JP2009523815A - 免疫原性が調節された非天然アミノ酸ポリペプチド - Google Patents

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Abstract

調節された免疫原性を有する非天然にコードされたアミノ酸のポリペプチド、およびその使用が提供される。

Description

発明の詳細な説明
〔関連出願の相互参照〕
本出願は、米国仮特許出願６０／７６０，６７２明細書（２００６年１月１９日出願）の利益を主張するものである（なお、その全体は、全ての目的のために参照によって本明細書に組み込まれる）。
〔発明の分野〕
本発明は、少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸により修飾された、免疫原性が調節されたポリペプチドに関する。
〔発明の背景〕
様々な天然タンパク質および組み換えタンパク質は、医療への有用性、および薬学的有用性を有している。上記タンパク質が精製され、分離され、そして製剤化されると、当該タンパク質は、様々な治療指標のために、非経口的に投与されることができる。しかしながら、非経口的に投与されるタンパク質は免疫原性を有していたり、比較的水に不溶であったり、薬理学的半減期が短かったりする。その結果、患者において、タンパク質の血中濃度を治療的に有用な血中濃度にすることが困難なことがある。参照によって本明細書に組み込まれる「Schellekens, H. in Clinical Therapeutics 2002; 24(11):1720-1740」では、治療タンパク質の免疫原性、抗体形成により引き起こされる臨床効果として可能性のあるもの（アレルギー反応、またはアナフィラキシー反応など）、治療タンパク質の効力の減少、ならびに、内在性タンパク質に対する自己免疫の発達に影響を与え得る要因が、議論されている。このように、免疫原性は、多くの方法により、タンパク質の治療効力および安全性を限定し得るものである。治療効力は、中和抗体の形成によって直接減少され得る。また、効力は、中和抗体または非中和抗体に対する結合が血中半減期を変更し得るときに、間接的に減少され得る。望まれない免疫反応は、注入部位における反応として見られることがある。そのような反応には、特に限定されないが、遅延型過敏反応が含まれる。また、免疫反応は、薬物の薬物動態学的性質および／または薬力学的性質を変化し得る。参照によって本明細書に組み込まれる「Wadhwa, Mら J of Immunol Methods 2003; 278:1-17」、「Adair, F. et D. Ozanne, BioPharm 2002 Feb; p. 30-6」、「Chamberlain, P. et A.R. Mire-Sluis in Dev Biol Basel 2003; 112:3-11」、および「Chamberlain, P. The Regulatory Review 2002; 5(5):4-93」には、免疫原性であることが報告されたタンパク質が記載されている。
ヒト組み換えタンパク質でさえも、液性免疫反応を誘導することができるので、免疫原性の減少は、重要な検討事項であり得る（参照によって本明細書に組み込まれる「Atkins M Bら (1986) J. Clin. Oncol. 4, 1380-1391」、「Gribben J Gら (1990) Lancet 335, 434-437」）。上記問題は、タンパク質にポリ（エチレングリコール）などのポリマーを接合することによって、解決されることがある。参照によって本明細書に組み込まれるＤａｖｉｓらの米国特許第４，１７９，３３７号明細書には、酵素およびインシュリンなどのタンパク質にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を接合することにより、当該タンパク質の生理活性が非接合体のときと比べて実質的に等しいままであるにも拘らず、得られた接合体における上記タンパク質の免疫原性が低くなることが記載されている。参照によって本明細書に組み込まれるＮａｋａｇａｗａらの米国特許第４，７９１，１９２号明細書には、ＰＥＧをインスリン分泌促進タンパク質に接合することにより、その副作用および免疫原性を減少させることが開示されている。「Veroneseら, Applied Biochem and Biotech, 11 :141-152 (1985）」には、リボヌクレアーゼおよびスーパーオキシドジムターゼ（superoxide dimutase）を修飾するための、フェニルクロロギ酸エステルを有する活性化ポリエチレングリコールが開示されている。また、参照によって本明細書に組み込まれるＫａｔｒｅらの米国特許第４，７６６，１０６号明細書および米国特許第４，９１７，８８８号明細書には、ポリマーセ接合によってタンパク質を可溶化することが開示されている。免疫原性の減少および半減期の増加をするために、ＰＥＧおよび他のポリマーが組み換えタンパク質に接合されている。参照によって本明細書に組み込まれるＮｉｔｅｃｋｉらの米国特許第４，９０２，５０２号明細書、「Enzon, Inc., 国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９０／０３１３３号パンフレット」、Ｎｉｓｈｉｍｕｒａの欧州特許出願公開１５４，３１６号明細書、およびＴｏｍａｓｉの国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ８５／０２５７２号パンフレットを参照のこと。「Knaufら, J. Biol. Chem., 263: 15064-15070 (1988)」には、様々なポリオキシル化グリセロールおよびポリエチレングリコールにより、修飾されたインターロイキン−２のラットにおける薬力学的挙動についての研究が報告されている。また、参照によって本明細書に組み込まれる「Abuchowski Aら (1977) J. Biol. Chem 252, 3582- 3586」および「Abuchowski Aら (1977) J. Biol. Chem 252, 3578-3581」を参照のこと。また、薬物とＰＥＧとから形成された接合体が開発されている（参照によって本明細書に組み込まれる「Caliceti Pら (1993) Farmaco 48, 919-932」、「Conover C D5 ら (1997) Anticancer-Res 17, 3361-3368」、「Greenwald R Bら (1998) Bioorg. Med. Chem. 6, 551-562」、「Pendri Aら (1998) Anticancer- Drug-Des 13, 387-395」）。さらに、ＰＥＧをリポソームに共有結合させることによって、非特異的な取り込みが減少すること、およびリポソームの安定性と半減期とが増加することが発見された（参照によって本明細書に組み込まれる「Kirpotin Dら (1997) Biochemistry 36, 66-75」、「Cabanes Aら (1998) Clin. Cancer Res. 4, 499-505」、「Meyer Oら (1998) J. Biol. Chem. 273, 15621-15627」）。ＰＥＧ修飾は、酵素の免疫原性を減少させること（「Abuchowski Aら (1977) J. Biol. Chem. 252, 3582-3586」、「Chaffee Sら (1992) J. Clin. Invest. 89, 1643-1651」）、抗体の免疫原性を減少させること（「Kitamura Kら (1991) Cancer Res 51, 4310-4315」）、毒素の免疫原性を減少させること（「Wang Q Cら (1993) Cancer Res 53, 4588-4594」、「He X Hら (1999) Life Sci 65, 355-368」）、ヒト組み換えタンパク質の免疫原性を減少させること（「Katre N V (1990). J. Immunol 144, 209-213」）、および他のタンパク質の免疫原性を減少させること（「Chinol Mら (1998) Br. J. Cancer 78, 189-197」）が分かった（なお、上記文献の全ては、参照によって本明細書に組み込まれる）。インターフェロンは、ポリエチレングリコールを付加することによって、修飾された（米国特許第４，９１７，８８８号明細書、米国特許第５，３８２，６５７号明細書、国際公開第９９／５５３７７号パンフレット、国際公開第０２／０９７６６号パンフレット、国際公開第０２／３１１４号パンフレット）。いくつかの場合、ＰＥＧ化によって、抗体のアグレトープへの接近が立体的に妨害され、これによって、中和抗体を産生する患者がわずかに減少することが観察された（例えば、「Hershfieldら PNAS 1991 88:7185-7189 (1991)」、「Bailon ら Bioconjug. Chem. 12: 195- 202(2001)」、「He ら Life Sci. 65: 355-368 (1999)」を参照のこと）。また、安定な共有連結を介して、ポリペプチドをＰＥＧ化することによって、エピトープを遮ることが、参照によって本明細書に組み込まれる「Pool, R. Science 248:305」に記載されている。
ポリマーをポリペプチドに接着することによって、血中半減期が増加し得ることが示された。参照によって本明細書に組み込まれる、欧州特許出願公開第０ ４４２ ７２４ Ａ２号明細書には、ＰＥＧ化されたインターロイキン−６誘導体の血中半減期が、延長していることが記載されている。また、薬物をポリマーに接着することにより、水溶性が増加すること、保存中の安定性が増加すること、および免疫原性が減少することが報告されている（参照によって本明細書に組み込まれる、欧州特許出願公開第０ ５３９ １６７号明細書、および国際公開第９４／１３３２２号パンフレット）。また、ＩＬ−２またはそのムテインとポリマーとの接合体は、当該接合体の免疫原性が減少していること、水溶性が増加していること、半減期が増加していることが報告されている（米国特許第５，３６２，８５２号明細書、米国特許第５，０８９，２６１号明細書、米国特許第５，２８１，６９８号明細書、および国際公開第９０／０７９３８号パンフレット（上記文献の全ては、参照によって本明細書に組み込まれる））。
親水性ポリマーであるポリ（エチレングリコール）（略してＰＥＧ）を共有結合することは、多くの生物活性分子の、水溶性の増加、生体利用効率、血中半減期の増加、治療半減期の増加、免疫原性の調節、生物活性の調節、または循環時間の延長を行う方法である（なお、上記生物活性分子には、タンパク質、ペプチド、および特定の疎水性分子が含まれる）。ＰＥＧは、（ｉ）薬剤、（ｉｉ）人工移植物、および、（ｉｉｉ）生体適合性、毒性の欠如、免疫原性の欠如が重要である他の用途に幅広く用いられている。ＰＥＧの所望の性質を最大限に引き出すために、生物活性分子に接着されるＰＥＧポリマーの総分子量と水和状態とは、ＰＥＧポリマーの接着に一般的に起因する有利な特性（水溶性および循環半減期の増加など）が与えられる程度であって、かつ親分子の生物活性に有害な影響を与えない程度に、十分高い必要がある。
ＰＥＧ誘導体は、反応性化学機能性基（リジン残基、システイン残基およびヒスチジン残基など）、Ｎ末端、および炭水化物部分を介して、生物活性分子に連結することが多い。タンパク質および他の分子は、ポリマーの接着に利用可能な反応部位の数が限定されていることがしばしばある。また、多くの場合、ポリマーの接着による修飾に最も適した部位が、受容体結合に重要な役割を果たし、上記生物活性分子の生物活性を保持するのに必要である。その結果、生物活性分子における上記反応部位に、ポリマー鎖を無差別に接着させることによって、ポリマーで修飾された上記分子の生物活性が顕著に減少するか、完全に失われることが、頻繁に起こる。「R. Clark ら, (1996), J. Biol. Chem., 271 :21969-21977」。所望の利点を標的分子に与えるほど、十分な分子量のポリマーを有する接合体を形成するために、従来技術のアプローチでは、通常、上記標的分子に、多くのポリマー腕を無作為に接着する工程を含んでいる。このため、親分氏の生物活性を減少させるか、または完全に失う危険性が高いといえる。
ＰＥＧ誘導体をタンパク質に接着するための場を形成する反応部位は、タンパク質の構造から決定される。酵素を含むタンパク質は、Ｈ２Ｎ−−ＣＨＲ−−ＣＯＯＨという一般構造を有するアルファ−アミノ酸の様々な配列から構成される。あるアミノ酸のアルファアミノ部分（Ｈ２Ｎ−−）は、隣接するアミノ酸のカルボキシ部分（−−ＣＯＯＨ）と接合して、−−（ＮＨ−−ＣＨＲ−−ＣＯ）ｎ−−として表すことができるアミド連結を形成している（下付き文字の「ｎ」は、数百または数千に相当し得る）。Ｒで表される断片は、タンパク質の生物活性およびＰＥＧ誘導体の接着のための反応部位を含み得る。
例えば、アミノ酸がリジンである場合、アルファ位と同様にイプシロン位に−−ＮＨ２部分が存在する。イプシロン位の−−ＮＨ２は、塩基性ｐＨの条件下において反応性である。ＰＥＧによるタンパク質の誘導体化に関する分野の技術の多くは、タンパク質に存在するリジン残基のイプシロン位の−ＮＨ２部分に接着するためのＰＥＧ誘導体を開発することに向けられていた。「“Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation”, Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17」。しかし、上記ＰＥＧ誘導体の全ては、それらを、タンパク質の表面に頻繁に多く存在するリジン残基に対して選択的に取り付ることができないという、共通の制限を有している。このことは、タンパク質の活性にとってリジン残基が重要な場合（例えばリジン残基が酵素の活性部位に存在する場合）、または、リジン残基が受容体結合部位に存在する場合のような、タンパク質と他の生体分子との相互作用の仲介に、リジン残基が関与する場合には、重大な制限になり得る。
タンパク質をＰＥＧ化する既存の方法の第２問題であって、同等の重要性を有する問題は、ＰＥＧ誘導体と所望の残基以外の残基との望ましくない副反応が起こり得ることである。ヒスチジンは、−−Ｎ（Ｈ）−−という構造で表される反応性のイミノ部分を含んでいるが、イプシロン位の−−ＮＨ２と反応する多くの化学反応種は、−−Ｎ（Ｈ）−−と反応することもできる。同様に、アミノ酸のシステインの側鎖は、−ＳＨという構造で表される遊離のスルヒドリル基を生じる。いくつかの事例では、リジンのイプシロン位の−−ＮＨ２基を標的とするＰＥＧ誘導体は、システイン、ヒスチジンまたは他の残基とも反応する。このため、ＰＥＧにより誘導体化された生理活性分子の異種混合物ともいうべき複合体が生じるし、また標的とされる生理活性分子の活性が破壊される危険性が生じる。よって、１つの化学官能基をタンパク質内の１つの部位に導入することができるＰＥＧ誘導体を開発することが望ましく、これにより、該タンパク質の表面の明確に規定されかつ予測できる特定の部位において、１つ以上のＰＥＧポリマーを生理活性分子に選択的に結合させることができる。
リジン残基以外にも、他のアミノ酸側鎖（システイン、ヒスチジン、およびＮ−末端など）を標的とする活性型ＰＥＧ試薬の開発に、甚大な技術的努力が注ぎ込まれてきた。例えば、米国特許第６，６１０，２８１号明細書（参照によって本明細書に組み込まれる）、および「“Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation”, Nektar Molecular Engineering Catalog, 2003, pp. 1-17」を参照のこと。部位特異的突然変異誘発法、および他の技術的に公知の手法を用いて、タンパク質の構造にシステイン残基を、部位特異的に導入することができる。そして、得られる遊離のスルヒドリル部分を、ＰＥＧ誘導体と反応させて、チオール反応性官能基を生じさせることができる。しかし、この手法は、遊離のスルヒドリル基の導入によって、生じるタンパク質の発現、折りたたみおよび安定性が悪化することがあるという問題を抱えている。したがって、１つ以上のＰＥＧポリマーをタンパク質に選択的に結合させることができるとともに、スルヒドリル基およびタンパク質に一般的に発見される他の化学官能基と共生できる（すなわち、そのような官能基と望ましくない副反応を起こさない）化学官能基を、生理活性分子に導入する手段を有することが望ましいと考えられる。
従来技術を標本調査すれば分かるように、タンパク質の側鎖（特に、リジンアミノ酸の側鎖における−−ＮＨ２部分、およびシステインの側鎖における−ＳＨ部分）に接着するために開発された上記誘導体の多くは、それらの合成および使用について問題を有していることが分かった。あるものは、加水分解されて、変質または分解する不安定な連結、あるいは水溶液の環境（血流など）において不安定な連結を、タンパク質と形成してしまう。あるものは、より安定な連結を形成するが、連結が形成される前に加水分解される。このことは、タンパク質を接着することができる前に、ＰＥＧ誘導体における反応基が不活性化され得ることを意味している。あるものは、若干の毒性を有しているため、インビボでの使用にはあまり適さない。あるものは、反応が遅すぎるため、実際には役に立たない。あるものは、タンパク質の活性に関与する部位に接着することによって、タンパク質の活性を消失させてしまう。あるものは、それらが接着する部位に特異的ではなく、このため、所望の活性が失われることや、結果の再現性が乏しくなることがあり得る。ポリ（エチレングリコール）部分によるタンパク質の修飾に関連した課題を克服するために、より安定なＰＥＧ誘導体（参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，６０２，４９８号明細書）、または分子上および表面上のチオール部分と選択的に反応するＰＥＧ誘導体（参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，６１０，２８１号明細書）が開発された。選択的に反応して、安定な化学結合を形成するためのきっかけがあるまで、生理的環境下において化学的に不活性なＰＥＧ誘導体が、明らかに技術的に必要とされている。
近年、タンパク質の部位特異的修飾に関連する多くの制限を克服する見込みのある、タンパク質科学における完全に新しい技術が報告された。具体的には、原核生物であるEschrichia coli(E. coli)（例えば、「L.Wangら(2001),Science292:498-500」）、および真核生物であるSacchromyces cerevisiae(S. cerevisiae)（例えば、「J.Chinら, Science 301: 964-7(2003)」）のタンパク質生合成機構に、新規の構成要素が加えられた。これにより、インビボにおいて、タンパク質へ非遺伝的にコードされたアミノ酸を組み込むことが可能になった。これまでにない化学的、物理的または生物学的性質を有する多数の新たなアミノ酸が、この手法によって、アンバーコドン、ＴＡＧに反応して、E.coliおよび酵母においてタンパク質へ高い忠実性で効率的に組み込まれた。例えば、「J.W.Chinら, (2002) Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027」、「J.W.Chin,& P.G.Schultz, (2002), ChemBioChem 3(11):1135-1137」、「J.W.Chinら, (2002), PNAS United States of America 99:11020-11024」、および、「L. Wang,& P.G.Schultz, (2002), Chem. Comm.,1:1-11」を参照のこと（上記文献は、それらの全体が参照によって組み込まれる）。なお、上記新たなアミノ酸としては、例えば、光親和性標識されたアミノ酸、光異性化性（ｐｈｏｔｏｉｓｏｍｅｒｉｚａｂｌｅ）アミノ酸、光架橋アミノ酸（例えば、「Chin, J. W.ら (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99:11020-11024」、および「Chin, J, W.ら, (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027」を参照のこと）、ケトアミノ酸、重原子を含んでいるアミノ酸、およびグリコシル化アミノ酸が挙げられる。これらの研究では、（１）タンパク質中に存在せず、（２）２０の遺伝的にコードされた一般アミノ酸において存在する全ての官能基に対して化学的に不活性であり、（３）使用したときに、選択的かつ効率よく反応して安定な共有連結を形成し得る、化学官能基（ケトン基、アルキン基およびアジド部分など）を選択的且つ型通りに導入できることが証明された。
非遺伝的にコードされた（遺伝的にコードされていないアミノ酸）を、タンパク質に組み込むことにより、天然に生じる官能基（リジンのイプシロン位の−ＮＨ２、システインのスルフィドリル（−ＳＨ）、ヒスチジンのイミノ基など）に代わる有益な化学官能基を導入することができる。２０の一般的な遺伝的にコードされたアミノ酸において見られる官能基に対して不活性であるが、非天然アミノ酸に組み込まれ得る官能基と首尾よく効率的に反応して、安定な連結を形成する特定の化学官能基が知られている。例えば、アジド基およびアセチレン基は、触媒量の銅が存在する水溶性の条件下において、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］の付加環化反応を受けることが、公知である。例えば、「Tornoeら, (2002) J. Org. Chem. 67:3057-3064」、および「Rostovtsevら, (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41 :2596-2599」を参照のこと。アジド部分をタンパク質の構造に導入することは、例えば、タンパク質に見られるアミン、スルヒドリル、カルボン酸、ヒドロキシル基に対して化学的に不活性であるが、アセチレン部分と円滑かつ効率よく反応して付加環化産物を形成する官能基を組み込むことであるといえる。重要なことは、アセチレン部分が存在しないときには、他のタンパク質側鎖が存在する生理的条件下において、アジドは化学的に不活性でかつ非反応性であり続けるということである。
本発明は、特に、ポリペプチドにおける任意の天然に生じるアミノ酸の１つ以上を、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸により置換することによって、または非天然アミノ酸を付加することによって、ポリペプチドの免疫原性を調節することに取り組むものである。また、本発明は、生物学的性質もしくは薬理学的性質が改善されたポリペプチド（治療半減期が改善されているか、または免疫原性が調節されたポリペプチドなど）を製造することに取り組むものである。
〔本発明の要旨〕
本発明は、非天然にコードされたアミノ酸を１つ以上含んでいる、免疫原性が調節されたポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、上記非天然にコードされたアミノ酸を１つ以上含んでいるポリペプチドでは、当該ポリペプチドの免疫原性は減少している。いくつかの実施形態において、上記非天然にコードされたアミノ酸を１つ以上含んでいるポリペプチドでは、当該ポリペプチドの免疫原性は増加している。いくつかの実施形態において、上記非天然にコードされたアミノ酸を１つ以上含んでいるポリペプチドでは、当該ポリペプチドの１つ以上の特定のエピトープに関する免疫原性が、野生型ポリペプチド（native polypeptide）と比べて、調節されている。いくつかの実施形態において、上記非天然にコードされたアミノ酸を１つ以上含んでいるポリペプチドでは、当該ポリペプチドの１つ以上の特定のエピトープに関する免疫原性が、野生型ポリペプチドと比べて減少している。いくつかの実施形態において、上記非天然にコードされたアミノ酸を１つ以上含んでいるポリペプチドでは、当該ポリペプチドの１つ以上の特定のエピトープに関する免疫原性が、野生型ポリペプチドと比べて増加している。
また、本発明は、ポリペプチドにおける任意の天然に生じるアミノ酸の１つ以上を、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸により、置換することによって、または非天然アミノ酸をポリペプチドに付加することによって、ポリペプチドの免疫原性を調節する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、免疫原性が調節されたポリペプチドは、１つ以上の翻訳後修飾を含んでいる。いくつかの実施形態では、免疫原性が調節されたポリペプチドは、リンカー、ポリマーまたは生物活性分子に連結される。
いくつかの実施形態では、免疫原性が調節されたポリペプチドに存在する、非天然にコードされたアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結される。いくつかの実施形態では、上記水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含んでいる。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸は、リンカーにより水溶性ポリマーに連結または結合される。いくつかの実施形態では、上記ポリ（エチレングリコール）分子は、二官能性ポリマーである。いくつかの実施形態では、上記二官能性ポリマーは、第２ポリペプチドに連結される。
いくつかの実施形態では、上記ポリペプチドは、置換、付加、または欠失を有さない対応するポリペプチドと比べて、ポリペプチドの免疫原性を調節する置換、付加、または欠失を含んでいる。いくつかの実施形態では、上記ポリペプチドは、置換、付加、または欠失を有さない対応するポリペプチドの血中半減期または循環時間と比べて、ポリペプチドの血中半減期または循環時間を調節する置換、付加、または欠失を含んでいる。
いくつかの実施形態では、上記ポリペプチドは、置換、付加、または欠失を有さない対応するポリペプチドの水溶性と比べて、ポリペプチドの水溶性を増加させる置換、付加、または欠失を含んでいる。いくつかの実施形態では、上記ポリペプチドは、置換、付加、または欠失を有さない対応するポリペプチドと比べて、宿主細胞において製造されたポリペプチドの可溶性を増加させる置換、付加、または欠失を含んでいる。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドにおけるアミノ酸の置換は、少なくとも１つの置換が、上記非天然にコードされたアミノ酸によるものであれば、天然に生じるアミノ酸によるものであってもよいし、または非天然に生じるアミノ酸によるものであってもよい。
いくつかの実施形態では、上記非天然にコードされたアミノ酸は、カルボニル基、アセチル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を含んでいる。
いくつかの実施形態では、上記非天然にコードされたアミノ酸は、カルボニル基を含んでいる。いくつかの実施形態では、上記非天然にコードされたアミノ酸は、
Figure 2009523815
 の構造を有している（ｎは０−１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり、Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリールであり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）。
いくつかの実施形態では、上記非天然にコードされたアミノ酸は、アミノオキシ基を含んでいる。いくつかの実施形態では、上記非天然にコードされたアミノ酸は、ヒドラジド基を含んでいる。いくつかの実施形態では、上記非天然にコードされたアミノ酸は、ヒドラジン基を含んでいる。いくつかの実施形態では、上記非天然にコードされたアミノ酸残基は、セミカルバジド基を含んでいる。
いくつかの実施形態では、上記非天然にコードされたアミノ酸残基は、アジド基を含んでいる。いくつかの実施形態では、上記非天然にコードされたアミノ酸は、
Figure 2009523815
 の構造を有する（ｎは０−１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであるか、あるいは存在しておらず；ＸはＯ、Ｎ、またはＳであるか、あるいは存在しておらず；ｍは０−１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）。
いくつかの実施形態では、上記非天然にコードされたアミノ酸は、アルキン基を含んでいる。いくつかの実施形態では、上記非天然にコードされたアミノ酸は、
Figure 2009523815
 の構造を有する（ｎは０−１０であり；Ｒ１はアルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり；ＸはＯ、Ｎ、またはＳであるか、あるいは存在しておらず；ｍは０−１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）。
いくつかの実施形態では、上記水溶性ポリマーに連結された上記ポリペプチドは、（ｉ）カルボニル含有アミノ酸を含んでいるポリペプチドと、（ｉｉ）アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、またはセミカルバジド基を含んでいるポリ（エチレングリコール）分子とを反応させることによって、作製される。いくつかの実施形態では、上記アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、またはセミカルバジド基は、アミド連結を介して、上記ポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。いくつかの実施形態では、上記アミノオキシ基は、カルバメート連結を介して、上記ポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。
いくつかの実施形態では、上記水溶性ポリマーに連結された上記ポリペプチドは、（ｉ）カルボニル基を含んでいるポリ（エチレングリコール）分子と、（ｉｉ）アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、またはセミカルバジド基を含んでいる非天然にコードされたアミノ酸を含有しているポリペプチドとを反応させることにより、作製される。
いくつかの実施形態では、上記水溶性ポリマーに連結された上記ポリペプチドは、アルキン基含有アミノ酸を含んでいるポリペプチドと、アジド部分を含んでいるポリ（エチレングリコール）とを反応させることにより作製される。いくつかの実施形態では、上記アジド基またはアルキン基は、アミド連結を介して、ポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。
いくつかの実施形態では、上記水溶性ポリマーに連結された上記ポリペプチドは、アジド含有アミノ酸を含んでいるポリペプチドと、アルキン部分を含んでいるポリ（エチレングリコール）分子とを反応させることにより作製される。いくつかの実施形態では、上記アジド基またはアルキン基は、アミド連結を介して、ポリ（エチレングリコール）分子に連結されている。
いくつかの実施形態では、上記ポリ（エチレングリコール）分子の分子量は、約０．１ｋＤａから約１００ｋＤａまでの間である。いくつかの実施形態では、上記ポリ（エチレングリコール）分子の分子量は、約０．１ｋＤａから約５００ｋＤａまでの間である。
いくつかの実施形態では、上記ポリ（エチレングリコール）分子は、分枝状ポリマーである。いくつかの実施形態では、分枝状ポリマーであるポリ（エチレングリコール）の各分枝の分子量は、約１ｋＤａから１００ｋＤａまでの間であるか、または約１ｋＤａから約５０ｋＤａまでの間である。
いくつかの実施形態では、上記ポリペプチドに連結される上記水溶性ポリマーは、ポリアルキレングリコール部分を含んでいる。いくつかの実施形態では、上記ポリペプチドに組み込まれる上記非天然にコードされたアミノ酸残基は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン、セミカルバジド基、アジド基、またはアルキン基を含んでいる。いくつかの実施形態では、上記ポリペプチドに組み込まれる上記非天然にコードされたアミノ酸残基は、カルボニル部分を含んでおり、上記水溶性ポリマーは、アミノオキシ部分、ヒドラジド部分、ヒドラジン部分、またはセミカルバジド部分を含んでいる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドに組み込まれる、上記非天然にコードされたアミノ酸残基は、アルキン部分を含んでおり、上記水溶性ポリマーは、アジド部分を含んでいる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドに組み込まれる、上記非天然にコードされたアミノ酸残基は、アジド部分を含んでおり、上記水溶性ポリマーは、アルキン部分を含んでいる。
また、本発明は、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる、免疫原性が調節されたポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体とを含有する組成物を提供する。いくつかの実施形態では、上記非天然にコードされたアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。
また、本発明は、セレクターコドンを含み、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を提供する。いくつかの実施形態では、上記細胞は、ポリペプチドに非天然にコードされたアミノ酸を置換するための、直交化ＲＮＡシンテターゼ、および／または直交化ｔＲＮＡを含んでいる。
また、本発明は、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる、免疫原性が調節されたポリペプチドを作製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、上記方法は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、直交化ＲＮＡシンテターゼ、および／または直交化ｔＲＮＡを含んでいる細胞を、上記ポリペプチドが発現することができる条件下において培養する工程と、上記ポリペプチドを細胞および／または培地から精製する工程とを含んでいる。
また、本発明は、ポリペプチドの免疫原性を調節する方法を提供する。いくつかの実施形態では、上記方法は、天然に生じるポリペプチドにおける任意のアミノ酸の１つ以上を、非天然にコードされたアミノ酸により置換する工程、および／またはポリペプチドをリンカー、ポリマー、水溶性ポリマーもしくは生物活性分子に連結する工程を含んでいる。いくつかの実施形態では、上記ポリペプチドの免疫原性は、増加もしくは減少しているか、あるいは、天然のポリペプチドの特定の免疫原性部分またはエピトープの１つ以上を対象としている。
本発明は、共有結合により少なくとも１つの水溶性ポリマーに連結された成長ホルモン（ＧＨ）を含んでいる、ホルモン組成物を提供する。なお、上記共有結合は、オキシム結合である。上記ＧＨは、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸を含んでいてもよい。当該非天然にコードされたアミノ酸としては、例えば、カルボニル基（ケトンなど）を含んでいる非天然にコードされたアミノ酸が挙げられ、より具体的には、当該非天然にコードされたアミノ酸は、パラ−アセチルフェニルアラニンである。いくつかの実施形態では、上記オキシム結合は、上記非天然にコードされたアミノ酸と上記水溶性ポリマーとの間に形成される。上記ＧＨは、米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書に記載の配列番号２における３５の位置に対応する位置において、パラ−アセチルフェニルアラニンで置換される（なお、上記文献は、その全体が参照によって組み込まれる）。いくつかの実施形態では、上記水溶性ポリマーは、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子を含んでいる。上記ＰＥＧは、直鎖状であってもよい。直鎖状ＰＥＧの分子量は、例えば、約０．１から約１００ｋＤａの間、約１から約６０ｋＤａの間、または約２０から約４０ｋＤａの間、または約３０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、上記ＰＥＧは、分枝状ＰＥＧである。分枝状ＰＥＧの分子量は、例えば、約１から約１００ｋＤａの間、約３０から約５０ｋＤａの間、または約４０ｋＤａの間である。いくつかの実施形態では、上記ＧＨは、複数の共有結合によって、複数の水溶性ポリマーに連結されている。上記共有結合の少なくとも１つは、オキシム結合である。これらの実施形態のいくつかでは、上記ＧＨは、ヒト成長ホルモン（ＧＨ、例えば、ｈＧＨ）である。ＧＨ（例えばｈＧＨ）は、米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書に記載の配列番号２で表される配列と、少なくとも約８０％同一である配列を有している。また、上記ＧＨ（例えばｈＧＨ）は、いくつかの実施形態では、米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書に記載の配列番号２で表される配列を有している。上記ＧＨ（例えばｈＧＨ）が複数の水溶性ポリマーに連結されているいくつかの実施形態では、当該ＧＨは、複数の非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。
特定の実施形態では、本発明は、上記ＧＨ（例えばｈＧＨ）を含有するＧＨ組成物を提供する。当該ＧＨ（例えばｈＧＨ）は、米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書に記載の配列番号２で表される配列を含んでいる。上記ＧＨ（例えばｈＧＨ）は、オキシム結合を介して、３０ｋＤａの直鎖状ＰＥＧに連結されている。当該オキシム結合は、米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書に記載の配列番号２の３５の位置に対応する位置において置換されたパラ−アセチルフェニルアラニンにより形成されている。
さらに別の実施形態では、本願発明は、オキシム結合を介して水溶性ポリマーに連結された、免疫原性が調節されたポリペプチドを作製する方法を提供する。当該方法は、カルボニル基を含んでいる非天然にコードされたアミノ酸と、ＰＥＧオキシアミンとを、オキシム結合の形成に適切な条件下において接触させる工程を含んでいる。上記非天然にコードされたアミノ酸は、カルボニル基などのケトン基を含んでいてもよい。上記非天然にコードされたアミノ酸は、パラ−アセチルフェニルアラニンであってもよい。パラ−アセチルフェニルアラニンを含んでいるいくつかの実施形態では、当該パラ−アセチルフェニルアラニンは、米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書に記載の配列番号２における３５のアミノ酸に対応するＧＨ（例えばｈＧＨ）の位置において、置換されている。いくつかの実施形態では、上記ＰＥＧオキシアミンは、モノメトキシＰＥＧ（ＭＰＥＧ）オキシアミンである。いくつかの実施形態では、上記ＭＰＥＧオキシアミンは、直鎖状である。直鎖状ＭＰＥＧの分子量は、例えば、約２０から４０ｋＤａであるか、または約３０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、上記ＭＰＥＧオキシアミンは、３０ｋＤａの直鎖状のモノメトキシ−ＰＥＧ−２アミノオキシエチルアミンカルバメート塩酸塩である。米国特許出願第１１／３１６，５３４号明細書には、このＰＥＧの合成スキームが詳細に記載されている（なお、上記文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる上記ＧＨ（例えばｈＧＨ）は、（ｉ）ポリペプチドをコードし、上記非天然にコードされたアミノ酸を組み込むためのセレクターコドンを備えるように修飾された核酸と、（ｉｉ）上記非天然にコードされたアミノ酸とを、上記非天然にコードされたアミノ酸を、（ｉ）の核酸のコドンに応じて、タンパク質に組み込むことができる細胞機構を有する生物に導入することによって、作製される。いくつかの実施形態では、オキシム結合を形成するための反応条件には、ＭＰＥＧ−ポリペプチドの混合物が製造されるように、約４から６のｐＨにおいてＭＰＥＧとポリペプチドとを混合すること、およびＭＰＥＧ−ポリペプチドの混合物を、約１０から５０時間室温において、穏やかに攪拌することが含まれる（なお、上記ポリペプチドには、特に限定されないが、ＧＨ（例えばｈＧＨ）が含まれる。また上記ＭＰＥＧ−ポリペプチドの混合物における、ＭＰＥＧ：ポリペプチドの比は、約５から１０である）。
本発明の免疫原性が調節されたポリペプチドは、特に限定されないが、免疫原性を有するポリペプチドの免疫原性の減少もしくは削除、免疫原の免疫原性を誘導もしくは刺激するワクチン、ポリペプチドに結合する抗体のブロック、または自己免疫疾患の治療を含む多種多様な使用に役立ち得る。
〔図面の簡単な説明〕
図１は、脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）−ｈＧＨの融合導入遺伝子の略図である。
図２は、ｈＧＨが遺伝子導入されていない（ｈＧＨナイーブ）マウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、（ｍｅｔ）−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。プレートは、（ｍｅｔ）−ｈＧＨによりコートされていた。
図３は、ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、（ｍｅｔ）−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。プレートは、（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨによりコートされていた。
図４は、ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、（ｍｅｔ）−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。プレートは、ＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨによりコートされていた。
図５は、ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。プレートは、（ｍｅｔ）−ｈＧＨによりコートされていた。
図６は、ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。プレートは、（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨによりコートされていた。
図７は、ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。プレートは、ＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨによりコートされていた。
図８は、ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、ＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。プレートは、（ｍｅｔ）−ｈＧＨによりコートされていた。
図９は、ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、ＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。プレートは、（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨによりコートされていた。
図１０は、ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、ＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。プレートは、ＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨによりコートされていた。
図１１は、ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、フロイント不完全アジュバントに溶解した（ｍｅｔ）−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。プレートは、（ｍｅｔ）−ｈＧＨによりコートされていた。
図１２は、ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、フロイント不完全アジュバントに溶解した（ｍｅｔ）−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。プレートは、（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨによりコートされていた。
図１３は、ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、フロイント不完全アジュバントに溶解した（ｍｅｔ）−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。プレートは、ＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨによりコートされていた。
図１４は、ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、フロイント不完全アジュバントに溶解した（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。プレートは、（ｍｅｔ）−ｈＧＨによりコートされていた。
図１５は、ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、フロイント不完全アジュバントに溶解した（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。プレートは、（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨによりコートされていた。
図１６は、ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、フロイント不完全アジュバントに溶解した（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。プレートは、ＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨによりコートされていた。
図１７は、ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、フロイント不完全アジュバントに溶解したＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。プレートは、（ｍｅｔ）−ｈＧＨによりコートされていた。
図１８は、ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、フロイント不完全アジュバントに溶解したＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。プレートは、（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨによりコートされていた。
図１９は、ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、フロイント不完全アジュバントに溶解したＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。プレートは、ＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨによりコートされていた。
図２０は、マウスにおける免疫原性のデータ（抗体力価）の概要を示す図である。
図２１は、ウサギの血清アルブミンの接合体に関するマトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析（MALDI-TOF Mass Spectrometry）を示す図である。
図２２は、ウサギにおけるＤＮＰの免疫反応（パネルＡ）、ｐ−アセチルフェニルアラニンの免疫反応（パネルＢ）、Ｐｈｅの免疫反応（パネルＣ）、およびＴｙｒの免疫反応（パネルＤ）の比較を示す図である。
〔定義〕
本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール、細胞株、コンストラクト、および試薬に限定されるものではなく、変更され得ることを理解されたい。また、本明細書で用いられている専門用語は、特定の実施形態のみを記載するために用いられているのであって、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本明細書に記載の方法および組成物の範囲の限定を意図していないことを理解されたい。
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形の形態は、内容から明らかに分かるものを除いて、複数形の形態も含んでいる。したがって、例えば、「ｈＧＨ」への言及は、そのようなタンパク質の１つ以上について言及することであり、かつ当業者に公知のその同等物を含んでいる。
本明細書に記載の方法、組成物、戦略、技術は、ポリペプチドまたはタンパク質の特定の形式、種類、もしくはファミリーに限定されるものではない。実際のところ、実質的に任意のポリペプチドが、少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸を含み、別の分子（本明細書に記載のＰＥＧなど）で修飾されるように、設計または修飾され得る。例えば、上記ポリペプチドは、以下の治療タンパク質と相同であり得る：アルファ−１ 抗トリプシン、アンギオスタチン、抗溶血性因子、抗体、抗体断片、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ｇｒｏ−ａ、ｇｒｏ−ｂ、ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ、カルシトニン、ｃ−ｋｉｔリガンド、サイトカイン、ＣＣケモカイン、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１ アルファ、単球炎症性タンパク質−ｉ ベータ、ランテス（ＲＡＮＴＥＳ）、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣ１、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、ｃ−ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子 ５ａ、補体阻害剤、補体受容体 １、サイトカイン、上皮性好中球活性ペプチド−７８、ＭＩＰ−１６、ＭＣＰ−１、上皮成長因子（ＥＧＦ）、上皮性好中球活性ペプチド、赤血球生成促進因子（ＥＰＯ）、剥離性トキシン、ファクター ＩＸ、ファクター ＶＩＩ、ファクター ＶＩＩＩ、ファクター Ｘ、繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、フィブリノゲン、フィブロネクチン、４−ヘリカルバンドルタンパク質（four-helical bundle protein）、ＦＬＴ、Ｇ−ＣＳＦ、ｇｌｐ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、成長因子、成長因子受容体、ｇｒｆ、ヘッジホッグタンパク質、ヘモグロビン、肝細胞成長因子（ｈＧＦ）、ヒルジン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ヒト血清アルブミン、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１ 受容体、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−１ 受容体、インシュリン、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＦＮ−アルファ、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−ガンマ、あらゆるインターフェロン様分子もしくはＩＦＮファミリーの一員、インターロイキン（ＩＬ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニュールチュリン（ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、癌遺伝子産物、パラシトニン（ｐａｒａｃｉｔｏｎｉｎ）、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン、プレイオトロピン（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｎ）、プロテインＡ、プロテインＧ、ｐｔｈ、発熱性外毒素 Ａ、発熱性外毒素 Ｂ、発熱性外毒素 Ｃ、ｐｙｙ、レラキシン、レニン、ＳＣＦ、生合成低分子タンパク質、可溶性補体受容体 Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ １、可溶性インターロイキン受容体、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、超抗原、ブドウ球菌性エンテロトキシン、ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ、ステロイドホルモン受容体、スーパーオキシドジスムターゼ、毒素性ショック症候群トキシン、チモシンアルファ １、組織プラスミノゲン活性化因子、腫瘍成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子、腫瘍壊死因子アルファ、腫瘍壊死因子ベータ、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、ＶＬＡ−４ タンパク質、ＶＣＡＭ−１ タンパク質、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼ、ｍｏｓ、ｒａｓ、ｒａｆ、ｍｅｔ、ｐ５３、ｔａｔ、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ｊｕｎ、ｍｙｂ、ｒｅｌ、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、テストステロン受容体、アルドステロン受容体、ＬＤＬ受容体、およびコルチコステロン。
したがって、上記成長ホルモンに関する以下の記載は、説明のためになされており、単なる例を提供するものであるので、本明細書に記載の方法、組成物、戦略および技術の範囲を限定するものではない。また、本出願におけるｈＧＨポリペプチドへの言及は、一般名を任意のポリペプチドの例として用いることを意図している。非天然にコードされたアミノ酸の置換に関して、ｈＧＨにおける特定のアミノ酸の位置への言及は、説明のためになされており、単なる例を提供するものであるので、本明細書に記載の方法、組成物、戦略および技術の範囲を限定するものではない。したがって、ｈＧＨポリペプチドまたはタンパク質に関する、本明細書に記載の修飾および化学反応は、任意のポリペプチドまたはＧＨスーパーファミリーの任意の一員に対して同様に適用されることができる。上記ＧＨスーパーファミリーの任意の一員には、本明細書において具体的に記載されたものが含まれるが、これに限定されない。
特に定義されない限り、本明細書で用いられた全ての技術用語および科学用語は、本明細書に記載の本発明が属する技術における当業者の一人によって、一般的に理解される意味と同じ意味を有している。本明細書に記載の方法、装置、および材料と、同等または類似の任意のものを、本明細書に記載の発明の実施または試験に用いることができるが、好ましい方法、装置、および材料を記載する。
本明細書に述べられた全ての出版物および特許は、目下記載されている発明と一緒に用いられ得る、出版物に記載されたコンストラクトや方法論などを記載および開示することを目的として、それらの全体が参照のために本明細書に組み込まれる。本明細書において検討された出版物は、本出願の出願日よりも前の開示のみを提供するものである。本明細書では、先行発明の長所または他の如何なる理由によって、本発明らが、上記開示よりも先行している資格を与えられないことを、承認していると解釈されることはない。
用語「実質的な精製」は、ポリペプチドが、天然に生じている環境（すなわち、組み換えにより製造されるポリペプチドの場合は、自然状態の細胞または宿主細胞）において発見されるようなタンパク質を伴う構成要素、または該タンパク質と相互作用する構成要素から、実質的にもしくは本質的に遊離していてもよいことに関する。細胞内の物質から実質的に遊離し得るポリペプチドには、例えば、タンパク質の調製物であって、該調製物に混入しているタンパク質（contaminating protein）が、乾燥重量で約３０％よりも少ない、約２５％よりも少ない、約２０％よりも少ない、約１５％よりも少ない、約１０％よりも少ない、約５％よりも少ない、約４％よりも少ない、約３％よりも少ない、約２％よりも少ない、または約１％よりも少ない調製物が挙げられる。ポリペプチドまたはそのバリアントが、宿主細胞によって組み換えにより製造されるとき、該タンパク質は、細胞の乾燥重量に対して約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％あるいはそれ以下の重量で存在し得る。ポリペプチドまたはそのバリアントが、宿主細胞によって組み換えにより製造されるとき、該タンパク質は、細胞の乾燥重量に対して約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、または約１ｍｇ／Ｌあるいはそれ以下で培地に存在し得る。したがって、本発明の方法により製造されたときの「実質的に精製された」ポリペプチドの純度は、適切な方法（ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ、およびキャピラリー電気泳動など）により決定されたときに、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％であり、具体的には、上記純度は少なくとも約７５％、８０％、８５％であり、より具体的には上記純度は少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％またはそれ以上である。
「組み換え宿主細胞」、または「宿主細胞」は、挿入方法（例えば、直接の取込、形質導入、ｆ−交配、または組み換え宿主細胞を作製する他の技術的に公知の方法）に関係無く、外因性のポリヌクレオチドを含んでいる細胞のことをいう。外因性のポリヌクレオチドを、非統合型のベクター（プラスミドなど）として維持してもよいし、あるいは、宿主のゲノムに統合してもよい。
本明細書で用いられるような用語「培養基」は、任意の宿主細胞を支持し得るまたは含み得る任意の培地、溶液、固体物、半固体物、または剛性の支持体を含んでいる。上記宿主細胞としては、例えば、細菌の宿主細胞、酵母の宿主細胞、昆虫の宿主細胞、植物の宿主細胞、真核生物の宿主細胞、哺乳類の宿主細胞、ＣＨＯ細胞、原核宿主細胞、E. coli、またはPseudomonasの宿主細胞および細胞含有物が挙げられる。したがって、上記用語は、宿主細胞が成長した培養基（例えばポリペプチドが分泌された培養基）を包含している。さらに、そのような培養基は、増殖工程の前のものであってもよいし、後のものであってもよい。また、ポリペプチドが細胞内に製造されるために、当該ポリペプチドを放出させるために、宿主細胞が溶解されるか、破壊される場合、上記用語は、宿主細胞のライセートを含むバッファまたは試薬を包含してもよい。
タンパク質のリフォールディングに関して本明細書で用いられるような「還元剤」は、還元状態においてスルヒドリル基を維持し、かつ分子内または分子間のジスルフィド結合を減少させる任意の化合物もしくは材料として定義される。適切な還元剤としては、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、ジチオエリスリトール、システイン、システアミン（２−アミノエタンチオール）、および還元型グルタチオンが挙げられる。多種多様な還元剤が、本発明の方法および組成物における使用に適切であることは、当業者に直ちに明らかである。
タンパク質のリフォールディングに関して本明細書で用いられるような「酸化剤」は、酸化される化合物から電子を除去することができる、任意の化合物または材料として定義される。適切な酸化剤としては、例えば、酸化型グルタチオン、システイン、シスタミン、酸化型ジチオスレイトール、酸化型エリスリトール（oxidized erythreitol）、および酸素が挙げられる。多種多様な酸化剤が、本発明の方法における使用に適切であることは、当業者に直ちに明らかである。
本明細書で用いられるような「変性剤」は、タンパク質の可逆的なアンホールディングを引き起こす任意の化合物または材料として定義される。変性剤の強さは、特定の変性剤の性質と濃度との両方により決定される。適切な変性剤としては、例えば、カオトロピック性物質、界面活性剤、有機溶媒、水混和性溶媒、リン脂質、またはそれらの２つ以上の組み合わせが挙げられる。適切なカオトロピック性物質としては、例えば、尿素、グアニジン、およびチオシアン酸ナトリウムが挙げられる。有用な界面活性剤としては、例えば、強界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンエステル（ＴｗｅｅｎまたはＴｒｉｔｏｎといった界面活性剤など）、サルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）など）、非イオン性の弱い界面活性剤（ジギトニンなど）、陽イオン性の弱い界面活性剤（Ｎ−＞２，３−（ジオレイオキシ）−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムなど）、イオン性の弱い界面活性剤（コール酸ナトリウム、またはデオキシコール酸ナトリウムなど）、あるいは、両性イオン性の界面活性剤（スルホベタイン（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）、３−（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンサルフェート（ＣＨＡＰＳ）、および３−（３−クロルアミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）など）が挙げられる。有機溶媒、水混和性溶媒（アセトニトリルなど）、低級アルカノール（特にＣ２−Ｃ４のアルカノール（エタノールまたはイソプロパノールなど））、または低級アルカンジオール（特に、Ｃ２−Ｃ４のアルカンジオール（エチレングリコールなど）を、変性剤として用いてもよい。本発明に有用なリン脂質は、天然に生じるリン脂質（ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルイノシトールなど）であってもよいし、または合成リン脂質誘導体もしくはバリアント（ジヘキサノイルホスファチジルコリンまたはジヘプタノイルホスファチジルコリンなど）であってもよい。
本明細書で用いられるような「リフォールディング」は、ジスルフィド結合含有ポリペプチドを、ジスルフィド結合に関して、不適切に折りたたまれた状態、あるいは折りたたまれていない状態から、未変性の立体構造もしくは適切に折りたたまれた立体構造に変形させる任意の処理、反応または方法のことである。
本明細書で用いられるような「コフォールディング」は、具体的には、互いに相互作用する少なくとも２つのポリペプチドを用いて、折りたたまれていないか、不適切に折りたたまれたポリペプチドを、未変性の適切に折りたたまれたポリペプチドへ変形させる、リフォールディングの処理、反応または方法のことをいう。
本明細書で用いられるような「成長ホルモン」または「ＧＨ」は、以下の成長ホルモンの生物活性を少なくとも１つ有するポリペプチドおよびタンパク質を含んでいる：すなわち、任意の哺乳類種および他の家畜に由来する成長ホルモン、ならびに、それらの類似体、異性体、模擬体、断片、混成タンパク質、融合タンパク質、オリゴマーおよびマルチマー、相同体、グリコシル化パターンのバリアント、バリアント、スプライスバリアント、およびムテイン。上記成長ホルモンの生物活性は、同じであってもよいし、異なっていてもよい。また、上記成長ホルモンの合成方法または製造方法としては、例えば、特に限定されないが、核酸分子をマイクロインジェクションすることによるインビトロ、またはインビボでの組み換え法（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の形態の核酸の何れから製造されてもよい）、合成方法、遺伝子導入方法、および遺伝子活性化方法が挙げられる。なお、上記哺乳類種の成長ホルモンには、ヒト（ｈＧＨ）、ウシ（ｈＧＨ）、ブタ（ｈＧＨ）が含まれるが、これらに限定されない。また上記家畜に由来する成長ホルモンには、トリ（ｈＧＨ）が含まれるが、これに限定されない。同様に、用語「ポリペプチド」は、記載されたような上記形態を含んでいる。
用語「ポリペプチド」は、１つ以上のアミノ酸の置換、付加、または欠失を含んでいるポリペプチドを包含する。ｈＧＨの典型的な置換には、例えば、天然のｈＧＨの４１の位置におけるリジンの置換、または１７６の位置におけるフェニルアラニンの置換が含まれる。いくつかの場合では、上記置換は、当該置換が４１の位置である場合には、イソロイシン残基またはアルギニン残基であってもよいし、１７６の位置である場合には、チロシンである。Ｆ１０の位置は、例えば、Ａ、Ｈ、またはＩで置換されることができる。Ｍ１４の位置は、例えばＷ、Ｑ、またはＧで置換されてもよい。他の典型的な置換には、任意の置換またはそれらの組み合わせが含まれ、例えば、特に限定されないが、
R167N, D171S, E174S, F176Y, I179T;
R167E, D171S, E174S, F176Y;
Fl0A, M14W, H18D, H21N;
Fl0A, M14W, H18D, H21N, R167N, D171S, E174S, F176Y, I179T;
Fl0A, M14W, H18D, H21N, R167N, D171A, E174S, F176Y, I179T;
F10H, M14G, H18N, H21N;
Fl0A, M14W, H18D, H21N, R167N, D171A, T175T, I179T;または、
Fl0I, M14Q, H18E, R167N, D171S, I179Tが挙げられる。なお、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，１４３，５２３号明細書を参照のこと。
天然に生じるポリペプチドにおけるアミノ酸の多種多様な位置での典型的な置換は、記載されており、例えば、アゴニスト活性を増加する置換、プロテアーゼ耐性を増加する置換、ポリペプチドをアンタゴニストに変換する置換などが挙げられ、また用語「ポリペプチド」に包含される。
アゴニストのＧＨ（例えばｈＧＨ）の配列は、天然に生じるｈＧＨの配列であって、以下の修飾、H18D, H21N, R167N, D171S, E174S, I179Tを含んでいる配列を包含する。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，８４９，５３５号明細書を参照のこと。また、アゴニストのｈＧＨの配列は、
H18D, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174S;
H18A, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174S;または、
H18D, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174Aを含んでいる。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，０２２，７１１号明細書を参照のこと。H18A、Q22A、F25A、D26A、Q29A、E65A、K168A、E174Aの置換を含んでいるｈＧＨポリペプチドでは部位Ｉにおいて、ｈＧＨ受容体に対する親和性が増強している。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，８５４，０２６号明細書を参照のこと。プロテアーゼに対する耐性が増加したｈＧＨの配列には、Ｃ−Ｄループ内のアミノ酸が１つ以上置換されているｈＧＨが含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、置換には、特に限定されないが、R134D, T135P, K140A、およびそれらの任意の組み合わせが含まれる。例えば、「Alam ら (1998) J. Biotechnol. 65:183-190」を参照のこと。
ヒト成長ホルモンアンタゴニストは、Ｇ１２０における置換（例えば、G120R, G120K, G120W, G120Y, G120FまたはG120E）を有し、時々さらに、以下の置換H18A, Q22A, F25A, D26A, Q29A, E65A, K168A, E174Aを有する成長ホルモンを含んでいる。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，００４，９３１号明細書を参照のこと。いくつかの実施形態では、ｈＧＨアンタゴニストは、ＧＨをアンタゴニストとして機能させる、１０６−１０８または１２７−１２９の領域における置換を少なくとも１つ含んでいる。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，６０８，１８３号明細書を参照のこと。いくつかの実施形態では、上記ｈＧＨアンタゴニストは、ｈＧＨ分子の部位ＩＩ結合領域に存在する水溶性ポリマーに連結した、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。いくつかの実施形態では、上記ｈＧＨポリペプチドは、以下の置換H18D, H21N, R167N, K168A, D171S, K172R, E174S, I179Tと、G120における置換とをさらに含んでいる（例えば、米国特許第５，８４９，５３５号明細書を参照のこと）。
