BR112015004022B1 - Aminoácidos modificados compreendendo um grupo azido - Google Patents

Abstract

AMINOACIDOS MODIFICADOS COMPREENDENDO UM GRUPO AZIDO. A presente invenção se refere aos aminoácidos modificados compreendendo um grupo azido, polipeptídeo, anticorpose conjugados que compreendem os aminoácidos modificadose métodos paraproduzir os polipeptídeos, anticorpose conjugados que compreendem os aminoácidos modificados. Os polipeptídeos, anticorpos e conjugados são úteis em métodos de tratamento e prevenção, em métodos de detecção e nos métodos de diagnóstico.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO

[0001] O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório de Patente de N° de série US61/696,087 intitulado "AMINOÁCIDOS MODIFICADOS" depositado em 31 de agosto de 2012, cuja totalidade é aqui incorporada a título de referência.

CAMPO

[0002] Os aminoácidos modificados, aqui fornecidos, compreendem um grupo azido, polipeptídeo, anticorpos e conjugados que compreendem os aminoácidos modificados e os métodos para produzir os polipeptídeos, anticorpos e conjugados que compreendem os aminoácidos modificados. Os polipeptídeos, anticorpos e conjugados são úteis em métodos de tratamento e prevenção, métodos de detecção e aos métodos de diagnóstico.

ANTECEDENTES

[0003] Os polipeptídeos produzidos são amplamente utilizados na terapia e aplicações de diagnóstico. Os anticorpos terapêuticos têm sido úteis por muitos anos, por exemplo, no tratamento de câncer e de condições inflamatórias. Os polipeptídeo terapêuticos também são utilizados para tratar e prevenir as condições do sangue e as infecções virais. Os polipeptídeo de diagnóstico têm sido utilizados com sucesso para identificar as células e os tecidos saudáveis e doentes in vivo.

[0004] Muitos polipeptídeo podem proporcionar a funcionalidade de direcionamento para células específicas. A afinidade seletiva de certos polipeptídeo pode ser utilizadacomo alvo para quase qualquer célula ou tecido desejado, por exemplo, uma célula que expressa um antígeno. Um polipeptídeo pode transportar uma molécula de carga útil para diminuir ou destruir a célula ou tecido alvo. Os polipeptídeos vêm sendo utilizado em terapia para doenças como o câncer, doenças inflamatórias, doenças autoimunes e em rejeição de transplantes.

[0005] Em certas aplicações terapêuticas os polipeptídeos estão ligados a escudos moleculares para aumentar o seu tempo de vida dentro de um organismo. Polipeptídeos também encontraram uso como diagnóstico. Estes polipeptídeos podem transportar um marcador para indicar a presença de um receptor alvo em uma célula ou em um tecido. Estas etiquetas são normalmente ligadas aos polipeptídeos por meio de ligações covalentes.

[0006] Até o momento, as técnicas de ligação dos polipeptídeos a entidades moleculares, tais como cargas moleculares, incluindo escudos moleculares e etiquetas, têm sido limitadas pela sua heterogeneidade no grau e na localização da ligação aos polipeptídeos, por seus baixos rendimentos e por perdas em atividade. Locais de conjugação típicos incluem locais aleatórios nas cadeias de polipeptídeos, por exemplo, aminas aleatórias nas cadeias laterais de aminoácidos, e o terminal-N de certas cadeias polipeptídicas. Em tais técnicas, alguns polipeptídeos podem estar ligados ao conjugado em um local, enquanto outos polipeptídeos estão ligados ao mesmo conjugado em outro local, e alguns polipeptídeo podemestar ligadosa nada.

[0007] Portanto, existe a necessidade, de polipeptídeos modificados em posições de locais específicos optimizados para uniformizar, o rendimento e/ou atividade para promover o uso promissor dopolipeptídeo, por exemplo, na terapia e no diagnóstico.

RESUMO

[0008] São fornecidos aqui aminoácidos modificados compreendendo um grupo azido, polipeptídeo, anticorpos e conjugados que compreendem os aminoácidos modificados e métodos para produzir os polipeptídeos, anticorpose conjugados que compreendem os aminoácidos modificados. Os polipeptídeos, anticorpos e conjugados são úteis em métodos de tratamento e prevenção, em métodos de detecção e nos métodos de diagnóstico.

[0009] Em um aspecto, um composto de acordo com a fórmula I é proporcionado:

ou um sal deste, em que: D é -Ar-W3- ou -W1-Y1-C(O)-Y2-W2-; Ar é

cada um de W1, W2, W3 é independentemente uma ligação simples ou alquileno inferior; cada X1, independentemente, é -NH-, -O-, ou -S-; cada Y1 é independentemente uma ligação simples, -NH-, ou -O-; cada Y2 representa independentemente uma ligação simples, -NH-, -O-, ou um pirrolidinileno N-ligado ou C-ligado; e um entre Z1, Z2, e Z3 é -N- e os outros de Z1, Z2, e Z3 são independentemente - CH-.

[0010] Em outro aspecto, os polipeptídeos eos anticorpos compreendendo um resíduo de aminoácido que corresponde a um composto de fórmula I são proporcionados. Em modalidades particulares, os conjugados de polipeptídeos e as cargas são fornecidos. Em outras modalidades, os conjugados de anticorpos e as cargas são fornecidos.

[0011] Em outro aspecto, um tRNA ortogonal aminoacilado é fornecido com um resíduo de aminoácido que corresponde a um composto de fórmula I. Em um aspectorelacionado, um método de produção de polipeptídeo é fornecido, compreendendo contatar um polipeptídeo com um tRNA ortogonal aminoacilado com um resíduo de aminoácido correspondente a um composto de fórmula I.

[0012] Os compostos de fórmula I aqui descritos podem ser incorporados em qualquer polipeptídeo conhecido dos versados na arte. Tais polipeptídeo incluem, mas não estão limitados a proteínas, anticorpos, fragmentos de anticorpos, enzimas e ácidos nucléicos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0013] A Figura 1 proporciona um esquema da reação dos compostos (30), (40) e (50) com o composto (60).

[0014] A Figura 2 proporciona um gráfico de kobs vs. [Azida] para reação do composto (30), composto (40) e composto (50) com o composto (60). Na Figura 2, kobs é representada no eixo vertical em unidades de sec-1 de 0 a 0,006 e [Azida] é representada no eixo horizontal em unidades de mM de 0 a 3. Na Figura 2, os resultados para o composto (30) são fornecidos como círculos abertos, os resultados para o composto (40) são fornecidos como triângulos cheios, e os resultados para o composto (50) são fornecidos como círculos cheios. Como representado na Figura 2, os compostos (30) e (40) exibiram uma constante de velocidade de primeira ordem de 1,4 M-1sec-1, aproximadamente 7 vezes maior do que a constante de velocidade de primeira ordem de 0,2 M-1 sec-1 para o composto (50).

[0015] A Figura 3 fornece um gráfico de um curso de tempo para a incorporação pAMF no local Y50TAG em GFP. Na Figura 3, RFU está representado graficamente no eixo vertical de 0 a 400000 e o tempo é representado no eixo horizontal em unidades de minutos entre 0 e 600. Na Figura 3, os resultados para turbo GFP são fornecidos como quadrados cheio (parte superior), os resultados para pCNFRS D286R pAMF são fornecidos como diamantes cheios (meio), e os resultados para Y50TAG são fornecidos como triângulos cheios (parte inferior). Como representado na Figura 3, turboGFP é de aproximadamente 250.000 RFU em 200 minutos, pCNFRS D286R pAMF é de aproximadamente 130.000 RFU em 200 minutos e Y50TAG é de aproximadamente 0 RFU em 200 minutos. Como representado na Figura 3, turbo GFP é de aproximadamente 340.000 RFU em 400 minutos, pCNFRS D286R pAMF é de aproximadamente 160.000 RFU em 400 minutos e Y50TAG é de aproximadamente 0 RFU em 400 minutos. Como representado na Figura 3, turbo GFP é de aproximadamente 370.000 RFU em 600 minutos, pCNFRS D286R pAMF é de aproximadamente 170.000 RFU em 600 minutos e Y50TAG é de aproximadamente 0 RFU em 600 minutos.

[0016] A Figura 4 proporciona um traçado da fração de DBCO-NH2 (61) remanescente em função do tempo (horas) durante uma reação com análogos dos aminoácidos (30), (1) e (2). Na Figura 4, a fração de DBCO-NH2 (61) restante é representada no eixo vertical em um valor adimensional de 0 a 1,2 e o tempo é representado no eixo horizontal em unidades de 0 horas a 20 horas. Na Figura 4, os resultados para o composto (30) são fornecidos como losangos cheios, os resultados para o composto (1) são fornecidos como quadrados cheios, e os resultados para o composto (2) são fornecidos como triângulos cheios. Como representado na Figura 4, os compostos (1) e (30) reagem com o composto (61) em taxas comparáveis, enquanto que a taxa de reação entre o composto (2) e composto (61) foi de duas a quatro vezes mais lenta do que a velocidade dereação entre os compostos (1) e (61) e os compostos (30) e (61).

DESCRIÇÃO DE MODALIDADES EXEMPLIFICATIVAS

[0017] Os compostos de fórmula I, polipeptídeo, anticorpos e conjugados que compreendem os resíduos de aminoácidos correspondentes para os compostos de fórmula I, e os métodos para produzir os polipeptídeos, anticorpos e conjugados compreendendo os resíduos de aminoácidos modificados correspondentes aos compostos de fórmula I são aqui proporcionados.

Definições

[0018] Ao se referir aos compostos aqui previstos, os seguintes termos têm os seguintes significados salvo indicação contrária. A menos que definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é normalmente entendido por um pessoa versada na arte. No caso em que existe uma pluralidade de definições para um termo aqui descrito, prevelecerá aquele indicado nesta seção a menos que seja indicado de outra forma.

[0019] O termo "alquil", tal como aqui utilizado, a menos que especificado de outra forma, se refere a uma um hidrocarboneto linear ou ramificado saturado. Em certas modalidades, o grupo alquil é um hidrocarboneto primário, secundário, ou terciário. Em certas modalidades, o grupo alquil inclui um a dez átomos de carbono, isto é, C1 a C10. Em certas modalidades, o grupo alquil é selecionado a partir do grupo que consiste em metil, CF3, CCl3, CFCl2, CF2Cl, etil, CH2CF3, CF2CF3, propil, isopropil, butil, isobutil, sec-butil, t-butil, pentil, isopentil, neopentil, hexil, iso-hexil, 3-metilpentil, 2,2-dimetilbutil e 2,3- dimetilbutil. O termo inclui ambos os grupos alquil substituídos e não substituídos, incluindo grupos alquil halogenados. Em certas modalidades, o grupo alquil é um grupo alquil fluorado. Exemplos não limitativos de radicais,com as quais o grupo alquil pode ser substituído, são selecionados do grupo que consiste em halogênio (flúor, cloro, bromo ou iodo), hidroxil, carbonil, sulfanil, amino, alquilamino, arilamino, alcóxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfônico, sulfato, ácido fosfônico, fosfato, ou fosfonato, tanto protegido como desprotegido conforme necessário, como conhecido por aqueles versados na arte, por exemplo, como ensinado em Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley e Sons, Segunda edição, 1991, aqui incorporada por referência.

[0020] O termo "alquil inferior", tal como aqui usado, e a menos que especificado de outra forma, se refere a um radical hidrocarboneto saturado linear ou ramificado tendo de um a seis átomos de carbono, isto é, C1 a C6. Em certas modalidades, o grupo alquil inferior é um hidrocarboneto primário, secundário, ou terciário. O termo inclui ambos os radicais substituídos e não substituídos.

[0021] O termo "cicloalquil", tal como aqui utilizado, a menos que especificado de outra forma, se refere a um hidrocarboneto cíclico saturado. Em certas modalidades, o grupo cicloalquil pode ser um anel saturado, e/ou em ponte, e/ou sem ponte, e/ou um grupo bicíclico fundido. Em certas modalidades, o grupo cicloalquil inclui três a dez átomos de carbono, isto é, cicloalquil C3 a C10. Em algumas modalidades, o cicloalquil tem de 3 a 15 (C3-15), de 3 a 10 (C3-10), ou entre 3 e 7 (C3-7) átomos de carbono.Em certas modalidades, o grupo cicloalquil é ciclopropil, ciclobutil, ciclopentil, ciclo-hexil, ciclo-hexilmetil, ciclo-heptil, biciclo [2.1.1] hexil, biciclo [2.2.1] heptil, decalinil ou adamantil. O termo inclui ambos os grupos cicloalquil substituídos e não substituídos, incluindo grupos cicloalquil halogenados. Em certas modalidades, o grupo cicloalquil é um grupo cicloalquil fluorado. Exemplos não limitativos de radicais com os quais o grupo cicloalquil pode ser substituído são selecionados a partir do grupo que consiste em halogênio (flúor, cloro, bromo ou iodo), hidroxil, carbonil, sulfanil, amino, alquilamino, arilamino, alcóxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfônico, sulfato, ácido fosfônico, fosfato, ou fosfonato, tanto protegido como desprotegido conforme a necessidade.

[0022] "Alquileno" se refere aos grupos de hidrocarbonetos alifáticos saturados divalentes, particularmente tendo uma a onze átomos de carbono que pode ser de cadeia linear ou ramificada. Em certas modalidades, o grupo alquileno contém de 1 a 10 átomos de carbono. O termo inclui tanto os radicais substituídos como os radicais não substituídos. Este termo é exemplificado por grupos tais como metileno (-CH2-), etileno (-CH2CH2-), os isómeros de propileno (por exemplo, -CH2CH2CH2- e -CH(CH3)CH2-) e similares. O termo inclui grupos alquileno halogenados. Em certas modalidades, o grupo alquileno é um grupo alquileno fluorado. Exemplos não limitativos de radicais com os quais o grupo alquileno pode ser substituído são selecionados a partir do grupo que consiste em halogênio (flúor, cloro, bromo ou iodo), hidroxil, carbonil, sulfanil, amino, alquilamino, alquilaril, arilamino, alcóxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfônico, sulfato, ácido fosfônico, fosfato, fosfonato e, tanto protegido ou desprotegido conforme necessário.

[0023] "Alquenil" se refere aos grupos monovalentes de hidrocarbonetos olefinicamente insaturados, em certa modalidade, contendo até cerca de 11 átomos de carbono, de 2 a 8 átomos de carbono, ou de 2 a 6 átomos de carbono, que pode ser de cadeia linear ou ramificada, tendo pelo menos 1, ou de 1 a 2 locais de insaturação olefínica. O termo inclui ambos os radicais substituídos e não substituídos. Exemplos de grupos alquenil incluem etenil (ou seja, de vinil, ou -CH=CH2), n-propenil(CH2CH=CH2), isopropenil (-C(CH3)=CH2), e semelhantes. O termo inclui grupos alquenil halogenados. Em certas modalidades, o grupo alquenil é um grupo alquenil fluorado. Exemplos não limitativos de radicais com os quais o grupo alquenil pode ser substituído são selecionados a partir do grupo que consiste em halogênio (flúor, cloro, bromo ou iodo), hidroxil, carbonil, sulfanil, amino, alquilamino, arilamino, alcóxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfônico, sulfato, ácido fosfônico, fosfato, ou fosfonato, tanto protegido como desprotegido conforme a necessidade.

[0024] O termo "cicloalquenil", tal como aqui utilizado, a menos que especificado de outra forma, se refere a um hidrocarboneto cíclico insaturado. Em certas modalidades, cicloalquenilse refere aos sistemas de anel mono- ou multicíclicos, que incluem pelo menos uma ligação dupla. Em certas modalidades, o grupo cicloalquenil pode ser uma ponte, ou não ponte, e/ou um grupo bicíclico fundido. Em certas modalidades, o grupo cicloalquil inclui três a dez átomos de carbono, isto é, cicloalquil C3 a C10. Em algumas modalidades, o cicloalquenil tem de 3 a 7 (C310), ou 4 a 7 (C3-7) átomos de carbono. O termo inclui ambos os grupos cicloalquenil substituídos e não substituídos, incluindo grupos cicloalquenil halogenados. Em certas modalidades, o grupo cicloalquenil é um grupo cicloalquenil fluorado. Exemplos não limitativos de radicais com os quais o grupo cicloalquenil pode ser substituído, são selecionados a partir do grupo que consiste em halogênio (flúor, cloro, bromo ou iodo), hidroxil, carbonil, sulfanil, amino, alquilamino, arilamino, alcóxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfônico, sulfato, ácido fosfônico, fosfato, ou fosfonato, tanto protegido como desprotegido conforme a necessidade.

[0025] "Alcenileno" se refere a grupos hidrocarboneto divalentes olefinicamente insaturados, em certas modalidades, possuindo até cerca de 11 átomos de carbono ou de 2 a 6 átomos de carbono o qual pode ser de cadeia linear ou ramificada e possuindo pelo menos 1, ou de 1 a 2 locais de insaturação olefínico. Este termo é exemplificado por grupos tais como etenileno (-CH=CH-), os isômeros de propenileno (por exemplo, -CH=CHCH2- e -C(CH3) =CH- e -CH=C(CH3)-) e similares. O termo inclui ambos os grupos alcenileno substituídos e não substituídos, incluindo grupos alcenileno halogenados. Em certas modalidades, o grupo alcenileno é um grupo alcenileno fluorado. Exemplos não limitativos de radicais com os quais o grupo alcenileno pode ser substituído são selecionados do grupo que consiste em halogênio (flúor, cloro, bromo ou iodo), hidroxil, carbonil, sulfanil, amino, alquilamino, arilamino, alcóxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfônico, sulfato, ácido fosfônico, fosfato, ou fosfonato, tanto protegido como desprotegido conforme a necessidade.

[0026] "Alquinil" se refere a grupos hidrocarboneto insaturados acetilenicamente, em certas modalidades, possuindo até cerca de 11 átomos de carbono ou de 2 a 6 átomos de carbono o qual pode ser de cadeia linear ou ramificada e possuindo pelo menos 1 ou de 1 a 2 locais de insaturação alquinil. Exemplos não limitativos de grupos alquinil incluem acetilênico, etinil (-C=CH),propargil (- CH2C=CH), e semelhantes. O termo inclui grupos alquinil substituídos e não substituídos, incluindo grupos alquinil halogenados. Em certas modalidades, o grupo alquinil é um grupo alquinil fluorado. Exemplos não limitativos de radicais com os quais o grupo alquinil pode ser substituído são selecionados a partir do grupo que consiste em halogênio (flúor, cloro, bromo ou iodo), hidroxil, carbonil, sulfanil, amino, alquilamino, arilamino, alcóxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfônico, sulfato, ácido fosfônico, fosfato, ou fosfonato, tanto protegido quanto desprotegido conforme a necessidade.

[0027] O termo "aril", tal como aqui utilizado e salvo especificação contrária, se refere ao fenil, bifenil ou naftil. O termo inclui ambos os radicais substituídos e não substituídos. Um grupo aril pode ser substituído com qualquer radical descrito, incluindo, mas não se limitando a uma ou mais radicais selecionados a partir do grupo que consiste em halogênio (flúor, cloro, bromo ou iodo), alquilo, haloalquilo, hidroxilo, amino, alquilamino, arilamino, alcóxi, ariloxi, nitro, ciano, ácido sulfónico, sulfato, ácido fosfónico, fosfato, ou fosfonato, tanto protegido quanto desprotegido conforme a necessidade, como conhecido por aqueles versados na arte, por exemplo, como ensinado em Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley e Sons, segunda edição, 1991.

[0028] “Alcóxi" refere-se ao grupo-OR' em que R' é alquil ou cicloalquil. Os grupos alcóxi incluem, a título de exemplo, metoxi, etoxi, n-propoxi, isopropoxi, n-butoxi, terc-butoxi, sec-butoxi, n-pentoxi, n-hexoxi, 1,2- dimetilbutoxi, e outros semelhantes.

[0029] "Alcoxicarbonilo" se refere a um radical - C(O)-alcóxiondealcóxiconforme aquidefinido.

[0030] "Amino" refere-se aoradical -NH2.

[0031] "Carboxilo" ou "carboxi" se referem ao radical -C(O)OH.

[0032] Os termos "alquilamino" ou “arilamino" se referem aum grupo amino que tem um ou dois substituintes alquil ou aril, respectivamente. Em modalidades, o substituinte alquil é alquil inferior. Em uma outra modalidade, o alquiloualquil inferior én ão substituído.

[0033] "Halogênio" ou "halo" se refere a cloro, bromo, flúorou iodo.

[0034] "Tioalcóxi" se refere ao grupo-SR'em que R' éalquiloucicloalquil.

[0035] O termo "heterociclil" ou "heterocíclicos" se refere a um sistema de anéis não aromáticos monocíclicos monovalentes e/ou sistema de anéis multicíclicos que contém pelo menos um anel não aromático, onde um ou mais dos átomos de anel não aromáticos são heteroátomos selecionados independentemente de O, S ou N; e os átomos restantes do anel são átomos de carbono. Em determinadas modalidades, o heterociclil ou o grupo heterocíclico tem de 3 a 20, de 3 a 15, de 3 a 10, de 3 a 8, de 4 a 7, ou de 5 a 6 átomos de anel. Os grupos de heterociclil estão ligados ao resto da molécula através do anel não aromáticos. Em determinadas modalidades, o heterociclil é um sistema de anéis monocíclico, bicíclico, triciclíco, tetracíclicos, que pode incluir um sistema de anéis fundidos ou em ponte, em que os átomos de nitrogênio ou enxofre podem ser opcionalmente oxidados, os átomos de nitrogênio podem ser opcionalmente quaternizado e alguns anéis podem ser parcialmente ou totalmente saturados, ou aromáticos. O heterociclil pode ser fixado à estrutura principal em qualquer heteroátomo ou átomo de carbono que resulta na criação de um composto estável. Exemplos de tais radicais heterocíclicos incluem, mas não estão limitados a azepinil, benzodioxanil, benzodioxolil, benzofuranonil, benzopiranonil, benzopiranil, benzotetrahidrofuranil, benzotetrahidrotienil, benzothiopiranil, benzoxazinil, β- carbolinil, cromanil, cromonil, cinnolinil, coumarinil, decahidroisoquinolinil, dihidrobenzisothiazinil, dihidrobenzisoxazinil, dihidrofuril, dihidroisoindolil, dihidropiranil, dihidropirazolil, dihidropirazinil, dihidropiridinil, dihidropirimidinil, dihidropirrolil, dioxolanil, 1,4-dithianil, furanonil, Imidazolinidil, imidazolinil, indolinil, isobenzotetrahidrofuranil, isobenzotetrahidrotienil, isocromanil, isocoumarinil, isoindolinil, isotiazolidinil, isoxazolidinil, morfolinil, octahidroindolil, octahidroisoindolil, oxazolidinonil, oxazolidinil, oxiranil, piperazinil, piperidinil, 4- piperidonil, pirazolidinil, pirazolinil, pirrolidinil, pirrolinil, quinuclidinil, tetrahidrofuril, tetrahidroisoquinolinil, tetrahidropiranil, tetrahidrotienil, thiamorfolinil, tiazolidinil, tetrahidroquinolinil e 1,3,5-trithianil. Em determinadas modalidades, os heterocíclicos também podem ser opcionalmente substituído conforme descrito neste documento.

[0036] O termo "heteroaril" se refere a um grupo aromático monocíclico monovalente e/ou grupo aromático multicíclicos que contêm pelo menos um anel aromático, no qual pelo menos um anel aromático contém um ou mais heteroátomos selecionados independentemente de O, S e N no anel. Os grupos de heteroaril estão ligados ao resto da molécula através do anel aromático. Cada anel de um grupo de heteroaril pode conter um ou dois átomos de O, um ou dois átomos de S, e/ou um a quatro átomos de N, desde que o número total de heteroátomos em cada anel seja quatro ou menos e que cada anel contenha pelo menos um átomo de carbono. Em determinadas modalidades, o heteroaril tem de 5 a 20, de 5 a 15 ou de 5 a 10 átomos do anel. Exemplos de grupos de heteroaril monocíclicos incluem, mas não estão limitados a furanil, imidazólicos, isotiazolil, isoxazolil, oxadiazolil, oxadiazolil, oxazolil, pirazinil, pirazolil, piridazinil, piridil, pirimidinil, pirrolil, tiadiazolil, tiazoil, tienil, tetrazolil, triazinil e triazolil. Exemplos de grupos de heteroaril bicíclicos incluem, mas não estão limitados a benzofuranil, benzimidazolil, benzoisoxazolil, benzopiranil, benzotiadiazolil, benzotiazolil, benzotienil, benzotriazolil, benzoxazolil, furopiridil, imidazopiridinil, imidazotiazolil, indolizinil, indol, indazolil, isobenzofuranil, isobenzotienil, isoindolil, isoquinolinil, isotiazolil, nafthiridinil, oxazolopiridinil, ftalazinil, pteridinil, purinil, piridopiridil, pirrolopiridil, quinolinil, quinoxalinil, quinazolinil, tiadiazolopirimidil e thienopiridil. Exemplos de grupos de heteroaril tricíclicos incluem, mas não estão limitados a acridinil, benzindolil, carbazolil, dibenzofuranil, perimidinil, fenantrolinil, fenantridinil, fenarsazinil, fenazinil, fenotiazinil, fenoxazinil e xanthenil. Em determinadas modalidades, heteroaril pode também ser opcionalmente substituído conforme descrito neste documento.

[0037] O termo "alquilaril" se refere a um grupo aril com um substituinte alquil. O termo "aralquil" ou "arilaquil" se refere a um grupo alquil com um substituinte aril.

[0038] O termo "grupo de proteção" neste documento e a menos que seja definido ao contrário se refere a um grupo que é adicionado a um átomo de oxigênio, nitrogênio ou fósforo para impedir suas reações adicionais ou para outros fins. Uma grande variedade de grupo de proteção de oxigênio e nitrogênio é conhecida por aqueles versados na arte da síntese orgânica.

[0039] "Sal farmaceuticamente aceitável" se refere a qualquer sal de um composto que conserva as suas propriedades biológicas e que não é tóxico, ou por outro lado que não seja indesejável para o uso farmacêutico aqui apresentado. Tais sais podem ser derivados de uma variedade de trocadores de íons orgânicos e inorgânicos conhecidos na arte. Tais sais incluem, mas não estão limitados aos sais de adição (1) ácido formados com ácidos orgânicos ou inorgânicos, tais como clorídrico, bromídrico, ácido sulfúrico,nítrico, fosfórico, sulfâmico, ácido acético, trifluoroacético, tricloroacético, propiônico, hexanôico, ciclopentilpropiônico, ácido glicólico, glutárico, pirúvico, láctico, malônico, succínico, sórbico, ascórbico, málico, maléico, fumárico, tartárico, cítrico, benzôico, 3- (4-hidroxibenzoil)benzôico, pícrico, cinâmico, manD élico, anidridos ftálico, láurico, metanossulfônico, etanesulfônico,2-etano-disulfônico, 2-hidroxietano- sulfônico, benzenossulfônico, 4-clorobenzenosulfônico, 2- naftalenossulfônico, 4-toluenossulfônico, canfótico, camforsulfônico, 4-metilbiciclo[2.2.2]-oct-2-eno-1- ccarboxílico,glucoheptônico, 3-fenilpropiciônico, trimetilacetico, tert-butilacético, ácido lauril sulfúrico, glucônico, benzôico, glutâmico, hidroxinaftôicos, salicílico, esteárico, ciclohexilsulfamico, quinico, ácido mucônico e os ácidos como; ou (2) base de adição de sais formados quando um próton ácido presente no composto pai, tanto (a) é substituído por um íon metálico, por exemplo, um íon de metal alcalino, um íon alcalino-terroso ou um íon de alumínio, ou metais alcalinos ou metais hidróxidos alcalinos terrosos, tais como sódio, potássio, cálcio, magnésio, alumínio, lítio, zinco e hidróxido de bário, amônia como (b) as coordenadas com uma base orgânica, tais como aminas orgânicas alifáticas, alicíclicas ou aromáticas, tais como amônia, metilamina, dimetilamina, dietilamina, picolina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, etilenodiamina, lisina, arginina, ornitina, colina, N,N'-dibenziletileno-diamina, cloroprocaína, dietanolamina, procaína, N-benzilfenetilamina,N- metilglucamina piperazina, tris (hidroximetil)-aminometano, hidróxido de tetrametilamônio e semelçhantes.

[0040] Sais farmaceuticamente aceitáveis também incluem, a título apenas de exemplo, sem se limitar ao sódio, potássio, cálcio, magnésio, amônio, tetraquilamôniae afins, e quando o composto contém uma funcionalidade básica, sais de ácidos orgânicos ou inorgânicos tóxicos, tais como hidrohalides, por exemplo, cloridrato e hidrobromide, sulfato, fosfato, sulfamato, nitrato, acetato, contra-íons, tricloroacetato, propionato, hexanoato, ciclopentilpropionato, ácido glicólico, glutarato, piruvato, lactato, malonato, succinato, sorbato, ascorbato, malato, maleato, fumarato, tartarato, citrato, benzoato, 3-(4-hidroxibenzoil)benzoato, picrato, cinamato, mandelato, ftalato, laurato, (mesilato) metanossulfonato, etanosulfonato, 1,2-etano-dissulfonato, 2- hidroxietanosulfonato, (besilato) benzenosulfonato, 4-clorobenzenosulfonato, 2-naftalenosulfonato, 4- toluenesulfonato, canforato,, camforsulfonato, 4- metilbiciclo[2.2.2]-oct-2-ene-1-carboxilato, glucoheptonato, 3-fenilpropionato, trimetilacetato, tert- butilacetato, lauril sulfato de sódio, gluconato, benzoato, glutamato, hidroxinaftoato, salicilato, estearato, ciclohexilsultanato, quinate, muconato e afins.

[0041] O termo "acil" ou "éstér O-ligado" se refere a um grupo da fórmula C(O)R‘, onde R‘ é alquil ou cicloalquil (incluindo alquil inferior), carboxilato de aminoácido, aril incluindo fenil, alquaril, arilalquil, incluindo benzil, alcóxialquil, incluindo metoximetil, ariloxialquil, tais como fenoximetil, ou alquil substituído (incluindo alquil inferior), incluindo fenil substituído opcionalmente com cloro, bromo, flúor, iodo, C1 a C4 alquil ou C1 a C4 alcóxi,ésteres de sulfonato,tais como alquiloouarilalquilsulfonilincluindometanossulfonil,mono, dioutrifosfato d éster, tritiloumonometoxi-tritil, benzil substituído, alcaril, arilalquilincluindo benzil, alcoxialquilincluindometoximetil, ariloxialquil, tal como fenoximetil. Os grupos arilonosésterescompreendemde forma ótimaumgrupo fenil. Em particular, os grupos acilincluem acetil, trifluoroacetil, metilacetil, ciclpropilacetil, propionil, butiril, hexanoíl, heptanoíl, octanoíl, neo- heptanoíl, fenilacetil, 2-acetoxi-2-fenilacetil,difenilacetil, α- metoxi-α-trifluorometil-fenilacetil, bromoacetil, 2-nitro-benzeneacetil, 4-cloro-benzeneacetil, 2-cloro-2,2-difenil-2-cloro-2-fenilacetil, trimetilacetil, clorodifluoroacetil, perfluoroacetil, fluoroacetil, bromodifluoroacetil, metoxiacetil, 2-tiofenoacetil, clorosulfonilacetil, 3-metoxifenilacetil, fenoxiacetil, terc-butilacetil, tricloroacetil, monocloro-acetil, dicloroacetil, 7H-dodecafluor-heptanoil, perfluor-heptanoil, 7H-dodeca-fluoroheptanoil, 7-clorododecafluoro- heptanoíl, 7-cloro-dodecafluoro-heptanoíl, 7H-dodecafluoroheptanoil, 7H-dodeca-fluoroheptanoil, nona- flúor-3,6-dioxa-heptanoíl, nonafluoro-3,6-dioxaheptanoil, perfluoroheptanoil, metoxibenzoil, 3-amino-5-feniltiofeno- 2-carboxílico, 3,6-dicloro-2-metoxi-benzoil, 4-(1,1,2,2- tetrafluoro-etoxi) -benzoil, 2-bromo-propionil, omega- aminocapril, decanoíl, n-pentadecanoíl, estearil, 3- ciclopentil-propionil, 1-benzeno-carboxil, O-acetilmandelyi, pivaloílacetil, 1-adamantano-carboxílico, ciclo-hexano-carboxílico, 2,6-piridinedicarboxil, ciclopropano-carboxil, ciclobutano-carboxil, carboxilperfluorociclohexil, 4-metilbenzoil, clorometil isoxazolilcarbonil,carboxiloperfluorociclohexil, crotonil, 1-metil-1H-indazole-3-carbonil, 2-propenilo, isovaleril, 1- pirrolidinocarbonil, 4-fenilbenzoíl.

[0042] O termo "aminoácido" se referea ocorrência natural e sintética de aminoácidos α, β, y ou δe inclui mas não está limitado aos aminoácidos encontrados nas proteínas, ou seja, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, fenilalanina, triptofano, prolina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, glutamina, aspartato, glutamato, lisina, arginina e histidina. Em determinadas modalidades, o aminoácido está na configuração L. Alternativamente, o aminoácido pode ser um derivado de alanil, valinil, leucinil, isoleuccinil, prolinil, fenilalaninil, triptofanil, metioninil, glicinil, serinil, threoninil, cisteinil, tirosinil, asparaginil, glutaminil, aspartoil, glutaroil, lisinil, argininil, histidinil, β-alanil, β-valinil, β-leucinil, β- isoleuccinil, β-prolinil, β-fenilalaninil, β-triptofanil, β-metioninil, β-glicinil, β-serinil, β-threoninil, β- cisteinil, β-tirosinil, β-asparaginil, β-glutaminil, β- aspartoil, β-glutaroil, β-lisinil, β-argininil ou β- histidinil.

[0043] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados permutavelmente neste documento para se referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Ou seja, uma descrição direcionada para um polipeptídeo se aplicaigualmente a uma descrição de um peptídeo e uma descrição de uma proteína e vice-versa. Os termos se aplicam para polímeros de aminoácidos naturais, bem como polímeros de aminoácidos em que um ou mais resíduos de aminoácidos é um aminoácido modificado. Além disso, tais "polipeptídeos", "proteínas" e "peptídeos" incluem cadeias de aminoácidos de qualquer comprimento, incluindo proteínas de comprimento total, em que os resíduos de aminoácidos são ligados por ligações peptídicas covalentes.

[0044] O termo "substancialmente isento de" ou "substancialmente na ausência de" no que diz respeito à uma composição de nucleosídios se refere a uma composição de nucleosídeos que inclui pelo menos 85 ou 90%, em peso, em determinadas modalidades 95%, 98%, 99% ou 100%, em peso, do enantiômero designado daquele nucleosídeo. Em determinadas modalidades, nos métodos e compostos aqui previstos, os compostos são substancialmente isentos dos enantiômeros.

[0045] Da mesma forma, o termo "isolado" no que diz respeito uma composição de nucleosídiosse refere a uma composição de nucleosídeo que inclui pelo menos 85, 90%, 95%, 98%, 99% a 100%, em peso, do nucleosídeo, o restante é constituído por outras espécies químicas ou enantiômeros.

[0046] "Solvato" se refere a um composto aqui previsto ou um sal, que inclui ainda uma quantidade estequiométrica ou não estequiométrica do solvente ligado pelas forças intermoleculares não covalentes. Onde o solvente é a água, o solvato é um hidrato.

