFN serve parcialmente para induzir a produção de 2',5'-AS (2 ',5'-oligoadenilato sintetase), que por sua vez exerce os seus efeitos antivincos. Usando | como traçador, os parâmetros farmacodinâmicos de IFN são reflectidos pela actividade in vivo do 2 ' ,5'-AS. O 2',5'-AS catalisa a síntese de 2',5'-A (25 '-oligoadenilato) de ATP na presença de ágar Poli(|)·Poli(C) (a actividade de 2',5'-AS pode ser representada pela concentração do sintetizado 2',5'-A). Primeiro, o 2',5'-AS nas amostras é absorvido e activado por agarose Poli(|)·Poli(C), depois catalisa o substrato ATP para gerar 2',5'-A. Uma mistura de 2 ', 5'-A marcada com 1251 , soro anti-2',5'-A e anticorpo secundário é adicionada na amostra que de seguida é incubada e centrifugada para separar a mistura. O sobrenadante é eliminado e um detector de radiação gama é utilizado para medir a radioactividade do sedimento. O nível de união do 2', 5'-A marcado com 1251 é calculado. É usada a regressão logística de quatro parâmetros para gerar a curva padrão, e de seguida a concentração do produto 2',5'-A induzido por 2',5'-AS numa amostra desconhecida poderia ser estimada.
Usando o método 2',5'-A anteriormente mencionado, os resultados na tabela 1 e na FIG. 7 mostraram que a concentração de soro 2',5'-A, após uma única injecção s.c. de 30 yg-kg-l YPEG-rhlFN-a2a SP2 em Macaco caranguejeiro (Macaca fascicularis) (15 Macacos caranguejeiros, 7 fêmeas e 8 machos. Laboratory Animal Center of the Academy of Military Medicai Sciences, Certification No. SCXK-(MIL)2002-001. Peso corporal 2,5 -3,7 kg, criados em jaulas diferentes, alimentados com alimentos de 22/32 macaco padrão, bebida à discrição) . Pode ser visto na Fig. 5, depois da administração, que a actividade de 2',5'-AS no soro foi claramente aumentada, e o tempo até ao pico de 2' . 5'-A no soro foi mais retardado do que aquele do YPEG-IFN-a2a SP2. 0 tempo até ao pico médio foi 24 ± 18.33h, e a concentração para o pico foi 104.31 ± 56.39 Pmol-dL-1.
Tabela 1. As concentrações de soro 2',5'-A durante o tempo, após uma única injecção s.c. de 30 yg-kg_1 YPEG-rhIFN-a2a SP2 num Macaco carangue jeiro . (Pmol-dL_i)
Tempo N° de macacos Média SD (h) caranguejeiros 1 2 3 0 16,08 19,01 42, 91 26, 00 + 14, 72 1 39,04 - 16, 19 27, 61 + 16, 16 2 48,21 16, 90 20,20 28, 44 + 17, 21 4 55,22 36, 09 74, 16 55, 15 + 19,04 8 32,04 59,69 99,52 63, 75 ± 33, 92 10 13,52 41,21 51,85 35,53 + 19, 79 12 37,35 53,32 119,76 70, 14 + 43, 71 24 58,29 167,22 87, 42 104,31 + 56,39 48 77,50 160,67 71, 41 103,19 + 49,87 72 62,88 165,97 58,52 95, 79 + 60,82 96 73,53 119,79 90,85 94, 72 + 23,37 168 45, 41 135,26 68,92 83,20 + 46,60 240 48,14 102,61 73,97 74, 90 + 27,25 312 93,23 21,69 62,84 59,26 + 35, 90 □ Farmacocinética de YPEG-IFN-a2a SP2 e rhIFN-cx2a em Macaco caranguejeiro
Uma única injecção s.c. de 7,5, 30 ou 120 yg-kg_1 de YPEG-IFN-a2a SP2 foi administrada a um Macaco caranguejeiro. Para o grupo de administração, 1 ml de sangue venoso foi recolhido na perna posterior oposta ao local injectado anteriormente lh, 2h, 23/32 4h, 8h, lOh, 12h, 24h, 48h, 72h, 96h, 168h, 240h, e 312h depois da administração. Para o grupo com uma única injecção s.c. de rhIFN-cx2a (7,5 yg-kg-1), 1 ml de sangue foi recolhido anteriormente 0,5h, lh, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h, 8h, e 24h depois da administração. Depois serem mantidas a 4 °C durante 30 minutos, as amostras de sangue foram centrifugadas a 2000 rpm durante 10 min. a uma baixa temperatura, de seguida o soro foi separado imediatamente e armazenado a -20 °C para análise adicional.