天然に生じるヒトＧＨの完全な全長のアミノ酸配列、および成熟した天然に生じるＧＨのアミノ酸配列、および天然に生じる突然変異体については、それぞれ米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書に記載の配列番号１、２、および３で表される配列を参照のこと。いくつかの実施形態では、本発明のＧＨポリペプチド（例えばｈＧＨポリペプチド）は、米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書に記載の配列番号１、２、および３で表される配列と実質的に同一であるか、または成長ホルモンポリペプチドの他の任意の配列と実質的に同一である。例えば、いくつかの実施形態では、本発明のＧＨポリペプチド（例えばｈＧＨポリペプチド）は、米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書に記載の配列番号１、２、もしくは３、または成長ホルモンポリペプチドの他の任意の配列と、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％同一である。いくつかの実施形態では、本発明のＧＨポリペプチド（例えばｈＧＨポリペプチド）は、米国特許出願公開２００５／０１７０４０４号明細書に記載の配列番号２で表される配列と、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％同一である。ｈＧＨの多くの天然に生じる突然変異体は既に同定されている。当該突然変異体には、ｈＧＨ−Ｖ（「Seeburg, DNA 1: 239 (1982)」、米国特許第４，４４６，２３５号明細書、米国特許第４，６７０，３９３号明細書、および米国特許第４，６６５，１８０号明細書（なお、上記文献は、参照によって本明細書に組み込まれる））、およびｈＧＨの３２−４６の残基が欠失した２０−ｋＤａのｈＧＨ（米国特許出願公開２００５／０１７０４０４号明細書に記載の配列番号３）（「Kostyoら, Biochem. Biophys. Acta 925: 314 (1987)」、「Lewis, U.ら, J. Biol. Chem., 253:2679-2687 (1978)」）が含まれる。胎盤成長ホルモンは、「Igout, A.ら, Nucleic Acids Res. 17(10):3998 (1989)」に記載されている。また、転写後プロセシング、翻訳後プロセシング、分泌プロセシング、代謝プロセシング、および他の生理的プロセシングにより生じた多くのｈＧＨバリアントは、報告されている。当該バリアントとしては、例えば、タンパク質分解により切断されたバリアント、または２鎖のバリアント（「Baumann, G., Endocrine Reviews 12: 424 (1991)」）が挙げられる。ジスルフィド連結（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ）を介して直接連結したｈＧＨダイマーは、「Lewis, U. J.ら, J. Biol. Chem. 252:3697-3702 (1977)」、「Brostedt, P. and Roos, P., Prep. Biochem. 19:217-229 (1989)」に記載されている。ｈＧＨ突然変異体をコードする核酸分子、およびｈＧＨ突然変異体のポリペプチドは、公知であり、例えば、特に限定されないが、米国特許第５，５３４，６１７号明細書、米国特許第５，５８０，７２３号明細書、米国特許第５，６８８，６６６号明細書、米国特許第５，７５０，３７３号明細書、米国特許第５，８３４，２５０号明細書、米国特許第５，８３４，５９８号明細書、米国特許第５，８４９，５３５号明細書、米国特許第５，８５４，０２６号明細書、米国特許第５，９６２，４１１号明細書、米国特許第５，９５５，３４６号明細書、米国特許第６，０１３，４７８号明細書、米国特許第６，０２２，７１１号明細書、米国特許第６，１３６，５６３号明細書、米国特許第６，１４３，５２３号明細書、米国特許第６，４２８，９５４号明細書、米国特許第６，４５１，５６１号明細書、米国特許第６，７８０，６１３号明細書、および米国特許出願公開第２００３／０１５３００３号明細書に開示されたものが挙げられる。同様に、用語「ポリペプチド」は、公知のポリペプチドについて上記で言及したものと同等のものを含む。
ｈＧＨの市販品は、Humatrope（登録商標）（Eli Lilly & Co.）、Nutropin（登録商標）（Genentech）、Norditropin（登録商標）（Novo-Nordisk）、Genotropin（登録商標）（Pfizer）、およびSaizen/Serostim（登録商標）（Serono）の名称で売買されている。
また、用語「ポリペプチド」は、（１）天然に生じるポリペプチドの薬学的に許容可能な塩およびプロドラッグ、ならびに、上記塩のプロドラッグ、多形体、水和物、溶媒和物、生物活性型断片、生物活性型バリアント、および立体異性体、ならびに（２）天然に生じるポリペプチドの、アゴニスト、模擬体、およびアンタゴニストのバリアント、ならびに（３）それらのポリペプチド融合体が含まれる。用語「ポリペプチド」には、別のアミノ酸をアミノ末端、カルボキシ末端、またはその両方に含んでいる融合体が含まれる。典型的な融合体としては、例えば、特に限定されないが、ポリペプチドの組み換え発現により得られるメチオニルポリペプチド（メチオニンがポリペプチドのＮ−末端に連結している成長ホルモン）、精製を目的とした融合体（例えば、特に限定されないが、ポリヒスチジンまたは親和性エピトープとの融合体）、血清アルブミン結合ペプチドとの融合体、血清アルブミンなどの血清タンパク質との融合体が挙げられる。参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，７５０，３７３号明細書には、受容体分子に対する結合特性が変更された、新規タンパク質（成長ホルモンおよび抗体断片のバリアントなど）を選択する方法が記載されている。上記方法は、興味のあるタンパク質をコードする遺伝子を、線状ファージＭ１３のコートタンパク質の遺伝子ＩＩＩのカルボキシ末端ドメインに融合させる工程を含んでいる。
様々な文献において、ポリマーの接合、またはグリコシル化によりポリペプチドを修飾することが開示されている。用語「ポリペプチド」は、ＰＥＧなどのポリマーに接合されたポリペプチドを含んでいる。また用語「ポリペプチド」では、システイン、リジン、または他の残基の１つ以上がさらに誘導体化されていてもよい。さらに、上記ポリペプチドは、リンカーまたはポリマーを含んでいてもよい。上記リンカーまたはポリマーは、本発明の非天然アミノ酸に接合されていてもよいし、リジンもしくはシステインに結合するなどの技術的に公知の手法を利用して、天然にコードされたアミノ酸に接合されていてもよい。
ポリペプチド（ｈＧＨなど）のポリマー接合は、報告されている。例えば、米国特許第５，８４９，５３５号明細書、米国特許第６，１３６，５６３号明細書、および米国特許第６，６０８，１８３号明細書を参照のこと（上記文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。米国特許第４，９０４，５８４号明細書には、リジンが欠損しているＰＥＧ化したポリペプチドであって、少なくとも１つのリジン残基が欠失されているか、または他の任意のアミノ酸残基で置換されているポリペプチドが開示されている。国際公開第９９／６７２９１号パンフレットには、タンパク質とＰＥＧとを接合する方法であって、タンパク質における少なくとも１つのアミノ酸残基を欠失し、当該タンパク質がＰＥＧと接合するほど十分な条件下において、当該タンパク質とＰＥＧとを接触させる方法が開示されている。国際公開第９９／０３８８７号パンフレットには、成長ホルモンスーパーファミリーに属するポリペプチドのＰＥＧ化したバリアントであって、システイン残基が、ポリペプチドの特定の領域に位置する非必須のアミノ酸で置換されているバリアントが開示されている。国際公開第００／２６３５４号パンフレットには、アレルゲン性が減少したポリペプチドのグリコシル化バリアントであって、対応する親ポリペプチドと比べて、少なくとも１つのグリコシル化部位を含んでいるバリアントを製造する方法が開示されている。参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，２１８，０９２号明細書には、天然のポリペプチドと比べて、少なくとも１つの別の炭水化物鎖を導入するための、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）および他のポリペプチドの修飾が記載されている。
また、用語「ポリペプチド」には、グリコシル化ポリペプチド、および、特に限定されないが、任意のアミノ酸の位置においてグリコシル化されたポリペプチド、Ｎ連結型のグリコシル化ポリペプチド、またはＯ連結型のグリコシル化ポリペプチドが含まれる。また、ヌクレオチドが１つだけ変更されているバリアントは、ポリペプチドの生物活性型バリアントであると考えられる。さらに、スプライスバリアントも含まれる。また、用語「ポリペプチド」には、１つ以上の任意のポリペプチド、または任意の他のポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ポリマー、低分子、リンカー、リガンド、もしくは他の任意の種類の生物活性分子が、化学的手段によって連結されているか、もしくは融合タンパク質として発現している、ポリペプチドのヘテロダイマー、ホモダイマー、ヘテロマルチマー、またはホモマルチマー、ならびに、例えば、特定の欠失または他の修飾を含んでいるが、それでも生物活性を維持しているポリペプチドの類似体が含まれる。
特に断りの無い限り（すなわち、米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書に記載の配列番号１、米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書に記載の配列番号３、または他のｈＧＨの配列に基づいて比較しているとき以外は）、本明細書に記載のＧＨ（例えばｈＧＨ）におけるアミノ酸の位置に対する言及の全ては、米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書に記載の配列番号２の位置に基づいている。当業者は、米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書に記載の配列番号１，２または３、あるいは任意の他のＧＨの配列における位置に対応するアミノ酸の位置は、任意の他のＧＨ（例えばｈＧＨ）分子（ＧＨまたはｈＧＨの融合体、バリアント、もしくは断片など）において直ちに同定され得ることを理解する。例えば、ＢＬＡＳＴなどの配列アライメントプログラムを用いて、米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書に記載の配列番号１，２または３、あるいは他のＧＨの配列における位置に対応する、タンパク質の特定の位置を整列し、同定することができる。また、米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書に記載の配列番号１，２または３、あるいは他のＧＨの配列に関する本明細書に記載のアミノ酸の置換、欠失または付加は、本明細書に記載されているか、もしくは技術的に公知であるＧＨまたはｈＧＨの融合体、バリアントもしくは断片などでの対応する位置における置換、欠失または付加のことを意図しており、本発明に明示的に包含される。
用語「ポリペプチド」は、１つ以上のアミノ酸の置換、付加、または欠失を含んでいるポリペプチドを包含する。本発明のポリペプチドは、１つ以上の天然アミノ酸による修飾、および１つ以上の非天然アミノ酸による修飾を含んでいてもよい。天然に生じるポリペプチドにおけるアミノ酸の多種多様な位置における典型的な置換は、報告されており、用語「ポリペプチド」に包含される。上記置換には、特に限定されないが、ポリペプチドの生物活性の１つ以上を調節する置換が含まれ、より具体的には、例えば、特に限定されないが、アゴニスト活性を増加させる置換、ポリペプチドの可溶性を増加させる置換、プロテアーゼ感受性を減少させる置換、ポリペプチドをアンタゴニストに変換する置換などが挙げられる。
ヒトＧＨアンタゴニストには、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、１０３、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３、および１２７における置換を有するか、または１の位置（すなわちＮ末端）に付加されているか、あるいはそのあらゆる組み合わせを有するアンタゴニストが含まれるが、これに限定されない（米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書に記載の配列番号２、または米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書に記載の配列番号１もしくは３において対応するアミノ酸、または他の任意のＧＨ配列）。いくつかの実施形態では、ｈＧＨアンタゴニストは、ＧＨをアンタゴニストとして機能させる、１−５（Ｎ末端）、６−３３（Ａへリックス）、３４−７４（ＡへリックスとＢへリックスとの間の領域、Ａ−Ｂループ）、７５−９６（Ｂへリックス）、９７−１０５（ＢへリックスとＣへリックスとの間の領域、Ｂ−Ｃループ）、１０６−１２９（Ｃへリックス）、１３０−１５３（ＣへリックスとＤへリックスとの間の領域、Ｃ−Ｄループ）、１５４−１８３（Ｄへリックス）、１８４−１９１（Ｃ末端）の領域において、少なくとも１つの置換を含んでいる。他の実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸を組み込む部位の例には、へリックスＡのアミノ末端領域内の残基とへリックスＣの一部の残基とが含まれる。別の実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸（ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンまたはＯ−プロパルギル−Ｌ−チロシンなど）によるＧ１２０の置換である。他の実施形態では、上記置換は、ｈＧＨポリペプチドをｈＧＨアンタゴニストにするさらに別の置換と組み合わされる。例えば、非天然にコードされたアミノ酸は、本明細書で同定された位置の１つにおいて置換され、それと同時に、置換がＧ１２０に導入される（例えば、Ｇ１２０Ｒ、Ｇ１２０Ｋ、Ｇ１２０Ｗ、Ｇ１２０Ｙ、Ｇ１２０Ｆ、またはＧ１２０Ｅ）。いくつかの実施形態では、上記ｈＧＨアンタゴニストは、ｈＧＨ分子の受容体結合領域に存在する水溶性ポリマーに連結した、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドの生物活性を調節する付加、置換または欠失をさらに含んでいる。例えば、付加、置換、または欠失は、ポリペプチドの性質または活性を１つ以上調節するものであってもよい。例えば、付加、置換、または欠失は、ポリペプチドの受容体または結合パートナーに対する親和性の調節、受容体のダイマー化の調節（増加または減少など）、ダイマーになった受容体の安定化、結合パートナーの立体構造もしくは１つ以上の生物活性の調節、循環時間の調節、治療半減期の調節、ポリペプチドの安定性の調節、プロテアーゼによる切断の調節、用量の調節、放出もしくは生体利用効率の調節、精製の促進、あるいは、特定の投与経路の改善もしくは変更をするものであってもよい。同様に、ポリペプチドは、検出（ＧＦＰなど）、精製、またはポリペプチドの他の特徴を改善する、プロテアーゼ切断配列、反応基、抗体結合ドメイン（ＦＬＡＧまたはポリＨｉｓなど）、他の親和性に基づく配列（ＦＬＡＧ、ポリＨｉｓ、ＧＳＴなど）、あるいは、連結分子（ビオチンなど）を含んでいてもよい。
また、用語「ポリペプチド」には、連結しているホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモマルチマー、およびヘテロマルチマーが含まれる。これらダイマーおよびマルチマーとしては、例えば、非天然にコードされたアミノ酸の側鎖を介して、同じもしくは異なる非天然にコードされたアミノ酸の側鎖、または天然にコードされたアミノ酸の側鎖に直接的に連結しているもの、あるいはリンカーを介して間接的に連結しているものが挙げられる。典型的なリンカーには、例えば、有機低分子、様々な長さの水溶性ポリマー（ポリ（エチレングリコール）もしくはポリデキストランなど）、または様々な長さのポリペプチドが含まれる。
「非天然にコードされたアミノ酸」は、２０の一般アミノ酸のうちの１つ、セレノシステイン、もしくはピロリジンではないアミノ酸のことをいう。用語「非天然にコードされたアミノ酸」と同義として用いられてもよい別の用語は、「非天然アミノ酸」、「天然ではないアミノ酸」、「非天然に生じるアミノ酸」、ならびに、それらの様々にハイフンで繋げられたもの、およびハイフンで繋げられていないものである。また、用語「非天然にコードされたアミノ酸」としては、天然にコードされたアミノ酸（２０の一般アミノ酸、またはピロリジンおよびセレノシステインなどが含まれるが、これらに限定されない）の修飾（例えば翻訳後修飾）によって生じるが、それ自体は翻訳複合体により成長中のポリペプチド鎖に天然に組み込まれないアミノ酸が挙げられるが、これに限定されない。上記非天然に生じるアミノ酸としては、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−トレオニン、およびＯ−ホスホチロシンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
「アミノ末端修飾基」は、ポリペプチドのアミノ末端に接着することができる任意の分子のことをいう。同様に、「カルボキシ末端修飾基」は、ポリペプチドのカルボキシ末端に接着することができる任意の分子のことをいう。末端修飾基には、例えば、様々な水溶性ポリマー、血清アルブミンなどのタンパク質もしくはペプチド、あるいは、ペプチドの血中半減期を増加させる他の部分が含まれる。
用語「官能基」、「活性部分」、「活性化基」、「脱離基」、「反応部位」、「化学反応基」、および「化学反応部分」は、識別可能で、定義可能な分子の一部またはユニットに言及するために、本明細書および技術的に用いられる。上記用語は、化学技術的にある程度同義であり、ある機能または活性を行使するとともに、他の分子と反応する分子の一部を示すために本明細書において用いられる。
用語「連結」または「リンカー」は、化学反応の結果、標準的に形成される基または結合のことであり、通常、共有連結である。加水分解に安定な連結は、連結が実質的に水中において安定であり、（例えば、長期間、ことによると無期限の生理的条件下において）有用なｐＨ値において水と反応しないことを意味する。加水分解に不安定または分解性の連結は、連結が水中または水溶液中（例えば、血液）において分解可能であることを意味する。酵素に不安定または分解性の連結は、連結が１つ以上の酵素により分解され得ることを意味する。技術的に理解されるように、ＰＥＧおよびそれに関連するポリマーは、分解性の連結を、ポリマーの骨格、またはポリマーの骨格と該ポリマー分子の末端にある１つ以上の官能基との間のリンカー基に含み得る。例えば、ＰＥＧカルボン酸または活性型ＰＥＧカルボン酸と生物活性剤のアルコール基との反応によって形成されるエステル連結は、一般的に、生理条件下において加水分解され、生物活性剤を放出する。他の加水分解可能な連結としては、例えば、カーボネート連結、アミンとアルデヒドとの反応から生じるイミン連結、アルコールとリン酸基との反応により形成されるリン酸エステル連結、ヒドラジドとアルデヒドとの反応生成物であるヒドラゾン連結、アルデヒドとアルコールとの反応生成物であるアセタール連結、ギ酸塩とアルコールとの反応生成物であるオルソエステル連結（例えば、ＰＥＧなどのポリマーの末端における）アミン基とペプチドのカルボキシル基とにより形成されるペプチド連結、および（例えばポリマーの末端における）ホスホラミジーテ（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）基とオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基とにより形成されるオリゴヌクレオチド連結が挙げられる。
本明細書で用いられるときの用語「生物活性分子（生物学的に活性な分子）」、「生物活性部分」、または「生物活性剤」は、生物に関する生物学的な系、経路、分子、または相互作用における任意の物理性質もしくは生物化学性質に影響を与えることができる任意の物質のことを意味する。上記生物としては、例えば、ウイルス、細菌、バクテリオファージ、トランスポゾン、プリオン、昆虫、真菌、植物、動物、およびヒトが挙げられる。特に、本明細書で用いられるような生物活性分子には、ヒトまたは他の動物における疾患の診断、回復、鎮静、治療、または予防を意図される任意の物質、あるいは、ヒトまたは動物の身体的もしくは精神的な健康状態を増強するための任意の物質が含まれるが、これらに限定されない。生物活性分子としては、例えば、ペプチド；タンパク質；酵素；低分子薬物；ワクチン；免疫原；ハードドラッグ；ソフトドラッグ；炭水化物；無機原子または分子；色素；脂質；ヌクレオシド；放射性核種；オリゴヌクレオチド；トキソイド；毒素；原核細胞；真核細胞；ウイルス、ポリサッカライド、ウイルス、細菌、昆虫、動物または任意の他の細胞もしくは細胞種から得られるか、もしくはそれらに由来する核酸およびその一部；リポソーム；微粒子；およびミセルなどが挙げられる。本発明と一緒に使用するための適切な生物活性剤の種類としては、薬物、プロドラッグ、放射性核種、造影剤、ポリマー、抗生物質、殺菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心・血管作動薬、抗不安剤、ホルモン、成長因子、ステロイド剤、および細菌由来の毒素などが挙げられる。
「二官能性ポリマー」は、他の部分（アミノ酸の側鎖など）と特異的に反応して、共有連結または非共有連結を形成することができる別々の官能基を２つ含んでいるポリマーのことをいう。二官能性リンカーでは、一方の官能基は、特定の生物活性を有する構成要素における基と反応し、もう一方の官能基は第２の生物活性を有する構成要素における基と反応する。この二官能性リンカーを用いて、第１の生物活性を有する構成要素、二官能性リンカーおよび第２の生物活性を有する構成要素を含んでいる接合体を形成してもよい。様々な化合物をペプチドに接着させるための多くの手法およびリンカー分子が公知である。例えば、欧州特許出願第１８８，２５６号明細書、米国特許第４，６７１，９５８号明細書、米国特許第４，６５９，８３９号明細書、米国特許第４，４１４，１４８号明細書、米国特許第４，６９９，７８４号明細書、米国特許第４，６８０，３３８号明細書、および米国特許第４，５６９，７８９号明細書を参照のこと。これらは参照によって、本明細書に組み込まれる。「多官能性ポリマー」は、他の部分（アミノ酸の側鎖基など）と特異的に反応して、共有連結または非共有連結を形成することができる別々の官能基を２つ以上含んでいるポリマーのことをいう。二官能性ポリマーまたは多官能性ポリマーは、任意の所望の長さ、もしくは分子量であってもよいし、さらに、分子に連結される１つ以上の分子の間に特定の所望の間隔または立体構造を提供するように選ばれてもよい。
置換基が、左から右に書くという従来の化学式により記載されている場合、該置換基は、右から左に書かれた構造に由来する化学的に同一の置換基を同じく含んでいる。例えば、−ＣＨ２Ｏ−は−ＯＣＨ２−と同じである。
用語「置換基」は、特に限定されないが「不干渉性置換基」を含む。「不干渉性置換基」は、安定な化合物を産出する基である。適切な不干渉性置換基または遊離基（ｒａｄｉｃａｌ）としては、例えば、ハロ、Ｃ１−Ｃ１０のアルキル、Ｃ２−Ｃ１０のアルケニル、Ｃ２−Ｃ１０のアルキニル、Ｃ１−Ｃ１０のアルコキシ、Ｃ１−Ｃ１２のアラルキル、Ｃ１−Ｃ１２のアルカリル、Ｃ３−Ｃ１２のシクロアルキル、Ｃ３−Ｃ１２のシクロアルケニル、フェニル、置換フェニル、トルオイル、キシレニル、ビフェニル、Ｃ２−Ｃ１２のアルコキシアルキル、Ｃ２−Ｃ１２のアルコキシアリール、Ｃ７−Ｃ１２のアリールオキシアルキル、Ｃ７−Ｃ１２のオキシアリール、Ｃ１−Ｃ６のアルキルスルフィニル、Ｃ１−Ｃ１０のアルキルスルフォニル、−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）（ここで、ｍは１から８である）、アリール、置換アリール、置換アルコキシ、フルオロアルキル、ヘテロ環式の遊離基、置換ヘテロ環式の遊離基、ニトロアルキル、−−ＮＯ２、−−ＣＮ、−−ＮＲＣ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）、Ｃ２−Ｃ１０のアルキルチオアルキル、−−Ｃ（Ｏ）Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）、−−ＯＨ、−−ＳＯ２、＝Ｓ、−−ＣＯＯＨ、−−ＮＲ２、カルボニル、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）−ＣＦ３、Ｃ（Ｏ）−ＣＦ３、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−−（Ｃ１−Ｃ１０のアリール）−Ｓ−−（Ｃ６−Ｃ１０のアリール）、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０のアリール）、−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０のアルキル）（ここで各ｍは１〜８である）、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、−−ＳＯ２ＮＲ２、−−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ２、およびそれらの塩などが挙げられる。本明細書で用いられるような各Ｒ基は、Ｈ、アルキルもしくは置換アルキル、アリールもしくは置換アリール、アラルキルまたはアルカリルである。
用語「ハロゲン」には、フッ素、塩素、ヨウ素、および臭素が含まれる。
用語「アルキル」は、それ自体または別の置換基の一部として、特に断りの無い限り、炭素原子数が指定された（すなわち、Ｃ１−１０は、１から１０の炭素を意味する）、２価の遊離基および多価の遊離基を含んでいてもよいし、完全飽和、単不飽和、またはポリ不飽和であってもよい、直鎖状、分枝鎖状、または環状の炭化水素の遊離基（ラジカル）、あるいはそれらの組み合わせを意味する。飽和炭化水素の遊離基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、およびシクロプロピルメチル、ならびにｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、およびｎ−オクチルなどの同族体と異性体とが挙げられる。不飽和アルキル基は、１つ以上の２重または３重結合を有しているものである。不飽和アルキル基としては、例えば、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタンジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−および３−プロピニル、３−ブチニル、ならびに、高級同族体および異性体などが挙げられる。また、用語「アルキル」は、特に断りの無い限り、下記においてより詳細に定義されるアルキルの誘導体（ヘテロアルキルなど）を含むことを意味している。炭化水素基に限定されないアルキル基のことを、「ホモアルキル」という。
用語「アルキレン」は、それ自体または別の置換基の一部として、アルカンから誘導された２価の遊離基を意味する。アルキレンとしては、例えば、−ＣＨ２ＣＨ２−および−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−という構造が挙げられる。また、アルキレンには、以下の「ヘテロアルキレン」として定義される基が含まれる。通常、アルキル（またはアルキレン）基は、１から２４までの炭素原子を有しているが、本明細書に記載の方法および組成物の特定の実施形態では、これらの基は、１０以下の炭素原子を有している。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、アルキル基またはアルキレン基における鎖がより短いもののことであり、一般的に、８以下の炭素原子を有している。
用語「アルコキシ」、「アルキルアミノ」および「アルキルチオ（またはチオアルコキシ）」は、従来の意味において用いられ、酸素原子、アミノ基、または硫黄原子のそれぞれを介して、分子の残基に接着するアルキル基のことをいう。
用語「ヘテロアルキル」は、それ自体または他の用語と組み合わせて、特に断りの無い限り、既定された数の炭素原子と少なくとも１つのヘテロ原子とから成る、安定な直鎖状、分枝鎖状、または環状の炭化水素の遊離基、あるいはそれらの組み合わせを意味する。上記ヘテロ原子は、Ｎ、Ｏ、ＳｉおよびＳから選択される。窒素原子および硫黄原子は、必要に応じて酸化されてもよいし、窒素のヘテロ原子は必要に応じて４級化されてもよい。Ｏ、Ｎ、およびＳ、ならびにＳｉのヘテロ原子は、ヘテロアルキル基の内部の任意の位置、または、アルキル基が分子の残部と接着する位置に配置されてもよい。例えば、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられるが、これらに限定されない。２以下のヘテロ原子は、隣接していてもよく、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３、および−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３が挙げられる。同様に、用語「ヘテロアルキレン」は、それ自体または他の置換基の一部として、ヘテロアルキルに由来する２価の遊離基を意味し、例えば、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−、および−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−が挙げられる。ヘテロアルキレン基では、同種または異種のヘテロ原子を、鎖の末端の一方または両方に配置することができる（例えば、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ、およびアミノオキシアルキレンなどが挙げられる）。さらに、アルキレンおよびヘテロアルキレンの連結基では、連結基の配向性は、連結基の一般式が書かれた方向によって示されるわけではない。例えば、一般式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−および−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−の両方を表す。
用語「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」は、それら自体または他の用語との組み合わせにおいて、特に断らない限りは、それぞれ「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環化型を表す。したがって、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルには、飽和環連結、部分不飽和環連結および完全不飽和環連結が含まれる。さらに、ヘテロシクロアルキルでは、ヘテロ原子を、ヘテロ環が分子の残部に接着する位置に配置することができる。シクロアルキルとしては、例えば、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロヘキセニル、３−シクロヘキセニル、およびシクロヘプチルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキルとしては、例えば、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、および２−ピペラジニルなどが挙げられる。さらに、上記用語は、２環構造、および３環構造も含んでいる。同様に、用語「ヘテロシクロアルキレン」は、それ自体または他の置換基の一部として、ヘテロシクロアルキルに由来する２価の遊離基を意味し、用語「シクロアルキレン」は、それ自体または他の置換基の一部として、シクロアルキルに由来する２価の遊離基を意味する。
本明細書で用いられるような用語「水溶性ポリマー」は、水溶液に可溶である任意のポリマーのことをいう。水溶性ポリマーとポリペプチドとの連結により、例えば、以下のような変化が生じる。すなわち、非修飾の形態と比べた血中半減期の増加または調節、あるいは治療半減期の増加または調節、免疫原性の調節、物理的会合特性（凝集および多量体形成など）の調節、受容体結合性の変更、１つ以上の結合パートナーに対する結合性の変更、および、受容体の２量体化および多量体化の変更など。水溶性ポリマーは、それ自体生物活性を有していてもよいし、有していなくてもよい。また、水溶性ポリマーは、ポリペプチドを他の物質（１つ以上のポリペプチドまたは１つ以上の生物活性分子など）に接着させるためのリンカーとして利用されてもよい。適切なポリマーとしては、特に限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそれらのモノＣ１−Ｃ１０アルコキシもしくはアリールオキシ誘導体（これらは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，２５２，７１４号明細書に記載されている）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテル無水マレイン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、デキストラン誘導体（デキストラン サルフェートなど）、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、ヘパリン、ヘパリンの断片、多糖類（ポリサッカライド）、オリゴサッカライド、グリカン、セルロースおよびセルロース誘導体（メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースなど）、デンプンおよびデンプン誘導体、ポリペプチド、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアルキレングリコールのコポリマーおよびその誘導体、ポリビニルエチルエーテル、およびアルファ−ベータ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルトアミド（ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ）など、ならびに、それらの混合物が挙げられる。上記水溶性ポリマーとしては、例えば、ポリエチレングリコールおよび血清アルブミンが挙げられる。
本明細書で用いられるような用語「ポリアルキレングリコール」または「ポリ（アルケングリコール）」は、ポリエチレングリコール（ポリ（エチレングリコール））、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール、およびそれらの誘導体のことをいう。用語「ポリアルキレングリコール」および／または「ポリエチレングリコール」は、直鎖状ポリマーおよび分枝状ポリマー、ならびに０．１ｋＤａから１００ｋＤａの間の平均分子量を含む。他の典型的な実施形態は、例えば、商業的な供給業者のカタログ（Shearwater Corporationのカタログ「“Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications”(2001)」など）に記載されている。
用語「アリール」は、特に断りの無い限り、ポリ不飽和芳香族炭化水素の置換基を意味する。この置換基は、（ｉ）単環、または（ｉｉ）一緒に融合もしくは共有連結した複環（例えば、特に限定されないが１から３までの環）であってもよい。用語「ヘテロアリール」は、Ｎ、ＯおよびＳから選択される１から４までのヘテロ原子を含んでいるアリール基（環）のことである。上記ヘテロアリールでは、窒素原子および硫黄原子が、必要に応じて酸化されたり、窒素原子が必要に応じて４級化されたりしている。ヘテロアリール基を、ヘテロ原子を介して分子の残部に接着させることができる。アリール基およびヘテロアリール基としては、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソキサゾリル、４−イソキサゾリル、５−イソキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル（ｐｕｒｉｎｙｌ）、２−ベンズイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル、および６−キノリルが挙げられる。上記の各アリール環系およびヘテロアリール環系のための置換基は、以下に記載の許容可能な置換基の群から選択される。
簡潔には、他の用語と組み合わせて用いたときの用語「アリール」（アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキル（ａｒｙｌａｌｋｙｌ）など）は、上記において定義したようなアリール環およびヘテロアリール環の両方を含む。したがって、用語「アリールアルキル」は、アリール基がアルキル基と接着している遊離基を含むことを意味し、例えば、ベンジル、フェネチル、およびピリジルメチルなどが挙げられる。また、上記アルキル基における炭素原子（メチレン基など）が酸素原子により置換されているアルキルアリールとしては、例えば、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、および３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなどが挙げられる。
上記各用語（「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」および「ヘテロアリール」など）は、示された遊離基の置換型および非置換型の両方を含んでいることを意味する。各種類の遊離基のための典型的な置換基を以下に示す。
（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと称されることが多い基を含む）アルキル遊離基およびヘテロアルキル遊離基のための置換基は、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（０）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ、および−ＮＯ２などから選択される様々な基の１つ以上であってもよく、また、上記置換基の数は、０から（２ｍ’＋１）までの範囲であってもよい。ｍ’は、上記遊離基における炭素原子の総数である。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、それぞれ独立して、水素、置換もしくは非置換へテロアルキル、非置換もしくは置換アリール（１−３のハロゲンで置換されたアリールなどを含む）、置換あるいは非置換アルキル基、アルコキシ基、もしくはチオアルキル基、またはアリールアルキル基のことである。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含んでいるとき、例えば、Ｒ基のそれぞれは、これらの基が２つ以上存在するとき、それぞれＲ’基、Ｒ’’基、Ｒ’’’基およびＲ’’’’基として、独立して選択される。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に接着する場合、それらは、窒素原子と組み合わさって、５−、６−、７−員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルなどを含むことを意味する。置換基に対する上記検討によれば、当業者の一人は、用語「アルキル」は、水素基以外の基と結合した炭素原子を含む基（例えば、ハロアルキル（−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３など）、およびアシル（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３など））を包含することを意味すると理解する。
アルキル遊離基について記載された置換基と同様に、アリールおよびヘテロアリール基のための置換基には、様々なものがある。さらに、アリールおよびヘテロアリール基のための置換基は、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮおよび−ＮＯ２、−Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシおよびフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキルなどから選択され、上記置換基の数は、０から芳香環系の開放原子価の総数の範囲である。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’は、それぞれ独立して、水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール、およびヘテロアリールから選択される。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含んでいるとき、例えば、Ｒ基のそれぞれは、これらの基が２つ以上存在するとき、それぞれＲ’基、Ｒ’’基、Ｒ’’’基およびＲ’’’’基として、独立して選択される。
本明細書で用いられるような用語「調節された血中半減期」は、未修飾の形態と比べたときの、修飾型ポリペプチドの循環半減期の正の変化または負の変化のことをいう。血中半減期は、ポリペプチドを投与した後の様々な時点の血液試料を採取して、各試料における該ポリペプチドの濃度を決定することにより測定される。血清中の濃度と時間との相互関係から、血中半減期を計算することができる。血中半減期が少なくとも約２倍に増加することが望ましいが、例えば、投与計画を満足すること、または毒性効果を避けることができる場合には、それよりも小さい方が有利である。いくつかの実施形態では、増加は、少なくとも約３倍であるか、少なくとも約５倍であるか、または少なくとも約１０倍である。
本明細書で用いられるような用語「調節された治療半減期」は、未修飾の形態と比べたときの、修飾型ポリペプチドの治療的有効量の半減期の正の変化または負の変化のことをいう。投与後の様々な時点における、上記分子の薬物動態的性質および／または薬力学的性質を、測定することにより治療半減期は測定される。治療半減期が増加すると、投与計画または総用量に特定の利益をもたらすことや、あるいは、望ましくない効果を避けることができる。いくつかの実施形態では、治療半減期の増加は、効力の増加、標的に対する修飾された分子の結合の増加もしくは減少、酵素（プロテアーゼなど）による分子の破壊の増加もしくは減少、あるいは未修飾の分子における作用の別のパラメーターまたは機構の増加もしくは減少に起因する。
用語「免疫原性」は、免疫反応を誘発するタンパク質の能力を意味する。上記免疫反応には、特に限定されないが、中和抗体および非中和抗体の産生、免疫複合体の形成、補体活性化、肥満細胞活性化、炎症およびアナフィラキシーが含まれる。免疫反応は、液性（Ｂリンパ球が分泌する抗体）であってもよいし、細胞性（Ｔリンパ球）であってもよいし、あるいはその両方であってもよい。また、用語「免疫原性」は、アレルギー誘発性を包含する。アレルギー誘発性は、免疫化または物質への暴露に対するＩｇＥ免疫反応を誘発する、当該物質の能力として定義される。アレルゲンは、アレルギーという過敏状態を誘導し、いくつかの被検体において抗体形成を刺激する物質である。アレルゲンは、天然に生じるものであってもよいし、合成されたものであってもよい。また、アレルゲンには、特に限定されないが、花粉、昆虫の残骸、食物、血清、カビ胞子、ほこり、動物の鱗屑、および薬物が含まれる。
本明細書で用いられるような用語「調節された免疫原性」は、野生型のタンパク質と比較したときの、免疫系を活性化する能力における正の変化または負の変化のことを意味する。なお、当該免疫系は、液性であっても、細胞性であってもよい。例えば、変異タンパク質が、（１）野生型ポリペプチドと比べたときに、中和抗体および／または非中和抗体をより高い力価またはより低い力価において誘発するか、あるいはより多くの被検体もしくはより少数の被検体に誘発するか、あるいは、（２）中和抗体および／または非中和抗体を誘発しない場合、当該変異タンパク質は「調節された免疫原性」を有していると言うことができる。中和抗体および／または非中和抗体の量は、増加してもよいし、または減少してもよい。野生型ポリペプチドが、免疫反応を被検体に対してある割合で産生する場合、免疫原性が減少した変異タンパク質は、例えば、免疫反応を被検体にしてより少ない割合で産生するか、あるいは産生しない。また、野生型タンパク質と比べて、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）のアレルの１つ以上に対する、変異タンパク質の結合性が減少している場合、または変異タンパク質によって、Ｔ細胞の活性化が誘導される被検体の割合が減少している場合、当該変異タンパク質は、減少した免疫原性を有していると言える。如何なる特定の作用機構に限定されること無く、抗原取り込み、Ｔ細胞結合性または抗体結合性は、タンパク質の免疫原性を増加または減少する修飾によって影響を受け得る。
核酸またはタンパク質に適用されるときの用語「単離」は、核酸またはタンパク質が、天然の状態において結合している細胞の他の構成要素の少なくともいくつかから遊離していることを示すか、あるいは核酸またはタンパク質がインビボまたはインビトロにおいて産生される濃度よりもより高濃度に濃縮されていることを示す。それは、均質な状態であってもよい。単離された物質は、乾燥状態、半乾燥状態、または溶液（水溶液など）に対して溶解した状態であってもよい。それは、薬学的に許容可能な担体または賦形剤をさらに含んでいる薬学的組成物の構成要素であってもよい。純度と均質性とは、通常、分析化学的手法（ポリアクリルアミドゲル電気泳動、または高速液体クロマトグラフィーなど）を用いて決定される。調製物の大部分を占めるタンパク質が、実質的に精製される。特に、単離される遺伝子に隣接し、興味のある遺伝子以外のタンパク質をコードする翻訳領域から、単離される遺伝子は分離される。用語「精製」は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて実質的に１つのバンドを生じさせることを示す。特に、そのことは、核酸またはタンパク質の純度が、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％またはそれ以上であることを意味し得る。
用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、またはリボヌクレオチド、およびそれらの一本鎖または２本鎖の形態のポリマーのことを表す。具体的に限定されない限り、上記用語は、天然のヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を含む。ここで、上記類似体は、参照核酸と同様の結合性質を有し、かつ天然に生じるヌクレオチドと同様の方法で代謝されるものである。特に具体的に他のものに限定されない限り、上記用語は、オリゴヌクレオチドの類似体（ＰＮＡ（ペプチド核酸（peptidonucleic acid））、アンチセンス技術に用いられるＤＮＡの類似体（ホスホチオエート、およびホスホロアミデートなど）など）のこともいう。他に示さない限り、特定の核酸配列は、明確に示された配列だけでなく、該核酸配列の保存的に修飾されたバリアント（縮重コドンの置換体など）および相補的配列も当然に含む。具体的には、１つ以上の選択された（または全ての）コドンの３番目の位置を、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することにより、縮重コドンの置換体を得ることができる（「Batzerら Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991)」、「Ohtsukaら J. Biol. Chem. 260:2605- 2608 (1985)」および、「Rossoliniら, Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)」）。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーのことをいうために同義で用いられている。つまり、ポリペプチドに関する記述は、ペプチドの記述およびタンパク質の記述に対して、等しく適用される。また、この逆も同様である。上記用語は、天然に生じるアミノ酸ポリマー、およびアミノ酸残基の１つ以上が非天然にコードされたアミノ酸であるアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書で用いられるような上記用語は、任意の長さのアミノ酸鎖のタンパク質（全長タンパク質など）であって、アミノ酸残基が共有ペプチド結合により連結されているタンパク質を包含する。
用語「アミノ酸」は、天然に生じるアミノ酸、および非天然に生じるアミノ酸、ならびに、天然に生じるアミノ酸と同じように機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模擬体のことをいう。天然にコードされたアミノ酸は、２０の一般アミノ酸、ピロリジン、およびセレノシステインである。上記２０の一般アミノ酸は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンである。アミノ酸類似体は、天然に生じるアミノ酸と基本的な化学構造（すなわち、α炭素が、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合している構造）が同じである化合物のことをいい、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどが挙げられる。上記類似体では、Ｒ基が修飾されている（ノルロイシンなど）か、またはペプチド骨格が修飾されているが、天然に生じるアミノ酸と同じ基本的な化学構造が保たれている。
アミノ酸が本明細書に示されるときは、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生物化学命名委員会（Biochemical Nomenclature Commission）から推薦されている公知の３文字表記、または１文字表記のどちらかが用いられてもよい。同様に、ヌクレオチドは、共通に受け入れられている１文字コードにより示されてもよい。
用語「保存的に修飾されたバリアント」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に修飾されたバリアント」は、同一または本質的に同一なアミノ酸配列をコードする核酸配列のことか、または核酸配列が、アミノ酸配列をコードしない場合は、本質的に同一の配列のことをいう。遺伝コードの縮重により、多くの機能的に同一の核酸が、任意の所定のタンパク質をコードしている。例えば、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵのコドンは、全てアラニンのアミノ酸をコードしている。したがって、コドンによりアラニンが特定される全ての位置では、コードされるポリペプチドを変化させることなく、対応するコドンの何れかにコドンを変化させることができる。このような核酸の変種は「サイレント変種」であり、保存的に修飾された変種の１つである。また、ポリペプチドをコードする本明細書における全ての核酸は、該核酸の可能なサイレント変種の全ても表している。当業者の一人は、機能的に同一の分子が得られるように、核酸における各コドンを修飾することができると認識している（なお、このときのコドンには、ＡＵＧ（メチオニンに対する通常唯一のコドン）およびＴＧＧ（トリプトファンに対する通常唯一のコドン）は除かれる）。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変種は、記載された各配列に潜在的に含まれる。
アミノ酸配列に関して言えば、当業者の一人は、コードされた配列において１アミノ酸または数％のアミノ酸を、変更、付加、または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質の配列に対する個々の置換、欠失、または付加は、それら変更が、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または化学的に類似のアミノ酸による置換になる場合において、「保存的に修飾されたバリアント」であると理解する。機能的に類似のアミノ酸を示す保存的な置換の一覧は、技術的に公知である。そのような保存的に修飾されたバリアントは、本発明における多形態バリアント、種間の同族体、および対立遺伝子に加えられるとともに、それらを排除するものではない。
機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当業者に公知である。以下の８群のそれぞれは、互いに保存的な置換となるアミノ酸を含んでいる（例えば、「Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties (W H Freeman & Co.; 2nd edition(December 1993))」を参照のこと）：
（１）アラニン（Ａ）およびグリシン（Ｇ）；
（２）アスパラギン酸（Ｄ）およびグルタミン酸（Ｅ）；
（３）アスパラギン（Ｎ）およびグルタミン（Ｑ）；
（４）アルギニン（Ｒ）およびリジン（Ｋ）；
（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）およびバリン（Ｖ）；
（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）；
（７）セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）；ならびに、
（８）システイン（Ｃ）およびメチオニン（Ｍ）。
２つ以上の核酸またはポリペプチドの配列に対する用語「同一」、または「同一性」の百分率は、同じである２つ以上の配列またはサブ配列に関する。（ｉ）配列を比較ウィンドウに対して最も対応するように比較および整列させたとき、あるいは、（ｉｉ）（ａ）配列を、以下の配列比較アルゴリズム（または当業者に利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを用いるか、もしくは（ｂ）手動による整列と目視検査とによって、測定されるような指定領域について比較および整列させたとき、それら配列が、ある百分率で同じであるアミノ酸残基または核酸を有する場合（すなわち特定の領域に対して約６０％の同一性、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または９９％の同一性を有する場合）、配列は「実質的に同一」であるといえる。また、この定義は、試験配列の相補体にも関する。同一性は、少なくとも約５０アミノ酸またはヌクレオチドの長さである領域に対して、あるいは、７５−１００アミノ酸またはヌクレオチドの長さである領域に対して存在することができるし、あるいは、特に指定されない場合では、同一性は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全長の配列に渡って、存在することができる。
配列比較では、通常、試験配列を比較するために、１つの配列を参照配列として用いる。配列比較アルゴリズムを用いたとき、試験配列および参照配列を、コンピューターに入力し、その後、配置を指定する。また、必要に応じて、配列アルゴリズムプログラムにおけるパラメーターを指定する。初期のプログラムパラメーターを用いてもよいし、別のパラメーターを指定してもよい。それから、配列比較アルゴリズムにより、プログラムのパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性の百分率を計算する。
本明細書で用いられるような「比較ウィンドウ」は、２０から６００まで、一般的には、約５０から約２００、より一般的には約１００から１５０から成る群から選択される連続した位置の数のうちの何れか１つの区分（セグメント）を参照することを含んでいる。また、このとき、２つの配列を最適に整列した後に、配列を同じ数の連続した部位の参照配列と比較してもよい。比較のために配列を整列させる方法は、当業者に公知である。比較のための配列の最適な整列を、例えば、（ｉ）「Smith and Waterman (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c」の局所的相同性アルゴリズム（local homology algorithm）、（ｉｉ）「Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443」の相同性整列アルゴリズム（homology alignment algorithm）、（ｉｉｉ）「Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444」の類似性に関する検索、（ｉｖ）これらアルゴリズムのコンピューターによる実施（「Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI」におけるTFASTA, GAP, BESTFIT, およびFASTA)、あるいは（ｖ）手動による整列と目視検査と（例えば、「Ausubelら, Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)」を参照のこと）によって、実施することができる。
配列同一性および配列類似性の百分率を決定するために適したアルゴリズムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０のアルゴリズムが挙げられる。これらは、「Altschulら (1997) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402」および「Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410」にそれぞれ記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ、ワールドワイドウェブ：ncbi.nlm.nih.gov）を介して、公的に利用することができる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーター、Ｗ、ＴおよびＸにより、整列（アライメント）の感度と速度とが決定される。ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮプログラムは、初期値として、１１のワード長（Ｗ）、期待値（Ｅ）または１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用している。アミノ酸配列用のＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期値として、３のワード長、１０の期待値（Ｅ）、および５０のＢＬＯＳＵＭ６２得点集団（「Henikoff & Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915」を参照のこと）の整列（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、ならびに両方の鎖の比較を用いている。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、通常、「低い複雑性」のためのフィルタを使用することなく実施される。
また、ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより、２つの配列間における類似性を統計解析することができる（例えば、「Karlin and Altschul, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787」を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって与えられる類似性の尺度の１つは、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の間における適合が偶然に生じる可能性の指標を与える最小総和確率（Ｐ（Ｎ））である。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較において最小総和確率が、約０．２未満、約０．０１未満、または約０．００１未満であるならば、核酸は、参照配列と類似していると考えられる。
語句「〜に対する選択的な（または特異的な）ハイブリダイズ」は、特定のヌクレオチド配列が複合混合物（全細胞、ＤＮＡライブラリー、またはＲＮＡライブラリーなど）に存在するときに、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件下において、当該特定のヌクレオチド配列にのみ、分子が結合すること、２本鎖を形成すること、またはハイブリダイズすることをいう。
語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件」は、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、ＰＮＡ配列、または他の核酸模擬体配列、あるいはそれらの組み合わせがハイブリダイズする、技術的に公知である低イオン強度および高温度の条件ことをいう。通常、ストリンジェントな条件下では、プローブは、核酸の複合混合物（全細胞、ＤＮＡライブラリー、またはＲＮＡライブラリーなど）における標的のサブ配列にハイブリダイズするが、該複合混合物に存在する他の配列とはハイブリダイズしない。ストリンジェントな条件は、配列に依存する。また、環境が異なれば、ストリンジェントな条件も異なる。配列が長ければ、より高い温度において特異的にハイブリダイズする。「Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-- Hybridization with Nucleic Probes, “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays” (1993)」には、核酸のハイブリダイゼーションが幅広く網羅されている。一般的に、ストリンジェントな条件は、既定のイオン強度、ｐＨにおいて、特異的な配列の熱融解温度（Ｔｍ）よりも約５−１０℃低いように選択される。Ｔｍは、（既定のイオン強度、ｐＨ、および核酸の濃度において）標的に相補的なプローブの５０％が、平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度である（標的配列は、過剰に存在するので、Ｔｍでは、プローブの５０％が平衡状態において占有される）。ストリンジェントな条件は、ｐＨが７．０から８．３において塩濃度が約１．０Ｍのナトリウムイオン濃度よりも低く、通常、約０．０１−１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、温度は、短いプローブ（１０から５０ヌクレオチドなど）については少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（５０ヌクレオチドよりも長いものなど）については少なくとも約６０℃である。また、ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤を添加することにより達成されてもよい。選択的なまたは特異的なハイブリダイゼーションのためには、陽性シグナルが、バックグラウンドの少なくとも２倍であってもよいし、必要に応じて、バックグラウンドのハイブリダイゼーションの１０倍であってもよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件の典型としては、以下の条件であり得る。５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳにおいて、４２℃でインキュベーションするか、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳにおいて６５℃でインキュベーションし、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳにより、６５℃で洗浄する。上記洗浄を、５分、１５分、３０分、６０分、１２０分またはそれ以上実施することができる。
本明細書で用いられるような用語「真核生物」は、系統発生領域（ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｄｏｍａｉｎ）の真核生物（Ｅｕｃａｒｙａ）に属する生物のことをいう。真核生物としては、例えば、動物（哺乳類、昆虫、爬虫類、鳥類など）、繊毛虫類、植物（単子葉植物、双子葉植物、藻類など）、真菌、酵母、鞭毛虫、微胞子虫目、原生生物などが挙げられる。
本明細書で用いられるような用語「非真核生物」は、真核生物ではない生物のことをいう。例えば、非真核生物は、系統発生領域の真正細菌（Escherichia coli, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putidaなどが挙げられるが、これらに限定されない）、または、系統発生領域の古細菌（例えば、Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium(Haloferax volcaniiおよびHalobacterium種のNRC-1など）, Archaeoglobus fulgidus, Pyrococcus furiosus, Pyrococcus horikoshii, Aeuropyrum pernixなど）に属していてもよい。
本明細書で用いられるような用語「被検体」は、治療、観察または実験の対象である動物のことであるが、ある実施形態では哺乳類であり、他の実施形態ではヒトである。
本明細書で用いられるような用語「有効量」は、投与される修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドの量であって、治療される疾病、病気、または疾患の１つ以上の症状をある程度軽減する量のことをいう。本明細書に記載の修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを含んでいる組成物を、予防的治療、治療の増強、および／または、治療上の処置のために投与することができる。
用語「増強する」または「増強」は、所望の効果の効力、または持続期間のどちらかを、増加または引き延ばすことを意味する。つまり、治療剤の効果を増強する事に関して、用語「増強する」は、系に対する他の治療剤の効果の効力または持続期間のどちらかを増加または引き延ばす能力のことをいう。本明細書で用いられるような「増強性有効量」は、所望の系における別の治療剤の効果を増強するのに十分な量のことをいう。患者に使用されたとき、この使用についての有効量は、疾病、病気、または疾患の重症度および治療単位（ｃｏｕｒｓｅ）、薬歴、患者の健康状態、および薬物への反応性、ならびに治療を担当する医師の判断に依存する。
本明細書で用いられるような用語「修飾型（修飾された）」は、所定のポリペプチドになされた任意の変化に関し、例えば、ポリペプチドの翻訳後修飾、共翻訳修飾、化学構造、アミノ酸配列、またはポリペプチドの長さの変化などが挙げられる。「（修飾型）」の形態は、検討されるポリペプチドが、必要に応じて修飾されることを意味する。すなわち、検討中のポリペプチドは、修飾され得るか、または修飾され得ない。
用語「翻訳後修飾」は、天然または非天然アミノ酸の任意の修飾であって、上記アミノ酸がポリペプチド鎖に組み込まれた後に、上記アミノ酸に生じる修飾のことをいう。この用語は、例えば、インビボの共翻訳修飾、インビトロの共翻訳修飾（無細胞翻訳系など）、インビボの翻訳後修飾、およびインビトロの翻訳後修飾などを含んでいる。
予防のための適用では、修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを含んでいる組成物は、特定の疾病、疾患、または病気を発症しやすい患者、あるいは、特定の疾病、疾患、または病気の危険性のある患者に投与される。そのような量は、「予防的有効量」として定義される。この場合、正確な量は、患者の健康状態、および体重などに依存する。また、当業者の一人は、一般的な実験（例えば、用量増加臨床試験）により、上記予防的有効量を決定することが考慮される。
用語「保護」は、ある反応条件下において、化学的に反応性の官能基（化学反応官能基）の反応を防止する部分、または「保護基」が存在することに関する。保護基は、保護される化学反応基の種類に応じて変えることができる。例えば、化学反応基が、アミンまたはヒドラジドである場合、保護基を、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）から成る群から選ぶことができる。化学反応基が、チオールである場合、保護基は、オルソピリジルジスルフィドであってもよい。化学反応基が、カルボン酸（ブタン酸またはプロピオン酸など）またはヒドロキシル基である場合、保護基は、ベンジル基またはアルキル基（メチル、エチル、またはｔｅｒｔ−ブチル）であってもよい。また、ＮｖｏｃおよびＭｅＮｖｏｃなどの光解離性基を含む技術的に公知の他の保護基を、本明細書に記載の方法および組成物と一緒に用いてもよいし、あるいは、本明細書に記載の方法および組成物に用いてもよい。さらに、技術的に公知の他の保護基も、本明細書に記載の方法および組成物と一緒に用いてもよいし、あるいは、本明細書に記載の方法および組成物に用いてもよい。
一例を挙げると、封鎖基／保護基は、以下の化合物から選択されてもよい。
Figure 2009523815
 他の保護基は、「Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley & Sons, New York, NY, 1999」に記載されている。なおこの文献の全ては、参照によって本明細書に組み込まれる。
治療への適用では、修飾型非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物を、疾病、病気、または疾患の症状を回復するか、該症状の進行を少なくとも部分的に停止するのに十分な量で、疾病、病気、または疾患を既に患っている患者に投与する。そのような量は、「治療的有効量」として定義され、疾病、病気、または疾患の重症度および治療単位、薬歴、患者の健康状態、および薬物への反応性、ならびに治療を担当する医師の判断に依存する。また、当業者の一人は、一般的な実験（例えば、用量増加臨床試験）により、上記治療的有効量を決定することが考慮される。
用語「治療」は予防および／または治療上の処置に関する。
本明細書に示された非天然にコードされたアミノ酸ポリペプチドには、同位体で標識された化合物が含まれる。この同位体で標識された化合物は、１つ以上の原子が、天然に一般的に発見される原子量または質量数とは異なる原子量または質量数を有する原子で置換されている。本化合物に組み込まれ得る同位体には、例えば、水素、炭素、窒素、酸素、フッ素、および塩素の同位体が含まれ、例えば、それぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏ、１７Ｏ、３５Ｓ、１８Ｆ、３６Ｃｌなどが挙げられる。本明細書に記載の特定の同位体で標識された化合物（例えば、３Ｈおよび１４Ｃなどの放射性同位体が組み込まれた化合物）は、組織分布アッセイの基質および／または薬物に有用である。さらに、重水素（つまり２Ｈ）などの同位体で置換することにより、インビボの半減期の増加もしくは必要用量の減少などの代謝安定性が向上し、これによって、特定の治療的利点を得ることができる。
全ての異性体（特に限定されないが、鏡像異性体またはジアステレオマーおよびそれらの混合物が含まれる）は、本明細書に記載の組成物の一部として考慮される。追加のまたはさらなる実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸ポリペプチドは、所望の効果（所望の治療効果など）を引き起こすために用いられる代謝産物の製造を必要とする生物に投与されて、代謝される。さらなるまたは追加の実施形態は、非天然にコードされたアミノ酸ポリペプチドの活性代謝産物である。
いくつかの状況では、非天然にコードされたアミノ酸ポリペプチドは、互変異性体として存在してもよい。また、本明細書に記載の上記非天然にコードされたアミノ酸ポリペプチドは、薬学的に許容可能な溶媒（水およびエタノールなど）と一緒になった溶媒和物の形態で存在してもよいし、非溶媒和の形態で存在してもよい。溶媒和物の形態は、本明細書に開示されていると考慮される。当業者は、本明細書における化合物のいくつかが、いくつかの互変異性体で存在し得ることを認識する。上記互変異性体の全ては、本明細書に記載の組成物の一部として考慮される。
他に指示しない限り、当業者に公知の質量分析、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学、生物化学、組み換えＤＮＡ技術、および薬理学の従来方法が、用いられる。
〔詳細な説明〕
＜Ｉ．序論＞