[0047] "Composição isotópica" se referea quantidade de cada isótopo presente para um dado átomo, e "composição isotópica natural" se refere à composição isotópica natural ou abundância para um determinado átomo. Átomos contendo sua composição isotópica natural também podem ser referidos neste documento como átomos "não enriquecidos". A menos que seja designado ao contrário, os átomos dos compostos citados neste documento se destinama representar qualquer isótopo estável daquele átomo. Por exemplo, a menos que indicado ao contrário, quando uma posição é designada especificamente como "H" ou "hidrogênio", a posição é entendida ter hidrogênio em sua composição isotópica natural.

[0048] "Enriquecimento isotópico" se refere à percentagem de incorporação de uma quantidade de um isótopo específico em um determinado átomo em uma molécula no lugar de abundância isotópica natural do átomo. Por exemplo, enriquecimento de deutério de 1% em uma determinada posição significa que 1% das moléculas de uma determinada amostra contém deutério na posição especificada. Porque a distribuição de deutério que ocorre naturalmente é de cerca de 0,0156%, o enriquecimento de deutério em qualquer posição em um composto sintetizado usando matérias-primas não-enriquecida é de cerca de 0,0156%. O enriquecimento isotópico dos compostos aqui apresentados pode ser determinado usando os métodos analíticos convencionais, conhecidos por aquueles versados na arte, incluindo a espectrometria de massa e espectroscopia de ressonância magnética nuclear.

[0049] "Isotopicamente enriquecido" se refere a um átomo tendo uma composição isotópica diferente da composição isotópica natural daquele átomo. "isotopicamente enriquecido" também pode se referir a um composto que contenha pelo menos um átomo tendo uma composição isotópica diferente daquela da composição isotópica natural daquele átomo.

[0050] Como usado aqui, "alquil", "cicloalquil", "alquenil", "cicloalquenil", "alceno," "aril", "alcóxi", "alcoxicarbonil", "amino", "carboxila", "aquilamino", "arilamino", "tioalcóxi", "heterociclil", "heteroaril", "aquilheterociclil", "aquilheteroaril", "acil", "aralquil", "alquaril", "purina", "pirimidina," "carboxil" e "grupos de aminoácido" opcionalmente incluem deutério em uma ou mais posições onde os átomos de hidrogênio estão presentes, e no qual a composição do átomo ou átomos de deutério é diferente da composição isotópica natural.

[0051] Também como usado aqui, "alquil", "cicloalquil", "alquenil", "cicloalquenil", "alceno," "aril", "alcóxi", "alcoxicarbonil", "carboxil", "aquilamino", "arilamino", "tioalcóxi", "heterociclil", "heteroaril", "aquilheterociclil", "aquilheteroaril", "acil", "aralquil", "alquaril", "purina", "pirimidina," "carboxil" e "grupos de aminoácido" opcionalmente compreendem carbono-13 em uma quantidade que não seja a mesma da composição isotópica natural.

[0052] Como usado aqui, EC50 se refere a uma dosagem, concentração ou quantidade de um determinado composto teste que provoca uma resposta dose-dependente em 50% da expressão máxima de uma resposta particular que é induzida, provocada ou potencializada pelo composto teste específico.

[0053] Como usado aqui, o IC50 se refere a uma quantidade, concentração ou dosagem de um composto teste em particular que atinge uma inibição de 50% de uma resposta máxima em um ensaio que mede tal resposta.

[0054] O termo "hospedeiro" como usado aqui, se refere a quaisquer organismos unicelulares ou multicelulares, em que um vírus pode replicar, incluindo animais e linhas celulares e em determinadas modalidades, um ser humano. Alternativamente, um hospedeiro pode estar carregando parte de umgenoma viral, cuja replicação ou função pode ser alterada pelos compostos e composições aqui descritas. O termo hospedeiro inclui especificamente células infectadas, células transfectadas com todo ou parte de um genoma viral e animais, em particular, os primatas (incluindo os chimpanzés) e seres humanos. Em aplicações emanimais, o hospedeiro é um paciente humano. Em aplicações veterinárias, em certas indicações, no entanto, são claramente antecipadas pela presente divulgação (tais como os chimpanzés).

[0055] Como usado aqui, os termos "sujeito" e "paciente" são usados permutavelmente neste documento. Os termos “sujeito” e "sujeitos" se referem a um animal, como um mamífero incluindo um não primata (por exemplo, uma vaca, porco, cavalo, gato, cão, rato e rato) e um primata (ex., um macaco, tal como um macaco de cynomolgous, um chimpanzé e um humano) e por exemplo, um ser humano. Em determinadas modalidades, o sujeito é responsivo ou não responsivo a tratamentos atuais para infecção da hepatite C. Em outra modalidade, o assunto é um animal (por exemplo, um cavalo, uma vaca, um porco, etc.) ou um animal de estimação (por exemplo, um cão ou um gato). Em determinadas modalidades, o sujeito é um ser humano.

[0056] Como usado aqui, o termo "agente terapêutico" e "agentes terapêuticos" se referem a qualquer agente que pode ser usado no tratamento ou prevenção de uma doença ou um ou mais sintomas destes. Em determinadas modalidades, o termo "agente terapêutico" inclui um composto aqui apresentado. Em determinadas modalidades, um agente terapêutico é um agente que é conhecido por ser útil para ser usado, ou tem sido ou está sendo usado para o tratamento ou prevenção de uma doença ou de um ou mais sintomas deste.

[0057] "Quantidade terapeuticamente eficaz" se refere a uma quantidade de um composto ou composição que, quando administrados a um sujeito para tratar uma doença, é suficiente para efetuar tal tratamento para a doença. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" pode variar dependendo, nomeadamente, do composto, da doença e de sua gravidade, idade, peso, e etc, do sujeito a ser tratado.

[0058] "Tratamento" ou "trato" de qualquer doença ou distúrbio se refere, em determinadas modalidades, para atenuar uma doença ou distúrbio que existe em um sujeito. Em outra modalidade, "tratamento" ou "trato" inclui melhorar pelo menos um parâmetro físico, que pode ser imperceptível pelo sujeito. Em outra modalidade, o "tratamento" ou "trato" inclui modular a doença ou distúrbio, e também fisicamente (por exemplo, a estabilização de um sintoma aparente) ou fisiologicamente (por exemplo, a estabilização de um parâmetro físico) ou ambos. Em outra modalidade, "tratamento" ou "trato" inclui retardar o aparecimento da doença ou transtorno.

[0059] Como usado aqui, os termos “agente profilático" e "agentes profiláticos", como usados se referem a qualquer agente que pode ser usado na prevenção de uma doença ou um ou mais sintomas desta. Em determinadas modalidades, o termo "agente profilático" inclui um composto aqui apresentado. Em certas outras modalidades, o termo "agente profilático" não faz referência a um composto aqui apresentado. Por exemplo, um agente profilático é um agente que é conhecido por ser útil para ser usado, ou tem sido ou está sendo usado para prevenir ou impedir o início, o desenvolvimento, a progressão e/ou a gravidade de um transtorno.

[0060] Como usado aqui, a frase "quantidade profilaticamente efetiva" se refere a quantidade de uma terapia (por exemplo, agente profilático) que é suficiente para resultar na prevenção ou redução do desenvolvimento, recorrência ou surgimento de um ou mais sintomas associados com uma doença (ou para aumentar ou melhorar os efeitos profiláticos de outra terapia (por exemplo, outro agente profilático).

[0061] O termo "substancialmente pura" no que diz respeito a uma composição que compreende um resíduo aminoácido modificadose refere a uma composição que inclui pelo menos 80, 85, 90 ou 95%, em peso, ou, em determinadas modalidades, 95, 98, 99 ou 100%, em peso, por exemplo,peso seco, do resíduo aminoácido modificado em relação à parte restante da composição. A percentagem de peso pode ser em relação ao peso total de proteína na composição ou em relação ao peso total de resíduos de aminoácidos modificados na composição. A pureza pode ser determinada por técnicas conhecidas daqueles versados na arte.

[0062] O termo "anticorpos" se refere a qualquer macromolécula que seria reconhecida como um anticorpo por aqueles versados na arte. Os anticorpos compartilham propriedades comuns, incluindo a ligação e corrente de pelo menos uma cadeia polipeptídica que é substancialmente idêntica de uma cadeia de polipeptídeos que pode ser codificada por qualquer dos genes da imunoglobulina reconhecidos por aqueles versados na arte. Os genes das imunoglobulinas incluem, mas não estão limitados a K, À, α, Y (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4), δ, ε e μ genes da região constante, bem como os genes da região variável da imunoglobulina. O termo inclui anticorpos completos e fragmentos de anticorpos reconhecidos por aqueles versados na arte e suas variantes.

[0063] O termo "fragmento de anticorpo" se refere a qualquer forma de um anticorpo que não seja a forma de comprimento completo. Os fragmentos de anticorpos neste documento incluem anticorpos que são componentes menores que existem dentro de anticorpos completos e os anticorpos que têm sido projetados. Os fragmentos de anticorpos incluem, mas não estão limitados a Fv, Fc, Fab, e (Fab')2, cadeia única Fv (scFv), diabodies, triabodies, tetrabodies, anticorpos híbrido bifuncional, CDR1, CDR2 e CDR3, combinações de CDR’s, regiões variáveis, regiões de armação, regiões constantes e afins (Maynard & Gouveia, 2000, Daiane. Rev. Biomed. ENG. 2:339-76; Hudson, 1998, Curr. Opinião. Biotechnol. 9:395-402).

[0064] O termo "imunoglobulina (Ig)" se refere a uma proteína, que consiste de um ou mais polipeptídeos substancialmente codificados por um dos genes da imunoglobulina, ou uma proteína substancialmente idêntica aos mesmos na sequência de aminoácidos. As imunoglobulinas incluem, mas não estão limitadas aos anticorpos. As imunoglobulinas podem ter várias formas estruturais, incluindo, mas não se limitando aos anticorposde comprimento completo, fragmentos dos anticorpos e domínios individuais das imunoglobulinas incluindo, mas não se limitando a VH, CY1, CY2, CY3, VI e CL.

[0065] O termo "domínio de imunoglobulinas (Ig)" se refere a um domínio de proteínas consistindo de um polipeptídeo substancialmente codificado por um gene de imunoglobulina. Os domínios Ig incluem, mas não estão limitados a VH, CY1, CY2, CY3, VI e CL.

[0066] O termo "região variável" de um anticorpo se refere a um polipeptídeo ou polipeptídeos compostos de domínio de imunoglobulina VH,domínios de imunoglobulina VL ou domínios de imunoglobulina VH e VL. A região variável pode se referir a este ou estes polipeptídeos isoladamente, como um fragmento de Fv, como um fragmento de scFv, quando esta região se encontra no contexto de um fragmento de anticorpo maior, ou quando esta região se encontra no contexto de um anticorpo completo ou alternativamente, a estrutura molecular sem anticorpo.

[0067] O termo "variável" se refere ao fato de que certas partes dos domínios variáveis diferem extensivamente em sequência entre os anticorpos e são responsáveis para a especificidade da ligação de cada anticorpo específico para o antígeno particular. No entanto, a variabilidade não é uniformemente distribuída através dos domínios variáveis de anticorpos. Se concentrado em três segmentos chamados regiões determinantes de complementariedade (CDR’s) tanto em cadeia pesada quanto em cadeia leve de domínios variáveis. As porções mais conservadas dos domínios variáveis são chamadas as regiões de armação (FR). Os domínios variáveis de nativos pesado e cadeias leve, cada umacompreende quatro regiões de FR, em grande parte adotando uma configuração de folhaβ ligada por três ou quatro CDRs, que formam um elo de conexão e em alguns casos, formando parte da estrutura da folhaβ. Os CDRs em cada cadeia são mantidos juntos em estreita proximidade das regiões FR e, com os CDRs de outra cadeia, contribui para a formação do sítio de ligação do antígeno de anticorpos (ver Kabat et al., sequências de proteínas imunológicas utéis, 5a Ed. serviço de saúde pública, National Institutes of Health, Bethesda, Mariland (1991)).

[0068] Os domínios constantes normalmente não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas exibem várias funções efetoras. Dependendo da seqüência de aminoácidos da região constante das suas cadeias pesadas, anticorpos ou imunoglobulinas podem ser atribuídos a diferentes classes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM e várias destas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4; IgA1 e IgA2. As regiões constantes da cadeia pesada que correspondem a diferentes classes de imunoglobulinas são chamadas α, δ, ε, Y e μ, respectivamente. As várias classes de imunoglobulina humana, apenas humanas IgG1, IgG2, IgG3 e IgM são conhecidos para ativar o complemento.

[0069] O termo "conjugado" se refere a qualquer grupo que pode ser conectado a um resíduo de aminoácido modificado como descrito neste documento. Em algumas modalidades, os termos: "conjugado" e "carga" são usados de forma intercambiável. Um conjugado pode ser uma molécula pequena ou uma macromolécula. Em algumas modalidades, o conjugado é uma molécula Bioativa incluindo, mas não se limitando a uma proteína, um peptídeo, um ativo de ácidos nucléico ou um híbrido deste. Em algumas modalidades, o conjugado é um polímero como o glicol de polietileno. Em algumas modalidades, um conjugado é um agente terapêutico, incluindo uma droga comercialmente disponível. Em algumas modalidades, um conjugado é uma etiqueta que pode reconhecer e se ligar a alvos específicos, tais como uma carga molecular que é prejudicial para as células alvo ou uma etiqueta útil para detecção ou diagnóstico. Em algumas modalidades, o conjugado está ligado a um resíduo de aminoácido modificado através de um ligante. Em algumas modalidades, o conjugado está diretamente ligado a um resíduo de aminoácido modificado sem um ligante.

[0070] O termo "seqüência de proteína variante" se referea uma sequência de proteína que tem um ou mais resíduos que diferem em uma identidade aminoácida de outra seqüência de proteína semelhante. A dita seqüência de proteína semelhante pode ser a sequência de proteína natural tipo selvagem, ou outra variante da sequência do tipo selvagem. As variantes incluem proteínas que têm um ou mais inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos. As variantes incluem também proteínas que têm um ou mais aminoácidos modificados pós-translacionalmente.

[0071] O termo "anticorpo parental " se refere a um anticorpo conhecido por aqueles versados na arte que é modificado de acordo com a descrição aqui apresentada. A modificação pode ser física, ou seja, quimicamente ou bioquimicamente substituindo ou modificando um ou mais aminoácidos do anticorpo parental para produzir um anticorpo no âmbito da presentedescrição. A modificação também pode ser conceitual, ou seja, usando a seqüência de uma ou mais cadeias polipeptídicas do anticorpo parental para projetar um anticorpo que compreende um ou mais locais específicos dos aminoácidos modificadosde acordo com a presente descrição. Os anticorpos parentais podem ser anticorpos que ocorrem naturalmente ou anticorpos concebidos ou desenvolvidos em um laboratório. Os anticorpos parentais também podem ser anticorpos artificiais ou criados, por exemplo, anticorpos quiméricos ou humanizados.

[0072] O termo "variante modificada conservativamente" se refere a uma proteína que difere de uma proteína relacionada pelas substituições conservadoras na sequência de aminoácidos. Uma peesoa versda na arte reconhecerá que substituiçõesindividuais, supressões ou adição de um peptídeo, polipeptídeo ou seqüência da proteína que altera, adiciona ou exclui um único aminoácido ou uma pequena porcentagem de aminoácidos na seqüência codificada é uma "variante modificada conservativamente" onde a alteração resulta na substituição de um aminoácido com um aminoácido quimicamente semelhante. As tabelas de substituição conservatica fornecendo aminoácidos funcionalmente semelhantes são conhecidas na arte. Tais variante modificadas conservativamente estão em adição e não excluem as variantes polimórficas, homólogos entre espécies e alelos.

[0073] Noss oito grupos a seguir cada um contêm aminoácidos que são substituições conservadoras, um para o outro: 1) Alanina (A), Glicina (G); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W); 7) Serina (S), Treonina (T); e 8) Cisteína (C), Metionina (M). Veja, por exemplo, Creighton, proteínas: estruturas e propriedades moleculares, W H Freeman & Co.; 2a edição (dezembro de 1993).

[0074] Os termos "idênticos" ou "identidade", no contexto de duas ou mais sequências de polipeptídeos sereferem a duas ou mais seqüências ou subseqüências que são iguais. As seqüências são "substancialmente idênticas" se elas têm uma percentagem de resíduos de aminoácidos ou de nucleotídeos que são iguais (ou seja, cerca de 60% da identidade, opcionalmente, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90% ou cerca de 95% da identidade sobre uma região especificada), quando comparadas e alinhada para a máxima correspondência sobre uma janela de comparação ou uma região designada como medido usando um dos seguintes algoritmos de comparação ou pelo alinhamento manual eu inspeção visual. A identidade pode existir sobre a região que é pelo menos cerca de 50 aminoácidos ou nucleótideos de comprimento, ou sobre uma região que é de 75 a 100 aminoácidos ou nucleótideos de comprimento, ou, se não especificado, através de toda a sequência ou um polipeptídeo. No caso dos anticorpos, a identidade pode ser medida do lado de fora das CDRs variáveis. O alinhamento ideal das seqüências para comparação pode ser realizado, incluindo, mas não se limitando ao algoritmo de homologia localde Smith e Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, pela busca de método de similaridade de Pearson e Nat'l de proc. de Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444, pela implementações computadorizadas desses algoritmos ((GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.); ou pelo alinhamento manual e inspeção visual (ver, por exemplo, Ausubel et al, protocolos atuais em Biologia Molecular (suplemento de 1995)).

[0075] Exemplos de algoritmos que são adequados para a determinação percentagem de identidade da sequência de identidade e similaridade da seqüência incluem os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al. (1977) Nuc. Ácidos res 25:3389-3402 e Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. O software para realização das análises de explosão estápublicamente disponível através do National Center for Biotechnology Information. Os parâmetros do algoritmo de explosão W, T e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O programa BLASTN (para seqüências de nucleotídeos) usa como padrão um comprimento (W), de 11 palavras, uma expectativa (E) ou 10, M = 5, N =-4 e uma comparação de ambas as vertentes. Para as sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrão de comprimento 3palavras e a expectativa (E) de 10, e o alinhamento(B) de 50, BLOSUM62 scoring matrix (ver Henikoff e Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. US 89:10915), expectativa (E) de 10, M = 5, N =-4 e uma comparação de ambas as vertentes. O algoritmo BLAST geralmente é executado com o filtro de "baixa complexidade" desligado. Em algumas modalidades, o algoritmo de explosão geralmente é executado com o filtro de "baixa complexidade" ativado.

[0076] O algoritmo BLAST também realiza uma análise estatística da semelhança entre duas seqüências (ver, por exemplo, Karlin e Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre as duas seqüências de nucleotídeos ou aminoácidos poderia ocorrer por acaso. Por exemplo, um ácido nucléico é considerado semelhante a uma sequência de referência se a menor probabilidade de soma em comparação entre o teste de ácidos nucléicose o ácido nucléico de referência for menor do que cerca de 0,2, mais de preferência menor do que cerca de 0,01 e mais, de preferência menor do que aproximadamente 0,001.

[0077] O termo "aminoácido" se refere a aminoácidos que ocorrem naturalmente eaminoácidos que não ocorrem naturalmente, bem como aminoácidos,tais como a prolina, análogos de aminoácidos e aminoácidos miméticos que funcionam de forma semelhante aosaminoácidos que ocorrem naturalmente.

[0078] Aminoácidos codificados naturalmente são os aminoácidos proteinogênico conhecidos pelos versados na arte. Estes incluem 20 aminoácidos comuns (alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutâmico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina) e a pirrolisina menos comum e selenocisteína. Aminoácidos codificados naturalmente incluem variantes pós-translacional dos 22 aminoácidos que ocorrem naturalmente, tais como a aminoácidos prenilado, aminoácidos isoprenilado, aminoáciodo mirisoilado, aminoácidospalmitoilado, aminoácidos glicosilados N-ligado, aminoácidos glicosilados O-ligada aminoácidos, aminoácidos fosforilados e acilatado aminoácidos de ocorrência natural.

[0079] O termo "aminoácido modificado" se refere a um aminoácido que não é um aminoácidoproteinogênico ou uma variante modificada pós-translacionalmentedeste. Em particular, o termo se refere a um aminoácido que não é um dos 20 aminoácidos comuns ou pirrolisina ou selenocisteína ou variantes pós-translacionalmentemodificadas deste.

Compostos

[0080] São fornecidos aqui compostos de acordo com a fórmula I:

ou um sal deste, em que: D é-Ar-W3- ou-W1-Y1-C(O)Y2-W2-; Ar é

cada X1, independentemente, é -NH-, -O-, ou -S-; cada Y1 é independentemente uma ligação simples,-NH-, ou -O-; cada Y2 representa independentemente uma ligação simples, -NH-, -O-, ou um pirrolidinileno N-ligado ou C- ligado; e um de Z1, Z2, e Z3 é -N- e os outros de Z1, Z2, e Z3 são independentemente -CH-.

[0081] Em uma modalidade, D é -Ar-Ws-; e Ar e W3são conforme definidos no contexto da fórmula I. Em uma modalidade particular, D é -Ar-W3-; e o Ar é

eAr, Z1, Z2, Z3e W-3são definidos no contexto da fórmula I. Em determinadas modalidades, D é -Ar-W3-; e Ar é

eAr, Z1, Z3, X1e W3são definidos no contexto da fórmula I. Em determinadas modalidades, D é -Ar-W3-; W3 é -CH2-; e Ar é

Onde Z1 e Z2 são conforme definidos no contexto da fórmula I.

[0082] Em uma modalidade, D é-W -Y1-C(O)-Y2-W2-; e W2W1, Y1e Y2 são conforme definidos no contexto da fórmula I. Em certas modalidades, D é -W -Y1-C(O)-Y2-W2; e cada Y1 é independentemente -NH- ou -O-; e W1e W2, Y2 são conforme definidos no contexto da fórmula I. Em determinadas modalidades, D é-W-Y1-C(O)-Y2-W2; cada Y2é independente um pirrolidinileno N-ligados ou C-ligadoe cada W2 é uma ligação simples; e W1e Y1conforme definidos no contexto da fórmula I. Em uma modalidade particular, D é-W-Y1-C(O)-Y2- W2; cada Y2independente é uma ligação simples, -NH- ou -O-; e cada W2 é alquileno inferior; e W1e Y1 são definidos no contexto da fórmula I.

[0083] Em uma modalidade, um composto de acordo com a fórmula I é fornecido:

Onde D é definido no contexto da fórmula I.

[0084] Em uma modalidade, os compostos de uma das fórmulas I e Ia são fornecidas onde cada W2 e W3 é independente alquileno C1-C3. Em outra modalidade, os compostos de uma das fórmulas I e Ia são fornecidos onde cada W2 e W3 é independente alquileno C1-C2.

[0085] Em uma modalidade, um composto de acordo com a fórmula II é fornecido:

ou um sal, onde W4é alquileno C1- C10. Em uma outra modalidade, W4 é alquileno C1-C5. Em uma modalidade, W4é alquileno C1-C3. Em uma modalidade, W4 é alquileno C1.

[0086] Em uma modalidade, um composto de acordo com a fórmula 30 é fornecido:

ou um sal deste.

[0087] Em uma modalidade é fornecido um composto de acordo com qualquer uma das fórmulas 1-29 e 40:

ou um sal deste.

[0088] Em uma modalidade, fornecido com um resíduo de aminoácido correspondente a um composto de fórmula I, Ia, II, I-30 ou 40. Em uma modalidade, um conjugado é fornecido compreendendo um polipeptídeo que compreende um resíduo de aminoácido correspondente a um composto de fórmula I, Ia, II, I-30 ou 40, ligado a uma carga e, opcionalmente, compreendendo uma porção de ligação entre o anticorpo e a carga.

[0089] Em uma modalidade, um anticorpo é fornecido compreendendo um resíduo de aminoácido correspondente a um composto de fórmula I, Ia, II, I-30 ou 40. Em uma modalidade, um conjugado é fornecido compreendendo anticorpo que compreende um resíduo de aminoácido correspondente a um composto de fórmula I, Ia, II, I-30 ou 40, ligado a uma carga e, opcionalmente, compreendendo uma porção de ligação entre o anticorpo e a carga.

[0090] Em uma modalidade, uma tRNA ortogonal é fornecida aminoacilatada com um resíduo de aminoácido correspondente a um composto de fórmula I, Ia, II, I-30 ou 40. Em uma modalidade relacionada, é fornecido um método para produzir um polipeptídeo, compreendendo contatar um polipeptídeo com um aminoacilatado de tRNA ortogonal com um resíduo de aminoácido correspondente a um composto de fórmula I, Ia, II, I-30 ou 40 em condições adequadas para incorporar o resíduo de aminoácido no polipeptídeo. Em um aspecto, os pares de base do tRNA ortogonal com um codão que normalmente não está associado com um aminoácido. Em outro aspecto, o contato ocorre em uma mistura de reação que compreende uma sintetase tRNA capaz de aminoacilatar o tRNA ortogonal com um composto de fórmula I, Ia, II, I-30 ou 40.

[0091] Em determinadas modalidades, um polipeptídeo composto por um resíduo de aminoácido modificado é fornecido de acordo com qualquer uma das seguintes fórmulas, onde D é definido no contexto da fórmula I:

Aqueles versados na arte reconhecerão que as proteínas são geralmente compreendidas de L-aminoácidos. No entanto, com aminoácidos modificados, os presentes métodose composições fornecem ao prático a capacidade de usar aminoácidos modificados L, D ou racêmico. Em determinadas modalidades, os aminoácidos modificados aqui descritos incluem versões D dos aminoácidos naturais e versões racêmica dos aminoácidos naturais.

Reação de cicloadição de Huisgen

[0092] Vantajosamente, os aminoácidos modificados compreendem os grupos de azido, tais como compostos de acordo com qualquer uma das fórmulas I, Ia, II, 1-30 ou 40, aqui apresentada e os polipeptídeos compreendendo- osfacilita as reações de formas seletivas e eficientes com um segundo composto constituído por um grupo de alquino. Acredita-se que os grupos alquino e azido reagem em uma reação de cicloadição 1,3-dipolar para formar um radical 1,2,3-triazolileno que liga o aminoácido modificado (ou o polipeptídeo compreendendo o aminoácido modificado) para o segundo composto. Esta reação entre alquino e azido para formar um triazol é geralmente conhecida por aqueles versados na arte como uma reação de cicloadição de Huisgen.

[0093] A reatividade exclusiva dos grupos funcionais de alquino e azidose torna extremamente útil para a modificação seletiva de polipeptídeos e outras moléculas biológicas. Azidos orgânicos, particularmente alifáticas azidas e alcinos são geralmente estáveis na direção de condições comuns de químicas reativas. Em particular, tanto os grupos funcionais alquino como azido são inertes em direção as cadeias laterais (ou seja, gruposR) dos 20 aminoácidos comuns encontrados em polipeptídeos que ocorrem naturalmente. Quando aproximado, no entanto, a natureza de "mola" dos grupos alquino e azidofoi revelada e estes reagem seletivamente e eficientemente através de reação de cicloadição de Huisgen [3 + 2] para gerar o triazol correspondente. Veja, por exemplo, Chin J., et al., Science 301:964-7 (2003); Wang, Q., et al., J. am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Chin, J. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002).

[0094] Porque a reação de cicloadição de Huisgen envolve uma reação de cicloadição seletiva (ver, por exemplo, Padwa, A., COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS, Vol. 4, (Ed. Trost, B. M., 1991), p. 1069-1109; Huisgen, R. em 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMESTRY, (Ed. Padwa, A., 1984), p. 1-176), em vez de uma substituição nucleofílica, a incorporação de aminoácidos codificado não-naturalmente contendo cadeias laterais com alquino e azido permite que os polipeptídeos resultantes sejam modificado seletivamente na posição do aminoácido codificado não-naturalmente. A reação de cicloadição envolvendo azido ou compostos contendo alquino pode ser realizados à temperatura ambiente sob condições aquosas através da adição de Cu(II) (incluindo, mas sem se limitar, sob a forma de uma quantidade catalítica de CuSO4) na presença de um agente redutor para reduzir Cu(II) para Cu(I), in situ, em quantidade catalítica. Veja, por exemplo, Wang, Q., et al., J. am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003); Tornoe, W. C., et al., J. org. Chem. 67:3057-3064 (2002); Rostovtsev, et al., Angew. Chem. int. Ed. 41:2596-2599 (2002). Agentes redutores incluem, mas não se limitam a ascorbato, cobre metálico, quinino, hidroquinona, vitamina K, glutationa, cisteína, Fe2 +, Co2+e um potencial elétrico aplicado.

Polipeptídeos

[0095] Os polipeptídeos aqui fornecidos compreendem um ou mais resíduos de aminoácidos modificado em posições de local específico em uma sequência de aminoácidos pelo menos uma cadeia de polipeptídeos. Em uma modalidade, as composições são anticorpos que inclui um ou mais resíduos de aminoácidos modificados em posições específicas na seqüência de aminoácidos pelo menos uma cadeia de polipeptídeos.

[0096] O polipeptídeo pode compartilhar alta identidade de seqüência com qualquer polipeptídeo reconhecido por aqueles versados na arte, ou seja, um polipeptídeo parental. Em determinadas modalidades, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo é idêntica a sequência de aminoácidos do polipeptídeo parental, que não sejam os aminoácidos modificados em posições de local específico. Em outras modalidades, o polipeptídeo aqui apresentado pode ter um ou mais inserções, deleções ou mutações em relação ao polipeptídeo parental em adição a um ou mais aminoácidos modificadosem posições de local específico. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo aqui apresentado pode ter uma seqüência primária exclusiva, podendo ser reconhecido como um polipeptídeo por aqueles versados na arte. Em certos aspectos desta modalidade, o polipeptídeo é um anticorpo.

[0097] As composições e os métodos descritos neste documento fornecem para a incorporação de pelo menos um aminoácido modificado em um polipeptídeo. O aminoácido modificado pode está presente em qualquer local sobre o polipeptídeo, incluindo qualquer posição terminal ou qualquer posição interna do polipeptídeo. De preferência, o aminoácido modificado não destrói a atividade e/ou a estrutura terciária do polipeptídeo em relação ao aminoácido homólogo que ocorre naturalmentete, a menos que tal destruição da atividade e/ou estrutura terciária tenha sido um dos propósitos da incorporação do aminoácido modificado no polipeptídeo. Além disso, a incorporação do aminoácido modificado no polipeptídeo pode modificar em certa medida a atividade (por exemplo, manipular a eficácia terapêutica do polipeptídeo, melhorar o perfil de segurança do polipeptídeo, ajustar a farmacocinética, farmacológicas e/ou farmacodinâmicas do polipeptídeo (por exemplo, aumentar a solubilidade em água, biodisponibilidade, aumentar a meia-vida do soro, aumentar a meia vida terapêutica, modular a imunogenicidade, modular a atividade biológica ou estender o tempo de circulação)fornecer funcionalidade adicional ao polipeptídeo, incorporando uma etiqueta, rótulo ou sinal detectável no polipeptídeo, facilitar as propriedades de isolamento do polipeptídeo e qualquer combinação das modificações acima mencionadas) e/ou estrutura terciária do polipeptídeo em relação ao polipeptídeo homólogo do aminoácido que ocorre naturalmente sem causar uma destruição total da estrutura de atividade e/ou terciária. Tais modificações da atividade e/ou estrutura terciária são frequentemente um dos objetivos de efetuar tais modalidades, embora a modalidade do aminoácido modificado em polipeptídeo também pode ter pouco efeito sobre a atividade e/ou a estrutura terciária do polipeptídeo em relação ao polipeptídeo homólogao do aminoácido que ocorre naturalmente. Correspondentemente, os polipeptídeos de aminoácidos modificados, composições que compreende polipeptídeos de aminoácidos modificados, métodos para fazer tais polipeptídeos e composições de polipeptídeo, métodos para purificar, isolar e caracterizar tais polipeptídeos e composições dos polipeptídeos e métodos para usar tais polipeptídeos e composições do polipeptídeo são considerados como estando no âmbito da divulgação da presente invenção. Além disso, os polipeptídeos de aminoácidos modificados aqui descritos também podem ser ligados a outro polipeptídeo (incluindo, a título de exemplo, um polipeptídeo de aminoácido modificado ou um polipeptídeo de aminoácido que ocorre naturalmente).

[0098] Métodos, composições, estratégias e técnicas descritas neste documento não estão limitados a um determinado tipo, classe ou família de polipeptídeos ou proteínas. Na verdade, praticamente qualquer polipeptídeo pode incluir pelo menos um aminoácido modificado aqui descrito. A título de exemplo, apenas, o polipeptídeo pode ser homólogo a uma proteína terapêutica selecionada do grupo constituído por: Alfa-1 antitripsina, angiostatina, fator antihemolitico, anticorpo, apolipoproteína, apoproteína, fator atrial natriuretico, polipeptídeo natriurético atrial, peptídeo atrial, C- X-C quimeoquina, T39765, NAP-2, ENA-78, gro-a, gro-b, gro-c, IP-10, GCP-2, NAP-4, SDF-1, PF4, MIG, calcitonina, kit ligante c, citocinas, quimeoquina CC, monócitos quimiotático proteína- 1, monócitos quimiotático proteína-2, monócito quimiotático proteína-3, alfa de proteína-1 inflamatória monócito, monócito proteína-1 inflamatória beta, RANTES, 1309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262, CD40, CD40 ligante, kit ligante c, colágeno, fator de simulante de colônia (CSF), fator de complemento 5a, inibidor do complemento, receptor do complemento 1, citocinas, epiteliais neutrófilos de ativação do peptídeo -78, fator de crescimento, MIP-16, MCP-1, fator de crescimento epiD érmico (EGF), neutrófilos epiteliais ativando o peptídeo, eritropoietina (EPO), toxina esfoliante, fator IX, fator VII, fator VIII, fator X, fator de crescimento fibroblástico (FGF), fibrinogênio, fibronectina, proteína de quatro-hélice bundle, G-CSF, glp-1, GM-CSF, glucocerebrosidase, gonadotropina, fator de crescimento, receptor do fator de crescimento, grf, proteínas de porco- espinho, hemoglobina, fator de crescimento de hepatócito (hGF), hirudina, hormônio do crescimento humano (hGH), albumina de soro humano, ICAM-1, ICAM-1 receptor, LFA-1, receptor LFA-1, insulina, fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), IGF-I, IGF-II, interferon (IFN), IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma, interleucina (IL), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, fator de crescimento de queratinócitos (KGF), lactoferrina, fator inibitório de leucemia, luciferase, neurturin, fator inibitório dos neutrófilos (NIF), oncostatin M, proteína osteogênica, produto do oncogene, paracitonin, hormônio paratireóide, PD-ECSF, PDGF, hormônio peptídeo, pleiotropin, proteína A, proteína G, pth, pirogênicas exotoxin A, pirogênica exotoxina B, pirogênicas exotoxina C, pyy, relaxina, renina, SCF, proteínas biossintética pequenas, receptor complementar solúvel 1, solúvel em CAM-1 receptor interleucina solúvel, receptor solúvel TNF, somatomedina, somatostatina, somatotropina, estreptoquinase, superantigens, enterotoxina estafilocócica, SEA, SEB, SECT, SEC2, SEC3, SED, SEE, receptor do hormônio esteróide, superóxido dismutase, toxina da síndrome do choque tóxico, timosina alfa 1, ativador de plasminogênio tecidual, fator de crescimento tumoral (TGF), fator de necrose tumoral, fator de necrose tumoral alfa, fator de necrose tumoral beta, receptor de fator de necrose tumoral (TNFR), proteína VLA-4, proteína VCAM-1, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), uroquinase, mos, ras, raf, conhecido, p53, tat, fos, myc, jun, myb, rel, receptor do estrogênio, receptores de progesterona, receptores de testosterona, receptor de aldosterona, receptor LDL e corticosterona. Em uma modalidadeadicional relacionada, o polipeptídeo de aminoácido modificado também pode ser homólogo a qualquer elemento do polipeptídeo da família de intemperismo do hormônio do crescimento.