Foi usado o imunoensaio em sanduíche guantitativo duplo. Um anticorpo monoclonal específico ao IFN-α humano recombinante foi pré-revestido em placa de microtitulação. O padrão e as amostras foram pipetados nos poços de microtitulação, em gue o rhIFN-cx2a ou YPEG-IFN-a2a SP2 ligar-se-iam ao anticorpo imobilizado. A placa foi lavada para eliminar substâncias livres, e de seguida o IFN-α IgG anti-humano (anticorpo secundário) foi adicionado aos poços. Depois de a reacção estar completa, a placa foi lavada e a peroxidase de rábano (HRP) foi adicionada aos poços. Depois de lavar a enzima livre e reagentes, a cor gerada ao adicionar solução de substrato HRP em cada poço foi proporcional à guantidade da ligação IFN-a2a ou YPEG-IFN-a2a SP2 na primeira fase. A reacção foi parada e a intensidade da cor foi medida. Quanto maior for o valor OD de absorvância, maior é a concentração de IFN-a2a ou YPEG-IFN-a2a SP2 na amostra. As curvas padrão foram fixadas para IFN-a2a e YPEG-IFN-a2a SP2, respectivamente, para medir a concentração do medicamento no soro em amostras de sangue.
De acordo com o protocolo na descrição do kit (American
Biomedical Co., número de lote 3271), 100 μΐ padrão ou amostra de sangue foi adicionado a cada poço, e misturado suavemente com misturador de placas. De acordo com a concentração antecipada de uma amostra desconhecida, a amostra foi diluída com a solução diluída nos intervalos de concentração da curva padrão. A curva padrão do rhIFN-a2a ou YPEG-IFN-cx2a SP2 para cada placa foi fixada para calcular a concentração da amostra 24/32 desconhecida nessa placa. A placa foi incubada à temperatura ambiente durante lh, e lavada uma vez com solução de lavagem de placa. 100 μΐ de anticorpo secundário foram adicionados a cada poço, e mantidos abaixo da temperatura ambiente durante lh. A placa foi lavada 3 vezes, e os 100 μΐ de HRP conjugados foram adicionados a cada poço. A placa foi incubada sob temperatura ambiente durante lhe lavada 4 vezes. 100 μΐ de substrato TMB foram adicionados a cada poço, e mantidos abaixo da temperatura ambiente, no escuro, durante 15 min. 100 μΐ de solução de paragem foram adicionados a cada poço, e misturados suavemente para parar a reacção. O valor OD de absorvância em 450nm foi medido com um leitor de microplacas durante 5 min. para determinar a concentração de cada amostra.