ポリペプチドの免疫原性および／またはアレルギー誘発性を減少させる最も一般的な戦略の１つは、望ましくない免疫反応またはアレルギー反応を生じるポリペプチドのエピトープを、当該ポリペプチドに接合したポリマー分子（ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）など）により遮ることである。参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，８５６，４５１号明細書には、アレルギー誘発性が減少した修飾型ポリペプチドが記載されている。当該ポリペプチドは、分子量が１−６０ｋＤａの範囲であるポリマーに接合した、分子量が１０−１００ｋＤａの範囲である親ポリペプチドを含んでいる。上記ポリペプチドは、別の接着基を有する親タンパク質のバリアントであり得る。当該別の接着基としては、例えば、上記親タンパク質に存在しないアミノ基が挙げられる。参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第９６／４０７９２号パンフレットには、アレルギー誘発性および／または免疫原性を減少するために、タンパク質をＰＥＧ化する特定の方法が開示されている。参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第９７／３０１４８号パンフレットには、タンパク質のアレルギー誘発性を減少する方法であって、当該タンパク質が少なくとも２つのポリマー分子に接合される方法が開示されている。参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第９８／３５０２６号パンフレットには、ポリペプチド−ポリマー接合体であって、当該ポリペプチドの３次元構造の表面にポリマー分子を結合させるための、選択された接着基の１つ以上が付加または除去されている、接合体が開示されている。部位特異的突然変異導入法を用いることにより、上記ポリマー分子用の接着基は、接着され得るポリマー分子の数を増加させるために上記ポリペプチド表面の所定の位置に追加され得る。接着され得るポリマー分子の数を増加させることを目的として、および／または、ポリペプチドの活性部位、またはその近傍において当該接着基を除去して、ポリペプチドの活性の減少を引き起こし得る、当該活性部位の近傍での過剰なＰＥＧ化を避けることを目的として、部位特異的突然変異導入法を用いることにより、上記ポリマー分子用の接着基は、上記ポリペプチド表面の所定の位置に追加され得る。
ポリペプチドを修飾する別の方法は、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第９２／１０７５５号パンフレットに開示されており、エピトープを同定し、その後に、当該エピトープを構成するアミノ酸残基を修飾してエピトープを破壊することによって、タンパク質のアレルギー誘発性を減少させることが示唆されている。
参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，２１８，０９２号明細書には、新規または追加の炭水化物が少なくとも１つ接着しているポリペプチドであって、対応する未修飾ポリペプチドと比べて、安定性が増加しているといわれているポリペプチドが開示されている。上記追加の炭化水素分子は、ポリペプチドの骨格にＮグリコシル化部位を１つ以上付加し、当該ポリペプチドをグリコシル化を実施する宿主細胞において発現させることによって提供される。参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第００／２６３５４号パンフレットには、タンパク質（特に酵素）のアレルギー誘発性を減少させる方法が開示されている。当該方法では、付加された１つ以上のグリコシル化部位を介した、タンパク質のグリコシル化を増加されることによって、アレルギー誘発性の減少が仲介される。
ポリペプチドに基づく薬物の使用に関して、免疫反応の発生以外には、迅速に分解される、あるいは体内において排除されるという短所がさらに知られている。ポリペプチドとポリマー分子との接合により、インビボでの機能半減期が増加し得ることが報告されている。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４，９３５，４６５号明細書には、問題のポリペプチドのＰＥＧ接合体の大きさが増加したために、クリアランス時間が延長したＰＥＧ化ポリペプチドが開示されている。参照によって本明細書に組み込まれる国債公開第９８／４８８３７号パンフレットは、抗原性が減少し、血中半減期が増加した、一本鎖抗原結合ポリペプチド−ポリアルキレンオキシドの接合体に関する。修飾される当該一本鎖抗原結合ポリペプチドには、ポリアルキレンオキシドを接合可能であるＣｙｓまたはＬｙｓが１つ以上、ある所定の部位に挿入されていてもよい。「Delgado ら, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 9(3,4): 249-304 (1992)」を参照のこと。
参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第９６／１２５０５号明細書には、薬理学的性質が改善されていると報告されている、ポリペプチドと低分子量の新油性化合物との接合体が開示されている。ポリペプチドのＰＥＧ化によって、当該ポリペプチドの機能が低下することが報告されている。この活性の低下を避けるためめに、ＰＥＧ化の間に、上記ポリペプチドの活性部位を遮蔽することが示唆されている。より具体的には、参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第９４／１３３２２号パンフレットに、ドメインにより仲介される生物活性を有する第１物質と、ポリマーとの接合体を調製する手順であって、接合の間に、上記第１物質のドメインが、第２物質によって保護され、接合後に当該第２物質が除去される手順が開示されている。従来の接合手順では、生物活性が減少したポリマー接合体が生じ得るが、この方法を用いることにより、従来の接合手順と比較して、第１物質の生物活性は完全に保存される。
参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第９３／１５１８９号パンフレットは、タンパク質分解酵素−ＰＥＧ付加物を調製する方法に関する。当該方法は、ＰＥＧと当該タンパク質分解酵素とを反応させるときに、当該タンパク質分解酵素の活性部位またはその近傍へのＰＥＧの結合を防ぐために、当該活性部位をブロックするように、巨大分子化した阻害剤が当該酵素に連結される工程を含んでいる。
参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第９７／１１９５７号パンフレットには、ポリペプチド（特にファクターＶＩＩＩ）のインビボでの機能を改善する方法が開示されている。この方法は、上記ポリペプチドの露出した標的を遮ることによって実施される。また、当該方法では、（１）上記ポリペプチドは、有機合成により製造されるリガンドを有する基に特異的な吸着体と相互作用することにより固相化され、（２）生体適合可能なポリマーが活性化されて、固相化されたポリペプチドに接合され、そして（３）接合体が上記吸着体から溶出される。
参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第９７／４７７５１号パンフレットには、ポリマー、糖部分、または有機誘導体化剤へ接合することなどによって生じた、ＤＮＡｓｅの修飾に関する様々な形態が開示されている。参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第９９／４０１９８号パンフレットには、免疫原性が減少するように修飾された、スタフィロキナーゼバリアントが開示されている。参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４，９０４，５８４号明細書には、リジンが欠損しているＰＥＧ化したポリペプチドであって、少なくとも１つのリジン残基が欠失されているか、または他の任意のアミノ酸残基で置換されているポリペプチドが開示されている。参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第９９／６７２９１号パンフレットには、タンパク質とＰＥＧとを接合する方法であって、タンパク質における少なくとも１つのアミノ酸残基を欠失し、当該タンパク質がＰＥＧと接合するほど十分な条件下において、当該タンパク質とＰＥＧとを接触させる方法が開示されている。参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第９９／０３８８７号パンフレットには、成長ホルモンスーパーファミリーに属するポリペプチドのＰＥＧ化バリアントであって、上記ポリペプチドの特定の領域に位置する非必須のアミノ酸がシステイン残基で置換されているバリアントが開示されている。
先行技術における上記方法の全ては、興味のあるポリペプチドを修飾する特異的突然変異誘発法を用いることに基づいている。そのような部位特異的突然変異誘発技術を用いることにより、ポリマー接着基が追加または除去される。これによって、ポリペプチド−ポリマー接合体であって、上記ポリマー分子が、ある所定の位置（通常は、修飾されるポリペプチドの表面）に接着されている接合体を構築することが可能になる。
参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第９８／２７２３０号パンフレットには、タンパク質を修飾するためのシャッフリング技術の使用が開示されている。エキソンシャッフリング、モノクローナル抗体のヒト化、および部位特異的突然変異誘発法は、免疫原性エピトープを削除すると提案されている他の手段である。
特に限定されないが、タンパク質配列、投与経路および投与頻度、ならびに患者集団を含むいくつかの要因が、タンパク質の免疫原性の原因となり得る。凝集は、インターフェロンアルファの免疫原性と関連付けられている（「Braunら Pharm. Res. 1997 14: 1472-1478」）。別の研究では、ＤＲ１５ ＭＨＣのアレルの存在によって、中和抗体形成に対する感受性が増加することが示唆され、また興味深いことに、同じアレルによって、多発性硬化症に対する感受性がもたらされることが示唆されている（「Sticklerら Genes Immun. 2004 5: 1-7」）。
凝集がポリペプチド（インターフェロン（特にインターフェロンベータ）など）の免疫原性の原因となり得るので、可溶性が改善するように操作されたバリアントの免疫原性は、減少していてもよい。システインが欠損したバリアントでは、不必要な分子内ジスルフィド結合または分子間ジスルフィド結合の形成が最小限に留められ（参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第４，５１８，５８４号明細書、米国特許第４，５８８，５８５号明細書、米国特許第４，９５９，３１４号明細書）、当該バリアントは、凝集に対する傾向が減少している。疎水性コアが合理的設計法を用いて最適化されることにより、可溶性が増加したインターフェロンベータのバリアントが、請求されている（参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第００／６８３８７号パンフレット）。いくつかの場合では、可溶性は安定性を改善することにより増加され得る。また、インターフェロンの安定性と可溶性とを向上させる、代替製剤も開示されている（参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６７５，４８３号明細書、米国特許第５，７３０，９６９号明細書、米国特許第５，７６６，５８２号明細書、および国際公開第０２／３８１７０号パンフレット）。いくつかのロイシン残基およびフェニルアラニン残基が、セリン残基、トレオニン残基またはチロシン残基で置換されることにより、可溶性が増加しているインターフェロンベータのムテインは、請求されている（参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第９８／４８０１８号パンフレット）。
参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００５０１８１４４６号明細書には、（１）修飾をエピトープの領域に導入し、（２）多様化された突然変異体のライブラリーであって、各突然変異体の導入されたアミノ酸が１つ以上変更されているライブラリーを樹立し、（３）機能が良好に保存されるとともに、抗原性が大幅に減少したバリアントを選択する無作為的な手法が記載されている。そのような多様化されたライブラリーは、当業者に公知の技術の範囲内で樹立され得る（「Reetz M T; Jaeger K E, in “Biocatalysis- from Discovery to Application” edited by Fessner W D, Vol. 200, pp. 31 -57 (1999)」、「Stemmer, Nature, vol. 370, p.389-391, 1994」、「Zhao and Arnold, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol. 94, pp. 7997-8000, 1997」、または「Yano ら, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, vol. 95, pp 5511- 5515, 1998」）。これらには、特に限定されないが、スパイク化突然変異誘発法（spiked mutagenesis）が含まれる。当該スパイク化突然変異誘発法では、ある部分のヌクレオチドの混合物を用いて合成されたオリゴヌクレオチドプライマーを１つ以上用いるＰＣＲ突然変異法を実施することにより、タンパク質配列のある部分が無作為化される（「Lanio T, Jeltsch A, Biotechniques, Vol. 25(6), 958,962,964-965 (1998)」）。各トリプレット（ｔｒｉｐｌｅｔ）において用いられるオリゴヌクレオチドの混合物は、突然変異した遺伝子産物の対応するアミノ酸が、ある所定の分布関数内において無作為化されるように、設計され得る。この設計を手助けするアルゴリズムは開示されている（「Jensen L J ら, Nucleic Acids Research, Vol. 26(3), 697-702 (1998)」）。
タンパク質の免疫原性を調節する他の方法は開発されている。そのような方法には、ＭＨＣ結合アグレトープを除去し、Ｔ細胞受容体結合または抗体結合を避けることによって、Ｔ細胞の活性化を阻止する手法が含まれる。多様なＭＨＣ分子は、約１０３のアレルを含んでおり、抗体のレパートリーは、約１０８と見積もられ、Ｔ細胞受容体のレパートリーは、さらに多い。タンパク質配列内のクラスＩＩのＭＨＣ結合ペプチドを同定し、除去または修飾することによって、免疫原性の分子機序は回避され得る。より免疫原性の低いタンパク質を生成することを目的として、上記アグレトープを削除することが既に開示されている。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる、国際公開第９８／５２９７６号パンフレット、国際公開第０２／０７９２３２号パンフレット、および国際公開第００／３３１７号パンフレットを参照のこと。また、Ｔ細胞エピトープの除去または修飾、およびＴ細胞エピトープの予測は、「Adair, F. et D. Ozanne, BioPharm 2002 Feb; p. 30-6」および「 Mucha JMら BMC Immunology 2002; 3:2」に記載されている。
患者が治療タンパク質に対する抗体を発現させると、治療単位は中断され得るか、上記タンパク質は当該タンパク質の異なる型で置換され得るか、免疫抑制剤により治療が開始され得るか、免疫寛容が誘導され得るか、あるいは他の措置が実施され得る。
少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドが、本発明に提供される。本発明の特定の実施形態では、少なくとも１つの非天然アミノ酸を有するポリペプチドは、少なくとも１つの翻訳後修飾を含んでいる。一実施形態では、少なくとも１つの翻訳後修飾は、当業者の一人に公知の特定の反応基に適切な化学方法論を利用した、第２反応基を含んでいる分子と、第１反応基を含んでいる非天然アミノ酸の少なくとも１つとの接着を含んでいる。ここで、該分子としては、例えば、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質またはポリペプチドあるいはポリペプチド類似体、抗体または抗体断片、金属キレート剤、共同因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害性リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、蛍光団、金属含有部分（ｍｏｉｅｔｙ）、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合または非共有結合で相互作用する基、光ケージド部分（a photocaged moiety）、化学線により励起可能な部分、光異性体化可能部分、ビオチン、ビオチンの誘導体、ビオチンの類似体、重原子を組み込んでいる部分、化学的に切断可能な基、光切断可能な基、伸長した側鎖、炭素連結型の糖、酸化還元活性化剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識されている部分、生物物理学的なプローブ、燐光性の基、化学発光性の基、電子密度の高い基、磁性基、挿入基、発色団、エネルギー伝達剤、生物活性剤、検出可能な標識、低分子、量子ドット、ナノ伝達剤、放射性ヌクレオチド、放射性伝達剤、中性子捕獲剤、あるいは上記または他の任意の所望の化合物もしくは物質の任意の組み合わせが挙げられる。例えば、上記第１反応基は、アルキニル部分であり（例えば非天然アミノ酸であるｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンにおけるアルキニル部分であり、この場合、プロパルギル基は、ときどきアセチレン部分と呼ばれる）、第２反応基は、アジド部分であり、［３＋２］の付加環化という化学方法論が利用される。別の例を挙げると、第１反応基は、アジド部分であり（例えば、非天然アミノ酸であるｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンにおけるアジド部分）、第２反応基はアルキニル部分である。本発明の修飾型ポリペプチドの特定の実施形態では、少なくとも１つの翻訳後修飾を含んでいる少なくとも１つの非天然アミノ酸（ケト官能基を含んでいる非天然アミノ酸など）であって、該少なくとも１つの翻訳後修飾がサッカライド部分を含んでいる非天然アミノ酸が、用いられる。特定の実施形態では、翻訳後修飾は、真核細胞または非真核細胞において、インビボで作製される。上記分子は、リンカーポリマー、水溶性ポリマー、または他の分子により、上記ポリペプチドに接着され得る。上記分子は上記ポリペプチドに直接連結され得る。
特定の実施形態では、上記タンパク質は、ある宿主細胞によりインビボにおいて作製された少なくとも１つの翻訳後修飾を含んでおり、該翻訳後修飾は通常、別の宿主細胞種により作製されないものである。特定の実施形態では、上記タンパク質は、真核細胞によりインビボにおいて作製された少なくとも１つの翻訳後修飾を含んでおり、該翻訳後修飾は通常、非真核細胞により作製されないものである。翻訳後修飾には、例えば、グリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミテートの付加、リン酸化、および糖脂質連結修飾などが含まれる。一実施形態では、翻訳後修飾は、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン連結によるオリゴサッカライドのアスパラギンへの接着を含んでいる（例えば、上記オリゴサッカライドが（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃなどを含んでいる場合）。別の実施形態では、翻訳後修飾は、ＧａｌＮＡｃ−セリン、ＧａｌＮＡｃ−トレオニン、ＧｌｃＮＡｃ−セリン、またはＧｌｃＮＡｃ−トレオニン連結による、オリゴサッカライド（例えばＧａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなど）のセリンまたはトレオニンへの接着を含んでいる。特定の実施形態では、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、分泌または局在配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、および／あるいはＧＳＴ融合などを含んでいてもよい。分泌シグナル配列の例には、特に限定されないが、原核生物の分泌シグナル配列、真核生物の分泌シグナル配列、細菌での発現のために５’が最適化された真核細胞の分泌シグナル配列、新規の分泌シグナル配列、ペクチン酸リアーゼ分泌シグナル配列、ＯｍｐＡ分泌シグナル配列、およびファージ分泌シグナル配列が含まれる。分泌シグナル配列としては、例えば、特に限定されないが、ＳＴＩＩ（原核生物）、Ｆｄ ＧＩＩＩ、およびＭ１３（ファージ）、Ｂｇｌ２（酵母）、およびトランスポゾンに由来するシグナル配列ｂｌａが挙げられる。
興味のあるタンパク質またはポリペプチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または１０以上の非天然アミノ酸を含んでいてもよい。非天然アミノ酸は、同一であっても異なっていてもよく、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なる非天然アミノ酸を含んでいる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なる部位が、タンパク質に存在し得る。特定の実施形態では、天然発生型のタンパク質に存在する特定のアミノ酸の少なくとも１つ（ただし、全てではない）が非天然アミノ酸で置換されている。
本発明は、非天然にコードされたアミノ酸を少なくとも１つ含んでいるポリペプチド（特に限定されないが、ＧＨスーパーファミリーの一員（特にｈＧＨ）など）に基づく、方法および組成物を提供する。少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸をポリペプチドに導入することにより、（例えば、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸とは反応するが、一般的に生じる２０のアミノ酸とは反応しないという）特異的な化学反応を含む接合化学反応を適用することができる。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドは、非天然にコードされたアミノ酸の側鎖を介して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマーと連結している。本発明は、ＰＥＧ誘導体によりタンパク質を選択的に修飾するための効率が高い方法を提供する。該方法は、非遺伝的にコードされたアミノ酸を、セレクターコドンに応じてタンパク質に選択的に組み込む工程と、その後に、適切に反応するＰＥＧ誘導体により、上記アミノ酸を修飾する工程とを含んでいる。上記非遺伝的にコードされたアミノ酸は、例えば、２０の天然に組み込まれるアミノ酸には発見されない官能基または置換基（例えば、ケトン、アジドまたはアセチレン部分）を含んでいるアミノ酸である。一旦組み込まれると、それから、非天然にコードされたアミノ酸に存在する特定の置換基または官能基に適切な、当業者に公知の化学方法論を利用することにより、非遺伝的にコードされたアミノ酸の側鎖を修飾することができる。多種多様な公知の化学方法論が、水溶性ポリマーをタンパク質に組み込む本発明において、適切に使用される。上記方法論には、例えば、アセチレンまたはアジド誘導体のそれぞれとのＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］の付加環化反応などが含まれる（例えば、「Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis, Vol. 4, (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109」、および「Huisgen, R. in 1.3-Dipolar Cycloaddition Chemistry. (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176」を参照のこと）。
Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］の付加環化方法は、求核置換反応というよりは付加環化に関係するので、タンパク質を、非常に高い選択性でもって修飾することができる。触媒量のＣｕ（Ｉ）塩を反応混合物に添加することにより、非常に良好な位置選択性（１，４＞１，５）でもって、溶液の状態において室温で、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］の付加環化反応を実施することができる。例えば、「Tornoeら, (2002) J. Org. Chem. 67:3057-3064」、「Rostovtsevら, (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599」、および国際公開第０３／１０１９７２号パンフレットを参照のこと。［３＋２］付加環化を通して、本発明のタンパク質に追加することができる分子には、適切な官能基または置換基を有する実質的に任意の分子（アジドまたはアセチレン誘導体など）が含まれる。アセチレン基を有する非天然アミノ酸（ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンなど）、または、アジド基を有する非天然アミノ酸（ｐ−アジド−フェニルアラニンなど）のそれぞれに、上記分子を追加することができる。
Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］の付加環化から得られる５員環は、一般的に還元環境において可逆であり、溶液環境において長期間にわたって、加水分解に対して安定である。よって、多種多様な物質の物理特性および化学特性を、本発明の活性型ＰＥＧ誘導体により、過酷な溶液条件下において修飾することができる。さらに重要なことは、アジドおよびアセチレン部分は、互いに特異的であるために（そして、例えば、２０の遺伝的にコードされた一般アミノ酸の何れとも反応しないために）、非常に高い選択性でもって、タンパク質を１つ以上の特定の部位において修飾できることである。
また、本発明は、１つ以上のアセチレンまたはアジド部分を有する、ＰＥＧ誘導体およびそれに関連する親水性ポリマーの水溶性でかつ加水分解に安定な誘導体を提供する。アセチレン部分を含んでいるＰＥＧポリマー誘導体は、セレクターコドンに応じてタンパク質へ選択的に導入されたアジド部分との結合に対して、高い選択性を有する。同様に、アジド部分を含んでいるＰＥＧポリマー誘導体は、セレクターコドンに応じてタンパク質へ選択的に導入されたアセチレン部分との結合に対して、高い選択性を有する。
より具体的には、アジド部分には、例えば、アルキルアジドおよびアリールアジド、ならびにこれらアジドの誘導体が含まれる。アルキルアジドおよびアリールアジドの誘導体には、アセチレンに特異的な反応性が維持されている限り、他の置換基が含まれていてもよい。アセチレン部分には、アルキルアセチレンおよびアリールアセチレン、ならびに、これらの誘導体が含まれる。アルキルアセチレンおよびアリールアセチレンの誘導体には、アジドに特異的な反応性が維持されている限り、他の置換基が含まれていてもよい。
本発明は、多種多様な官能基、置換基、または部分を有する物質と、次の他の物質との接合体を提供する：標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質またはポリペプチドあるいはポリペプチド類似体、抗体または抗体断片、金属キレート剤、共同因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害性リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、蛍光団、金属含有部分（ｍｏｉｅｔｙ）、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合または非共有結合で相互作用する基、光ケージド部分（a photocaged moiety）、化学線により励起可能な部分、光異性体化可能部分、ビオチン、ビオチンの誘導体、ビオチンの類似体、重原子を組み込んでいる部分、化学的に切断可能な基、光切断可能な基、伸長した側鎖、炭素連結型の糖、酸化還元活性化剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識されている部分、生物物理学的なプローブ、燐光性の基、化学発光性の基、電子密度の高い基、磁性基、挿入基、発色団、エネルギー伝達剤、生物活性剤、検出可能な標識、低分子、量子ドット、ナノ伝達剤、放射性ヌクレオチド、放射性伝達剤、中性子捕獲剤、あるいは上記または他の任意の所望の化合物もしくは物質の任意の組み合わせなど。また、本発明は、アジドまたはアセチレン部分を有する物質と、対応するアセチレンまたはアジド部分を有するＰＥＧポリマー誘導体との接合体を含んでいる。例えば、アジド部分を含んでいるＰＥＧポリマーを、タンパク質内のアセチレン機能性基（functionality）を有する非遺伝的にコードされたアミノ酸を含んでいる位置において、生物活性分子に結合することができる。ＰＥＧと生物活性分子とをつなげる連結には、例えば、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］の付加環化の産物が含まれる。
ＰＥＧを用いて、生体材料の表面を修飾できることは技術的に十分確立されている（例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，６１０，２８１号明細書、「Mehvar, R., J. Pharm Pharm Sci, 3(1): 125-136 (2000)」を参照のこと）。また、本発明は、１つ以上の反応性のアジドまたはアセチレン部位を有する表面と、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］の付加環化連結を介して、該表面に結合した本発明の１つ以上のアジドまたはアセチレン含有ポリマーとを含んでいる生体材料を提供する。また、カルボン酸、アミン、アルコール、またはチオール部分を含んでいる連結などのアジドまたはアセチレン連結以外の連結によって、生体材料と他の物質とを、アジドまたはアセチレン活性化ポリマーの誘導体に結合することができる。これによれば、アジドまたはアセチレン部分をその後の反応に利用することができる。
本発明は、本発明のアジドおよびアセチレン含有ポリマーを合成する方法を含んでいる。アジド含有ＰＥＧ誘導体の場合、アジドを、ポリマーの炭素原子に直接結合させることができる。これの代わりに、１つの末端にアジド部分を有する連結剤を、従来の活性型ポリマーに接着させることにより、アジド含有ＰＥＧ誘導体を調製することができる。これにより得られたポリマーは、その末端にアジド部分を有している。アセチレン含有ＰＥＧ誘導体の場合、アセチレンを、ポリマーの炭素原子に直接結合させることができる。これの代わりに、１つの末端にアセチレン部分を有する連結剤を、従来の活性型ポリマーに接着させることにより、アセチレン含有ＰＥＧ誘導体を調製することができる。これにより得られたポリマーは、その末端にアセチレン部分を有している。
より具体的には、アジド含有ＰＥＧ誘導体の場合、少なくとも１つの活性型ヒドロキシル部分を有する水溶性ポリマーに対して、より反応性のある部分（メシラート、トレシラート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、トシレート、またはハロゲン脱離基など）を有する置換ポリマーを製造する反応を実施する。スルホニル酸ハロゲン化物、ハロゲン原子、および他の脱離期を含んでいるＰＥＧ誘導体の調製と使用とは、当業者に公知である。それから、得られた置換ポリマーに対して、該ポリマーの末端において上記のより反応性のある部分をアジド部分に置換する反応を実施する。これの代わりに、少なくとも１つの活性型の求核部分もしくは求電子部分を有する水溶性ポリマーを、１つの末端にアジドを有する連結剤と反応させる。これにより、ＰＥＧポリマーと連結剤との間に共有結合が形成され、アジド部分が、該ポリマーの末端に配置される。アミン、チオール、ヒドラジド、ヒドラジン、アルコール、カルボキシレート、アルデヒド、ケトン、およびチオエステルなどを含む求核部分および求電子部分は、当業者に公知である。
より具体的には、アセチレン含有ＰＥＧ誘導体の場合、少なくとも１つの活性型ヒドロキシル部分を有する水溶性ポリマーに対して、ハロゲンまたは他の活性型脱離基をアセチレン部分を含んでいる前躯体から移動させる反応を実施する。これの代わりに、少なくとも１つの活性型の求核部分もしくは求電子部分を有する水溶性ポリマーを、１つの末端にアセチレンを有する連結剤と反応させる。これにより、ＰＥＧポリマーと連結剤との間に共有結合が形成され、アセチレン部分が該ポリマーの末端に配置される。有機合成におけるハロゲン部分、活性型脱離基、求核部分、および求電子部分の使用と、ＰＥＧの調製および使用とは、当業者に対して十分確立されている。
また、本発明は、他の物質（例えば、アジドまたはアセチレン部分を含んでいるＰＥＧおよびＰＥＧ誘導体などの水溶性ポリマー）を修飾型タンパク質に追加するために、タンパク質を選択的に修飾する方法を提供する。アジドおよびアセチレン含有ＰＥＧ誘導体を用いることにより、生体適合性、安定性、可溶性、免疫原性の欠失が重要である分子と表面との性質を修飾することができるとともに、技術的に以前から知られていたＰＥＧ誘導体をタンパク質に接着させる手段よりも、より選択的な手段を提供することができる。
＜ＩＩ．例としての成長ホルモンスーパーファミリー＞
本明細書に記載の方法、組成物、戦略および技術は、ポリペプチドまたはタンパク質の特定の種類、分類またはファミリーに限定されない。実際に、ほとんどあらゆるポリペプチドが、本明細書に記載の少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸を含むように、設計または修飾され得る。
以下のタンパク質：成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２（ｐ３５サブユニット）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、オンコスタチン Ｍ、繊毛状の神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、アルファ インターフェロン、ベータ インターフェロン、イプシロン インタフェロン、ガンマ インターフェロン、オメガ インターフェロン、タウ インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、およびカージオトロフィン−１（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ−１）（ＣＴ−１）（「ＧＨスーパーファミリー」）は、成長ホルモン（ＧＨ）スーパーファミリーの遺伝子によってコードされるタンパク質を含む（「Bazan, F., Immunology Today 11: 350-354 (1990)」；「Bazan, J. F. Science 257: 410-413 (1992)」；「Mott, H. R. and Campbell, I. D., Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)」；「Silvennoinen, O. and Ihle, J. N., SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS (1996)」）。今後、遺伝子のクローニングおよび配列決定を経て、当該遺伝子ファミリーの更なる構成要素が同定されるであろうということが、予想される。ＧＨスーパーファミリーの各一員は、それらのアミノ酸またはＤＮＡ配列の同一性が通常、限られているにもかかわらず、類似した二次構造および三次構造を有する。共通の構造的特徴により、遺伝子ファミリーの新しい一員を、迅速に同定することができる。ＧＨスーパーファミリーの一員の間についての構造的相同性の程度を考えると、非天然にコードされたアミノ酸は、本発明を用いて、当該ＧＨスーパーファミリーの任意の一員に組み込まれ得る。タンパク質のこのファミリーの各一員は、４−ヘリカルバンドルを含んでいる。
Ｇ−ＣＳＦ（「Zinkら, FEBS Lett.314:435 (1992)」；「Zinkら, Biochemistry 33:8453 (1994)」；「Hillら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5167 (1993)」）、ＧＭ−ＣＳＦ（「Diederichs, K.,ら Science 154: 1779-1782 (1991)」；「Walterら, J. Mol. Biol. 224:1075-1085 (1992)」）、ＩＬ−２（「Bazan, J. F. and McKay, D. B. Science 257: 410-413 (1992)」）、ＩＬ−４（「Redfieldら, Biochemistry 30: 11029-11035 (1991)」；「Powersら, Science 256:1673-1677 (1992)」）、およびＩＬ−５（「Milburnら, Nature 363: 172-176 (1993)」）などの多くのサイトカインの構造は、Ｘ線回折およびＮＭＲ調査によって決定されている。そして、上記多くのサイトカインは、一次配列に相同性があまりないにもかかわらず、顕著に保存されたＧＨ構造を示す。インターフェロンは、モデリングおよび他の研究（「Leeら, J. Interferon Cytokine Res. 15:341 (1995)」；「Murgoloら, Proteins 17:62 (1993)」；「Radhakrishnanら, Structure 4:1453 (1996)」；「Klavsら, J. Mol. Biol. 274:661 (1997) 」）に基づいて、当該ファミリーの一員であると考えられる。エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、モデリングおよび突然変異誘導法の研究（「Boisselら, J. Biol. Chem. 268: 15983-15993 (1993)」；「Wenら, J. Biol. Chem. 269: 22839-22846 (1994) 」）に基づいて、当該ファミリーの一員であると考えられる。現在、上記のサイトカインおよび成長因子のすべては、一つの大きい遺伝子ファミリーを構成すると考えられている。
共有する類似した二次および三次構造に加えて、当該ファミリーの一員は、細胞内シグナル伝達経路を活性化するために、細胞表面受容体をオリゴマー形成する必要があるという性質を共有する。ＧＨおよびＥＰＯなどが含まれるいくつかのＧＨファミリーの一員は、一種類の受容体に結合し、かつそれのホモダイマーを形成させる。ＩＬ−２、ＩＬ４、およびＩＬ−６などが含まれる他のファミリーの一員は、２種類以上の受容体に結合し、かつその受容体のヘテロダイマーまたはそれよりも高次の集合体を形成させる（「Davisら, (1993) Science 260: 1805-1808」；「Paonessaら, (1995) EMBO J. 14: 1942-1951」；「Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)」）。突然変異誘発の研究は、ＧＨのように、これらの他のサイトカインおよび成長因子が、複数、通常２つの受容体結合部位を含み、かつそれらの同種の受容体に連続的に結合することを示している（「Mott and Campbell, Current Opinion in Structural Biology 5: 114-121 (1995)」；「Matthewsら, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 9471-9476」）。ＧＨのように、これらの他のファミリーの一員にとっての主要な受容体結合部位は、主として４つのアルファヘリックスおよびＡ−Ｂループに存在する。受容体結合に関与する、ヘリカルバンドルにおける特定のアミノ酸は、当該ファミリーの一員の間で異なる。ＧＨスーパーファミリーの一員と相互作用する細胞表面受容体のほとんどは、構造的に関連し、第２の大きな複数の遺伝子のファミリーを構成する。例えば、参照によって組み込まれる米国特許出願第６，６０８，１８３号明細書を参照のこと。
ＧＨスーパーファミリーの多様な一員の突然変異に関する研究から、通常、アルファヘリックスに結合したループが、受容体結合に関与しない傾向があるという一般的な結論が得られた。特に、短いＢ−Ｃループは、すべてではないがほとんどのファミリーの一員において、受容体結合に必須ではないと思われる。従って、ＧＨスーパーファミリーの各一員において、該Ｂ−Ｃループは、本明細書に記載されているような非天然にコードされたアミノ酸で置換され得る。また、Ａ−Ｂループ、Ｃ−Ｄループ（およびＧＨスーパーファミリーのインターフェロン／ＩＬ−１０のような一員のＤ−Ｅループ）は、非天然に生じるアミノ酸で置換され得る。また、ヘリックスＡに近接した、および最後のヘリックスに遠位のアミノ酸は、受容体結合に関与しない傾向があるので、非天然に生じるアミノ酸を導入するための部位であり得る。いくつかの実施形態では、ループ構造内のあらゆる場所（例えば、上記Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、Ｃ−Ｄ、またはＤ−Ｅループの最初の１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上のアミノ酸）において、非天然にコードされたアミノ酸は置換される。いくつかの実施形態では、上記Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｃ、Ｃ−Ｄ、またはＤ−Ｅループの最後の１、２、３、４、５、６、７、またはそれ以上のアミノ酸において、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸が置換される。
特に限定されないが、ＥＰＯ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、およびベータ インターフェロンなどを含むＧＨファミリーの特定の一員は、Ｎ−連結型および／またはＯ−連結型の糖を含む。上記タンパク質におけるグリコシル化部位は、ほぼ例外なくループ領域に生じ、かつアルファヘリックスバンドルには生じない。ループ部位は、一般的に受容体結合に関与せず、かつ該部位は糖基による共有結合性の結合のための部位であるので、該部位は、非天然に生じるアミノ酸の置換を上記タンパク質に導入するための有用な部位であり得る。タンパク質においてＮ−連結型およびＯ−連結型のグリコシル化部位を含んでいるアミノ酸は、これらのアミノ酸が表面に露出しているので、非天然に生じるアミノ酸による置換のための部位となり得る。従って、天然タンパク質は、これらの部位において該タンパク質に接着する嵩高い糖基を許容でき、かつグリコシル化部位は、受容体結合部位から離れて位置する傾向がある。
今後、ＧＨ遺伝子ファミリーの更なる構成要素が、おそらく発見されるであろう。ＧＨスーパーファミリーの新しい構成要素は、予想されるタンパク質配列の、コンピューターを使った二次および三次構造解析を経て同定され得る。ＧＨスーパーファミリーの各一員は、通常、非螺旋形のアミノ酸（ループ部位）によって結合される、４つか５つの両親媒性のヘリックスを持つ。該タンパク質は、細胞からの分泌を促進するために、該タンパク質のＮ末端に疎水性のシグナル配列を含んでいる。また上記のような後日発見されたＧＨスーパーファミリーの一員は、本発明の範囲内に含まれる。関連出願は、「Modified Four Helical Bundle Polypeptides and Their Uses」と題された国際特許出願（国際公開第０５／０７４６５０号パンフレットとして２００５年８月１８日公開された）である（なお、上記文献は参照によって本明細書に組み込まれる）
ＧＨスーパーファミリーの一員はヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）である。ヒト成長ホルモンは、ヒトの正常な成長と発達との制御に大きく関与している。この天然に生じる一本鎖下垂体ホルモンは、１９１アミノ酸残基からなり、約２２ｋＤａの分子量を有している。ｈＧＨは、多くの生物学的効果を示す。当該生物学的効果には、特に、線形成長（体形成）、乳汁分泌、マクロファージの活性化、インスリン様効果、および糖尿病誘発効果が含まれる（「Chawla, R.ら, Ann. Rev. Med. 34:519-547 (1983)」、「Isaksson, O.ら, Ann. Rev. Physiol, 47:483-499 (1985)」、「Hughes, J. and Friesen, H., Ann. Rev. Physiol., 47:469-482 (1985)」）。
ｈＧＨの構造は、公知であり（「Goeddel, D.ら, Nature 281 :544-548(1979)」）、ｈＧＨの３次元構造はＸ線結晶学的方法により決定されている（「de Vos, A.ら, Science 255:306-312 (1992)」）。上記タンパク質は、密集した球状の構造を有している。当該構造は、両親媒性のＮ末端から始まるＡ−Ｄと呼ばれる４つのヘリカルバンドルを含み、それらヘリカルバンドルはループにより結合されている。また、ｈＧＨは、４つのシステイン残基を含んでいる。これらシステイン残基は２つの分子内ジスルフィド結合に加わっている。すなわち、Ｃ５３はＣ１６５と対になっており、Ｃ１８２はＣ１８９と対になっている。上記ホルモンはグリコシル化されず、E. coliにおいて分泌型として発現されない（「Chang, Cら, Gene 55:189-196 (1987)」）。
ｈＧＨの多くの天然に生じる突然変異体が既に同定されている。当該突然変異体には、ｈＧＨ−Ｖ（「Seeburg, DNA 1: 239 (1982)」、米国特許第４，４４６，２３５号明細書、米国特許第４，６７０，３９３号明細書、および米国特許第４，６６５，１８０号明細書（なお、上記文献は、参照によって本明細書に組み込まれる））、およびｈＧＨの３２−４６の残基が欠失した２０−ｋＤａのｈＧＨ（「Kostyoら, Biochem. Biophys. Acta 925: 314 (1987)」、「Lewis, U.ら, J. Biol. Chem., 253:2679-2687 (1978)」）が含まれる。また、転写後プロセシング、翻訳後プロセシング、分泌プロセシング、代謝プロセシング、および他の生理的プロセシングにより生じた多くのｈＧＨバリアントは、報告されている（「Baumann, G., Endocrine Reviews 12: 424 (1991)」）。
ｈＧＨの生物学的効果は、特定の細胞受容体との相互作用から生まれる。上記ホルモンは、胎盤性ラクトゲンおよびプロラクチンを含む相同タンパク質のファミリーの一員である。しかしながら、ｈＧＨは広範な種特異性を示し、クローニングされた体細胞起源の受容体（Leung, D.ら, Nature 330:537-543 (1987)）、またはプロラクチン受容体（Boutin, J.ら, Cell 53:69-77 (1988)）に結合するという点において、上記ファミリーの一員の間では特異である。構造研究および生物化学研究に基づいて、ラクトゲン結合ドメインおよびソマトジェニック結合ドメイン（somatogenic binding domain）に関する機能マップが、提案されている（Cunningham, B. and Wells, J., Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 3407 (1991)）。ｈＧＨ受容体は、造血成長因子受容体／サイトカイン受容体／成長因子受容体のファミリーの一員である。当該ｈＧＨ受容体は、インターロイキン（ＩＬ）３受容体、ＩＬ４受容体およびＩＬ６受容体、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）受容体、エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体、ならびにＧ−ＣＳＦ受容体などの他のいくつかの受容体を含んでいる。「Bazan, Proc. Natl. Acad. Sci USA 87: 6934-6938 (1990)」を参照のこと。上記サイトカイン受容体ファミリーの一員は、保存された４つのシステイン残基と、膜貫通領域のすぐ外側に位置するトリプトファン−セリン−Ｘ−トリプトファン−セリンモチーフとを含んでいる。上記保存された配列は、タンパク質−タンパク質の相互作用に関与すると考えられる。例えば、「Chibaら, Biochim. Biophys. Res. Comm. 184: 485-490 (1992)」を参照のこと。ｈＧＨと、その受容体（ｈＧＨｂｐ）の細胞外ドメインとの相互作用は、ホルモン−受容体相互作用の中で最もよく理解されているものである。高解像度のＸ線結晶解析データ（Cunningham, B.ら, Science, 254:821-825 (1991)）から、ｈＧＨは２つの受容体結合部位を有し、ｈＧＨにおける異なる部位を用いて、２つの受容体分子に連続的に結合することが示された。上記２つの受容体結合部位は、部位Ｉ、および部位ＩＩと呼ばれている。部位Ｉには、へリックスＤのカルボキシ末端と、へリックスＡの一部と、Ａ−Ｂループが含まれている。一方、部位ＩＩには、へリックスＡのアミノ末端領域と、へリックスＣの一部が含まれている。ＧＨとその受容体との結合は、連続して起こる。まず、ＧＨの部位Ｉにおいて、当該ＧＨの受容体と結合し、その後、部位ＩＩにおいて第２のＧＨ受容体と結合する。その結果、受容体の２ダイマー化が起こり、さらに当該ホルモンに対する細胞反応を引き起こす細胞内シグナル経路が活性化される。Ｇ１２０Ｒの置換が部位ＩＩに導入されているｈＧＨのムテインは、１つのｈＧＨ受容体に結合することができるが、２つの受容体をダイマー化させることができない。このため、当該ムテインは、おそらく細胞内シグナル経路を活性化することなく受容体部位を占有することにより、インビトロにおいてｈＧＨのアンタゴニストとして機能する（Fun, G.ら, Science 256:1677-1680 (1992)）。
このように、上記成長ホルモンのスーパーファミリーの記載は、説明のためになされており、単なる例を提供するものであるので、本明細書に記載の方法、組成物、戦略および技術の範囲を限定するものではない。また、本出願におけるＧＨポリペプチドに対する言及は、一般名を任意のポリペプチドの例として用いることを意図している。したがって、ｈＧＨポリペプチドまたはタンパク質に関する、本明細書に記載の修飾および化学反応は、ＧＨスーパーファミリーの一員などを含む任意のポリペプチドに対して同様に適用されることができる。上記ＧＨスーパーファミリーの一員には、本明細書において具体的に記載されたものが含まれるが、これに限定されない。
＜ＩＩＩ．本発明と一緒に用いる組み換え核酸の一般的な方法＞
本発明の多くの実施形態では、興味のあるポリペプチドをコードする核酸が単離され、クローニングされ、ときどき組み換え方法を用いて変更される。そのような実施形態は、例えば、特に限定されないが、タンパク質発現のために使用されるか、またはバリアント、誘導体、発現カセットもしくはポリペプチドに由来する他の配列を作製する間に使用される。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドをコードする上記配列は、異種プロモーターに動作可能に連結される。ｈＧＨの単離と宿主細胞におけるＧＨの製造とは、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４，６０１，９８０号明細書、米国特許第４，６０４，３５９号明細書、米国特許第４，６３４，６７７号明細書、米国特許第４，６５８，０２１号明細書、米国特許第４，８９８，８３０号明細書、米国特許第５，４２４，１９９号明細書、米国特許第５，７９５，７４５号明細書、米国特許第５，８５４，０２６号明細書、米国特許第５，８４９，５３５号明細書、米国特許第６，００４，９３１号明細書、米国特許第６，０２２，７１１号明細書、米国特許第６，１４３，５２３号明細書、および米国特許第６，６０８，１８３号明細書に記載されている。
非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドをコードする核酸配列は、親ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて合成してもよい（なお、当該親ポリペプチドは、例えば、特に限定されないが、米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書に記載の配列番号２で表されるアミノ酸配列（ｈＧＨ）を有している。）。その後、関連するアミノ酸を導入するか（すなわち組み込みむか、もしくは置換する）、または除去する（すなわち欠失するか、もしくは置換する）ように、該ヌクレオチド配列を変えてもよい。上記核酸配列は、従来の方法に従って部位特異的変異誘発法により都合よく修飾されてもよい。これの代わりに、ヌクレオチド配列を化学合成により調製してもよい。上記化学合成は、例えば、オリゴヌクレオチドが所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計されるオリゴヌクレオチド合成機を用いて実施される。また、上記化学合成において、組み換えポリペプチドが製造されるであろう宿主細胞に好適なコドンを選択することが好ましい。例えば、所望のポリペプチドの一部をコードする低オリゴヌクレオチドのいくつかを、ＰＣＲ、ライゲーション、またはライゲーション連鎖反応により合成および会合することができる。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる「Baranyら, Proc. Natl. Acad. Sci 88: 189-193 (1991)」、および米国特許第６，５２１，４２７号明細書を参照のこと。
本発明には、遺伝子組み換えの分野における通常の技術が利用される。本発明に使用される一般的な方法を開示する基本的なテキストとしては、「Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd ed. 2001)」、「Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)」、および「Current Protocols in Molecular Biology (Ausubelら, eds., 1994)」が挙げられる。
分子生物学の技術を記載している一般的なテキストには、「Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger)」、「Sambrookら, Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 (“Sambrook”)」、および「Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubelら, eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (supplemented through 1999) (“Ausubel”)」が含まれる。これらのテキストには、突然変異誘発法、ベクターの使用、プロモーター、ならびに、例えば、直交化ｔＲＮＡ、直交化シンテターゼ、それらの対、および非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質を製造するためのセレクターコドンを含んでいる遺伝子またはポリヌクレオチドの生成に関する他の多くの関連する題目が記載されている。
新規シンテターゼまたはｔＲＮＡの製造、ｔＲＮＡ分子に対する突然変異の誘発、シンテターゼをコードするポリヌクレオチドに対する突然変異の誘発、ｔＲＮＡのライブラリーの製造、シンテターゼのライブラリーの製造、セレクターコドンの製造、興味のあるタンパク質またはポリペプチド中の非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンの挿入などの様々な目的のために、様々な種類の突然変異誘発法が本発明に用いられる。該突然変異誘発法には、例えば、部位特異的突然変異誘発法、ランダム点突然変異誘発法、相同性組み換え、ＤＮＡシャッフリング、または他の再帰的突然変異誘発法（recursive mutagenesis）、キメラコンストラクト、ウラシル含有テンプレートを用いた突然変異誘発法、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発法（oligonucleotide- directed mutagenesis）、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発法、ギャップ２本鎖ＤＮＡを用いた突然変異誘発法など、あるいは、それらの任意の組み合わせが含まれる。別の適切な方法には、ポイントミスマッチ修復、修復欠損宿主株を用いた突然変異誘発法、選択制限および精製制限、欠損突然変異誘発法、全遺伝子合成による突然変異誘発法、および２本鎖切断修復などが含まれる。また、キメラコンストラクト突然変異誘発法などに関する突然変異誘発法も、本発明に含まれる。一実施形態では、突然変異誘発を、天然に生じる分子の分かっている情報（特に限定されないが、配列、配列比較、物理的性質、２次構造、３次構造、４次構造、もしくは結晶構造など）により導くことができるし、または、天然に生じる分子を変更するか、もしくは突然変異させることにより導くことができる。
これらの手法は、本明細書に見られるテキストと例とに開示されている。別の情報は、以下の刊行物および、そこで引用されている参考文献に見られる。「Lingら, Approaches to DNA mutagenesis: an overview, Anal Biochem. 254(2): 157-178 (1997)」、「Daleら, Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method, Methods Mol. Biol. 57:369-374 (1996)」、「Smith, In vitro mutagenesis, Ann. Rev. Genet. 19:423-462 (1985)」、「Botstein & Shortle, Strategies and applications of in vitro mutagenesis, Science 229:1193-1201 (1985)」、「Carter, Site-directed mutagenesis, Biochem. J. 237:1-7 (1986)」、「Kunkel, The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis, in Nucleic Acids & Molecular Biology (Eckstein, F. and Lilley, D.M.J. eds., Springer Verlag, Berlin) (1987)」、「Kunkel, Rapid and efficient site-specific mutagenesis -without phenotypic selection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492 (1985)」、「Kunkelら, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods in Enzymol. 154, 367-382 (1987)」、「Bassら, Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities, Science 242:240-245 (1988)」、「Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml3-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment, Nucleic Acids Res. 10:6487-6500 (1982)」、「Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods in Enzymol. 100:468-500 (1983)」、「Zoller & Smith, Oligonucleotide-directed mutagenesis: a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template, Methods in Enzymol. 154:329-350 (1987)」、「Taylorら, The use of phosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8749-8764 (1985)」、「Taylorら, The rapid generation of oligonucleotide- directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA, Nucl. Acids Res. 13: 8765-8785 (1985)」、「Nakamaye & Eckstein, Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 14: 9679-9698 (1986)」、「Sayersら, 5’-3’ Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis, Nucl. Acids Res. 16:791-802 (1988)」、「Sayersら, Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide, (1988) Nucl. Acids Res. 16: 803-814」、「Kramerら, The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction, Nucl. Acids Res. 12: 9441-9456 (1984)」、「Kramer & Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA, Methods in Enzymol. 154:350-367 (1987)」、「Kramerら, Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations, Nucl. Acids Res. 16: 7207 (1988)」、「Fritzら, Oligonucleotide-directed construction of mutations: a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro, Nucl. Acids Res. 16: 6987-6999 (1988)」、「Kramerら, Different base/base mismatches are corrected with different efficiencies by the methyl-directed DNA mismatch-repair system of E. coli, Cell 38:879-887 (1984)」、「Carterら, Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using Ml3 vectors, Nucl. Acids Res. 13: 4431-4443 (1985)」、「Carter, Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml3 vectors, Methods in Enzymol. 154: 382-403 (1987)」、「Eghtedarzadeh & Henikoff, Use of oligonucleotides to generate large deletions, Nucl. Acids Res. 14: 5115 (1986)」、「Wellsら, Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317: 415- 423 (1986)」、「Nambiarら, Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein, Science 223: 1299-1301 (1984)」、「Sakmar and Khorana, Total synthesis and expression of a gene for the alpha-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein (transducin), Nucl. Acids Res. 14: 6361-6372 (1988)」、「Wellsら, Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites, Gene 34:315-323 (1985)」、「Grundstroemら, Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale ‘shot-gun’ gene synthesis, Nucl. Acids Res. 13: 3305-3316 (1985)」、「Mandecki, Oligonucleotide-directed double- strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83:7177-7181 (1986)」、「Arnold, Protein engineering for unusual environments, Current Opinion in Biotechnology 4:450-455 (1993)」、「Sieberら, Nature Biotechnology, 19:456-460 (2001)」、「W. P. C. Stemmer, Nature 370, 389-91 (1994)」、および「I. A. Lorimer, I. Pastan, Nucleic Acids Res. 23, 3067-8 (1995)」。上記方法の多くについての別の詳細は、「Methods in Enzymolgy Volume 154」に見られ得る。また、「Methods in Enzymolgy Volume 154」には、様々な突然変異誘発法に関する問題をトラブルシューティングするための有益な制御が記載されている。
例えば、シンテターゼのライブラリーに突然変異を誘発するか、またはｔＲＮＡを変更するという本発明の突然変異誘発法に使用するためなどのオリゴヌクレオチドは、通常、「Beaucage and Caruthers, Tetrahedron Letts. 22(20):1859-1862, (1981)」に記載の固相ホスホラミジーテトリエステル法に従って、化学的に合成される。また、そのような化学的合成では、例えば、「Needham-VanDevanter ら, Nucleic Acids Res., 12:6159-6168 (1984)」に記載の自動合成機が用いられる。
また、本発明は、直交化ｔＲＮＡ／ＲＳの対を介してインビボにおいて非天然アミノ酸を組み込むための真核生物の宿主細胞、非真核生物の宿主細胞、および、生物に関する。宿主細胞は、一般的に本発明のポリヌクレオチド、または本発明のポリヌクレオチドを含んでいるコンストラクト（例えば、本発明のベクター）により遺伝子組み換えされている。この遺伝子組み換えとしては、例えば、形質転換、形質導入、またはトランスフェクションなどが挙げられる。また、本発明のベクターは、例えばクローニングベクターであってもよいし、発現ベクターであってもよい。例えば、直交化ｔＲＮＡ、直交化ｔＲＮＡシンテターゼ、および誘導体化されるタンパク質のためのコード領域は、所望の宿主細胞において機能する遺伝子発現制御要素に動作可能に連結される。上記ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージ、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド（naked polynucleotide）、または接合されたポリヌクレオチドの形態であってもよい。上記ベクターを、標準の方法によって細胞および／または微生物に導入する。標準の方法としては、例えば、エレクトロポレーション（「Frommら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 5824 (1985)」、ウイルスベクターによる感染、および／または、核酸が小ビーズもしくは粒子のマトリックスの中または表面上にある小粒子による、高速弾道的浸透（「Kleinら, Nature 327, 70-73 (1987)」）が挙げられる。
遺伝子組み換えが実施された宿主細胞を、スクリーニング工程、プロモーターの活性化、または形質転換体の選択などのような活動に適切なように修飾された従来の培養液において培養することができる。必要に応じて、上記宿主細胞を、トランスジェニック生物の中へ培養することができる。細胞の単離および培養など（例えば、その後に核酸を単離するための細胞の単離および培養）に関する他の有用な文献としては、例えば、以下の文献が挙げられる：「Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley- Liss, New York」およびそこで引用されている文献、ならびに「Payneら (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY」、「Gamborg and Phillips (eds.) (1995) Plant Cell. Tissue and Organ Culture Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)」、および「Atlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FL」。