[0099] Em determinadas modalidades, os aminoácidos modificados podem está em qualquer posição dentro do polipeptídeo no terminal-N, terminal-C, ou dentro do polipeptídeo. Em modalidades vantajosas, os aminoácidos modificados são posicionados em locais selecionados, em um polipeptídeo. Esses locais são identificados como fornecedres de locais ideais para substituição com os aminoácidos modificados. Cada local é capaz de suportar um aminoácido modificado com ótima estrutura, função e/ou métodos para produzir o polipeptídeo.

[00100] Em determinadas modalidades, uma posição de local específico para substituição fornece um polipeptídeo que é estável. A estabilidade pode ser medida por qualquer um versado na arte.

[00101] Em determinadas modalidades, uma posição de local específico para substituição fornece um polipeptídeo que tem propriedades funcionais ótimas. Por exemplo, o polipeptídeo pode mostrar pouca ou nenhuma perda de ligação de afinidade pelo seu alvo em comparação com um polipeptídeo sem o aminoácido de local específico modificado. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo pode mostrar uma ligação avançada em comparação com um polipeptídeo sem o aminoácido de local específico modificado. Em certos aspectos desta modalidade, o polipeptídeo é um anticorpo e o alvo é um antígeno.

[00102] Em determinadas modalidades, uma posição de local específico para substituição fornece um polipeptídeo que pode ser feito vantajosamente. Por exemplo, em determinadas modalidades, o polipeptídeo mostra propriedades vantajosas em seus métodos de síntese, discutidos neste documento. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo pode mostrar pouca ou nenhuma perda de rendimento na produção em comparação com um polipeptídeo sem o aminoácido modificado de local específico. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo pode mostrar maior rendimento na produção em comparação com um polipeptídeo sem o aminoácido modificado de local específico. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo pode mostrar pouco ou nenhuma perda de supressão de tRNA, descrito neste documento, em comparação com um polipeptídeo sem o aminoácido modificado de local específico. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo pode mostrar supressão de tRNA reforçada, como descrito aqui, em produção comparada com um polipeptídeo sem o aminoácido modificado de local específico. Em certos aspectos desta modalidade, o polipeptídeo é um anticorpo.

[00103] Em determinadas modalidades, uma posição de local específico para substituição fornece um polipeptídeo que tem solubilidade vantajosa. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo pode mostrar pouca ou nenhuma perda de solubilidade em comparação com um polipeptídeo sem o aminoácido modificado de local específico. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo pode mostrar maior solubilidade em comparação com um polipeptídeo sem o aminoácido modificado de local específico. Em certos aspectos desta modalidade, o polipeptídeo é um anticorpo.

[00104] Em determinadas modalidades, uma posição de local específico para substituição fornece um polipeptídeo que tem expressão vantajosa. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo pode mostrar pouca ou nenhuma perda na expressão em comparação com um polipeptídeo sem o aminoácido modificado de local específico. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo pode mostrar maior expressão em comparação com um polipeptídeo sem o aminoácido modificado de local específico. Em certos aspectos desta modalidade, o polipeptídeo é um anticorpo.

[00105] Em determinadas modalidades, uma posição de local específico para substituição fornece um polipeptídeo que tem dobramento vantajoso. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo pode mostrar pouca ou nenhuma perda de dobramento adequado em comparação com um polipeptídeo sem o aminoácido modificado de local específico. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo pode mostrar dobradura melhorada em comparação com um polipeptídeo sem o aminoácido modificado de local específico. Em certos aspectos desta modalidade, o polipeptídeo é um anticorpo.

[00106] Em determinadas modalidades, uma posição de local específico para substituição fornece um polipeptídeo que é capaz de uma conjugação vantajosa. Conforme descrito neste documento, vários aminoácidos modificados têm cadeias laterais ou grupos funcionais que facilitam a conjugação do polipeptídeo para um segundo agente, diretamente ou através de um ligante. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo pode mostrar eficiência melhorada de conjugação em comparação com um polipeptídeo sem os mesmos ou outros aminoácidos modificados em outras posições. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo pode mostrar rendimento de conjugação melhorado em comparação com um polipeptídeo sem os mesmos ou outros aminoácidos modificados em outras posições. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo pode mostrar a especificidade de conjugação melhorada em comparação com um polipeptídeo sem os mesmos ou outros aminoácidos modificados em outras posições. Em certos aspectos desta modalidade, o polipeptídeo é um anticorpo.

[00107] Em determinadas modalidades, também é fornecido neste documento, variantes conservadoramente modificadas de polipeptídeos e anticorpos descritos neste documento. As Variantes conservadoramente modificadas de um polipeptídeo incluem um ou mais inserções, exclusões ou substituições que não perturbem a estrutura e/ou a função do polipeptídeo quando avaliada por uma pessoa versada na arte. Em determinadas modalidades, as variantes conservadoramente modificadas incluem 20 ou menos aminoácido inserções, exclusões ou substituições. Em determinadas modalidades, as variantes conservadoramente modificadas incluem 15 ou menos inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos. Em determinadas modalidades, as variantes conservadoramente modificadas incluem 10 ou menos inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos. Em determinadas modalidades, as variantes conservadoramente modificadas incluem 9 ou menos inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos. Em determinadas modalidades, as variantes conservadoramente modificadas incluem 8 ou menos inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos. Em determinadas modalidades, as variantes conservadoramente modificadas incluem 7 ou menos inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos. Em determinadas modalidades, as variantes conservadoramente modificadas incluem 6 ou menos inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos. Em determinadas modalidades, as variantes conservadoramente modificadas incluem 5 ou menos inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos. Em determinadas modalidades, as variantes conservadoramente modificadas incluem 4 ou menos inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos. Em determinadas modalidades, as variantes conservadoramente modificadas incluem 3 ou menos inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos. Em determinadas modalidades, as variantes conservadoramente modificadas incluem 2 ou menos inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos. Em determinadas modalidades, as variantes conservadoramente modificadas incluem 1inserção, exclusão ou substituição de aminoácidos. Em certas modalidades, as substituições são conservadoras, substituindo um aminoácido dentro da mesma classe, conforme descrito neste documento. Em certas modalidadeses, o polipeptídeo é um anticorpo.

[00108] Em determinadas modalidades, os polipeptídeos podem ser modificados para modular a estrutura, estabilidade e/ou atividade. Em tais modalidades, as modificações podem ser conservadoras ou outra sem serconservadoras. As modificações só precisam ser apropriadas para o prático realizar os métodos e usar as composições descritas neste documento. Em determinadas modalidades onde o polipeptídeo é um anticorpo, as modificações reduzem, mas não eliminam a afinidade de ligação do antígeno. Em determinadas modalidades onde o polipeptídeo é um anticorpo, as modificações aumentam a afinidade de ligação do antígeno. Em determinadas modalidades, as modificações melhoram a estrutura ou a estabilidade do polipeptídeo. Em determinadas modalidades, as modificações reduzem, mas não eliminam a estrutura ou a estabilidade do polipeptídeo. Em determinadas modalidades, variantes modificadas incluem 20 ou menos inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos. Em determinadas modalidades, variantes modificadas incluem 15 ou menos inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos. Em determinadas modalidades, variantes modificadas incluem 10 ou menos inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos. Em determinadas modalidades, variantes modificadas incluem 9 ou menos inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos. Em determinadas modalidades, variantes modificadas incluem 8 ou menos inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos. Em determinadas modalidades, variantes modificadas incluem 7 ou menos inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos. Em determinadas modalidades, variantes modificadas incluem 6 ou menos inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos. Em determinadas modalidades, variantes modificadas incluem 5 ou menos inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos. Em determinadas modalidades, variantes modificadas incluem 4 ou menos inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos. Em determinadas modalidades, variantes modificadas incluem 3 ou menos inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos. Em determinadas modalidades, variantes modificadas incluem 2 ou menos inserções, exclusões ou substituições de aminoácidos. Em determinadas modalidades, variantes modificadas incluem 1inserção, exclusão ou substituição de aminoácidos.

[00109] Também se encontra no âmbito as variantes pós-translacionalmente modificadas. Qualquer um dos polipeptídeos aqui fornecidos pós-translacionalmente pode ser modificado de qualquer forma conhecida por aqueles versados na arte. As modificações pós-translacionais típicas para polipeptídeos incluem ligação intercadeias de dissulfeto, ligação intercadeias de bissulfeto, glicolisação ligado-N e proteólise. São também aqui fornecidos outros polipeptídeospós-translacionalmente modificados tendo modificações como fosforilação, glicosilação ligado-O, metilação, acetilação, lipidação, GPI ancoragem, miristoilação e prenilação. A modificação pós-translacional pode ocorrer durante a produção, in vivo, in vitro ou de outra forma. Em determinadas modalidades, a modificação pós-translacional pode ser uma modificação intencional por um médico, por exemplo, usando os métodos fornecidos neste documento. Em certas modalidades, o polipeptídeo é um anticorpo.

[00110] Também incluídos no escopo são polipeptídeos fundidos para outros peptídeos ou polipeptídeos. Fusões exemplificativas incluem, mas não se limita a, por exemplo, um polipeptídeo de metionil, no qual uma metionina é ligada aoterminal-N do polipeptídeo resultante da expressão recombinante, fusões, com a finalidade de purificação (incluindo, mas não se limitando à poli-histidina ou afinidade do epítopos), fusões, para fins de ligação a outras moléculas biologicamente ativas, fusões com peptídeos de ligação de albumina de soroe fusões com proteínas do soro como a albumina. Os polipeptídeos podem incluir seqüências de clivagem de protease, grupos reativos, domínios de ligação de polipeptídeo (incluindo, mas não se limitando aFLAG ou poli-His) ou outras seqüências de afinidade com base (incluindo, mas não se limitando a FLAG, poli-His, GST, etc.). Os polipeptídeos também podem incluir moléculas ligadas (incluindo, mas não se limitando a biotina) que melhoram a detecção (incluindo, mas não se limitando a GFP), purificação ou outras características do polipeptídeo. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos compõem uma sequência de afinidade do terminal-C que facilitam a purificação de polipeptídeos de comprimento total. Em determinadas modalidades, tal sequência de afinidade do terminal-C é uma sequência poli-His, por exemplo, uma sequência 6-His. Em certas modalidades, o polipeptídeo é um anticorpo.

[00111] Os polipeptídeos que são conjugados para uma ou mais partes de conjugação também são fornecidos neste documento. A porção de conjugação pode ser qualquer porção de conjugação considerada útil para uma pessoa versada na arte. Por exemplo, a porção de conjugação pode ser um polímero, tais como o polietileno glicol, que pode melhorar a estabilidade do polipeptídeo in vitro ou in vivo. A porção de conjugação pode ter atividade terapêutica, gerando assim um conjugado de dorga de polipeptídeo. A porção de conjugação pode ser uma carga molecular que é prejudicial para as células alvo. A porção de conjugação pode ser uma etiqueta útil para detecção ou diagnóstico. Em determinadas modalidades, a porção de conjugaçãoé ligada ao polipeptídeo através de uma ligação covalente direta. Em determinadas modalidades, a porção de conjugaçãoé ligada do polipeptídeo via um ligante. Em modalidades vantajosas, o agrupamento de conjugação ou o ligante é ligado através de um dos aminoácidos modificados do polipeptídeo. Porções de conjudaçã Oe ligantes exemplares são aqui descritos. Em certas modalidades, o polipeptídeo é um anticorpo.

[00112] O polipeptídeo parental pode ser qualquer polipeptídeo conhecido por aqueles versados na arte, ou mais tarde descoberto, sem limitação. Em certas modalidades, o polipeptídeo é um anticorpo. O polipeptídeo parental pode ser substancialmente codificado pelo gene do polipeptídeo ou genes do polipeptídeo de qualquer organismo, incluindo, mas não se limitando aos seres humanos, ratos, ratos, coelhos, camelos, lhamas, dromedários, macacos, especialmente mamíferos e particularmente humanos e particularmente camundongos e ratos. Em uma modalidade, o polipeptídeo parental pode ser plenamente humano, obtidos, por exemplo, de um paciente ou sujeito, usando ratos transgênicos ou outros animais (Ver Bruggemann & Taussig, 1997, Curr. Opinião. Biotechnol. 8:455-458 para exemplos de anticorpo) ou bibliotecas de polipeptídeos humano juntamente com métodos de seleção (Ver Griffiths & Duncan, 1998, Curr. Opinião. Biotechnol. 9:102 a 108 para exemplos de anticorpo). O polipeptídeo parental pode ser de qualquer fonte, incluindo artificiais ou naturais. Por exemplo, um polipeptídeo parental pode ser um polipeptídeo produzido, incluindo, mas não se limitando aospolipeptídeos quiméricos e polipeptídeos humanizados (Ver Clark, 2000, Immunol. Today 21:397-402 para exemplos de anticorpo) ou derivado de uma biblioteca combinatorial. Além disso, o polipeptídeo parental pode ser uma variante projetada de um polipeptídeo que substancialmente é codificada por genes de um ou mais polipeptídeos naturais. Por exemplo, em uma modalidade o polipeptídeo parental é um polipeptídeo que foi identificado pela maturação de afinidade.

[00113] OS polipeptídeos parentais podem ser qualquer polipeptídeo conhecido na arte ou qualquer polipeptídeo desenvolvido por aqueles versados na arte sem limitação. Exemplos de anticorpo incluem, mas não estão limitados ao anticorpo anti-TNF (Patente US 6,258,562) anticorpo anti-IL-12 e/ou anti-IL-12p40 (Patente US 6,914,128); anticorpo anti-IL-18 (US patente publicação n° 2005/0147610), anti-05, anti-CBL, anti-CD147, anti-gp120, anti-VLA-4, anti-CD11a, anti-CD18, anti-VEGF, anti-CD40L, anti-CD-40 (veja por exemplo, a publicação PCT WO 2007/124299) anti-Id, anti-ICAM-1, anti-CXCL13, anti-CD2, anti-EGFR, anti-TGF-beta 2, anti-HGF, anti-cMet, anti DLL- 4, anti-NPR1, anti-PLGF, anti-ErbB3, anti-E-seletina, antiFact VII, gp anti-Her2/neu, anti-F, anti-CD11/18, anti- CD14, anti-ICAM-3, anti-RON, anti-SOST, anti-CD-19, anti- CD80 veja por exemplo, a publicação PCT WO 2003/039486) anti-CD4, anti-CD3, anti-CD23, anti-beta2-integrina, anti- alfa4beta7, anti-CD52, anti-HLA DR, anti-CD22 (por exemplo, ver o a patente US 5,789,554), anti-CD20, anti-MIF, anti- CD64 (FcR), anti-TCR alfa beta, anti-CD2, anti-Hep B, anti- CA 125, anti-EpCAM, anti-gp120, anti-CMV, anti-gpIIbIIIa, anti-IgE, anti-CD25, anti-CD33, anti-HLA, anti-IGF1,2, anti IGFR, anti-VNRintegrin, anti-IL-1alfa, anti-IL-1beta, anti- IL-1 receptor, anti-IL-2 receptor, anti-IL-4, anti-IL-4 receptor, anti-IL5, anti-IL-5 receptor, anti-IL-6, anti-IL- 8, anti-IL-9, anti-IL-13, receptor anti-IL-13, anti-IL-17, anti-IL-6R, anti-RANKL, anti-NGF, anti-DKK, anti- alfaVbeta3,anti-IL-17A, anti-IL23p19 e anti-IL-23 (veja, Presta, L. G. (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116: 731-6).

[00114] Os polipeptídeos parentais também podem ser selecionados de vários polipeptídeos terapêuticos aprovados para o uso em ensaios clínicos, ou em desenvolvimento para uso clínico. Exemplos de anticorpo de polipeptídeos, tais como terapêuticos incluem, mas não estão limitados a rituximab (Rituxan®, Roche/Genentech/IDEC) (ver, por exemplo, a patente US 5.736.137), um anticorpo quimérico anti-CD20 aprovado para tratar o linfoma não-Hodgkin; HuMax-CD20, um anti-CD20 atualmente está sendo desenvolvido pela Genmab, um anticorpo anti-CD20 descrito na patente US 5.500.362, AME-133 (Eevolução Molecular Aplicada), hA20 (Immunomedics, Inc.), HumaLYM (Intracel) e PRO70769 (PCT aplicação no. PCT/US2003/040426), Trastuzumabe (Herceptin ®, Genentech) (ver, por exemplo, a patente US 5.677.171), um anticorpo anti-Her2/neu humanizado, aprovado para tratar o câncer de mama; pertuzumabe (rhuMab- 2C4, Omnitarg®), atualmente sendo desenvolvido pela pela Genentech; um anticorpo anti-Her2 (patente US 4.753.894; cetuximab (Erbitux®, Imclone) (patente US 4.943.533; PCT WO 96/40210), um anticorpo quimérico anti-EGFR em ensaios clínicos para uma variedade de cânceres; ABX-EGF (patente US 6.235.883), atualmente sendo desenvolvido pela Abgenix- Immunex-Amgen; HuMax-EGFr (patente US 7.247.301), atualmente sendo desenvolvido pela Genmab; 425, EMD55900, EMD62000 e EMD72000 (Merck KGaA) (patente US 5.558.864; Murthy, et al. (1987) Arch Biochem. Referências. 252(2): 549-60; Rodeck, et al. (1987), J. Cells Bichem. 35(4): 31520; Kettleborough, et al. (1991) Protein Eng. 4(7): 77383); ICR62 (Institute of Cancer Research) (PCT WO 95/20045; Modjtahedi, et al. (1993) J. Cell Biophys. 22(1-3): 129-46; Modjtahedi, et al. (1993) Br. J. Cancer 67(2): 247-53; Modjtahedi, et al. (1996) ir. J. câncer 73(2): 228-35; Modjtahedi, et al. (2003) Int. J. câncer 105(2): 273-80); TheraCIM HR3 (YM Biosciences, Canadá e Centro de Immunologia Molecular, Cuba (patente US 5.891.996; patente US 6.506.883; Mateo, et al. (1997) Immunotechnol. 3(1): 71-81); mAb-806 (Ludwig Institute for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering) (Jungbluth, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100(2): 639-44); KSB-102 (KS Biomedix); MR1-1 (IVAX, National Cancer Institute) (PCT Publicação No. WO 01/62931A2); e SC100 (Scancell) (PCT Publicação No. WO 01/88138); alemtuzumab (Campath®, Millenium), um mAb humanizado atualmente aprovado para tratamento da leucemia linfocítica crônica de células B; Muromonab-CD3 (Orthoclone OKT3 ®), um anticorpo anti-CD3, desenvolvido pela Ortho Biotech/Johnson & Johnson, ibritumomab tiuxetan (Zevalin®), um anticorpo anti-CD20 desenvolvido pelo IDEC/Schering AG, Gentuzumab ozogamicina (Mylotarg®), um anticorpo anti-CD33 (proteína p67), desenvolvido pela Celltech/Wyeth, alefacept (Amevive®), uma fusão de Fc anti-LFA-3 desenvolvida pela Biogen), abciximab (ReoPro®), desenvolvido pela Centocor e Lilly, basiliximab (Simulect®), desenvolvido pela Novartis, palivizumab (Synagis®), desenvolvido por Medimmune, infliximab (Remicade®), um anticorpo anti-TNFα, desenvolvido pela Centocor, adalimumab (Humira®), um anticorpo anti-TNFα, desenvolvido pela Abbott, Humicade®, um anticorpo anti- TNFα, desenvolvido pela Celltech, golimumab (CNTO-148), um anticorpo TNF totalmente humano desenvolvido pela Centocor, etanercept (Enbrel®), um receptor TNF p75 fusão Fc desenvolvido pela Immunex/Amgen, Ienercept, um receptor de p55TNF fusão Fc anteriormente desenvolvido pela Roche, ABX- CBL, um anticorpo anti-CD147 sendo desenvolvido pela Abgenix, ABX-IL8, um anticorpo anti-IL8 sendo desenvolvido pela Abgenix, ABX-MA1, um anticorpo anti-MUC18 sendo desenvolvido pela Abgenix, Pemtumomab (R1549, 90Y-muHMFG1), um anti-MUC1 sendo desenvolvido pela Antisoma, Therex (R1550), um anticorpo anti-MUC1 sendo desenvolvido pela Antisoma, AngioMab (AS1405), sendo desenvolvido pela Antisoma, HuBC-1, sendo desenvolvido pela Antisoma, Thioplatin (AS1407) sendo desenvolvido pela Antisoma, Antegren ® (natalizumab), um anti-alfa-4-beta-1 (VLA-4) e alfa-4-beta-7 anticorpo sendo desenvolvido pela Biogen, MAb VLA-1, um anticorpo anti-VLA-1 integrina sendo desenvolvido pela Biogen, LTBR mAb, anticorpos anti-linfotoxina beta do receptor (LTBR) sendo desenvolvido pela Biogen, CAT-152, um anti-TGF -β anticorpo, sendo desenvolvido pela Cambridge Antibody Technology, ABT 874 (J695), um anticorpo anti-IL- 12 p40 sendo desenvolvido pela Abbott, CAT-192, um anticorpo anti-TGFβ1 sendo desenvolvido pela Cambridge Antibody Technology e Genzyme, CAT-213, um anticorpo anti- Eotaxin1 sendo desenvolvido pela Cambridge Antibody Technology, LymphoStat-B® um anti-Blys sendo desenvolvido pela Cambridge Antibody Technology e Human Genome Sciences Inc., TRAIL-R1 mAb, um anti-TRAIL-R1 sendo desenvolvido pela Cambridge Antibody Technology e Human Genome Sciences, Inc., Avastin® bevacizumab, rhuMAb-VEGF), um anti-VEGF sendo desenvolvido pela Genentech, um receptor da maília anti-HER sendo desenvolvido pela Genentech, Anti-Tissue Fator (ATF), umfator anti-Tissue sendo desenvolvido pela Genentech, Xolair® (Omalizumab), um anti-IgE sendo desenvolvido pela Genentech, Raptiva® (Efalizumab), um anti-CD11a sendo desenvolvido pela Genentech e Xoma, MLN-02 Antibody (formerly LDP-02), sendo desenvolvido pela Genentech e Millenium Pharmaceuticals, HuMax CD4, um anti- CD4 sendo desenvolvido pela Genmab, HuMax-IL15, um anti- IL15 sendo desenvolvido pela Genmab e Amgen, HuMax-Inflam, sendo desenvolvido pela Genmab e Medarex, HuMax-Cancer, um anti-Heparanase I sendo desenvolvido pela Genmab e Medarex e Oxford GcoSciences, HuMax-Lymphoma, sendo desenvolvido pela Genmab e Amgen, HuMax-TAC, sendo desenvolvido pela Genmab, IDEC-131, e anti-CD40L sendo desenvolvido pela IDEC Pharmaceuticals, IDEC-151 (Clenoliximab), um anti-CD4 sendo desenvolvido pela IDEC Pharmaceuticals, IDEC-114, um anti- CD80 sendo desenvolvido pela IDEC Pharmaceuticals, IDEC- 152, um anti-CD 23 sendo desenvolvido pelo IDEC Pharmaceuticals, anti-macrophage migration fator (MIF) anticorpos sendo desenvolvido pela IDEC Pharmaceuticals, BEC2, um anticorpo anti-idiotypic sendo desenvolvido pela Imclone, IMC-1C11, um anticorpo anti-KDR sendo desenvolvido pela Imclone, DC101, um anticorpo anti-flk-1 sendo desenvolvido pela Imclone, anticorpos anti-VE cadherin sendo desenvolvido pela Imclone, CEA-Cide® (Iabetuzumab), um anti-carcinoembryonic antigeno (CEA) anticorpo sendo desenvolvido pela Immunomedics, LymphoCide® (Epratuzumab), um anti-CD22 anticorpo sendo desenvolvido pela Immunomedics, AFP-Cide, sendo desenvolvido pela Immunomedics, MyelomaCide, sendo desenvolvido pela Immunomedics, LkoCide, sendo desenvolvido pela Immunomedics, ProstaCide, sendo desenvolvido pela Immunomedics, MDX-010, um anti-CTLA4 anticorpo sendo desenvolvido pela Medarex, MDX-060, um anti-CD30 anticorpo sendo desenvolvido pela Medarex, MDX-070 sendo desenvolvido pela Medarex, MDX-018 sendo desenvolvido pela Medarex, Osidem® (IDM-1), e anti-Her2 anticorpo sendo desenvolvido pela Medarex e Immuno-Designed Molecules, HuMax®-CD4, um anti-CD4 anticorpo sendo desenvolvido pela Medarex e Genmab, HuMax-IL15, um anti-IL15 anticorpo sendo desenvolvido pela Medarex e Genmab, CNTO 148, um anti-TNFα anticorpo sendo desenvolvido pela Medarex e Centocor/J&J, CNTO 1275, um anti-cytokine anticorpo sendo desenvolvido pela Centocor/J&J, MOR101 e MOR102, anti-intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) (CD54) anticorpos sendo desenvolvido pela MorphoSys, MOR201, um anti-fibroblast growth fator receptor 3 (FGFR-3) anticorpo sendo desenvolvido pela MorphoSys, Nuvion® (visilizumab), um anti-CD3 anticorpo sendo desenvolvido pela Protein Design Labs, HuZAF®, um anti-gamma interferon anticorpo sendo desenvolvido pela Protein Design Labs, Anti-α 5 β1 Integrin, sendo desenvolvido pela Protein Design Labs, anti-IL-12, sendo desenvolvido pela Protein Design Labs, ING-1, um anti-Ep-CAM anticorpo sendo desenvolvido pela Xoma, Xolair® (Omalizumab) a humanized anti-IgE anticorpo developed by Genentech e Novartis, e MLN01, um anti-Beta2 integrin anticorpo sendo desenvolvido pela Xoma. In another embodiment, the therapeutics include KRN330 (Kirin); huA33 anticorpo (A33, Ludwig Institute for Cancer Research); CNTO 95 (alpha V integrins, Centocor); MEDI-522 (alpha Vβ3integrin, Medimmune); volociximab (alpha Vβ1 integrin, Biogen/PDL); Human mAb 216 (B cell glycosolated epitope, NCl); BiTE MT103 (bispecific CD19XCD3, Medimmune); 4G7XH22 (Bispecific BcellxFcgammaRl, Medarex/Merck KGa); rM28 (Bispecific CD28XMAPG, EP Patent No. EP1444268); MDX447 (EMD 82633) (Bispecific CD64XEGFR, Medarex); Catumaxomab (removab) (Bispecific EpCAMx anti-CD3, Trion/Fres); Ertumaxomab (bispecific HER2/CD3, Fresenius Biotech); oregovomab (OvaRex) (CA-125, ViRexx); Rencarex® (WX G250) (carbonic anhidrase IX, Wilex); CNTO 888 (CCL2, Centocor); TRC105 (CD105 (endoglin), Tracon); BMS-663513 (CD137 agonist, Brystol Myers Squibb); MDX-1342 (CD19, Medarex); Siplizumab (MEDI-507) (CD2, Medimmune); Ofatumumab (Humax- CD20) (CD20, Genmab); Rituximab (Rituxan) (CD20, Genentech); veltuzumab (hA20) (CD20, Immunomedics); Epratuzumab (CD22, Amgen); lumiliximab (IDEC 152) (CD23, Biogen); muromonab-CD3 (CD3, Ortho); HuM291 (CD3 fc receptor, PDL Biopharma); HeFi-1, CD30, NCl); MDX-060 (CD30, Medarex); MDX-1401 (CD30, Medarex); SGN-30 (CD30, Seattle Genentics); SGN-33 (Lintuzumab) (CD33, Seattle Genentics); Zanolimumab (HuMax-CD4) (CD4, Genmab); HCD122 (CD40, Novartis); SGN-40 (CD40, Seattle Genentics); Campath1h (Alemtuzumab) (CD52, Genzyme); MDX-1411 (CD70, Medarex); hLL1 (EPB-1) (CD74.38, Immunomedics); Galiximab (IDEC-144) (CD80, Biogen); MT293 (TRC093/D93) (cleaved collagen, Tracon); HuLuc63 (CS1, PDL Pharma); ipilimumab (MDX-010) (CTLA4, Brystol Myers Squibb); Tremelimumab (Ticilimumab, CP-675,2) (CTLA4, Pfizer); HGS-ETR1 (Mapatumumab) (DR4TRAIL-R1 agonist, Human Genome Science/Glaxo Smith Kline); AMG-655 (DR5, Amgen); Apomab (DR5, Genentech); CS-1008 (DR5, Daiichi Sankyo); HGS-ETR2 (lexatumumab) (DR5TRAIL-R2 agonist, HGS); Cetuximab (Erbitux) (EGFR, Imclone); IMC-11F8, (EGFR, Imclone); Nimotuzumab (EGFR, YM Bio); Panitumumab (Vectabix) (EGFR, Amgen); Zalutumumab (HuMaxEGFr) (EGFR, Genmab); CDX-110 (EGFRvIII, AVANT Immunotherapeutics); adecatumumab (MT201) (Epcam, Merck); edrecolomab (Panorex, 17-1A) (Epcam, Glaxo/Centocor); MORAb-003 (folate receptor a, Morphotech); KW-2871 (ganglioside GD3, Kyowa); MORAb-009 (GP-9, Morphotech); CDX-1307 (MDX-1307) (hCGb, Celldex); Trastuzumab (Herceptin) (HER2, Celldex); Pertuzumab (rhuMAb 2C4) (HER2 (DI), Genentech); apolizumab (HLA-DR beta chain, PDL Pharma); AMG-479 (IGF-1R, Amgen); anti-IGF-1R R1507 (IGF1-R, Roche); CP 751871 (IGF1-R, Pfizer); IMC-A12 (IGF1- R, Imclone); BIIB022 (IGF-1R, Biogen); Mik-beta-1 (IL-2Rb (CD122), Hoffman LaRoche); CNTO 328 (IL6, Centocor); AntiKIR (1-7F9) (Killer cell Ig-like Receptor (KIR), Novo); Hu3S193 (Lewis (y), Wyeth, Ludwig Institute of Cancer Research); hCBE-11 (LTβR, Biogen); HuHMFG1 (MUC1, Antisoma/NCl); RAV12 (N-linked carbohidrate epitope, Raven); CAL (parathyroid hormone-related protein (PTH-rP), University of California); CT-011 (PD1, CureTech); MDX-1106 (ono-4538) (PD1, Medarex/Ono); MAb CT-011 (PD1, Curetech); IMC-3G3 (PDGFRa, Imclone); bavituximab (phosphatidylserine, Peregrine); huJ591 (PSMA, Cornell Research Foundation); muJ591 (PSMA, Cornell Research Foundation); GC1008 (TGFb (pan) inhibitor (IgG4), Genzyme); Infliximab (Remicade) (TNFa, Centocor); A27.15 (transferrin receptor, Salk Institute, INSERN WO 2005/111082); E2.3 (transferrin receptor, Salk Institute); Bevacizumab (Avastin) (VEGF, Genentech); HuMV833 (VEGF, Tsukuba Research Lab, PCT Publication No. WO/2000/034337, University of Texas); IMC- 18F1 (VEGFR1, Imclone); IMC-1121 (VEGFR2, Imclone).

[00115] Em determinadas modalidades, os polipeptídeos aqui fornecidos compreendem um aminoácido modificado em uma posição de local específico. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos aqui fornecidos compreendem dois aminoácidos modificados em posições de local específico. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos aqui fornecidos compreendem três aminoácidos modificados em posições de local específico. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos aqui fornecidos compreendem três aminoácidos modificados em posições de local específico.

Anticorpos

[00116] Em certasmodalidades, são aqui fornecidos anticorpos que inclui um ou mais polipeptídeos que compõem um ou mais aminoácidos modificados conforme descrito neste documento. Em determinadas modalidades, o anticorpo é uma heterotetramer composto por duas cadeias leves idênticas (L) e duas cadeias pesadas idênticas (H). Cada cadeia leve pode ser ligada a uma cadeia pesada por uma ligação de bissulfeto covalente. Cada cadeia pesada pode ser ligada à cadeia pesada por uma ou mais ligações de bissulfeto covalente. Cada cadeia pesada e cada cadeia leve também podem ter uma ou mais ligações de bissulfeto intracadeia. Como é conhecido por aqueles versados na arte, cada cadeia pesada normalmente compreende um domínio variável (VH) seguido de um número de domínios constantes. Cada cadeia leve normalmente compreende um domínio variável em uma extremidade (VL) e um domínio constante. Como é conhecido por aqueles versados na arte, os anticorpos normalmente têm afinidade seletiva para suas moléculas-alvo, ou seja, antígenos.

[00117] Os anticorpos fornecidos neste documento podem ter qualquer forma de polipeptídeos conhecida por aqueles versados na arte. Eles podem ser completos ou ser fragmentos. Anticorpos completos exempleficativos compreendem IgA, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, etc. Fragmentos exemplificativos incluem Fv, Fab, Fc, sFv, etc.

[00118] Um ou mais aminoácidos modificados podem ser localizados em posições de local específico selecionados de pelo menos uma cadeia de polipeptídeo de um anticorpo. A cadeia de polipeptídeos pode ser qualquer cadeia de polipeptídeo do anticorpo sem limitação, incluindo a cadeia leve ou qualquer cadeia pesada. A posição de local específico pode ser em qualquer domínio do anticorpo, incluindo qualquer domínio variável e qualquer domínio constante.

[00119] As posições de local específico para substituir podem ser descritas com qualquer sistema de nomenclatura de polipeptídeos conhecido por aqueles versados na arte.Em uma modalidade em que o polipeptídeo é um anticorpo, o sistema de numeração pode ser o sistema de numeração Kabat, no qual as posições de local específico estão em resíduos de cadeia pesada H005, H023, H042, H065, H074, H084, H118, H119, H132, H134, H135, H136, H137, H138, H139, H155, H160, H162, H165, H172, H174, H176, H177, H191, H194, H219, H238, H239, H241, H243, H246, H262, H264, H265, H267, H268, H269, H270, H271, H272, H274, H275, H278, H280, H281, H282, H283, H286, H289, H292, H293, H294, H295, H296, H297, H298, H299, H300, H301, H303, H305, H317, H320, H324, H326, H327, H329, H330, H332, H333, H334, H335, H337, H339, H340, H344, H355, H356, H358, H359, H360, H375, H383, H384, H386, H389, H392, H398, H420, H421, H436 e H438. Especificamente, aqui são fornecidos anticorpos que inclui um ou mais aminoácidos modificados em uma ou mais posições selecionadas a partir de resíduos de Kabat H005, H023, H042, H065, H074, H084, H118, H119, H132, H134, H135, H136, H137, H138, H139, H155, H160, H162, H165, H172, H174, H176, H177, H191, H194, H219, H238, H239, H241, H243, H246, H262, H264, H265, H267, H268, H269, H270, H271, H272, H274, H275, H278, H280, H281, H282, H283, H286, H289, H292, H293, H294, H295, H296, H297, H298, H299, H300, H301, H303, H305, H317, H320, H324, H326, H327, H329, H330, H332, H333, H334, H335, H337, H339, H340, H344, H355, H356, H358, H359, H360, H375,H383, H384, H386, H389, H392, H398, H420, H421, H436 e H438.