Após uma única injecção s.c. de 7,5, 30 ou 120 pg-kg-1 de YPEG-rhIFN-a2a em Macaco caranguejeiro, a semi-vida era de 35.81 ± 2.50, 31.38 ± 11.84 e 36.77 ± 2.24 h, respectivamente. Após uma única injecção s.c. de 7,5 pg-kg_1 de rhIFN-a2a em Macaco carangue jeiro, a semi-vida foi de 3.02 ± 0.55h. A semi-vida de rhIFN-a2a foi significativamente prolongada após a Peguilação. (7) Actividade especifica in vitro A actividade in vitro biológica de cada isómero de modificação YPEG-IFN-a2a foi estimada usando o ensaio de inibição de efeito citopático. De acordo com o método descrito no Determination
Method of Interferon Activity (Pharmacopoeia of the People's
Republic of China, 2005, Volume 3, Appendix X C) , o interferão protege as células amnióticas humanas (WISH) de danos provocados pelo vírus de estomatite vesicular (VSV). O Violeta cristal foi usado para marcar as células WISH sobreviventes, e o valor OD de absorvância foi medido aos 570nm. A curva de efeito de protecção do interferão foi fixada para células WISH, para determinar a actividade biológica in vitro dos interferões. Os resultados da actividade biológica in vitro de cada uma das amostras são mostrados na tabela 2, e 3 testes 25/32 paralelos foram realizados para cada amostra. Depois da modificação YPEG, em todos os isómeros de modificação dos produtos modificados por PEG num único resíduo aminoácido, a amostra SP2 mostrou a actividade específica in vitro mais elevada, que foi 1-2 vezes mais do que no SP1 e SP3, e também 1-2 vezes mais elevada do que a amostra não resolvida e PEGASYS (produzida por Hoffmann-La Roche, Basel, Switzerland; embalado separadamente por Shanghai Roche Pharmaceuticals Ltd., número do lote de produto B1016, número do lote de embalagem SH0020).
Tabela 2. Resultados da actividade biológica in vitro para cada isómero de modificação de YPEG-IFN-a2a (3 testes paralelos) amostra Tipo de PEG M.W.PEG (KD) N° de Posições de Modificação Actividade Específica Média (x 106| U/mg) YPEG-IFN-a2a SPl Ramificada em Y 40 1 1.04±0.110 YPEG-IFN-a2a SP2 Ramificada em Y 40 1 2.26±0.129 YPEG-IFN-cx2a SP3 Ramificada em Y 40 1 1.11±0.091 Amostra não resolvida de YPEG-IFN-a2a Ramificada em Y 40 1 1.01±0.173 PEGASYS Ramificada em U 40 1 0.903±0.056 (8) A resolução da posição de modificação em YPEG-IFN-a2a SP2 0 sistema de solvente de YPEG-IFN-a2a SP2 foi mudado para 50mM NH4 HCO3 (pH8,0) por ultrafiltração com ultrafiltro 5K (Millipore, material polietersulfona), e a concentração proteica foi determinada como sendo 4,02 mg/ml usando espectroscopia UV. Tripsina TPCK (Promega) foi dissolvida (0,5 pg/μΐ) na solução proporcionada pelo fabricante. As amostras foram adicionadas de acordo com a tabela 3: 26/32
Tabela 3. Composição de reacção da digestão de tripsina por YPEG-IFN-a2a SP2
Componentes de reacção Volume 5 0mM NH4HCO3, pH8 . 0 7,15 ml YPEG-IFN-a2a (4.02 mg/ml) 1,25 ml Tripsina (0,5 yg/μΐ) 0,2 ml Volume de reacção total 8,6 ml 0 sistema de reacção foi mantido em banho-maria a 37 °C durante 48h, de seguida 1,52 ml de 20% de ácido acético foram adicionados para parar a reacção. Uma quantidade pequena de amostra foi recolhida para mapeamento peptídico HPLC-RP C18. O instrumento para análise foi sistema WATERS HPLC, com um controlador do tipo 600, detector de comprimento de onda duplo 2487, e o software para processamento de dados foi o EMPOWER 2. A coluna analítica HPLC foi Júpiter C 18 (diâmetro de partícula 5ym, diâmetro de poro 300A, <f>4,6xl50mm, produzido por
Fenomenex, USA). A fase móvel A foi 0,1 % TFA/H20, fase móvel B foi 0,1% TFA/90% ACN/H20, a velocidade de fluxo foi 1 ml/min, e o comprimento de onda de detecção foi estabelecido em 214nm. Consultar a tabela 4 para os gradientes de eluição, e os resultados foram mostrados nas Figs. 8-9.