標的核酸を細胞に導入する公知の方法のいくつかは利用可能であり、それらの何れかを、本発明に用いることができる。これらには、ＤＮＡを含んでいる細菌のプロトプラストと受容細胞との融合、エレクトロポレーション、発射による照射（projectile bombardment）、およびウイルスベクターによる感染（さらに以下で検討する）などが含まれる。細菌細胞を用いて、本発明のＤＮＡコンストラクトを含んでいるプラスミドの数を増幅することができる。細菌を対数増殖期まで成長させて、細菌の中のプラスミドを、技術的に公知の様々な方法により単離することができる（例えばSambrookを参照のこと）。さらに、細菌からプラスミドを精製するための多くのキットが、市販されている（例えば、Pharmacia Biotechから販売されているEasyPrep（登録商標）およびFlexiPrep（登録商標）、Stratageneから販売されているStrataClean（登録商標）、ならびにQiagenから販売されているQIAprep（登録商標）を参照のこと）。単離され、精製されたプラスミドを、その後にさらに操作して、細胞にトランスフェクションするために用いられるか、または生物に感染する関連ベクターに組み込むために用いられる他のプラスミドを製造する。典型的なベクターは、転写ターミネーター、翻訳ターミネーター、転写開始配列、翻訳開始配列、および特定の標的核酸の発現を調節するのに有用なプロモーターを含んでいる。必要に応じて、ベクターは、少なくとも１つの独立したターミネーター配列、真核生物もしくは原核生物またはその両方において包括的発現カセットの複製を可能にする配列を含んでいる包括的発現カセット（generic expression cassette）と、原核系および真核系のための選択マーカーとを含んでいる。また、上記包括的発現カセットが、真核生物および原核生物の両方において包括的発現カセットの複製を可能にする配列を含む場合は、そのベクターは、例えば、シャトルベクターである。ベクターは、原核生物、真核生物、またはその両方において複製と組み込みとに適したものである。「Gillam & Smith, Gene 8:81 (1979)」、「Robertsら, Nature, 328:731 (1987)」、「Schneider, E.ら, Protein Expr. Purif. 6(1)10-14 (1995)」、上記「Ａｕｓｕｂｅｌ」、上記「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」、上記「Ｂｅｒｇｅｒ」を参照のこと。クローニングに有用な細菌およびバクテリオファージのカタログは、例えば、ＡＴＣＣにより提供されており、例えば、ＡＴＣＣから出版されている、「The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992) Ghernaら (eds)」が挙げられる。また、シークエンシング、クローニング、分子生物学の他の態様、および根本的な理論的考察に関する別の基本的手法が、「Watsonら (1992) Recombinant DNA Second Edition Scientific American Books, NY」に見られる。さらに、本質的に任意の核酸（および実質的に任意の標識された核酸（標準的なものであっても、非標準的なものであってもよい）は、特別に作製されたものであってもよいし、様々な商業的供給者の何れかに標準的に注文されたものであってもよい。該商業的供給者は、例えば、Midland Certified reagent Company （Midland、TX、ワールドワイドウェブのmcrc.comにおいて利用可能である）、The Great American Gene Company（Ｒａｍｏｎａ、CA、ワールドワイドウェブのgenco.comにおいて利用可能である）、ExpressGen Inc.（Chicago、IL、ワールドワイドウェブのexpressgen.comにおいて利用可能である）、Operon Technologies Inc.（Alameda，CA）、および他の多くが挙げられる。
（セレクターコドン）
本発明のセレクターコドンは、タンパク質の生合成機構の遺伝的コドンの枠組みを拡張するものである。例えば、セレクターコドンには、ユニークな３塩基コドン、ナンセンスコドン（アンバーコドン（ＵＡＧ）、オーカーコドンまたはオパールコドン（ＵＧＡ）などの終止コドンなど）、非天然コドン、４塩基以上のコドン、またはレアコドンなどが含まれる。所望の遺伝子またはポリヌクレオチドに導入され得るセレクターコドンの数の範囲が広いことは当業者には、直ちに明らかである。例えば、ポリペプチドの少なくとも一部をコードする１つのポリヌクレオチドに、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはそれ以上のセレクターコドンを導入することができる。
一実施形態では、本発明の方法は、インビボにおいて１つ以上の非天然アミノ酸を組み込むための、終止コドンであるセレクターコドンの使用を含んでいる。例えば、終止コドン（ＵＡＧなど）を認識するＯ−ｔＲＮＡは製造され、該Ｏ−ｔＲＮＡが所望の非天然アミノ酸を用いてＯ‐ＲＳによりアミノアシル化される。このＯ−ｔＲＮＡは、宿主の天然に生じるアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼにより認識されない。従来の部位特異的突然変異誘発法を用いて、終止コドン（ＴＡＧなど）を、興味のあるポリペプチドの興味のある部位に導入することができる。例えば、「Sayers, J.R.ら (1988), 5’-3’ Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 16:791-802」を参照のこと。Ｏ‐ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ、および興味のあるポリペプチドをコードする核酸が、インビボにおいて組み合わされると、非天然アミノ酸が、ＵＡＧコドンに応じて組み込まれる。これにより、特定の位置において非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドが得られる。
真核生物の宿主細胞をほとんど混乱させることなく、インビボにおける非天然アミノ酸の組み込みを、実施することができる。例えば、ＵＡＧコドンの抑圧効率は、Ｏ−ｔＲＮＡ（アンバーサプレッサーｔＲＮＡなど）と真核生物の終結因子（ｅＲＦなど）とに依存するので、Ｏ−ｔＲＮＡおよび／またはサプレッサーｔＲＮＡの発現量を増加することなどにより、抑圧効率を調整することができる。なお、終結因子は、終止コドンに結合して、成長中のペプチドのリボソームからの放出を開始するものである。
また、非天然アミノ酸は、レアコドンによりコードされ得る。例えば、インビトロのタンパク質合成反応におけるアルギニンの濃度が低いとき、レアアルギニンコドンＡＧＧは、アラニンによりアシル化される合成ｔＲＮＡによるＡｌａの挿入に有効であると判明している。例えば、「Ma ら, Biochemistry, 32:7939 (1993)」を参照のこと。この場合、合成ｔＲＮＡは、Escherichia coliにおいて微量種として存在する天然に生じるｔＲＮＡＡｒｇと競合する。いくつかの生物は全ての３塩基コドンを使用しない。Micrococcus luteusにおいて、割り当てられていないコドンであるＡＧＡは、インビトロの転写／翻訳抽出物における、アミノ酸の挿入に利用されている。例えば、「Kowal and Oliver, Nucl. Acid. Res.. 25:4685 (1997)」を参照のこと。本発明の構成要素は、インビボにおけるこれらレアコドンを用いるように生成され得る。
また、セレクターコドンには、４塩基以上のコドン（例えば、４、５、６またはそれ以上の塩基のコドン）などの拡張されたコドン（拡張コドン）が含まれる。４塩基コドンとしては、例えば、特に限定されないが、ＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、およびＣＣＣＵなどが挙げられる。５塩基コドンとしては、例えば、特に限定されないが、ＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、およびＵＡＧＧＣなどが挙げられる。本発明の特徴には、フレームシフト抑圧に基づいた、拡張コドンの使用が含まれる。４塩基以上のコドンは、例えば、１つ以上の非天然アミノ酸を同じタンパク質に挿入することができるが、これに限定されない。例えば、アンチコドンループ（例えば、少なくとも８−１０ｎｔのアンチコドンループ）を有する突然変異したＯ−ｔＲＮＡ（特別なフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡなど）の存在下において、４塩基以上のコドンが１アミノ酸として読まれる。他の実施形態では、アンチコドンループは、例えば、少なくとも４塩基コドン、少なくとも５塩基コドン、または少なくとも６塩基コドンまたはそれ以上を解読することができる。４塩基コドンには、２５６の可能性があるので、４塩基以上のコドンを用いると、同じ細胞において複数の非天然アミノ酸をコードすることができる。「Andersonら, (2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size, Chemistry and Biology, 9:237-244」、「Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code: Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of “Shifty” Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli, J. Mol. Biol. 307: 755-769」を参照のこと。
例えば、以前から、４塩基コドンを用いて、インビトロの生合成方法により非天然アミノ酸をタンパク質に組み込まれている。例えば、「Maら, (1993) Biochemistry, 32:7939」、および「Hohsakaら, (1999) J. Am. Chem. Soc, 121 :34」。ＣＧＣＧおよびＡＧＧＵを用いて、２−ナフチルアラニンとリジンのＮＢＤ誘導体とが、２つの化学的にアシル化されたフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡにより、インビトロにおいてストレプトアビジンに同時に組み込まれた。例えば、「Hohsakaら, (1999) J. Am. Chem. Soc, 121: 12194」を参照のこと。インビボにおける研究では、Ｍｏｏｒらは、ＵＡＧＮコドンを抑圧するというＮＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕ誘導体の能力を調べた（ＮはＵ、Ａ、ＧまたはＣであり得る）。そして、ＵＣＵＡアンチコドンを有するｔＲＮＡＬｅｕにより、４塩基のＵＡＧＡが、１３から２６％の効率でもって、０または−１フレームにおける解読がほとんどなく、解読され得ることを発見した（「Mooreら, (2000) J. Mol. Biol., 298:195」を参照のこと）。一実施形態では、レアコドンまたはナンセンスコドンに基づく拡張コドンを、本発明に用いることができる。これによれば、他の望ましくない部位におけるミスセンスのリードスルーと、フレームシフト抑圧とを減少することができる。
所定の系に関して、内在性の系が天然塩基コドンを使用しない（または稀に使用する）場合、セレクターコドンには、天然の３塩基コドンの１つも含まれ得る。例えば、これには、天然３塩基コドンを認識するｔＲＮＡを欠いた系、および／または、３塩基コドンがレアコドンである系が含まれる。
必要に応じて、セレクターコドンは、非天然塩基対を含んでいる。該非天然塩基対は、存在する遺伝子アルファベットをさらに拡張する。１つの付加的な塩基対により、３塩基コドンの数が、６４から１２５に増加する。３番目の塩基対の性質には、安定かつ選択的な塩基対形成、ポリメラーゼにより高い忠実度で行われる、ＤＮＡの効率の良い酵素的組み込み、および初期の非天然塩基対の合成後に、継続されるプライマーの効率の良い伸長が含まれる。方法と組成物とに適応され得る非天然塩基対は、例えば「Hiraoら, (2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein, Nature Biotechnology, 20:177-182」に記載されている。また、「Wu, Y.ら, (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:14626- 14630」を参照のこと。さらに、他の関連する刊行物を以下に列挙する。
インビボでの使用に関して、非天然ヌクレオシドは、膜透過性であり、リン酸化されることにより対応する３リン酸塩を形成する。さらに、増加した遺伝情報は安定であり、細胞内酵素により破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒおよびその他によるこれまでの努力によれば、正準のワトソン−クリック対における水素結合パターンとは異なる水素結合パターンが利用された。その水素結合パターンのうち最も注目すべき例は、イソ−Ｃ：イソ−Ｇ対である。例えば、「Switzerら, (1989) J. Am. Chem. Soc. 11 1:8322」、「Piccirilliら, (1990) Nature, 343:33」、および「Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602」を参照のこと。一般的に、これら塩基は、天然塩基とある程度で誤った塩基対を形成するし、酵素により複製されることができない。Ｋｏｏｌと協働者とは、塩基間の疎水性のパッキング相互作用により、塩基対が形成されるように水素結合が置き換られ得ることを実証した。「Kool, (2000) Curr. Opin. Chem. Biol., 4:602」、および「Guckian and Kool, (1998) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825」を参照のこと。上記必要条件の全てを満足する非天然塩基対を開発する努力において、Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ、および協働者は、一連の非天然の疎水性塩基を体系的に合成し、研究した。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対は、天然塩基対よりも安定であることが発見され、Escherichia coliのＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片（ＫＦ）により、効率的にＤＮＡに組み込まれることができる。例えば、「McMinnら, (1999) J. Am. Chem. Soc. 121 :11585-6」、および「Ogawaら, (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:3274」を参照のこと。３ＭＮ：３ＭＮ自己対は、生物学的機能に十分な効率と選択性とでもって、ＫＦにより合成されることができる。例えば、「Ogawaら, (2000) J. Am. Chem. Soc. 122:8803」を参照のこと。しかし、両塩基とも、複製をさらにするときに、連鎖停止剤として作用する。ＰＩＣＳ自己対を複製するために用いることができる、突然変異のＤＮＡポリメラーゼが近年、進化された。さらに、７ＡＩ自己対を複製することができる。例えば、「Taeら, (2001) J. Am. Chem. Soc, 123:7439」を参照のこと。また、新規の金属塩基対（metallobase pair）、Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙも開発された。このＤｉｐｉｃ：Ｐｙは、Ｃｕ（ＩＩ）の結合にしたがって、安定な対を形成する。「Meggersら, (2000) J. Am. Chem. Soc, 122:10714」を参照のこと。拡張コドンと非天然コドンとは、天然コドンに対して本質的に直交であるので、本発明の方法は、拡張コドンと非天然コドンとのための直交化ｔＲＮＡを生成するために、この性質を利用することができる。
また、翻訳バイパス系を用いて、非天然アミノ酸を、所望のポリペプチドに組み込むことができる。翻訳バイパス系では、長い配列が遺伝子に挿入されるが、この配列はタンパク質に翻訳されない。該配列は、リボソームに該配列を飛び越えさせて、挿入の下流から翻訳を再開させるきっかけとなる構造を含んでいる。
特定の実施形態では、本発明の方法および／または組成物における、興味のあるタンパク質もしくはポリペプチド（あるいはそれらの一部）は、核酸にコードされている。通常、該核酸は、少なくとも１つのセレクターコドン、少なくとも２つのセレクターコドン、少なくとも３つのセレクターコドン、少なくとも４つのセレクターコドン、少なくとも５つのセレクターコドン、少なくとも６つのセレクターコドン、少なくとも７つのセレクターコドン、少なくとも８つのセレクターコドン、少なくとも９つのセレクターコドン、あるいは、１０またはそれ以上のセレクターコドンを含んでいる。
当業者の一人に公知の方法、および本明細書に記載の方法を用いて、興味のあるタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子を、例えば非天然アミノ酸を組み込むための１つ以上のセレクターコドンを含むように突然変異させることができる。例えば、興味のあるタンパク質に関する核酸を、１つ以上のセレクターコドンを含むように突然変異させることにより、１つ以上の非天然アミノ酸を組み込むことができる。本発明には、例えば少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる任意のタンパク質の突然変異体、変形体などを含むそのような任意のバリアントが包含される。同様に、本発明には、対応する核酸、すなわち１つ以上の非天然アミノ酸をコードする１つ以上のセレクターコドンを有する任意の核酸も含まれる。
ポリペプチドの任意の所望の位置にシステインが導入されるように、ｈＧＨポリペプチドなどの興味のあるタンパク質をコードする核酸分子を、容易に突然変異させても良い。反応性分子、水溶性ポリマー、タンパク質または多種多様な他の分子を、興味のあるタンパク質へ導入するために、システインが広く用いられている。システインをポリペプチドの所望の位置に組み込むのに適した方法は、当業者に公知であり、例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，６０８，１８３号明細書に記載の方法や、標準の突然変異誘発技術が挙げられる。
＜ＩＶ．非天然にコードされたアミノ酸＞
非常に多種多様な非天然にコードされたアミノ酸が、本発明における使用に適している。任意の数の非天然にコードされたアミノ酸を、ポリペプチドに導入することができる。一般的に、導入された非天然にコードされたアミノ酸は、２０の遺伝的にコードされた一般アミノ酸に対して実質的に化学的に不活性である。ここで、該一般アミノ酸は、すなわちアラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンである。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸は、２０の一般アミノ酸には発見されない官能基と効率的かつ選択的に反応して、安定な接合体を形成する官能基（例えばアジド、ケトン、アルデヒドおよびアミノオキシ基）を側鎖に含んでいる。例えば、アジド官能基を含んでいる非天然にコードされたアミノ酸を含有するポリペプチドを、ポリマー（例えば、ポリ（エチレングリコール）と反応させることができる。また、このポリペプチドを、上記ポリマー以外のものと反応させてもよく、上記ポリペプチドとアルキン部分を含んでいる第２ポリペプチドとを、反応させることにより、アジド官能基とアルキン官能基との選択的反応からＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化産物が形成され、これにより、安定な接合体を形成することができる。
アルファ−アミノ酸の一般構造は、以下のように示される（一般式Ｉ）。
Figure 2009523815
 非天然にコードされたアミノ酸は、通常、上記一般式を有する任意の構造であるが、Ｒ基は、２０の天然アミノ酸に用いられているＲ基以外の任意の置換基であるとともに、本発明における使用に適していてもよいものである。本発明の非天然にコードされたアミノ酸は、通常、側鎖の構造においてのみ天然アミノ酸と異なるので、非天然にコードされたアミノ酸は、天然もしくは非天然にコードされたアミノ酸などの他のアミノ酸と、アミド結合を天然に生じるポリペプチドに形成される様式と同じ様式で形成する。しかし、非天然にコードされたアミノ酸は、非天然にコードされたアミノ酸を天然アミノ酸から区別する側鎖を有している。例えば、必要に応じて、Ｒは、アルキル−、アリール−、アシル−、ケト−、アジド−、ヒドロキシル−、ヒドラジン、シアノ−、ハロ−、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノー、スルホニル−、ボレート（ｂｏｒａｔｅ）、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、またはアミノ基など、あるいはそれらの任意の組み合わせを含んでいる。本発明の使用において適切であり得る他の興味のある非天然に生じるアミノ酸には、光活性化可能なクロスリンカーを含んでいるアミノ酸、スピンラベルアミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、新規官能基を有する放射性アミノ酸、他の分子と共有的または非共有的に相互作用するアミノ酸、光ケージドおよび／または光異性化可能なアミノ酸、ビオチンまたはビオチン類似体を含んでいるアミノ酸、グリコシル化アミノ酸（糖置換セリンなど）、他の炭水化物により修飾されたアミノ酸、ケト含有アミノ酸、ポリエチレングリコールまたはポリエーテルを含んでいるアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的に切断可能および／または光切断可能なアミノ酸、天然アミノ酸と比べて伸長した側鎖（例えば約５よりも長い、もしくは約１０よりも長い炭素などを含んでいる長鎖炭化水素またはポリエーテルなど）を有するアミノ酸、炭素連結型糖アミノ酸（carbon-linked sugar-containing amino acid）、酸化還元活性を有するアミノ酸、アミノ酸を含んでいるアミノチオ酸、ならびに、１つ以上の毒性部分を含んでいるアミノ酸が含まれる。
水溶性ポリマーとの反応に有用でかつ本発明における使用に適し得る、典型的な非天然にコードされたアミノ酸には、特に限定されないが、カルボニル、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、セミカルバジド、アジド、およびアルキンの反応基を有する非天然にコードされたアミノ酸が含まれる。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸は、サッカライド部分を含んでいる。上記アミノ酸の例としては、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−トレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギン、およびＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンなどが挙げられる。また、上記アミノ酸の例には、例えば、アミノ酸とサッカライドとの間の天然に生じるＮ‐またはＯ−連結が、天然には通常発見されない共有連結（例えば、アルケン、オキシム、チオエーテル、およびアミドなど）により置換されている例が含まれる。また、上記アミノ酸の例は、天然に生じるタンパク質に通常発見されないサッカライド（例えば、２−デオキシ−グルコース、および２デオキシガラクトースなど）を含んでいる。
本明細書に示された多くの非天然にコードされたアミノ酸は、例えば、Ｓigma-Aldrich（St. Louis, MO, USA)、Novabiochem (a division of EMD Biosciences, Darmstadt, Germany）、またはPeptech (Burlington, MA, USA)から市販されている。市販されていない非天然にコードされたアミノ酸は、必要に応じて、当業者に公知の標準の方法を用いるか、本明細書に示されるようにして合成される。有機合成技術に関しては、例えば、ＦｅｓｓｅｎｄｏｎとＦｅｓｓｅｎｄｏｎとによる「Organic Chemistry(1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.)」、Ｍａｒｃｈによる「Advanced Organic Chemistry(Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)」、およびＣａｒｅｙとＳｕｎｄｂｅｒｇとによる「Advanced Organic Chemistry (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)」を参照のこと。また、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，０４５，３３７号明細書と、米国特許第７，０８３，９７０号明細書とを参照こと。また、新規側鎖を含んでいる非天然アミノ酸に加えて、本発明における使用に適していてもよい非天然アミノ酸は、必要に応じて修飾された骨格構造を含んでおり、例えば、一般式ＩＩおよびＩＩＩの構造により示されるようなアミノ酸が挙げられる。
Figure 2009523815
 （Ｚは、通常ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’またはＳ−Ｒ’を含み；同一であってもよいし、または異なっていてもよいＸおよびＹは、通常ＳまたはＯを含み；必要に応じて同一または異なっているＲおよびＲ’は、通常一般式Ｉで示される非天然アミノ酸の上記Ｒ基についての構成要素のリストと同じリスト、および水素から選ばれる）。例えば、本発明の非天然アミノ酸は、一般式ＩＩおよびＩＩＩで示されるように、アミノ基またはカルボキシル基に置換基を必要に応じて含んでいる。この種類の非天然アミノ酸には、例えば２０の一般的な天然アミノ酸の側鎖に相当する側鎖か、非天然の側鎖を有する、α−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートなどが含まれる。さらに、α−炭素における置換基は、必要に応じて、例えば、Ｌアミノ酸、Ｄアミノ酸、またはα−α−２置換アミノ酸を含んでおり、例えば、Ｄ−グルタミン酸（ｇｌｕｔａｍａｔｅ）、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、およびアミノ酪酸などが挙げられる。他の構造的に異なるアミノ酸には、環状アミノ酸（プロリン類似体、ならびに、３、４、６、７、８、および９員環のプロリン類似体）、βアミノ酸、およびγアミノ酸（置換β−アラニンおよびγ−アミノ酪酸など）が含まれる。
多くの非天然アミノ酸は、天然アミノ酸（チロシン、グルタミン、およびフェニルアラニンなど）に基づいていおり、本発明における使用に適している。チロシン類似体には、例えば、パラ−置換チロシン、オルソ−置換チロシン、メタ置換チロシンが含まれる。ここで、置換チロシンは、例えば、ケト基（アセチル基など）、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン基、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０の直鎖もしくは分枝鎖の炭化水素、飽和もしくは不飽和の炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、またはアルキニル基などを含んでいる。さらに、アリール環が複数置換されているものも、考慮される。本発明における使用に適していてもよいグルタミン類似体には、例えば、α−ヒドロキシ誘導体、γ−置換誘導体、環状誘導体およびアミド置換グルタミン誘導体が含まれる。本発明における使用に適していてもよいフェニルアラニン類似体の例には、特に限定されないが、パラ−置換フェニルアラニン、オルソ−置換フェニルアラニン、およびメタ−置換フェニルアラニンなどが含まれ、ここで、置換基は、例えば、特に限定されないが、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、イオド、ブロモ、ケト基（アセチル基など）、ベンゾイル、またはアルキニル基などを含んでいる。本発明における使用に適していてもよい非天然アミノ酸の具体的な例には、例えば、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−イオド−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、およびｐ−プロパルギルオキシ−フェニルアラニンなどが挙げられる。本発明における使用に適していてもよい様々な非天然アミノ酸の構造の例は、例えば、「In vivo incorporation of unnatural amino acids.」と題された国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットに提供されている。また、さらなるメチオニン類似体については、参照によって本明細書に組み込まれる「Kiickら, (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99:19-24」も参照のこと。
一実施形態では、非天然アミノ酸（ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙａｌａｎｉｎｅ）など）を含んでいるポリペプチドの組成物が、提供される。また、ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙａｌａｎｉｎｅ）を含んでおり、タンパク質および／または細胞を含有している様々な組成物が提供される。１態様では、非天然アミノ酸であるｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン（ｐｈｅｎｙａｌａｎｉｎｅ）を含んでいる組成物は、直交化ｔＲＮＡをさらに含んでいる。非天然アミノ酸を、直交化ｔＲＮＡに、例えば共有結合させることができる。このような結合の例としては、アミノ−アシル結合を介した直交化ｔＲＮＡへの共有結合、直交化ｔＲＮＡにおける末端の糖であるリボースの３’ＯＨまたは２’ＯＨへの共有結合などが挙げられる。
タンパク質へ組み込むことができる非天然アミノ酸を介した化学部分から、様々な利点が得られるとともに、タンパク質を様々に操作することができる。例えば、ケト官能基のユニークな反応性によれば、多くのヒドラジンまたはヒドロキシルアミン含有試薬の何れかを用いて、インビトロおよびインビボにおいてタンパク質を選択的に修飾することができる。例えば、重原子非天然アミノ酸は、Ｘ線構造データの位相合わせに有用であり得る。また、非天然アミノ酸を用いた重元素の部位特異的な導入は、重元素の位置を選択するときに、選択性と柔軟性とを与える。光反応性非天然アミノ酸（例えば、ベンゾフェノンおよびアリールアジド（フェニルアジドなど）の側鎖を有するアミノ酸）により、例えば、インビボおよびインビトロにおけるタンパク質の光架橋を効率的に実施することができる。光反応性非天然アミノ酸の例には、特に限定されないが、ｐ−アジド−フェニルアラニン、およびｐ−ベンゾイル−フェニルアラニンが含まれる。光反応性非天然アミノ酸を有するタンパク質を、時間的な制御を備える光反応基の励起により、任意に架橋することができる。１例では、例えば、核磁気共鳴および振動分光法に用いる局所的構造と動態とのプローブとしての同位体標識されたメチル基などで、非天然アミノ酸のメチル基を置換することができる。アルキニルまたはアジド官能基によれば、例えば、［３＋２］付加環化反応を介して、タンパク質を分子により選択的に修飾することができる。
アミノ末端においてポリペプチドに組み込まれる非天然アミノ酸を、２０の天然アミノ酸に用いられる置換基以外の任意の置換基であるＲ基と、α−アミノ酸に標準的に存在するＮＨ２（一般式Ｉを参照のこと）と異なる第２反応基とから構成することができる。同様の非天然アミノ酸を、α−アミノ酸に標準的に存在するＣＯＯＨ基（一般式Ｉを参照のこと）と異なる第２反応基により、カルボキシ末端に組み込むことができる。
本発明の非天然アミノ酸は、上記２０の天然アミノ酸では得ることができない特性をさらに備えるように、選択または設計され得る。例えば、非天然アミノ酸は、当該非天然アミノ酸が組み込まれるタンパク質の生物学的性質を修飾するように、必要に応じて選択または設計される。例えば、以下の性質が、タンパク質に非天然アミノ酸を含有させることによって、必要に応じて修飾され得る；毒性、生体内分布、可溶性、安定性（例えば、熱安定性、加水分解安定性、酸化安定性、および酵素分解に対する耐性など）、精製の促進、構造的性質、立体的性質、化学的および／または光化学的性質、酵素活性、酸化還元電位、半減期、および他の分子と、例えば共有結合的または非共有結合的に反応する能力など。
（非天然アミノ酸の構造および合成：カルボニル基、カルボニル様基、マスクされたカルボニル基、保護されたカルボニル基、およびヒドロキシルアミン基）
いくつかの実施形態において、本発明は、ポリペプチド（例としては、オキシム結合によって水溶性ポリマー（例えばＰＥＧ）と連結されているポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない）を提供する。
非天然にコードされたアミノ酸の多くの種類は、オキシム結合の形成に適切である。これらの例としては、カルボニル、ジカルボニル、またはヒドロキシアミン基を含む非天然にコードされたアミノ酸が挙げられるが、これに限定されない。そのようなアミノ酸は、「Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides」と題された２００４年１２月２２日に出願の、米国特許出願第６０／６３８，４１８号明細書、米国特許出願第６０／６３８，５２７号明細書、および米国特許出願第６０／６３９，１９５号明細書（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されている。また、そのようなアミノ酸は、「Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides」と題された２００５年７月１日出願の、米国特許出願第６０／６９６，２１０号明細書、米国特許出願第６０／６９６，３０２号明細書、および米国特許出願第６０／６９６，０６８号明細書（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されている。また、非天然にコードされたアミノ酸は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０４５，３３７号明細書および米国特許第７，０８３，９７０号明細書に記載されている。
本発明のいくつかの実施形態は、１つ以上の位置においてアミノ酸パラアセチルフェニルアラニンで置換されているポリペプチドを利用する。ｐ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンおよびｍ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンの合成は、参照によって組み込まれる「Zhang, Z.ら,. Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)」に記載されている。他のカルボニル含有アミノ酸またはジカルボニル含有アミノ酸は、当業者によって同様に調製され得る。さらに、本明細書に含まれる非天然アミノ酸の限定されない例示的な合成は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，０８３，９７０号明細書の図４、２４−３４および３６−３９に示されている。
求電子性反応基を有するアミノ酸は、とりわけ、求核付加反応を介して分子を連結するための多様な反応を可能にする。そのような求電子性反応基の例としては、カルボニル基（ケト基およびジカルボニル基など）、カルボニル様基（カルボニル基（ケト基およびジカルボニル基など）と類似の反応性を有し、かつカルボニル基と構造的に類似しているもの）、マスクされたカルボニル基（カルボニル基（ケト基およびジカルボニル基など）に容易に変えられ得るもの）、または保護されたカルボニル基（脱保護によってカルボニル基（ケト基およびジカルボニル基など）と同様の反応性を有するもの）が挙げられる。そのようなアミノ酸としては、一般式（ＩＶ）の構造を有するアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｊは、
Figure 2009523815
 であり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ’’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、または保護基であるか、または２以上のＲ’’基が存在する場合に、２つのＲ’’はヘテロシクロアルキルを任意に形成し；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ３およびＲ４のそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、低級アルキル、または置換低級アルキルであるか、Ｒ３とＲ４と、または２のＲ３基は、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを任意に形成するか；
または−Ａ−Ｂ−Ｊ−Ｒ基は、少なくとも１つのカルボニル基（ジカルボニル基など）、保護されたカルボニル基（保護されたジカルボニル基など）、またはマスクされたカルボニル基（マスクされたジカルボニル基など）を含む、２環式または３環式のシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルをともに形成するか；
または−Ｊ−Ｒ基は、少なくとも１つのカルボニル基（ジカルボニル基など）、保護されたカルボニル基（保護されたジカルボニル基など）、またはマスクされたカルボニル基（マスクされたジカルボニル基など）を含む、単環式または２環式のシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルをともに形成し；
Ａがフェニルであり、かつＲ３のそれぞれがＨである場合に、Ｂは存在し；Ａが−（ＣＨ２）４−であり、かつＲ３のそれぞれがＨである場合に、Ｂは−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）−ではなく；ＡとＢとが存在せず、かつＲ３のそれぞれがＨである場合に、Ｒはメチルではない）。
その他に、一般式（Ｖ）の構造を有するものが挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ａがフェニルである場合に、Ｂは存在し；Ａが−（ＣＨ２）４である場合に、Ｂは−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）−ではなく；ＡとＢとが存在しない場合に、Ｒはメチルでない）。
その他に、一般式（ＶＩ）の構造を有するアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、Ｂは、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換低級へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれ独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、Ｒのそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択される）。
その他に、以下のアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、そのような化合物は、必要に応じて、アミノ保護基であるか、カルボキシル保護されているか、またはそれらの塩である）。その他に、以下の非天然アミノ酸のあらゆるものが、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれ得る。
その他に、一般式（ＶＩＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、Ｂは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択され；ｎは０から８であり；
Ａが−（ＣＨ２）４−である場合に、Ｂは、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２ＣＨ２）−ではない）。
その他に、以下のアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、そのような化合物は、必要に応じてアミノ保護されているか、任意にカルボキシル保護されているか、必要に応じてアミノ保護とカルボキシル保護とをされているか、またはそれらの塩である）。その他に、これらの非天然アミノ酸および以下の非天然アミノ酸のあらゆるものは、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれ得る。
その他に、一般式（ＶＩＩＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級へテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンまたは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドである）。
その他に、一般式（ＩＸ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （Ｂは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、または置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、かつ存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’からなる群から選択される（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）。
その他に、以下のアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、そのような化合物は、必要に応じてアミノ保護されているか、任意にカルボキシル保護されているか、必要に応じてアミノ保護とカルボキシル保護とをされているか、またはそれらの塩である）。その他に、これらの非天然アミノ酸および以下の非天然アミノ酸のあらゆるものは、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれ得る。
その他に、一般式（Ｘ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、Ｂは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択され；ｎは０から８である）。
その他に、以下のアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、そのような化合物は、必要に応じてアミノ保護されているか、任意にカルボキシル保護されているか、必要に応じてアミノ保護とカルボキシル保護とをされているか、またはそれらの塩である。その他に、これらの非天然アミノ酸および以下の非天然アミノ酸のあらゆるものは、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれ得る。
モノカルボニル構造の他に、本明細書に記載の非天然アミノ酸は、ジカルボニル基、ジカルボニル様基、マスクされたジカルボニル基、および保護されたジカルボニル基といった基を含み得る。
例えば、一般式（ＸＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換へテロアルキレン、低級へテロシクロアルキレン、置換低級へテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｂは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドである）。
その他に、一般式（ＸＩＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （Ｂは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択される）。
その他に、以下のアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、そのような化合物は、必要に応じてアミノ保護されているか、任意にカルボキシル保護されているか、必要に応じてアミノ保護とカルボキシル保護とをされているか、またはそれらの塩である）。その他に、非天然アミノ酸および以下の非天然アミノ酸のあらゆるものは、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれ得る。
その他に、一般式（ＸＩＩＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、Ｂは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、低級ヘテロアルキレン、置換低級ヘテロアルキレン、−Ｏ−、−Ｏ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ−、−Ｓ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｓ（Ｏ）ｋ−（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｓ（Ｏ）ｋ（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）−、−ＮＲ’−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−ＣＯＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−、−ＣＳＮ（Ｒ’）−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）ＣＯ−（アルキレンもしくは置換アルキレン）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）Ｓ（Ｏ）ｋＮ（Ｒ’）−、−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−、Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ（Ｒ’）−、−Ｃ（Ｒ’）＝Ｎ−Ｎ＝、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ＝Ｎ−、および−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’）−Ｎ（Ｒ’）−（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択されるリンカーであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’からなる群から選択され（ここで、Ｒ’それぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）；ｎは０から８である）。
その他に、以下のアミノ酸があげられる：
Figure 2009523815
 （ここで、そのような化合物は、必要に応じてアミノ保護されているか、任意にカルボキシル保護されているか、必要に応じてアミノ保護とカルボキシル保護とをされているか、またはそれらの塩である。その他に、これらの非天然アミノ酸および以下の非天然アミノ酸のあらゆるものは、非天然アミノ酸ポリペプチドに組み込まれ得る。
その他に、一般式（ＸＩＶ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｘ１は、Ｃ、Ｓ、またはＳ（Ｏ）であり；Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）である（ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）。
その他に、一般式（ＸＩＶ−Ａ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）である（ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）。
その他に、一般式（ＸＩＶ−Ｂ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、Ａは、任意であり、かつ存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）である（ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）。
その他に、一般式（ＸＶ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｘ１は、Ｃ、Ｓ、またはＳ（Ｏ）であり；ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；かつＣＲ８Ｒ９基のそれぞれにおけるＲ８およびＲ９のそれぞれは独立して、Ｈ、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリールからなる群から選択されるか、またはあらゆるＲ８およびＲ９は、＝Ｏもしくはシクロアルキルを一緒に形成することができるか、またはあらゆるＲ８およびＲ９は、隣接するＲ８基と一緒にシクロアルキルを形成することができる）。
その他に、一般式（ＸＶ−Ａ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレン；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；ＣＲ８Ｒ９基のそれぞれにおけるＲ８およびＲ９のそれぞれは独立して、Ｈ、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリールからなる群から選択されるか、またはあらゆるＲ８およびＲ９は、＝Ｏもしくはシクロアルキルを一緒に形成することができるか、またはあらゆるＲ８およびＲ９は、隣接するＲ８基と一緒にシクロアルキルを形成することができる）。
その他に、一般式（ＸＶ−Ｂ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
ｎは、０、１、２、３、４、または５であり；ＣＲ８Ｒ９基のそれぞれにおけるＲ８およびＲ９のそれぞれは独立して、Ｈ、アルコキシ、アルキルアミン、ハロゲン、アルキル、アリールからなる群から選択されるか、またはあらゆるＲ８およびＲ９は、＝Ｏもしくはシクロアルキルを一緒に形成することができるか、またはあらゆるＲ８およびＲ９は、隣接するＲ８基と一緒にシクロアルキルを形成することができる）。
その他に、一般式（ＸＶＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｘ１は、Ｃ、Ｓ、またはＳ（Ｏ）であり；Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）である（ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）。
その他に、一般式（ＸＶＩ−Ａ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）である（ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）。
その他に、一般式（ＸＶＩ−Ｂ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｒは、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｌは、アルキレン、置換アルキレン、Ｎ（Ｒ’）（アルキレン）またはＮ（Ｒ’）（置換アルキレン）である（ここで、Ｒ’は、Ｈ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）。
その他に、一般式（ＸＶＩＩ）の構造を有するアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、Ａは、任意であり、存在する場合に、低級アルキレン、置換低級アルキレン、低級シクロアルキレン、置換低級シクロアルキレン、低級アルケニレン、置換低級アルケニレン、アルキニレン、低級ヘテロアルキレン、置換ヘテロアルキレン、低級ヘテロシクロアルキレン、置換低級ヘテロシクロアルキレン、アリーレン、置換アリーレン、ヘテロアリーレン、置換ヘテロアリーレン、アルカリレン、置換アルカリレン、アラルキレン、または置換アラルキレンであり；
Ｍは、−Ｃ（Ｒ３）−、
Figure 2009523815
 であり（ここで、（ａ）は、Ａ基との結合を表し、（ｂ）は、それぞれのカルボニル基との結合を表し、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、もしくは置換シクロアルキルから選択されるか、またはＲ３とＲ４と、もしくは２つのＲ３基、もしくは２つのＲ４基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成する）；
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｔ３は、結合、Ｃ（Ｒ）（Ｒ）、Ｏ、またはＳであり、Ｒは、Ｈ，ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドである）。
その他に、一般式（ＸＶＩＩＩ）の構造を有するアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、Ｍは、−Ｃ（Ｒ３）−、
Figure 2009523815
 であり（ここで、（ａ）は、Ａ基との結合を表し、（ｂ）は、それぞれのカルボニル基との結合を表し、Ｒ３およびＲ４は独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、もしくは置換シクロアルキルであるか、またはＲ３とＲ４と、もしくは２つのＲ３基、もしくは２つのＲ４基は、任意にシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルを形成する）；
Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｔ３は、結合、Ｃ（Ｒ）（Ｒ）、Ｏ、またはＳであり、Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；
Ｒ１は、任意であり、存在する場合に、Ｈ、アミノ保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒ２は、任意であり、存在する場合に、ＯＨ、エステル保護基、樹脂、アミノ酸、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドであり；
Ｒａのそれぞれは独立して、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、−Ｎ（Ｒ’）２、−Ｃ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、ｋは１、２または３である）、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、−ＯＲ’、および−Ｓ（Ｏ）ｋＲ’（ここで、Ｒ’のそれぞれは独立して、Ｈ、アルキル、または置換アルキルである）からなる群から選択される）。
その他に、一般式（ＸＩＸ）の構造を有するアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルであり；Ｔ３は、Ｏ、またはＳである）。
その他に、一般式（ＸＸ）の構造を有するアミノ酸が挙げられる：
Figure 2009523815
 （ここで、Ｒは、Ｈ、ハロゲン、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、または置換シクロアルキルである）。
その他に、一般式（ＸＸＩ）の構造を有する以下のアミノ酸が挙げられる。
Figure 2009523815
 ｐ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンおよびｍ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンの合成は、参照によって組み込まれる「Zhang, Z.ら., Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)」に記載されている。他のカルボニル含有アミノ酸またはジカルボニル含有アミノ酸は、当業者によって同様に調製され得る。その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０８３，９７０の図４、２４−３４および３６−３９。
いくつかの実施形態において、非天然アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、化学的に修飾されて、反応性のカルボニル官能基、またはジカルボニル官能基を生成する。例えば、接合反応に有用なアルデヒド機能性基は、隣接するアミノ基およびヒドロキシル基を有する機能性基から生成され得る。生物活性分子がポリペプチドである場合に、例えば、Ｎ末端セリンまたはスレオニン（通常に存在し得るか、または化学的もしくは酵素的な消化を介して露出され得る）は、過ヨウ素酸塩を用いた穏やかな酸化的切断条件下における、アルデヒド機能性基の生成に使用され得る。例えば、「Gaertner, et. al., Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992)」；「Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3: 138-146 (1992)」；「Gaertner et al., J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994)」を参照のこと。しかし、当該技術において公知の方法は、ペプチドまたはタンパク質のＮ末端におけるアミノ酸に対して限定される。
本発明において、隣接するヒドロキシル基およびアミノ基を有する非天然アミノ酸は、「マスクされた」アルデヒド機能性基としてポリペプチドに組み込まれ得る。例えば、５−ヒドロキシリジンは、イプシロンアミンに対して隣接するヒドロキシル基を有する。アルデヒドを生成するための反応条件は、典型的に、ポリペプチド内の他の部位が酸化することを避ける穏やかな条件下において、過剰なモル濃度のメタ過ヨウ素酸ナトリウムの添加に関する。酸化反応のｐＨは、一般的に約７．０である。典型的な反応は、ポリペプチドの緩衝化溶液に対して、約１．５モル濃度過剰なメタ過ヨウ素酸ナトリウムの添加に続いて、暗所における１０分間のインキュベーションを含んでいる。例えば、米国特許第６，４２３，６８５号明細書を参照のこと。
カルボニル機能性基またはジカルボニル機能性基は、穏やかな条件の下に水性溶液においてヒドロキシルアミン含有試薬と選択的に反応して、生理学的条件下において安定な対応するオキシム連結を形成し得る。例えば、「Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959)」；「Shao, J. and Tarn, J. P., J. Am. Chem. Soc. 1 17:3893- 3899 (1995)」を参照のこと。さらに、カルボニル基またはジカルボニル基の固有の反応性が、他のアミノ酸側鎖の存在下において選択的な修飾を可能にする。例えば、「Cornish, V. W., et al., J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996)」；「Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992)」；「Mahal, L. K., et al., Science 276:1125-1128 (1997)」を参照のこと。
（非天然アミノ酸（ヒドロキシルアミン含有アミノ酸）の構造および合成）
米国仮特許出願第６０／６３８，４１８号明細書は、参照によってその全体が組み込まれる。従って、米国仮特許出願第６０／６３８，４１８号明細書におけるセクションＶ（「非天然アミノ酸」と題される）、パートＢ（「非天然アミノ酸（ヒドロキシアミン含有アミノ酸）の構造および合成」と題される）に与えられた開示内容は、そのような開示内容が本明細書に示されているも同然に、本明細書に記載されている非天然アミノ酸、非天然アミノ酸ポリペプチド、および修飾非天然アミノ酸ポリペプチドを作製する、精製する、性質決定する、および使用する方法、組成物（例としては、一般式Ｉ−一般式ＸＸＸＶが挙げられる）、技術および戦略に対して完全に適用される。
（非天然アミノ酸の化学合成）
本発明における使用に好適な非天然アミノ酸の多くは、例えば、Ｓｉｇｍａ（ＵＳＡ）またはＡｌｄｒｉｃｈ（Milwaukee, WI, USA）から市販されている。市販されていない非天然アミノ酸は、本明細書に規定されているように、または多様な公開物に規定されているように、または当業者に公知の標準的な方法を用いて、任意に合成される。有機合成技術に関しては、例えば、「Organic Chemistry by Fessendon and Fessendon, (1982, Second Edition, Willard Grant Press, Boston Mass.)」；「Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)」；および「Advanced Organic Chemistry by Carey and Sundberg (Third Edition, Parts A and B, 1990, Plenum Press, New York)」を参照のこと。非天然アミノ酸の合成について記載している付加的な公開物としては、例えば、「In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids」と題された国際公開第2002/085923号パンフレット;「Matsoukasら, (1995) J. Med. Chem., 38, 4660-4669」;「King, F.E. & Kidd, D.A.A. (1949) A New Synthesis ofGlutamine and of γ- Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates. J. Chem. Soc. 3315-3319」;「Friedman, O.M. & Chatterrji, R. (1959) Synthesis of Derivatives ofGlutamine as Model Substrates for Anti- Tumor Agents. J. Am. Chem. Soc. 81, 3750-3752」;「Craig, J.Cら. (1988) Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4 [[4-(diethylamino)-l-methylbutyl]amino]quinolim (Chloroquine). J. Ore. Chem. 53, 1167-1170」;「Azoulay, M., Vilmont, M. & Frappier, F. (1991) Glutamine analogues as Potential Antimalarials, Eur. J. Med. Chem. 26, 201-5」;「Koskinen, A.M.P. & Rapoport, H. (1989) Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues. J. Ore. Chem. 54, 1859-1866」;「Christie, B.D. & Rapoport, H. (1985) Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine. Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization. J. Qrg. Chem. 50:1239-1246」;「Bartonら, (1987) Synthesis of Novel alpha-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry: Synthesis of L- and D-alpha-Amino-Adipic Acids, L-alpha- aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives. Tetrahedron 43:4297-4308」;および「Subasingheら, (1992) Quisqualic acid analogues: synthesis of bela-heterocyclic 2- aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-senitized site. J. Med. Chem. 35:4602-7」が挙げられる。また、参照によって本明細書に組み込まれる「Protein Arrays」と題された米国特許第2004/0198637号明細書を参照のこと。
‐Ａ．カルボニル反応基‐
カルボニル反応基を有するアミノ酸は、求核付加を介して分子（例としては、ＰＥＧまたは他の水溶性分子が挙げられるが、これらに限定されない）を連結する多様な反応、または特にアルドール縮合反応を可能にする。
例示的なカルボニル含有アミノ酸は、以下のように表され得る：
Figure 2009523815
 （ここで、ｎは０−１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリールであり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｒ２は単純アルキル（すなわち、メチル、エチルまたはプロピル）であり、ケトン部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置されている。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｒ２は単純アルキル（すなわち、メチル、エチルまたはプロピル）であり、ケトン部分は、アルキル側鎖に対してメタ位に位置されている。
ｐ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンおよびｍ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンの合成は、参照によって本明細書に組み込まれる「Zhang, Z.ら, Biochemistry 42: 6735-6746 (2003)」に記載されている。他のカルボニル含有アミノ酸は、当業者によって同様に調製され得る。
いくつかの実施形態において、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドは、化学的に修飾されて、反応性のカルボニル官能基を生成する。例えば、接合反応に有用なアルデヒド機能性基は、隣接するアミノ基とヒドロキシル基とを有する機能性基から生成され得る。生物活性分子がポリペプチドである場合に、例えば、Ｎ末端セリンまたはスレオニン（通常に存在し得る、または化学的もしくは酵素的な消化を介して露出され得る）は、過ヨウ素酸塩を用いた穏やかな酸化切断条件においてアルデヒド機能性基を生成するために使用され得る。例えば、「Gaertner, et ah, Bioconjug. Chem. 3: 262-268 (1992) 」；「Geoghegan, K. & Stroh, J., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992) 」；「Gaertner ら, J. Biol. Chem. 269:7224-7230 (1994) 」を参照のこと。しかし、当該技術において公知の方法は、ペプチドまたはタンパク質のＮ末端におけるアミノ酸に制限される。
本発明において、隣接するヒドロキシル基とアミノ基とを有する非天然にコードされたアミノ酸アミノ酸は、「マスクされた」アルデヒド機能性基としてポリペプチドに組み込まれ得る。例えば、５−ヒドロキシリジンは、イプシロンアミンと隣接するヒドロキシル基を有する。アルデヒドを生成する反応条件は、典型的に、ポリペプチド内の他の部位における酸化を回避するための穏やかな反応条件において、過剰なモル濃度のメタ過ヨウ素酸ナトリウムの添加に関する。酸化反応のｐＨは、典型的に約７．０である。典型的な反応は、ポリペプチド緩衝化溶液に対する、１．５モル濃度を超えるメタ過ヨウ素酸ナトリウムの添加に続いて、暗所における約１０分間のインキュベーションに関する。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，４２３，６８５号明細書を参照のこと。
カルボニル機能性基は、水性溶液における穏やかな条件の下に、ヒドラジン含有試薬、ヒドラジド含有試薬、ヒドロキシアミン含有試薬、またはセミカルバジド含有試薬と選択的に反応して、生理学的条件においてそれぞれに安定な対応するヒドラゾン、オキシム、またはセミカルバジドの連結を形成し得る。例えば、「Jencks, W. P., J. Am. Chem. Soc. 81, 475-481 (1959) 」；「Shao, J. and Tarn, J. P., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995) 」を参照のこと。さらに、カルボニル基の固有な反応性は、他のアミノ酸側鎖の存在下において選択的な修飾を可能にする。例えば、「Cornish, V. W., ら, J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151 (1996) 」；「Geoghegan, K. F. & Stroh, J. G., Bioconjug. Chem. 3:138-146 (1992) 」；「Mahal, L. K., ら, Science 276:1125-1128 (1997) 」を参照のこと。
‐Ｂ．ヒドラジン、ヒドラジド、またはセミカルバジド反応基‐
求核性基（例えば、ヒドラジン、ヒドラジドまたはセミカルバジド）を含んでいる非天然にコードされたアミノ酸は、ＰＥＧまたは他の水溶性ポリマー（例として挙げられるが、これらに限定されない）との接合体を形成するための多様な求電子基との反応を可能にする。
例示的なヒドラジン含有アミノ酸、ヒドラジド含有アミノ酸、またはセミカルバジド含有アミノ酸は、以下のように表され得る：
Figure 2009523815
 （ここで、ｎは０−１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであるか、または存在せず；Ｘは、Ｏ、ＮまたはＳであるか、または存在せず；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）。
いくつかの実施形態において、ｎは４であり、Ｒ１は存在せず、ＸはＮである。いくつかの実施形態において、ｎは２であり、Ｒ１は存在せず、Ｘは存在しない。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、酸素原子は、アリール環上におけるアルファティック（alphatic）基に対してパラに位置されている。
ヒドラジド含有アミノ酸、ヒドラジン含有アミノ酸、またはセミカルバジド含有アミノ酸は、市販の供給源から利用可能である。例えば、Ｌ−グルタミン酸−γ−ヒドラジドは、Sigma Chemical（St. Louis, MO）から入手可能である。市販されていない他のアミノ酸は、当業者によって調製され得る。例えば、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第６，２８１，２１１号明細書を参照のこと。
ヒドラジド、ヒドラジンまたはセミカルバジド機能性基を有する非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドは、アルデヒドまたは類似の化学反応性を有する他の官能基を含む多様な分子と効率的かつ選択的に反応し得る。例えば、「Shao, J. and Tarn, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995)」を参照のこと。ヒドラジド、ヒドラジンおよびセミカルバジド官能基の固有な反応性は、通常の２０のアミノ酸に存在する求核性基（例としては、セリンもしくはスレオニンのヒドロキシ基、またはリジンとＮ末端とのアミノ基が挙げられるが、これらに限定されない）と比較して、アルデヒド、ケトンおよび他の求電子性基に対してより著しい反応を起こさせる。