[00120] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que inclui um ou mais aminoácidos modificados em uma ou mais posições selecionadas a partir de resíduos de Kabat H005, H023, H074, H084, H118, H119, H132, H134, H135, H136, H137, H139, H160, H162, H165, H172, H191, H194, H239, H241, H246, H267, H268, H269, H270, H271, H272, H274, H275, H280, H281, H282, H283, H286, H289, H292, H293, H294, H295, H296, H297, H298, H299, H300, H301, H303, H305, H317, H320, H324, H326, H327, H329, H330, H332, H333, H334, H335, H337, H339, H340, H344, H355, H359, H375, H386, H389, H392, H398, H420, H421 e H438.

[00121] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que inclui um ou mais aminoácidos modificados em uma ou mais posições, selecionados a partir de resíduos de Kabat H005, H084, H118, H132, H136, H239, H293, H334, H355, H359 e H389.

[00122] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que inclui um ou mais aminoácidos modificados em uma ou mais posições, selecionados a partir de resíduos de Kabat H023, H074, H119, H134, H135, H137, H139, H160, H162, H165, H172, H191, H194,H241, H246, H267, H268, H269, H270, H271, H272, H274, H275, H280, H281, H282, H283, H286, H289, H292, H294, H295, H296, H297, H298, H299, H300, H301, H303, H305, H317, H320, H324, H326, H327, H329, H330, H332, H333, H335, H337, H339, H344, H355, H375, H386, H392, H398, H420, H421, H340 e H438.

[00123] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que inclui um ou mais aminoácidos modificados em uma ou mais posições selecionados de resíduos de Kabat H042, H065, H138, H155, H174, H176, H177, H219, H238, H243, H262, H264, H265, H278, H356, H358, H360, H383, H384 e H436.

[00124] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que inclui um ou mais aminoácidos modificados em uma ou mais posições, selecionados a partir de resíduos de Kabat, correspondente a H292-H301, H303 e H305.

[00125] Nosistema de numeração de anticorpo Chothia, estas posições estãonos resíduos na cadeia pesada H005, H023, H042, H065, H074, H084, H118, H119, H132, H134, H135, H136, H137, H138, H139, H155, H160, H162, H165, H172, H174, H176, H177, H191, H194, H219, H238, H239, H241, H243, H246, H262, H264, H265, H267, H268, H269, H270, H271, H272, H274, H275, H278, H280, H281, H282, H283, H286, H289, H292, H293, H294, H295, H296, H297, H298, H299, H300, H301, H303, H305, H317, H320, H324, H326, H327, H329, H330, H332, H333, H334, H335, H337, H339, H340, H344, H355, H356, H358, H359, H360, H375, H383, H384, H386, H389, H392, H398, H420, H421, H436 e H438. Especificamente, aqui são fornecidos anticorpos que inclui um ou mais aminoácidos modificados em uma ou mais posições selecionadas de resíduos de Chotia H005, H023, H042, H065, H074, H084, H118, H119, H132, H134, H135, H136 H137, H138, H139, H155, H160, H162, H165, H172, H174, H176 H177, H191, H194, H219, H238, H239, H241, H243, H246, H262 H264, H265, H267, H268, H269, H270, H271, H272, H274, H275 H278, H280, H281, H282, H283, H286, H289, H292, H293, H294 H295, H296, H297, H298, H299, H300, H301, H303, H305, H317 H320, H324, H326, H327, H329, H330, H332, H333, H334, H335 H337, H339, H340, H344, H355, H356, H358, H359, H360, H375 H383, H384, H386, H389, H392, H398, H420, H421, H436 e H438.

[00126] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que inclui um ou mais aminoácidos modificados em uma ou mais posições selecionadas de resíduos de Chotia H005, H023, H074, H084, H118, H119, H132, H134, H135, H136, H137, H139, H160, H162, H165, H172, H191, H194, H239, H241, H246, H267, H268, H269, H270, H271, H272, H274, H275, H280, H281, H282, H283, H286, H289, H292, H293, H294, H295, H296, H297, H298, H299, H300, H301, H303, H305, H317, H320, H324, H326, H327, H329, H330, H332, H333, H334, H335, H337, H339, H340, H344, H355, H359, H375, H386, H389, H392, H398, H420, H421 e H438.

[00127] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que inclui um ou mais aminoácidos modificados em uma ou mais posições, selecionados a partir de resíduos de Chothia H005, H084, H118, H132, H136, H239, H293, H334, H355, H359 e H389.

[00128] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que inclui um ou mais aminoácidos modificados em uma ou mais posições, selecionados a partir de resíduos de Chothia correspondente à H292-H301, H303 e H305.

[00129] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que inclui um ou mais aminoácidos modificados em uma ou mais posições, selecionados a partir de resíduos Chothia H023, H074, H119, H134, H135, H137, H139, H160, H162, H165, H172, H191, H194, H241, H246, H267, H268, H269, H270, H271, H272, H274, H275, H280, H281, H282, H283, H286, H289, H292, H294, H295, H296, H297, H298, H299, H300, H301, H303, H305, H317, H320, H324, H326, H327, H329, H330, H332, H333, H335, H337, H339, H344, H355, H375, H386, H392, H398, H420, H421, H340 e H438.

[00130] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que inclui um ou mais aminoácidos modificados em uma ou mais posições selecionadas de resíduos de Chothia H042, H065, H138, H155, H174, H176,H177, H219, H238, H243, H262, H264, H265, H278, H356, H358, H360, H383, H384 e H436.

[00131] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados por pelo menos uma ou mais posições, selecionados a partir de resíduos L22, L7 e L152, de acordo com o esquema de numeração Kabat ou Chothia.

[00132] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados por pelo menos uma ou mais posições, selecionados a partir de resíduos L043, L049, L056, L057, L060, L067, L068, L109, L112, L114, L144, L153, L156, L157, L168, L184, L202, L203 e L206, de acordo com o esquema de numeração Kabat ou Chothia. Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificadospor pelo menos uma ou mais posições, selecionados a partir de resíduos L043, L049, L056, L057, L060, L067, L068, L109, L112, L114, L144, L153, L156, L168, L184, L202 e L203, de acordo com o esquema de numeração Kabat ou Chothia. Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados por pelo menos uma ou mais posições, selecionados a partir de resíduos L043, L049, L056, L057, L060, L067, L068, L109, L144, L153, L156, L184, L202 e L203, de acordo com o esquema de numeração Kabat ou Chothia. Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados por pelo menos uma ou mais posições, selecionados a partir de resíduos L049, L056, L057, L060, L067, L109, L153, L202 e L203, de acordo com o esquema de numeração Kabat ou Chothia.

[00133] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados em pelo menos uma ou mais posições selecionadas de resíduos (-)L001, L003, L005, L007, L008, L009, L010, L016, L017, L018, L020, L022, L026, L027, L045, L058, L063, L065, L066, L070, L077, L079, L107, L138, L142, L143, L152, L171, L182, L188, L199 e L201, de acordo com o esquema de numeração Kabat ou Chothia. Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados por pelo menos uma ou mais posições, selecionados a partir dos resíduos mínimo de 1, L003, L005, L007, L008, L009, L010, L016, L017, L018, L020, L022, L026, L027, L045, L058, L063, L065, L066, L070, L077, L079, L107, L142, L143, L152, L171, L182, L188, L199 e L201, de acordo com o esquema de numeração Kabat ou Chothia. Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados em pelo menos uma ou mais posições selecionadas de resíduos (-) L001, L003, L005, L007, L008, L009, L016, L017, L018, L020, L022, L026, L027, L045, L058, L063, L065, L066, L070, L077, L079, L107, L142, L152, L171, L182, L188 e L199, de acordo com o esquema de numeração Kabat ou Chothia. Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados por pelo menos uma ou mais posições, selecionados a partir de resíduos menos 1, L005, L007, L008, L016, L017, L018, L020, L022, L027, L045, L058, L063, L077, L079, L107, L142, L152, L182, L188 e L199, de acordo com o esquema de numeração Kabat ou Chothia. Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados em pelo menos uma ou mais posições selecionadas de resíduos (-) L001, L016, L063 e L199, de acordo com o esquema de numeração Kabat ou Chothia.

[00134] Em determinadas modalidades, neste documento são fornecidos anticorpos compreendendo dois ou mais aminoácidos modificados por pelo menos uma ou mais posições selecionadas de resíduos (-)L001, L007, L008, L016, L022, L063, L014, L070, L138, L142, L143 e L152, de acordo com o esquema de numeração Kabat ou Chothia.

[00135] Em determinadas modalidades, neste documento são fornecidos anticorpos compreendendo dois ou mais aminoácidos modificados por pelo menos uma ou mais posições, selecionados de resíduos (-)L001, L007, L008, L016, L022, L063, L070, L138, L142, L143, L152 e L201, de acordo com o esquema de numeração Kabat ou Chothia.

[00136] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados por pelo menos uma ou mais posições, selecionados daqueles correspondentes ao 22, 7 e 152 do polipeptídeo de cadeia leve representativo de acordo com SEQ ID n°: 2.

[00137] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados por pelo menos uma ou mais posições, selecionados daqueles correspondentesno mínimo a 1, 3, 5, 7, 8, 9, 10, 16, 17, 18, 20, 22, 26, 27, 45, 58, 63, 65, 66, 70, 77, 79, 107, 138, 142, 143, 152, 171, 182, 188, 199 e 201 do polipeptídeoddselecionados daqueles correspondentes no mínimo de acordo com SEQ ID n°: 2.

[00138] Em determinadas modalidades, são aqui fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados por pelo menos uma ou mais posições, selecionados daquelesque correspondemno minimo 1, 3, 5, 7, 8, 9, 16, 17, 18, 20, 22, 26, 27, 45, 58, 63, 65, 66, 70, 77, 79, 107, 142, 143, 152, 171, 182, 188, 199 e 201 do polipeptídeo de cadeia leve representativo de acordo com SEQ ID n°: 2.

[00139] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados por pelo menos uma ou mais posições, selecionados daqueles correspondentesno mínimo de 1, 3, 5, 7, 8, 9, 16, 17, 18, 20, 22, 26, 27, 45, 58, 63, 65, 66, 70, 77, 79, 107, 142, 152, 171, 182, 188 e 199 do polipeptídeo de cadeia leve representativo de acordo com SEQ ID n°: 2.

[00140] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados por pelo menos uma ou mais posições, selecionados daqueles correspondentesno mínimo de 1, 5, 7, 8, 16, 17, 18, 20, 22, 27, 45, 58, 63, 77, 79, 107, 142, 152, 182, 188 e 199 do polipeptídeo de cadeia leve representativo de acordo com SEQ ID n°: 2.

[00141] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados por pelo menos uma ou mais posições, selecionados daqueles correspondentes no mínimo de 1, 16, 63 e 199 do polipeptídeo de cadeia leve representativo de acordo com SEQ ID n°: 2.

[00142] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados por pelo menos uma ou mais posições, selecionados daqueles correspondentes no mínimo de 1, 7, 8, 16, 22, 63, 14, 70, 138, 142, 143 e 152 do polipeptídeoselecionados daqueles correspondentes no mínimo de acordo com SEQ ID n°: 2.

[00143] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados por pelo menos uma ou mais posições, selecionados daqueles correspondentes no mínimo de 1, 7, 8, 16, 22, 63, 70, 138, 142, 143, 152 e 201 do polipeptídeo cadeia leve representativa de acordo com SEQ ID n°: 2.

[00144] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados por pelo menos uma ou mais posições selecionadas daquelas correspondentes a 43, 49, 56, 57, 60, 67, 68, 109, 112, 114, 144, 153, 156, 157, 168, 184, 202, 203 e 206 do polipeptídeo de cadeia leve representativo de acordo com SEQ ID n°: 2.

[00145] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados por pelo menos uma ou mais posições selecionadas daquelas correspondentes a 43, 49, 56, 57, 60, 67, 68, 109, 112, 144, 153, 156, 168, 184, 202 e 203 do polipeptídeo de cadeia leve representativo de acordo com SEQ ID n°: 2.

[00146] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados por pelo menos uma ou mais posições selecionadas daquelas correspondentes a 43, 49, 56, 57, 60, 67, 68, 109, 144, 153, 156, 184, 202 e 203 do polipeptídeo de cadeia leve representativo de acordo com SEQ ID n°: 2.

[00147] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados por pelo menos uma ou mais posições selecionadas daquelas correspondentes aos 49, 56, 57, 60, 67, 109, 153, 202 e 203 do polipeptídeo de cadeia leve representativo de acordo com SEQ ID n°: 2.

[00148] Em outras palavras, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados por pelo menos uma ou mais posições selecionadasdaquelas correspondentes a 407, 124, 183, 139, 25, 40, 119, 193, 225, 19, 52, 71, 117 ou 224 do polipeptídeo de cadeia pesada representante de acordo com SEQ ID n°: 1 e pelo menos uma ou mais posições selecionadas daquelas que correspondem a 22, 7 e 152 do do polipeptídeo de cadeia leve representativo de acordo com SEQ ID n°: 2.

[00149] As posições de local específico também podem ser identificadas em relação às seqüências de aminoácidos das cadeias polipeptídicas de um anticorpo de referência. Por exemplo, a sequência de aminoácidos de uma cadeia pesada de referência é fornecida na SEQ ID n°: 1. Na cadeia pesada de referência, as posições de local específico estão nos resíduos 5, 23, 42, 66, 75, 88, 121, 122, 135, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 158, 163, 165, 168, 175, 177, 179, 180, 194, 197, 222, 241, 242, 244, 246, 249, 265, 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 277, 278, 281, 283, 284, 285, 286, 289, 292, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 306, 308, 320, 323, 327, 329, 330, 332, 333, 335, 336, 337, 338, 340, 342, 343, 347, 358, 359, 361, 362, 363, 378,386, 387, 389, 392, 395, 401, 423, 424, 439 e 441. Especificamente, aqui são fornecidos anticorpos que inclui um ou mais aminoácidos modificados em uma ou mais posições selecionadas daquelas correspondentes a 5, 23, 42, 66, 75, 88, 121, 122, 135, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 158, 163, 165, 168, 175, 177, 179, 180, 194, 197, 222, 241, 242, 244, 246, 249, 265, 267, 268, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 277, 278, 281, 283, 284, 285, 286, 289, 292, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 306, 308, 320, 323, 327, 329, 330, 332, 333, 335, 336, 337, 338, 340, 342, 343, 347, 358, 359, 361, 362, 363, 378, 386, 387, 389, 392, 395, 401, 423, 424, 439 e 441 do anticorpo de cadeia pesado representativo de acordo com SEQ ID n°: 1.

[00150] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que inclui um ou mais aminoácidos modificados em uma ou mais posições selecionadas daquelas correspondentes a 5, 23, 75, 88, 121, 122, 135, 137, 138, 139, 140, 142, 163, 165, 168, 175, 194, 197, 242, 244, 249, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 277, 278, 283, 284, 285, 286, 289, 292, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 306, 308, 320, 323, 327, 329, 330, 332, 333, 335, 336, 337, 338, 340, 342, 343, 347, 358, 362, 378, 389, 392, 395, 401,423, 424 e 441 do anticorpo de cadeia pesado representativo de acordo com SEQ ID n°: 1.

[00151] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que inclui um ou mais aminoácidos modificados em uma ou mais posições selecionadas daquelas correspondentes a 5, 88, 121, 135, 139, 242, 296, 337, 358, 362 e 392 do anticorpo de cadeia pesada representativo de acordo com SEQ ID n°: 1.

[00152] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que inclui um ou mais aminoácidos modificados em uma ou mais posições selecionadosdaqueles correspondentes a 23, 75, 122, 137, 138, 140, 142, 163, 165, 168, 175, 194, 197, 244, 249, 270, 271, 272, 273, 274 275, 277, 278, 283, 284, 285, 286, 289, 292, 295, 297, 298 299, 300, 301, 302, 303, 304, 306, 308, 320, 323, 327, 329 330, 332, 333, 335, 336, 338, 340, 342, 343, 347, 358, 378,389, 395, 401, 423, 424 e 441 do anticorpo de cadeia pesado representativo de acordo com SEQ ID n°: 1.

[00153] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que inclui um ou mais aminoácidos modificados em uma ou mais posições selecionadas daqueles correspondentes 42, 66, 141, 158, 177, 179, 180, 222, 241, 246, 265, 267, 268, 281, 359, 361, 363, 386, 387 e 439 do anticorpo de cadeia pesado representativo de acordo com SEQ ID n°: 1.

[00154] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que inclui um ou mais aminoácidos modificados em uma ou mais posições selecionadas daqueles correspondentes a 292-301, 303 e 305 do anticorpo de cadeia pesado representativo de acordo com SEQ ID n°: 1.

[00155] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que inclui um ou mais aminoácidos modificados em uma ou mais posições selecionadas da cadeia pesada ou resíduos de cadeia leve H404, H121, H180, H241, L22, L7, L152, H136, H25, H40, H119, H190, H222, H19, H52 ou H70 de acordo com o esquema de numeração Kabat ou Chothia.

[00156] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que inclui um ou mais aminoácidos modificados em uma ou mais posições selecionadas da cadeia pesada ou resíduos de cadeia leve H404, H121, H180, H241, L22, L7, L152, H136, H25, H40, H119, H190 e H222 de acordo com o esquema de numeração Kabat ou Chothia.

[00157] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que inclui um ou mais aminoácidos modificados em uma ou mais posições selecionadas da cadeia pesada ou resíduos de cadeia leve H404, H121, H180, H241, L22, L7, L152 e H136 de acordo com o esquema de numeração Kabat ou Chothia.

[00158] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que inclui uma cadeia de polipeptídeo tendo pelo menos 70%, 80% ou 90% de homologia para SEQ ID n°: 1 e tendo um ou mais aminoácidos modificados em locais selecionados de locais correspondente a resíduos 404, 121, 180, 241, 136, 25, 40, 119, 190, 222, 19, 52 ou 70 do polipeptídeo representante da cadeia pesada de acordo com SEQ ID n°: 1.

[00159] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que inclui uma cadeia de polipeptídeo tendo pelo menos 70%, 80% ou 90% de homologia para SEQ ID n°: 2 e possui um ou mais aminoácidos modificadosem locais selecionados de locais correspondente a resíduos 22, 7 e 152 do polipeptídeo de cadeia leve representativo de acordo com SEQ ID n°: 2.

[00160] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados de locais epecifícos. Em determinadas modalidades, cada aminoácido modificado é independente em um site específico selecionado do grupo que consiste de posições otimamente substituíveis de qualquer cadeia de polipeptídeos do anticorpo.

[00161] Em determinadas modalidades, os anticorpos compreendem dois ou mais aminoácidos de local específico modificados de um polipeptídeo único de cadeia leve. Em determinadas modalidades, os anticorpos compreendem dois ou mais aminoácidos de local específico modificados de um polipeptídeo único de cadeia pesada. Em determinadas modalidades, os anticorpos constituem pelo menos um aminoácido de local específico modificado em um polipeptídeo de cadeia leve e pelo menos um aminoácido de local específico modificado em um polipeptídeo de cadeia pesada.

[00162] Em determinadas modalidades, os anticorpos constituem pelo menos um aminoácido de local específico modificado em um polipeptídeo de cadeia leve e pelo menos um aminoácido de local específico modificado em cada um dos dois polipeptídeos de cadeia pesada. Em determinadas modalidades, os anticorpos constituem pelo menos um aminoácido de local específico modificado em cada um dos dois polipeptídeos de cadeia leve e pelo menos um aminoácido de local específico modificado em um polipeptídeo de cadeia pesada. Em determinadas modalidades, os anticorpos constituem pelo menos um aminoácido de local específico modificado em cada um dos dois polipeptídeos de cadeia leve e pelo menos um aminoácido de local específico modificado em cada um dos dois polipeptídeos de cadeia pesada.

[00163] Em determinadas modalidades, os anticorpos compreendem três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais ou seis ou mais aminoácidos modificados local específico. Em determinadas modalidades, os anticorpos compreendem de dois a seis aminoácidos modificados.

[00164] As posições de local específico para substituição podem ser descritas com qualquer sistema de nomenclatura de anticorpo conhecido por aqueles versados na arte. No sistema de numeração Kabat, estas posições estão nos resíduos de cadeia leve ou pesada H404, H121, H180, L22, L7, L152, H136, H25, H40, H119, H190, H222, H19, H52, H70, H110 e H221. Em outras palavras, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados por pelo menos uma ou mais posições selecionadas de resíduos de Kabat H404, H121, H180, L22, L7, L152, H136, H25, H40, H119, H190, H222, H19, H52, H70, H110 e H221.

[00165] Em algumas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados por pelo menos uma ou mais posições, selecionadas a partir de resíduos de Kabat H404, H121, H180, H136, H25, H40, H119, H190, H222, H19, H52, H70, H110 e H221.

[00166] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados por pelo menos uma ou mais posições, selecionados a partir de resíduos L22, L7 e L152, de acordo com o esquema de numeração Kabat ou Chothia.

[00167] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados de locais epecifícos nas posições de seqüência correspondente aos resíduos selecionados de resíduos de cadeia leve ou pesada H404, H121, H180, L22, L7, L152, H136, H25, H40, H119, H190, H222, H19, H52, H70, H110 ou H221 de acordo com o esquema de numeração Kabat ou Chothia.

[00168] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados de locais epecifícos nas posições de seqüência correspondente a resíduos selecionados a partir de resíduos, 407, 124, 183, 139, 25, 40, 119, 193, 225, 19, 52, 71, 117 ou 224 do polipeptídeo representante da cadeia pesada de acordo com SEQ ID n°: 1.

[00169] Em determinadas modalidades, aqui são fornecidos anticorpos que compreende dois ou mais aminoácidos modificados de locais epecifícos nas posições de seqüência correspondente a resíduos selecionados a partir de resíduos 22, 7 ou 152 do polipeptídeo de cadeia leve representativo de acordo com SEQ ID n°: 2.

[00170] O anticorpo pode ter qualquer forma de anticorpo reconhecida por aqueles versados na arte. O anticorpo pode abranger uma cadeia de polipeptídeo único - uma cadeia única pesada ou uma cadeia única leve. O anticorpo pode também formar multímeros que serão reconhecidas por aqueles versados na arte incluindo homodímeros, heterodímeros, homomultímeros e heteromultímeros. Estes multímeros podem ser ligados ou desligados. As ligações úteis incluem ligações intercadeias de dissulfeto típico para moléculas do polipeptídeo. O mediastino também pode ser ligado por outros aminoácidos, incluindo os aminoácidos modificados aqui descritos. O anticorpo pode ser uma imunoglobulina, tal como de qualquer classe ou subclasse incluindo IgA, IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 e IgM. O anticorpo pode ser da forma de qualquer fragmento de anticorpo incluindo Fv, Fc, Fab, e (Fab')2 e scFv.

[00171] Um anticorpo parental pode ter afinidade para qualquer antígeno conhecido por aqueles versados na arte, ou mais tarde descoberto. Praticamente qualquer substância pode ser um antígeno para um anticorpo parental, ou um anticorpo da presente descrição. Exemplos de antígenos úteis incluem, mas não estão limitados ao fator antitripsina alfa-1, angiostaina, fator antihemolítico, polipeptídeos, apolipoproteína, apoproteína, fator atrial natriureticopolipeptídeo natriurético atrial, peptídeos atriais, quimiocinas C - X - C (por exemplo, T39765, NAP-2, ENA-78, Gro-a, Gro-b, Gro-c, IP-10, GCP-2, 4-NAP, SDF-1, PF4, MIG), calcitonina, quimiocinas CC (por exemplo, monócitos quimiotático proteína-1, monócitos quimiotático proteína-2, monócitos quimiotático proteína-3, alfa de proteína-1 inflamatória monócito, beta de proteína-1 inflamatória monócito, RANTES, I309, R83915, R91733, HCC1, T58847, D31065, T64262), ligante CD40, ligante de C-kit, colágeno, fator estimulador de colônia (CSF), fator complementar 5a, inibidor complementar, receptor complementar1, citocinas, (por exemplo, peptídeo de ativação neutrófilos epiteliais-78, GRO/MGSA, GRO, GRO, MIP-1, MIP-1, 1-MCP), fator de crescimento epidérmico (EGF), eritropoietina ("EPO"), toxinas esfoliantes A e B, fator IX, fator VII, fator VIII, fator X, fator de crescimento fibroblástico (FGF), fibrinogênio, fibronectina, G-CSF, GM-CSF, glucocerebrosidase, gonadotropina, fatores de crescimento, proteínas de porco- espinho (por exemplo, Sonic,Indian, Desert), hemoglobina, fator de crescimento de hepatócito (HGF), hirudina, albumina de soro humano, insulina, fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), interferons (por exemplo, IFN- α, IFN-, IFN-Y), interleucinas (por exemplo, Il-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL- 12, etc.), fator de crescimento de queratinócitos (KGF), lactoferrina, fator inibitório de leucemia, luciferase, neurturina, fator inibitório dos neutrófilos (NIF), oncostatina M, proteína osteogênica, hormônio paratireóide, PD-ECSF, PDGF, hormônios peptídicos (por exemplo, hormônio do crescimento humano), pleiotropina, proteína, proteína G, exotoxinas pirogênicas A, B e C, relaxina, renina, SCF, receptor do complemento solúvel I, solúvel em I-CAM 1, receptores solúveis interleucina (Il-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15), receptor TNF solúvel, somatomedina, somatostatina, somatotropina, estreptoquinase, superantigens, ou seja, enterotoxinas estafilocócicas (SEA, SEB, SEC1, SEC2, SEC3, SED, SEE), superóxido dismutase, toxina da síndrome do choque tóxico (TSST-1), alfa-Timosina 1, ativador de plasminogênio tecidual, fator de necrose tumoral (beta TNF), receptor de fator de necrose tumoral (TNFR), fator de necrose tumoral- alfa (TNF-alfa), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), uroquinase e outros. Estes antígenos podem ser obtidos por métodos conhecidos por aqueles versados na arte, por exemplo, de fontes comerciais ou de sequências de polipeptídeo ou polinucleotídicas publicadas (por exemplo, Genbank).

[00172] Antígenos adicionais incluem, mas não estão limitados a transcriptional e ativadores de expressão. Ativadores de expressão e transcricionais exemplificativos incluem genes e proteínas que modulam o crescimento celular, diferenciação, regulamento ou semelhantes. Os ativadores de expressão e transcricionais são encontrados no vírus, procariontes e eucariontes, incluindo fungos, plantas e animais, incluindo mamíferos, fornecendo uma ampla gama de alvos terapêuticos. Será apreciado que ativadores de expressão e transcricionais regulam a transcrição por muitos mecanismos, por exemplo, por ligação a receptores, estimulando uma cascata de transdução de sinal, regulando a expressão de fatores de transcrição, ligando-se aos promotores e melhoradores, ligando as proteínas que se ligam a promotores e melhoradores, desesperilizando o DNA, emenda pre-mRNA, poliadenilação do RNA e RNA degradante. Os antígenos incluem, mas não estão limitados aos ativadores de expressão, tais como citocinas, moléculas inflamatórias, fatores de crescimento, seus receptores e produtos oncogene, e.g., interleucinas (por exemplo, Il-1, Il-2, IL-8, etc.), interferons, FGF, IGF-I, IGF-II, FGF, PDGF, TNF, TGF-α, TGF-β, EGF, KGF, SCF/c-Kit, CD40/CD40L, VLA-4VCAM-1, ICAM-1/LFA-1 e hialurin/CD44; moléculas de sinalização de transdução e produtos oncogene correspondentes, por exemplo, Mos, Ras, Raf e Met; ativadores transcricionais e supressores, por exemplo, p53, Tat, Fos, Myc, Jun, Myb, Rel e receptores de hormônios esteróides, tais como aqueles para estrógeno, progesterona, testosterona, aldosterona, ligante do receptor LDL e corticosterona.

[00173] Vacinas de proteínas podem ser antígenos incluindo, mas não limitado às proteínas dos fungos infeciosos, por exemplo, Aspergillus, espécies Candida; bactérias, especialmente E. coli, que serve de modelo para as bactérias patogênicas, bem como bactérias clinicamente importantes, tais como estafilococos (por exemplo, aureus), ou estreptococos (por exemplo, pneumoniae); protozoários, tais como sporozoa (por exemplo, plasmódios), rhizopods (por exemplo, Entamoeba) e flagelados (Trypanosoma, Leishmania, Trichomonas, Giardia, etc.); vírus, tais como vírus (+)RNA (exemplos incluem poxvirus, por exemplo, vaccinia; Picornaviruses, por exemplo, a poliomielite; Togaviruses, por exemplo, rubéola; flavivírus, por exemplo, HCV; e coronavírus), vírus (-) RNA (por exemplo, Rhabdoviruses, por exemplo, VSV; Paramyxovimses, por exemplo, RSV; Orthomyxovimses, por exemplo, da gripe; Bunyaviruses; e Arenaviruses), vírus dsDNA (Reoviruses, por exemplo), RNA para vírus DNA, ou seja, retrovírus, por exemplo, HIV e HTLV e certos vírus DNA para RNA, como a hepatite B.

[00174] Os antígenos podem ser enzimas incluindo, mas não limitados a amidases, aminoácido racemases, acilases, dehalogenases, dioxigenases, diarilpropano peroxidases, epimerases, epóxido hidrolases, esterases, isomerases, quinases, isomerases de glicose, glicosidases, glicosil transferases, haloperoxidases, monooxigenases (por exemplo, p450s), lipases, peroxidases de lignina, nitrilo hidratases, nitrilases, proteases, fosfatases, subtilisins, transaminase e nucleases.

[00175] Proteínas agronomicamente relacionadas tais como proteínas de resistência a insetos (por exemplo, as proteínas Cry), enzimas de produção de amido e lipídios, toxinas de plantas e insetos, proteínas de resistência a toxina, proteínas de desintoxicação de micotoxina, enzimas de crescimento de plantas (por exemplo, Ribulose 1,5- bisfosfato carboxilase/oxigenase, "RUBISCO"), lipoxigenase (LOX) e carboxilase fosfoenolpiruvato (PEP) podem também ser antígenos.

[00176] Por exemplo, o antígeno pode ser uma molécula de doenças associadas, tais como o antígeno de superfície do tumor como idiotipos de células B, CD20 em células malignas B, CD33 em explosões leucêmicas e HER2/neu em câncer de mama. Alternativamente, o antígeno pode ser um receptor de fator de crescimento. Exemplos dos fatores de crescimento incluem, mas não estão limitados aos fatores de crescimento epiédrmico (EGFs), transferrina, fator de crescimento semelhante à insulina, fatores de crescimento de transformação (TGFs), interleucina-1 e interleucina-2. Por exemplo, uma alta expressão de receptores EGF foi encontrada em uma ampla variedade de tumores primários epiteliais humanos. TGF-α foi encontrado para mediar uma via de estimulação autócrina em células cancerosas. Os vários anticorpos monoclonais murino têm demonstrado ser capaz de se ligaremaos receptores EGF, bloquear a ligação do ligante aos receptores EGF e inibir a proliferação de uma variedade de linhas de células cancerosas humanas em cultura e em modelos de enxerto heterólogo. Mendelsohn e Baselga (1995) Antibodies to growth factors e receptors, in Biologic Therapy of Cancer, 2nd Ed., J B Lippincott, Philadelphia, pp 607-623. Assim, os anticorpos podem ser usados para tratar uma variedade de cânceres.

[00177] O antígeno também pode ser a proteína de superfície celular ou receptor associado com doença arterial coronariana, como a glicoproteína plaquetária do receptor IIb/IIIa, doenças auto-imunes, como CD4, CAMPATH-1 e lipídios uma região do lipopolissacarídeo bacteriana gram-negativa. Anticorpos humanizados contra CD4 foram testados em ensaios clínicos no tratamento de pacientes com artrite reumatóide, psoríase postular generalizada, psoríase grave e micose fungóide. Anticorpos contra lipídios uma região do lipopolissacarídeo bacteriano Gram- negativo foram testados clinicamente no tratamento de choque séptico. Anticorpos contra CAMPATH-1 também foram testados clinicamente no tratamento de contra a artrite reumatóide refratária. Assim, anticorpos aqui apresentados podem ser usados para tratar uma variedade de doenças auto- imunes.

[00178] Antígenos úteis também incluem proteínas ou peptídeos associados com doenças alérgicas humanas, tais como proteínas mediadoras de inflamações, por exemplo, interleucina-1 (IL-1), fator de necrose tumoral (TNF), receptor de leucotrieno e 5-lipoxigenase e moléculas de adesão, tais como V-CAM/VLA-4. Além disso, a IgE também pode servir como antígeno porque IgE desempenha papel essencial nas reações alérgicas do tipo hipersensibilidade imediata I, tal como a asma. Estudos têm mostrado que o nível do soro total IgE tende a se correlacionar com a severidade das doenças, especialmente na asma. et al. (1989) “Association of asthma with serum IgE levels e skintest reactivity to allergens” New Engl. L. Med. 320:271- 277.Assim, os anticorpos selecionados contra a IgE podem ser utilizados para reduzir o nível de IgE ou bloquear a ligação da IgE, mastócitos e basófilos no tratamento de doenças alérgicas sem ter impacto substancial sobre as funções imunes normais.

[00179] O antígeno também pode ser uma superfície viral ou a proteína do núcleo que pode servir como um antígeno para desencadear a resposta imune do hospedeiro. Exemplos destas proteínas virais incluem, mas não estão limitados as glicoproteínas (ou antígenos de superfície, por exemplo, GP120 e GP41) e proteínas do capsídeo (ou proteínas estruturais, por exemplo, proteína P24); antígenos de superfície ou proteínas do núcleo dovírus da hepatite A, B, C, D ou E (por exemplo,antígeno de superfície da hepatite B (HBsAg) pequeno: do vírus da hepatite B e as proteínas do núcleo do vírus da hepatite C, NS3, NS4 e NS5 da febre); glicoproteína (G-proteína) ou a proteína de fusão (F-proteína) de vírus sincicial respiratório (VSR); proteínas de superfície e núcleo de herpes simplex vírus HSV-1 e HSV-2 (por exemplo, glicoproteína D de HSV-2).

[00180] O antígeno também pode ser um produto gene supressor de tumor mutante que perdeu a sua função de supressão de tumor e pode tornar as células mais suscetíveis ao câncer. Genes supressores de tumor são genes que funcionam para inibir as células de crescimento e divisão ciclos, evitando assim o desenvolvimento de neoplasia. As mutações em genes supressores de tumor faz com que a célula ignore um ou mais dos componentes da rede de sinais inibitórios, superando os pontos de verificação do ciclo celular e resulta em uma maior taxa de crescimento de célula de câncer controlada. Exemplos de genes supressores do tumor incluem, mas não são limitados a, DPC- 4, NF-1, NF-2, RB, p53, WT1, BRCA1 e BRCA2. DPC-4 é envolvido no cancer pancreático e participa de uma via citoplasmática que inibe a divisão celular. NF-1 codifica uma proteína que inibe o Ras, uma proteína citoplasmática inibitória. NF-1 está envolvido no neurofibroma e feocromocitomas do sistema nervoso e leucemia mielóide. NF- 2 codifica uma proteína nuclear que está envolvida em meningioma, schwanoma e ependimoma do sistema nervoso. Códigos de RB para a proteína pRB, uma proteína nuclear que é um grande inibidor do ciclo celular. RB está envolvido no retinoblastoma, bem como câncer no osso, da bexiga, câncer de pequenas células, câncer de pulmão e mama. p53 codifica a proteína p53 que regula a divisão celular e pode induzir a apoptose. Mutação e/ou inação de p53 encontra-se em uma ampla gama de cânceres. WT1 está envolvido no tumor de Wilms dos rins. BRCA1 está envolvido no câncer da mama e ovário, e BRCA2 está envolvido no câncer de mama. Assim, os anticorpos podem ser usados para bloquear as interações do produto de gene com outras proteínas ou bioquímicos em vias de desenvolvimento e no aparecimento de tumor.