Tabela 4. Os gradientes de eluição para mapeamento peptídico HPLC-RP C18 YPEG-IFN-a2a SP 2 digerido por tripsina
Tempo (min) A% B% A CN% 1 0 100 0 0 2 8 100 0 0 3 68 40 60 54 4 72 40 60 54 5 75 100 0 0 6 80 100 0 0
Com base nos resultados de detecção, pode ser determinado que a amostra foi quase totalmente digerida. Os produtos foram tratados com redução de DTT depois de a reacção ser parada. A coluna Sephacryl S-100HR (018x255mm, lCV=64ml; GE Healthcare) 27/32 foi pré-equilibrada com 3CV de 20mM PBNa-400mM NaCl (pH7,0), e 3% CV da amostra de YPEG-IFN-a2a SP2 por TPCK digerido totalmente por tripsina foram carregados por pressão hidrostática. Foram usados 20mM PBNa-400mM NaCl (pH7,0) para eluição, e a detecção do comprimento de onda foi estabelecida em 280nm. A amostra foi recolhida desde o primeiro pico de eluição (amostra número: YPEG-IFN-cx2a S100-1, Fig. 10), e o sistema de solvente foi mudado para 5mM PBNa (pH7) com ultrafiltro 5K. Foi realizada a liofilização a vácuo. Os aminoácidos N-terminal da amostra liofilizada foram determinados usando degradação Edman, e a sequência dos 7 aminoácidos no N-terminal da amostra foi XiSPXAW (tabela 5), em que X denota cisteina α-aminoácida (Cys), um não-a-aminoácido ou outro aminoácido modificado que não pode ser detectado usando degradação. De acordo com a sequência mostrada na SEQ ID N°. 1, pode ser determinado que o YPEG-IFN-a2a SP2 foi principalmente o produto modificado por YPEG em Lysl34.
Tabela 5. Resultado da sequenciação para os aminoácidos N-terminal de YPEG-IFN-a2a S100-1
Simples Sequência N-terminal detectada A posição de modificação de PEG correspondente YPEG-IFN-a2a S100-1 XYSPXAW Lysl3 4 Nota: X denota uma cisteina α-aminoácida, um não-a-aminoácido ou outro aminoácido modificado que não pode ser detectado usando degradação Edman.
Listagens de sequência <110> BIOSTEED GENE EXPRESSION TECH. CO., LTD. 28/32
<12Ο> INTERFERON ALPHA2A MODIFIED BY POLYETHYLENEGLYCOL, THE PREPARATION AND USE THEREOF <13 0> P2007473C <160> 1 <17 0> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 29/32
Cys A5P Leu pro Gin S Thr HÍS ser Leu Gly 10 Ser Ars Arg Thr Leu 15 Met Leu Leu Ala Gin 20 Met Arg Lys rle ser 25 Leu Phe ser cys Leu 30 Lys ASp Arg Hl 5 ASP Phe Gly Phe Pro Gin Glu Glu Phe Gly Asn Gin Phe Gin 35 40 45 Lys Ala Glu Thr rle Pro vai Leu ΗΪ S Glu Met lie Gin Gin He Phe 50 55 60 Asn 65 Leu Phe Ser Thr ?ss ASP ser Ser Ala Ala 75 Trp Asp Glu Thr Leu 60 Leu ASP Lys phe W Thr Glu Leu Tyr Gin »0 Gin Leu .Asn Asp Leu 95 Glu Ala Cys Vai ile Gin Gly val Gly val Thr Glu Thr pro Leu Met Lys 100 105 110 GlU ASP ser 115 lie Leu Ala Vai Í58 Lys Tyr Phe Gin Arg 123 11 e Thr Leu Tyr Leu 130 Lys Glu Lys Lys & ser Pro cys Ala i; s Glu val val Arg Ala 145 Glu rle Met ΑΓβ ser 150 phe ser Leu Ser Thr 15S Asn Leu Gin Glu ser 160 i_eu Arg ser Lys τ 1 π λr, π .„nSto de 2012 Lisboa, 27 de Ag 30/32
REFERENCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de referências citadas pelo Titular tem como único objectivo ajudar o leitor e não forma parte do documento de patente europeia. Ainda que na sua elaboração se tenha tido o máximo cuidado, não se podem excluir erros ou omissões e o EPO não assume qualquer responsabilidade a este respeito.