‐Ｃ．アミノオキシ含有アミノ酸‐
アミノオキシ（ヒドロキシアミンとも呼ばれる）基を含んでいる非天然にコードされたアミノ酸は、ＰＥＧまたは他の水溶性ポリマー（例として挙げられるが、これらに限定されない）との接合体の形成するための求電子性基との反応を可能にする。ヒドラジン、ヒドラジドおよびセミカルバジドと同様に、アミノオキシ基の増強された求核性は、アミノオキシ基がアルデヒドまたは類似の化学反応性を有する他の官能基と効率的かつ選択的に反応することを可能にする。例えば、「Shao, J. and Tarn, J., J. Am. Chem. Soc. 117:3893-3899 (1995)」；「H. Hang and C. Bertozzi, Ace. Chem. Res. 34: 727-736 (2001) 」を参照のこと。ヒドラジン基との反応の結果は、対応するヒドラゾンであるが、これに対してオキシムは、一般的にカルボニル含有基（例えば、ケトン）とアミノオキシ基の反応から生じる。
例示的なアミノオキシを含んでいるアミノ酸は、以下のように表され得る：
Figure 2009523815
 （ここで、ｎは０−１０であり、Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、または置換アリールであるか、または存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、またはＳであるか、または存在せず；ｍは０−１０であり；ＹはＣ（Ｏ）であるか、または存在せず；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは１であり、Ｙは存在する。いくつかの実施形態において、ｎは２であり、Ｒ１およびＸは存在せず、ｍは０であり、Ｙは存在しない。
アミノオキシ含有アミノ酸は、容易に入手可能なアミノ酸前駆体（ホモセリン、セリンおよびスレオニン）から容易に調製され得る。例えば、「M. Carrasco and R. Brown, J. Org. Chem. 68: 8853-8858 (2003) 」を参照のこと。ある種のアミノオキシ含有アミノ酸（例えば、Ｌ−２−アミノ−４−（アミノオキシ）ブチル酸）は、天然の供給源から単離されている（Rosenthal, G, Life Sci. 60: 1635-1641 (1997)）。他のアミノオキシ含有アミノ酸は、当業者によって調製され得る。
‐Ｄ．アジドおよびアルキン反応基‐
アジド官能基およびアルキル官能基の固有な反応性を利用することにより、アジド官能基およびアルキル官能基を、ポリペプチドおよび他の生体分子の選択的な修飾に、非常に良好に役立てることができる。有機アジド、特にアルファティックアジド、およびアルキンは、通常の反応性の化学的条件に対して一般的に安定である。特に、アジド官能基およびアルキン官能基の両方は、天然に生じるポリペプチドに見られる通常の２０のアミノ酸の側鎖（すなわち、Ｒ基）に対して不活性である。しかし、非常に近づくと、アジド基およびアルキン基の「ばね荷重」性質が現れ、それらは、ヒュイゲン（Ｈｕｉｓｇｅｎ）［３＋２］環付加反応を介して選択的かつ効率的に反応して、対応するトリアゾールを生成する。例えば、「Chin J., ら, Science 301 :964-7 (2003)」；「Wang, Q,, ら, J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003) 」；「Chin, J. W., ら, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002) 」を参照のこと。
Ｈｕｉｓｇｅｎ環付加反応が、求核置換よりむしろ選択的な環付加反応に関与するので（例えば、「Padwa, A., in COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS, Vol. 4, (ed. Trost, B. M., 1991), p. 1069-1109」；「Huisgen, R. in 1,3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY, (ed. Padwa, A., 1984), p. 1-176」を参照のこと）、アジド含有側鎖およびアルキン含有側鎖を有する非天然にコードされたアミノ酸の組み込みは、結果として生じるポリペプチドが非天然にコードされたアミノ酸の位置において修飾されることを可能にする。アジド含有ポリペプチドまたはアルキン含有ポリペプチドに関する環付加反応は、室温において水性条件の下に、Ｃｕ（ＩＩ）（例としては、触媒量のＣｕＳＯ４の形態が挙げられるが、これに限定されない）の付加によって、インサイチュー（in situ）においてＣｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）に還元する触媒量の還元物質の存在下において、達成され得る。例えば、「Wang, Q., ら, J. Am. Chem. Soc. 125, 3192-3193 (2003) 」；「Tornoe, C. W., ら, J. Org. Chem. 67:3057-3064 (2002) 」；「Rostovtsev, ら, Angew. Chem. Int. Ed. 41:2596-2599 (2002) 」を参照のこと。例示的な還元物質の例としては、アスコルビン酸塩、金属銅、キニーネ、ヒドロキノン、ビタミンＫ、グルタチオン、システイン、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋および印加された電位が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの場合において、アジドとアルキンとの間におけるＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環付加反応が所望される場合に、ポリペプチドは、アルキン部分を含んでいる非天然にコードされたアミノ酸を含み、当該アミノ酸に接着されるべき水溶性ポリマーは、アジド部分を含んでいる。また代替可能に、逆反応（すなわち、アミノ酸上におけるアジド部分および水溶性ポリマー上に存在するアルキン部分を用いた）も達成され得る。
また、アジド官能基は、アリールエステルを含んでいる水溶性ポリマーと選択的に反応し、かつアリールホスフィン部分により適切に官能基化されて、アミド連結を生成する。アリールホスフィン基はインサイチューにおいてアジドを還元し、その結果として生じたアミンは近接するエステル連結と効率的に反応して、対応するアミドを生成する。例えば、「E. Saxon and C. Bertozzi, Science 287, 2007-2010 (2000) 」を参照のこと。アジド含有アミノ酸は、アルキルアジド（例としては、２−アミノ−６−アジド−１−ヘキサン酸が挙げられるが、これに限定されない）またはアリールアジド（ｐ−アジド−フェニルアラニン）のいずれかであり得る。
アリールエステルおよびホスフィン部分を含んでいる、例示的な水溶性ポリマーは、以下のように示さ表され得る：
Figure 2009523815
 （ここで、Ｘは、Ｏ、Ｎ、またはＳであり得るか、または存在し得ず、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性ポリマーであり、Ｒは、Ｈ、アルキル基、アリール基、置換アルキル基および置換アリール基であり得る）。例示的なＲ基の例としては、−ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＮ、および−ＮＯ２が挙げられるが、これらに限定されない。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’のそれぞれは、独立して、水素基、置換もしくは非置換のヘテロアルキル基、置換もしくは非置換のアリール基（例としては、１−３のハロゲンと置換されたアリールが挙げられるが、これに限定されない）、置換もしくは非置換のアルキル基、アルコキシ基もしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が２つ以上のＲ基を含んでいる場合に、例えば、２つ以上のこれらの基が存在する場合に、Ｒ基のそれぞれは、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’およびＲ’’’’のそれぞれであるように、独立して選択される。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に接着する場合、それらは、窒素原子と組み合わさって、５−、６−、７−員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、１−ピロリジニルおよび４−モルホリニルを含むが、これらに限定されないことが意図される。置換基の上述の議論から、当業者は、用語「アルキル」は、特に限定されないが、ハロアルキル（−ＣＦ３および−ＣＨ２ＯＣＨ３が含まれるが、これらに限定されない）およびアシル（−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、および−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３が含まれるが、これらに限定されない）などの、水素基以外の基と結合された炭素原子を含む基を包含することを意図していると理解する。
また、アジド官能基は、チオエステルを含んでいる水溶性ポリマーと選択的に反応し、かつアリールホスフィン部分を用いて適切に機能付与されて、アミド連結を生成し得る。アリールホスフィン基は、インサイチューにおいてアジドを還元し、その結果として生じるアミンは、チオエステル連結と効率的に反応して、対応するアミドを生成する。チオエステル部分およびホスフィン部分を含んでいる例示的な水溶性ポリマーは、以下のように表され得る：
Figure 2009523815
 （ここで、ｎは１−１０であり、ＸはＯ、Ｎ、またはＳであり得るか、または存在し得ず、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性ポリマーである）。
例示的なアルキン含有アミノ酸は、以下のように表され得る：
Figure 2009523815
 （ここで、ｎは０−１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキルまたは置換アリールであるか、または存在せず；Ｘは、Ｏ、ＮまたはＳであるか、存在せず；ｍは０−１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはカルボキシ末端修飾基である）。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｘは存在せず、ｍは０であり、アセチレン部分はアルキル側鎖に対してパラ位に位置されている。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは１であり、プロパルギロキシ基は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置されている（すなわち、プロパルギル−チロシン）。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１およびＸは存在せず、ｍは０である（すなわち、プロパリルグリシン）。
アルキン含有アミノ酸は、市販されている。例えば、プロパルギルグリシンは、Ｐｅｐｔｅｃｈ（Burlington, MA）から市販されている。代替可能に、アルキン含有アミノ酸は、標準的な方法に従って調製され得る。例えば、ｐ−プロパルギロキシフェニルアラニンは、例えば、「Deiters, A.ら, J. Am. Chem. Soc. 125: 11782-11783 (2003) 」に記載されているように合成され得、かつ４−アルキニル−Ｌ−フェニルアラニンは、「Kayser, B., ら, Tetrahedron 53(7): 2475-2484 (1997) 」に記載されているように、合成され得る。他のアルキン含有アミノ酸は、当業者によって調整され得る。
例示的なアジド含有アミノ酸は、以下のように表され得る：
Figure 2009523815
 （ここで、ｎは０−１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキルまたは置換アリールであるか、または存在せず；Ｘは、Ｏ、ＮまたはＳであるか、または存在せず；ｍは０−１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド、またはアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチドまたはカルボキシ末端修飾基である）。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｘは存在せず、ｍは０であり、アジド部分は、アルキル側鎖に対してパラに位置されている。いくつかの実施形態において、ｎは０−４であり、Ｒ１およびＸは存在せず、ｍ＝０である。いくつかの実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは２であり、β−アジドエトキシ部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置されている。
アジド含有アミノ酸は、商業的な供給源から入手可能である。例えば、４−アジドフェニルアラニンは、Chem-Impex International Inc.,(Wood Dale, IL)から入手され得る。市販されていないこれらのアジド含有アミノ酸に関して、アジド基は、適切な脱離基（例としては、ハロゲン化物、メシラート、トシレートが挙げられるが、これらに限定されない）の排除を介した、または適切に保護されたラクトンの開環を介した（例として挙げられるが、これらに限定されない）、当業者に公知の標準的な方法を用いて、比較的容易に調製され得る。例えば、「Advanced Organic Chemistry by March (Third Edition, 1985, Wiley and Sons, New York)」を参照のこと。
‐Ｅ．アミノチオール反応基‐
ベータ置換アミノチオール官能基の固有な反応性は、チアゾリジンの形成を介したアルデヒド基を含んでいるポリペプチドおよび他の生体分子の選択的な修飾に、それらを極めて有効にする。例えば、「Shao and J. Tarn, J. Am. Chem. Soc. 1995, 1 17 (14) 3893-3899」を参照のこと。いくつかの実施形態において、ベータ置換アミノチオールアミノ酸は、ポリペプチドに組み込まれ得、かつそれからアルデヒド機能性基を含んでいる水溶性ポリマーと反応し得る。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマー、薬剤接合体または他のペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）は、チアゾリジンの形成を介したベータ置換アミノチオールアミノ酸を含んでいるポリペプチドに対して結合され得る。
（非天然アミノ酸の細胞性の取り込み）
細胞による非天然アミノ酸の取り込みは、タンパク質への取り込みを目的として（例として挙げられるが、これに限定されない）、非天然アミノ酸を設計および選択するときに典型的に考慮される１課題である。例えば、α−アミノ酸の高い電荷密度は、これらの化合物が細胞透過性ではあり得ないことを示唆する。天然アミノ酸は、タンパク質に基づく輸送系の収集を介して真核細胞に取り込まれる。非天然アミノ酸が少しでも細胞によって取り込まれるならば、これを評価する急速なふるいが行われ得る。例えば、「Protein Arrays」と題された米国出願公開第２００４／１９８６３７号明細書（参照によってその全体が本明細書に組み入れられる）、および「Liu, D.R. & Schultz, P.G. (1999) Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code. PNAS United States 96:4780-4785 」における、例えば、毒性アッセイを参照のこと。取り込みは、多様なアッセイを用いて容易に分析されるが、細胞性の取り込み経路に受け容れられる非天然アミノ酸の設計ための代替案は、インビボにおいてアミノ酸を作り出す生合成経路を提供することである。
（非天然アミノ酸の生合成）
多くの生合成経路が、アミノ酸および他の化合物を産生するために細胞にすでに存在している。特定の非天然アミノ酸用の生合成方法は、天然（例としては、細胞内が挙げられるが、これに限定されない）に存在し得ない一方で、本明細書に記載の方法および組成物は、そのような方法を提供する。例えば、非天然アミノ酸用の生合成経路は、新しい酵素の添加、または存在する宿主細胞経路の修飾によって宿主細胞において生成され得る。追加の新しい酵素は、天然に生じる酵素または人工的に発展させた酵素であり得る。例えば、ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成（「In vivo incorporation of unnatural amino acids」と題された国際公開第２００２／０８５９２３号パンフレットにおける一例に示されるように）は、他の生物に由来する公知の酵素の組み合わせの追加を基にしている。これらの酵素に関する遺伝子は、当該遺伝子を備えるプラスミドを用いた真核細胞の形質転換によって当該細胞に導入され得る。細胞において発現した場合に、当該遺伝子は、所望の化合物を合成する酵素経路を提供する。任意に添加されるこの種の酵素の例は、以下の例に規定される。追加の酵素の配列は、例えば、ジーンバンクに見出される。また、人工的に発展させた酵素は、同様の方法において細胞の中に加えられ得る。この方法において、細胞性機構、および細胞資源は、非天然アミノ酸を産生するために操作される。
多様な方法が、生合成経路に使用するための新規な酵素の産生、または存在する経路の発展に利用可能である。例えば、Maxygen, Inc.（www.maxigen.comにおけるワールドワイドウェブ上において利用可能である）によって開発されたような（例として挙げられるが、これに限定されない）、反復的な組み換えは、新規の酵素および経路の開発に使用され得る。例えば、「Stemmer (1994), Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling, Nature 370(4):389- 391」、および「Stemmer, (1994), DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: In vitro recombination for molecular evolution, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91:10747-10751」を参照のこと。同様に、Genencor（genencor.comにおけるワールドワイドウェブ上において利用可能である）によって開発されたDesignPath（登録商標）は、代謝経路操作（例としては、細胞において非天然アミノ酸を作り出す経路の操作が挙げられるが、これに限定されない）に任意に使用される。この技術は、新しい遺伝子（例としては、機能的なゲノミクスを介して同定された遺伝子が挙げられるが、これに限定されない）、ならびに分子進化および設計の組み合わせを用いて、宿主生物に存在する経路を再構築する。また、Diversa Corporation（diversa.comにおけるワールドワイドウェブ上において利用可能である）は、新しい経路を作り出すための（例として挙げられるが、これに限定されない）、遺伝子および遺伝子経路のライブラリーを迅速にスクリーニングする技術を提供する。
典型的に、本発明の設計された生合成経路を用いて産生された非天然アミノ酸は、タンパク質の効率的な生合成に十分な濃度（例としては、天然の細胞における量が挙げられるが、これに限定されない）に産生されるが、他のアミノ酸の濃度に影響する、または細胞性の資源を使い果たす程ではない。この方法においてインビボにおいて生成される典型的な濃度は、約１０ｍＭから０．０５ｍＭである。特定の経路に関して所望される酵素の生成に使用される遺伝子を備えるプラスミドを用いて、細胞が形質転換され、かつ非天然アミノ酸が生成されると、インビボにおける選択は、リボソームタンパク質の合成および細胞増殖の両方に対して、非天然アミノ酸の産生をさらに最適化するために、任意に使用される。
（非天然アミノ酸を有するポリペプチド）
非天然アミノ酸の組み込みは、多様な目的（例としては、タンパク質構造および／または機能の変化の修正、大きさの変更、酸性度の変更、求核性の変更、水素結合の変更、疎水性の変更、プロテアーゼ標的部位の接触性の変更、部分に対する標的化の変更（例としては、タンパク質アレイ用が挙げられるが、これに限定されない）、生物活性分子の付加、ポリマーの接着、放射性核種の接着、血清中半減期の修飾、組織透過性（例えば、腫瘍）の修飾、活性な輸送の修飾、組織、細胞もしくは器官の特徴または分布の修飾、免疫原性の修飾、プロテアーゼ耐性の修飾などが挙げられるが、これらに限定されない）のためになされ得る。非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質は、増強されたもしくはまったく新しい触媒的、または生物学的な性質を有し得る。例えば、以下の性質は、タンパク質への非天然アミノ酸の含有によって任意に修飾される：毒性、体内分布、構造的性質、分光性質、化学的および／または光化学的な性質、触媒能、半減期（例としては、血清中半減期が挙げられるが、これに限定されない）、ならびに他の分子との共有結合的または非共有結合的な（例として挙げられるが、これらに限定されない）反応能など。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質を含有している組成物は、新規の治療、診断、触媒酵素、産業的なタンパク質（例としては、抗体が挙げられるが、これに限定されない）、ならびにタンパク質の構造および機能に関する研究（例として挙げられるが、これらに限定されない）に有用である。例えば、「Dougherty, (2000) Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function, Current Opinion in Chemical Biology, 4:645-652」を参照のこと。
本発明の１態様において、少なくとも１（例としては、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０以上が挙げられるが、これらに限定されない）の非天然アミノ酸を有する、少なくとも１つのタンパク質を含む。非天然アミノ酸は、同じであってもよいし、異なっていてもよい。例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なる非天然アミノ酸を含んでいる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の異なる部位が、タンパク質に存在し得る。他の態様において、タンパク質に存在する特定のアミノ酸の、すべてではないが、少なくとも１つが非天然アミノ酸で置換されているタンパク質を含む。２つ以上の非天然アミノ酸を有する所定のタンパク質に関して、当該非天然アミノ酸は同一であり得るか、異なり得る（例としては、タンパク質が２つ以上の異なる種類の非天然アミノ酸を含み得るか、２の同じ非天然アミノ酸を含み得ることが挙げられるが、これらに限定されない）。３つ以上の非天然アミノ酸を有する所定のタンパク質に関して、当該非天然アミノ酸は、同じであり得るか、異なり得るか、または少なくとも１つの非天然アミノ酸と複数の同種の非天然アミノ酸との組み合わせであり得る。
少なくとも１つの非天然アミノ酸を有する興味のあるタンパク質またはポリペプチドは、本発明の特徴である。また、本発明は、本発明の組成物および方法を用いて産生された少なくとも１つの非天然アミノ酸を有する、タンパク質またはポリペプチドを包含する。また、賦形剤（例としては、薬学的に許容可能な賦形剤が挙げられるが、これに限定されない）は、タンパク質とともに存在し得る。
非天然アミノ酸を有する興味のあるタンパク質またはポリペプチドを、真核細胞において産生することによって、タンパク質またはポリペプチドは、翻訳後修飾を一般的に含んでいる。ある種の実施形態では、タンパク質は、少なくとも１つの非天然アミノ酸、および真核細胞によってインビボにおいてなされた少なくとも１つの翻訳後修飾を含み、ここで、当該翻訳後修飾は、原核細胞によってなされないものである。例えば、翻訳後修飾の例としては、グリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、糖脂質連結修飾、およびグリコシル化などが挙げられるが、これらに限定されない。１態様において、翻訳後修飾の例としては、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン連結による、アスパラギンに対するオリゴサッカライド（（ＧｌｃｎＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃなどが挙げられるが、これに限定されない）の接着が挙げられる。真核細胞のＮ結合オリゴサッカライドのいくつかの例を載せている表１を参照のこと（付加的な残基が存在し得るが、示されていない）。他の態様において、翻訳後修飾の例としては、ＧａｌＮＡｃ−セリン連結もしくはＧａｌＮＡｃ−スレオニン連結、またはＧｌｃＮＡｃ−セリン連結もしくはＧｌｃＮＡｃスレオニン連結による、セリンまたはスレオニンに対するオリゴサッカライド（Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなどが挙げられるが、これらに限定されない）の接着が挙げられる。
Figure 2009523815
 さらにもう１態様において、翻訳後修飾の例としては、前駆体（例としては、カルシトニン前駆体、カルシトニン遺伝子関連ペプチド前駆体、プレプロ副甲状腺ホルモン（preproparathyriod hormone）、プレプロインシュリン、プロインシュリン、プレプロオピオメラノコルチン、およびプロオピオメラノコルチンなどが挙げられるが、これらに限定されない）のタンパク質分解性のプロセシング、多サブユニットタンパク質への集合もしくは巨大分子への集合、細胞における他の部位（例としては、細胞小器官（例えば、小胞体、ゴルジ装置、核、リソソーム、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、葉緑体、液胞など）または分泌経路の通過が挙げられるが、これらに限定されない）への移動が挙げられる。ある種の実施形態において、タンパク質は、分泌配列または局在化配列である、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、またはＧＳＴ融合などを備える。参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４，９６３，４９５号明細書および米国特許第６，４３６，６７４号明細書には、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）ポリペプチドの分泌を向上するために設計された構築物について詳細に説明されている。
非天然アミノ酸の１の利点は、非天然アミノ酸が、付加的な分子の付加に使用され得る付加的な化学部分を与えることである。これらの修飾は、真核細胞もしくは原核細胞のインビボにおいて、またはインビトロにおいてなされ得る。従って、ある種の実施形態において、翻訳後修飾は非天然アミノ酸を介する。例えば、翻訳後修飾は、求核−求電子反応を介し得る。タンパク質の選択的な修飾に現在、使用されるほとんどの反応は、求核反応パートナーと求電子反応パートナーとの間における共有結合（例としては、α−ハロケトンのヒスチジン側鎖またはシステイン側鎖との反応が挙げられるが、これらに限定されない）の形成に関する。これらの場合における選択性は、タンパク質における求核性残基の数および接触性によって決定される。本発明のタンパク質において、他のより選択的な反応は、例えば、非天然ケトアミノ酸の、ヒドラジドまたはアミノオキシ化合物との反応に使用され得る。例えば、すべてが参照によって本明細書に組み込まれる、「Cornishら, (1996) J. Am. Chem. Soc. 118:8150-8151」；「Mahalら, (1997) Science. 276:1125-1128」；「Wangら, (2001) Science 292:498-500」；「Chinら, (2002) J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027」；「Chinら, (2002) Proc. Natl. Acad. ScL 99: 11020-11024」；「Wangら, (2003) Proc. Natl. Acad. ScL 100:56-61」；「Zhangら, (2003) Biochemistry. 42:6735-6746」；および「Chinら, (2003) Science. 301:964-7」を参照のこと。これは、多くの試薬（例としては、蛍光団、架橋剤、サッカライド誘導体および細胞毒性分子が挙げられるが、これらに限定されない）を用いたほとんどあらゆるタンパク質の選択的な標識を可能にする。また、参照によって本明細書に組み込まれる、「Glycoprotein synthesis」と題された米国特許第６，９２７，０４２を参照のこと。また、アジドアミノ酸を介した（例として挙げられるが、これに限定されない）翻訳後修飾は、トリアリールホスフィン試薬を用いた（例として挙げられるが、これに限定されない）シュタウディンガー連結を介してなされ得る。例えば、「Kiickら, (2002) Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation, PNAS 99: 19-24」を参照のこと。
本発明は、セレクターコドンに応じてタンパク質にアジド部分またはアルキニル部分（例として挙げられるが、これらに限定されない）を含んでいる非天然アミノ酸の遺伝子的組み込みに関する、タンパク質の選択的な修飾のための他の高効率な方法を提供する。それから、これらのアミノ酸側鎖は、アジド誘導体またはアルキニル誘導体（例として挙げられるが、これらに限定されない）を別々に用いて、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環付加反応（例として挙げられるが、これに限定されない）（例えば、「Padwa, A. in Comprehensive Organic Synthesis. Vol. 4. (1991) Ed. Trost, B. M., Pergamon, Oxford, p. 1069-1109」；および「Huisgen, R. in 1 ,3-Dipolar Cycloaddition Chemistry. (1984) Ed. Padwa, A., Wiley, New York, p. 1-176」を参照のこと）によって修飾され得る。この方法は、求核性置換よりむしろ環付加に関するので、タンパク質は極めて高い選択性を有して修飾され得る。この反応は、反応混合物に対する触媒量のＣｕ（Ｉ）塩の添加によって、水性条件の下に室温において、優れた位置選択性（１，４＞１，５）を有して達成され得る。例えば、「Tornoeら, (2002) J. Org. Chem. 67:3057-3064」；および「Rostovtsevら, (2002) Angew. Chem. Int. Ed. 41: 2596-2599」を参照のこと。使用され得る他の方法は、テトラシステインモチーフを有するビス砒素化合物におけるリガンド交換である（例えば、「Griffinら, (1998) Science 281 :269-272」を参照のこと）。
［３＋２］環付加を介して本発明のタンパク質に加えられ得る分子としては、アジド誘導体またはアルキニル誘導体を有するほとんどあらゆる分子が挙げられる。分子の例としては、色素、蛍光団、架橋剤、サッカライド誘導体、ポリマー（例としては、ポリエチレングリコールの誘導体が挙げられるが、これに限定されない）、光架橋剤、細胞毒性化合物、親和性標識、ビオチンの誘導体、樹脂、ビーズ、もう１のタンパク質もしくはポリペプチド（もしくはそれ以上）、ポリヌクレオチド（例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが挙げられるが、これらに限定されない）、金属キレート剤、共同因子、脂肪酸、および炭水化物などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの分子は、アルキニル基（例としては、ｐ−プロパルギロキシフェニルアラニンが挙げられるが、これに限定されない）またはアジド基（例としては、ｐ−アジド−フェニルアラニンが挙げられるが、これらに限定されない）を別々に有する非天然アミノ酸に加えられ得る。
＜Ｖ．非遺伝的にコードされたアミノ酸を備えるポリペプチドのインビボにおける生成＞
本発明のポリペプチドは、天然に生じる系にコードされないアミノ酸を加えるか、または置換するために、修飾ｔＲＮＡおよび修飾ｔＲＮＡシンテターゼを用いてインビボにおいて生成され得る。
天然に生じる系においてコードされないアミノ酸を使用するｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンテターゼを生成する方法は、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０４５，３３７号明細書、および７，０８３，９７０号明細書に記載されている。これらの方法は、翻訳系に対して内在性のシンテターゼおよびｔＲＮＡと独立して機能する（そして、このためにときに「直交」と呼ばれる）翻訳機構の生成を含んでいる。典型的に、当該翻訳系は、直交化ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）および直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含んでいる。典型的に、Ｏ−ＲＳは、翻訳系における少なくとも１つの非天然に生じるアミノ酸を用いてと、Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化し、Ｏ−ｔＲＮＡは、当該系における他のｔＲＮＡによって認識されない少なくとも１つのセレクターコドンを認識する。これによって、当該翻訳系は、コードされたセレクターコドンに応じて、当該系において産生されるタンパク質に非天然にコードされたアミノ酸を挿入する。このようにして、コードされたポリペプチドにおける所定の位置にアミノ酸が「置換される」。
広範な直交化ｔＲＮＡおよびアミノアシルｔＲＮＡは、ポリペプチドに特定の合成アミノ酸を挿入する当該技術において説明されており、かつ一般的に本発明における使用に好適である。例えば、ケト特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、「Wang, L.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:56-61 (2003) 」、および「Zhang, Z.ら, Biochem. 42(22):6735-6746 (2003)」に記載されている。例示的なＯ−ＲＳまたはこれらの一部は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，０４５，３３７号明細書、および米国特許第７，０８０，９７０号明細書に開示のアミノ酸配列を含んでおり、またそれら文献に開示のポリヌクレオチド配列にコードされている。また、Ｏ−ＲＳとともに使用するための対応するＯ−ｔＲＮＡ分子は、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０４５，３３７号明細書、および米国特許第７，０８３，９７０号明細書に記載されている。
アジド特異的なＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの系の例が、「Chin, J. W., ら, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002) 」に記載されている。ｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅ用の例示的なＯ−ＲＳ配列の例としては、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，０８３，９７０号明細書に記載されているように、配列番号１４−１６および２９−３２のヌクレオチド配列、ならびに配列番号４６−４８および６１−６４のアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の使用に好適な例示的なＯ−ｔＲＮＡ配列の例としては、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，０８３，９７０号明細書に開示されているように、配列番号１−３のヌクレオチド配列が挙げられるが、これらに限定されない。特定の非天然にコードされたアミノ酸に対して特異的なＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの他の例が、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第７，０４５，３３７号明細書に記載されている。S. cerevisiaeにおいてケト含有アミノ酸およびアジド含有アミノ酸の両方を組み込む、Ｏ−ＲＳおよびＯ−ｔＲＮＡは、「Chin, J. W.ら, Science 301 :964-967 (2003). 」に記載されている。
様々な他の直交化の対が報告されている。S. cerevisiaeのｔＲＮＡおよびシンテターゼから由来する、グルタミニル系（例えば、「Liu, D. R., and Schultz, P. G. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96:4780-4785」を参照のこと）、アスパルチル系（例えば、「Pastrnak, M.ら, (2000) HeIv. Chim. Acta 83:2277-2286」を参照のこと）、およびチロシル系（例えば、「Ohno, S.ら, (1998) J. Biochem. (Tokyo. Jpn.) 124:1065-1068」；および「Kowal, A. K.ら, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:2268-2273」を参照のこと）が、E. coliにおける非天然アミノ酸の見込みのある組み込みについて記載されている。E. coliのグルタミニルシンテターゼ（例えば、「Kowal, A. K.ら, (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98:2268-2273」を参照のこと）、およびチロシルシンテターゼ（例えば、「Edwards, H., and Schimmel, P. (1990) MoI. Cell. Biol. 10:1633-1641」を参照のこと）に由来する系は、S. cerevisiaeにおける使用に関して記載されている。E. coliのチロシル系は、哺乳類細胞における、３−ヨード−Ｌ−チロシンのインビボにおける組み込みに使用されている。「Sakamoto, K.ら, (2002) Nucleic Acids Res. 30:4692-4699」を参照のこと。
Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの使用は、非天然にコードされたアミノ酸をコードする特異的なコドンの選択に関与する。あらゆるコドンが使用され得るが、一般的にＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが発現されている細胞において、まれにしか使用されないか、または決して使用されないコドンを選択することが好ましい。例えば、例示的なコドンとしては、ナンセンスコドン（例えば、ストップコドン（アンバー、オーカー、およびオパール））、４塩基以上のコドン、ならびにまれにしか使用されない、または使用されない他の天然の３塩基コドンが挙げられる。
特異的なセレクターコドンは、当該技術において公知の突然変異誘発方法（例としては、部位特異的突然変異誘発法、カセット突然変異誘発法、制限選択突然変異誘発法などが挙げられるが、これらに限定されない）を用いて、ポリヌクレオチドコード配列における適切な位置に導入され得る。
タンパク質の生合成機構の構成要素（例えば、非天然アミノ酸を組み込むために使用され得るＯ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡおよびＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対）を生成する方法は、「Wang, L.,ら Science 292: 498-500 (2001)」;「Chin, J. W.ら, J. Am. Chem. Soc. 124:9026-9027 (2002) 」；「Zhang, Z.ら, Biochemistry 42: 6735-6746 (2003) 」に記載されている。非天然アミノ酸のインビボにおける組み込みのための方法および組成物は、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０４５，３３７号明細書に記載されている。また、生体のインビボにおける翻訳系に使用する直交化ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼ対を選択する方法は、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第７，０４５，３３７号明細書、および米国特許第７，０８３，９７０号明細書に記載されている。その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、「Site Specific Incorporation of Keto Amino Acids into proteins」と題された国際公開第０４／０３５７４３号パンフレットには、ケトアミノ酸の組み込み用の直交化ＲＳおよびｔＲＮＡ対について記載されている。その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、「Expanding the Eukaryotic Genetic Code」と題された国際公開第０４／０９４５９３号パンフレットには、真核宿主細胞における非天然にコードされたアミノ酸の組み込み用の直交化ＲＳおよびｔＲＮＡ対について記載されている。
少なくとも１つの組み換え直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を製造する方法は、（ａ）第１生物からの少なくとも１つのアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）に由来するＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーを生成する工程、（ｂ）非天然にコードされたアミノ酸と天然アミノ酸との存在下において、直交化ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化するメンバーについて、ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーを選択（および／またはスクリーニング）して、活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）のプールを提供する工程、および／または、（ｃ）非天然にコードされたアミノ酸の非存在下において、Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性型ＲＳ（ＲＳの突然変異体の活性型など）のプールを選択して、少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを提供する工程を含んでおり、上記少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳは、非天然にコードされたアミノ酸を用いてＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する、方法である。上記第１生物は、例えば、原核生物（Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, またはT. thermophilusなど）、あるいは、真核生物である。上記（ｃ）工程では、必要に応じて、陰性選択により、活性型ＲＳ（ＲＳの突然変異体の活性型など）のプールを選択してもよい。
一実施形態では、ＲＳは、不活性型ＲＳである。活性型ＲＳを突然変異させることにより、不活性型ＲＳを生成することができる。例えば、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、または少なくとも約１０、あるいはそれ以上のアミノ酸を、異なるアミノ酸（アラニンなど）に突然変異させることにより、不活性型ＲＳを生成することができる。
技術的に公知の様々な技術を用いて、ＲＳの突然変異体のライブラリーを生成することができる。そのような技術として、例えば、（１）ＲＳについてのタンパク質の３次元構造に基づく合理的設計、または（２）無作為的技術もしくは合理的設計技術におけるＲＳヌクレオチドの突然変異誘発法が挙げられる。例えば、部位特異的突然変異誘発法、ランダム突然変異誘発法、多様性を生成する組み換え突然変異誘発法、キメラコンストラクト、合理的設計、および本明細書に記載の方法または技術的に公知の方法によって、ＲＳの突然変異体を生成することができる。
一実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸と天然アミノ酸との存在下において、活性型メンバー（例えば、直交化ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化する活性型メンバー）について、ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーを選択（および／またはスクリーニング）する工程は、（ｉ）少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる陽性選択またはスクリーニングマーカーと、ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーとを複数の細胞へ導入する段階、（ｉｉ）選択剤の存在下において、複数の細胞を成長させる段階、ならびに（ｉｉｉ）選択および／またはスクリーニング剤の存在下において、陽性選択またはスクリーニングマーカーにおける少なくとも１つのセレクターコドンを抑圧することによって、生存する（または特定の反応を示す）細胞を同定して、活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）のプールを含んでいる陽性選択された細胞の一部（ｓｕｂｓｅｔ）を提供する段階を含んでいる。上記陽性選択および／またはスクリーニングマーカーは、例えば、抗生物質耐性遺伝子である。上記セレクターコドンは、例えば、アンバーコドン、オーカーコドン、またはオパールコドンである。また、必要に応じて、選択剤および／またはスクリーニング剤の濃度を、変更することができる。
１態様では、陽性選択マーカーは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子であり、セレクターコドンは、該ＣＡＴ遺伝子におけるアンバー終止コドンである。必要に応じて、陽性選択マーカーは、β−ラクタマーゼであり、セレクターコドンは、該β−ラクタマーゼ遺伝子におけるアンバー終止コドンである。別の態様では、陽性スクリーニングマーカーは、蛍光もしくは発光スクリーニングマーカー、または親和性に基づくスクリーニングマーカー（細胞表面マーカーなど）を含んでいる。
一実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸の非存在下において、Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）について、上記プールを陰性選択またはスクリーニングする工程は、（ｉ）陽性選択またはスクリーニングからの活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）のプールと一緒に、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる陰性選択またはスクリーニングマーカーを、第２生物の複数の細胞に導入する段階、ならびに（ｉｉ）非天然にコードされたアミノ酸とスクリーニングまたは選択剤とが補充された第１培養基では、生存するか、もしくは特定のスクリーニング反応を示すが、非天然にコードされたアミノ酸と選択またはスクリーニング剤とが補充されていない第２培養基では、生存しないか、もしくは特定のスクリーニング反応を示さない、細胞を同定して、少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを有する生存細胞またはスクリーニングされた細胞を提供する段階を含んでいる。上記陰性選択および／またはスクリーニングマーカーは、例えば、抗生物質耐性遺伝子（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子など）である。例えば、ＣＡＴ同定のプロトコールは、必要に応じて、適切なＯ−ＲＳ組み換え体を決定するときの陽性選択および／または陰性スクリーニングとしての役割を果たす。例えば、必要に応じて、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいるＣＡＴを含み、１つ以上の非天然アミノ酸を含んでいるか、または含んでいない成長プレート上において、クローンのプールは複製される。したがって、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるプレートにおいて、排他的に成長するコロニーは、組み換えＯ−ＲＳを含んでいると見なされる。１態様では、選択（および／またはスクリーニング）剤の濃度は、変更される。いくつかの態様では、第１生物と第２生物とは、異なっている。よって、第１生物および／または第２生物は、原核生物、真核生物、哺乳類、Escherichia coli、菌類、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などを、必要に応じて含んでいる。他の実施形態では、スクリーニングマーカーは、蛍光または発光スクリーニングマーカー、または親和性に基づくスクリーニングマーカーを含んでいる。
別の実施形態では、活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）について、プールをスクリーニングまたは選択する工程（陰性選択する工程など）は、（ｉ）陽性選択の工程（ｂ）からの、ＲＳの突然変異体の活性型のプールを単離する段階、（ｉｉ）少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる陰性選択またはスクリーニングマーカーと、活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）のプールとを、第２生物の複数の細胞へ導入する段階、ならびに、（ｉｉｉ）非天然にコードされたアミノ酸が補充されていない第１培養基では、生存するか、もしくは特定のスクリーニング反応を示すが、上記非天然にコードされたアミノ酸が補充されている第２培養基では、生存しないか、もしくは特定のスクリーニング反応を示さない細胞を同定して、上記非天然にコードされたアミノ酸に特異的な組み換えＯ−ＲＳを少なくとも１つ有する生存細胞またはスクリーニングされた細胞を提供する段階を含んでいる。上記少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる陰性選択またはスクリーニングマーカーは、例えば、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる毒性マーカー遺伝子（リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子など）である。１態様では、少なくとも１つのセレクターコドンは、約２つ以上のセレクターコドンを含んでいる。そのような実施形態は、必要に応じて、少なくとも１つのセレクターコドンが２つ以上のセレクターコドンを含んでおり、第１生物と第２生物とが異なっているということを含んでいてもよい。第１生物と第２生物とは、それぞれ、原核生物、真核生物、哺乳類、Escherichia coli、菌類、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などを、必要に応じて含んでいる。また、いくつかの態様は、陰性選択マーカーが、リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子（該遺伝子は少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる）を含んでいるということを包含している。他の態様では、スクリーニングマーカーは、必要に応じて蛍光または発光スクリーニングマーカー、または親和性に基づくスクリーニングマーカーを含んでいるということを包含している。本明細書における実施形態では、スクリーニングおよび／または選択は、必要に応じて、スクリーニングおよび／または選択のストリンジェンシーが変更されることを含んでいる。
一実施形態では、少なくとも１つの組み換え直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を製造する方法は、（ｄ）少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを単離する工程、（ｅ）少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳに由来するＯ−ＲＳ（必要に応じてＯ−ＲＳの突然変異体）の第２組を生成する工程、ならびに、（ｆ）Ｏ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する能力を含んでいるＯ−ＲＳの突然変異体が得られるまで、上記（ｂ）工程と（ｃ）工程とを繰り返す工程を、さらに含んでいてもよい。必要に応じて、（ｄ）工程‐（ｆ）工程は、繰り返される（例えば少なくとも約２回）。１態様では、少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳに由来するＯ−ＲＳの突然変異体の第２組は、突然変異誘発法によって生成されてもよい。該突然変異誘発法としては、例えば、ランダム突然変異誘発法、部位特異的突然変異誘発法、組み換え、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
上記方法における、陽性選択／スクリーニングの（ｂ）工程、陰性選択／スクリーニングの（ｃ）工程、または陽性および陰性選択／スクリーニングの（ｂ）工程と（ｃ）工程との両方などを含んでいる選択／スクリーニング工程のストリンジェンシーは、必要に応じて、選択／スクリーニングのストリンジェンシーを変更する段階を含んでいる。別の実施形態では、陽性選択／スクリーニングの（ｂ）工程、陰性選択／スクリーニングの（ｃ）工程、または陽性および陰性選択／スクリーニングの（ｂ）工程と（ｃ）工程との両方は、レポーターを使用する段階を含んでおり、該レポーターは、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）により検出されるか、または発光により検出されるものである。必要に応じて、上記レポーターは、ファージディスプレイ、または細胞表面などに提示される。また、上記レポーターは、非天然にコードされたアミノ酸またはその類似体に関する親和性または触媒活性に基づいて選択される。一実施形態では、シンテターゼの突然変異体は、ファージディスプレイ、または細胞表面に提示される。
組み換え直交化ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を製造する方法は、（ａ）第１生物からの少なくとも１つのｔＲＮＡ（サプレッサーｔＲＮＡなど）に由来するｔＲＮＡの突然変異体のライブラリーを生成する工程、（ｂ）第１生物からのＲＳの非存在下において、第２生物からのアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）により、アミノアシル化されるｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）について、上記ライブラリーをスクリーニングまたは選択（陰性選択など）して、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを提供する工程、ならびに（ｃ）導入された直交化ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーについて、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを選択またはスクリーニングして、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを提供する工程を含んでおり、上記少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識するとともに、第２生物からのＲＳにより効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化される、方法である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのｔＲＮＡは、サプレッサーｔＲＮＡであり、ならびに／あるいは、天然のユニークな３塩基コドン、および／もしくは非天然塩基を含んでいるか、またはナンセンスコドン、レアコドン、非天然コドン、少なくとも４塩基を含んでいるコドン、アンバーコドン、オーカーコドン、またはオパール終止コドンである。一実施形態では、組み換えＯ−ｔＲＮＡの直交性は、改善されている。いくつかの実施形態では、Ｏ−ｔＲＮＡが、修飾の必要なく、第２生物から第１生物へ必要に応じて移入されることが好ましい。様々な実施形態では、第１生物と第２生物とは、同じであるか、異なっている。さらに、第１生物と第２生物とは、必要に応じて、原核生物（Methanococcus jannaschii, Methanobacteium thermoautotrophicum, Escherichia coli, Halobacteriumなど）、真核生物、哺乳類、菌類、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などから選択される。さらに、組み換えｔＲＮＡは、必要に応じて、非天然にコードされたアミノ酸によりアミノアシル化されるものであり、該非天然アミノ酸は、天然にまたは遺伝子操作によって、インビボにおいて生合成されるものである。非天然にコードされたアミノ酸は、少なくとも第１生物または第２生物の成長培養基に、必要に応じて加えられる。
１態様では、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼによりアミノアシル化される、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）について、上記ライブラリーをスクリーニングまたは選択（陰性選択など）する工程（（ｂ）工程）は、（ｉ）少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる毒性マーカー遺伝子と、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のライブラリーとを、第２生物からの複数の細胞へ導入する段階、ならびに、（ｉｉ）少なくとも１つの直交化ｔＲＮＡまたは非機能的なｔＲＮＡを含んでいるｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを含有している生存細胞を選択する段階を含んでいる。また、上記毒性マーカー遺伝子の代わりに、毒物もしくは静止剤の製造を引き起こす遺伝子、または生物にとって必須の遺伝子を用いてもよい（ただし、これらマーカー遺伝子は、少なくとも１つのセレクターコドンを含んでいる）。例えば、細胞密度比の比較アッセイを用いて、生存細胞を選択することができる。
別の態様では、毒性マーカー遺伝子は、２つ以上のセレクターコドンを含んでいてもよい。上記方法の別の実施形態では、毒性マーカー遺伝子は、リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子であり、該リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子は、少なくとも１つのアンバーコドンを含んでいる。必要に応じて、リボヌクレアーゼであるバルナーゼの遺伝子は、２つ以上のアンバーコドンを含んでいてもよい。
一実施形態では、導入された直交化ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）により、アミノアシル化されるメンバーについて、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを選択またはスクリーニングする工程は、Ｏ−ＲＳと一緒に陽性選択またはスクリーニングマーカー遺伝子と、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールとを、第２細胞からの複数の細胞へ導入する段階、ならびに、抗生物質などの選択またはスクリーニング剤の存在下において成長した、生存細胞またはスクリーニングされた細胞を同定して、少なくとも１つの組み換えｔＲＮＡを有する細胞のプールを提供する段階を含んでいてもよい。該少なくとも１つの組み換えｔＲＮＡは、Ｏ−ＲＳによりアミノアシル化され、陽性マーカー遺伝子によりコードされた翻訳産物へ、少なくとも１つのセレクターコドンに応じて、アミノ酸を挿入するものである。上記陽性選択またはスクリーニングマーカー遺伝子は、薬剤耐性遺伝子、生物に必須の遺伝子、または毒物の解毒を引き起こす遺伝子を含んでいる。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、少なくとも１つのセレクターコドン（少なくとも１つのアンバー終止コドンなど）を含んでいるβ−ラクタマーゼ遺伝子が挙げられる。別の実施形態では、選択またはスクリーニング剤の濃度が、変更される。
特異的なＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対を生成する方法が提供される。該方法は、（ａ）第１生物からの少なくとも１つのｔＲＮＡに由来するｔＲＮＡの突然変異体のライブラリーを生成する工程、（ｂ）第１生物からＲＳの非存在下において、第２生物からのアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）により、アミノアシル化されるｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）について、上記ライブラリーを陰性選択またはスクリーニングして、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを提供する工程、ならびに（ｃ）導入された直交化ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーについて、ｔＲＮＡ（必要に応じてｔＲＮＡの突然変異体）のプールを選択またはスクリーニングして、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを提供する工程を含んでいる。少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識し、第２生物からのＲＳにより効率的に認識されず、そして、Ｏ−ＲＳにより優先的にアミノアシル化される。また、上記方法は、（ｄ）第３生物からの少なくとも１つのアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）に由来するＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体）のライブラリーを生成する工程、（ｅ）非天然にコードされたアミノ酸と天然アミノ酸との存在下において、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化するメンバーについて、ＲＳの突然変異体のライブラリーを選択またはスクリーニングして、活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）のプールを提供する工程、ならびに（ｆ）非天然にコードされたアミノ酸の非存在下において、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを優先的にアミノアシル化する活性型ＲＳ（必要に応じてＲＳの突然変異体の活性型）について、上記プールを陰性選択またはスクリーニングして、少なくとも１つの特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対を提供する工程を含んでおり、上記少なくとも１つの特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対は、非天然にコードされたアミノ酸に対して特異的な少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳと、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡとを含んでいる、方法である。本方法によって製造される特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対が含まれる。特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対には、例えば、ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ｍｕｔＴｙｒＲＳの対（ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ＳＳ１２ＴｙｒＲＳの対など）、ｍｕｔＲＮＡＬｅｕ−ｍｕｔＬｅｕＲＳの対、ｍｕｔＲＮＡＴｈｒ−ｍｕｔＴｈｒＲＳの対、またはｍｕｔＲＮＡＧｌｕ−ｍｕｔＧｌｕＲＳの対などが含まれる。さらに、上記方法は、第１生物および第３生物が、同じであること（例えばMethanococcus jannaschiiであること）を含んでいる。
また、本発明の方法には、第２生物のインビボの翻訳系に使用するための直交化ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼの対を選択する方法が含まれる。この方法は、特に限定されないが、第１生物から単離されたか、または第１生物に由来するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）およびｔＲＮＡと、マーカー遺伝子とを、第２生物からの細胞の第１組に導入する工程、上記マーカー遺伝子とｔＲＮＡとを、第２生物からの複製した細胞の組に導入する工程、ならびに、上記複製した細胞の組では生存できないが、上記第１組では生存する細胞について選択するか、上記複製した細胞の組では特定のスクリーニング反応を示さないが、上記第１組では特定のスクリーニング反応を示す細胞をスクリーニングする工程を含んでおり、上記第１組と複製した細胞の組とは、選択またはスクリーニング剤の存在下において成長させられ、生存細胞またはスクリーニングされた細胞は、第２生物のインビボの翻訳系に使用するための直交化ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼの対を含んでいる、方法である。一実施形態では、比較および選択またはスクリーニングする工程は、インビボでの相補性試験（complementation assay）を含んでいる。選択またはスクリーニング剤の濃度は、変更可能である。
本発明の生物は、様々な生物および様々な組み合わせを含んでいる。例えば、本発明の方法の第１生物および第２生物は同一であってもよいし、異なっていてもよい。一実施形態では、上記生物は、必要に応じて、原核生物である。該原核生物としては、例えば、特に限定されないが、Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, またはT. thermophilusなどが挙げられる。代わりに、上記生物は、必要に応じて真核生物を含んでいる。該真核生物としては、例えば、特に限定されないが、植物（例えば、単子葉植物または双子葉植物などの複雑な生物）、藻類、原生生物、真菌（酵母など）、または動物（例えば哺乳類、昆虫、節足動物）などが挙げられる。別の実施形態では、上記第２生物は、原核生物（例えば、特に限定されないが、Methanococcus jannaschii, Methanobacterium thermoautotrophicum, Halobacterium, Escherichia coli, A. fulgidus, P. furiosus, P. horikoshii, A. pernix, またはT. thermophilusなど）である。代わりに、上記第２生物は真核生物（例えば、特に限定されないが、酵母、動物細胞、植物細胞、真菌、または哺乳類細胞など）であってもよい。様々な実施形態では、第１生物と第２生物とは異なっている。
＜ＶＩ．ポリペプチドにおける非天然アミノ酸の位置＞
本発明は、ポリペプチドへの１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸の組み込みを意図している。１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸は、ポリペプチドの活性を破壊しない特定の位置に組み込まれ得る。これは、「保存的な」置換（例としては、疎水性のアミノ酸を用いた疎水性アミノ酸の置換、大きなアミノ酸を用いた大きなアミノ酸の置換、親水性のアミノ酸を用いた親水性アミノ酸の置換が挙げられるが、これらに限定されない）、および／または活性に不要な位置における非天然アミノ酸の挿入を行うことによって達成され得る。
例えば、ＧＨ（例えばｈＧＨ）の領域は、以下のように例証され得る（ここで、ｈＧＨにおけるアミノ酸位置は、中央の列に示されている（参照によってその全体が本明細書に組み込まれる米国出願公開第２００５／１７０４０４号明細書の配列番号２））。
Figure 2009523815