[00181] O antígeno pode ser uma molécula de CD, incluindo, mas não se limitando a, CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD2, CD3Y, CD3δ, CD3ε, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8α, CD8β, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CDw12, CD13, CD14, CD15, CD15s, CD16a, CD16b, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a, CD42b, CD42c, CD42d, CD43, CD44, CD45, CD45R, CD46, CD47, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CDw60, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64, CD65, CD66a, CD66b, CD66c, CD66d, CD66e, CD66f, CD67, CD68, CD69, CDw70, CD71, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CD79α, CD79β, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CDw92, CD93, CD94, CD95, CD96, CD97, CD98, CD99, CD100, CD101, CD102, CD103, CD104, CD105, CD106, CD107a, CD107b, CDw108, CDw109, CD110-113, CD114, CD115, CD116, CD117, CD118, CD119, CD120a, CD120b, CD121a, CD121b, CD122, CD123, CDw124, CD125, CD126, CDw127, CDw128a, CDw128b, CD129, CDw130, CD131, CD132, CD133, CD134, CD135, CD136, CDw137, CD138, CD139, CD140a, CD140b, CD141, CD142, CD143, CD144, CDw145, CD146, CD147, CD148, CDw149, CD150, CD151, CD152, CD153, CD154, CD155, CD156, CD157, CD158a, CD158b, CD161, CD162, CD163, CD164, CD165, CD166, e TCRZ. O antígeno pode ser VEGF, receptor VEGF, EGFR, Her2, TNFa, receptor TNFRI, GPIIb/IIIa, cadeia alfa IL-2R, cadeia de beta IL-2R, proteína RSV F alfa4 integrina, IgE, IgE do receptor, digoxina, veneno de víbora-tapete, complemento C5, antígeno tumoral de OPGL, CA-125, proteínas de estafilococos, proteínas Staphylococcusepidermidis, proteínas de Staphylococcus aureus, proteínas envolvidas na infecção de estafilococos (incluindo, mas não se limitando aStaphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis), receptor de IL-6, CTLA-4, RSV, subunidade tática do receptor IL-2, IL-5 e EpCam. O antígeno pode ser um fragmento de uma molécula.

[00182] Exemplos de anticorpos parentais biespecíficos úteis incluem, mas não limitados àqueles com um anticorpo direcionado contra um antígeno da célula tumoral e o outro anticorpo direcionado contra uma molécula de gatilho citotóxicos, tais como anti-FcYRI/anti-CD 15, nti-p185HER2/FcYRIII (CD16), anti-CD3, anti-CD3/anti- maligno célula B (1D10), anti-CD3/anti-p185HER2, anti- CD3/anti-p97, anti-CD3/ célula de carcinoma anti-renal, anti-CD3/anti-OVCAR-3, anti-CD3/L-D1 (anti-colon carcinoma), anti-CD3/hormônio estimulante análogo anti- melanocito, anti-EGF receptor/anti-CD3, anti-CD3/anti- CAMA1, anti-CD3/anti-CD19, anti-CD3/MoV18, molécula de adesão celular anti-neural (NCAM)/anti-CD3, proteína de ligação anti-folato (FBP)/anti-CD3, carcinoma associado antigêno anti-pan (AMOC-31)/anti-CD3; anticorpo biespecifico com um anticorpoque se liga especificamente a tumor antigenoeoutro anticorpoque se liga a uma toxina, tal como anti-saporin/anti-Id-1, anti-CD22/anti-saporin, anti- CD7/anti-saporin, anti-CD38/anti-saporin, anti-CEA/anti- ricin uma cadeia, anti-interferon-α (IFN-α)/ anti-hibridoma idiotipo, anti-CEA/anti-vinca alcalóide; anticorpos bispecificos para a conversão de exemplos de enzima ativada como anti-CD30/anti-alcalina fosfatase (que catalisa a conversão do pró-fármaco fosfato de mitomicina ao álcool mitomicina); anticorpos bispecifico que podem ser usados como agentes fibrinolíticos como ativador de plasminogênio fibrina e tecido (tPA), ativador de plasminogênio anti- fibrin/anti-uroquinase-tipo (uPA);anticorpos bispecifico para o direcionamento de complexos imunes a célula superfície receptores como anti-baixolipoproteína de densidade (LDL)/receptor anti-Fc (por exemplo, FCYRI, FCYRII ou FCYRIII); anticorpos bispecifico para uso em terapia de doenças infeciosas como a anti-CD3/anti-vírus simples da Herpes (HSV), receptor anti-T-cell: CD3 complexo/anti-influenza, anti-FcYR/anti-HIV; anticorpos bispecifico para deteção de tumor in vitro ou in vivo como anti-CEA/anti-EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, anti-anti- p185HER2/anti-hapten; anticorpos bispecifico como adjuvantes de vacina (ver Fanger, M W et al., Crit Rev Immunol. 1992; 12(34):101-24 que é incorporada por referência neste documento); e anticorpos bispecific como ferramentas de diagnóstico, tais como a peroxidase de rabanete de anticoelho IgG/anti-ferritina, anti-cavalo (HRP) / anti- hormônio, somatostatin e substance P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/anti-β-galactosidase (ver Nolan, O et R. O'Kennedy, Biochim Biophys Acta. 1990 Aug. 1; 1040(1):1-11, que está incorporada por referência neste documento). Exemplos de triespecífico anticorpos anti-CD3/anti- CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 e anti-CD3/anti- CD8/anti-CD37.

Ligantes e Cargas Úteis

[00183] Em certas modalidades, o polipeptídeo compreende um aminoácido modificado possuindo um grupo reativo, tal como aqui descrito. Um perito na arte pode usar o grupo reativo para ligar o polipeptídeo de qualquer entidade molecular capaz de formar uma ligação covalente com o aminoácido modificado, direta ou indiretamente através de um ligante. Assim, os conjugados aqui proporcionados compreendem um polipeptídeo compreendendo um resíduo de aminoácido que corresponde a um composto de fórmula I, Ia, II, 1-30 ou 40 ligados a uma carga útil, e opcionalmente compreendendo uma porção de ligação entre o polipeptídeo e a carga útil.

[00184] Ligantes úteis incluem aqueles aqui descritos. Em certas modalidades, o ligante é qualquer ligante bivalente ou multivalente conhecido dos versados na arte. Geralmente, o ligante é capaz de formar ligações covalentes com o grupo funcional e o carbono alfa de aminoácido modificado. Ligantes bivalentes úteis incluem uma ligação, alquileno, alquileno substituído, heteroalquileno substituo, arileno, arileno substituo, heteroarileno e heteroarileno substituído. Em certas modalidades, o ligante é alquileno C1-10 ou heteroalquileno C1-10.

[00185] A carga molecular pode ser qualquer entidade molecular que um perito na arte possa desejar para conjugar com o polipeptídeo. Em certas modalidades, a carga é um grupo terapêutico. Em tal modalidade, o polipeptídeo conjugado pode ser usado para atingir a parte ativa terapêutica para o seu alvo molecular. Em certas modalidades, a carga é uma porção de rotulagem. Em tais modalidades, o polipeptídeo conjugado pode ser utilizado para detectar a ligação do polipeptídeo ao seu alvo. Em certas modalidades, a carga é uma porção citotóxica. Em tais modalidades, o conjugado pode ser usado como alvo para a porção citotóxica para uma célula doente, por exemplo, uma célula cancerígena, para iniciar a destruição ou eliminação da célula. Conjugados compreendendo outras cargas moleculares aparentes para aqueles peritos na técnica estão dentro do âmbito dos conjugados aqui descritos.

[00186] Em certas modalidades, um conjugado pode ter uma carga selecionada do grupo que consiste de uma etiqueta, um corante, um polímero, um polímero solúvel em água, polietileno glicol, um derivado de polietileno- glicol, um fotoligante, um composto citotóxico, um radionuclido, um fármaco, um marcador de afinidade, um marcador de fotoafinidade, um composto reativo, uma resina, uma segunda proteína ou polipeptídeo ou polipeptídeo análogo, um anticorpo ou fragmento de anticorpo, um quelante de metais, um co-fator, um ácido graxo, um hidrato de carbono, um polinucleótido, um DNA, um RNA, um polinucleótido anti-mensageiro, um peptídeo, um dendrímero solúvel em água, uma ciclodextrina, um ácido ribonucléico inibidora, um biomaterial, uma nanopartícula, um marcador de spin, um fluoróforo, um grupo contendo metal, uma radical radioativo, um grupo funcional novo, um grupo covalente ou não covalente interage com outras moléculas, uma porção photocaged, uma porção fotoisomerizable, biotina, um derivado de biotina, um análogo de biotina, que incorpora uma porção de um átomo pesado, um grupo quimicamente clivável, um grupo fotoclivável, uma cadeia lateral alongada, um açúcar ligado ao carbono, um agente redox-ativo, um tioácido amino, um fragmento tóxico, um radical marcado isotopicamente, uma sonda biofísico, um grupo fosforescente, um grupo quimioluminescente, um grupo de eletróns densos, um grupo magnético, um grupo intercalante, um cromóforo, um agente de transferência de energia, um agente biologicamente ativo, um marcador detectável, uma molécula pequena, ou qualquer combinação destes. Em uma modalidade, a carga é uma etiqueta, um corante, um polímero, um composto citotóxico, um radionuclido, uma droga, um marcador de afinidade, uma resina, uma proteína, um polipeptídeo, um análogo de polipeptídeo, um anticorpo, fragmento de anticorpo, um quelante de metais, um cofator, um ácido graxo, um hidrato de carbono, um polinucleótido, um DNA, um RNA, um peptídeo, um fluoróforo, ou um açúcar ligado a carbono. Em outra modalidade, a carga é uma etiqueta, um corante, um polímero, uma droga, um anticorpo, fragmento de anticorpo, um DNA, um RNA, ou um peptídeo.

[00187] Cargas úteis incluem qualquer droga citotóxica, agente citostático ou imunomodulador. Classes úteis de agentes citotóxicos ou imunomoduladores incluem, por exemplo, agentes antitubulina, auristatinas, ligantes do sulco menores DNA, inibidores da replicação do DNA, agentes alquilantes (por exemplo, complexos de platina, tal como cis-platina, mono (platina), cloreto de bis (platina) e complexos de platina tri-nuclear e carboplatina), antraciclinas, antibióticos, antifolatos, antimetabolitos, inibidores de calmodulina, sensibilizadores quimioterapia, duocarmicinas, etoposídeo, pirimidinas fluoradas, ionóforos, lexitropsins, maitansinóides, nitrosoureias, platinols, compostos formadores de poros, antimetabolitos purina, puromycins, radiação sensibilizadores, rapamicinas, esteróides, taxanos, inibidores da topoisomerase, alcalóides de vinca, ou semelhantes.

[00188] Agentes imunomoduladores ou Citotóxico individual incluem, por exemplo, um androgênio, antramicina (AMC), asparaginase, 5-azacitidina, azatioprina, bleomicina, bussulfano, butionina sulfoximina, caliqueamicina, derivados de Calicheamicina, camptotecina, carboplatina, carmustina (BSNU), CC-1065, clorambucilo, cisplatina, colchicina, ciclofosfamida, citarabina, a citidina arabinósido, citocalasina B, dacarbazina, datinomicina (anteriormente atinomicina), daunorrubicina, dacarbazina, DM1, DM4, docetaxel, doxorrubicina, etoposido, um estrogênio, 5-fluordeoxiuridine, 5 fluorouracil, gemcitabina, gramicidina D, hidroxiureia, idarrubicina, ifosfamida, irinotecano, lomustina (CCNU), maitansina, mecloretamina, melfalano, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitramicina, mitomicina C, mitoxantrona, nitroimidazol, paclitaxel, palitoxina, plicamicina, procarbizine, rizoxina, estreptozotocina, tenoposido, 6-tioguanina, thiotépa, topotecano, vinblastina, vincristina, vinorelbine, VP-16 e VM-26.

[00189] Em algumas modalidades, os agentes citotóxicos adequados incluem, por exemplo, ligantes do sulco menor do DNA (por exemplo, enediynas e lexitropsinas, um composto CBI;. Ver também Patente US N° 6.130.237), duocarmicinas, os taxanos (por exemplo, paclitaxel e docetaxel), puromicinas, alcalóides de vinca, CC-1065, SN- 38, topotecan, morfolino-doxorubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorrubicina, equinomicina, combretastatina, netropsina, epotilona A e B, estramustina, criptoficinas, cemadotina, maitansinóides, discodermolida, eleuterobina, e mitoxantrona.

[00190] Em algumas modalidades, a carga é um agente anti-tubulina. Exemplos de agentes anti-tubulina incluem, mas não estão limitados aos taxanos (por exemplo, Taxol (paclitaxel), Taxotere (docetaxel)), T67 (Tularik) e alcalóides da vinca (por exemplo, vincristina, vinblastina, vindesina e vinorelbina). Outros agentes antitubulina incluem, por exemplo, derivados de bacatina, análogos do taxano (por exemplo, as epotilonas, epotilona A e B), nocodazol, colquicina e colcimide, estramustina, criptoficinas, cemadotina, maitansinóides, combretastatinas, discodermolida, e eleuterobina.

[00191] Em certas modalidades, o agente citotóxico é um maitansinóide, outro grupo de agentes anti-tubulina. Por exemplo, em modalidades específicas, o maitansinol podem ser maitansina ou DM-1 (ImmunoGen, Inc.;ver também Chari et al, 1992, Cancer Res. 52:. 127-131).

[00192] Em algumas modalidades, a carga é um auristatina, tais como auristatina E ou um seu derivado. Por exemplo, o derivado de auristatina E pode ser um éster formado entre auristatina E e um ácido ceto. Por exemplo, auristatina E pode ser feita para reagir com ácido benzôico ou ácido paraacetilbenzoilvalérico para produzir AEB e AEVB, respectivamente. Outros derivados de auristatina típicos incluem AFP, MMAF e MMAE. A síntese e a estrutura de derivados de auristatina são descritas no Pedido de Publicação de Patente No. WO 04/010957, Pedido de Publicação de Patente No WO 02/088172, e patentes U.S. Nos.6,323,315; 6,239,104; 6,034,065; 5,780,588; 5,665,860; 5,663,149; 5,635,483; 5,599,902; 5,554,725; 5,530,097; 5,521,284; 5,504,191; 5,410,024; 5,138,036; 5,076,973; 4,986,988; 4,978,744; 4,879,278; 4,816,444; e 4,486,414.

[00193] Em algumas modalidades, a carga não é um radioisótopo. Em algumas modalidades, a carga não é radioativa.

[00194] Em algumas modalidades, a carga é um antimetabolito. O antimetabolito pode ser, por exemplo, um antagonista da purina (por exemplo, azotioprina ou micofenolato de mofetil), um inibidor da di-hidrofolato redutase (por exemplo, metotrexato), aciclovir, gangciclovir, zidovudina, vidarabina, ribavirina, azidotimidina, citidina arabinósido, amantadina, didesoxiuridina, iododesoxiuridina, poscarnet, ou trifluridina.

[00195] Em outras modalidades, a carga é tacrolimus, ciclosporina, rapamicina ou FU506. Em outras modalidades, o fármaco é aldesleucina, alemtuzumab, alitretinoína, alopurinol, altretamina, amifostina, anastrozol, o trióxido de arsénio, bexaroteno, bexaroteno, calusterona, capecitabina, celecoxib, cladribina, darbepoetina alfa, Denileucina diftitox, dexrazoxano, propionato de dromostanolona, epirubicina, epoetina alfa, estramustina, exemestano, filgrastim, floxuridina, fludarabina, fulvestrant, gemcitabina, gemtuzumab ozogamicina (MYLOTARG), goserelina, idarubicina, ifosfamida, mesilato de imatinib, interferon alfa-2a, irinotecano, letrozol, leucovorin, levamisole, mecloretamina ou mostarda de azoto, de megestrol, mesna, metotrexato, metoxsaleno, mitomicina C, mitotano, nandrolona fenopropionato, oprelvekin, oxaliplatina, pamidronato pegademase, pegaspargase, pegfilgrastim, pentostatin, pipobromano, plicamicina, porfímero de sódio, procarbazina, quinacrine, rasburicase, Rituximab, sargramostim, estreptozoeina, tamoxifeno, temozolomida, teniposido, testolactona, tioguanina, toremifeno, Tositumomabe, trastuzumab (Herceptin), tretinoína, mostarda de uracil, valrubicina, vinblastina, vincristina, vinorelbina ou zoledronato.

[00196] Em algumas modalidades, a carga é um agente imunomodulador. O agente imunomodulador pode ser, por exemplo, gangciclovir, etanercept, tacrolimus, ciclosporina, rapamicina, ciclofosfamida, azatioprina, micofenolato de mofetil ou metotrexato. Alternativamente, o agente imunomodulador pode ser, por exemplo, um glucocorticóide (por exemplo, cortisol ou aldosterona) ou de um análogo de glucocorticóides (por exemplo, prednisona ou dexametasona).

[00197] Em algumas modalidades, o agente imunomodulador é um agente antiinflamatório, tal como derivados arilcarboxílicos, os derivados de pirazole, contendo derivados de oxicam e derivados do ácido nicotínico. As classes de agentes antiinflamatórios incluem, por exemplo, inibidores da ciclo-oxigenase, inibidores da 5-lipoxigenase, e antagonistas de receptores de leucotrienos.

[00198] Inibidores da ciclooxigenase apropriados incluem o ácido meclofenâmico, ácido mefenâmico, carprofeno, diclofenaco, diflunisal, fenbufeno, fenoprofeno, indometacina, cetoprofeno, nabumetona, sulindaco, tenoxicam e tolmetina.

[00199] Inibidores de Lipoxigenase adequados incluem inibidores redoxes, (por exemplo, os derivados de catecol butano, ácido nordihidroguaiarético (NDGA), masoprocol, fenidona, Ianopalen, indazolinonas, nafazatrom, benzofuranol, alquilhidroxilamina) e inibidores não redoxes (por exemplo, hidroxitiazoles, metoxiaquiltiazoles, benzopiranos e seus derivados, metóxi, ácidos de Boswella e derivados acetilados de ácidos boswélicos, e ácidos quinolinemetoxifenilacéctico substituídos com radicais cicloalquil), e precursores dos inibidores redoxes.

[00200] Outros inibidores da lipoxigenase adequados incluem antioxidantes (por exemplo, fenóis, propilgalato, flavonóides e/ou substratos que ocorrem naturalmente que ocorrem contendo flavonóides, derivados hidroxilados das flavonas, flavonóis, diidroquercetina, luteolina, galangina, orobol, derivados de calcona, 4,2', 4'- trihidroxicalcona, orto-aminofenóis, N-hidroxiureias, benzofuranols, ebselen e espécies que aumentam a atividade dos redutores de selenoenzimas), agentes quelantes de ferro (por exemplo, ácidos hidroxâmicos e seus derivados, N- hidroxiureias, 2-benzil-1-naftol, catecóis, hidroxilaminas, carnosol trolox C, catecol, naftol, sulfassalazina, zileuton, ácido 5-hidroxiantranico e 4-(omega-arilalquil) ácidos fenilalcanóico), compostos contendo imidazol (por exemplo, o cetoconazol e o itraconazol), fenotiazinas, e derivados de benzopirano.

[00201] Ainda outros inibidores de lipoxigenase adequados incluem inibidores de eicosanóides (por exemplo, octadecatetraenóico, eicosatetraenóico, docosapentaenóico, ácidos eicosahexaenóico e docosahexaenóico e ésteres, PGE1 (prostaglandina E1), PGA2 (prostaglandina A2), viprostol, ácidos 15-monohidroxieicosatetraenóico, 15-monohidroxi- eicosatrienóico e 15-monohidroxieicosapentaenóico, e leucotrienos B5, C5 e D5), compostos de interferência com os fluxos de cálcio, fenotiazinas, difenilbutilaminas, verapamil, fuscoside, curcumina, ácido clorogênico, ácido cafeíco, ácido 5,8,11,14-eicosatetraienoíco (ETYA), hidroxifenilretinamida, ionapalen, esculina, dietilcarbamazina, fenantrolina, baicaleína, proxicromil, tioéteres, sulfureto de dialilo e di-(1-propenil) sulfureto.

[00202] Antagonistas dos receptores de leucotrienos incluem calcitriol, ontazolast, Bayer Bay-x-1005, Ciba- Geigy CGS-25019C, ebselen, Leo Denmark ETH-615, Lilly LY- 293111, Ono ONO-4057, Terumo TMK-688, Boehringer Ingleheim BI-RM-270, Lilly LY 213024, Lilly LY 264086, Lilly LY 292728, Ono ONO LB457, Pfizer 105696, Perdue Frederick PF 10042, Rhone-Poulenc Rorer RP 66153, SmithKline Beecham SB- 201146, SmithKline Beecham SB-201993, SmithKline Beecham SB-209247, Searle SC-53228, Sumitamo SM 15178, American Home Products WAY 121006, Bayer Bay-o-8276, Warner-Lambert CI-987, Warner-Lambert CI-987BPC-15LY 223982, Lilly LY 233569, Lilly LY-255283, MacroNex MNX-160, Merck e Co. MK- 591, Merck e Co. MK-886, Ono ONO-LB-448, Purdue Frederick PF-5901, Rhone-Poulenc Rorer RG14893, Rhone-Poulenc Rorer RP 66364, Rhone-Poulenc Rorer RP 69698, Shionoogi S-2474, Searle SC-41930, Searle SC-50505, Searle SC-51146, Searle SC-52798, SmithKline Beecham SK&F-104493, Leo Denmark SR- 2566, Tanabe T-757 e Teijin TEI-1338.

[00203] As outras cargas de drogas úteis incluem compostos químicos úteis no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterápicos incluem Erlotinib (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), Bortezomib (VELCADE®, Millennium Pharm.), Fulvestrant (FASLODEX®, AstraZeneca), Sutent (SU11248, Pfizer), Letrozole (FEMARA®, Novartis), Imatinib mesylate (GLEEVEC®, Novartis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), Oxaliplatin (Eloxatin®, Sanofi), 5-FU (5-fluorouracil), Leucovorin, Rapamycin (Sirolimus, RAPAMUNE®, Wyeth), Lapatinib (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), Lonafarnib (SCH 66336), Sorafenib (BAY43-9006, Bayer Labs), e Gefitinib (IRESSA®, AstraZeneca), AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen),agentes aquilantes, tais como tiotepa e ciclofosfamida CYTOXAN®; sulfonatos de alquiltais, tais como bussulfano, improssulfano e pipossulfano; aziridinas tais como benzodopa, carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas e metilamelaminas incluindo altretamina, trietilenomelamina, trietilenofosforamida, trietilenotiofosforamida e trimetilmelamina; acetogenins (especialmente bulatacina e bulatacinona); uma camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano); briostatina; calistatina; CC-1065 (incluindo adozelesina, carzelesina e bizelesina análogos sintéticos); criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina; duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CB1-TM1); eleuterobina; pancratistatina; um sarcodictiina; espongistatina; mostardas de azoto tais como clorambucil, cloromafazina, clorofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de óxido de mecloretamina, melfalano, novembiquina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostarda de uracil; nitrosureias, tais como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, e ranimnustina; antibióticos, tais como os antibióticos de enediina (por ex., caliqueamicina, especialmente caliqueamicina gammall e caliqueamicina omegall (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183-186); dinemicina, incluindo dinemicina A; bisfosfonatos, tais como clodronato; uma esperamicina; bem como cromóforo de neocarzinostatina e cromóforos antibióticos de enediina relacionados), aclacinomisinas, atinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, catinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina, cromomicinas, datinomicina, daunorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L norleucina, ADRIAMYCIN® (doxorubicina), morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorrubicina e desoxidoxorrubicina), epirrubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, tais como mitomicina C, ácido micofenico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti- metabolitos, tais como metotrexato e 5-fluorouracil (5-FU); análogos de ácido fólico, tais como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos de purina, tais como fludarabina, 6-mercaptopurina, thiamniprina, tioguanina; análogos de pirimidina, tais como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, didesoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; androgênios, tais como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenais, tais como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; repositor ácido fólico, tais como ácido frolínico; aceglatono; glicosídeo aldofosfamida; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxate; defofamina; demecolcina; diaziquona; elformithine; acetato de eliptinio; epotilona; etoglucido; nitrato de gálio; hidroxiureia; lentinano; lonidainina; maitansinoides, tais como maitansina e ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; fenamete; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etil-hidrazida; procarbazina; complexo polissacarídeo PSK® (JHS Natural Products, Eugene, Oreg.); razoxano; rizoxina; sizofurano; spirogermanium; ácido tenuazônico; triaziquone; 2,2',2''- triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T- 2, verracurina A, roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxóides, por exemplo, TAXOL® (paclitaxel; Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ), Abraxane® (free-Cremophor), fórmulações de nanopartículas de engenharia de albumina de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, lll), e TAXOTERE® (doxetaxel; Rhone-Poulenc, Antoni, França); cloranmbucil; GEMZAR® (gemcitabina); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina, tais como cisplatina e carboplatina; vinblastina; etoposido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; NAVELBINE® (vinorelbina); novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; capecitabina (XELODA®); ibandronato; CPT-11; inibidor da topoisomerase RFS 2000; difluorometilrnitina (DMFO); retinóides, tais como ácido retinóico; e sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos e derivados de qualquer um dos acima.

[00204] As outras cargas úteis incluem: (i) agentes anti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação hormonal em tumores, tais como anti-estrogênios e moduladores seletivos do receptor de estrogênio (SERMs), incluindo, por exemplo, tamoxifeno (incluindo NOLVADEX®; citrato de tamoxifeno), raloxifeno, droloxifeno, 4- hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona, e FARESTON® (citrato de toremifina); (ii) inibidores de aromatase que inibem a enzima aromatase, que regula a produção de estrogênio nas glândulas suprarrenais, tais como, por exemplo, 4(5)-imidazoles, aminoglutetimida, MEGASE® (acetato de megestrol), AROMASIN® (exemestano; Pfizer), formestanie, fadrozol, RIVISOR® (vorozol), FEMARA® (letrozol; Novartis), e ARIMIDEX® (anastrozol;AstraZeneca); (iii) anti-androgênios, tais como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, e goserelina; bem como troxacitabina (um análogo do nucleosídeo citosina 1,3- dioxolano); (iv) inibidores da proteína quinase; (v) inibidores da quinase lipídica; (vi) os oligonucleótideos anti-sentido, particularmente aqueles que inibem a expressão de genes nas vias de sinalização implicadas na proliferação celular aberrante, tais como, por exemplo, PKC-alfa, Ralf e H-Ras; (vii) ribozimas, tais como inibidores da expressão de VEGF (por exemplo, ANGIOZYME®) e inibidores da expressão de HER2; (viii) vacinas, tais como vacinas de terapia de genes, por exemplo, ALLOVECTIN®, LEUVECTIN®, e VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; um inibidor de topoisomerase 1 tal como LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; agentes (ix) anti-angiogênicos, tais como bevacizumab (Avastin, Genentech); e (x) sais farmaceuticamente aceitáveis, ácidos e derivados de qualquer um dos acima. Outros agentes anti-angiogênicos incluem inibidores da MMP- 2 (matriz-metaloproteinase 2), inibidores da MMP-9 (matriz- metaloproteinase 9), inibidores de COX-II (ciclooxigenase II), e inibidores da tirosina quinase do receptor de VEGF. Exemplos de tais inibidores de metaloproteinases da matriz úteis que podem ser utilizados em combinação com os presentes compostos/composições são descritos nos documentos WO 96/33172, WO 96/27583, EP 818442, EP 1004578, WO 98/07697, WO 98/03516, WO 98/34918, WO 98/34915, WO 98/33768, WO 98/30566, EP 606,046, EP 931,788, WO 90/05719, WO 99/52910, WO 99/52889, WO 99/29667, WO 99/07675, EP 945864, patente US No. 5,863,949, patente US No. 5,861,510, e EP 780,386, todos aqui incorporados na sua totalidade por referência. Exemplos de inibidores de tirosina quinase do receptor de VEGF incluem 4-(4-bromo-2-fluoroanilino)-6-metoxi-7-(4-ilmetoxi-1-metilpiperidin) quinazolina (ZD6474; Exemplo 2 no documento WO 01/32651), 4-(4-fluor-2-metilindol-5-iloxi)-6-metoxi-7-(3-pirrolidin-1-ilpropoxi) quinazolina (AZD2171; Exemplo 240 no documento WO 00/47212), vatalanib (PTK787; documento WO 98/35985) e SU11248 (sunitinib; WO 01/60814), e compostos, tais como os revelados na publicação PCT números WO 97/22596, WO97/30035, WO 97/32856, e WO 98/13354.

[00205] Em certas modalidades, a carga é um anticorpo ou um fragmento de anticorpo. Em certas modalidades, o anticorpo ou fragmento de carga útil pode ser codificado por qualquer um dos genes de imunoglobulina reconhecidos por aqueles versados na arte. Os genes de imunoglobulinas incluem, mas não estão limitados a K, À, α, Y (IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4), δ, ε e genes da região constanteμ, assim como os genes da região variável da imunoglobulina. O termo inclui anticorpos de comprimento completo e fragmentos de anticorpos reconhecidos por aqueles versados na arte, e variantes destes. Os fragmentos exemplificativos incluem, mas não se limitam a Fv, Fc, Fab, e (Fab')2, Fv de cadeia simples (scFv), diacorpos, triacorpos, tetracorpos, polipeptídeo híbridos bifuncionais, CDR1, CDR2, CDR3, conjuntos de CDR, regiões variáveis, regiões estruturais, regiões constantes e afins.

[00206] Em certas modalidades, a carga é um ou mais polímeros solúveis em água. Uma grande variedade de polímeros macromoleculares e outras moléculas podem ser ligadas aos polipeptídeo aqui descritos para modular as propriedades biológicas do polipeptídeo, e/ou proporcionar novas propriedades biológicas do polipeptídeo. Estes polímeros macromoleculares podem ser ligados ao polipeptídeo através de um aminoácido codificado naturalmente, por meio de um aminoácido não codificado naturalmente, ou qualquer substituinte funcional de um aminoácido natural ou modificado, ou qualquer substituinte ou grupo funcional adicionado a um aminoácido natural ou modificado. O peso molecular do polímero pode ser de uma vasta gama, incluindo, mas não se limitando a está entre cerca de 100 Da e aproximadamente 100.000 Da ou mais.

[00207] O polímero selecionado pode ser solúvel em água de modo a que uma proteína à qual está ligado não precipita em um ambiente aquoso, tal como um ambiente fisiológico. O polímero pode ser ramificado ou não ramificado. De preferência, para utilização terapêutica da preparação de produto final, o polímero será farmaceuticamente aceitável.

[00208] Em certas modalidades, a proporção de moléculas de polietilenoglicol para moléculas de polipeptídeo irá variar, assim como as suas concentrações na mistura de reação. Em geral, a razão ótima (em termos de eficiência de reaçãona qual é mínimo o excesso de proteína ou polímero que não reagiu) pode ser determinada pelo peso molecular do polietilenoglicol selecionado e sobre o número de grupos reativos disponíveis. Como se refere ao peso molecular, tipicamente, quanto maior for o peso molecular do polímero, menor será o número de moléculas de polímero que podem ser ligadas à proteína. De modo semelhante, a ramificação do polímero deverá ser levada em conta quando se otimizam estes parâmetros. Geralmente, quanto maior o peso molecular (ou quanto mais ramificações) maior é a razão polímero:proteína.

[00209] O polímero solúvel em água pode ser qualquer forma estrutural incluindo, mas não se limitando a linear, ramificada ou bifurcada. Tipicamente, o polímero solúvel em água é um poli(alquilenoglicol), tal como polietilenoglicol (PEG), mas outros polímeros solúveis em água podem também ser utilizados. A título de exemplo, o PEG é utilizado para descrever certas modalidades.

[00210] O PEG é um polímero solúvel em água bem conhecido,que está disponível comercialmente ou pode ser preparado por polimerização da abertura do anel do etileno glicol de acordo com métodos bem conhecidos na arte (Sandler e Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York, Vol. 3, pages 138-161). O termo "PEG" é utilizado amplamente para abranger qualquer molécula de polietileno- glicol, sem ter em conta o tamanho ou a modificação em uma extremidade do PEG, e pode ser representado como ligado a um polipeptídeo pela fórmula: XO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-Y, onde n é 2 a 10.000 e X é H ou uma modificação do terminal, incluindo, mas não se limitando a, um alquil C1-4.

[00211] Em alguns casos, um PEG termina em uma extremidade com um grupo hidroxi ou metoxi, ou seja, X é H ou CH3 ("PEG metoxi"). Alternativamente, o PEG pode terminar com um grupo reativo, formando assim um polímero bifuncional. Grupos reativos típicos podem incluir os grupos reativos que são vulgarmente utilizados para reagir com os grupos funcionais encontrados nos 20 aminoácidos comuns (incluindo, mas sem se limitar aos grupos de maleimida, carbonatos ativados (incluindo, mas não limitados ao éster de p-nitrofenil), ésteres ativados (incluindo, mas não se limitando a N-hidroxisuccinimida, éster de p-nitrofenil) e aldeídos), bem como grupos funcionais que são inertes para os 20 aminoácidos comuns, mas que reagem especificamente com grupos funcionais complementares presentes no aminoácido não codificado naturalmente (incluindo, mas não se limitando aos grupos azida, grupos alcino). Note-se que a outra extremidade do PEG, o que é mostrado na fórmula acima, por Y, vai anexar quer diretamente ou indiretamente a um polipeptídeo através de um aminoácido codificadode ocorrência natural ou não natural. Por exemplo, Y pode ser uma amida, carbamato ou uma ligação de uréiaa um grupo amina (incluindo, mas não se limitando a amina epsilon de lisina ou ao terminal-N) do polipeptídeo. Alternativamente, Y pode ser uma ligação maleimida a um grupo tiol (incluindo, mas não se limitando ao grupo tiol da cisteína). Alternativamente, Y pode ser uma ligação a um resíduo que normalmente não são acessíveis por meio dos 20 aminoácidos comuns. Por exemplo, um grupo azida no PEG pode ser reagido com um grupo alcino no polipeptídeo para formar um produto de cicloadiçãoHuisgen [3+2]. Alternativamente, um grupo alcino no PEG pode ser reagido com um grupo azida presente em um aminoácido codificado não naturalmente, tais como os aminoácidos modificados aqui descritos, para formar um produto semelhante. Em algumas modalidades, um nucleófilo forte (incluindo, mas não se limitando a hidrazina, hidrazida, hidroxilamina, semicarbazida) pode ser reagido com um grupo aldeído ou cetona presente em um aminoácido codificadonão naturalmente para formar uma hidrazona, oxima ou semicarbazona, tal como aplicáveis, o que em alguns casos pode ser ainda mais reduzida por meio de tratamento com um agente redutor apropriado. Alternativamente, o nucleófilo forte pode ser incorporado no polipeptídeo através de um aminoácido codificado nãonaturalmente usado para reagir de preferência com um grupo cetona ou aldeído presentes no polímero solúvel em água.