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• US UP4179337 A · EP 0809996 A
• US 4179337 A · CN 1243779 C
• EP 0593868 A
Literatura não-patente citada na descrição • Kenji Oritani; Paul W Kincade et al. Type I interferon and limitin: a comparison of structures, receptors, and functions Cytokine and Growth Factor Reviews, 2001, vol. 12, 337-348 • Yu-Sen Wang; Stephen Youngster et al. Structural and biological characterization of PEGylated recombinant interferon alpha-2b and its therapeutic implications
Advance Drug Delivery Reviews, 2002, vol. 54, 547-570 • Henco K. Brosius; F.J. et al. J. Mol. Biol., 19 85, vol. 185, 227-260 • Inada et al. J. Bioact. and Compatible Polymers, 1990, vol. 5, 343- • Delgado et al. Criticai Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 1992, vol. 9, 249 • Katre Advanced Drug Delivery Systems, 1993, vol. 10, 91 • Satake—Ishikawa et al. Cell Structure and Function, 1992, vol. 17, 157-160 31/32 • Katr et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1987, vol. 84, 1487 • Tsutsumi et al. Jpn. J. Câncer Res., 1994, vol. 85, 9 • Inoue et al. J. Lah. Clin. Med., 1994, vol. 124, 529 • Chamow et al. Bioconj. Chem., 1994, vol. 5, 133 • Monfardini et al. Bioconjugate Chem., 1995, vol. 6, 62 • Yu—Sen Wang et al. Advanced Drug Delivery Reviews, 2002, vol. 54, 547-570 • Yu-Sen Wang et al. Biochemistry, 2000, vol. 39, 10634-10640 • Laemmli et al. Nature, 1970, vol. 227, 680 • Pharmacopoeia of the People's Republic of China Appendix X C, 2005, vol. 3 • Determination Method of Interferon Activity (Pharmacopoeia of the People's Republic of China Appendix X C, 2005, vol. 3 32/32

Claims (10)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Um interferão-α peguilado (IFN-a2a) da estrutura como abaixo, obtido ao ligar IFN-a2a a um polietilenoglicol ramificado em forma de Y (YPEG):
    em que, Pa e Pb são polietilenoglicóis diferentes ou iguais (PEG); j é um número inteiro de 1 a 12; Ri é H, um grupo alquil C1-C12 substituído ou não substituído, um arilo substituído, um aralquilo ou um heteroalquilo; e Xi e X2 são grupos de ligação independentes, em que Xi é (CH2)n, e X2 é seleccionado do grupo que é composto por (CH2)n, (CH2)n OCO, (CH2) n NHCO, e (CH2) n CO, em que n é um número inteiro de 1 a 10, em que YPEG é ligado a IFN-cx2a mediante uma ligação amido formada pela cadeia lateral de grupo ε-amino do resíduo Lys no IFN-a2a correspondente à posição 134 na SEQ. ID n°.l.
  2. 2. O IFN-cx2a peguilado da reivindicação 1, com a estrutura como abaixo. O
    em que, R e R' são independentemente um grupo alquil C1-C4, preferencialmente metilo; j é um número inteiro de 1 a 12; m e m' indicam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro; m+m' é preferencialmente de 600 a 1500, e o peso molecular médio total do YPEG é de aproximadamente 10000 a 1/4 aproximadamente 60000 Dalton, mais preferivelmente aproximadamente 40000 Dalton.