 広範な生化学的および構造的な手法は、ポリペプチド内における非天然にコードされたアミノ酸による置換を目的とした、所望の部位の選択に採用され得る。ポリペプチド鎖のあらゆる部位が、非天然にコードされたアミノ酸を組み込むための選択に好適であり、かつ選択は、あらゆる目的もしくは特に所望ではない目的に関して、合理的な設計、または無作為の選択に基づき得ることは、当業者にとってたやすく理解される。所望の部位の選択は、あらゆる所望の性質、または活性を有する分子を産生するためであり得る。当該あらゆる所望の性質または活性の例としては、アゴニスト、スーパーアゴニスト、インバースアゴニスト、アンタゴニスト、受容体結合修飾物質、受容体活性修飾物質、結合パートナー対する結合の修飾物質、結合パートナー活性修飾物質、結合パートナー高次構造修飾物質、ダイマー形成もしくはマルチマー形成、本来の分子と比較して活性もしくは性質に対して変化がないこと、またはポリペプチドの物理的もしくは化学的な性質（例えば、可溶性、凝集、免疫原性または安定性）を操作することなどが挙げられる。例えば、ポリペプチドの生物活性に必要なポリペプチドにおける位置は、当該分野において公知の点突然変異分析、アラニンスキャニング法、またはホモログスキャニング法を用いて同定され得る。例えば、「Cunningham, B. and Wells, J., Science, 244:1081- 1085 (1989)」（ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）の生物活性に重要である１４残基の同定）および、「Cunningham, B.ら. Science 243: 1330-1336 (1989)」（ホモログスキャニング突然変異誘導法を用いた抗体および受容体エピトープの同定）を参照のこと。参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第５，５８０，７２３号明細書；米国特許第５，８３４，２５０号明細書；米国特許第６，０１３，４７８号明細書；米国特許第６，４２８，９５４号明細書；および米国特許第６，４５４，５６１号明細書には、標的物質とともにポリペプチドの活性に影響する活性ドメインの同定によって、ポリペプチド（例えば、ｈＧＨ）の構造および機能を体系的に解析する方法について記載されている。アラニンスキャニング突然変異誘導法、またはホモログスキャニング突然変異誘導法によって、生物活性に重要であるとして同定されたもの以外の残基は、ポリペプチドに求められる所望の活性に依存して、非天然にコードされたアミノ酸を用いた置換にとって良好な候補物であり得る。また代替可能に、生物活性に重要であるとして同定された部位は、この場合もやはり、ポリペプチドに求められる所望の活性に依存して、非天然にコードされたアミノ酸を用いた置換にとって良好な候補物であり得る。他の代替可能物は、ポリペプチド鎖の各位置における、非天然にコードされたアミノ酸を用いた連続する置換を簡単に行い、かつポリペプチドの活性に関する影響を観察するためのものである。非天然にコードされたアミノ酸を用いたあらゆるポリペプチドへの置換に関する位置を選択するあらゆる手段、技術または方法が、本発明における使用に好適であることは、当業者にとってたやすく理解される。
また、欠失を含むポリペプチドの天然に生じる突然変異体の構造および活性が、非天然にコードされたアミノ酸による置換に耐性があると思われる、タンパク質の領域を決定するために調査され得る。例えば、ｈＧＨについて「Kostyoら, Biochem. Biophys. Acta, 925: 314 (1987)」；「Lewis, U.ら, J. Biol. Chem., 253:2679-2687 (1978) 」を参照のこと。同様に、プロテアーゼ消化および単クローン性抗体は、それらの受容体との結合を担うポリペプチド（例えば、ｈＧＨ）の領域の同定に使用され得る。例えば、「Cunningham, B.ら. Science 243: 1330-1336 (1989); Mills, J.ら, Endocrinology, 107:391-399 (1980) 」：「Li, C, Mol. Cell. Biochem., 46:31-41 (1982)」（１３４−１４９残基の間のアミノ酸が活性を失うことなく欠失され得ることを示している）を参照のこと。非天然にコードされたアミノ酸を用いた置換に耐性がないと思われる残基が排除されていると、残りのそれぞれの位置における提案された置換の影響は、ポリペプチドおよびその結合タンパク質の３次元結晶構造から調査され得る。「de Vos, A.ら, Science, 255:306-312 (1992)」を参照のこと；ｈＧＨのすべての結晶構造は、タンパク質および核酸の大分子の３次元構造データを含む集中化されたデータベースであるProtein Data Bank（PDB、rcsb.orgにおけるワールドワイドウェブ上で利用可能である）（例としては、３ＨＨＲ、１ＡＸＩ、および１ＨＷＧが挙げられる）において入手可能である。３次元構造データが利用できない場合には、モデルによって、ポリペプチドの２次または３次の構造を調べる状態になり得る。従って、当業者は、非天然にコードされたアミノ酸を用いて置換され得るアミノ酸の位置を容易に同定し得る。
いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの２次構造であるらせんまたはベータシートを破壊しないタンパク質の領域に位置される１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。
非天然にコードされたアミノ酸の例示的な残基は、受容体結合する可能性のある領域、または結合パートナーとの結合に関する領域（例としては、ｈＧＨについては部位Ｉおよび部位ＩＩが挙げられるが、これらに限定されない）から除外された残基、完全または部分的に溶媒にさらされ得る残基、近傍の残基と最小の水素結合相互作用を有するか、または水素結合相互作用を有する残基、近傍の反応性残基に向かって最小にさらされ得る残基、ならびにポリペプチドの３次元構造、結晶構造、２次構造、３次構造もしくは４次構造によって予想されるような、その受容体と結合されるか、もしくは結合しないような、または他のポリペプチドもしくは他の生物活性分子と結合されるか、結合されないような、高い柔軟性がある領域（例としては、ｈＧＨについてはＣ−Ｄループが挙げられるが、これに限定されない）、または構造的に厳密な領域（例としては、ｈＧＨについてはＢらせんが挙げられるが、これに限定されない）にあり得る残基であり得る。
非天然にコードされたアミノ酸の組み込み用の残基、および任意にＰＥＧのような分子との接合用の残基の例としては、凝集の形成または可溶性を修飾する残基、精製を改良する残基、タンパク質の酸化を防止する残基、タンパク質のエピトープ構造を修飾する残基、ならびにアミド分解を防止する残基が挙げられるが、これらに限定されない。
参照によって本明細書に組み込まれる米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書には、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸の組み込み用の部位、および非天然にコードされたアミノ酸が水溶性ポリマーと連結され得る部位の多くについて記載されている。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドに組み込まれた少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸は、カルボニル基（例えばケトン基）を含んでいる。ある種の実施形態において、ポリペプチドに組み込まれた非天然にコードされたアミノ酸は、パラ−アセチルフェニルアラニンである。ポリペプチドが複数の非天然にコードされたアミノ酸を含むいくつかの実施形態において、ポリペプチドに組み込まれる２つ以上の非天然にコードされたアミノ酸は、パラ−アセチルフェニルアラニンである。ポリペプチドが複数の非天然にコードされたアミノ酸を含むいくつかの実施形態において、ポリペプチドに組み込まれる非天然にコードされたアミノ酸の実質的にすべてが、パラ−アセチルフェニルアラニンである。
いくつかの実施形態において、ポリペプチドと連結される水溶性ポリマーとしては、１つ以上のポリエチレングリコール分子（ＰＥＧ）が挙げられる。当該ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、直鎖状または分枝状であり得る。典型的に、本発明に使用される直鎖状ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、０．１約から約１００ｋＤａ、または約１から約６０ｋＤａ、または約２０から約４０ｋＤａ、または約３０ｋＤａの分子量（ＭＷ）を有し得る。典型的に、本発明に使用される分枝状ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、約１から約１００ｋＤａ、または約３０から約５０ｋＤａ、または約４０ｋＤａの分子量を有し得る。ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、本明細書にさらに説明されている。ある種の実施形態において、ポリペプチドと水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）との間の連結は、オキシム結合である。
本発明のある種の実施形態は、共有結合によって少なくとも１つの水溶性ポリマーを連結されたタンパク質を含んでいる組成物を包含し、ここで、当該共有結合はオキシム結合である。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマーはＰＥＧ（例えば、直鎖状ＰＥＧ）である。オキシム結合によってポリペプチドと連結されている少なくとも１つの直鎖状ＰＥＧを包含するいくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約０．１から約１００ｋＤａ、または約１から約６０ｋＤａ、または約２０から約４０ｋＤａ、または約３０ｋＤａの分子量を有することができる。オキシム結合によってポリペプチドと連結されている少なくとも１つの直鎖状ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは約３０ｋＤａの分子量を有する。オキシム結合によってポリペプチドと連結されている少なくとも１つの分枝状ＰＥＧを包含するいくつかの実施形態において、ＰＥＧは、約１から約１００ｋＤａ、または約３０から約５０ｋＤａ、または約４０ｋＤａの分子量を有することができる。オキシム結合によってポリペプチドと連結されている少なくとも１つの分枝状ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは、約４０ｋＤａの分子量を有する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドはＧＨ（例えば、ｈＧＨ）であり、かついくつかの実施形態において、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２と少なくとも約８０％が同一性である配列を有し；いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２の配列である配列を有する。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸を含み；これらの実施形態のいくつかにおいて、少なくとも１つのオキシム結合は、非天然にコードされたアミノ酸と少なくとも１つの水溶性ポリマーとの間にある。いくつかの実施形態において、非天然にコードされたアミノ酸は、カルボニル基（例えば、ケトン基）を含み；いくつかの実施形態において、非天然にコードされたアミノ酸は、パラ−アセチルフェニルアラニンである。いくつかの実施形態において、パラ−アセチルフェニルアラニンは、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２の３５位に対応する位置において置換されている。
従って、いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つの水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）と共有結合によって連結されたポリペプチドを提供し、ここで、共有結合はオキシム結合である。ある種の実施形態において、水溶性ポリマーはＰＥＧであり、かつＰＥＧは直鎖状ＰＥＧである。これらの実施形態において、直鎖状ＰＥＧは、約０．１から約１００ｋＤａ、または約１から約６０ｋＤａ、または約２０から約４０ｋＤａ、または約３０ｋＤａの分子量を有する。オキシム結合によってポリペプチドと連結されている直鎖状ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは約３０ｋＤａの分子量を有する。ある種の実施形態において、水溶性ポリマーは分枝状ＰＥＧであるＰＥＧである。これらの実施形態において、分枝状ＰＥＧは、約１から約１００ｋＤａ、または約３０から約５０ｋＤａ、または約４０ｋＤａの分子量を有する。オキシム結合によってポリペプチドと連結されている分枝状ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは約４０ｋＤａの分子量を有する。
いくつかの実施形態において、本発明は、ポリペプチドを提供し、ここで、ポリペプチドは非天然にコードされたアミノ酸を含み、ポリペプチドは、少なくとも１つの水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）と共有結合によって連結され、かつ共有結合は非天然にコードされたアミノ酸と水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）との間におけるオキシム結合である。いくつかの実施形態において、非天然にコードされたアミノ酸は、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２の３５位に対応する位置においてポリペプチド（例えば、ｈＧＨ）に組み込まれている。水溶性ポリマーがＰＥＧである場合のある種の実施形態において、ＰＥＧは直鎖状ＰＥＧである。これらの実施形態において、直鎖状ＰＥＧは、約０．１から約１００ｋＤａ、または約１から約６０ｋＤａ、または約２０から約４０ｋＤａ、または約３０ｋＤａの分子量を有する。オキシム結合によってポリペプチドと連結されている直鎖状ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは約３０ｋＤａの分子量を有する。水溶性ポリマーがＰＥＧである場合のある種の実施形態において、ＰＥＧは分枝状ＰＥＧである。これらの実施形態において、ＰＥＧは、約１から約１００ｋＤａ、または約３０から約５０ｋＤａ、または約４０ｋＤａの分子量を有する。オキシム結合によってポリペプチドと連結されているＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは約４０ｋＤａの分子量を有する。
いくつかの実施形態において、本発明はポリペプチドを提供し、ここで、ポリペプチドは、非天然にコードされたカルボニル含有アミノ酸である非天然にコードされたアミノ酸を含み、ポリペプチドは、少なくとも１つの水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）と共有結合によって連結されており、かつ共有結合は、非天然にコードされたアミノ酸と水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）との間におけるオキシム結合である。いくつかの実施形態において、非天然にコードされたカルボニル含有アミノ酸は、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２の３５位に対応する位置においてＧＨ（例えば、ｈＧＨ）に組み込まれている。水溶性ポリマーがＰＥＧである場合のある種の実施形態において、ＰＥＧは直鎖状ＰＥＧである。これらの実施形態において、直鎖状ＰＥＧは、約０．１から約１００ｋＤａ、または約１から約６０ｋＤａ、または約２０から約４０ｋＤａ、または約３０ｋＤａの分子量を有する。オキシム結合によってポリペプチドと連結されている直鎖状ＰＥＧを包含するこれらの実施形態において、ＰＥＧは約３０ｋＤａの分子量を有する。水溶性ポリマーがＰＥＧである場合のある種の実施形態において、ＰＥＧは分枝状ＰＥＧである。これらの実施形態において、分枝状ＰＥＧは、約１から約１００ｋＤａ、または約３０から約５０ｋＤａ、または約４０ｋＤａの分子量を有する。オキシム結合によってポリペプチドと連結されている分枝状ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは約４０ｋＤａの分子量を有する。
いくつかの実施形態において、本発明は、ケトン基を含んでいる非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる、ポリペプチドを提供し、ここで、ポリペプチドは、共有結合によって少なくとも１つの水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）と連結され、かつ共有結合は、ケトン基を含んでいる非天然にコードされたアミノ酸と、水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）との間におけるオキシム結合である。いくつかの実施形態において、ケトン基を含んでいる非天然にコードされたアミノ酸は、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２の３５位に対応する位置においてＧＨ（例えば、ｈＧＨ）に組み込まれている。水溶性ポリマーがＰＥＧである場合のある種の実施形態において、ＰＥＧは直鎖状ＰＥＧである。これらの実施形態において、直鎖状ＰＥＧは、約０．１から約１００ｋＤａ、または約１から約６０ｋＤａ、または約２０から約４０ｋＤａ、または約３０ｋＤａの分子量を有する。オキシム結合によってポリペプチドと連結されている直鎖状ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは約３０ｋＤａの分子量を有する。水溶性ポリマーがＰＥＧである場合のある種の実施形態において、ＰＥＧは分枝状ＰＥＧである。これらの実施形態において、分枝状ＰＥＧは、約１から約１００ｋＤａ、または約３０から約５０ｋＤａ、または約４０ｋＤａの分子量を有する。オキシム結合によってポリペプチドと連結されている分枝状ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは約４０ｋＤａの分子量を有する。
いくつかの実施形態において、パラ−アセチルフェニルアラニンである非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドを提供し、ここで、ＧＨは、共有結合によって少なくとも１つの水溶性ポリマーと連結し、かつ共有結合は、パラ−アセチルフェニルアラニンと水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）との間におけるオキシム結合である。いくつかの実施形態において、パラ−アセチルフェニルアラニンは、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２の３５位に対応する位置においてＧＨ（例えば、ｈＧＨ）に組み込まれている。水溶性ポリマーがＰＥＧである場合のある種の実施形態において、ＰＥＧは直鎖状ＰＥＧである。これらの実施形態において、直鎖状ＰＥＧは、約０．１から約１００ｋＤａ、または約１から約６０ｋＤａ、または約２０から約４０ｋＤａ、または約３０ｋＤａｂの分子量を有する。オキシム結合によってポリペプチドと連結されている直鎖状ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは約３０ｋＤａの分子量を有する。水溶性ポリマーがＰＥＧである場合のある種の実施形態において、ＰＥＧは分枝状ＰＥＧである。これらの実施形態において、分枝状ＰＥＧは、約１から約１００ｋＤａ、または約３０から約５０ｋＤａ、または約４０ｋＤａの分子量を有する。オキシム結合によってポリペプチドと連結されている分枝状ＰＥＧを包含するある種の実施形態において、ＰＥＧは約４０ｋＤａの分子量を有する。
ある種の実施形態において、本発明は、ＧＨ（例えば、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２を含むｈＧＨ）を提供し、ここで、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、約３０ｋＤａの分子量の直鎖状ＰＥＧに対してオキシム結合によって連結されているパラ−アセチルフェニルアラニンを用いて、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２の３５位に対応する位置において置換されている。
いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ（例えば、直鎖状ＰＥＧ）に対してオキシム結合を介して連結されているＧＨ（例えば、ｈＧＨ）を含むホルモン組成物を提供し、ここで、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２のアミノ酸配列を含み、かつＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、１つ以上の位置（例としては、対応する位置：１位より前（すなわち、Ｎ末端において）、１位、２位、３位、４位、５位、８位、９位、１１位、１２位、１５位、１６位、１９位、２２位、２９位、３０位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５２位、５５位、５７位、５９位、６５位、６６位、６９位、７０位、７１位、７４位、８８位、９１位、９２位、９４位、９５位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１１位、１１２位、１１３位、１１５位、１１６位、１１９位、１２０位、１２２位、１２３位、１２６位、１２７位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５８位、１５９位、１６１位、１６８位、１７２位、１８３位、１８４位、１８５位、１８６位、１８７位、１８８位、１８９位、１９０位、１９１位、１９２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端において）（米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２、または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）が挙げられるが、これらに限定されない）において置換された少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ（例えば、直鎖状ＰＥＧ）に対してオキシム結合を介して連結されているＧＨ（例えば、ｈＧＨ）を含んでいるホルモン組成物を提供し、ここで、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２のアミノ酸配列を含み、かつＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、１つ以上の位置（例としては、対応する位置：３０、３５、７４、９２、１０３、１４３、１４５（米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２、または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）が挙げられるが、これらに限定されない）において置換されている非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ（例えば、直鎖状ＰＥＧ）に対してオキシム結合を介して連結されているＧＨ（例えば、ｈＧＨ）を含んでいるホルモン組成物を提供し、ここで、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２のアミノ酸配列を含み、かつＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、１つ以上の位置（例としては、対応する位置：３５、９２、１４３、１４５（米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号１もしくは３に対応するアミノ酸、または配列番号２）が挙げられるが、これらに限定されない）において置換された少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ（例えば、直鎖状ＰＥＧ）とオキシム結合を介して連結されたＧＨ（例えば、ｈＧＨ）を含んでいる、ホルモン組成物を提供し、ここで、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２のアミノ酸配列を含み、かつＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、１つ以上の位置（例としては、対応する位置：米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２に由来する、または米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号１もしくは３に対応するアミノ酸に由来する、３５、９２、１３１、１３４、１４３、１４５またはこれらのあらゆる組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）において少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ（例えば、直鎖状ＰＥＧ）に対してオキシム結合を介して連結されたＧＨ（例えば、ｈＧＨ）を含んでいる、ホルモン組成物を提供し、ここで、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２のアミノ酸配列を含み、かつＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、１つ以上の位置（例としては、対応する位置：参照によってその全体が組み込まれる米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号１もしくは３に対応するアミノ酸、または配列番号２に由来する、３０、３５、７４、９２、１０３、１４５、またはこれらのあらゆる組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）において置換された少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ（例えば、直鎖状ＰＥＧ）に対してオキシム結合を介して連結されているＧＨ（例えば、ｈＧＨ）を含んでいる、ホルモン組成物を提供し、ここで、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２のアミノ酸配列を含み、かつＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、１つ以上の位置（例としては、対応する位置：米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号１もしくは３に対応するアミノ酸、または配列番号２に由来する、３５、９２、１４３、１４５、またはこれらのあらゆる組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）において置換された少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ（例えば、直鎖状ＰＥＧ）に対してオキシム結合を介して連結されているＧＨ（例えば、ｈＧＨ）を含んでいる、ホルモン組成物を提供し、ここで、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２のアミノ酸配列を含み、かつＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、１つ以上の位置（例としては、対応する位置：米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号１もしくは３に対応するアミノ酸、または配列番号２に由来する３５位が挙げられるが、これに限定されない）において置換された少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。ＰＥＧが直鎖状ＰＥＧである実施形態において、ＰＥＧは、約０．１から約１００ｋＤａ、または約１から約６０ｋＤａ、または約２０から約４０ｋＤａ、または約３０ｋＤａの分子量を有し得る。
いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ（例えば、直鎖状ＰＥＧ）に対してオキシム結合を介して連結されているＧＨ（例えば、ｈＧＨ）を含んでいるホルモン組成物を提供し、ここで、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２のアミノ酸配列を含み、かつＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、１つ以上の位置（例としては、対応する位置：１位より前（すなわち、Ｎ末端において）、１位、２位、３位、４位、５位、８位、９位、１１位、１２位、１５位、１６位、１９位、２２位、２９位、３０位、３２位、３３位、３４位、３５位、３６位、３７位、３８位、３９位、４０位、４１位、４２位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、５２位、５５位、５７位、５９位、６５位、６６位、６９位、７０位、７１位、７４位、８８位、９１位、９２位、９４位、９５位、９７位、９８位、９９位、１００位、１０１位、１０２位、１０３位、１０４位、１０５位、１０６位、１０７位、１０８位、１０９位、１１１位、１１２位、１１３位、１１５位、１１６位、１１９位、１２０位、１２２位、１２３位、１２６位、１２７位、１２９位、１３０位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４１位、１４２位、１４３位、１４４位、１４５位、１４６位、１４７位、１４８位、１４９位、１５０位、１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、１５６位、１５８位、１５９位、１６１位、１６８位、１７２位、１８３位、１８４位、１８５位、１８６位、１８７位、１８８位、１８９位、１９０位、１９１位、１９２位（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端において）（米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２、または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）が挙げられるが、これらに限定されない）において置換された、パラ−アセチルフェニルアラニンである少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ（例えば、直鎖状ＰＥＧ）に対してオキシム結合を介して連結されているＧＨ（例えば、ｈＧＨ）を含んでいるホルモン組成物を提供し、ここで、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２のアミノ酸配列を含み、かつＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、１つ以上の位置（例としては、対応する位置：３０、３５、７４、９２、１０３、１４３、１４５（米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２、または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）が挙げられるが、これらに限定されない）において置換された、パラ−アセチルフェニルアラニンである非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ（例えば、直鎖状ＰＥＧ）とオキシム結合を介して連結されているＧＨ（例えば、ｈＧＨ）を含んでいるホルモン組成物を提供し、ここで、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２のアミノ酸配列を備え、かつＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、１つ以上の位置（例としては、対応する位置：３５、９２、１４３、１４５（米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号１もしくは３に対応するアミノ酸、または配列番号２）が挙げられるが、これらに限定されない）において置換された、パラ−アセチルフェニルアラニンである少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ（例えば、直鎖状ＰＥＧ）に対してオキシム結合を介して連結されたＧＨ（例えば、ｈＧＨ）を含んでいる、ホルモン組成物を提供し、ここで、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２のアミノ酸配列を備え、かつＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、１つ以上の位置（例としては、対応する位置：米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２に由来する、または米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号１もしくは３に対応するアミノ酸に由来する、３５、９２、１３１、１３４、１４３、１４５またはこれらのあらゆる組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）において置換された、パラ−アセチルフェニルアラニンである少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ（例えば、直鎖状ＰＥＧ）に対してオキシム結合を介して連結されたＧＨ（例えば、ｈＧＨ）を含んでいる、ホルモン組成物を提供し、ここで、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２のアミノ酸配列を含み、かつＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、１つ以上の位置（例としては、対応する位置：参照によってその全体が組み込まれる米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号１もしくは３に対応するアミノ酸、または配列番号２に由来する、３０、３５、７４、９２、１０３、１４５、またはこれらのあらゆる組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）において置換された、パラ−アセチルフェニルアラニンである少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ（例えば、直鎖状ＰＥＧ）に対してオキシム結合を介して連結されているＧＨ（例えば、ｈＧＨ）を含んでいる、ホルモン組成物を提供し、ここで、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２のアミノ酸配列を含み、かつＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、１つ以上の位置（例としては、対応する位置：米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号１もしくは３に対応するアミノ酸、または配列番号２に由来する、３５、９２、１４３、１４５、またはこれらのあらゆる組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない）において置換された、パラ−アセチルフェニルアラニンである少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧ（例えば、直鎖状ＰＥＧ）とオキシム結合を介して連結されているＧＨ（例えば、ｈＧＨ）を含んでいる、ホルモン組成物を提供し、ここで、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２のアミノ酸配列を備え、かつＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、１つ以上の位置（例としては、対応する位置：米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号１もしくは３に対応するアミノ酸、または配列番号２に由来する３５位が挙げられるが、これに限定されない）において置換された、パラ−アセチルフェニルアラニンである少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。ＰＥＧが直鎖状ＰＥＧである実施形態において、ＰＥＧは、約０．１から約１００ｋＤａ、または約１から約６０ｋＤａ、または約２０から約４０ｋＤａ、または約３０ｋＤａの分子量を有し得る。
いくつかの実施形態において、本発明はポリペプチドを提供し、ここで、ポリペプチドは少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸を含み、かつポリペプチドは、複数の水溶性ポリマー（例えば、複数のＰＥＧ）と共有結合によって連結され、１つ以上の共有結合は、少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸と水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）との間におけるオキシム結合である。ポリペプチドは、約２−１００の水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、または約２−５０の水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、または約２−２５の水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、または約２−１０の水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、または約２−５の水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、または約５−１００の水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、または約５−５０の水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、または約５−２５の水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、または約５−１０の水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、または約１０−１００の水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、または約１０−５０の水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、または約１０−２０の水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、または約２０−１００の水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、または約２０−５０の水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）、または約５０−１００の水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）と連結されている。１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸は、本明細書に記載されているあらゆる位置においてポリペプチドに組み込まれ得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸は、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２の３５位に対応する位置において、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）に組み込まれている。いくつかの実施形態において、非天然にコードされたアミノ酸は、非天然にコードされたカルボニル含有アミノ酸（例えば、非天然にコードされたケトン含有アミノ酸（例えば、パラ−アセチルフェニルアラニン））である少なくとも１つの非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。いくつかの実施形態において、非天然にコードされたアミノ酸は、パラ−アセチルフェニルアラニンを含んでいる。いくつかの実施形態において、パラ−アセチルフェニルアラニンは、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２の３５位に対応する位置において、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）に組み込まれており、ここで、パラ−アセチルフェニルアラニンは、１のポリマー（例えば、１のＰＥＧ）とオキシム結合によって連結されている。いくつかの実施形態において、水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、非天然にコードされたアミノ酸の少なくとも１に対して共有結合によって、ポリペプチドと連結されている。いくつかの実施形態において、共有結合はオキシム結合である。いくつかの実施形態において、複数の水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、複数の非天然にコードされたアミノ酸に対して共有結合によって、ポリペプチドと連結されている。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの共有結合はオキシム結合であり；いくつかの実施形態において、複数の共有結合はオキシム結合であり；いくつかの実施形態において、実質的にすべての結合はオキシム結合である。複数の水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）は、直鎖状、分枝状またはあらゆるこれらの組み合わせであり得る。１つ以上の直鎖状ＰＥＧを組み込む実施形態において、直鎖状ＰＥＧは、約０．１から約１００ｋＤａ、または約１から約６０ｋＤａ、または約２０から約４０ｋＤａ、または約３０ｋＤａの分子量を有する。１つ以上の分枝状ＰＥＧを組み込む実施形態において、分枝状ＰＥＧは、約１から約１００ｋＤａ、または約３０から約５０ｋＤａ、または約４０ｋＤａの分子量を有する。複数の水溶性ポリマー（例えば、ＰＥＧ）を採用している実施形態は、一般に単一のＰＥＧが使用される実施形態よりも低い分子量にあるそのようなポリマーを採用することは、十分に理解される。従って、いくつかの実施形態において、複数のＰＥＧの全体的な分子量は、約０．１−５００ｋＤａ、または約０．１−２００ｋＤａ、または約０．１−１００ｋＤａ、または約１−１０００ｋＤａ、または約１−５００ｋＤａ、または約１−２００ｋＤａ、または約１−１００ｋＤａ、または約１０−１０００ｋＤａ、または約１０−５００ｋＤａ、または約１０−２００ｋＤａ、または約１０−１００ｋＤａ、または約１０−５０ｋＤａ、または約２０−１０００ｋＤａ、または約２０−５００ｋＤａ、または約２０−２００ｋＤａ、または約２０−１００ｋＤａ、または約２０−８０ｋＤａ、または約２０−６０ｋＤａ、または約５−１００ｋＤａ、または約５−５０ｋＤａ、または約５−２０ｋＤａである。
ヒトＧＨアンタゴニストの例としては、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、１０３、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３および１２７における置換か、１位における付加（すなわち、Ｎ末端）か、またはこれらのあらゆる組み合わせ（米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号１もしくは３に対応するアミノ酸、または配列番号２）を有するそれらが挙げられるがこれらに限定されない。
広範な非天然にコードされたアミノ酸は、ポリペプチドの所定の位置において置換され得るか、またはポリペプチドの所定の位置に組み込まれ得る。一般的に、特定の非天然にコードされたアミノ酸は、非天然にコードされたアミノ酸のその受容体を用いた３次元結晶構造の調査、非天然にコードされたアミノ酸に基づく保存的な置換（すなわち、Ｐｈｅ、ＴｙｓまたはＴｒｐに対するアリールに基づく非天然にコードされたアミノ酸（例えば、ｐ−アセチルフェニルアラニンまたはＯ−プロパルギルチロシン）の置換）に対する好ましさ、およびポリペプチドへ導入するために所望する特定の接合化学的性質（例えば、アルキル部分を有する水溶性ポリマーとのＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］環付加をもたらすこと、またはホスフィン部分を順番に組み込むアリールエステルを有する水溶性ポリマーとのアミド結合形成を望む場合には、４−アジドフェニルアラニンの導入）に基づいて、組み込みに関して選択される。
一実施形態において、本発明の方法は、第１反応基を含んでいる非天然アミノ酸をタンパク質に組み込む工程、および当該タンパク質と第２反応基を含んでいる分子とを接触させる工程を含んでいる。上記分子は特に限定されないが、例えば、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋剤、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、樹脂、第２のタンパク質またはポリペプチドあるいはポリペプチド類似体、抗体または抗体断片、金属キレート剤、共同因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスポリヌクレオチド、サッカライド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害性リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、蛍光団、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合または非共有結合で相互作用する基、光ケージド部分、化学線により励起可能な部分、光異性体化可能部分、ビオチン、ビオチンの誘導体、ビオチンの類似体、重原子を組み込んでいる部分、化学的に切断可能な基、光切断可能な基、伸長した側鎖、炭素連結型の糖、酸化還元活性化剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識されている部分、生物物理学的なプローブ、燐光性の基、化学発光性の基、電子密度の高い基、磁性基、挿入基、発色団、エネルギー伝達剤、生物活性剤、検出可能な標識、低分子、量子ドット、ナノ伝達剤、放射性ヌクレオチド、放射性伝達剤、中性子捕獲剤、あるいは上記または他の任意の所望の化合物もしくは物質の任意の組み合わせを含んでいる。第１反応基は、第２反応基と反応して、［３＋２］環付加を介して非天然アミノ酸に分子を接着する。一実施形態において、第１反応基はアルキニル部分またはアジド部分であり、第２反応基はアジド部分またはアルキニル部分である。例えば、第１反応基がアルキニル部分であり（例としては、ｐ−プロパルギルフェニルアラニンが挙げられるが、これに限定されない）、第２反応基はアジド部分である。他の例において、第１反応基はアジド部分であり（例としては、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンが挙げられるが、これに限定されない）、第２反応基はアルキニル部分である。
いくつかの場合において、非天然にコードされたアミノ酸置換は、ポリペプチド内の他の付加、置換または欠失と組み合わせられて、ポリペプチドの他の生物学的特色に影響を及ぼす。いくつかの場合において、他の付加、置換または欠失は、ポリペプチドの安定性（例としては、タンパク質分解性の消化に対する耐性が挙げられるが、これに限定されない）を増強し得るか、またはその受容体に対するポリペプチドの親和性を増強し得る。いくつかの実施形態において、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）ポリペプチドは、米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２におけるＦ１０Ａ、Ｆ１０Ｈ、Ｆ１０Ｉ；Ｍ１４Ｗ、Ｍ１４Ｑ、Ｍ１４Ｇ；Ｈ１８Ｄ；Ｈ２１Ｎ；Ｇ１２０Ａ；Ｒ１６７Ｎ；Ｄ１７１Ｓ；Ｅ１７４Ｓ；Ｆ１７６Ｙ、Ｉ１７９Ｔ、またはこれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸置換を含んでいる。ｈＧＨに関する他の置換は、参照によってその全体が組み込まれる米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書に記載されている。いくつかの場合において、他の付加、置換または欠失は、ポリペプチドの可溶性（例としては、E. coliまたは他の宿主細胞において発現される場合が挙げられるが、これらに限定されない）を増強し得る。いくつかの実施形態において、付加、置換または欠失は、E. coliまたは他の組み換え宿主細胞における発現の後における、ポリペプチドの可溶性を増強し得る。いくつかの実施形態において、部位は、E. coliまたは他の組み換え宿主細胞における発現の後における、ポリペプチドの可溶性の増強を生じる非天然アミノ酸の組み込みに関する他の部位に加えて、天然にコードされるアミノ酸、または非天然アミノ酸を用いた置換に関して選択される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、ポリペプチド受容体、結合タンパク質、関連リガンドに対する親和性を調節するか、受容体ダイマライゼーションを調節（例としては、低減または増強が挙げられるが、これらに限定されない）するか、受容体ダイマーを安定化するか、循環半減期を調節するか、放出もしくは生体利用効率を調節するか、精製を容易にするか、または特定の投与経路を改善もしくは変更する、他の付加、置換または欠失を含んでいる。例えば、本明細書に記載されている１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸の導入に加えて、１つ以上の以下の置換が導入されて、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）バリアントのその受容体に対する親和性を増強させる：Ｆ１０Ａ、Ｆ１０ＨまたはＦ１０Ｉ；Ｍ１４Ｗ、Ｍ１４Ｑ、またはＭ１４Ｇ；Ｈ１８Ｄ；Ｈ２１Ｎ；Ｒ１６７Ｎ；Ｄ１７１Ｓ；Ｅ１７４Ｓ；Ｆ１７６Ｙ；ならびにＩ１７９Ｔ。同様に、ポリペプチドは、検出（ＧＦＰなど）、精製、組織または細胞膜を介した輸送、プロドラッグの放出もしくは活性化、ポリペプチドの大きさの低下、または他のポリペプチドの特色を改善する、化学的もしくは酵素的な切断配列、プロテアーゼ切断配列、反応基、抗体結合ドメイン（ＦＬＡＧまたはポリＨｉｓなど）、他の親和性に基づく配列（ＦＬＡＧ、ポリＨｉｓ、ＧＳＴなど）、もしくは連結分子（ビオチンなど）を含んでいてもよい。
いくつかの実施形態において、非天然にコードされたアミノ酸の置換は、ポリペプチドアンタゴニストを生成する。１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸の組み込み用の例示的な部位の部分集合としては：１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、１０３、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３、１２７、または１位の前に付加（米国出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号１もしくは３に対応するアミノ酸、または配列番号２またはあらゆる他のＧＨ配列）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）アンタゴニストは、ＧＨにアンタゴニストの機能を果たさせる、領域１−５（Ｎ末端）、領域６−３３（Ａらせん）、領域３４−７４（ＡらせんとＢらせんとの間の領域、Ａ−Ｂループ）、領域７５−９６（Ｂらせん）、領域９７−１０５（ＢらせんとＣらせんとの間の領域、Ｂ−Ｃループ）、領域１０６−１２９（Ｃらせん）、領域１３０−１５３（ＣらせんとＤらせんとの間の領域、Ｃ−Ｄループ）、領域１５４−１８３（Ｄらせん）、領域１８４−１９１（Ｃ末端）において、少なくとも１つの置換を備える。他の実施形態において、非天然にコードされたアミノ酸の組み込みの例示的な部位としては、らせんＡのアミノ末端領域およびらせんＣの一部の内部にある残基が挙げられる。他の実施形態において、非天然にコードされたアミノ酸を用いたＧ１２０の置換（例えば、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンまたはＯ−プロパルギル−Ｌ−チロシン）。他の実施形態において、上述において紹介した置換は、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）ポリペプチドをＧＨ（例えば、ｈＧＨ）アンタゴニストにさせる、付加的な置換と組み合わせられる。例えば、非天然にコードされたアミノ酸は、本明細書において特定された位置の１つにおいて置換され、かつ同時の置換がＧ１２０に導入される（例えば、Ｇ１２０Ｒ、Ｇ１２０Ｋ、Ｇ１２０Ｗ、Ｇ１２０Ｙ、Ｇ１２０Ｆ、またはＧ１２０Ｅ）。いくつかの実施形態において、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）アンタゴニストは、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）分子の受容体結合領域に存在する水溶性ポリマーと連結された非天然にコードされたアミノ酸を備える。
いくつかの場合において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のアミノ酸が非天然にコードされたアミノ酸を用いて置換される。いくつかの場合において、ポリペプチドは、天然アミノ酸に対する１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の置換を、さらに含んでいる。例えば、いくつかの実施形態において、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）の以下の領域における１つ以上の残基は、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸により置換されている：１−５（Ｎ末端）；３２−４６（Ａ−ＢループのＮ末端の端部）；９７−１０５（Ｂ−Ｃループ）；および１３２−１４９（Ｃ−Ｄループ）；および１８４−１９１（Ｃ末端）。いくつかの実施形態において、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）の以下の領域における１つ以上の残基が、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸により置換される：１−５（Ｎ末端）、６−３３（Ａらせん）、３４−７４（ＡらせんとＢらせんとの間の領域、Ａ−Ｂループ）、７５−９６（Ｂらせん）、９７−１０５（ＢらせんとＣらせんとの間の領域、Ｂ−Ｃループ）、１０６−１２９（Ｃらせん）、１３０−１５３（ＣらせんとＤらせんとの間の領域、Ｃ−Ｄループ）、１５４−１８３（Ｄらせん）、１８４−１９１（Ｃ末端）。いくつかの場合において、１つ以上の非天然にコードされた残基は、１つ以上の低分子量の直鎖状または分枝状のＰＥＧ（総量においておよそ〜５−２０ｋＤａまたはそれ未満）と連結されており、これによって単一の高分子量のＰＥＧに接着された種と比較して、結合親和性および比較的な血清中半減期を増強される。
＜ＶＩＩ．非真核生物および真核生物における発現＞
クローニングされたポリヌクレオチドを高レベルで発現させるために、一般的に、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、直接転写に対する強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、さらにタンパク質をコードする核酸用であれば、翻訳開始用のリボソーム結合部位を含んでいる発現ベクターにサブクローニングする。適切な細菌プロモーターは、当業者に公知であり、かつ「Sambrookら」および「Ausubelら」に説明されている。
本発明のポリペプチドの発現を目的とした細菌発現系は、例えば、E. coli、Bacillus sp.、およびSalmonella（「Palvaら, Gene 22:229- 235 (1983)」、「Mosbachら, Nature 302:543-545 (1983)」）において、利用可能であるが、これらに限定されない。そのような発現系用のキットは市販されている。また、哺乳類細胞、酵母、および昆虫細胞にとっての真核発現系は、当業者に公知であり、かつ市販もされている。直交化ｔＲＮＡおよびアミノアシル化ｔＲＮＡシンテターゼ（上述されている）を使用して、本発明のポリペプチドが発現される場合において、発現用の宿主細胞は、直交型の構成要素を使用する該宿主細胞の能力に基づいて選択される。例示的な宿主細胞としては、グラム陽性細菌（例えば、B. brevis、B. subtilis、またはStreptomycesが挙げられるが、これらに限定されない）、およびグラム陰性細菌（E. coli、Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa、Pseudomonas putida）だけでなく、酵母および他の真核細胞が挙げられる。Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳの対を含んでいる細胞は、本明細書に記載されているように使用され得る。
本発明の真核生物の宿主細胞、または非真核生物の宿主細胞は、非常に有用な量の非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質を合成する能力を提供する。１態様において、組成物は、例えば、非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質の、少なくとも１０マイクログラム、少なくとも５０マイクログラム、少なくとも７５マイクログラム、少なくとも１００マイクログラム、少なくとも２００マイクログラム、少なくとも２５０マイクログラム、少なくとも５００マイクログラム、少なくとも１ミリグラム、少なくとも１０ミリグラム、少なくとも１００ミリグラム、少なくとも１グラム、もしくはそれ以上を含んでいるか、またはインビボタンパク質産生方法（組み換えタンパク質の産生および精製についての詳細が本明細書に与えられている）を用いて達成され得る量を任意に含んでいるが、これらに限定されない。他の態様において、タンパク質は、例えば、細胞ライセート、緩衝液、薬学的緩衝液または他の液体懸濁液（例えば、１ｎｌから１００Ｌまでの任意の量などであるが、これらに限定されない）の中に、例えば、１リットルごとに少なくとも１０マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも５０マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも７５マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも１００マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも２００マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも２５０マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも５００マイクログラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも１ミリグラムのタンパク質、１リットルごとに少なくとも１０ミリグラムのタンパク質、またはそれ以上の濃度において任意に組成物に存在するが、これらに限定されない。少なくとも１つの非天然アミノ酸を含んでいる真核細胞におけるタンパク質の大量（例えば、通常に、例えば、インビボ翻訳が挙げられる他の方法を用いて可能な量よりも多いが、これに限定されない）の産生は、本発明の１特徴である。
本発明の真核生物の宿主細胞、または非真核生物の宿主細胞は、非常に有用な量に非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質を生合成する能力を提供する。例えば、非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質は、細胞抽出物、細胞ライセート、培地、および／または緩衝液などの中に、例えば、少なくとも１０μｇ／リットル、少なくとも５０μｇ／リットル、少なくとも７５μｇ／リットル、少なくとも１００μｇ／リットル、少なくとも２００μｇ／リットル、少なくとも２５０μｇ／リットル、少なくとも５００μｇ／リットル、少なくとも１ｍｇ／リットル、少なくとも２ｍｇ／リットル、少なくとも３ｍｇ／リットル、少なくとも４ｍｇ／リットル、少なくとも５ｍｇ／リットル、少なくとも６ｍｇ／リットル、少なくとも７ｍｇ／リットル、少なくとも８ｍｇ／リットル、少なくとも９ｍｇ／リットル、少なくとも１０ｍｇ／リットル、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｍｇ／リットル、１ｇ／リットル、５ｇ／リットル、１０ｇ／リットル、またはそれ以上の濃度において、産生され得る。
‐Ｉ．発現系、培養および単離‐
任意の数の適切な発現系において、ポリペプチドを発現させてもよい。該発現系としては、例えば、酵母、昆虫、哺乳類、および細菌などが挙げられる。典型的な発現系の例を以下に示す。
（酵母）
本明細書で用いられるような用語「酵母」は、ポリペプチドをコードする遺伝子を発現可能な、任意の様々な酵母を含んでいる。そのような酵母としては、子嚢胞子を生じる酵母（ascosporogenous yeasts）（Endomycetales）、担子胞子を生じる酵母（basidiosporogenous yeasts）、および不完全真菌（Blastomycetes）の群に属する酵母などが挙げられるが、これらに限定されない。子嚢胞子を生じる酵母は、２のファミリー（SpermophthoraceaeおよびSaccharomycetaceae）に分けられる。後者は、４のサブファミリー（Schizosaccharomycoideae（Schizosaccharomyces属など）、Nadsonioideae、Lipomycoideae、およびSaccharomycoideae（Pichia属、Kluyveromyces属、およびSaccharomyces属など）から構成されている。担子胞子を生じる酵母には、Leucosporidium属、Rhodosporidium属、Sporidiobolus属、Filobasidium属、およびFilobasidiella属が含まれる。不完全真菌（Blastomycetes）の群に属する酵母は、２のファミリーSporobolomycetaceae（Sporobolomyces属およびＢｕｌｌｅｒａ属など）、およびCryptococcaceae（Candida属など）に分けられる。
本発明と一緒に使用するための特に興味のあるものとして、Pichia属, Kluyveromyces属, Saccharomyces属, Schizosaccharomyces属, Hansenula属, Torulopsis属, およびCandida属に含まれる種であり、例えば、P. pastoris, P. guillerimondii, S. cerevisiae, S. carlsbergensis, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyveri, S, norbensis, S. oviformis, K. lactis, K. fragilis, C. albicans, C. maltosa, およびH. polymorphaが挙げられるが、これらに限定されない。
ポリペプチドの発現に好適な酵母の選択は、当業者の技術範囲にある。発現用の酵母宿主の選択において、好適な宿主は、例えば、良好な分泌能、低いタンパク質分解活性、良好な分泌能、良好な可溶化タンパク質産生、および総合的な強健さを有することが示されている酵母であり得る。酵母は、一般的に様々な供給源から入手でき、例えば、カリフォルニア大学生物物理学および医学物理学分野（Department of Biophysics and Medical Physics, University of California）のYeast Genetic Stock Center (バークレイBerkeley, CA), and the American Type Culture Collection (「ATCC」) (Manassas, VA)などから入手することができる。
用語「酵母宿主」または「酵母宿主細胞」は、組み換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡの受容物として使用し得るか、または使用されている酵母を含む。この用語は、組み換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡを受け容れている元々の酵母宿主細胞の子孫を含んでいる。１の親細胞の子孫は、形態、ゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡの補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）において、偶発的な突然変異、または計画的な突然変異に起因して、元々の親細胞と必ずしも完全に一致しなくてもよいことを理解されたい。関連する性質（例えば、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在）により特徴付けられる親細胞と十分に類似する、親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれる。
発現ベクターおよび形質転換ベクター（染色体外レプリコンまたは組み込みベクターなど）は、多くの酵母宿主を形質転換するために開発された。例えば、発現ベクターは、S. cerevisiae (「Sikorskiら, GENETICS (1989) 122:19」、「Itoら, J. BACTERIOL. (1983) 153:163」、「Hinnenら, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1978) 75:1929」)、C. albicans (「Kurtzら, MOL. CELL. BIOL. (1986) 6:142」)、C. maltosa (「Kunzeら, J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141」)、H. polymorpha (「Gleesonら, J. GEN. MICROBIOL. (1986) 132:3459」、「Roggenkampら, MOL. GENETICS AND GENOMICS (1986) 202:302」)、K. fragilis (「Dasら, J. BACTERIOL. (1984) 158:1165」)、K. lactis (「De Louvencourtら, J. BACTERIOL. (1983) 154:737」、「Van den Bergら, BIOTECHNOLOGY (NY) (1990) 8:135」)、 P. guillerimondii (「Kunzeら, J. BASIC MICROBIOL. (1985) 25:141」)、 P. pastoris (「米国特許第５，３２４，６３９号明細書、米国特許第４，９２９，５５５号明細書、および米国特許第４，８３７，１４８号明細書、「Creggら, MOL. CELL. BIOL. (1985) 5:3376」、Schizosaccharomyces pombe (「Beachら, NATURE (1982) 300:706」)、および Y. lipolytica(「Davidowら, CURR. GENET. (1985) 10:380 (1985)」、「Gaillardinら, CURR. GENET. (1986) 10:49」)、A. nidulans (「Balanceら, BIOCHEM. BIOPHYS. RES. COMMUN. (1983) 112:284-89」、「Tilburnら, GENE (1983) 26:205-221」、および「Yeltonら, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1984) 81:1470-74」)、 A. niger (「Kelly and Hynes, EMBO J. (1985) 4:475-479」)、T. reesia (欧州特許出願公開第０２４４２３４号明細書)、および糸状菌(例えば、Neurospora、Penicillium、Tolypocladium(国際公開第９１／００３５７号パンフレット)など)に対して開発された。なお、各文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
酵母ベクターの制御配列は、当業者に公知であり、かつアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（欧州特許出願公開第０２８４０４４号明細書）、エノラーゼ、グルコキナーゼ、グルコース‐６リン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸‐デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰまたはＧＡＰＤＨ）、ヘキソキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、３‐ホスホグリセリン酸ムターゼ、およびピルビン酸キナーゼ（ＰｙＫ）（欧州特許出願公開第０３２９２０３号明細書）といった遺伝子に由来するプロモーター領域などが挙げられるが、これに限定されない。また、酸性ホスファターゼをコードしている酵母のＰＨＯ５遺伝子も、有用なプロモーター配列を提供し得る（Miyanoharaら, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1983) 80:1）。酵母宿主と一緒に用いるのに適切な他のプロモーター配列には、３‐ホスホグリセリン酸キナーゼ（「Hitzemanら, J. BIOL. CHEM. (1980) 255:12073」）、および他の解糖系の酵素（例えば、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、およびホスホグルコースイソメラーゼ（例えば、「Hollandら, BIOCHEMISTRY (1978) 17:4900」、「Hessら, J. ADV. ENZYME REG. (1969) 7:149」）が含まれ得る。増殖条件によって制御される転写の付加的な利点を有する、酵母の誘導性プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性ホスファターゼ、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド‐３‐リン酸デヒドロゲナーゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用を担う酵素にとってのプロモーター領域を含んでいてもよい。酵母発現への使用に適切なベクターおよびプロモーターが、欧州特許出願公開第００７３６５７号明細書に、さらに記載されている。