[00212] Qualquer uma massa molecular para o PEG pode ser usada como praticamente desejado, incluindo, mas não limitado a cerca de 100 Daltons (Da) a 100.000 Da ou mais, conforme desejado (incluindo, mas não se limitando a, às vezes 0,1 a 50 kDa ou 10 a 40 kDa). Os PEG de cadeia ramificadainclui, mas não se limita as moléculas de PEG com cada cadeia, tendo um PM que varia de 1 a 100 kDa (incluindo, mas não se limitando a 1 a 50 kDa ou 5 a 20 kDa) também pode ser usado. Uma ampla gama de moléculas de PEG é descritas, incluindo, mas não se limitando ao catálogo de Shearwater Polimers, Inc., catálogo Nektar Therapeutics, aqui incorporados por referência.

[00213] De um modo geral, pelo menos um terminal da molécula de PEG está disponível para a reação com o aminoácido não codificado naturalmente. Por exemplo, os derivados PEG que contêm porções de alquino e azida para reagir com as cadeias laterais de aminoácidos podem ser utilizados para ligar o PEG aos aminoácidos não codificados naturalmente, como aqui descritos. Se o aminoácido não codificado naturalmente compreende uma azida, em seguida, o PEG vai tipicamente conter tanto um alcino para efetuar a formação da produto de cicloadição [3+2] ou uma espécie PEG ativada (isto é, éster, carbonato) contendo um grupo fosfina para efetuar a formação da ligação amida. Alternativamente, se o aminoácido não codificado naturalmente compreende um alcino, então o PEG conterá tipicamente uma fração de azida para efetuar a formação doproduto de cicloadição Huisgen [3+2]. Se o aminoácido não codificado naturalmente compreende um grupo carbonil, o PEG compreenderá tipicamente um nucleófilo potente (incluindo, mas não se limitando a uma hidrazida, hidrazina, hidroxilamina, ou a funcionalidade de semicarbazida), a fim de efetuar a formação do correspondente hidrazona, oxima, e ligações semicarbazona, respectivamente. Em outras alternativas, uma orientação inversa dos grupos reativos aqui descritos pode ser utilizada, ou seja, uma porção azida em que o aminoácido não codificado naturalmentepode ser reagido com um derivado de PEG contendo um alcino.

[00214] Em algumas modalidades, o polipeptídeo variante com um derivado PEG contém uma funcionalidade química que é reativa com a funcionalidade química presente na cadeia lateral do aminoácido não codificado naturalmente.

[00215] Em certas modalidades, a carga principal é um polímero ocontendo acetileno ou azida compreendendo uma cadeia principal de polímero solúvel em água possuindo um peso molecular médio de cerca de 800 Da até cerca de 100.000 Da. A cadeia principal do polímero do polímero solúvel em água pode ser o polietilenoglicol. No entanto, deve ser entendido que uma vasta variedade de polímeros solúveis em água, incluindo, mas não limitados ao poli(etileno)glicol e outros polímeros relacionados, incluindo poli(dextrano) e poli(propilenoglicol), também são adequados para utilização e que o uso do termo PEG ou polietilenoglicol destina-se a abranger e incluir todas essas moléculas. O termo PEG inclui, mas não está limitado ao polietilenoglicol em qualquer das suas formas, incluindo PEG bifuncional, PEG multi-braços, derivado de PEG, PEG bifurcado, PEG ramificado, PEG pendente (por exemplo, PEG ou polímeros relacionados que têm um ou mais grupos funcionais pendentes na cadeia principal do polímero), ou PEG com ligações degradáveis na mesma.

[00216] A cadeia principal do polímero pode ser linear ou ramificada. As estruturas poliméricas ramificadas são geralmente conhecidas na arte. Tipicamente, um polímero ramificado tem uma porção do núcleo de ramo central e uma pluralidade de cadeias de polímero linear ligada ao núcleo do ramo central. PEG é habitualmente utilizado em formas ramificadas que podem ser preparadas por adição de óxido de etileno a vários polióis, tais como glicerol, oligómeros de glicerol, pentaeritritol e sorbitol. A porção do ramo central pode também ser derivada a partir de vários aminoácidos, tais como lisina. O polietilenoglicol ramificadopode ser representado em forma geral como R(-PEG- OH)m em que R é derivado de uma porção do núcleo, tal como glicerol, oligómeros de glicerol, ou pentaeritritol, e m representa o número de braços. Moléculas de PEG multi- braços, tais como descritos nas patentes US 5,932,462 5,643,575; 5,229,490; 4,289,872; pedido de patente US 2003/0143596; WO 96/21469; e WO 93/21259, onde cada uma das quais é aqui incorporada por referência em sua totalidade, também pode ser utilizado como a cadeia principal do polímero.

[00217] PEG ramificado também pode está sob a forma de um PEG bifurcado representado por PEG (-YCHZ2)n, em que Y é um grupo de ligação e o símbolo Z representa um grupo terminal ativado ligado a CH por uma cadeia de átomos de comprimento definido.

[00218] Ainda outra forma ramificada, o PEG pendente, tem grupos reativos, tais como carboxil, ao longo da cadeia principal de PEG em vez de na extremidade das cadeias PEG.

[00219] Em adição a estas formas de PEG, o polímero pode também ser preparado com ligações fracas ou degradáveis na estrutura. Por exemplo, o PEG pode ser preparado com ligações éster na estrutura polimérica que estão sujeitos a hidrólise. Tal como aqui mostrado, esta hidrólise resulta na clivagem do polímero em fragmentos de peso molecular inferior: -PEG-CO -PEG--G O-PEG-CO G-GO-PEG-. É entendido por aqueles versados na arte que o termo polietilenoglicol ou PEG representa ou inclui todas as formas conhecidas na arte, incluindo, mas não se limitando àquelas aqui divulgadas.

[00220] Muitos outros polímeros são também adequados para o uso. Em algumas modalidades, são particularmente adequadasas cadeias principais de polímeros que são solúveis em água, com 2 a cerca de 300 terminais. Exemplos de polímeros adequados incluem, mas não estão limitados a outros poli(alquileno-glicóis), tais como poli(propileno glicol) ("PPG"), os seus copolímeros (incluindo, mas não se limitando aos copolímeros de etileno-glicol e propileno- glicol), terpolímeros, misturas, e semelhantes. Embora o peso molecular de cada cadeia da cadeia principal do polímero possa variar, está tipicamente na gama de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da, frequentemente de cerca de 6000 Da a cerca de 80.000 Da.

[00221] Os especialistas na técnica irão reconhecer que a lista precedente de cadeias principais substancialmente solúveis em água não é de forma alguma exaustiva e é meramente ilustrativa e que todos os materiais poliméricos que têm as qualidades aqui descritas são contemplados como sendo adequados para utilização.

[00222] Em algumas modalidades os derivados de polímero são "multi-funcionais", o que significa que a cadeia principal do polímero tem pelo menos dois terminais, e possivelmente até cerca de 300 terminais, funcionalizada ou ativada com um grupo funcional. Derivados de polímeros multifuncionais incluem, mas não estão limitados aos polímeros lineares contendo dois terminais, sendo cada terminal ligado a um grupo funcional que pode ser o mesmo ou diferente.

[00223] O grupo funcional azida pode reagir seletivamente com uma porção de carga contendo um éster aril apropriadamente funcionalizado e com uma porção aril fosfina para gerar uma ligação amida. O grupo aril fosfina reduz a azida in situ e a amina resultante reage em seguida, de forma eficiente com uma ligação éster proximal para gerar a amida correspondente. Veja, por exemplo, E. Saxon e C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000). Em algumas modalidades, o aminoácido contendo azida é um alquil azida (incluindo, mas não limitado ao ácido 2-amino- 6-azido-1-hexanóico) ou uma aril azida (p-azido- fenilalanina).

[00224] Exemplos de porções de carga contendo um aril éster e um radical de fosfina pode ser representado como a seguir:

em que X é -O-, -NH-, -S-, ou uma ligação simples, Ph é fenil, W é um radical de carga útil e R é H, alquil, aril, alquil substituído e grupos aril substituídos. Exemplos de grupos R incluem, mas não estão limitados a, - CH2-, -C(CH3)3, -OR', -NR'R'', -SR', -halogêneo, -C(O)R', - CONR'R'', -S(O)2R', -S(O)2NR'R", -CN e -NO2. R', R'', R''' e R'''' são cada um independentemente hidrogênio, substituído ou heteroalquil não substituído, aril substituído ou não substituído, incluindo, mas não se limitando ao aril substituído com 1-3 halogênios, alquil substituído ou não substituído, grupos alcóxi ou tioalcóxi, ou grupos arilalquil. Quando um composto aqui descrito inclui mais do que um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente selecionado, assim como cada um dos gruposR', R'', R''' e R''''quando mais do que um desses grupos está presente. Quando R'e R''estão ligados ao mesmo átomo de azoto, eles podem ser combinados com o átomo de azoto para formar um anel de 5-, 6-, ou 7- elementos. Por exemplo, -NR'R'' pretende incluir, mas não se limitam a 1- pirrolidinil e 4-morfolinil. A partir da discussão acima sobre os substituintes, um perito na arte entenderá que o termo "alquil" pretende incluir grupos incluindo átomos de carbono ligados a grupos diferentes de hidrogênio, tais como grupos de haloalquil (incluindo, mas não limitados a - CF3 e -CH2CF3) e acil (incluindo, mas não se limitando a - C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3, e semelhantes).

[00225] O grupo funcional azida pode também ser reagido seletivamente com uma porção de carga contendo um tioéster e apropriadamente funcionalizado com uma unidade aril fosfina para gerar uma ligação amida. O grupo aril fosfina reduz a azida in situ e, em seguida, a amina resultante reage de forma eficiente com a ligação tioéster para gerar a amida correspondente. Os polímeros solúveis em água contendo um tioéster exemplificativo e uma porção de fosfina pode ser representada como a seguir:

[00226] Em uma modalidade, o derivado de polímero tem a estrutura: XA-PAY-B-Alquinil, em que: B é uma porção de ligação, a qual pode estar presente ou ausente; PAY é uma porção de carga útil; A é uma porção de ligação, a qual pode estar presente ou ausente e que pode ser igual a B ou diferentes; e X é um segundo grupo funcional. Exemplos de uma porção de ligação para A e B incluem, mas não estão limitados a um grupo alquil multiplamente funcionalizados contendo até 18, e mais preferivelmente entre 1 a 10 átomos de carbono. Um heteroátomo, tal como nitrogênio, oxigênio ou enxofre podem ser incluídos com a cadeia alquil. A cadeia alquil pode também ser ramificada a um heteroátomo. Outros exemplos de uma porção de ligação de A e B incluem, mas não estão limitados a um grupo aril multiplamente funcionalizado, contendo até 10 e mais preferencialmente de 5 a 6 átomos de carbono. O grupo aril pode ser substituído com átomos de carbono, mais átomos nitrogênio, oxigênio ou de enxofre. Outros exemplos de grupos de ligação adequados incluem os grupos de ligação descritos nas patentes US 5.932.462; 5.643.575; e no pedido de patente US 2003/0143596, cada um destes é aqui incorporado por referência. Aqueles versados na arte reconhecerão que a lista anterior para a ligação de porções é de nenhuma forma exaustiva e é meramente ilustrativa e que todos os radicais de ligação que possuam as qualidades aqui descritas são contempladas como sendo adequado para uso.

[00227] Os exemplos de grupos funcionais adequados para utilização como X incluem, mas não estão limitados a, hidroxil, hidroxil protegido, alcóxil, éster ativo, tal como ésteres de N-hidroxisuccinimidilo e ésteres 1- benzotriazolil, carbonato ativo, tal como N-hidroxi- succinimidilo e carbonatos de 1-benzotriazolil, acetal carbonatos, aldeído, hidratos de aldeído, alquenil, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona ativa, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epóxido, glioxais, dionas, mesilatos, tosilatos, tresilato, alceno, e cetona. Como é compreendido por aqueles versados na arte, o radical X selecionado deve ser compatível com o grupo alquinil de modo que a reação com o grupo alquinil não ocorre. Os derivados poliméricos contendo alquinil podem ser homobifuncional, o que significa que o segundo grupo funcional (isto é, X) é também uma unidade alquinil, ou heterobifuncional, o que significa que o segundo grupo funcional é um grupo funcional diferente.

[00228] O termo "protegido" se refere à presença de um grupo ou radical protetor que evita a reação do grupo funcional quimicamente reativo em determinadas condições de reação. O grupo protetor vai variar dependendo do tipo de grupo quimicamente reativo a ser protegido. Por exemplo, se o grupo quimicamente reativo é uma amina ou uma hidrazida, o grupo protetor pode ser selecionado a partir do grupo de terc-butilxicarbonil (t-Boc) e 9-fluorenilmetoxicarbonil (Fmoc). Se o grupo quimicamente reativo é um tiol, o grupo protetor pode ser ortopiridildisulfido. Se o grupo quimicamente reativo é um ácido carboxílico, tais como o ácido butanóico ou o ácido propiônico, ou um grupo hidroxil, o grupo protetor pode ser benzil ou um grupo alquil, tal como metil, etil ou terc-butil. Podem também ser utilizados outros grupos protetores conhecidos na arte.

[00229] Os exemplos específicos de grupos funcionais terminais na literatura incluem, mas não estão limitados ao carbonato de N-succinimidilo (veja, por exemplo, a patente US. 5.281.698, 5.468.478), amina (veja, por exemplo, Buckmann et al. Makromol. Chem. 182:1379 (1981), Zaplipsky et al. Eur. Polym. J. 19:1177 (1983)), hidrazida (Veja, por exemplo, Andresz et al. Makromol. Chem. 179:301 (1978)), succinimidil propionate e succinimidil butanoato (veja, por exemplo, Olson et al. in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp 170-181, Harris & Zaplipsky Eds., ACS, Washington, D.C., 1997; veja também patente US 5,672,662), succinimidil succinato (Veja, por exemplo, Abuchowski et al. Cancer Biochem. Biophys. 7:175 (1984) e Joppich et al. Macrolol. Chem. 180:1381 (1979), succinimidil éster (veja, por exemplo, patente US 4,670,417), benzotriazol carbonato (veja, por exemplo, patente US 5,650,234), glicidil éter (veja, por exemplo, Pitha et al. Eur. J Biochem. 94:11 (1979), Elling et al., Biotech. Appl. Biochem. 13:354 (1991), oxicarbonilimidazol (veja, por exemplo, Beauchamp, et al., Anal. Biochem. 131:25 (1983), Tondelli et al. J. Controlled Release 1:251 (1985)), carbonato p-nitrofenil (veja, por exemplo, Veronese, et al., Appl. Biochem. Biotech., 11: 141 (1985); e Sartore et al., Appl. Biochem. Biotech., 27:45 (1991)), aldeído (veja, por exemplo, Harris et al. J. Polym. Sci.Chem. Ed. 22:341 (1984), patente US 5,824,784, patente US 5,252,714), maleimida (veja, por exemplo, Goodson et al. Bio/Technology 8:343 (1990), Romani et al. in Chemistry of Peptides e Proteins 2:29 (1984)), e Kogan, Synthetic Comm. 22:2417 (1992)), ortopiridil-disulfido (veja, por exemplo, Woghiren, et al. Bioconj. Chem. 4:314(1993)), acrilol (veja, por exemplo, Sawhney et al., Macromolecules, 26:581 (1993)), vinilsulfona (veja, por exemplo, patente US 5,900,461). Todas as referências e patentes anteriores são aqui incorporadas por referência.

[00230] Em certas modalidades, derivados de polímeros compreendem uma cadeia principal de polímero possuindo a estrutura: X-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-alquinil, em que: X é um grupo funcional tal como aqui descrito; e n é cerca de 20 a cerca de 4000. Em outra modalidade, os derivados do polímero compreendem uma cadeia principal de polímero possuindo a estrutura: X-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2- O-(CH2)m-W-alquinil, em que: W é um alifático ou aromático que compreendende uma porção ligante entre 1 a 10 átomos de carbono; n é cerca de 20 a cerca de 4000; X é um grupo funcional tal como aqui descrito; e m está entre 1 e 10. Exemplos de grupos funcionais adequados incluem, mas não estão limitados ao ácido carboxílico hidroxil, hidroxil protegido, acetal, alquenil, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, protegido, maleimida, ditiopiridina, vinilpiridina e cetona.

[00231] Derivados PEG contendo alquinil podem ser preparados por uma variedade de métodos conhecidos na técnica e/ou aqui descritos. Em um método para a preparação de um derivado de polímero contendo alquinil, um agente de ligação tendo uma funcionalidade alquinil é posto em contato com uma porção de carga útil, em que o agente de reticulação tem uma funcionalidade química que reage seletivamente com uma funcionalidade química do polímero PEG, para formar um produto derivado de polímero contendo alquinil em que o alquinil é separado da estrutura polimérica por um grupo de ligação.

[00232] Um esquema de reação exemplificativo é mostrado aqui: X-PEG-M+N-ligante-alquinil^PG-X-PEG-ligante- alquinil, em que: PEG é polietilenoglicol e X é um grupo de proteção, tal como alcóxi ou um grupo funcional, tal como aqui descrito; e M é um grupo funcional que não é reativo com a funcionalidade alquinil, mas que irá reagir eficientemente e seletivamente com o grupo funcional N. Exemplos de grupos funcionais adequados incluem, mas não estão limitadas a, M ser um ácido carboxílico, carbonato ou éster ativo se N é uma amina; sendo M uma cetona se N é uma hidrazida ou uma unidade aminooxi; sendo M um grupo de saída, se N for um nucleófilo.

[00233] A purificação do produto bruto pode ser conseguida por métodos conhecidos, incluindo, mas sem se limitar, a precipitação do produto, seguido por cromatografia, se necessário.

[00234] Um exemplo mais específico é aqui mostrado, no caso de diamina PEG, em que uma das aminas é protegida por uma porção do grupo protetor, tal como terc-butil-Boc e a diamina PEG mono-protegida resultante é reagida com uma porção ligante que carrega a funcionalidade alquinil: BocHN-PEG-NH2+HO2C-(CH2)3-alquinil. Neste exemplo, o grupo amina pode ser acoplado ao grupo ácido carboxílico, usando uma variedade de agentes de ativação, tais como cloreto de tionilo ou reagentes de carbodiimida e N-hidroxisuccinimida ou N-hidroxibenzotriazol para criar uma ligação amida entre o derivado PEG de monoamina e a porção ligante contendo alquinil. Após a formação bem sucedida da ligação amida, o derivado contendo alquinil protegido N-terc-butil-Boc resultante pode ser utilizado diretamente para modificar as moléculas bioativas ou pode ser mais elaborado para instalar outros grupos funcionais úteis. Por exemplo, o grupo de N-t-Boc pode ser hidrolisado pelo tratamento com um ácido forte para gerar um omega-amino-PEG-azida. A amina resultante pode ser usada como um identificador sintético para instalar outras funcionalidades úteis, tais como os grupos maleimida, dissulfuretos ativados, ésteres ativados e assim por diante para a criação de valiosos reagentes heterobifuncionais.

[00235] Em outra modalidade, o derivado de polímero tem a estrutura: X-A-PAY-B-C=C-R em que: R pode ser H ou um grupo alquil, alceno, alcóxil, ou aril ou aril substituído; B é uma porção de ligação, a qual pode estar presente ou ausente; PAY é uma porção de carga útil; A é uma porção de ligação, a qual pode estar presente ou ausente e que pode ser igual a B ou diferentes; e X é um segundo grupo funcional.

[00236] Os exemplos de uma porção de ligação A e B incluem, mas não estão limitados a um grupo alquil multiplamente funcionalizados contendo até 18, e mais preferivelmente entre 1 a 10 átomos de carbono. Um heteroátomo, tal como nitrogênio, oxigênio ou enxofre podem ser incluídos com a cadeia alquil. A cadeia alquil pode também ser ramificada a um heteroátomo. Outros exemplos de uma porção de ligação A e B incluem, mas não estão limitados a, um grupo aril multiplamente funcionalizado, contendo até 10 e mais preferencialmente de 5 a 6 átomos de carbono. O grupo aril pode ser substituído com átomos de carbono, nitrogênio, oxigênio ou átomos de enxofre. Outros exemplos de grupos de ligação adequados incluem os grupos de ligação descritos na patente US 5,932,462 e 5,643,575 e pedido de patente US 2003/0143596, cada uma das quais é aqui incorporado por referência. Aqueles versados na arte reconhecerão que a lista anterior para a ligação de porções não é de forma alguma exaustiva e destina-se a ser meramente ilustrativa, e que uma grande variedade de porções de ligação que têm as qualidades aqui descritas, é contemplada como útil.

[00237] Os exemplos de grupos funcionais adequados para uso como X incluem hidroxil, hidroxil protegido, alcóxil, éster ativo, tal como ésteres de N- hidroxisuccinimidil e ésteres 1-benzotriazolil, carbonato ativo, tais como carbonatos N-hidroxisuccinimidil e carbonato de 1-benzotriazolil, acetal, aldeído, hidratos de aldeído, alquenil, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona ativa, amina, aminooxi, amina protegida, hidrazida, hidrazida protegida, tiol protegido, ácido carboxílico, ácido carboxílico protegido, isocianato, isotiocianato, maleimida, vinilsulfona, ditiopiridina, vinilpiridina, iodoacetamida, epóxido, glioxais, dionas, mesilatos, tosilatos e tresilato, alceno, cetona, e acetileno. Como seria entendido, o radical X selecionado deve ser compatível com o grupo acetileno de modo a que a reação com o grupo acetileno não ocorre. Os derivados poliméricos contendo acetileno pode ser homobifuncional, o que significa que o segundo grupo funcional (isto é, X), é também uma porção acetileno, ou heterobifuncional, o que significa que o segundo grupo funcional é um grupo funcional diferente.

[00238] Em uma outra modalidade, os derivados do polímero compreende uma cadeia principal de polímero possuindo a estrutura: X-CH2CH2θ-(CH2CH2θ)n-CH2CH2-O-(CH2)m=C =CH em que: X é um grupo funcional, tal como aqui descrito n é cerca de 20 a cerca de 4000; e m é entre 1 e 10. Exemplos específicos de cada um dos polímeros PEG heterobifuncional são mostrados aqui.

[00239] Os derivados PEG contendo acetileno podem ser preparados usando métodos conhecidos por aqueles versados na arte e/ou aqui descrito. Em um método, uma cadeia principal de polímero solúvel em água possuindo um peso molecular médio de cerca de 800 Da a cerca de 100000 Da, a cadeia principal do polímero que tem um primeiro terminal ligado a um primeiro grupo funcional e um segundo terminal ligado a um grupo nucleofílico adequado, é reagida com um composto que tem tanto uma funcionalidade do acetileno e um grupo de saída que é adequado para a reação com o grupo nucleofílico no PEG. Quando o polímero PEG tendo a porção nucleofílica e a molécula tendo o grupo de saída são combinados, o grupo de saída é submetido a um deslocamento nucleófilo e é substituída pela porção nucleófila, obtendo-se o polímero contendo acetileno desejado: X-PEG-Nu+A-L-C^X-PEG-Nu-AC=CR'.

[00240] Conforme mostrado, uma cadeia principal do polímero preferido para uso na reação tem a fórmula X-PEG- Nu, em que PEG é polietilenoglicol, Nu é uma porção nucleofílica e X representa um grupo funcional que não reage com Nu, L ou a funcionalidade acetileno.

[00241] Exemplos de Nu incluem, mas não estão limitados a amina, alcóxi, ariloxi, sulfidrilo, imino, carboxilato, hidrazida, grupos que reagem aminoxi principalmente através de um mecanismo do tipo SN2. Exemplos adicionais dos grupos Nu incluem aqueles grupos funcionais que reagem principalmente através de uma reação de adição nucleofílica. Exemplos de grupos L incluem cloreto, brometo, iodeto, mesilato, tresilato, tosilato e outros grupos submetidos ao deslocamento nucleofílico, bem como as cetonas, aldeídos, tioésteres, olefinas, grupos de carbonil alfa-beta insaturados, carbonatos e outros grupos eletrofílicos esperado para ser submetidos a adição de nucleófilos.

[00242] Em uma outra modalidade, A é um ligante alifático entre 1 a 10 átomos de carbono ou um anel aril substituído de entre 6 a 14 átomos de carbono. X é um grupo funcional que não reage com os grupos alquinil e L é um grupo de saída adequado.

[00243] Em outro método para preparação de derivados de polímeros contendo acetileno, um polímero PEG tendo um peso molecular médio de cerca de 800 Da a cerca de 100.000 Da, tendo ambos um grupo funcional protegido ou um agente de proteção em uma extremidade e um grupo de partida adequado na outra extremidade está em contato com um ânions de acetileno.

[00244] Polímeros solúveis em água podem ser ligados aos polipeptídeos. Os polímeros solúveis em água podem ser ligados por meio de um aminoácido não codificado naturalmente incorporado nos polipeptídeos ou qualquer grupo funcional ou substituinte de um aminoácido não natural codificado ou codificado naturalmente, ou qualquer grupo funcional ou substituinte de um aminoácido codificado naturalmente ou não modificado. Em uma modalidade, o aminoácido não codificado naturalmente é um aminoácido modificado, tal como aqui descrito. Em alternativa, os polímeros solúveis em água estão ligados a um anticorpo de ligação ao antígeno que incorpora um aminoácido não codificado naturalmente através de um aminoácido de ocorrência natural (incluindo, mas não se limitando a, cisteína, lisina ou ao grupo amina do resíduo terminal- N).Em alguns casos, os polipeptídeos compreendem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 aminoácidos modificados, em que um ou mais aminoácidos não codificado naturalmente são ligados ao polímero solúvel em água (incluindo, mas não se limitando a, PEG e/ou oligossacáridos). Em alguns casos, os polipeptídeos compreendem ainda 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais aminoácidos codificados que ocorrem naturalmente ligados aos polímeros solúveis em água. Em alguns casos, os polipeptídeos compreendem um ou mais aminoácidos não codificados que ocorrem naturalmente ligados aos polímeros solúveis em água e um ou mais aminoácidos que ocorrem naturalmente ligados a polímeros solúveis em água. Em algumas modalidades, os polímeros solúveis em água, aumentam a meia-vida no soro dos polipeptídeos em relação à forma não conjugada.

[00245] O número de polímeros solúveis em água ligados a um polipeptídeo (ou seja, o grau de PEGilação ou glicosilação) pode ser ajustado para proporcionar uma alteração (incluindo, mas não se limitando ao aumento ou diminuição) farmacológica, farmacocinética ou farmacodinâmica características, tais como meia-vida in vivo. Em algumas modalidades, a meia-vida de um polipeptídeo é aumentada pelo menos cerca de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 por cento, 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 50 vezes, ou pelo menos cerca de 100 vezes em relação a um polipeptídeo não modificado.

[00246] Em uma modalidade, um polipeptídeo compreendendo um aminoácido codificado que ocorre não naturalmete contendo carbonil é modificado com um derivado PEG que contenha um terminal de hidrazina, hidroxilamina, hidrazida ou porção semicarbazida que está ligada diretamente à cadeia principal de PEG.

[00247] Em algumas modalidades, o derivado PEG-terminal hidroxilamina terá a estrutura: RO-(CH2CH2O)n-O- (CH2)m-O-NH2, em que R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.), m é 2 a 10 e n é 100 a 1000 (isto é, o peso molecular médio está compreendido entre 5 a 40 kDa).

[00248] Em algumas modalidades, o derivado PEG contendo hidrazina ou hidrazida terá a estrutura: RO- (CH2CH2O)n-O-(CH2)m-X-NH-NH2, em que R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.), m é 2 a 10 e n 100 a 1000 é e X é opcionalmente um grupo carbonil (C=O) que pode estar presente ou ausente.

[00249] Em algumas modalidades, o derivado PEG contendo semicarbazida terá a estrutura: -(CH2CH2O)n-O- (CH2)m-O—NH2, em que R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.), m é 2 a 10 e n é 100-1000.

[00250] Em uma outra modalidade, um polipeptídeo que compreende um aminoácido que contém carbonil é modificado com um derivado PEG que contém uma hidroxilamina terminal, hidrazida, hidrazina, semicarbazida ou radical que está ligado à cadeia principal PEG por meio de uma ligação amida.

[00251] Em algumas modalidades, os derivados PEG terminal hidroxilamina tem a estrutura: RO-(CH2CH2O)n-O- (CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-O-NH2, em que R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.), m é 2 a 10 e n é 100 a 1000 (isto é, o peso molecular médio está compreendido entre 5 a 40 kDa).

[00252] Em algumas modalidades, os derivados PEG contendo hidrazida ou hidrazina tem a estrutura: RO- (CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-X-NH-NH2 onde R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.), m é 2 a 10, n é 100 a 1000 e X é opcionalmente um grupo carbonil (C=O) que pode estar presente ou ausente.

[00253] Em algumas modalidades, os derivados PEG contendo semicarbazida têm a estrutura: RO-(CH2CH2O)n-O- (CH2)2-NH-C(O)(CH2)m-NH-C(O)-NH-NH2, onde R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.), m é 2 a 10 e n é 100 a 1000.

[00254] Em uma outra modalidade, um polipeptídeo que compreende um aminoácido que contém carbonil é modificado com um derivado PEG ramificado que contém um terminal de hidrazina, hidroxilamina, hidrazida ou porção semicarbazida, com cada cadeia do PEG ramificado tendo um peso molecular variando de 10 a 40 kDa e, mais preferencialmente de 5 a 20 kDa.

[00255] Em uma outra modalidade, um polipeptídeo compreendendo um aminoácido não codificado naturalmente é modificado com um derivado PEG tendo uma estrutura ramificada. Por exemplo, em algumas modalidades, o derivado PEG com terminal hidrazina ou hidrazida terá a seguinte estrutura: [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m-X-NH-NH2, em que R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.), m é de 2 a 10 e n é 100 a 1000, e X é opcionalmente um grupo carbonil (C=O) que pode estar presente ou ausente.

[00256] Em algumas modalidades, os derivados PEG contendo um grupo semicarbazida terá a estrutura: [RO- (CH2CH2O)n-O-(CH2)2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-NH-C(O)-NH- NH2, em que R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.), X é opcionalmente NH, O, S, C(O) ou não está presente, m é 2 a 10 e n é 100 a 1000.

[00257] Em algumas modalidades, os derivados PEG contendo um grupo hidroxilamina terá a estrutura: [RO- (CH2CH2O)n-O-(CH2) 2-C(O)-NH-CH2-CH2]2CH-X-(CH2)m-O-NH2, em que R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.), X é opcionalmente NH, O, S, C (O) ou não está presente, m é 2 a 10 e n é 100 a 1000.

[00258] O grau e locais nos quais os polímeros solúveis em água estão ligados aos polipeptídeo são capazes de modular a ligação dos polipeptídeos a um antígeno ou receptor.

[00259] Métodos e propriedades químicas para a ativação dos polímeros, bem como para a conjugação de peptídeos encontram-se descritos na literatura e são conhecidos na arte. Métodos vulgarmente utilizados para a ativação de polímeros incluem, mas não estão limitadas a, ativação de grupos funcionais com brometo de cianogênio, periodato, glutaraldeído, biepoxides, epicloridrina, divinilsulfona, carbodiimida, haletos de sulfonil, triclorotriazina, etc. (ver, R. F. Taylor, (1991), PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson et al., (1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N.Y.; Dunn, R. L., et al., Eds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991).

[00260] Várias teses e monografias sobre a funcionalização e conjugação dos PEG estão disponíveis. Veja, por exemplo, Harris, Macronol. Chem. Phys. C25: 325373 (1985); Scouten, Methods in Enzymology 135: 30-65 (1987); Wong et al., Enzyme Microb. Technol. 14: 866-874 (1992); Delgado et al., Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249-304 (1992); Zalipsky, Bioconjugate Chem. 6: 150-165 (1995).

[00261] Os métodos para a ativação dos polímeros também podem ser encontrado no WO 94/17039, patente US 5,324,844, WO 94/18247, WO 94/04193, patente US 5,219,564, patente US 5,122,614, WO 90/13540, patente US 5,281,698, e WO 93/15189, e para a conjugação entre polímeros e enzimas ativadas, incluindo, mas não limitados ao fator de coagulação VIII (WO 94/15625), hemoglobina (WO 94/09027), molécula de transportar oxigênio (patente US 4,412,989), ribonuclease e superóxido dismutase (Veronese at al., App. Biochem. Biotech. 11: 141-45 (1985)). Todas as referências e patentes aqui citadas são incorporadas na sua totalidade por referência.

[00262] PEGuilação (isto é, a adição de qualquer polímero solúvel em água) de polipeptídeo contendo um aminoácido não codificado naturalmente, tais como p-azido- L-fenilalanina, é executada por qualquer método conveniente. Por exemplo, um polipeptídeo é um PEGuilado com derivado mPEG xom termianl alcino. Resumidamente, um excesso de sólido mPEG (5000)-O-CH2-C=CH é adicionado, com agitação, a uma solução aquosa de polipeptídeo contendo p- azido-L-Phe à temperatura ambiente. Tipicamente, a solução aquosa é tamponada com um tampão com pKa próximo do pH ao qual a reação deve ser realizada (geralmente cerca de pH 4 a 10). Exemplos de tampões adequados para a PEGilação a pH 7,5, por exemplo, incluem, mas não estão limitados a, HEPES, fosfato, borato, Tris-HCl, EPPS e TES. O pH é continuamente monitorizado e ajustado se necessário. A reação é tipicamente deixada prosseguir durante entre cerca de 1 a 48 horas.

[00263] Os produtos de reação são, subsequentemente, sujeito a cromatografia de interação hidrofóbica para separar as variantes polipeptídicas PEGiladas livre de mPEG (5000)-O-CH2-C=CH e quaisquer complexos de peso molecular elevado do polipeptídeo peguilado que podem se formar quando PEG desbloqueado é ativado em ambas as extremidades da molécula, assim, reticulam as moléculas as moléculas de variantes polipeptídicas. As condições durante a cromatografia de interação hidrofóbica são, tais que o mPEG livre (5000)-O-CH2-C=CH flui através da coluna, enquanto que quaisquer complexos de variante de polipeptídeo PEGilados reticulados elui após as formas desejadas, que contêm uma molécula de variante de polipeptídeo conjugado com uma ou mais grupos PEG. As condições adequadas variam dependendo dos tamanhos relativos dos complexos reticulados versus os conjugados desejados e são facilmente determinadas por aqueles versados na arte. O eluente contendo os conjugados desejados é concentrado por ultrafiltração e dessalinizada por diafiltração.

[00264] Se necessário, o polipeptídeo PEGuilado obtido a partir da cromatografia hidrofóbica pode ser adicionalmente purificado por um ou mais procedimentos conhecidos dos versados na arte, incluindo, mas não se limita a cromatografia de afinidade; ânions ou cromatografia de troca catiônica (utilizando, incluindo, mas não se limitando a, DEAE-SEPHAROSE); cromatografia em sílica; HPLC de fase inversa; filtração em gel (utilizando, incluindo, mas não se limitando a SEPHADEX G-75); cromatografia de interação hidrofóbica; cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de quelato de metal; ultrafiltração/diafiltração; precipitação com etanol; precipitação com sulfato de amônio; cromatofocagem; cromatografia de deslocamento; procedimentos eletroforéticos (incluindo, mas não se limitando a focagem isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (incluindo, mas não se limitados à precipitação com sulfato de amônio), ou extração. O peso molecular aparente pode ser estimado pela GPC por comparação com padrões de proteínas globulares (PROTEIN PURIFICATION METHODS, A PRACTICAL APPROACH (Harris & Angal, Eds.) IRL Press 1989, 293-306). A pureza do conjugado PEG-polipeptídeo pode ser avaliada pela degradação proteolítica (incluindo, mas não se limitando a, clivagem de tripsina), seguido por análise de espectrometria de massa. Pepinsky B., et al., J. Pharmcol. & Exp. Ther. 297(3):1059-66 (2001).