  3. 3. O IFN-a2a peguilado de qualquer uma das reivindicações 1 e 2, em que o IFN-a2a é extraído de uma fonte natural ou obtido através de biotecnologia recombinante, preferencialmente com a sequência de aminoácidos como mostrada na SEQ. ID n°.1, mais preferivelmente é um IFN-a2a humano recombinante.
  4. 4. O IFN-a2a peguilado da reivindicação 3, e que o IFN-a2a humano recombinante é artificialmente sintetizado ou expressado de um sistema de expressão seleccionado do grupo que é composto por um sistema de expressão procariótico, tal como E. coli, um sistema de expressão de levedura eucariótica, tal como Pichia, um sistema de expressão de célula de insecto ou um sistema de expressão de célula mamífera, tal como CHO.
  5. 5. O IFN-a2a peguilado de qualquer uma das reivindicações 1-4, em que o YPEG é um YPEG, de braço igual, de peso molecular de 40000 Dalton.
  6. 6. Uma composição que compreende uma quantidade farmaceuticamente aceitável do IFN-cx2a peguilado de qualquer uma das reivindicações 1-5 e um suporte ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
  7. 7. A composição de acordo com a reivindicação 6, compreendendo ainda manitol, um aminoácido, cloreto de sódio e acetato sódico, em que o aminoácido é preferencialmente seleccionado do grupo que é composto por ácido aspártico, asparagina e glicina.
  8. 8. Uso do IFN-a2a peguilado de qualquer uma das reivindicações 1-5 ou a composição de acordo com a reivindicação 6 ou 7 na preparação de um medicamento para tratar uma doença que necessita de tratamento com IFN-a2a, em que a doença é preferencialmente seleccionada do grupo que é composto por 2/4 infecções víricas, por ex., hepatite B, hepatite C, hepatite D e condiloma acuminatum, tumores, por ex., leucemia de células pilosas, leucemia crónica mielóide, leucemia não Hodgkin de baixo grau de malignidade, linfólise mediada por células, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiplo, melanoma maligno, linfoma cutâneo de células T, papiloma laringeo, carcinoma de células renais recorrente ou metastático, doenças inflamatórias e doenças, por ex., esclerose múltipla, artrite, asma, fibrose cística e doença pulmonar intersticial, e trombocitémia relacionada com doenças mieloproliferativas.
  9. 9. Um método para preparar e purificar o IFN-a2a peguilado de qualquer uma das reivindicações 1-5, que inclui os passos: (a) sob uma condição alcalina, preferencialmente em pH 9,0, que permite PEG ramificado em forma de Y como mostrado na fórmula (I) abaixo para reagir com IFN-a2a, e obter o IFN-a2a peguilado;
    ROCH2CH2(OCH2CH2)m-0-CHICH2 |f CH2)j —C R OCH2 C H 2 (OCH2 CH 2) m’ “O CH,—C II O em que R e R' são independentemente um grupo alquil C1-C4, preferencialmente metilo; j é um número inteiro de 1 a 12; m e m' indicam o grau de polimerização e podem ser qualquer número inteiro, e m+m' é preferencialmente de 600 a 1500; (b) capturando os produtos de reacção obtidos na fase (A) com uma resina de troca aniónica, preferencialmente Q-Sepharose FF, e eluindo os produtos num gradiente de anião, preferencialmente num gradiente de ião cloreto, para obter produtos modificados; (c) eluindo os produtos de reacção capturados na fase (B) com uma resina de troca catiónica, preferencialmente SP-Sepharose FF, num gradiente de catião, preferencialmente num gradiente de ião sódio, e recolhendo cada pico separadamente: 3/4 (d) determinando a actividade do produto de cada pico, e seleccionando o pico correspondente ao produto de reacção com a actividade mais elevada.