また、酵母エンハンサーを、酵母プロモーターと一緒に用いてもよい。さらに、合成プロモーターもまた、酵母プロモーターとして機能し得る。例えば、酵母プロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）を、別の酵母プロモーターの転写活性化領域につなぎ、合成混成プロモーターを作製してもよい。混成プロモーターとしては、例えば、ＧＡＰの転写活性化領域に連結されたＡＤＨ調節配列が挙げられる。米国特許第４，８８０，７３４号明細書、および米国特許第４，８７６，１９７号明細書を参照すればよく、これらの文献は参照によって本明細書に組み込まれる。混成プロモーターの他の例としては、解糖系酵素の遺伝子（例えば、ＧＡＰまたはＰｙＫ）の転写活性化領域と組み合わせたＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０、またはＰＨＯ５遺伝子の調節配列から成るプロモーターが挙げられる。欧州特許出願公開０１６４５５６号明細書を参照のこと。さらに、酵母プロモーターは、酵母のＲＮＡポリメラーゼとの結合能、および転写開始能を有する、非酵母由来の天然に存在するプロモーターを含んでいてもよい。
酵母発現ベクターの一部を構成し得る他の制御要素としては、例えば、ＧＡＰＤＨまたはエノラーゼ遺伝子に由来するターミネーター（「Hollandら, J. BlOL. CHEM. (1981) 256:1385」）が挙げられる。さらに、２μプラスミドの起点に由来する複製起点は、酵母に適切である。酵母に使用する適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドに存在するｔｒｐ１遺伝子である。「Tschumperら, GENE (1980) 10:157」、「Kingsmanら, GENE (1979) 7:141」を参照のこと。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン存在下において増殖能を欠如している酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。同様にＬｅｕ２欠損酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２または３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する公知のプラスミドにより補完される。
外因性ＤＮＡを酵母宿主に導入する方法は、当業者に公知の技術であり、かつ通常、アルカリ性陽イオンを用いて処理されたスフェロプラスト、または無処置の酵母宿主細胞のいずれかの形質転換が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、酵母の形質転換は、「Hsiaoら, PROC. NATL. ACAD. SCI. USA (1979) 76:3829」および「Van Solingenら, J. BACT. (1977) 130:946」に記載の方法にしたがって、実施され得る。しかし、また、例えば、核注入、エレクトロポレーション、または原形質融合によってＤＮＡを細胞に導入する他の方法も、「SAMBROOKら, MOLECULAR CLONING: A LAB. MANUAL (2001)」に通常に記載されているように、使用され得る。それから、酵母宿主細胞を当業者に公知の標準技術を用いて培養してもよい。
酵母宿主細胞において異種タンパク質を発現させる他の方法は、当業者に公知の技術である。一般的に、米国特許出願公開第２００２／００５５１６９号明細書、米国特許第６，３６１，９６９号明細書、米国特許第６，３１２，９２３号明細書、米国特許第６，１８３，９８５号明細書、米国特許第６，０８３，７２３号明細書、米国特許第６，０１７，７３１号明細書、米国特許第５，６７４，７０６号明細書、米国特許第５，６２９，２０３号明細書、米国特許第５，６０２，０３４号明細書、および米国特許第５，０８９，３９８号明細書、米国再発行特許発明第ＲＥ３７，３４３号明細書、および米国再発行特許発明第ＲＥ３５，７４９号明細書、国際公開第９９／０７８６２号パンフレット、国際公開第９８／３７２０８号パンフレット、および国際公開第９８／２６０８０号パンフレット、欧州特許出願公開第０９４６７３６号明細書、欧州特許出願公開第０７３２４０３号明細書、欧州特許出願公開第０４８０４８０号明細書、欧州特許出願公開第０４６００７１号明細書、欧州特許出願公開第０３４０９８６号明細書、欧州特許出願公開第０３２９２０３号明細書、欧州特許出願公開第０３２４２７４号明細書、および欧州特許出願公開第０１６４５５６明細書を参照のこと。また、「Gellissenら, ANTONIE VAN LEEUWENHOEK (1992) 62(l-2):79-93」、「Romanosら, YEAST (1992) 8(6):423-488」、「Goeddel, METHODS IN ENZYMOLOGY (1990) 185:3-7」を参照のこと。上記文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
酵母宿主株は、当業者に公知である標準の給飼バッチ発酵方法（feed batch fermentation method）を用いて、増幅段階の間に酵母宿主株を発酵槽において成長させてもよい。上記発酵方法は、特定の酵母宿主の炭素利用経路、または発現制御の様式の差異に原因して、適合されてもよい。例えば、saccharomyces酵母宿主の発酵は、１のグルコース飼料、複合的な窒素源（カゼイン加水分解物など）、および複数のビタミン補助物を必要としてもよい。これに対し、メチロトローフ酵母であるP. pastorisは、グリセロール、メタノール、および微量の無機化合物飼料を必要としてもよく、最適な成長および発現については単純なアンモニウム（窒素）塩だけを必要とする。例えば、米国特許第５，３２４，６３９号明細書、「Elliottら, J. PROTEIN CHEM. (1990) 9:95」、および「Fieschkoら, BIOTECH. BIOENG. (1987) 29:1113」を参照のこと。なお、これら文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
しかし、上記発酵方法は、用いられる酵母宿主株とは無関係な特定の共通の特徴を有していてもよい。例えば、成長限界栄養素（通常は炭素）を、発酵槽に増幅段階の間に添加して、最大限の成長を可能にしてもよい。さらに、発酵方法は、一般的に、十分な量の炭素、窒素、基本塩、リン、および他の微量栄養素（ビタミン、微量無機物、および塩など）を含むように調製された発酵培地を用いてもよい。Pichiaと一緒に使用するための適切な発酵培地の例が、米国特許第５，３２４，６３９号明細書、および米国特許第５，２３１，１７８号明細書に記載されている。なお、これら文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
（バキュロウイルス感染昆虫細胞）
用語「昆虫宿主」または「昆虫宿主細胞」は、組み換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡの受容物として使用し得るか、または使用されている昆虫をいう。この用語は、トランスフェクトされた元々の昆虫宿主細胞の子孫を含む。１の親細胞の子孫は、形態、ゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡの補体において、偶発的な突然変異、または計画的な突然変異に起因して、元々の親細胞と必ずしも完全に一致していなくてもよいことを理解されたい。関連する性質（例えば、ポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列の存在）により特徴付けられる親細胞と十分に類似する、親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれる。
ポリペプチドの発現に好適な昆虫細胞の選択は、当業者に公知である。いくつかの昆虫種は、当該分野において十分に説明されており、かつAedes aegypti、Bombyx mori、Drosophila melanogaster、Spodoptera frugiperda、およびTrichoplusia niを含めて、市販されている。発現用の昆虫宿主の選択において、適切な宿主は、特に、良好な分泌能、低いタンパク質分解活性、および総合的な強健さを有することが示されている宿主であり得る。昆虫は、一般的に、「Insect Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA)」、および「the American Type Culture Collection (「ATCC」) (Manassas, VA)」を含む、様々な供給源から入手することができるが、これらに限定されない。
一般的に、バキュロウイルス‐感染昆虫の発現系の構成要素は、バキュロウイルスのゲノム断片、および発現される異種遺伝子の挿入に便利な制限酵素認識部位の両方を含んでいるトランスファーベクター（普通は細菌のプラスミド）；当該トランスファーベクターにおけるバキュロウイルスに特異的な断片に対して、相同な配列を有する（これにより、バキュロウイルスゲノムに対する異種遺伝子の相同組み換えが可能になる）野生型バキュロウイルス；ならびに適切な昆虫宿主細胞および成長培地を含んでいる。ベクターの構築、細胞のトランスフェクション、プラークの選択、または培養における細胞の成長などに用いられる材料、方法および技術は公知であり、かつこれらの技術が記載されている手引書が利用可能である。
異種遺伝子をトランスファーベクターに挿入した後に、当該ベクターおよび野生型ウイルスゲノムを、当該ベクターと当該ウイルスゲノムとが組み換えを起こす昆虫宿主細胞に、トランスフェクションする。パッケージングされた組み換えウイルスが発現され、かつ組み換え体プラークが同定および精製される。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系にとっての材料および方法は、例えば、Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA)が提供している、キットの様式において市販されている。これらの技術は、一般的に当業者に公知であり、かつ「SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987)」に十分に記載されている。なお、この文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。また、「RICHARDSON, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY: BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS (1995)」、「AUSUBELら, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11 (1994)」、「KLNG AND POSSEE, THE BACULOVIRUS SYSTEM: A LABORATORY GUIDE (1992)」および「O’REILLYら, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)」を参照のこと。
バキュロウイルス／昆虫細胞発現系を用いた、様々な異種タンパク質の製造は、実際に、当業者に公知である。例えば、米国特許第６，３６８，８２５号明細書、米国特許第６，３４２，２１６号明細書、米国特許第６，３３８，８４６号明細書、米国特許第６，２６１，８０５号明細書、米国特許第６，２４５，５２８号明細書、米国特許第６，２２５，０６０号明細書、米国特許第６，１８３，９８７号明細書、米国特許第６，１６８，９３２号明細書、米国特許第６，１２６，９４４号明細書、米国特許第６，０９６，３０４号明細書、米国特許第６，０１３，４３３号明細書、米国特許第５，９６５，３９３号明細書、米国特許第５，９３９，２８５号明細書、米国特許第５，８９１，６７６号明細書、米国特許第５，８７１，９８６号明細書、米国特許第５，８６１，２７９号明細書、米国特許第５，８５８，３６８号明細書、米国特許第５，８４３，７３３号明細書、米国特許第５，７６２，９３９号明細書、米国特許第５，７５３，２２０号明細書、米国特許第５，６０５，８２７号明細書、米国特許第５，５８３，０２３号明細書、米国特許第５，５７１，７０９号明細書、米国特許第５，５１６，６５７号明細書、米国特許第５，２９０，６８６号明細書、国際公開第０２／０６３０５号パンフレット、国際公開第０１／９０３９０号パンフレット、国際公開第０１／２７３０１号パンフレット、国際公開第０１／０５９５６号パンフレット、国際公開第００／５５３４５号パンフレット、国際公開第００／２００３２号パンフレット、国際公開第９９／５１７２１号パンフレット、国際公開第９９／４５１３０号パンフレット、国際公開第９９／３１２５７号パンフレット、国際公開第９９／１０５１５号パンフレット、国際公開第９９／０９１９３号パンフレット、国際公開第９７／２６３３２号パンフレット、国際公開第９６／２９４００号パンフレット、国際公開第９６／２５４９６号パンフレット、国際公開第９６／０６１６１号パンフレット、国際公開第９５／２０６７２号パンフレット、国際公開第９３／０３１７３号パンフレット、国際公開第９２／１６６１９号パンフレット、国際公開第９２／０３６２８号パンフレット、国際公開第９２／０１８０１号パンフレット、国際公開第９０／１４４２８号パンフレット、国際公開第９０／１００７８号パンフレット、国際公開第９０／０２５６６号パンフレット、国際公開第９０／０２１８６号パンフレット、国際公開第９０／０１５５６号パンフレット、国際公開第８９／０１０３８号パンフレット、国際公開第８９／０１０３７号パンフレット、国際公開第８８／０７０８２号パンフレットを参照のこと。なお、各文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に有用なベクターは、公知であり、かつ例えば、バキュロウイルスのAutographacalifornica核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）に由来する、ヘルパー非依存性のウイルスベクターである昆虫の発現およびトランスファーベクターを含んでいる。この系に由来するウイルス発現ベクターは、一般的に、異種遺伝子の発現を誘導するために、ウイルスの強力なポリへドリン遺伝子プロモーターを利用する。一般的には、「O’Reillyら, BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS: A LABORATORY MANUAL (1992)」を参照のこと。
外来の遺伝子をバキュロウイルスのゲノムに挿入する前に、上記構成要素（プロモーター、リーダー（必要に応じて）、興味のあるコード配列、および転写終結配列を含んでいる）は、通常、中間置換コンストラクト（Intermediate transplacement construct）（トランスファーベクター）に集められる。中間置換コンストラクトは、細菌などの宿主において安定な維持が可能な染色体外エレメント（例えば、プラスミド）といった、レプリコンにおいてしばしば維持される。レプリコンは１の複製系を有し、このため、クローニングおよび増幅に適切な宿主における当該レプリコンの維持を可能にする。より具体的には、プラスミドは、ポリヘドリンポリアデニル化シグナル（「Miller, ANN. REV. MICROBIOL. (1988) 42:177」）と、Ｅ．ｃｏｌｉにおける選択および増殖に関する、原核生物のアンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子と複製起点と、を含有する。
ＡｃＮＰＶへ外来遺伝子を導入するために一般的に使用されるトランスファーベクターの１つは、ｐＡｃ３７３である。当業者に公知である他の多くのベクターもまた設計されており、例えば、ｐＶＬ９８５が挙げられる。ｐＶＬ９８５では、ポリヘドリン開始コドンがＡＴＧからＡＴＴに変えられ、かつＡＴＴの下流の３２塩基対にＢａｍＨＩクローニング部位が導入されている（「Luckow and Summers, VIROLOGY 170:31 (1989)」を参照のこと）。他の市販されているベクターとしては、例えば、PBlueBac4.5/V5-His、pBlueBacHis2、pMelBac、pBlueBac4.5(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）が挙げられる。
異種遺伝子を挿入した後に、トランスファーベクターおよび野生型バキュロウイルスのゲノムを、昆虫細胞宿主に同時トランスフェクションする。異種ＤＮＡをバキュロウイルスの所望の部位に導入するための方法は、当該分野において公知である。例えば、「SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987)」、「Smithら, MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156」、「Luckow and Summers, VIROLOGY (1989) 170:31」を参照のこと。例えば、挿入は、２重交差型相同組み換えによって、ポリへドリン遺伝子などの遺伝子の中にあり得る。また、挿入は、所望のバキュロウイルス遺伝子中に設けられた、制限酵素認識部位の中にあり得る。例えば、「Millerら, BIOESSAYS (1989) 11(4):91」を参照のこと。
トランスフェクションを、エレクトロポレーションにより達成してもよい。「TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995)」、「Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501」を参照のこと。代替可能に、リポソームを使用して、組み換え発現ベクターとバキュロウイルスとを用いて昆虫細胞をトランスフェクションしてもよい。例えば、「Liebmanら., BIOTECHNIQUES (1999) 26(1):36」、「Gravesら, BIOCHEMISTRY (1998) 37:6050」、「Nomuraら, J. BIOL. CHEM. (1998) 273(22): 13570」、「Schmidtら, PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1998) 12:323」、「Siffertら, NATURE GENETICS (1998) 18:45」、「TILKINSら, CELL BIOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK 145-154 (1998) 」、「Caiら, PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION (1997) 10:263」、「Dolphinら, NATURE GENETICS (1997) 17:491」、「Kostら, GENE (1997) 190:139」、「Jakobssonら, J. BlOL. CHEM. (1996) 271:22203」、「Rowlesら, J. BIOL. CHEM. (1996) 271(37): 22376」、「Revereyら, J. BIOL. CHEM. (1996) 271(39) :23607- 10」、「Stanleyら, J. BlOL. CHEM. (1995) 270:4121」、「Siskら, J. VlROL. (1994) 68(2):766」、および「Pengら, BIOTECHNIQUES (1993) 14(2):274」を参照のこと。市販されているリポソームとしては、例えば、セルフェクチン(Cellfectin(登録商標))、およびリポフェクチン(Lipofectin(登録商標))(Invitrogen, Corp., Carlsbad, CA)が挙げられる。また、リン酸カルシウムトランスフェクションを用いてもよい。「TROTTER AND WOOD, 39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1995)」、「Kitts, NAR (1990) 18(19):5667」、および「Mann and King, J. GEN. VIROL. (1989) 70:3501」を参照のこと。
バキュロウイルス発現ベクターは、たいていは、バキュロウイルスプロモーターを含んでいる。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスのＲＮＡポリメラーゼが結合でき、コード配列（例えば、構造遺伝子）をｍＲＮＡへと下流（３’）へ転写開始する任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、コード配列の５’末端近傍にたいてい配置される、転写開始領域を有している。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と転写開始部位とを含んでいる。また、バキュロウイルスのプロモーターは、エンハンサーと呼ばれる２次ドメインを有していてもよい。この２次ドメインは、存在する場合は、構造遺伝子から遠位に存在する。また、発現は、調節されてもよいし、恒常的であってもよい。
ウイルス感染サイクルの後期に多量に転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を提供する。有用なプロモーター配列の例としては、ウイルスポリヘドリンタンパク質をコードする遺伝子由来の配列（「FRIESENら, The Regulation of Baculovirus Gene Expression in THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (1986)」、欧州特許出願公開第０１２７８３９号明細書、および欧州特許出願公開第０１５５４７６号明細書）、およびｐ１０タンパク質をコードする遺伝子由来の配列（「Vlakら, J. GEN. VlROL. (1988) 69:765」）が挙げられる。
新しく形成されたバキュロウイルス発現ベクターは、感染性の組み換えバキュロウイルスにパッケージングされる。その後、成長したプラークが当業者に公知の方法により精製されもよい。「Millerら, BIOESSAYS (1989) 11(4):91」、「SUMMERS AND SMITH, TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN NO. 1555 (1987)」を参照のこと。
組み換えバキュロウイルス発現ベクターは、いくつかの昆虫細胞へ感染させるために開発されている。例えば、取り分け、Aedes aegypti(ATCC番号CCL-125)、Bombyx mori(ATCC番号CRL-8910)、Drosophila melanogaster(ATCC番号1963)、Spodoptera frugiperda、およびTriclioplusia niのための組み換えバキュロウイルスが開発されている。国際公開第８９／０４６，６９９号パンフレット、「Wright, NATURE (1986) 321:718」、「Carbonellら, J. VlROL. (1985) 56:153」、「Smithら, MOL. CELL. BIOL. (1983) 3:2156」を参照のこと。一般的には、「Fraserら, IN VITRO CELL. DEV. BIOL (1989) 25:225」を参照のこと。より具体的には、バキュロウイルス発現ベクターの系に用いられる細胞株としては、通常、Sf9(Spodoptera frugiperda)(ATCC番号CRL-1711)、Sf21(Spodoptera frugiperda)(Invitrogen Corp.,カタログ番号11497-013 (Carlsbad, CA))、Tri-368(Trichopulsia ni)、およびHigh-Five(登録商標)BTI-TN-5B1-4(Trichopulsia ni)が挙げられるが、これらに限定されない。
バキュロウイルス／発現における異種ポリペプチドの直接発現と融合発現とのための細胞および培地は、市販されている。また、細胞培養技術は、当業者に公知である。
（E. Coli、Pseudomonas species、および他の原核生物）
細菌における発現技術は、当業者に公知である。様々なベクターが、細菌宿主における使用に利用可能である。これらベクターは、１コピーベクター、またはコピー数が少ない多コピー型ベクターもしくはコピー数が多い多コピー型ベクター（low or high multicopy vectors）であってもよい。ベクターは、クローニングおよび／または発現に役立ち得る。ベクター、ベクターに関する豊富な文献、多くの市販のベクター、ならびにベクターとその制限酵素地図とその特徴とについて記載している手引書も同等に考慮して、本明細書では、これ以上論じる必要は無い。よく知られているように、ベクターは、通常は選択を可能にするマーカーを含んでいる。このマーカーは、細胞毒性剤への耐性、原栄養性、または免疫を提供し得るものである。しばしば、異なる特徴を提供する複数のマーカーが存在する。
細菌プロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼと結合可能な、およびコード配列（例えば、構造遺伝子）をｍＲＮＡへと下流（３’）へ転写開始できる任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、コード配列の５’末端近傍にたいてい配置される転写開始領域を有している。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位と転写開始部位とを含んでいる。また、細菌プロモーターは、オペレーターと呼ばれる２次ドメインを有していてもよい。この２次ドメインは、ＲＮＡ合成が始まる隣接したＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複してもよい。遺伝子リプレッサータンパク質が、オペレーターに結合することにより、特定の遺伝子の転写を阻害し得るように、オペレーターは、負に調節される（誘導性の）転写を可能にする。恒常的発現は、負の調節要素（オペレーターなど）が無いときに起こり得る。さらに、正の調節が、遺伝子アクチベータータンパク質の結合配列によりもたらされてもよい。該結合配列は、存在する場合は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列よりも遠位（５’）に存在する。遺伝子アクチベータータンパク質としては、例えば、カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）が挙げられる。このＣＡＰは、Escherichia coli(E. coli)のｌａｃオペロンの転写開始を助ける（「Raibaudら, ANNU. REV. GENET. (1984) 18:173」）。したがって、制御された発現は、正または負のいずれかであってもよく、これによって転写を増強または低減させてもよい。
代謝経路の酵素をコードしている配列は、特に有用なプロモーターを提供する。この配列としては、例えば、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（「Changら, NATURE (1977) 198:1056」）、およびマルトースなどの糖代謝酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる。別の例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）などの生合成酵素に由来するプロモーター配列が挙げられる（「Goeddelら, Nuc. ACIDS RES. (1980) 8:4057」、「Yelvertonら, NUCL. ACIDS RES. (1981) 9:731」、米国特許第４，７３８，９２１号明細書、欧州公開第０３６７７６号明細書、欧州公開第１２１７７５号明細書）。なお、これら文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。また、β‐ガラクトシダーゼ（ｂｌａ）のプロモーター系（「Weissmann (1981) “The cloning of interferon and other mistakes.” In Interferon 3 (Ed. I. Gresser) 」）、バクテリオファージ・ラムダのＰＬ（「Shimatakeら, NATURE (1981) 292:128」）、およびＴ５（米国特許第４，６８９，４０６号明細書）のプロモーター系も、有用なプロモーター配列を提供する（なお、これら文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。本発明の好ましい方法は、ポリペプチドを高レベルに誘導するためのＴ７プロモーターなどの強力なプロモーターを利用する。そのようなベクターの例は、当業者に公知であり、ｐＥＴ２９のシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、および国際公開第９９／０５２９７号明細書に記載のｐＰＯＰベクターなどが挙げられる（なお、上記文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）。そのような発現系は、宿主細胞の生存能力または成長パラメーターに支障をきたすことなく、宿主において、ポリペプチドを高レベルに産生する。
また、天然に生じない合成プロモーターも、細菌プロモーターとして機能する。例えば、１の細菌またはバクテリオファージのプロモーターの転写活性化配列を、別の細菌またはバクテリオファージのプロモーターのオペロン配列に結合して、合成混成プロモーターを作製してもよい（米国特許第４，５５１，４３３号明細書（なお、この文献は、参照によって本明細書に組み込まれる））。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーター配列と、ｌａｃリプレッサーにより調節されるｌａｃオペロン配列とを含む混成ｔｒｐ‐ｌａｃプロモーターである（「Amannら, GENE (1983) 25:167」、「de Boerら, PROC. NATL. ACAD. SCI. (1983) 80:21」）。さらに、細菌プロモーターは、細菌のＲＮＡポリメラーゼとの結合能、および転写開始能を有する非細菌起源の天然に生じるプロモーターを含んでいてもよい。また、非細菌起源の天然に生じるプロモーターを、適合するＲＮＡポリメラーゼに結合させることにより、原核生物におけるいくつかの遺伝子を高レベルに発現させることができる。バクテリオファージのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、共役型プロモーター系の例である（「Studierら, J. MOL. BIOL. (1986) 189:113」、「Taborら, Proc Natl. Acad. Sci. (1985) 82:1074」）。さらに、混成プロモーターは、バクテリオファージプロモーターと、E. coliのオペレーター領域とを含んでいてもよい（欧州公開第２６７８５１号明細書）。
また、機能性プロモーター配列に加えて、効率的なリボソーム結合部位が、外来遺伝子を原核細胞において発現させるために有効である。E. coliにおいて、リボソーム結合部位は、シャイン‐ダルガルノ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）と、該開始コドンから３〜１１ヌクレオチド上流に位置した、長さ３〜９ヌクレオチドの配列とを含んでいる（「Shineら, NATURE (1975) 254:34」）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とE. coliの16S rRNAの３’との間において塩基対を形成することにより、ｍＲＮＡとリボソームとの結合を促進すると考えられている（「Steitzら “Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA”, In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Ed. R. F. Goldberger, 1979) 」）。真核性遺伝子および原核性遺伝子を、弱いリボソーム結合部位により発現すること（「Sambrookら “Expression of cloned genes in Escherichia coli”, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989」）。
用語「細菌宿主」または「細菌宿主細胞」は、組み換えベクターまたは他のトランスファーＤＮＡにとっての受容物として使用され得るか、または使用されている細菌のことをいう。この用語は、トランスフェクションされている元々の細菌宿主細胞の子孫を含む。１の親細胞の子孫は、形態、ゲノムＤＮＡまたは全ＤＮＡの補体において、偶発的な突然変異、または計画的な突然変異に起因して、元々の親細胞と必ずしも完全に一致していなくてもよいことを理解されたい。関連する性質（例えば、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在）により特徴付けられる親細胞と十分に類似する、親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれる。
ポリペプチドの発現に適切な細菌宿主の選択は、当業者に公知である。発現のための細菌宿主の選択において、適切な宿主は、取り分け、良好な封入体形成能、低いタンパク質分解活性、および全体的に強健さを有することが示されている宿主であってもよい。細菌宿主は、一般的に、様々な供給源から入手することができ、例えば、「Bacterial Genetic Stock Center, Department of Biophysics and Medical Physics, University of California (Berkeley, CA)」、および「the American Type Culture Collection (「ATCC」) (Manassas, VA)」から入手することができるが、これらに限定されない。Ｋ株に由来する細菌（Ｗ３１１０など）、またはＢ株に由来する細菌（ＢＬ２１など）が、一般的に産業的／製薬的な発酵に用いられる。これらの株は、成長パラメーターが、極めてよく知られており、かつ強健であるから特に有用である。さらに、これらの株は、安全性および環境的理由にとって商業的に重要な、非病原性である。好適なE. coli宿主の他の例としては、BL21、DH10Bまたはこれらの派生物が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法のもう１つ別の実施形態では、E. coli宿主は、プロテアーゼが欠失した株（ＯＭＰ−、およびＬＯＮ−が挙げられるが、これらに限定されない）である。本発明の方法のもう１つ別の実施形態では、宿主細胞株は、Pseudomonas種(Pseudomonas fluorescens、Pseudomonas aeruginosa、およびPseudomonas putidaが挙げられるが、これらに限定されない)である。MB101株と命名されたPseudomonas fluorescensの１つの次亜種は、組み換え体の製造に有用であることが知られており、治療用タンパク質の製造過程に利用可能である。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの発現系の例としては、宿主株として「The Dow Chemical Company」から入手可能な系が挙げられる（Midland, MI(ワールドワイドウェブの「dow.com」において利用できる））。米国特許第４，７５５，４６５号明細書、および米国特許第４，８５９，６００号明細書には、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）を産生するための宿主細胞としてPseudomonas株を使用することが記載されている。なお、これらの文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
組み換え宿主細胞株が、確立されれば（すなわち、発現コンストラクトが、宿主細胞に導入され、適切な発現コンストラクトを有する宿主細胞が単離されれば）、当該組み換え宿主細胞株が、ポリペプチドの産生に適切な条件下において培養される。当業者には明らかなように、組み換え宿主細胞株の培養方法は、利用される発現コンストラクトの性質と、宿主細胞の個性とに依存する。組み換え宿主株は、当業者に公知の方法を用いて培養される。組み換え宿主細胞は、通常、炭素、窒素および無機塩の吸収可能な供給源、ならびに任意に、ビタミン、アミノ酸、成長因子、および当業者にとって公知の他のタンパク質性の培養補助物を含んでいる液体培養基において一般的に培養される。また、宿主細胞の培養のための液体培養基は、望ましくない微生物および／または化合物の成長を阻害するための抗生物質、または抗真菌剤（発現ベクターを含んでいる宿主細胞を選択するための抗生物質が挙げられるが、これに限定されない）を、任意に含み得る。
組み換え宿主細胞は、バッチ式または連続式で培養され、（ｉ）細胞を収集する（ポリペプチドが細胞内に蓄積する場合に）か、または（ｉｉ）バッチ式もしくは連続式のいずれかにおける培養上清を収集してもよい。原核生物の宿主細胞での製造については、バッチ式培養および細胞収集が好ましい。原核宿主細胞における産生のために、バッチ培養および細胞回収が好ましい。
本発明のポリペプチドは、組み換え系における発現の後に、普通は、精製される。ポリペプチドは、技術的にとって公知の様々な方法によって、宿主細胞または培地から精製され得る。細菌宿主細胞において産生されたポリペプチドは、（封入体の形態において）可溶性に乏しくても、または不溶性であってもよい。本発明の一実施形態では、技術的に公知の方法だけでなく、本明細書に記載された方法を利用して、アミノ酸の置換が、組み換えにより製造されたタンパク質の可溶性の増加を目的として選択されるポリペプチドにおいて容易に行われ得る。不溶性のタンパク質の場合に、当該タンパク質は、宿主細胞ライセートから遠心分離によって回収され得、さらに続く細胞のホモジナイゼーション（homogenization）が行われ得る。可溶性に乏しいタンパク質の場合、化合物（ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が挙げられるが、これに限定されない）は、部分的に可溶性のタンパク質の沈殿を引き起こすために加えられ得る。それから、沈殿したタンパク質は、遠心分離によって好都合に回収され得る。当業者にとって公知の様々な方法により、組み換え宿主細胞が崩壊またはホモジナイズされて、当該細胞内から封入体が放出され得る。宿主細胞の崩壊またはホモジナイゼーションは、よく知られる技術（酵素的細胞崩壊、超音波処理、ダウンス型ホモジナイゼーション（dounce homogenization）、または高圧放出崩壊が挙げられるが、これらに限定されない）を用いて実施され得る。本発明の方法の一実施形態では、高圧放出技術を、E. coli宿主細胞の崩壊に使用することにより、ポリペプチドの封入体を放出させる。ポリペプチドの封入体を取り扱うときに、繰り返しのホモジナイゼーション時間を最小化することが好都合である。これにより、可溶化、器械的なせん断またはタンパク質分解などの要因による損失を無くし、封入体の収量が最大になる。
不溶性のまたは沈殿したポリペプチドは、当該技術にとって公知の、適切な多くの可溶化試薬のいずれかを用いて可溶化され得る。好ましくは、ポリペプチドは、尿素またはグアジニン塩酸塩を用いて可溶化され得る。バッチの大きさが都合よく扱いやすいものを用いて、大規模なバッチが産生され得るように、可溶化されたポリペプチドの容積は、最小化されるべきである。組み換え宿主細胞が一度に数千リットルの容積であるバッチで成長され得るとき、この要因は、大規模な工業的設定において重要であり得る。また、特にヒトへの製薬利用のために大規模な工業的設定においてポリペプチドを製造するとき、機械および容器か、タンパク質産物自体かのいずれかを損傷するおそれのある過酷な化学物質の回避は、可能であれば、避けられるべきである。穏やかな変性試薬である尿素を、過酷な変性試薬であるグアニジン塩酸塩の代わりに、ポリペプチド封入体の可溶化に使用できることが、本発明の方法に示されている。尿素の使用は、ポリペプチドの製造過程および精製過程に利用されるステンレス鋼の設備に対する損傷の危険度を有為に低減すると同時に、ポリペプチド封入体を効率的に可溶化する。
可溶性タンパク質の場合、ポリペプチドは、細胞膜周辺腔に、または培地に分泌され得る。また、可溶性ポリペプチドは、宿主細胞の細胞質に存在し得る。精製段階を実施する前に、可溶性ポリペプチドを濃縮することが望ましいことがある。当業者に公知の標準的な技術は、細胞ライセートまたは培地などからの可溶性ポリペプチドの濃縮に使用され得る。また、当業者に公知の標準的な技術は、宿主細胞の崩壊、および宿主細胞の細胞質もしくは細胞膜周辺腔からの可溶性ポリペプチドの放出に使用され得る。
ポリペプチドが融合タンパク質として産生されるとき、融合配列は除去され得る。融合配列の除去は、酵素的切断または化学的切断によって果たされ得る。融合配列の酵素的除去は、当業者に公知の方法を用いて果たされ得る。融合配列の除去にふさわしい酵素の選択は、融合の個性によって決定され、かつ反応条件は、当業者にとって明らかなような酵素の選択によって特定される。化学的切断は、当業者に公知の試薬（臭化ブロマイド、ＴＥＶプロテアーゼ、および他の試薬が挙げられるが、これらに限定されない）を用いて果たされ得る。切断されたポリペプチドは、当業者に公知の方法によって、切断された融合配列から精製され得る。そのような方法は、当業者にとって明らかなように、融合配列およびポリペプチドの個性および性質によって決定される。精製方法の例としては、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、もしくは透析、またはこれらのあらゆる組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
また、ポリペプチドは、タンパク質溶液からＤＮＡを除去するために、精製され得る。ＤＮＡは、当業者に公知のあらゆる適切な方法（例えば、沈殿またはイオン交換クロマトグラフィー）によって除去され得るが、核酸沈殿試薬（例えば、硫酸プロタミンであるが、これに限定されない）を用いた沈殿によって除去され得る。ポリペプチドは、標準的なよく知られた方法（例としては、遠心分離またはろ過が挙げられるが、これらに限定されない）を用いて、沈殿されたＤＮＡから分離され得る。ポリペプチドがヒトの治療に用いられる設定、および本発明の方法が薬学的に許容可能なレベルまで宿主細胞のＤＮＡを低減する設定において、宿主核酸分子の除去は重要な要員である。
また、小規模または大規模な発酵方法は、タンパク質発現（例としては、発酵槽、振とうフラスコ、流動床バイオリアクター、中空糸バイオリアクター、ローラーボトル培養系、および攪拌タンクバイオリアクター系が挙げられるが、これらに限定されない）に使用され得る。これらの方法のそれぞれは、バッチ処理、給飼バッチ処理、連続様式処理において実施され得る。
本発明のヒトＧＨポリペプチドは、当該分野における標準的な方法を用いて、通常に回収され得る。例えば、培地または細胞ライセートは、細胞破片を除去するために遠心分離またはろ過され得る。上清は、濃縮され得るか、またはさらなる精製用の調製物を適当な状態にする適切な緩衝液の中において、所望の容積に希釈もしくは透析され得る。本発明のポリペプチドのさらなる精製としては、原型の形態から脱アミド化され、かつ短縮されたポリペプチドバリアントの形態の分離が挙げられる。
以下の例示的な手法のいずれかは、本発明のポリペプチドの精製に採用され得る。当該手法は、アフィニティークロマトグラフィー；陰イオン交換クロマトグラフィーもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー（例としては、DEAE SEPHAROSEを用いたものが挙げられるが、これに限定されない）；シリカ上におけるクロマトグラフィー；高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）；逆相ＨＰＬＣ；ゲルろ過（例としては、SEPHADEX G-75を用いたものが挙げられるが、これに限定されない）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；金属キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／ダイアフィルトレーション；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿；等電点電気泳動（chromatofocusing）；置換クロマトグラフィー；電気泳動的手法（例としては、調製用等電点電気泳動（isoelectric focusing）が挙げられるが、これに限定されない）、差別的可溶性（differential solubility）（例としては、硫酸アンモニウム沈殿が挙げられるが、これに限定されない）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは抽出である。
本発明のタンパク質（例としては、非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質、非天然アミノ酸を含んでいるペプチド、非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質に対する抗体、非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質にとっての結合パートナーなどが挙げられるが、これらに限定されない）は、当業者に公知の、かつ使用される標準的な手法に従って、部分的または実質的に均質に精製される。従って、本発明のポリペプチドは、当業者に公知の任意の多くの方法（例としては、硫酸アンモニウム沈殿もしくはエタノール沈殿、酸抽出もしくは塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、およびゲル電気泳動などが挙げられるが、これらに限定されない）によって、回収および精製され得る。タンパク質をリフォールディングする工程は、必要に応じて、正確に折りたたまれた成熟タンパク質を作製するときに、使用され得る。高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー、または他の適切な方法は、高い純度が所望される場合に、最終的な精製工程において採用され得る。一実施形態において、非天然アミノ酸（または非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質もしくはペプチド）に対して作製された抗体は、１つ以上の非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質またはペプチドの親和性に基づく精製などのための精製試薬として使用され得る。必要に応じて、部分的にまたは均質にまで精製されると、ポリペプチドは、多種多様な有用物（例えば、アッセイの構成要素、治療学、予防法、診断学、研究試薬として、および／または抗体生成用の抗原としてであるが、これらに限定されない）に関して、任意に使用される。
本明細書に言及されている他の参考文献に加えて、様々な精製／タンパク質折りたたみ方法は、当業者に公知である（例えば、「R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y. (1982）」、「Deutscher, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification. Academic Press, Inc. N.Y. (1990) 」、「Sandana, (1997) Bioseparation of Proteins, Academic Press, Inc.」、「Bollagら (1996) Protein Methods, 2nd Edition Wiley-Liss, NY」、「Walker, (1996) The Protein Protocols Handbook Humana Press, NJ, Harris and Angal, (1990) Protein Purification Applications: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England」、「Harris and Angal, Protein Purification Methods: A Practical Approach IRL Press at Oxford, Oxford, England」、「Scopes, (1993) Protein Purification: Principles and Practice 3rd Edition Springer Verlag, NY」、「Janson and Ryden, (1998) Protein Purification: Principles, High Resolution Methods and Applications, Second Edition Wiley-VCH, NY」、および「Walker (1998), Protein Protocols on CD-ROM Humana Press, NJ」ならびにこれらに引用されている参考文献に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない）。
真核生物の宿主細胞または非真核生物の宿主細胞において、非天然アミノ酸を用いて興味のあるタンパク質またはポリペプチドを産生することの１つの利点は、通常、該タンパク質または該ポリペプチドが、それらの本来の立体構造に折りたたまれることである。しかし、本発明のある種の実施形態において、当業者は、合成、発現および／または精製の後に、タンパク質またはポリペプチドが、関連するポリペプチドの所望の立体構造とは異なる立体構造を有することが可能であることを認識している。本発明の１態様において、発現されたタンパク質またはポリペプチドは、任意に変性され、かつそれから復元される。これは、当該分野において公知の方法を利用して（例としては、興味のあるタンパク質またはポリペプチドに対するシャペロニンの添加によって、カオトロピック剤（例えば、グアニジンＨＣｌ）にタンパク質を可溶化することによって、またはタンパク質二硫化物異性化酵素を用いてなどが挙げられるが、これらに限定されない）果たされ得る。
一般的には、発現したポリペプチドを変性または還元して、その後に当該ポリペプチドを好ましい立体構造へとリフォールディングさせることが望ましいことがある。例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥ、および／またはシャペロニンは、興味のある転写産物に加えられ得る。タンパク質の還元、変性および復元の方法は、当業者に公知である（「Debinski,ら, (1993) J. Biol. Chem., 268: 14065- 14070」、「Kreitman and Pastan (1993) Bioconiug. Chem.. 4: 581-585」、および「Buchner,ら, (1992) Anal. Biochem., 205: 263-270」を参照のこと）。Ｄｅｂｉｎｓｋｉらは、例えば、グアニジン−ＤＴＥにおける封入体タンパク質の変性および還元を記載している。タンパク質は、還元剤（例としては、酸化型グルタチオンおよびＬ−アルギニンを含有する還元剤が挙げられるが、これらに限定されない）においてリフォールディングされ得る。リフォールディング剤は、流されるか、またはそうでなければ、移動されて、１つ以上のポリペプチドもしくは他の発現産物と接触させられ得る。また、その逆もあり得る。
ポリペプチドを原核生物において産生する場合、そのように産生されるポリペプチドは、誤って折りたたまれることがある。このため、ポリペプチドの生物活性が、欠如または低減されていることがあり得る。タンパク質の生物活性は、「リフォールディング」によって復帰され得る。通常、誤って折りたたまれたポリペプチドは、例えば、１つ以上のカオトロピック剤（例えば、尿素および／またはグアニジン）およびジスルフィド結合を還元可能な還元剤（例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、または２メルカプトエタノール（２−ＭＥ））を用いて、ポリペプチド鎖が可溶化（ポリペプチドも不溶性である場合に）、アンフォールディングおよび還元されることによってリフォールディングされ得る。それから、穏やかな濃度のカオトロープ（chaotorope）において、ジスルフィド結合の強化を可能にする酸化剤（例えば、酸素、シスチンまたはシスタミン）が添加される。ポリペプチドは、当該分野において公知の標準的な方法（例えば、米国特許第４，５１１，５０２号明細書、米国特許第４，５１１，５０３号明細書、および米国特許第４，５１２，９２２号明細書に記載の方法、これらの文献は、参照によって本明細書に組み込まれる）を用いてリフォールディングされ得る。また、ポリペプチドは、他のタンパク質と共同して折りたたまれて、ヘテロダイマーまたはヘテロマルチマーを形成し得る。
リフォールディングまたは共同折りたたみの後に、ポリペプチドは、さらに精製され得る。ポリペプチドの精製は、当業者に公知の多様な技術（例としては、疎水性相互作用クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、および親和性クロマトグラフィーが挙げられるが、これらに限定されない）を用いて果たされ得る。また、付加的な精製は、精製されたタンパク質の乾燥または沈殿の段階を含み得る。
精製の後に、ポリペプチドは、当該分野において公知のあらゆる多様な方法（例としては、ダイアフィルトレーションおよび透析が挙げられるが、これらに限定されない）によって、異なる緩衝液に交換され得る、および／または濃縮され得る。単精製タンパク質として与えられるポリペプチドは、凝集および沈殿に供され得る。
精製ポリペプチドは、少なくとも９０％の純度（逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、またはドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって測定される純度）、または少なくとも９５％の純度、または少なくとも９８％の純度、または少なくとも９９％の純度、またはそれ以上の純度であり得る。ポリペプチドの正確な数値的な純度に関係なく、ポリペプチドは、薬学的産物としての使用、またはさらなる処理（例えば、水溶性ポリマー（ＰＥＧなど）との接合）にとって十分な純度であり得る。
ある種の分子は、他の活性成分もしくはタンパク質（賦形剤、担体および安定剤、ならびに血清アルブミンなど）の非存在下において治療薬として使用され得るか、またはそれらは、他のタンパク質もしくはポリマーとともに複合化され得る。
（一般的な精製方法）
様々な単離工程のいずれか１つは、ポリペプチドを含んでいる細胞ライセート、培地、抽出物、封入体、宿主細胞の細胞膜周辺腔、宿主細胞の細胞質または他の物質に対して実施されるか、または任意の単離工程から得られたポリペプチド混合物に対して実施される。上記任意の単離工程には、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）、逆相ＨＰＬＣ（「ＰＲ−ＨＰＬＣ」）、発泡床吸着（expanded bed adsorption）、またはそれらの任意の組み合わせおよび／あるいは繰り返し、ならびに任意の適切な順序でのそれらの任意の組み合わせおよび／または繰り返しが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載されている技術の実施に使用される設備、および他の必要な材料は、市販されている。ポンプ、フラクションコレクター、モニター、記録器、および全体のシステムが、例えば、Applied Biosystems(Foster City, CA)、Bio-Rad Laboratories, Inc.(Hercules, CA)、およびAmersham Biosciences, Inc.(Piscataway, NJ）から市販されている。また、クロマトグラフィーの材料（例としては、交換基質材料、溶剤および緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない）は、そのようは企業から入手可能である。
本明細書に記載されているカラムクロマトグラフィー手法における平衡および他の工程（例えば、洗浄および溶出）は、特殊な設備（例えば、ポンプ）を用いてより速く実施され得る。市販のポンプの例としては、ハイロードポンプＰ−５０（HILOAD（登録商標） Pump P-50）、ペリスタルティックポンプＰ−１（Peristaltic Pump P-1）、ポンプＰ−９０１（Pump P-901）、およびポンプＰ−９０３（Ｐｕｍｐ Ｐ−９０３）（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）が挙げられるが、これらに限定されない。
フラクションコレクターの例としては、レディフラック フラクションコレクター（REDIFRAC Fraction Collector）、ＦＲＡＣ−１００およびＦＲＡＣ−２００フラクションコレクター、ならびにスーパーフラック フラクションコレクター（SUPERFRAC(登録商標) Fraction Collector）(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)が挙げられるが、これらに限定されない。また、混合器は、ｐＨ勾配および直線的な濃度勾配の形成に利用可能である。市販の混合器としては、グラジエントミキサーＧＭ−１（Gradient Mixer GM-1）およびインラインミキサーズ(In-Line Mixers)(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)が挙げられる。
クロマトグラフィー過程は、あらゆる市販のモニターを用いて監視され得る。そのようなモニターは、ＵＶ、ｐＨおよび導電率のような情報の収集に使用され得る。検出器の例としては、モニターＵＶ−１（Monitor UV-1）、ユビコード Ｓ ＩＩ（UVICORD(登録商標) S II）、モニターＵＶ−Ｍ ＩＩ（Monitor UV-M II）、モニターＵＶ−９００（Monitor UV-900）、モニターＵＰＣ−９００（Monitor UPC-900）、モニターｐＨ／Ｃ−９００（Monitor pH/C-900）、およびコンダクティヴィティーモニター（Conductivity Monitor)(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）が挙げられる。実際に、全体のシステムは、市販されている（例えば、Amersham Biosciences(Piscataway, NJ）から提供されているアクタシステムズ（AKTA(登録商標) systems）が挙げられる）。
本発明の一実施形態において、例えば、ポリペプチドは、尿素において精製されたポリペプチド結果物の第１の変性によって、還元および変性され、続いて、適切なｐＨにおいて還元剤（例えば、ＤＴＴ）を含む緩衝液に希釈され得る。他の実施形態において、ポリペプチドは、約２Ｍから約９Ｍの範囲にある濃度の尿素において変性され、続いて約５．０から約８．０の範囲にあるｐＨのＴＲＩＳ緩衝液に希釈される。それから、この実施形態のリフォールディング混合物は、インキュベートされ得る。一実施形態において、リフォールディング混合物は、室温において４から２４時間、インキュベートされる。還元されかつ変性されたポリペプチド混合物は、それからさらに単離または精製され得る。
本明細書に述べられているように、第１のポリペプチド混合物のｐＨは、次のあらゆる単離工程を実施する前に、調整され得る。また、第１のポリペプチド混合物、またはあらゆるこれらの続きの混合物は、当該分野において公知の技術を用いて濃縮され得る。さらに、第１のポリペプチド混合物、またはあらゆるこれらの続きの混合物を含む溶出緩衝液は、当業者に公知の技術を用いて、次の単離工程に好適な緩衝液に交換され得る。
（イオン交換クロマトグラフィー）
イオン交換クロマトグラフィーが、一実施形態において、そして任意の付加的な工程として、第１のポリペプチド混合物対して実施されてもよい。一般的に、「ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY: PRINCIPLES AND METHODS」（カタログ番号18-1114-21, Amersham Biosciences(Piscataway, NJ)）を参照のこと。市販のイオン交換カラムとしては、ハイトラップ（ＨＩＴＲＡＰ（登録商標））カラム、ハイプレップ（ＨＩＰＲＥＰ（登録商標））カラム、およびハイロード（ＨＩＬＯＡＤ（登録商標））カラム（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）が挙げられる。そのようなカラムは、強い陰イオン交換体（例えば、Ｑセファロースファーストフロウ（Q SEPHAROSE(登録商標) Fast Flow）、Ｑセファロースハイパフォーマンス（Q SEPHAROSE(登録商標) High Performance）、およびＱセファロースＸＬ（Q SEPHAROSE(登録商標) XL)）；強い陽イオン交換体（例えば、ＳＰセファロースハイパフォーマンス（SP SEPHAROSE(登録商標) High Performance），ＳＰセファロースファーストフロウ（SP SEPHAROSE(登録商標) Fast Flow）、およびＳＰセファロースＸＬ（SP SEPHAROSE(登録商標) XL)）；弱い陰イオン交換体（例えば、デアエセファロースファーストフロウ（DEAE SEPHAROSE(登録商標) Fast Flow)）；および弱い陽イオン交換体（例えば、ＣＭセファロースファーストフロウ（CM SEPHAROSE(登録商標) Fast Flow)）（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）を利用している。陰イオン交換カラムクロマトグラフィーまたは陽イオン交換カラムクロマトグラフィーは、実質的に精製されたポリペプチドを単離するために、精製過程のあらゆる工程において、ポリペプチドに対して実施されてもよい。陽イオン交換クロマトグラフィー工程は、任意の適切な陽イオン交換基質を用いて実施され得る。有用な陽イオン交換基質の例としては、繊維状の、多孔質の、非多孔質の、微粒子状の、ビーズ状の、または架橋された陽イオン交換基質材料が挙げられるが、これらに限定されない。そのような陽イオン交換基質材料の例としては、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリスチレン、シリカ、ポリエーテル、または上述のものの何れかの混合材料が挙げられるが、これらに限定されない。
陽イオン交換基質は、強いまたは弱い陽イオン交換体を含む、あらゆる適切な陽イオン交換体であり得る。強い陽イオン交換体は、広いｐＨ範囲に渡ってイオン化を維持し得、かつこのようにして、広いｐＨ範囲に渡ってポリペプチドと結合可能であり得る。しかし、弱い陽イオン交換体は、ｐＨに応じてイオン化を失い得る。例えば、弱い陽イオン交換体は、ｐＨが約ｐＨ４またはｐＨ５より下に低下すると、電荷を失い得る。適切な陽イオン交換体の例としては、荷電した官能基（例えば、スルホプロピル（ＳＰ）、メチルスルホネート（Ｓ）、またはスルホエチル（ＳＥ））が挙げられるが、これに限定されない。陽イオン交換基質は、好ましくは約２．５から約６．０のポリペプチド結合ｐＨ範囲を有する、強い陽イオン交換体であってもよい。代替可能に、強い陽イオン交換体は、約２．５から約５．５のポリペプチド結合ｐＨ範囲を有していてもよい。陽イオン交換基質は、約３．０のポリペプチド結合ｐＨを有する強い陽イオン交換体であってもよい。代替可能に、陽イオン交換基質は、好ましくは約６．０から約８．０のポリペプチド結合ｐＨ範囲を有する、強い陽イオン交換体であってもよい。陽イオン交換基質は、好ましくは約８．０から約１２．５のポリペプチド結合ｐＨ範囲を有する強い陽イオン交換体であってもよい。代替可能に、陽イオン交換体は、好ましくは約８．０から約１２．０のポリペプチド結合ｐＨ範囲を有する強い陽イオン交換体であってもよい。
ポリペプチドを装填する前に、陽イオン交換基質は、例えば、カラム容積の数倍の希釈液、弱酸（例えば、カラム容積の４倍のｐＨ３、２０ｍＭの酢酸）を用いて、平衡化され得る。平衡化に続いて、ポリペプチドが加えられてもよく、かつカラムは、やはり弱酸（例えば、弱い酢酸溶液またはリン酸溶液）を用いた実質的に精製されたポリペプチドの溶出前に、１回から数回ほど洗浄されてもよい。例えば、カラム容積のおよそ２−４倍のｐＨ３、２０ｍＭの酢酸は、カラムの洗浄に使用され得る。また、例えば、カラム容積の２−４倍の、ｐＨ５．５、０．０５Ｍの酢酸ナトリウム、または０．１Ｍの塩化ナトリウムと混合されたｐＨ５．５、０．０５Ｍの酢酸ナトリウムを用いた付加的な洗浄が、使用され得る。代替可能に、当該分野において公知の方法を用いて、陽イオン交換基質は、カラム容積の数倍の希釈液、弱塩基を用いて平衡化され得る。
代替可能に、実質的に精製されたポリペプチドは、基質からポリペプチドを移動させるほど十分に低いｐＨまたはイオン強度を有する緩衝液と、陽イオン交換基質とを接触させることによって、溶出され得る。溶出緩衝液のｐＨは、約ｐＨ２．５から約ｐＨ６．０までの範囲であり得る。より詳細には、溶出緩衝液のｐＨは、約ｐＨ２．５から約ｐＨ５．５、約ｐＨ２．５から約ｐＨ５．０までの範囲であり得る。溶出緩衝液は約３．０のｐＨを有し得る。また、溶出緩衝液の量は、広範に変化してもよく、かつ通常、カラム容積の約２倍から約１０倍の範囲にある。
陽イオン交換基質に対するポリペプチドの吸着に続いて、実質的に精製されたポリペプチドは、当該基質からポリペプチドを移動させるほど十分に高いｐＨまたはイオン強度を有する緩衝液と、基質を接触させることによって溶出され得る。実質的に精製されたポリペプチドの高ｐＨ溶出における使用に適した緩衝液の例としては、少なくとも約５ｍＭから少なくとも約１００ｍＭの濃度範囲にある、クエン酸塩、リン酸塩、蟻酸塩、酢酸塩、ＨＥＰＥＳおよびＭＥＳ緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。
（逆相クロマトグラフィー）
ＲＰ−ＨＰＬＣは、当業者に公知の適切なプロトコールに従って、タンパク質を精製するために、実施され得る。例えば、「Pearsonら, ANAL BIOCHEM. (1982) 124:217-230 (1982)」、「Rivierら, J. CHROM. (1983) 268:112-119」、「Kunitaniら, J. CHROM. (1986) 359:391-402」を参照のこと。ＲＰ−ＨＰＬをポリペプチドに対して実施して、実質的に精製されたポリペプチドを単離してもよい。この点に関して、多種多様な長さ（例としては、少なくともＣ３から少なくともＣ３０まで、少なくともＣ３から少なくともＣ２０まで、または少なくともＣ３から少なくともＣ１８までの長さが挙げられるが、これらに限定されない）を有するアルキル機能性基を用いた、シリカ誘導体化樹脂が使用され得る。代替可能に、ポリマー化樹脂が使用され得る。例えば、スチレンポリマー樹脂である、TosoHaas Amberchrome CG1000sd樹脂が使用され得る。また、多種多様なアルキル鎖を有するシアノ樹脂またはポリマー化樹脂が、使用され得る。さらに、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムは、溶媒（例えば、エタノール）を用いて洗浄され得る。ソースＲＰカラム（Source RP colum）は、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムの他の例である。
イオン対化剤および有機緩和剤（例えば、メタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、またはエタノール）を含む適切な溶出緩衝液が、ポリペプチドをＰＲ−ＨＰＬＣカラムから溶出するために、使用され得る。最も一般的に使用されるイオン対化剤の例としては、酢酸、蟻酸、過塩素酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、ヘプタフルオロブチル酸、トリエチルアミン、テトラメチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、酢酸トリエチルアンモニウムが挙げられるが、これらに限定されない。溶出は、分離時間の短縮、およびピーク幅の縮小に好ましい勾配条件を有する、１つ以上の勾配条件または定組成条件を用いて実施され得る。他の方法は、異なる溶媒濃度範囲を有する２の勾配の使用に関する。本明細書における使用に適した溶出緩衝液の例としては、酢酸アンモニウム溶液およびアセトニトリル溶液が挙げられるが、これらに限定されない。
（疎水性相互作用クロマトグラフィー精製技術）
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、ポリペプチドに対して実施されてもよい。一般的に、「HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK: PRINCIPLES AND METHODS (カタログ番号18-1020-90, Amersham Biosciences (Piscataway, NJ))」を参照すればよく、これは参照によって本明細書に組み込まれる。適切なＨＩＣ基質の例としては、アルキル置換基質もしくはアリール置換基質（例えば、ブチル置換基質、ヘキシル置換基質、オクチル置換基質、またはフェニル置換基質（例として、アガロース基質、架橋アガロース基質、セファロース基質、セルロース基質、シリカ基質、デキストラン基質、ポリスチレン基質、ポリ（メタクリレート）基質が挙げられる））、および混合形式基質（例としては、ポリエチレンアミン樹脂基質、またはブチル置換ポリ（メタクリレート）基質もしくはフェニル置換ポリ（メタクリレート）基質が挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。疎水性相互作用クロマトグラフィーに関する市販の原料の例としては、ハイトラップ（ＨＩＴＲＡＰ（登録商標））、ハイプレップ（ＨＩＰＲＥＰ（登録商標））およびハイロード（ＨＩＬＯＡＤ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
簡単に説明すると、装填の前に、ＨＩＣカラムは、当業者に公知の標準的な緩衝液（例えば、酢酸溶液／塩化ナトリウム溶液、または硫酸アンモニウムを含むＨＥＰＥＳ）を用いて、平衡化され得る。硫酸アンモニウムは、ＨＩＣカラム装填用の緩衝液として使用され得る。それから、ポリペプチドの装填した後に、カラムは、不要な物質を取り除くための標準的な緩衝液と条件とを用いて洗浄され得るが、ポリペプチドはカラムに保持されている。ポリペプチドは、カラム容積の約３倍から約１０倍の標準的な緩衝液（例えば、とりわけ、ＥＤＴＡと平衡化緩衝液より低濃度の硫酸アンモニウムとを含むＨＥＰＥＳ緩衝液、または酢酸／塩化ナトリウム緩衝液）を用いて溶出され得る。また、例えば、リン酸カルシウムを用いた減少直線塩勾配は、分子の溶出に使用され得る。それから、この溶出物は、例えば、ダイアフィルトレーション、または限外ろ過といったろ過によって濃縮されてもよい。ダイアフィルトレーションは、ポリペプチドの溶出に使用される塩を除くために利用され得る。
（他の精製技術）