[00265] Um polímero solúvel em água, ligado a um aminoácido de um polipeptídeo pode ser também derivatizado ou substituído, sem limitação.

[00266] Em uma outra modalidade, um polipeptídeo é modificado com um derivado PEG que contém uma fração de azida que vai reagir com um alcino presente na cadeia lateral do aminoácido não codificado naturalmente. Em geral, os derivados PEG terão um peso molecular médio variando de 1 a 100 kDa e, em algumas modalidades de 10 a 40 kDa.

[00267] Em algumas modalidades, o derivado PEG com terminal azida têm a estrutura: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-N3 em que R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.), m é 2 a 10 e n é 100 a 1000 (isto é, o peso molecular médio está compreendido entre 5 a 40 kDa).

[00268] Em uma outra modalidade, o derivado PEG com terminal azida têm a estrutura: RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)m-NH-C (O)-(CH2)P-N3, onde R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.), m é 2 a 10, p é 2 a 10 e n é 100 a 1000 (isto é, o peso molecular médio está compreendido entre 540 kDa).

[00269] Em uma outra modalidade, um polipeptídeo compreendendo um aminoácido contendo alcino é modificado com um derivado PEG ramificado que contém uma porção terminal de azida, com cada cadeia do PEG ramificado tendo um peso molecular variando de 10 a 40 kDa e, mais preferencialmente, de 5 a 20 kDa. Por exemplo, em algumas modalidades, o derivado de azida de PEG-terminal terá a seguinte estrutura: [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH (CH2)m-X-(CH2)P-N3 em que R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.), m é 2 a 10, p é 2 a 10, e n é 100 a 1000, e X é opcionalmente um grupo O, N, S ou grupo carbonil (C=O), em cada caso, que podem estar presentes ou ausentes.

[00270] Em uma outra modalidade, um polipeptídeo é modificado com um derivado PEG que contém um alcino que vai reagir com uma porção azida presente na cadeia lateral do aminoácido codificado não naturalmente, tal como um aminoácido modificado, aqui descrito.

[00271] Em algumas modalidades, o derivado PEG com terminal alcino terá a seguinte estrutura: RO-(CH2CH2O)n-O- (CH2)m-C=CH em que R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.), m é 2 a 10 e n é 100 a 1000 (isto é, o peso molecular médio está compreendido entre 5 a 40 kDa).

[00272] Em uma outra modalidade, um polipeptídeo compreendendo um aminoácido codificado não naturalmente contendo alcino é modificado com um derivado PEG que contém uma azida ou alcino terminal de terminal que está ligado à cadeia principal de PEG por meio de uma ligação amida.

[00273] Em algumas modalidades, o derivado PEG com terminal alcino terá a seguinte estrutura: RO-(CH2CH2O)n-O- (CH2)m-NH-C(O)-(CH2)p-C=CH em que R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.), m é 2 a 10, p é 2 a 10 e n é 100 a 1000.

[00274] Em uma outra modalidade, um polipeptídeo compreendendo um aminoácido que contém azida é modificado com um derivado PEG ramificado que contém um alcino terminal, com cada cadeia de PEG ramificado tendo um peso molecular variando de 10 a 40 kDa e, mais preferencialmente, de 5 a 20 kDa. Por exemplo, em algumas modalidades, o derivado de PEG com terminal alcino terá a seguinte estrutura: [RO-(CH2CH2O)n-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH (CH2)m-X-(CH2) pC=CH onde R é um alquil simples (metil, etil, propil, etc.), m é 2 a 10, p é 2 a 10, e n é 100 a 1000, e X é opcionalmente um grupo O, N, S ou grupo carbonil (C=O), ou não está presente.

[00275] Em uma outra modalidade, um polipeptídeo é modificado com um derivado PEG que contém um grupo funcional ativado (incluindo, mas sem se limitar ao éster, carbonato), que compreende ainda um grupo aril fosfina que vai reagir com uma porção azida presente na cadeia lateral do aminoácido não codificado naturalmente. Em geral, os derivados PEG terão um peso molecular médio variando de 1 a 100 kDa e, em algumas modalidades, de 10 a 40 kDa.

[00276] Outros exemplos de moléculas PEG que podem ser ligados aos polipeptídeos, bem como métodos de PEGuilação incluem as descritas, por exemplo, nas publicação de patentes americanas números 2004/0001838; 2002/0052009; 2003/0162949; 2004/0013637; 2003/0228274; 2003/0220447; 2003/0158333; 2003/0143596; 2003/0114647; 2003/0105275; 2003/0105224; 2003/0023023; 2002/0156047; 2002/0099133; 2002/0086939; 2002/0082345; 2002/0072573; 2002/0052430; 2002/0040076; 2002/0037949; 2002/0002250; 2001/0056171; 2001/0044526; 2001/0027217; 2001/0021763; patentes americanas números 6,646,110; 5,824,778; 5,476,653; 5,219,564; 5,629,384; 5,736,625; 4,902,502; 5,281,698; 5,122,614; 5,473,034; 5,516,673; 5,382,657; 6,552,167; 6,610,281; 6,515,100; 6,461,603; 6,436,386; 6,214,966; 5,990,237; 5,900,461; 5,739,208; 5,672,662; 5,446,090; 5,808,096; 5,612,460; 5,324,844; 5,252,714; 6,420,339; 6,201,072; 6,451,346; 6,306,821; 5,559,213; 5,612,460; 5,747,646; 5,834,594; 5,849,860; 5,980,948; 6,004,573; 6,129,912; WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378,WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, W095/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, WO 98/05363, EP 809 996, WO 96/41813, WO 96/07670, EP 605 963, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 e EP 154 316, que são aqui incorporados por referência. Qualquer uma das moléculas PEG aqui descritas podem ser utilizadas em qualquer forma, incluindo, mas não se limitando a cadeia simples, cadeia ramificada, cadeia multi-braços, funcional único, bi-funcional, multi-funcional, ou qualquer combinação destes.

[00277] Em determinadas modalidades, os polipeptídeo podem ser ligados às cargas com um ou mais ligantes capazes de reagir com o aminoácido modificado. Um ou mais ligantes podem ser quaisquer ligantes aparentes para aqueles versados na arte. O termo "ligante" é aqui utilizado para se referir a grupos ou ligações que normalmente são formadas como o resultado de uma reação química e são tipicamente ligações covalentes. Ligações hidroliticamente estáveis significam que as ligações são substancialmente estáveis em água e não reagem com água a valores de pH úteis, incluindo, mas sem se limitar a, sob condições fisiológicas, durante um período de tempo prolongado, mesmo indefinidamente. As ligações hidroliticamente instáveis ou degradáveis significam que as ligações são degradáveis em água ou em soluções aquosas, incluindo, por exemplo, sangue. As ligações enzimaticamente degradáveis ou instáveis significam que a ligação pode ser degradada por um ou mais enzimas. Como se entende na arte, o PEG e os polímeros relacionados podem incluir ligações degradáveis na estrutura polimérica ou no grupo ligante entre a estrutura do polímero e um ou mais dos grupos funcionais terminais da molécula do polímero. Por exemplo, as ligações éster formadas por reação de ácidos carboxílicos PEG ou ácidos carboxílicos ativados de PEG com grupos de álcool sobre um agente biologicamente ativo geralmente hidrolisar em condições fisiológicas para liberar o agente. Outras ligações hidroliticamente degradáveis incluem, mas não estão limitadas as ligações de carbonato; as ligações imina resultaram da reação de uma amina e um aldeído; ligações éster fosfato formados pela reação de um álcool com um grupo fosfato; ligações hidrazona que são o produto da reação de uma hidrazida com um aldeído; ligações de acetal que são o produto da reação de um aldeído e um álcool; ligações de ortoéster que são o produto da reação de um formato com um álcool; ligações peptídicas formadas por um grupo amina, incluindo, mas não se limitando a uma extremidade de um polímero, tal como PEG, e um grupo carboxil de um peptídeo; e ligações oligonucleotídicas formadas por um grupo fosforamidita, incluindo, mas não se limitando na extremidade de um polímero, e um grupo 5'hidroxil de um oligonucleótido. Ligantes ramificados podem ser utilizados em polipeptídeo. Um número diferente de ligantes cliváveis é conhecido dos versados na arte. Veja as patentes americanas números 4,618.492; 4,542,225, e 4,625,014. Os mecanismos para a liberação de um agente a partir destes grupos ligantes incluem, por exemplo, a irradiação de uma ligação fotolábil e hidrólise catalisada por ácido. Patente US No. 4,671,958, por exemplo, inclui uma descrição dos imunoconjugados compreendendo ligantes que são clivadas no local alvo in vivo pelas enzimas proteolíticas do sistema do complemento do paciente. O comprimento do ligante pode ser selecionado ou predeterminado, dependendo de uma relação espacial pretendida entre o polipeptídeo e a molécula ligada a ele. Tendo em vista o grande número de métodos que têm sido relatados para a fixação de uma variedade de compostos de radiodiagnóstico, compostos radioterapêuticos, drogas, toxinas e outros agentes para polipeptídeo um perito na arte será capaz de determinar um método adequado para a fixação de um dado agente para um polipeptídeo.

[00278] Qualquer ligante homo ou hetero bifuncional pode ser usado para ligar os conjugados. O ligante pode ter uma vasta gama de peso molecular ou de comprimento molecular. Ligantes de peso molecular maior ou menor podem ser utilizados para fornecer uma relação espacial ou conformação desejada entre o polipeptídeo e a entidade ligada. Os ligantes tendo comprimento molecular maior ou menor também podem ser utilizados para proporcionar um espaço desejado ou flexibilidade entre o polipeptídeo e a entidade ligada. Do mesmo modo, um ligante tendo uma forma ou conformação particular pode ser utilizado para conferir uma determinada forma ou conformação para o polipeptídeo ou a entidade ligada, quer antes ou depois do polipeptídeo atingir o seu alvo. Os grupos funcionais presentes em cada extremidade do elemento de ligação podem ser selecionados para modular a liberação de um polipeptídeo ou uma carga sob condições desejadas. Esta otimização da relação espacial entre o polipeptídeo e a entidade ligada pode fornecer novoas propriedades desejadas ou moduladas para a molécula.

[00279] Em algumas modalidades, são fornecidos ligantes bifuncionais solúveis em água que possuem uma estrutura de pilares que inclui: a) uma azida, um alcino, uma hidrazina, uma hidrazida, uma hidroxilamina, ou um grupo contendo carbonil, em pelo menos uma primeira extremidade de uma cadeia principal do polímero; e b) pelo menos um segundo grupo funcional sobre uma segunda extremidade da cadeia principal do polímero. O segundo grupo funcional pode ser o mesmo do primeiro grupo funcional ou outro. O segundo grupo funcional, em algumas modalidades, não é reativo com o primeiro grupo funcional. Em algumas modalidades, os compostos solúveis em água que compreendem pelo menos um braço de uma estrutura molecular ramificada são fornecidos. Por exemplo, a estrutura molecular ramificada pode ser uma estrutura dendrítica.

Composições Polipeptídicas

[00280] Os polipeptídeo aqui descritos podem ser fórmulados em composições, utilizando métodos disponíveis na técnica e aqueles aqui revelados. Qualquer um dos compostos aqui descritos pode ser proporcionado na composição farmacêutica apropriada e ser administrada por uma via de administração adequada.

[00281] Em certas modalidades, as composições polipeptídicas aqui proporcionadas compreendem adicionalmente um veículo farmaceuticamente aceitável. O veículo pode ser um diluente, excipiente ou veículo com o qual a composição farmacêutica é administrada. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo aqueles de origem petrolífera, animal, vegetal ou de origem sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo e semelhantes. As soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e de glicerol também podem ser empregues como veículos líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Os excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e semelhantes. A composição, se desejado, também pode conter quantidades menores de agentes humidificante ou emulsionantes, ou agentes de tamponamento do pH. Estas composições podem tomar a forma de soluções, suspensões, emulsão, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, fórmulações de liberação sustentada e afins. A fórmulação oral pode incluir veículos correntes, tais como qualidades farmacêuticas de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são descritos em E.W. Martin, 1990, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.

[00282] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é fornecida em uma forma adequada para administração a um sujeito humano. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica vai conter uma quantidade profilaticamente ou terapeuticamente eficaz do polipeptídeo, juntamente com uma quantidade adequada do veículo de modo a proporcionar a forma para administração apropriada ao doente. A fórmulação deve ser adequada ao modo de administração.

[00283] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é fornecida em uma forma adequada para administração intravenosa. Tipicamente, as composições adequadas para administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotónico estéril. Sempre que necessário, a composição pode também incluir um agente solubilizante e um anestésico local tal como lignocaína para aliviar a dor no local da injeção. Tais composições, contudo, podem ser administrados por uma via que não seja a administração intravenosa.

[00284] Em certas modalidadeses, a composição farmacêutica é adequada para administração subcutânea. Em modalidades particulares, a composição farmacêutica é adequada para administração intramuscular.

[00285] Os componentes da composição farmacêutica podem ser fornecidos separadamente ou misturados em uma forma de dosagem unitária, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado isento de água. Quando a composição é para ser administrada por infusão, pode ser dispensada com um frasco de infusão contendo água estéril de grau farmacêutico ou soro fisiológico. Quando a composição é administrada por injeção, uma amostra de água estéril por injeção ou solução salina pode ser fornecida de modo que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

[00286] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é fornecida como um pó seco liofilizado esterilizado, que é capaz de ser reconstituído com a concentração apropriada para a administração a um sujeito. Em algumas modalidades, os polipeptídeo são fornecidos como um concentrado isento de água. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é fornecido como um pó liofilizado estéril seco a uma unidade de dosagem de, pelo menos 0,5 mg, pelo menos 1 mg, pelo menos 2 mg, pelo menos 3 mg, pelo menos 5 mg, pelo menos 10 mg, pelo pelo menos 15 mg, pelo menos 25 mg, pelo menos 30 mg, pelo menos 35 mg, pelo menos 45 mg, pelo menos 50 mg, pelo menos 60 mg ou pelo menos 75 mg.

[00287] Em uma outra modalidade, a composição farmacêutica é fornecida em forma líquida. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é proporcionada na forma líquida e é substancialmente livre de tensioativos e/ou sais inorgânicos. Em algumas modalidades, o polipeptídeo é fornecido em forma líquida como em uma unidade de dosagem de pelo menos 0,1 mg/ml, pelo menos 0,5 mg/ml, pelo menos 1 mg/ml, pelo menos 2,5 mg/ml, pelo menos 3 mg/ml, pelo menos 5 mg/ml, pelo menos 8 mg/ml, pelo menos 10 mg/ml, pelo menos 15 mg/ml, pelo menos 25 mg/ml, pelo menos 30 mg/ml, ou pelo menos 60 mg/ml.

[00288] Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é fórmulada como uma forma de sal. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os formados com ânions, tais como os derivados dos ácidos clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc, e os formados com cátions, tais como os derivados de sódio, potássio, amônio, cálcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.

[00289] Em uso terapêutico, o médico irá determinar a posologia mais apropriada de acordo com um tratamento preventivo ou curativo e de acordo com a idade, peso, estágio da infecção e outros fatores específicos do sujeito a ser tratado. Em certas modalidades, as doses são de cerca de 1 a cerca de 1000 mg por dia para um adulto, ou de cerca de 5 a cerca de 250 mg por dia ou de cerca de 10 a 50 mg por dia para um adulto. Em certas modalidades, as doses são de cerca de 5 a cerca de 400 mg por dia ou 25 a 200 mg por dia por adulto. Em certas modalidades, as taxas de dose de cerca de 50 a cerca de 500 mg por dia também são contemplados.

Métodos de Uso para terapia ou profilaxia.

[00290] Certos polipeptídeo aqui proporcionados podem ser usados para o tratamento ou prevenção de qualquer doença ou estado considerado adequado para o praticante perito na arte. De um modo geral, um método de tratamento ou prevenção compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz da composição de polipeptídeo ou polipeptídeo a um sujeito em necessidade do mesmo para tratar ou prevenir a doença ou condição.

[00291] Uma quantidade terapeuticamente eficaz do polipeptídeo ou composição é uma quantidade que é eficaz para reduzir a gravidade, a duração e/ou os sintomas de uma doença ou condição particular. A quantidade do polipeptídeo ou composição que seja terapeuticamente eficaz na prevenção, tratamento, gerecialmente e/ou melhoria de uma doença particular pode ser determinada por técnicas clínicas padrão. A quantidade precisa do polipeptídeo ou composição a ser administrada dependnedo, em parte, da via de administração, a gravidade da doença ou condição particular, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do médico e as circunstâncias de cada sujeito.

[00292] Em algumas modalidades, a quantidade eficaz do polipeptídeo aqui proporcionada é entre cerca de 0,025 mg/kg e cerca de 1000 mg/kg de peso corporal de um sujeito humano. Em certas modalidades, o polipeptídeo é administrado a um sujeito humano em uma quantidade de cerca de 1000 mg/kg de peso corporal ou menos, cerca de 950 mg/kg de peso corporal ou menos, cerca de 900 mg/kg de peso corporal ou menos, cerca de 850 mg/kg de peso corporal ou menos, cerca de 800 mg/kg de peso corporal ou menos, cerca de 750 mg/kg de peso corporal ou menos, cerca de 700 mg/kg de peso corporal ou menos, cerca de 650 mg/kg de peso corporal ou menos, cerca de 600 mg/kg de peso corporal ou menos, cerca de 550 mg/kg de peso corporal ou menos, cerca de 500 mg/kg de peso corporal ou menos, cerca de 450 mg/kg de peso corporal ou menos, cerca de 400 mg/kg de peso corporal ou menos, cerca de 350 mg/kg de peso corporal ou menos, cerca de 300 mg/kg de peso corporal ou menos, cerca de 250 mg/kg de peso corporal ou menos, cerca de 200 mg/kg de peso corporal ou menos, cerca de 150 mg/kg de peso corporal ou menos, cerca de 100 mg/kg de peso corporal ou menos, cerca de 95 mg/kg de peso corporal ou menos, cerca de 90 mg/kg de peso corporal ou menos, cerca de 85 mg/kg de peso corporal ou menos, cerca de 80 mg/kg de peso corporal ou menos, cerca de 75 mg/kg de peso corporal ou menos, cerca de 70 mg/kg de peso corporal ou menos, ou cerca de 65 mg/kg de peso corporal ou menos.

[00293] Em algumas modalidades, a quantidade eficaz de polipeptídeo aqui fornecida está entre cerca de 0,025 mg/kg e cerca de 60 mg/kg de peso corporal de um sujeito humano. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz de um polipeptídeo da composição farmacêutica aqui proporcionada é cerca de 0,025 mg/kg ou menos, cerca de 0,05 mg/kg ou menos, cerca de 0,10 mg/kg ou menos, cerca de 0 ,20 mg/kg ou menos, cerca de 0,40 mg/kg ou menos, cerca de 0 ,80 mg/kg ou menos, cerca de 1,0 mg/kg ou menos, cerca de 1,5 mg/kg ou menos, cerca de 3 mg/kg ou menos, cerca de 5 mg/kg ou menos, cerca de 10 mg/kg ou menos, cerca de 15 mg/kg ou menos, cerca de 20 mg/kg ou menos, cerca de 25 mg/kg ou menos, cerca de 30 mg/kg ou menos, cerca de 35 mg/kg ou menos, cerca de 40 mg/kg ou menos, cerca de 45 mg/kg ou menos, cerca de 50 mg/kg ou cerca de 60 mg/kg ou menos.

[00294] A composição farmacêutica do presente método pode ser administrada utilizando qualquer método conhecido aos versados na arte. Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser administrada por via intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intravenosa, administração subcutânea, ou qualquer combinação destas. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica é administrada por via subcutânea. Em algumas modalidades, a composição é administrada por via intravenosa. Em algumas modalidades, a composição é administrada por via intramuscular.

Métodos de Uso para a detecção ou diagnóstico.

[00295] Os polipeptídeo aqui apresentados podem ser utilizados para a detecção de qualquer alvo ou para o diagnóstico de qualquer doença ou estado considerado adequado para o praticante perito na arte. Os métodos abrangem a detecção da ligação de um polipeptídeo a um alvo, em uma localização adequada, por exemplo, o organismo apropriado, tecido ou célula. Nos métodos, a formação de um complexo entre o polipeptídeo e o alvo pode ser detectada por qualquer método conhecido daqueles versados na arte. Exemplos incluem ensaios que utilizam reagentes secundários para a detecção, imunoprecipitação e ELISA e ensaios de aglutinação. Uma descrição pormenorizada destes ensaios é, por exemplo, dada em Harlow e Lane, Polypeptides: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1988 555-612, WO96/13590 de Maertens e Stuyver, Zrein et al. (1998) e WO96/29605.

[00296] Para o diagnóstico in situ, o polipeptídeo pode ser administrado a um indivíduo por métodos conhecidos na arte tais como, por exemplo, intravenosa, intranasal, intraperitoneal, intracerebral, injeção intra-arterial de tal modo que uma ligação específica entre um polipeptídeo com uma região eptitópica na proteína amilóide pode ocorrer. O complexo polipeptídeo/alvo pode convenientemente ser detectado através de uma etiqueta presa ao polipeptídeo ou qualquer outro método conhecido na técnica de detecção.

[00297] É também proporcionado aqui, kits para detecção ou diagnóstico. Exemplos de kits compreendem um ou mais polipeptídeo aqui proporcionados, juntamente com um ou mais reagentes úteis para a detecção de um complexo entre um ou mais polipeptídeos e os seus alvos.

Preparação de polipeptídeo compreendendo um aminoácido modificado.

[00298] Os polipeptídeo aqui descritos podem ser preparados por qualquer técnica comum para os versados na arte, sem limitação. As técnicas úteis para a preparação incluem a síntese in vivo, por exemplo, com tRNA modificado e tRNA sintetase, a síntese isenta de células, por exemplo, com tRNA modificado e tRNA sintetase, a síntese polipeptídica de fase sólida e síntese de polipeptídeo em fase líquida. Exemplos destas técnicas são descritas nesta seção e nos exemplos aqui apresentados. Em certas modalidadeses, o polipeptídeo é um anticorpo ou fragmento de anticorpo.

[00299] Em certos métodos, o polipeptídeo é traduzido e/ou transcrito a partir de um ou mais polinucleótideos que codificam o polipeptídeo. Por conseguinte, proporcionam-se aqui polinucleótideos, capazes de codificar os polipeptídeo possuindo um ou mais aminoácidos modificados nas posições de local específico em uma ou mais cadeias polipeptídicas. Em certas modalidades, os polinucleótideos compreendem um codão normalmente não associado com um aminoácido na posição do polinucleótido correspondente à posição do polipeptídeo de local específico para o aminoácido modificado. Exemplos de tais codões incluem codões de parada, codões de 4 pb, codões de 5 pb, e semelhantes. A mistura de reação compreende, tipicamente, um tRNA-sintetase capaz de fazer tRNA que complementa (suprimir) o dito codão. Estes tRNA supressores estão ligados aos aminoácidos modificados para facilitar a sua incorporação no polipeptídeo no local do codão supressor.

[00300] Os polipeptídeos podem ser preparados por técnicas conhecidas dos versados na arte para a expressão de polinucleótideos para incorporar os aminoácidos modificados em posições de local específico de um polipeptídeo. Tais técnicas são descritas, por exemplo, na patente US No. 7,045,337 e 7,083,970, nas publicações dos pedidos de patente Nos. US 2008/0317670, US 2009/0093405, US 2010/0093082, US 2010/0098630, US 2008/0085277 e nas publicações internacionais de patentes WO 2004/016778 A1 e WO 2008/066583 A2, os conteúdos destes são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

[00301] Em certas modalidades, um polipeptídeo pode ser preparado de uma mistura de reação isenta de células compreendendo pelo menos um tRNA ortogonal aminoacilado com um aminoácido modificado, em que os pares de bases tRNA ortogonais com um codão que não está normalmente associado com um aminoácido, por exemplo, um codão de parada; um codão de 4 pb, etc. A mistura de reação também compreende um tRNA sintetase capaz de aminoacilar o tRNA ortogonal com um aminoácido modificado. Um tRNA sintetase que pode ser utilizada é mostrada como SEQ ID NO: 55 e 56 na publicação de patente número US 2008/0233611. Wild-type tyrosyl m. janashcii tRNA também podem ser utilizados. Normalmente, a sintetase ortogonal de tRNA, o que é susceptível a degradação por proteases presentes em extratos de células bacterianas, é sintetizada exogenamente e adicionado à mistura de reação antes de se iniciar a síntese de polipeptídeo. O tRNA ortogonal pode ser sintetizado nas células bacterianas a partir da qual os extratos de células são obtidos, podem ser sintetizados de novo durante a reação de síntese de polipeptídeo, ou podem ser adicionados exogenamente à mistura de reação.

[00302] Em certas modalidades, os componentes que afetam de inserção de aminoácidos modificados e proteína de inserção ou de dobragem são opcionalmente adicionados à mistura de reação. Tais componentes incluem concentrações elevadas de fatores de tradução, para minimizar o efeito do fator de libertação 1 e 2 e para optimizar ainda mais as concentrações dos componentes ortogonais. Proteínas Chaperonas (Dsb System of oxidoreductases e isomerases, GroES, GroEL, DNAJ, DNAK, Skp, etc.) podem ser adicionados exogenamente à mistura de reação ou pode ser sobre-expresso em células de origem utilizadas para preparar o extrato da célula. As reações podem utilizar um reator de grande escala, pequena escala, ou podem ser multiplexados para executar uma pluralidade de sínteses simultâneas. Reações contínuas usarão um mecanismo de alimentação para introduzir um fluxo de reagentes, e pode-se isolar o produto final como parte do processo. Sistemas Batch também são de interesse, onde podem ser introduzidos reagentes adicionais para prolongar o período de tempo para a síntese ativa. Um reator pode ser executado em qualquer um dos modos como em bateladas, em bateladas estendida, semi- descontínua, semi-contínua, batelada de alimentação e contínuas, e que serão selecionadas em conformidade com a finalidade da aplicação. As reações podem ser de qualquer volume, quer em pequena escala, geralmente pelo menos cerca de 1 μl e não mais do que cerca de 15 μl, em uma reação superior, em que o volume de reação é de pelo menos cerca de 15 μl, normalmente pelo menos cerca de 50 μl, mais usualmente pelo menos cerca de 100 μl, e pode ser de 500 μl, 1000 μl, ou maior. Em princípio, as reações podem ser conduzidas em qualquer escala, desde que o oxigênio suficiente (ou outro aceitador de elétrons) seja fornecido quando necessário.

[00303] Os métodos úteis para a síntese em que pelo menos um aminoácido modificado é introduzido na cadeia polipeptídica durante o alongamento incluem, mas não estão limitados a: (i) adição de exógeno sintetase ortogonal purificado, aminoácidos modificados e tRNA ortogonal para a reação isenta de células, (II) adição de exógeno sintetase ortogonal purificado, aminoácido modificado à mistura de reação, mas com tRNA ortogonal transcritas durante a reação isenta de células, (III) adição de exógeno sintetase ortogonal purificado, aminoácido modificado à mistura de reação, mas com tRNA ortogonal sintetizado pelo organismo de fonte de extrato celular. Em certas modalidades, os componentes ortogonais são accionados por promotores reguláveis, de modo que os níveis de síntese podem ser controlados, embora outras medidas possam ser utilizadas, tais como controlar o nível dos moldes de DNA relevantes por adição ou por digestão específica.

[00304] Em certas modalidades, tRNA sintetase é sintetizado exogenamente e adicionado à mistura de reação isenta de células. Em certas modalidades, a mistura de reação é preparado a partir de células bacterianas em que ompT foi inativado ou é naturalmente inativo. Acredita-se que OmpT degrada os componentes da mistura de reação incluindo tRNA sintetase.

[00305] Em adição aos componentes acima, tais como extratos isentos de células, modelo genético e aminoácidos, materiais especificamente necessários para a síntese proteíca podem ser adicionados à reação. Estes materiais incluem sais, ácido folínico, AMP cíclico, inibidores de proteína ou ácido nucléico enzimas degradantes, inibidores ou reguladores da síntese de proteínas, ajustadores de potencial de oxidação/redução, surfactantes não desnaturante, componentes do tampão, espermina, espermidina, putrescina, etc.

[00306] De preferência os sais incluem potássio de magnésio, e sais de amônio (por exemplo, ácido acético ou ácido glutâmico). Um ou mais destes sais podem ter um aminoácido alternativo como um contra-ânion. Há uma interdependência entre as espécies iônicas para a concentração ideal. Estas espécies iônicas são tipicamente otimizadas no que diz respeito à produção de proteínas. Quando se altera a concentração de um determinado componente do meio de reação, que de outro componente pode ser alterada em conformidade. Por exemplo, as concentrações de vários componentes, tais como nucleídos e compostos de fonte de energia podem ser ajustados simultaneamente de acordo com a mudança nos outros componentes. Além disso, os níveis de concentração dos componentes no reator podem ser variados ao longo do tempo. O ajustador de potencial de oxidação/redução podem ser ditiotreitol, ácido ascórbico, glutationa e/ou as suas formas oxidadas.

[00307] Em certas modalidades, a reação pode prosseguir em um modo de diálise, de um modo descontínuo diafiltração, em um modo descontínuo com alimentação em um modo de operação semicontínua. Em certas modalidades, uma solução de alimentação pode ser fornecida ao reator por meio de uma membrana ou através de uma unidade de injeção. Polipeptídeo sintetizado podem acumular no reator seguido de isolamento ou de purificação após a conclusão da operação do sistema. As vesículas contendo o polipeptídeo também podem ser isoladas continuamente, por exemplo, por adsorção de afinidade a partir da mistura de reação quer in situ quer em um circuito de circulação, como o fluido é bombeado através da reação da matriz de adsorção.

[00308] Durante a síntese de proteínas no reator, os meios isolantes de proteína para seletivamente isolar a proteína desejada podem incluir uma unidade empacotada com partículas revestidas com moléculas de polipeptídeo ou de outras moléculas sintetizadas para adsorver a proteína desejada. De preferência, a proteína de isolamento, compreende duas colunas para uso alternado.

[00309] O polipeptídeo resultante pode ser purificado ou isolado por técnicas convencionais. Exemplos de técnicas são fornecidas nos exemplos aqui apresentados.

Métodos de Ensaio

[00310] Os polipeptídeo podem ser ensaiados para a sua atividade esperada, ou para uma nova atividade, de acordo com qualquer ensaio evidente para os versados na arte. O polipeptídeo resultante pode ser testado quanto à atividade em um ensaio funcional ou por quantificação da quantidade de proteína presente em um ensaio não funcional, por exemplo, imunocoloração, ELISA, na quantificação de Coomassie ou prata do gel corado, etc, e determinar a proporção de proteína biologicamente ativa a proteína total.

[00311] A quantidade de proteína produzida em uma reação de tradução pode ser medida de várias formas. Um método baseia-se na disponibilidade de um ensaio que mede a atividade da proteína particular a ser traduzida. Um exemplo de um ensaio para medir a atividade da proteína é um sistema de ensaio de luciferase, ou sistema de ensaio cloranfenicol-acetil-transferase. Estes ensaios medem a quantidade de proteína funcionalmente ativa produzida a partir da reação de tradução. Os ensaios de atividade não medirão a proteína completa que está inativa devido ao dobramento de proteínas inadequada ou falta de outras modificações pós traducionais necessárias para a atividade da proteína.

[00312] Um outro método para medir a quantidade de proteína produzida nas reações de transcrição e de tradução acopladas in vitro realiza as reações usando uma quantidade conhecida de um aminoácido radiomarcado tal como 35S- metionina, 3H-leucina ou 14C-leucina e, subsequentemente, medindo a quantidade de aminoácido radiomarcado incorporado na nova proteína traduzida. Ensaios de incorporação medirão a quantidade de aminoácidos radiomarcados em todas as proteínas produzidas em uma reação de tradução in vitro, incluindo os produtos de proteínas truncadas. A proteína marcada radioativamente pode ser ainda separada sobre um gel de proteína, e por autorradiografia confirmaram que o produto é o tamanho adequado e que os produtos proteicos secundários não tenham sido produzidos.

Preparação Aminoácidos Modificados

[00313] Os compostos aqui proporcionados podem ser preparados, isolados ou obtidos por qualquer método evidentes para os versados na arte. Os compostos aqui proporcionados podem ser preparados de acordo com o Esquema de Preparação Geral aqui fornecido. As condições de reação, reagentes e etapas não apresentadas no Esquema de Preparação Geral seria aparente e conhecido por aqueles versados na arte.Esquema de Preparação Geral 1a

Esquema de Preparação Geral 1b

[00314] No Esquema de Preparação Geral 1a, descrito no contexto da fórmula I. No Esquema de Preparação Geral 1b, W4 é definido, tal como descrito no contexto da fórmula II.

EXEMPLOS

[00315] Tais como aqui utilizados, os símbolos e convenções utilizados nestes processos, esquemas e exemplos, independentemente de uma abreviatura particular são especificamente definidos e são consistentes com os usados na literatura científica contemporânea, por exemplo, o Journal of Biological Chemistry.