  10. 10. O método de acordo com a reivindicação 9, em que o YPEG tem um peso molecular de 40 kD, e é preferencialmente um YPEG de braço igual, e mais preferencialmente o rácio de reacção molar do IFN-a2a e YPEG é 1:2. Lisboa, 27 de Agosto de 2012. 4/4
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CL2008002399A1 (es) 2007-08-16 2009-01-02 Pharmaessentia Corp Conjugado sustancialmente puro que posee una porcion polimerica, una porcion proteica (interferon alfa 2b) y un ligante alifatico de 1 a 10 atomos de carbono, util en el tratamiento de las hepatitis b o c.
US8597634B2 (en) 2007-09-04 2013-12-03 Biosteed Gene Expression Tech. Co., Ltd. Interferon alpha-2a modified by polyethylene glycol and methods of preparation thereof
PT2186830E (pt) 2007-09-04 2012-06-20 Biosteed Gene Expression Tech Co Ltd Interferão alfa 2b modificado com polietilenoglicol e método de preparação e aplicações do mesmo
EP2753348B1 (en) * 2011-09-05 2019-12-11 Hanmi Science Co., Ltd. Pharmaceutical compositions comprising an interferon alpha conjugate and gemcitabine for the treatment of cancer
EA037151B1 (ru) 2014-11-06 2021-02-11 Фармаэссентия Корпорейшн Способ лечения с использованием пегилированного интерферона
CN116120424A (zh) * 2022-06-06 2023-05-16 江苏靶标生物医药研究所有限公司 一种干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法及其应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US6610830B1 (en) * 1980-07-01 2003-08-26 Hoffman-La Roche Inc. Microbial production of mature human leukocyte interferons
US5382657A (en) * 1992-08-26 1995-01-17 Hoffmann-La Roche Inc. Peg-interferon conjugates
US5951974A (en) * 1993-11-10 1999-09-14 Enzon, Inc. Interferon polymer conjugates
JP2758154B2 (ja) * 1995-04-06 1998-05-28 エフ・ホフマン−ラ ロシユ アーゲー インターフェロンを含む液体製剤
TW517067B (en) 1996-05-31 2003-01-11 Hoffmann La Roche Interferon conjugates
CN1243779A (zh) 1998-07-31 2000-02-09 东莞中镇鞋材有限公司 纤维板及其制造方法
US6887462B2 (en) * 2001-04-09 2005-05-03 Chiron Corporation HSA-free formulations of interferon-beta
AU2003221291A1 (en) 2002-03-13 2003-09-22 Beijing Jiankai Technology Co., Ltd. Hydrophilic polymer derivate with y type branch and preparation method of it medical composite comprising above compound
WO2004039996A1 (en) * 2002-11-01 2004-05-13 Cadila Healthcare Limited Mthod for producing recombinant human interferon alpha 2b polypeptide in pichia pastoris
CA2503594C (en) * 2002-11-15 2011-05-10 Doris Brugger Positional isomers of peg ifn alpha 2a
US8597634B2 (en) 2007-09-04 2013-12-03 Biosteed Gene Expression Tech. Co., Ltd. Interferon alpha-2a modified by polyethylene glycol and methods of preparation thereof
PT2186830E (pt) * 2007-09-04 2012-06-20 Biosteed Gene Expression Tech Co Ltd Interferão alfa 2b modificado com polietilenoglicol e método de preparação e aplicações do mesmo

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Publication number Publication date
US20100239532A1 (en) 2010-09-23
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CN101636411B (zh) 2013-01-09
CA2698396A1 (en) 2009-03-12
US8597634B2 (en) 2013-12-03
PL2196475T3 (pl) 2012-10-31
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WO2009030065A1 (zh) 2009-03-12
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KR101483814B1 (ko) 2015-01-16
ES2386575T3 (es) 2012-08-23
ZA201001555B (en) 2010-11-24
DK2196475T3 (da) 2012-09-17
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