[00316] Para todos os exemplos seguintes, o procedimento padrão e métodos de purificação conhecidos por aqueles versados na arte podem ser utilizados. Salvo indicação contrária, todas as temperaturas são expressas em °C (graus Centígrados). Todos os métodos são realizados à salvo indicação contrária. Exemplo 1 2-Amino-3-(5-azidometil-piridin-2-il)-Ácido propiônico (1)

Preparação do composto A2

[00317] O anidrido acético (0,42 mL, 4,5 mmol, 1,1 eq) foi lentamente adicionada a uma solução de A1 (sal de HCl, 1,0 g, 4,1 mmol, 1 eq) e K2CO3 (1,18 g, 8,6 mmol, 2,1 eq) em água (20 mL) à temperatura ambiente. A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante 1 h. A água foi removida em um rotavapor, e o resíduo foi tratado com metanol. O sólido foi removido por filtração. A solução de metanol foi concentrada e o resíduo foi purificado por FCC (MeOH/DCM = 10/1) para proporcionar acetamida A2 (0,73 g, 71%) como um sólido branco. LCMS m/z: 253 (M+1). Preparação do composto A3

[00318] O cloreto de tionil (0,32 mL, 4,3 mmol, 1,5 eq) foi lentamente adicionada a uma solução da acetamida A2 (0,73 g, 2,9 mmol, 1 eq) e DMF (22 μL, 0,29 mmol) em CHCla (25 mL) à temperatura ambiente. Após 4 h, SOCl2 adicional (80 μL, 1,1 mmol) foi adicionado e a mistura foi agitada durante mais de 4 h. A mistura de reação foi diluída com CHCl3 (50 ml), e, em seguida, lavou-se com NaHCO3 saturado. A camada aquosa foi extraída duas vezes com CHCl3. As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre MgSO4. O produto bruto A3 (0,74 g, 95%) foi utilizado diretamente para a seguinte reação. LCMS m/z: 271 (M+1).Preparação do composto A4

[00319] Uma mistura do cloreto A3 (1,33 g, 4,9 mmol, 1 eq), NaN3 (0,64 g, 9,8 mmol, 2 eq) e Nal (73 mg, 0,49 mmol, 0,1 eq) em DMF (20 mL) foi agitada a 60oC durante 15 h. A mistura de reação foi então concentrada até à secar. O produto bruto foi purificado por FCC (EA) para dar o produto azido A4 (0,95 g, 71%). LCMS m/z: 278 (M+1).Preparação do composto A5

[00320] Uma mistura do éster metílico A4 (0,95 g, 3,4 mmol, 1 eq) e LiOH-H2O (0,29 g, 6,8 mmol, 2 eq) em THF/ água (6 mL/3 mL) foi agitada à temperatura ambiente por 3 h. A mistura de reação foi neutralizada a pH 7 com 1 N de HCl, e, em seguida, concentrada até secar. O produto bruto A5 (~ 0,91 g, quantitativo) foi usado diretamente para a seguinte reação. LCMS m/z: 264 (M+1), 262 (M-1).Preparação do composto (1)

[00321] Acilase I (100 mg, Sigma, A3010, Grau I) foi adicionada a uma solução de acetamida A5 (0,91 g, 3,4 mmol) em água (60 mL). Depois do pH da solução ser ajustado para 7,8 com 1 N da solução de hidróxido de lítio aquoso. A mistura de reação foi agitada a 38°C durante 16 h. Carvão ativado (2 g) foi adicionado e a solução foi agitada durante 10 min. A mistura foi filtrada através de uma almofada de Celite. O filtrado foi concentrado com cerca de 20 ml, que foi usado diretamente para a purificação por HPLC. As frações contendo o produto puro (1) foram combinadas e concentradas até secar. A amostra final foi secada por liofilização, para se obter aminoácido (1) (0,35 g, 46%) como um pó branco. LCMS m/z: 222 (M+1), 220 (M-1). 1H NMR (300 MHz, D2O) δ 8.36 (s, 1H), 7.71 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 4.36(s, 2H), 3.98 (dt, J = 2.7 e 6.5 Hz, 1H), 3.32-3.16 (m, 2H). Exemplo 2 Preparação do Composto (3)

Procedimento geral para preparação do composto (3)

[00322] Uma solução de piridina substituída de aminoácidos P (2 g, 8,6 mmol, 1,0 eq) em DCM adicionou-se trietilamina (3 mL, 21,5 mmol, 2,5 eq). A mistura de reação foi arrefecida a 0°C em banho de gelo e anidrido acético (0,974 mL, 10,3 mmol, 1,2 eq) foi adicionado gota a gota durante 5 min. A mistura foi aquecida até à temperatura ambiente e agitada por 3 h. Todos os solventes e os voláteis foram removidos e o resíduo (P1 bruto) foi secado a vácuo e utilizado na etapa seguinte sem purificação adicional.

[00323] O P1 bruto acima foi dissolvido em metanol anidro (20 mL) e arrefeceu a 0°C em banho de gelo. O cloreto de tionil (1,87 mL, 25,8 mmol, 3,0 eq) foi adicionado gota a gota durante 10 min. A mistura foi aquecida até a temperatura ambiente, e agitada durante a noite. O solvente foi removido, dissolvido em acetato de etil/NaHCO3 (3x), secado sobre Na2SO4 e foi concentrada para dar P2 bruto, o qual foi purificado por coluna de gel de sílica (DCM: MeOH = 9:1) para dar P2 (550 mg, 25%).

[00324] Uma solução de P2 (550 mg, 2,18 mmol, 1,0 eq) em clorofórmio (10 mL) foi adicionado 2 gotas de DMF. A mistura de reação foi arrefecida a 0°C em banho de gelo e cloreto de tionil (634 μl, 8,72 mmol, 4 eq) foi adicionado gota a gota por 5 min. A mistura foi aquecida até à temperatura ambiente e agitada durante a noite. A reação foi trabalhada com DCM/NaHCO3. A camada orgânica foi seca sobre Na2SO4 e purificada por coluna de gel de sílica (DCM: MeOH = 9:1) para dar o produto P3 (450 mg, 76%).

[00325] Uma solução de P3 (450 mg, 1,67 mmol, 1,0 eq) em DMF (10 mL) foi adicionado NaN3 (217 mg, 3,34 mmol, 2,0 eq) e Nal (25 mg, 0,167 mmol, 0,1 eq). A mistura de reação foi aquecida a 60 °C durante a noite. A reação foi trabalhada com DCM/NaHCO3. A camada orgânica foi seca sobre Na2SO4 e purificada por HPLC preparativa para dar produto P4 (400 mg, 86%).

[00326] Uma solução de P4 (400 mg, 1,44 mmol, 1,0 eq) em MeOH (5 mL) foi adicionada LiOH (303 mg, 7,2 mmol, 5 eq, em 5 mL de H2O). A reação foi agitada à temperatura ambiente durante 2h. O solvente foi removido e o resíduo foi utilizado diretamente na etapa seguinte sem purificação adicional.

[00327] Uma solução do resíduo acima em pequena quantidade de DMSO e tampão de NaH2PO4-Na2HPO4 (20 mL) foi adicionada acilase (100 mg) em 5 mL de tampão. A mistura foi aquecida a 37°C durante 72 h. Carvão vegetal (200 mg) foi adicionado à reação e foi agitada à temperatura ambiente durante 10 min, filtrada através de uma almofada de Celite. O filtrado foi concentrado e purificado por HPLC preparativa para dar o produto (3) (85 mg) como sal de HCl. LC-MS (ESI): 222 (M+1), 220 (M-1). 1HNMR (300 MHz, CD3OD) δ 8,50 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 8,17 (s, 1H), 7,33 (s, 1H), 7,27 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,49 (s, 2H), 4,03 (m, 1H), 3,42 (dd, 1H, J = 3,6 e 12,0 Hz,1H), 3,27 (m, 2H). Exemplo 3 Preparação do Composto (2)

Procedimento geral para preparação do composto (2)

[00328] Em uma solução de aminoácidos substituídos de piridina N (2 g, 8,6 mmol, 1,0 eq) em metanol (20 mL) a 0°C foi adicionado cloreto de tionil (1,25 mL, 17,82 mmol, 2,0 eq) gota a gota durante 10 min. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. O solvente foi removido para dar um resíduo (bruto N1), o qual foi seco a vácuo e utilizado na etapa seguinte sem purificação adicional.

[00329] Em uma solução de N1 bruto e trietilamina (4,8 mL, 34,4 mmol, 4,0 eq) em THF (20 mL) a 0°C foi adicionado gota a gota anidrido acético (1,22 mL, 12,9 mmol, 1,5 eq) ao longo de 10 min. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 3h. A reação foi diluída com DCM e lavada com NaHCO3 (3x), secada sobre Na2SO4, e purificado por coluna de gel de sílica (DCM: MeOH = 9:1) para dar o produto N2 (1,0 g, 46%).

[00330] Em uma solução de N2 (2 g, 7,94 mmol, 1,0 eq) em clorofórmio (20 mL) foram adicionadas 4 gotas de DMF. A mistura de reação foi arrefecida a 0°C em banho de gelo e cloreto de tionil (2,3 mL, 31,76 mmol, 4 eq) foi adicionado gota a gota durante 10 min. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A reação foi trabalhada com DCM/NaHCO3. A camada orgânica foi seca sobre Na2SO4 e purificada por coluna de gel de sílica (DCM: MeOH = 9:1) para dar o produto N3 (1 g, 47%).

[00331] Em uma solução de N3 (1 g, 3,7 mmol, 1,0 eq) em DMF (20 mL) foi adicionado NaN3 (481 mg, 7,4 mmol, 2,0 eq) e Nal (55,5 mg, 0,37 mmol, 0,1 eq). A mistura de reação foi aquecida a 60°C em um banho de óleo durante a noite. A reação foi diluída com DCM. A camada orgânica foi lavada com NaHCO3, secada sobre Na2SO4 e purificada por coluna de gel de sílica (DCM: MeOH = 9:1) para dar o produto N4 (1,8 g, 98%) como um óleo amarelo.

[00332] Uma solução de N4(1g, 3,6 mmol, 1,0 eq) em MeOH(20 mL) foi adicionado LiOH(757 mg, 18mmol, 5eq, em 10mL de água). A reação foi agitada a temperatura ambiente por 2 h. O solvente foi removido e o resíduo foi utilizado diretamente na etapa seguinte sem purificação adicional.

[00333] Uma solução do resíduo acima em DMSO pequeno e 50mM de tampão NaH2PO4-Na2HPO4 (100 ml de acilase foi adicionado (100 mg). A mistura foi aquecida a 37°C durante 48 h. A carvão vegetal (200 mg) foi adicionado à mistura de reação, e agitou-se à temperatura ambiente por 10min, filtrada em Celite. O filtrado foi concentrado e recristalizado a partir de MeOH para dar o produto(2) (1,3 g). LC-MS (ESI): 222 (M+1), 220 (M-1). 1HNMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 8,44 (s, 1H), 7,76 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 7,33 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,44 (s, 2H), 3,45 (m, 1H), 2,98-3,12 (m, 2H), 3,27 (m, 2H). Exemplo 4 Preparação do Composto (30)

Procedimento geral para preparação do composto (30)

[00334] Uma solução de éster metílico Phe B1 (50 g, 232 mmol, 1,0 eq) em DCM (300 mL) foi adicionada trietilamina (81 mL, 580 mmol, 2,5 eq) a 0°C foi adicionado anidrido acético (33 mL, 348 mmol, 1,5 eq) gota a gota durante 15 min. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 3h. A reação foi lavada com NaHCO3 (2x), secada sobre Na2SO4 e purificada por coluna de gel de sílica (DCM: MeOH = 9:1) para dar o produto B2 (50 g, 97%) como um sólido branco.

[00335] Uma mistura de éster B2 (52 g, 0,235 mol, 1,0 eq), MOM-Cl (136 mL, 1,79 mol, 7,6 eq) e ZnCl2 (128 g, 0,94 mol, 4,0 eq) foi agitada de 6 a 8°C por 8h. Após a remoção do volátil em rotavapor de 6 a 8°C, o resíduo foi vertido em gelo-água e extraída com acetato de etil (3x). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com NaHCO3 e secada sobre Na2SO4, e concentrada até um pequeno volume. Éter (50 mL) foi então adicionado. A solução de éter foi mantida em um frigorífico durante a noite a -20°C. O produto cristalizado foi filtrado e secado a vácuo para dar o produto B3 (31 g, 49%) como um sólido branco.

[00336] Uma soluçãode B3 (20 g, 74,2 mmol, 1,0 eq) em DMF (100 mL) foi adicionado NaN3 (9,64 g, 148 mmol, 2,0 eq) e Nal (1,11 g, 7,42 mmol, 0,1 eq). A mistura de reação foi aquecida a 60°C em um banho de óleo durante a noite. O solvente DMF foi removido sobre um evaporador rotativo, e a mistura de reação foi dissolvida em acetato de etil, e lavada com NaHCO3 (3x), secada sobre Na2SO4, e purificado por coluna de gel de sílica (DCM: MeOH = 9:1) para dar o produto B4 (20,5 g, 100%) como um óleo amarelo.

[00337] Uma solução de B4 (20 g, 724 mmol, 1,0 eq) em uma solução mista de THF: MeOH: H2O (50 mL: 50 mL: 20 mL) adicionou-se LiOH-H2O (6,94 g, 144,8 mmol, 2 eq). A reação foi agitada à temperatura ambiente durante 2h. O solvente foi removido para dar um resíduo, que foi processado com acetato de etil. A camada orgânica foi lavada com 1N HCl (3x), secada sobre Na2SO4 e concentrada para dar o produto B5 (18,3 g, 96%) como um óleo amarelo.

[00338] Uma solução de amida B5 acima (18g, 68,7 mmol) em DMSO (20 mL) e tampão de NaH2PO4- 50 mM NaH2PO4- Na2HPO4 (1,8 L) foi adicionado (1 g). A solução foi aquecida a 37°C durante 48 h. Carvão vegetal (20 g) foi adicionado à mistura de reação, e agitada à temperatura ambiente durante 10 min, filtrada através de Celite. O filtrado foi lavado com acetato de etil. A camada aquosa foi concentrada até um pequeno volume, e o produto foi precipitado como um sólido branco. O sólido foi filtrado e secado a vácuo para dar o produto (30) (10 g, 66%) como um sólido branco. LC-MS (ESI): 221 (M+1). 1H NMR (300 MHz,DMSO-d6) δ 7,27 (br s, 4H), 4,37 (s, 2H), 3,43 (m, 2H), 3,17 (m, 1H), 2,84 (m, 1H). Exemplo 5 Preparação do Composto (40)

Procedimento geral para a preparação do composto (40)

[00339] Em uma solução de J (10 g, 55,2 mmol, 1,0 eq) em DMSO (100 mL) foi adicionada azida de sódio (5,4 g, 82,8 mmol, 1,5 eq) em várias porções com agitação. A mistura foi aquecida a 40 a 50°C durante 5h. Depois de ser arrefecida até à temperatura ambiente, a mistura foi diluída com água (200 mL), e extraiu-se com éter (3x). A camada orgânica combinada foi lavada com salmoura, secada sobre Na2SO4 e concentrada para dar o produto J1 (7,8 g, 98,7%) como óleo.

[00340] O produto J1 acima (7,8 g, 54,5 mmol) foi suspenso em uma mistura de LiOH (11,4 g, 274 mmol, 5,0 eq) em água (100 mL) e MeOH (20 mL). A mistura foi deixada em agitação à temperatura ambiente durante 1 h e diluída com água (200 mL), e extraída com éter (3x). A camada aquosa foi acidificada com 1N de HCl até pH 2, e extraída com éter (3x). As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre Na2SO4 e concentradas para dar o produto J2 (7 g, 100%) como óleo.

[00341] Em uma solução de J2 (500 mg, 3,88 mmol, 1,0 eq) em DCM a 0°C foi adicionada N-metil morforlina (NMM, 510 ml, 4,65 mmol, 1,2 eq) e cloroformato de isobutil (607 ul, 4,65 mmol, 1,2 eq). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 2h. Na solução acima foi adicionado éster metílico de Boc-Lys (1,15 g, 3,88 mmol, 1,0 eq). A mistura foi agitada à temperatura ambiente por 3 h, suavizada com água. A reação foi extraída com DCM (3x). A camada orgânica foi lavada com salmoura e secada sobre Na2SO4 e, em seguida, concentrada para dar o produto J3 (900 mg, 63%) como óleo.

[00342] Em uma solução de J3 (900 mg, 2,42 mmol, 1,0 eq) em uma mistura de THF: MeOH: H2O (5 mL: 3 mL: 2 mL) adicionou-se LiOH (508 mg, 12,1 mmol, 5,0 eq). A mistura foi deixada a agitar à temperatura ambiente durante 1 h, concentrada até à secura para dar o sal de sódio bruto J4.

[00343] O produto bruto J4 foi tratado com 4N de HCl em dioxano (10 mL) e agitado à temperatura ambiente durante 1 h, concentrado para dar o produto bruto (40), o qual foi purificado por HPLC preparativa, para render (40) puro (332 mg, 53 %) como um sólido branco. LC-MS (ESI): 258 (M+1), 256 (M-1). 1H NMR (300 MHz, D2O) δ 3,52 (t, J = 6,9 Hz, 1H), 3,15 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 2,99 (t, J = 6,9 Hz, 2H), 2,12 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 1,66 (m, 4H), 1,35 (m, 2H), 1,18 (m, 2H).Exemplo 6 Avaliação da reatividade dos compostos (30) e (40)

[00344] Este exemplo proporciona uma avaliação da taxa de reação dos compostos (30) e (40), em comparação com um composto de referência, p-azido-fenilalanina (50).

[00345] DBCO analógico (60) foi dissolvido em acetonitrila a uma concentração de 60 μM. Análogos de aminoácidos (30), (40) e (50) foram diluídos em série em tampão PBS nos poços de uma placa de microtitulação de 96 poços em um volume de 180 μL. 20 μL de solução de estoque analógico DBCO foi adicionado a cada poço e a cinética da perda de DBCO para formar o aduto de adição foi monitorizada a 310 nm por absorvância usando um leitor de placa SpectraMax a 25°C. Um esquema da reação dos compostos (30), (40) e (50) com o composto (60) é apresentado na Figura 1. A cinética encaixa com precisão uma primeira ordem com decaimento A310 = A0 * (1-exp (-kobs*t)), onde kobs é a pseudo constante de velocidade de primeira ordem com unidades de s-1, sob condições em que [composto Azida] >> [DBCO]. Um gráfico de kohs versus [Azida] produz a constante de velocidade de segunda ordem (unidades de M-1 seg-1) para cada um dos aminoácidos, uma medida da reatividade química intrínseca de cada aminoácido.

[00346] Os resultados da experiência são apresentados conforme a figura 2. Surpreendentemente, os compostos (30) e (40) exibiram uma constante de velocidade de primeira ordem de 1,4 M-1 s-1, cerca de 7 vezes superior constante de velocidade de primeira ordem 0,2 M-1 s-1para o composto (50). Experiências semelhantes foram realizadas para avaliar a reatividade de compostos (1), (2) e (3); a reação dos compostos (1), (2) e (3) foi superior a 90% completa em 30 minutos e completada em menos de 2 horas, sugerindo que os compostos (1), (2) e (3) exibem taxas de exposição constantes semelhantes às dos compostos (30) e (40).Exemplo 7

[00347] A incorporação de composto (30) em um polipeptídeo exemplificativo, GFP.

[00348] Este exemplo descreve a incorporação de composto (30) para a proteína fluorescente verde. Para monitorizar a síntese de GFP, o turboGFP contendo DNA que codifica um codão âmbar (codão de parada) antes do cromóforo foi clonado no vetor de expressão OCFS pYD317. O codão de parada (TAG) foi inserido pela sobreposição de mutagênese PCR com os nucleótideos correspondentes ao aminoácido tirosina no 50° aminoácido de acordo com a estrutura cristalina de turboGFP (2G6X pdb). Estudos anteriores com este local demonstrou que as substituições não aromáticas nesta posição resultaram em uma ausência de fluorescência e que a supressão com uma nnAA aromático no codão de parada resulta em fluorescência.

[00349] As reações foram incubadas a 30°C em um espectrofotômetro (Molecular Devices, SpectraMaxM5) durante cinco horas com uma cobertura adesiva (VWR, 9503130) e intensidade de fluorescência medida em intervalos de 10 minutos, ÀEX = 47 6 nm e ÀEm = 51. A mistura de reação OCFS foi imediatamente adicionada nas microplacas um volume de reação final de 30 μL contendo 30% de extrato S30, 24 μg/mL de RNA polimerase T7, 1 mM de L-tirosina (Sigma, T8566), pré-mistura*, 10 μM de tRNA, 5 μM pCNFRS D286R, 1 mM do composto (30), e 3 nM de plasmídeo turboGFP (Evrogen, Rússia, subclonado em um vetor PYD317) em água tratada com DEPC (G Biosciences, 786-109). Uma reação de controle positivo utilizando turboGFP sem o codão de parada foi usada para assegurar que as reações prosseguam com taxas semelhantes as anteriormente observadas, enquanto que as reações contendo turboGFP Y50TAG foram também executadas sem tRNA para garantir que não foi detectada fluorescência (controle negativo), na ausência do sistema responsável pela incorporação de PAMF. A incorporação de pAMF em GFP alcança rendimentos relativamente elevados de proteína de um modo de local específico. A Figura 3 mostra um decurso de tempo para pAMF incorporação no local Y50TAG em GFP.Exemplo 8 A incorporação de composto (30) em um polipeptídeo exemplificativo, GM-CSF

[00350] O DNA que codifica o GMCSF humano com codão âmbar foi clonado no vetor de expressão pYD317. O codão TAG foi inserido pela sobreposição da mutagênese PCR com os nucleótideos correspondentes para o aminoácido serina na posição 6.

[00351] Extratos isentos de células que contêm tRNA CUA foram descongelados à temperatura ambiente e incubados com 50 μM de iodoacetamida durante 30 min. As reações isentos de células ocorreram a 30°C durante até 10 h, com 30% (v/v) de extrato tratado com iodoacetamida-glutamato de magnésio 8 mM, glutamato de amônio 10 mM, 130 mM de glutamato de potássio, 35 mM de piruvato de sódio, 1,2 mM de AMP, 0,86 mM de cada um de BPF, UMP e CMP, 2 mM de aminoácidos de todos os 18 aminoácidos, exceto tirosina e fenilalanina que foram adicionadas a 0,5 mM, 4 mM de oxalato de sódio, 1 mM de putrescina, 1,5 mM de espermidina, 15 mM de fosfato de potássio, 100 nM de T7 RNAP, 1,3 μM de E. coli DsbC, 2 mM de oxidada (GSSG), 1 μM de tRNA-sintetase, e 1 mM de composto (30). As concentrações de plasmídeo variante GMCSF TAG foi de 5 μg/ mL. Para marcar a proteína sintetizada com 14C, 3,33% (v/v) de 1-[U-14C]-leucina(300 mCi/mmol; GE Life Sciences, Piscataway, NJ) foram acrescentados a reação.

[00352] Para reduzir o gel, 4 μL de amostra, 1 μL de 1M de DTT, 7 μL de DI H2O e 4 μL de 4X tampão de LDS (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram misturados e aquecidos em borrão quente a 70°C durante 5 minutos. As amostras foram analisadas por 4~12% géis Bis-Tris SDS-PAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as recomendações do fabricante. Os géis foram secos e analisados por autorradiografia utilizando um Phosphoimager Storm 840 após cerca de 16 horas de exposição.

[00353] A autorradiografia demonstrou que comprimento completo intacto GMCSF contendo o composto (30) foi feita.Exemplo 9 A incorporação do composto (30) em um polipeptídeo exemplificativo, IgG

[00354] Para demonstrar a possibilidade de incorporação do composto (30) em IgG, o DNA que codifica a cadeia pesada de trastuzumab contendo um codão âmbar e o DNA que codifica a cadeia leve trastuzumab foram clonados em um vetor de expressão pYD317. O codão TAG foi inserido pela sobreposição de mutagênese PCR com os nucleótideos correspondentes para o aminoácido serina na posição 136 pelo índice UE no domínio CH1.

[00355] Extratos livres de células foram descongelados à temperatura ambiente e incubados com 50 μM de iodoacetamida durante 30min. As reações isentas de células ocorreram a 30°C durante até 10h, com 30% (v/v) de com 8mM de extrato tratado de iodoacetamida-glutamato de magnésio, 10mM de glutamato de amônio, 130mM de glutamato de potássio, 35mM de piruvato de sódio, 1,2 mM de AMP, 0,86 mM de cada um de BPF, UMP e CMP, 2mM de aminoácidos de todos os 18 aminoácidos, exceto tirosina e fenilalanina que foram adicionadoas a 0,5mM, 4 mM de oxalato de sódio, 1 mM de putrescina, 1,5 mM de espermidina, 15 mM de fosfato de potássio, 100 nM de T7 RNAP, 1,3 μM de E. coli DsbC, 5μM e levedura PDI, 2mM oxidada (GSSG), 15 μM de tRNA, 1 μM de tRNA-sintetase, e 1 mM do composto(30). As concentrações de plasmídeo variante TAG de cadeia pesada e cadeia leve foi de 7,5 μg/mL e 2,5 μg/mL. Para marcar a proteína sintetizada com 14C, 3,33% (v/v) de 1-[U-14C]-leucina(300 mCi/mmol; GE Life Sciences, Piscataway, NJ) foram acrescentados a reação.

[00356] Para reduzir o gel, 4 μL de amostra, 8 μL de de DI H2O e 4 μL de 4X tampão de LDS (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram misturados antes de serem carregados no gel. Para reduzir o gel 4 μL da amostra, 1mL de 1M DTT, 7 μL de DI H2O e 4 μL de 4X tampão de LDS (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram misturados e aquecidos em borrão quente a 70°C durante 5 minutos. As amostras foram analisadas por 4~12% de géis Bis-Tris SDS-PAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as recomendações do fabricante. Os géis foram secos e analisados por autorradiografia utilizando um Phosphoimager Storm 840 após cerca de 16 horas de exposição.

[00357] A autorradiografia de monstrou que a IgG de comprimento completo intacto contendo o composto (30) foi feita. Exemplo 10 Avaliação da reatividade dos compostos (30), (1) e (2)

[00358] Este exemplo proporciona uma avaliação da taxa de reação dos compostos (30), (1) e (2) com DBCO-NH2(61) (mostrado abaixo).

[00359] DBCO-NH2(61) foi dissolvido em pH 7,4 tampão de fosfato salino para se obter uma solução 500μM. Análogos de aminoácidos(30), (1) e (2) foram dissolvidos no mesmo tampão para se obter soluções límpidas 5 μM, e em seguida diluídos para uma concentração de 500 μM utilizando o mesmo tampão. Cem microlitros de cada análogo de aminoácido foram misturados com 100 μL de composto (61) e agitado e turbilhanado. A absorção do composto (61) foi monitorizada a 310 nm utilizando um espectrómetro UV NANODROP 1000. As medidas foram obtidas a 0, 0,5, 2, 6 e 20 horas. A redução na absorção do composto (61) é indicativada da sua reação com os análogos de aminoácidos.

[00360] Os resultados da experiência são apresentados na Figura 4. Os compostos (1) e (30) ragiram prontamente com o composto (61) em 1:1 de equivalência para produzir um rendimento quase quantitativo, em seis horas. A velocidade da reação entre o composto (1) e o composto (61) foi comparável à taxa de reação entre o composto (30) e o composto (61). A velocidade da reação entre o composto (2) e o composto (61) foi de duas a quatro vezes mais lenta do que a velocidade da reação entre os outros dois análogos de aminoácidos e composto (61). No entanto, a velocidade de reação do composto (2) deve ser mais rápida do que a do composto (50) do Exemplo 6, com base no composto (30) como um comparador comum.

Claims (54)

1. Composto, CARACTERIZADO pelo fato de ser conforme a formula II:

ou um sal deste, em que W4 é alquileno C1-C10 não substituído.

2. Composto de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de ser conforme a fórmula 30:

ou um sal deste.

3. Polipeptídeo CARACTERIZADO por compreender um ou mais resíduos de aminoácidos do composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 ou 2.

4. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo que compreende um ou mais resíduos de aminoácidos é selecionado a partir de um polipeptídeo de imunoglobulina, um polipeptídeo de imunoglobulina VH, um polipeptídeo de imunoglobulina VL, um polipeptídeo Fv, um polipeptídeo Fab, um polipeptídeo (Fab')2, um polipeptídeo Fv de cadeia única, e um polipeptídeo Fc.

5. Polipeptídeo CARACTERIZADO por compreender um ou mais resíduos de aminoácidos do composto conforme definido na reivindicação 1 ou 2, ligado a uma carga útil através de uma porção contendo 1,2,3-triazolileno, que foi formada por uma reação do N3 do um ou mais resíduos de aminoácidos com uma carga útil ligada a alcino e, opcionalmente, compreender uma porção de ligação entre a porção contendo 1,2,3-triazolileno do polipeptídeo e a carga útil.

6. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção contendo 1,2,3-triazolileno do polipeptídeo está ligada a carga útil por uma porção de ligação.

7. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 5 ou 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção 1,2,3-triazolileno está ligada na posição 1 do 1,2,3-triazolileno à posição W4 do um ou mais resíduos de aminoácidos.

8. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de ligação compreende uma ligação peptídica.

9. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de ligação compreende C1-18-alquileno, C1-18-alquileno substituído, hetero-C1-18- alquileno, hetero- C1-18-alquileno substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, ou heteroarileno substituído.

10. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de ligação compreende heteroalquileno ou heteroalquileno substituído.

11. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de ligação compreende um poli (alquilenoglicol); um polietilenoglicol; poli (dextrano); poli (propilenoglicol); -CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2- ou -CH2CH2θ-(CH2CH2θ)n- CH2CH2—O-(CH2)m—W- onde n é 20 a 4000; -O- (CH2CH2O)ni-O-(CH2)m-, -O- (CH2CH2O)ni-O-(CH2)mi-NH-C(O)-(CH2)pi-, ou [- O-(CH2CH2O)n1-O-(CH2)2-NH-C(O)]2CH(CH2)m1-X10-(CH2)p1- onde m1 é 2-10, n1 é 100-1.000, p1 é 2-10, e X10 é opcionalmente um grupo O, N, S ou carbonila (C=O), ou não presente.

12. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de ligação compreende um polietilenoglicol.

13. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga útil compreende um marcador, um composto citotóxico, ou uma combinação dos mesmos.

14. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga útil é um composto citotóxico.

15. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga útil é um maitansinóide.

16. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga útil é maitansina.

17. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga útil é DM-1.

18. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga útil compreende um ácido graxo, carboidrato, ou peptídeo, ou qualquer combinação destes.

19. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 5 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga útil compreende um carboidrato.

20. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 18 ou 19, CARACTERIZADO pelo fato de que a imunogenicidade do polipeptídeo é modulada em comparação com o seu anticorpo parental.

21. Anticorpo CARACTERIZADO por compreender um ou mais resíduos de aminoácidos do composto conforme definido na reivindicação 1 ou 2.

22. Anticorpo de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo que compreende um ou mais resíduos de aminoácidos é selecionado a partir de um polipeptídeo de imunoglobulina, um polipeptídeo de imunoglobulina VH, um polipeptídeo de imunoglobulina VL, um polipeptídeo Fv, um polipeptídeo Fab, um polipeptídeo (Fab')2, um polipeptídeo Fv de cadeia única, e um polipeptídeo Fc.

23. Anticorpo CARACTERIZADO por compreender um ou mais resíduos de aminoácidos do composto conforme definido na reivindicação 1 ou 2, ligado a uma carga útil através de uma porção contendo 1,2,3-triazolileno, que foi formada por uma reação do N3 do um ou mais resíduos de aminoácidos com uma carga útil ligada a alcino e, opcionalmente, compreender uma porção de ligação entre a porção contendo 1,2,3-triazolileno do anticorpo e a carga útil.

24. Anticorpo de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção contendo 1,2,3-triazolileno do anticorpo está ligada a carga útil por uma porção de ligação.

25. Anticorpo de acordo com a reivindicação 23 ou 24, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção 1,2,3-triazolileno está ligada na posição 1 do 1,2,3-triazolileno à posição W4 do um ou mais resíduos de aminoácidos.

26. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 25, CARACTERIZADO pelo fato de a porção de ligação compreende uma ligação peptídica.

27. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de ligação compreende C1-18-alquileno, C1-18-alquileno substituído, hetero-C1-18- alquileno, hetero-C1-18-alquileno substituído, arileno, arileno substituído, heteroarileno, ou heteroarileno substituído.

28. Anticorpo de acordo com as reivindicações de 23 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de ligação compreende heteroalquileno ou heteroalquileno substituído.

29. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de ligação compreende um poli (alquilenoglicol); um polietilenoglicol; poli (dextrano); poli (propilenoglicol); -CH2CH2θ-(CH2CH2θ)n-CH2CH2- ou — CH2CH2θ-(CH2CH2θ)n-CH2CH2-O-(CH2)m-W— onde n é 20 a 4000; m está entre 1 e 10 e W é uma porção de ligação alifática ou aromática compreendendo entre 1-10 átomos de carbono; -O-(CH2CH2O)ni-O-(CH2)ml — , -O-(CH2CH2O)ni-O-(CH2)mi-NH-C(O)-(CH2)pi—, ou [-O—(CH2CH2O)n1—O-(CH2) 2 — NH-C(O)]2CH(CH2)mi—X10-(CH2)pi— onde mi é 2-10, ni é 100 — 1.000, pi é 2-10, e X10 é opcionalmente um grupo O, N, S ou carbonila (C=O), ou não presente.

30. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 26, CARACTERIZADO pelo fato de que a porção de ligação compreende um polietilenoglicol.

31. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga útil compreende um marcador, um composto citotóxico, ou uma combinação dos mesmos.

32. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 32, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga útil é um composto citotóxico.

33. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 32, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga útil é um maitansinóide.

34. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 33, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga útil é maitansina.

35. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 33, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga útil é DM-1.

36. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga útil compreende um ácido graxo, carboidrato, ou peptídeo, ou qualquer combinação destes.

37. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 23 a 30, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga útil compreende um carboidrato.

38. Anticorpo de acordo com a reivindicação 36 ou 37, CARACTERIZADO pelo fato de que a imunogenicidade do polipeptídeo é modulada em comparação com o seu anticorpo parental.

39. tRNA ortogonal aminoacilado CARACTERIZADO por compreender um ou mais resíduos de aminoácidos do composto conforme definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 2.

40. Método para produzir um polipeptídeo, CARACTERIZADO por compreender o contato de um primeiro polipeptídeo com o tRNA ortogonal conforme definido na reivindicação 39 sob condições adequadas para a incorporação de um ou mais resíduos de aminoácidos no polipeptídeo.

41. Método de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de que a base de tRNA orthogonal pareia com um códon que normalmente não está associado a um aminoácido.

42. Método de acordo com a reivindicação 40 ou 41, CARACTERIZADO pelo fato de que o contato ocorre em uma mistura reacional que compreende uma tRNA sintetase que aminoacila o tRNA ortogonal com o composto de qualquer uma das reivindicações de 1 a 2.

43. Polipeptídeo CARACTERIZADO por ser preparado por contato de uma carga útil ligada a alcino, que compreende, opcionalmente, uma porção de ligação entre o alcino e a carga útil, com um polipeptídeo em que um ou mais resíduos de aminoácidos são conforme a fórmula lIa:

ou um sal deste, em que W4 é alquileno C1-C10

44. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 43, CARACTERIZADO pelo fato de que o um ou mais resíduos de aminoácidos da fórmula IIa são conforme:

ou um sal deste.

45. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 43 ou 44, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga útil ligada a alcino compreende uma porção de ligação entre o alcino e a carga útil, e a porção de ligação compreende um polietilenoglicol.

46. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 43 ou 44, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga útil ligada a alcino compreende uma porção de ligação entre o alcino e a carga útil, e a porção de ligação compreende uma ligação peptídica.

47. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 43 a 46, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga útil compreende um marcador, um composto citotóxico, ou uma combinação destes.

48. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 43 a 47, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga útil compreende um composto citotóxico e o composto citotóxico é um maitansinóide.

49. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 43 a 46, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga útil compreende um carboidrato.

50. Método para produzir um polipeptídeo, CARACTERIZADO por compreender: a) formar o polipeptídeo combinando uma carga útil ligada a alcino, que compreende, opcionalmente, uma porção de ligação entre o alcino e a carga útil, com um polipeptídeo compreendendo um ou mais resíduos de aminoácidos conforme a fórmula IIa:

ou um sal deste, em que W4 é alquileno C1-C10.

51. Método de acordo com a reivindicação 50, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga útil é um marcador, um composto citotóxico, ou uma combinação destes.

52. Método de acordo com a reivindicação 50 ou 51, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga útil compreende um composto citotóxico e o composto citotóxico é um maitansinóide.

53. Método de acordo com a reivindicação 50 ou 51, CARACTERIZADO pelo fato de que a carga útil compreende um carboidrato.

54. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 50 a 53, CARACTERIZADO pelo fato de que o um ou mais resíduos de aminoácidos de fórmula IIa é conforme:

ou um sal deste.

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