例えば、ゲルろ過（参照によって本明細書に組み込まれる「GEL FILTRATION: PRINCIPLES AND METHODS」（カタログ番号18-1022-18, Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（好適な基質の例としては、ＨＡウルトロゲル（HA-Ultrogel）、ハイリソリューション（High Resolution）（Calbiochem）、ＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイト（CHT Ceramic Hydroxyapatite(BioRad)）、バイオ−ゲルＨＴＰヒドロキシアパタイト（Bio-Gel HTP Hydroxyapatite(BioRad)）が挙げられるが、これらに限定されない）、ＨＰＬＣ、発泡床吸着、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、および凍結乾燥などを用いたさらに他の単離工程は、あらゆる過剰の塩を除去するために、および次の単離工程もしくは最終的な製剤の調合でさえ好適な緩衝液に交換するために、第１のポリペプチド混合物、またはあらゆる続くこれらの混合物に対して実施され得る。
ポリペプチド（実質的に精製されたポリペプチドが挙げられる）の収率は、当業者に公知の技術を用いて、本明細書に記載されている各工程において、監視されてもよい。また、そのような技術は、最後の単離工程の後に、実質的に精製されたポリペプチドの収率を評価するために使用され得る。例えば、ポリペプチドの収率は、陽イオン交換クロマトグラフィーおよびゲルろ過だけでなく、様々なアルキル鎖長（例えば、シアノＰＲ−ＨＰＬＣ、Ｃ１８ＲＰ−ＨＰＬＣ）を有する様々な逆相高圧液体クロマトグラフィーのあらゆるものを用いて、監視されてもよい。
本発明の特定の実施形態において、各精製工程の後におけるポリペプチドの収率は、各精製工程にとっての開始物質におけるポリペプチドの、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％、または少なくとも約９９．９９％であり得る。
精製は、標準的な技術（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を用いてか、ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡアッセイを用いたポリペプチドの測定によって、判定され得る。例えば、ポリクローナル抗体は、陰性対照酵母発酵および陽イオン交換回収から単離されたタンパク質に対して生成され得る。また、抗体は、宿主細胞タンパク質の汚染の存在に対するプローブに使用され得る。
ＰＲ−ＨＰＣＬ材料であるVydac C4(Vydac)は、シリカゲル粒子、Ｃ４−アルキル鎖を支持する表面からなる。タンパク質性不純物からのポリペプチドの分離は、疎水性相互作用の強度における差に基づいている。溶出は、希釈されたトリフルオロ酢酸におけるアセトニトリル勾配を用いて実施される。調製用ＨＰＬＣは、ステンレス鋼カラム（２．８から３．２リットルのVydac C4シリカゲルを用いて充填されている）を用いて実施される。ヒドロキシアパタイトウルトロゲル（Hydroxyapatite Ultrogel）溶出物は、トリフルオロ酢酸を加えることによって酸性化され、かつVydac C4カラム上に装填される。洗浄および溶出について、希釈されたトリフルオロ酢酸におけるアセトニトリル勾配が使用される。画分は、回収され、かつただちにリン酸緩衝液を用いて中性化される。ＩＰＣ限界内にあるポリペプチド画分は、プールされる。
デアエセファロース（DEAE Sepharose(Pharmacia)）材料は、セファロースビーズの表面と共有的に結合されるジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基からなる。ＤＥＡＥ基に対するポリペプチドの結合は、イオン性相互作用によって媒介される。アセトニトリルおよびトリフルオロ酢酸は、保持されることなくカラムを通過する。これらの物質が洗い流された後に、微量の不純物は、低ｐＨの酢酸緩衝液を用いてカラムを洗浄することによって除去される。それから、カラムは、中性のリン酸緩衝液を用いて洗浄され、かつポリペプチドは、向上されたイオン強度を有する緩衝液を用いて溶出される。カラムは、デアエセファロースファーストフロウ（DEAE Sepharose fast flow）を用いて充填されている。カラム容積は、３−１０ｍｇのポリペプチド／１ｍｌのゲルの範囲におけるポリペプチドの装填を保障するために調節される。カラムは、水および平衡化緩衝液（リン酸ナトリウム／カリウム）を用いて洗浄される。ＨＰＬＣ溶出物のプールされた画分は装填され、かつカラムは平衡化緩衝液を用いて洗浄される。それから、カラムは、洗浄緩衝液（酢酸ナトリウム緩衝液）により洗浄された後に、平衡化緩衝液により洗浄される。続いて、ポリペプチドは、溶出緩衝液（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム／カリウム）を用いてカラムから溶出され、主要な溶出プロファイルに従って、単一の画分に回収される。デアエセファロース（DEAE Sepharose）カラムの溶出物は、特定の伝導性に調節される。結果として生じる製剤原料は、テフロン（登録商標）（Teflon）ボトルの中に無菌的にろ過され、かつ−７０℃において保存される。
採用され得る付加的な方法としては、エンドトキシンを除去する工程が挙げられるが、これに限定されない。エンドトキシンは、例えば、Escherichia coliといったグラム陰性の宿主細胞の外膜に見られるリポ多糖（ＬＰＳｓ）である。エンドトキシンレベルを低減する方法は、当業者に公知であり、当該方法の例としては、シリカ支持体、ガラス粉末、またはヒドロキシアパタイトを用いた精製技術、逆相クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ならびにこれらの方法の組み合わせなどが挙げられるが、これらに限定されない。修飾および付加的な方法は、汚染物（例えば、興味のあるポリペプチドからの共遊走タンパク質）を除去するために要求されてもよい。エンドトキシンレベルを測定する方法は、当業者に公知であり、かつその例としては、カブトガニ血球抽出液（ＬＡＬ）アッセイが挙げられるが、これに限定されない。エンドセーフ（Ｅｎｄｏｓａｆｅ（商標））−ＰＴＳアッセイは、ＬＡＬ試薬、発色体基質、および対照標準エンドトキシンを用いて前装填されたカートリッジを利用する、手持ち式の分光光度計を伴う比色分析の単一チューブ系である。代替可能な方法としては、比濁法であり、かつ９６ウェル形式を使用する動力学的（Ｋｉｎｅｔｉｃ）ＬＡＬ法が挙げられる。
多種多様な方法および手法は、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドの収率および純度を評価するために使用されてもよく、当該方法および手法の例としては、ブラッドフォードアッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、質量分析（例としては、ＭＬＤＩ−ＴＯＦが挙げられるが、これに限定されない）、および当業者に公知のタンパク質性質決定に関する他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
付加的な方法としては、タンパク質染色法と一緒になったＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫ブロッティング、マトリックス支援レーザ脱離／イオン化−質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー／質量分析、等電点電気泳動、分析陰イオン交換、等電点電気泳動、および円偏光二色性が挙げられるが、これらに限定されない。
＜ＶＩＩＩ．代替系での発現＞
非組み換え宿主細胞、突然変異細胞、または無細胞系において非天然アミノ酸をタンパク質に導入するには数々の方法が用いられている。これらの系は、本明細書に記載のポリペプチドの作成にも好適に用いられる。リジン、システイン、およびチロシンのような反応性の高い側鎖は、リジンからＮ２−アセチル−リジンへの変換の結果生じる。化学合成は、非天然アミノ酸を組み込む直接的な方法をも提供する。ペプチド断片の酵素学的なライゲーション、および自然化学的ライゲーション法の近年の発展のため、より大きなタンパク質を作製することが可能となった。例えば、「P.E.DawsonおよびS.B.H.Kent,Annu.Rev.Biochem,69:923(2000)」を参照のこと。化学的ペプチドライゲーションおよび自然化学的ライゲーションについては米国特許出願第６，１８４，３４４号明細書、米国特許出願公開第２００４／０１３８４１２号明細書、米国特許出願公開第２００３／０２０８０４６号明細書、国際公開第０２／０９８９０２号パンフレット、および国際公開第０３／０４２２３５号パンフレットに記載されており、参照のために本明細書に組み込まれる。所望の一般的な非天然アミノ酸で化学的にアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡが、タンパク質の生合成を補助することを可能にするインビトロの抽出物に添加されるインビトロにおける生合成方法は、事実上全ての大きさの多様なタンパク質に１００以上の非天然アミノ酸を部位特異的に組み込むことに用いられている。例えば、「V.W.Cornish,D.Mendel および P.G.Schultz,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,1995,34:621(1995)」、「C.J.Noren, S.J.Anthony-Cahill, M.C.Griffith, P.G.Schultz, A general method for site-specific incorporation of non-natural amino acids into proteins, Science 244:182-188(1989)」、および「J.D.Bain, C.G.Glabe, T.A.Dix,A.R.Chamberlin, E.S.Diala, Biosynthtic site-specific incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J.Am.Chem.Soc.111:8013-8014(1989)」を参照のこと。広範な官能基が、タンパク質の安定性、タンパク質の折りたたみ、酵素機構、およびシグナル伝達系の研究のためにタンパク質に導入されてきた。
選択圧混合と呼ばれるインビボの方法は、野生型シンテターゼの混合物を利用することで発展してきた。例えば、「N.Budisa, C.Minks, S.Alefelder, W.Wenger, F.M.Dong, L.Moroder およびR.Huber, FASEB J., 13:41(1999)」を参照のこと。特定の天然アミノ酸を細胞に供給する代謝経路が止められている栄養要求性菌株は、標的の遺伝子の転写が抑制されている間に、制限された濃度の天然アミノ酸を含む最小培地で成長する。安定した成長期の初期において、天然アミノ酸は劣化し、非天然アミノ酸類似体と変換される。組み換えタンパク質の発現誘導は、非天然アミノ酸類似体を含有するタンパク質の蓄積を招く。例えば、この戦略を用いれば、ｏ、ｍ、およびｐ−フルオロフェニルアラニンはタンパク質に組み込まれ、ＵＶスペクトルにおいて２本の特徴的なピークを示し、容易に同定できる。例えば、「C.Minks, R.Huber, L.MoroderおよびN.Budisa, Anal.Biochem., 284:29(2000)」を参照のこと；前記引用文献は、トリフルオロメチオニンは１９ＦＮＭＲを用いてキトオリゴサッカライドとの相互作用を研究するために、バクテリオファージＴ４のメチオニンとの置換に用いられてきた。例えば、「H.Duewel, E.Daub, V.RobinsonおよびJ.F.Honek,Biochemistry,36:3404(1997)」を参照のこと；およびトリフロロロイシンはロイシンの代わりに組み込まれることで、ロイシンジッパータンパク質の熱安定性、および化学的安定性を向上させる。例えば、「Y.Tang, G.Ghirlanda, W.A.Petka, T.Nakajima, W.F.DeGrado、およびD.A.Tirrell, Angew.Chem.Int.Ed.Engl., 40:1494(2001)」を参照のこと。その上、セレノメチオニンおよびテルロメチオニンは、Ｘ線結晶解析において溶解相を促進させるために、多様な組み換えタンパク質に組み込まれる。例えば、「W.A.Hendrickson, J.R.Horton および D.M.Lemaster, EMBO J.,9:1665(1990)」、「J.O.Boles, K.Lewinski, M.Kunkle, J.D.Odom, B.Dunlap, L.Lebioda および M.Hatada,Nat.Struct.Biol.,1:283(1994)」、「N.Budisa, B.Steipe, P.Demange, C.Eckerskorn, J.Kellermann および R.Huber, Eur.J.Biochem.,230:788(1995)」、および「N.Budisa, W.Karnbrock, S.Steinbacher, A.Humm, L.Prade, T.Neuefeind, L.Moroder および R.Huber, J.Mol.Biol.,270:616(1997)」を参照のこと。アルケンまたはアルキン機能性基を有するメチオニンの類似体は、化学的手段によりタンパク質の付加修飾を可能にすることで効率的に組換えられてきた。例えば「J.D.van Hest および D.A.Tirrell, FEBS Lett.,428:68(1998)」、「J.C.van Hest, K.L.Kiick および D.A.Tirrell, J.Am.Chem.Soc.,122:1282(2000)」、および「K.L.Kiick および D.A.Tirrell, Tetrahedron,56:9487(2000)」；米国特許出願６，５８６，２０７号明細書；米国特許出願公開第２００２／００４２０９７号明細書を参照のこと。なお、これらは参照のために本明細書に組み込まれる。
本方法の成功は、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによる非天然アミノ酸類似体の認識に依存しており、一般的に、タンパク質翻訳の厳密性を保証するために高い選択性が要求される。本方法の範囲を広げる１つの方法は、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの基質特異性を緩めることであり、限定された場合において成功している。例えば、Escherichia coliのフェニルアラニン−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＰｈｅＲＳ）によるＡｌａ２９４のＧｌｙへの置換は、基質結合ポケットの大きさを増大し、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン（ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ）によるｔＲＮＡＰｈｅのアシル化を招く。「M.Ibba, P.Kast および H.Hennecke,Biochemistry,33:7107(1994)」を参照のこと。この変異ＰｈｅＲＳを有するEscherichia coli株は、フェニルアラニンの代わりにｐ−Ｃｌ−フェニルアラニンまたはｐ−Ｂｒ−フェニルアラニンの組み込みを可能にする。例えば、「M.Ibba および H.Hennecke, FEBS Lett.,364:272(1995)」;および「N.Sharma, R.Furter, P.Kast および D.A.Tirrell, FEBS Lett.,467:37(2000)」を参照のこと。同様に、Escherichia coliのチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合部位の近傍の点変異Ｐｈｅ１３０Ｓｅｒは、チロシンよりもアザチロシンに効率良く組み換えられることが可能であることが示された。「F.Hamano-Takaku, T.Iwama, S.Saito-Yano, K.Takaku, Y.Monden, M.Kitabatake, D.Soll および S.Nishimura, J.Biol.Chem.,275:40324(2000)」を参照のこと。
インビボにおけるタンパク質への非天然アミノ酸の組み換えの別の戦略は、校正機構を有するシンテターゼを修飾することである。これらのシンテターゼは対象を区別することができず、そのため同属の天然アミノ酸に構造的に類似のアミノ酸を活性化する。この間違いは離れた部位において修正され、間違えられたアミノ酸はタンパク質翻訳の厳密さを維持するため、ｔＲＮＡからアシル基を除去される。もし、シンテターゼの校正活性が無効であれば、誤って活性化された構造的類似体は、編集機能から逃れて組み込まれ得る。この手法は、近年バリル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＶａｌＲＳ）と共に公開されている。「V.Doring, H.D.Mootz, L.A.Nangle, T.L.Hendrickson, V.de Crecy-Lagard, P.Schimmel および P.Marliere,Science,292:501(2001)」を参照のこと。ＶａｌＳはｔＲＮＡＶａｌとＣｙｓ、Ｔｈｒ、またはアミノブチレート（Ａｂｕ）を誤ってアミノアシル化できる；これらの同族でないアミノ酸は、編集領域により続いて加水分解される。Escherichia coli染色体のランダム突然変異生成の後、選択されたEscherichia coli突然変異体株は、ＶａｌＲＳの編集部位に変異を有する。この編集に欠陥を有するＶａｌＲＳは、ｔＲＮＡＶａｌとＣｙｓとを間違って変換する。なぜなら、ＡｂｕはＣｙｓと立体的に似ており（ＡｂｕにおいてはＣｙｓの−ＳＨ基が−ＣＨ３に交換されている）、Ａｂｕの存在下において、このEscherichia coli突然変異体株が成長する場合、ＶａｌＲＳ突然変異体はＡｂｕもタンパク質に組み込む。質量分析は、天然タンパク質のそれぞれのバリン位置において約２４％のバリンがＡｂｕにより変換されていることを示す。
固相合成および半合成法は、多くの新規アミノ酸含有タンパク質合成も可能にしてきた。例えば、以下の刊行物および引用文献を挙げる：「Crick, F.H.C., Barrett, L.Brenner, S.Watts-Tobin, R.general nature of the genetic code for proteins.Nature,192:1227-1232(1961)」;「Hofmann,K., Bohn, H.Studies on polypeptides. XXXVI. the effect of pyrazole-imidazole replacement on the S-proteinactivating potency of an polypeptide fragment, J.Am Chem,88(24):5914-5919(1966)」;「Kaiser, E.T.Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enzymes, Acc Chem Res,22:47-54(1989)」;「Nakatsuka, T.,Sasaki, T.,Kaiser, E.T.Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme tiosubtilsin,J Am Chem Soc,109:3808-3810(1987)」;「Schnolzer, M.,Kent, S B H.Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides:backbone-engineered HIV protease,Science,256(5054):221-225(1992)」;「Chaiken, I.M.Semisynthetic peptides and proteins, CRC Crit Rev Biochem,11(3):255-301(1981)」;「Offord, R.E.protein engineering by chemical means?protein Eng.,1(3):151-157(1987)」;および「Jackson, D.Y., Burnier, J., Quan, C., Stanley, M., Tom, J., Wells、J.A.Adesigned Peptide Ligase for Yotal Synthesis of Ribonuclease A with Non-natural Catalytic Residues,Science,266(5183):243(1994)」。
化学的修飾は、共同因子、スピンラベル、およびオリゴヌクレオチドを含む非天然側鎖の多様性をタンパク質にインビトロで導入するために用いられてきた。例えば、「COREY, D.R., Schultz, P.G.Generation of a hybrid sequence-specific single-strand deoxyribonuclease,Science,238(4832):1401-1403(1987)」;「Kaiser, E.T., Lawrence D.S., Rokita, S.E. the chemical modification of enzymatic specificity, Annu Rev Biochem,54:565-595(1985)」;「Kaiser, E.T., Lawrence, D.S.Chemical mutation of enzyme active sites, Science,226(4674):505-511(1984)」;「Neet, K.E., Nanci A, Koshland, D.E.Properties of thiol-subtilisin, J Biol.Chem,243(24):6392-6401(1968)」;「Polgar, L.et M.L.Bender.A new enzyme containing a synthetically formed active site. Thiol-subtilsin.J.Am Chem Soc,88:3153-3154(1966)」;および「Pollack, S.J., Nakayama, G.Schultz, P.G.Introduction of nucleophles and spectroscopic probes into antibody combining site, Science, 242(4881):1038-1040(1988)」を参照のこと。
また、化学的に修飾されたアミノアシル−ｔＲＮＡｓを用いる生合成方法は、種々の生物物理学的なプローブを合成されたタンパク質にインビトロで導入するために用いられてきた。以下の刊行物および引用文献を参照のこと：「Brunner, J.New Photolabeling and crosslinking methods, Annu.Rev Biochem,62:483-514(1993)」;および「Kreig, U.C., Walter, P., Hohnson, A.E.Photoceoss linking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle,Proc.Natl.Acad.Sci,83(22):8604-8608(1986)」。
以前より、所望のアンバーノンセンス変異を含む遺伝子で計画されたタンパク質合成反応への化学的にアミノアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡの添加により、非天然アミノ酸は、タンパク質への部位特異的な組み込みをインビトロで可能にすることが示されてきた。これらの手段を用い、多くの共通の２０アミノ酸に類似した構造相同体を置き換えることができる。例えば、特定のアミノ酸要求性の株を用いた、フェニルアラニンのフルオロフェニルアラニンへの置換である。例えば、「Noren, C.J., Anthony-Cahill, Griffith, M.C., Schultz, P.G. A general method for site-specific incorporation of non-natural amino acid into proteins, Science, 244: 182-188(1989) 」;「 M.W.Nowak, らScience 268:439-42(1995) 」;「 Bain, J.D., Glabe, C.G., Dix, T.A., Chamberlin, A.R., Diala, E.S. Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide, J.Am Chem Soc, 111:8014(1989)」;「N. Budisa らFASEB J. 13:41-51(1999) 」;「Ellman, J.A.,Mendel, D., Anthony-Cahill, S., Noren, C.J., Schultz, P.G. Biosynthetic method for introducing non-natural amino acid site-specifically into proteins, Methods in Enz., vol. 202, 301-336(1992) 」;および「Mendel, D., Cornish, V.W. & Schultz, P.G. Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code, Annu Rev Biophys. Biomol Struct.24, 435-62(1995)」を参照のこと。
例えば、サプレッサーｔＲＮＡは、ストップコドンＵＡＧを認識するために作製され、非天然アミノ酸を化学的にアミノアシル化する。従来の部位直接的な変異は、タンパク質の遺伝子中の重要な部位に終止コドンＴＡＧを導入するために用いられてきた。例えば、「Sayers, J.R., Schmidt, W.Eckstein, F.5’-3’ Exonucleases in phosphorotioate-based olignoucleotide-directed Mutagenesis, Nucleic Acids Res, 16(3):791-802(1988)」を参照のこと。アシル化したサプレッサーｔＲＮＡおよび突然変異遺伝子が、インビトロの転写／翻訳系で結合した場合、非天然アミノ酸は、特定の部位に前記アミノ酸を含むタンパク質を生じるＵＡＧコドンに反応して組み込まれる。［３Ｈ］−Ｐｈｅを用いた実験およびα−ヒドロキシ酸を用いた実験により、ＵＡＧコドンにより部位特異的に所望のアミノ酸のみが組み換えられ、このアミノ酸はタンパク質の他のどの部位にも組み込まれないことが示された。例えば、「Norenら supra; Kobayashi ら(2003) Nature Structural Biology 10(6): 425-432」;および「Ellman, J.A., Mendel, D., Schultz, P.G.Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins, Science,255(5041): 197-200(1992)」を参照のこと。
ｔＲＮＡは、全ての方法または技術により所望のアミノ酸でアミノアシル化されてよい（特に限定されないが、化学的または酵素的アミノアシル化を含む）。
アミノアシル化は、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼまたはその他の酵素分子により達成されてよく、特に限定されないがリボザイムを含む。「リボザイム」という用語は、「触媒ＲＮＡ」と同義である。Ｃｅｃｈらは、触媒として働く天然に生じるＲＮＡｓ（リボザイム）の存在を示した（「Cech, 1987, Science, 236: 1532-1539」;「 McCorkleら1987, Concepts Biochem. 64:221-226」）。これらの天然ＲＮＡ触媒は、切断およびスプライシングのためのリボ核酸基質に働くことのみが示されていたが、近年のリボザイムについての技術的発展は、多様な化学反応へ触媒の使用可能性を広げてきた。これまでの研究において、自身の（２’）３’−末端にアミノアシルＲＮＡ結合を生成することを触媒できるＲＮＡ分子（「Illangakekareら 1995 Science 267: 643-647」）およびアミノ酸をあるＲＮＡ分子から他の分子へ転移できるＲＮＡ分子（「Lohse ら1996, Nature 381: 442-444」）が同定されてきた。
本明細書において参照のために示した米国特許出願公開第２００３／０２２８５９３号明細書には、リボザイムの構築法および天然にコードされた、または非天然にコードされたアミノ酸を有するｔＲＮＡのアミノアシル化におけるリボザイムの使用法を記述した。ｔＲＮＡをアミノアシル化できる酵素分子の基質固定形態（特に限定されないが、リボザイムを含む）は、アミノアシル化された生産物の効率的な親和性精製を可能にし得る。好適な基質の例は、アガロース、セファロース、および磁気ビーズが挙げられる。生産物およびアミノアシル化のためのリボザイムの基質固定形態の使用は、明細書中に参照のために示した「Chemistry and Biology 2003, 10:1077-1084」および米国特許出願公開第２００３／０２２８５９３号明細書に記載されている。
化学的なアミノアシル化方法は、特に限定されないが、Ｈｅｃｈｔらにより発表された「Hecht, S. M. Ace. Chem. Res. 1992, 25, 545」;「 Heckler, T. G.; Roesser, J. R.; Xu, C; Chang, P.; Hecht, S. M. Biochemistry 1988, 27, 7254」;「 Hecht, S. M.; Alford, B. L.; Kuroda, Y.; Kitano, S. J. Biol. Chem. 1978, 253, 4517」、ならびにSchultz、 Chamberlin、およびDoughertyらにより発表された「Cornish, V. W.; Mendel, D.; Schultz, P. G. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1995, 34, 621」;「 Robertson, S. A.; Ellman, J. A.; Schultz, P. G. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 2722」;「 Noren, C.J., Anthony-Cahill, S. J.; Griffith, M. C; Schultz, P. G. Science 1989, 244, 182」;「 Bain, J. D.; Glabe, C. G.; Dix, T. A.; Chamberlin, A. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8013」;「 Bain, J. D.らNature 1992, 356, 537」;「 Gallivan, J. P.; Lester, H. A.; Dougherty, D. A. Chem. Biol. 1997, 4, 740」;「 Turcattiら J. Biol. Chem. 1996, 271, 19991」;「 Nowak, M. W.ら Science, 1995, 268, 439」;「 Saks, M. E.ら J. Biol. Chem. 1996, 271, 23169」;「Hohsaka, T.ら J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 34」)を含む。これらは、アミノアシル化におけるシンテターゼの使用を避けるために、本明細書に参照のために組み込まれる。前記方法または他の化学的アミノアシル化方法は、ｔＲＮＡ分子のアミノアシル化に用いられてもよい。
触媒ＲＮＡを発生させる方法は、無作為に選ばれたリボザイム配列の離れたプール（ｐｏｏｌｓ）を形成する工程、プールについて指向進化（directed evolution）を実行する工程、所望のアミノアシル化活性についてプールをスクリーニングする工程、および所望のアミノアシル化活性を示すそれらのリボザイムの配列を選択する工程を含んでいてもよい。
リボザイムは、ＧＧＵモチーフ（ｍｏｔｉｆ）およびＵ−ｒｉｃｈ領域のような、アシル化活性を促進するモチーフおよび／または領域を含んでいる。例えば、Ｕ−ｒｉｃｈ領域は、アミノ酸基質の認識を促進でき、ＧＧＵモチーフはｔＲＮＡの３’末端に塩基対を形成できる。これらを組み合わせると、ＧＧＵおよびモチーフ、ならびにＵ−ｒｉｃｈ領域は、アミノ酸とｔＲＮＡの両方の同時認識を同時に促進する。これによりｔＲＮＡの３’末端のアミノアシル化が促進される。
リボザイムは、活性化クローンに見られる共通配列の系統的技術により、ｔＲＮＡＡｓｎ ＣＣＣＧと接合した、部分的に無作為に選択されたｒ２４ｍｉｎｉを用いたインビトロでの選択により産生できる。明細書において参照のために示した、米国特許出願公開第２００３／０２２８５９３号明細書に記載されている「Ｆｘ３リボザイム」と命名された方法により得られた典型的なリボザイムは、多様なアミノアシル−ｔＲＮＡを同族の非天然アミノ酸に変換する合成反応の多目的触媒として働く。
基質上への固定化は、アミノアシル化されたｔＲＮＡの効率的な親和性精製を可能にするために用いられてよい。好適な基質の例は、特に限定されないが、アガロース、セファロース、および磁気ビーズを含む。リボザイムは、ＲＮＡの化学的構造の利点を生かして樹脂に固定化することができ、そのようなＲＮＡのリボース上の３’−ｃｉｓ−ｄｉｏｌは、樹脂上のＲＮＡの固定化を促進し、対応するジアルデヒドを得るために過ヨウ素酸塩と共に酸化させることができる。安価なヒドラジド樹脂を含む多様な種類の樹脂が用いられてよく、アミノ化の減少は、樹脂およびリボザイム間の相互作用として不可逆的な連結を生じる。アミノアシル−ｔＲＮＡｓの合成は、このオンカラムアミノアシル化技術により、顕著に促進された。「Kourouklis ら Methods 2005; 36: 239-4」にカラムベースのアミノアシル化システムが記載されている。
アミノアシル化ｔＲＮＡの単離は多様な方法で達成できる。ある好適な方法は、カラムからアミノアシル化ｔＲＮＡを、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む酢酸ナトリウム溶液、５０ｍＭ Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（３−プロパンスルホン酸）、１２．５ｍＭ ＫＣｌ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、またはＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．０）のような緩衝液により溶出することである。
アミノアシル化したｔＲＮＡを、翻訳反応によって作製されたポリペプチドの選択された位置にアミノ酸（ｔＲＮＡのアミノアシル化に用いられたアミノ酸）を組み込むために翻訳反応に添加することができる。本発明のアミノアシル化されたｔＲＮＡを用いてよい翻訳系の例は、特に限定されないが、細胞ライセートを含む。細胞ライセートは、投入したｍＲＮＡからポリペプチドのインビトロでの翻訳のために必須な反応構成要素を提供する。そのような反応構成要素の例は、特に限定されないが、リボソームタンパク質、ｒＲＮＡ、アミノ酸、ｔＲＮＡｓ、ＧＴＰ、ＡＴＰ、翻訳開始因子および伸長因子、ならびに翻訳に関わる付加的な因子を含む。加えて、翻訳系は、ひとまとまりの翻訳または区分された翻訳であってよい。ひとまとまりの翻訳系は単一の区画において反応構成要素を結合し、一方区分された翻訳系は、反応産物から翻訳反応要素を分離し、翻訳の効率を抑制する。そのような翻訳系は市販されている。
さらに、転写／翻訳の共役系が用いられてもよい。転写／翻訳の共役系は投入したＤＮＡと対応したｍＲＮＡの双方の転写を可能とし、反応構成要素によって順に翻訳される。市販されている転写／翻訳の共役系の例は、Rapid Translation System(RTS, Roche Inc.）である。この系は、リボソームおよび翻訳因子のような翻訳要素を提供するためのＥ．Ｃｏｌｉライセートを含有する混合物を含む。さらに当該混合物には、投入されるＤＮＡを翻訳に用いる鋳型ｍＲＮＡに転写するための、ＲＮＡポリメラーゼが含まれる。ＲＴＳは、供給／消費される構成要素を含む区画および転写／翻訳区画の間を仲介する膜経由で、反応構成要素の区分化に用いることができる。
ｔＲＮＡのアミノアシル化は、他の試薬により実行されてよく、転写酵素、シンテターゼ、触媒抗体、多官能性タンパク質などを含むが、これらに限定されない。
「Luら in Mol Cell. 2001 Oct; 8(4): 759-60」には、非天然アミノ酸を含有する合成ペプチドに、タンパク質を化学的に結合させる方法が記載されている（翻訳後タンパク質連結反応）（expressed protein ligation）。
マイクロインジェクション技術は、タンパク質への非天然アミノ酸の組み込みにも使用されている。例えば、「M. W. Nowak, P. C. Kearney, J. R. Sampson, M. E. Saks, C. G. Labarca, S. K. Silverman, W. G. Zhong, J. Thorson, J. N. Abelson, N. Davidson, P. G. Schultz, D. A. Dougherty および H. A. Lester, Science. 268:439 (1995)」;および「D. A. Dougherty, Curr. Opin. Chem. Biol.. 4:645 (2000)」を参照のこと。アフリカツメガエル卵母細胞にインビトロで作製した２つのＲＮＡ種を共導入した：前記ＲＮＡ種は、標的のアミノ酸位置にＵＡＧ終止コドンを有する目的タンパク質をコードするｍＲＮＡ、および所望の非天然アミノ酸でアミノアシル化されたアンバーサプレッサーｔＲＮＡである。それゆえ、卵母細胞の翻訳機構は、ＵＡＧにより特定された位置に非天然アミノ酸を挿入する。この方法は、一般的にインビトロにおける発現系とは異なる、膜内在性タンパク質のインビボでの構造−機能研究を可能にした。蛍光共鳴エネルギー転移による距離を測定するためのタキキニンニューロキニン−２受容体への蛍光アミノ酸の組み込みを含む例を以下に挙げる。例えば、「G. Turcatti, K. Nemeth, M. D. Edgerton, U. Meseth, F. Talabot, M. Peitsch, J. Knowles, H. Vogel および A. Chollet, J. Biol. Chem.. 271:19991 (1996); the incorporation of biotinylated amino acids to identify surface-exposed residues in ion channels」を参照のこと。例えば、「J. P. Gallivan, H. A. Lester および D. A. Dougherty, Chem. Biol., 4:739 (1997); the use of caged tyrosine analogs to monitor conformational changes in an ion channel in real time」を参照のこと。例えば、「J. C. Miller, S. K. Silverman, P. M. England, D. A. Dougherty および H. A. Lester, Neuron, 20:619 (1998) and the use of alpha hydroxy amino acids to change ion channel backbones for probing their gating mechanisms」を参照のこと。例えば、「P. M. England, Y. Zhang, D. A. Dougherty および H. A. Lester, Cell, 96:89 (1999)」;および「T. Lu, A. Y. Ting, J. Mainland, L. Y. Jan, P. G. Schultz および J. Yang, Nat. Neurosci., 4:239 (2001)」を参照のこと。
インビボにおいて非天然アミノ酸を直接タンパク質に組み込む能力は、以下に挙げるような多様な有用性を提供する。例えば、高収量の突然変異タンパク質、技術的容易性、細胞内もしくは生きた組織における突然変異タンパク質研究の発展の可能性、ならびに治療上の処置および診断上の使用におけるこれらの突然変異タンパク質の使用を含む。タンパク質に様々な大きさ、酸性度、求核性、疎水性、および他の特性を有する非天然アミノ酸を含む能力は、タンパク質の機能を確認し、新規な性質を有する新たなタンパク質または組織を作り出すためにタンパク質の構造を合理的および体系的に操作する我々の能力を大きく拡大させた。
パラ−Ｆ−Ｐｈｅを部位特異的に組み込むある試みでは、酵母のアンバーサプレッサーｔＲＮＡＰｈｅＣＵＡ／フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ対が、ｐ−Ｆ−Ｐｈｅ抵抗性を示すＰｈｅ栄養要求性のEscherichia Coli株に使用された。例えば、「R.Futer, Protein Sci., 7:419(1998)」を参照のこと。
本発明のポリヌクレオチドの発現を得るために、無細胞（インビトロでの）翻訳系を用いることも可能である。翻訳系は、細胞系または無細胞系を用いてよく、原核生物または真核生物であってよい。細胞性翻訳系としては、例えば、特に限定されないが、全細胞調製物（透過性細胞など）、または細胞培養物が挙げられる。該細胞性翻訳系では、所望の核酸配列がｍＲＮＡに転写され翻訳される。無細胞性翻訳系は市販されており、多くの異なる種類および系がよく知られている。無細胞系の例は、特に限定されないが、Eschrichia coliライセートのような原核生物ライセートおよび小麦胚芽抽出物、昆虫細胞ライセート、ウサギ網状赤血球ライセート、ウサギ卵母細胞、ならびにヒト細胞ライセートのような真核生物ライセートを含む。真核生物抽出物、またはライセートは、生じるタンパク質が糖化、リン酸化、またはその他の修飾をされている場合に好適である。なぜなら、多くのそのような修飾は真核生物系でのみ可能であるからである。これらの抽出物およびライセートのあるものは市販されている（Promega; Madison,Wis.; Stratagene; La Jolla,Calif.; Amersham; Arlington Heights,III.; GIBCO/BRL; Grand Island, N.Y.)。イヌの膵臓抽出物のようなミクロゾール膜を含む膜質の抽出物は、分泌タンパク質の翻訳の利用にも好適である。これらの系には、鋳型としてのｍＲＮＡ（インビトロ翻訳）または鋳型としてのＤＮＡ（インビトロでの転写および翻訳を連結する）のどちらかを含む。このような系において、インビトロの合成は、リボソームにより方向付けられる。相当な努力が無細胞タンパク質発現系の発展に費やされてきた。例えば、「Kim, D.M.およびJ.R. Swartz, Biotechnology and Bio engineering, 74 :309-316 (2001)」;「 Kim, D.M. および J.R. Swartz, Biotechnology Letters, 22, 1537-1542, (2000) 」;「Kim, D.M., および J.R. Swartz, Biotechnology Progress, 16, 385-390, (2000) 」;「 Kim, D.M., および J.R. Swartz, Biotechnology and Bioengineering, 66, 180-188, (1999) 」;および「Patnaik, R. および J.R. Swartz, Biotechniqiies 24, 862-868, (1998)」；米国特許出願第６，３３７，１９１号明細書、米国特許出願公開第２００２／００８１６６０号明細書、国際公開第００／５５３５３号パンフレット、国際公開第９０／０５７８５号パンフレットを参照のためにここで引用する。非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドの発現に用いられてよい、その他の手法は、ｍＲＮＡ−ペプチド融合技術を含む。例えば、「R. Roberts および J. Szostak, Proc. Natl Acad. Sci (USA) 94:12297-12302 (1997) 」;「 A. FrankelらによるChemistry & Biology 10:1043-1050 (2003) 」を参照のこと。この手法においては、ピューロマイシンに結合したｍＲＮＡ鋳型は、リボソームにおいてペプチドに翻訳される。もし１つ以上のｔＲＮＡ分子が修飾されていれば、非天然アミノ酸は、さらにペプチドに組み込まれる。最後のｍＲＮＡコドンが読まれた後、ピューロマイシンはペプチドのＣ末端を捕捉する。もしｍＲＮＡペプチド結合の生成が、インビトロ分析において興味深い特徴を有することが明らかとなれば、ｍＲＮＡ配列からその性質を容易に明らかにすることができる。この方法において、当業者は、所望の特性を有するポリペプチドを同定するために１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドのライブラリーをスクリーニングしてよい。最近になって、精製された構成要素のインビトロにおけるリボソーム翻訳は、非天然アミノ酸に置換されたペプチドの合成を可能にすることが報告された。例えば、「A. ForsterらのProc. Natl Acad. Sci. (USA) 100:6353 (2003)」を参照のこと。
再構成された翻訳系も使用されてもよい。精製された翻訳因子の混合物は、ライセートの組み合わせ、開始因子−１（ＩＦ−１）、ＩＦ−２、ＩＦ−３（αもしくはβ）、伸長因子Ｔ（ＥＦ−Ｔｕ）、または終結因子のような精製された翻訳因子を補ったライセートと同様に、ｍＲＮＡをタンパク質に翻訳することにも用いられてきた。ここで参照のために引用する「Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubelら editors, Wiley Interscience, 1993) 」に記載されているように、無細胞系は、ＤＮＡが系に導入され、ｍＲＮＡに転写され、翻訳される転写／翻訳系とも連動してよい。真核生物の転写系におけるＲＮＡの転写は、異核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）または５’末端キャップ（７−メチルグアノシン）、および３’末端ポリＡテイル成熟ｍＲＮＡの形態にあり、これは特定の翻訳系において有用である。例えば、キャップされたｍＲＮＡは、網状赤血球ライセート系において高効率に翻訳される。
＜ＩＸ．ポリペプチドに連結している高分子ポリマー＞
本明細書に記載した非天然アミノ酸ポリペプチドへの多様な修飾は、本明細書に記載した組成、方法、技術および戦略を用いて達成することができる。これらの修飾は、ポリペプチドの構成要素である非天然アミノ酸にさらなる機能性基を組み込むことを含む。該機能性基としては、例えば、特に限定されないが、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋体；放射性核種；細胞毒性化合物；薬剤；親和性標識；光親和性標識；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質またはポリペプチドあるいはポリペプチド類似体；抗体または抗体断片；金属キレート剤；共同因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；サッカライド；水溶性デンドリマー；シクロデキストリン；阻害性リボ核酸；生体材料；ナノ粒子；スピンラベル；蛍光団；金属含有部分；放射性部分；新規官能基；他の分子と共有結合または非共有結合で相互作用する基；光ケージド部分；化学線により励起可能な部分；光異性体化可能部分；ビオチン；ビオチンの誘導体；ビオチンの類似体；重原子を組み込んでいる部分；化学的に切断可能な基；光切断可能な基；伸長した側鎖；炭素連結型の糖；酸化還元活性化剤；アミノチオ酸；毒性部分；同位体標識されている部分；生物物理学的なプローブ；燐光性の基；化学発光性の基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基；発色団；エネルギー伝達薬剤；生物活性剤；検出可能な標識；低分子；量子ドット；ナノ伝達剤；放射性ヌクレオチド；放射性伝達剤；中性子捕獲剤；あるいは上記または他の任意の所望の化合物もしくは物質の任意の組み合わせが挙げられる。本明細書に記載した組成、方法、技術、および戦略の限定されない例として、以下の記載において、非天然アミノ酸ポリペプチドへの高分子ポリマーの付加に焦点を当てるが、そこに記載した組成、方法、技術、および戦略は、上記機能性基などの他の機能性基（当業者が必要に応じて本明細書の開示を用いて作製することができる、好適な修飾を有する）を適用することができると理解されたい。
多様な高分子ポリマーおよび他の分子は、ポリペプチドの生物学的特性を調節するために、および／または分子に新規の生物学的特性を提供するために本発明のポリペプチドに連結できる。これらの高分子ポリマーは、天然にコードされたアミノ酸を介して、非天然にコードされたアミノ酸を介して、天然もしくは非天然アミノ酸の官能性置換基を介して、または天然もしくは非天然アミノ酸に付加された任意の置換基もしくは官能基を介して、ポリペプチドに連結できる。ポリマーの分子量は広い範囲であってよく、特に限定されないが、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間またはそれ以上を含む。ポリマーの分子量は、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの間であってよく、特に限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａを含む。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１００Ｄａと約５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１００Ｄａと約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１，０００Ｄａと約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約２，０００Ｄａと約５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約５，０００Ｄａと約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１０，０００Ｄａと約４０，０００Ｄａの間である。
本発明は、ポリマー：タンパク質接合体という実質的に同種の調製物を提供する。本明細書で用いられているように「実質的に同種」とは、ポリマー：タンパク質接合体分子が、全てのタンパク質の半分よりも多く観察されることを意味する。ポリマー：タンパク質接合体は生物活性を有する。本明細書において提供された「実質的に同種の」ＰＥＧ化ポリペプチド調製物は、同種の調製物の利点（例えば、ロット間薬物動態学の予測可能性を臨床適用することが簡単になること）を示すほど十分同種なものであるといえる。
ポリマー：タンパク質接合分子の混合物を作製するために当業者に選択されてもよく、本明細書により提供された効果は、モノポリマー：タンパク質接合体の一部を混合物中に含むために当業者により選択されてよい。従って、当業者は、もし所望するのであれば、様々な数のポリマー部分（すなわち、ジ−、トリ−、テトラ−など）が接着した様々なタンパク質の混合物を調製し、上記接合体と、本明細書に記載の方法を用いて調製されたモノーポリマー：タンパク質接合体とを組み合わせて、所望の割合のモノ−ポリマー：タンパク質を有する混合物を作製してもよい。
選択されたポリマーは、水溶性であってよく、そのため接着したタンパク質は生理的環境のような、水溶性環境中で沈殿しない。ポリマーは、分枝状であってもよいし、分枝状でなくてもよい。最終生産物調製物の治療的使用のために、ポリマーは薬学的に許容可能である。
ポリマーの例は、特に限定されないが、以下のものを含む：ポリアルキルエーテルおよびアルコキシキャップされたその類似体（例えば、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシエチレン／プロピレングリコール、およびメトキシまたはエトキシキャップされたそれらの類似体、特にポリオキシエチレングリコール、後者はポリエチレングリコールまたはＰＥＧとして知られている）；ポリビニルピロリドン；ポリビニルアルキルエステル；ポリオキサゾリン、ポリアルキルオキサゾリン、およびポリヒドロキシルアルキルオキサゾリン；ポリアクリルアミド、ポリアルキルアクリルアミド、およびポリヒドロキシアルキルアクリルアミド（例えば、ポリヒドロキシプロピルメタアクリルアミドおよびその誘導体）；ポリヒドロキシアルキルアクリレート；ポリシアル酸およびその類似体；疎水ペプチド配列；デキストランおよびデキストラン誘導体を含むポリサッカライドおよびその誘導体（例えば、カルボキシメチルデキストラン、デキストラン硫酸塩、アミノデキストラン）；セルロースおよびその誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース）；キチンおよびその誘導体（例えば、キトサン、スクシニルキトサン、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルキトサン）；ヒアルロン酸およびその誘導体；でんぷん；アルギン酸塩；コンドロイチン硫酸塩；アルブミン；プルランおよびカルボニルメチルプルラン；ポリアミノ酸およびその誘導体（例えば、ポリグルタミン酸、ポリリジン、ポリアスパラギン酸、ポリアスパラギン酸アミド）；以下のようなマレイン酸無水物共重合体：スチレンマレイン酸無水物共重合体、ジビニルエチルエーテルマレイン酸無水物共重合体；ポリビニルアルコール；それらの共重合体；それらのターポリマー；それらの混合物；および前述の誘導体。
タンパク質分子に対するポリエチレングリコール分子の割合は、その反応液中の濃度によって様々である。一般的に、最適な比率（最小限の過剰な未反応タンパク質またはポリマーが存在する反応の効率に関して）は、選択されたポリエチレングリコールの分子量、および好適な官能基の数によって好適に決定されてよい。分子量に関連して、一般的にポリマーの分子量が大きくなれば、タンパク質に接着しているポリマー分子の数が少なくなる。同様に、ポリマーの分枝はこれらの数値を最適化する際に配慮されるべきである。一般的に、分子量が大きくなれば（または分枝が増えれば）、ポリマー：タンパク質の比率は高くなる。
ＰＥＧ：ポリペプチド接合体を考慮する際に本明細書において用いられるような、「治療的有効量」という用語は、患者に有用である量を意味する。その量は、個人により様々であり、患者の全ての身体的特徴および疾患または病気の根本にある原因を含む要因の数に依存する。治療に用いられるポリペプチドの量は、変更可能であり、有益な濃度で所望の反応を維持する。本構成要素の臨床的に効果のある量は、公共に利用可能な材料および製品を用いて当業者により容易に確認されてよい。
水溶性ポリマーは、特に限定されないが、直鎖状、分岐状、または分枝状を含む任意の構造形状を含んでよい。特に、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）のようなポリ（アルキレングリコール）であるが、他の水溶性ポリマーも採用できる。一例として、ＰＥＧは、本発明の特定の実施形態を記載するために用いられる。
ＰＥＧはよく知られている水溶性のポリマーで市販されているものを使用するか、または技術的によく知られている方法（Sandler および Karo, Polymer Synthesis, Academic Press, New York,Vol.3,pages 138-161, Academic Press, New York,Vol.3,pages 138-161）を用いてエチレングリコールの開環重合により作製できる。「ＰＥＧ」という用語は、広く全てのポリエチレングリコール分子に使用され、大きさまたはＰＥＧの末端の修飾に関連せず、非天然アミノ酸ポリペプチドへの連結を以下の一般式により表すことができる：
ＸＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙ
ここで、ｎは約２〜約１０，０００であり、ＸはＨまたは末端修飾であり、特に限定されないが、Ｃ１−４アルキル、保護基、または末端官能基を含む。
ある場合において、本発明において用いられるＰＥＧは、１つの末端がヒドロキシまたはメトキシを有して終結している、すなわちＸがＨまたはＣＨ３である（「メトキシＰＥＧ」）。あるいは、ＰＥＧは反応基を有して終結してもよく、その結果、二官能性ポリマーが形成される。典型的な反応基は、２０の一般アミノ酸（特に限定されないが、マレイミド基、活性化炭酸塩（特に限定されないが、ｐ−ニトロフェニルエステルを含む）、活性化エステル（特に限定されないが、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルエステルを含む）、およびアルデヒドを含む）に見られる官能基との反応に通常用いられ、２０の一般アミノ酸を不活性化するが、非天然にコードされたアミノ酸の存在下における相補機能基と反応する（特に限定されないが、アジド基およびアルキン基を含む）それらの反応基を含むことができる。
上記の一般式中でＹにより示されるＰＥＧの他の末端は、天然に生じたまたは非天然にコードされたアミノ酸を介してポリペプチドに直接または間接的に接着する。例えば、Ｙはポリペプチドのアミン基（特に限定されないが、リジンのイプシロンアミンまたはＮ末端）に連結する、アミド連結、カルバメート連結または尿素連結であってもよい。また、Ｙはチオール基（特に限定されないが、システインのチオール基）に連結するマレイミド連結であってもよい。また、Ｙは、２０の一般アミノ酸を介しては通常接触できない残基に連結する連結であってもよい。例えば、ＰＥＧ上のアジド基は、［３＋２］型の付加環化反応（Ｈｕｉｓｇｅｎ反応）生産物を形成するためにポリペプチド上のアルキン基に反応できる。また、ＰＥＧ上のアルキン基は、同様の生産物を形成するために非天然にコードされたアミノ酸中に存在するアジド基に反応できる。いくつかの実施形態では、強い求核試薬（特に限定されないが、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジドを含む）は、ヒドラゾン、オキシム、またはセミカルバゾンを形成するために非天然にコードされたアミノ酸中に存在するアルデヒドまたはケトンに反応することができる。ある場合では、規定通りに好適な還元剤により処理され、さらに還元されることができる。また、強い求核試薬は、非天然にコードされたアミノ酸を介してポリペプチドに組み込むことができ、水溶性ポリマーの存在下でケトンまたはアルデヒドと共に優先的に反応に用いられる。
ＰＥＧの分子量は、実質的に望み通りに用いることができ、特に限定されないが、約１００ダルトン（Ｄａ）〜１００，００Ｄａまたは望み通りにさらに大きくてもよい（特に限定されないが、０．１〜５０ｋＤａまたは１０〜４０ｋＤａを含む）。ＰＥＧの分子量は広い範囲であってよく、特に限定されないが、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間またはそれ以上を含む。ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの間であってよく、特に限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの分子量は約１００Ｄａと約５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの分子量は約１００Ｄａと約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの分子量は約１，０００Ｄａと約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの分子量は約５，０００Ｄａと約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの分子量は約１０，０００Ｄａと約４０，０００Ｄａの間である。分枝鎖ＰＥＧは、特に限定されないが、１〜１００ｋＤａ（特に限定されないが、１〜５０ｋＤａまたは５〜２０ｋＤａを含む）の範囲の分子量の各鎖を有するＰＥＧ分子も用いることができる。分枝鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は、特に限定されないが、約１，０００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの間であってよく、特に限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、および１，０００Ｄａを含む。いくつかの実施形態では、分枝鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は約１，０００Ｄａと約５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、分枝鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は約５，０００Ｄａと約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、分子鎖ＰＥＧの各鎖の分子量は約５，０００Ｄａと約２０，０００Ｄａの間である。広い範囲のＰＥＧ分子は、特に限定されないが、本明細書に参照のために引用される「Shearwater Polymer, Inc. catalog, Nekter Therapeutics catalog」に記載されている。
一般的に、ＰＥＧ分子の少なくとも１つの末端は、非天然にコードされたアミノ酸との反応に好適である。例えば、アミノ酸側鎖に反応するアルキンおよびアジド部分を有するＰＥＧ誘導体は、本明細書に記載したように非天然にコードされたアミノ酸にＰＥＧを接着させるために用いることができる。もし、非天然にコードされたアミノ酸がアジドを含んでいれば、続いてＰＥＧは、特に［３＋２］型の付加環化反応（Ｈｕｉｓｇｅｎ反応）産物の形成に影響を与えるアルキン部分、またはアミド連結の形成に影響を与えるホスフィン基を含む活性化されたＰＥＧ種（すなわち、エステル、炭酸塩）のどちらかを含む。また、もし非天然にコードされたアミノ酸がアルキンを含んでいれば、続いてＰＥＧは、［３＋２］型の付加環化反応（Ｈｕｉｓｇｅｎ反応）産物の形成に影響を与えるアジド部分を特に含有する。もし非天然にコードされたアミノ酸がカルボニル基を含んでいれば、ＰＥＧは、関連するヒドラゾン、オキシム、およびセミカルバゾン連結の形成にそれぞれ影響を与えるため、特に強い求核試薬（特に限定されないが、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、またはセミカルバゾン機能性基を含む）を含む。他の代替方法では、上記した反応基の配向性の逆転が用いられる。すなわち、非天然にコードされたアミノ酸中のアジド部分は、アルケンを含有するＰＥＧ誘導体に反応することができる。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ誘導体を有するポリペプチドバリアントは化学機能性基を含む。非天然にコードされたアミノ酸の側鎖上に存在する化学機能性基に反応する。
いくつかの実施形態では、本発明は、平均分子量約８００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａを有するアジドおよびアセチレンを含むポリマー誘導体を含む水溶性ポリマー骨格を提供する。水溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリ（エチレングリコール）である。しかし、多様な水溶性ポリマー（特に限定されないが、ポリ（エチレン）グリコールおよび他の関連したポリマー（ポリ（デキストラン）およびポリ（プロピレングリコール）を含む）を含む）は、本発明の実施に際しても好適であり、ＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）の使用は、全てのそのような分子を網羅し、含むことを目的としている。ＰＥＧという言葉は、特に限定されないが、ポリ（エチレングリコール）、二官能性ＰＥＧ、マルチアームドＰＥＧ、誘導体化ＰＥＧ、分岐状ＰＥＧ、分枝状ＰＥＧ、垂れ下がったＰＥＧ（すなわち、ポリマー骨格に垂れ下がった１つ以上の官能基を有するＰＥＧまたは関連したポリマー）、または分解可能な連結を有するＰＥＧを含む。
ＰＥＧは通常、透明、無色、無臭、水溶性、熱に対して安定であり、さらに、多くの化学薬品に対して不活性であったり、加水分解または劣化しなかったり、一般的に毒性がない。ポリ（エチレングリコール）は生体適合性があると考えられており、つまりＰＥＧは生きた組織または器官を傷つけずに共存することができる。さらに具体的には、ＰＥＧは実質的に非免疫原性であり、つまりＰＥＧはインビボにおいて免疫反応を起す傾向がない。生体内において、生物学的に活性な薬剤（生物活性剤）のような、所望の機能を有する分子を接着させた場合、ＰＥＧは薬剤をマスクし、全ての免疫反応を減少または消失することができ、組織は試薬の存在を容認することができる。ＰＥＧは重大な免疫反応をほとんど起こさず、凝固の原因とならず、その他の望ましくない効果を有しない。式−ＣＨ２ＣＨ２−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−を有するＰＥＧ（ここで、ｎは３〜４，０００であり、特に約２０〜約２０００である）は、本発明の使用に好適である。本発明のいくつかの実施形態では、約８００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの分子量を有するＰＥＧは特にポリマー骨格として有用である。ＰＥＧの分子量は広い範囲であってよく、特に限定されないが、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間、またはそれ以上を含む。ＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａ〜１００，０００Ｄａの間であってよく、特に限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ，７０，０００Ｄａ，６５，０００Ｄａ，６０，０００Ｄａ，５５，０００Ｄａ，５０，０００Ｄａ，４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの分子量は約１００Ｄａと約５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの分子量は約１００Ｄａと約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの分子量は約１，０００Ｄａと約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの分子量は約５，０００Ｄａと約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ＰＥＧの分子量は約１０，０００Ｄａと約４０，０００Ｄａの間である。
ポリマー骨格は、直鎖状または分枝状であってもよい。分枝鎖状のポリマー骨格は一般的に知られている。一般的に、分枝状のポリマーは、分枝の中央コア部分および分枝の中央コアに連結した多数の直鎖状のポリマー鎖を有する。ＰＥＧは、通常、グリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリスリトール、およびソルビトールのような多数のポリオールにエチレンオキサイドを加えることで生成可能である分枝状の形態で用いられる。分枝の中央部分は、リジンのような、数種のアミノ酸に由来する。分枝状のポリ（エチレングリコール）は、Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍとして表すことができ、Ｒはグリセロール、グリセロールオリゴマー、またはペンタエリスリトールのようなコア部分に由来し、ｍは腕の本数を表す。複数の腕を有するＰＥＧ分子（本明細書に参照のために引用する米国特許出願第５，９３２，４６２号明細書；米国特許出願第５，６４３，５７５号明細書；米国特許出願第５，２２９，４９０号明細書；米国特許出願第４，２８９，８７２号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号明細書；国際公開第９６／２１４６９号パンフレット；および国際公開第９３／２１２５９号パンフレットに記載されている）も、ポリマー骨格として使用できる。
分枝状のＰＥＧは、ＰＥＧ（−ＹＣＨＺ２）ｍによって表される二本鎖ＰＥＧも形成できる。ここで、Ｙは連結基であり、Ｚは定義された長さの原子鎖によりＣＨに連結した活性化末端基である。
さらに他の分枝状の形状、垂れ下がったＰＥＧ（Pendant PEG）は、ＰＥＧ鎖の末端よりむしろＰＥＧ骨格の間に反応基（カルボニル基など）を有する。
ＰＥＧのこれらの形状に加えて、ポリマーは、骨格中で弱いまたは分解可能な連結を作製することもできる。例えば、ＰＥＧは、加水分解されやすいポリマー骨格中のエステル連結を作製できる。以下に示すように、この加水分解は、ポリマーを低分子量の断片に切断する：
−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＰＥＧ−＋Ｈ２Ｏ → ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈ＋ＨＯ−ＰＥＧ−
当業者は、ポリ（エチレングリコール）またはＰＥＧという用語は、特に限定されないが、本明細書において開示されたものを含む全ての形状を表し、または含むことを理解する。
多くの他のポリマーも本発明の使用に好適である。いくつかの実施形態では、２〜３００末端を有する水溶性ポリマー骨格は、本発明に特に有用である。好適なポリマーの例は、特に限定されないが、他のポリ（アルキレングリコール）（例えば、ポリ（プロピレングリコール））（「ＰＰＧ」）、それらの共重合体、（特に限定されないが、エチレングリコールおよびプロピレングリコールの共重合体を含む）、それらの三元重合体、それらの混合体などを含む。ポリマー骨格の各鎖の分子量は多様であるが、約８００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの範囲であり、大抵約６，０００Ｄａ〜約８０，０００Ｄａである。ポリマー骨格の各鎖の分子量は、約１００Ｄａと約１００，０００Ｄａの間であってよく、特に限定されないが、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ，７０，０００Ｄａ，６５，０００Ｄａ，６０，０００Ｄａ，５５，０００Ｄａ，５０，０００Ｄａ，４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａ、および１００Ｄａを含む。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１００Ｄａと約５０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１００Ｄａと約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１，０００Ｄａと約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約５，０００Ｄａと約４０，０００Ｄａの間である。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は約１０，０００Ｄａと約４０，０００Ｄａの間である。
当業者は、実質的な水溶性ポリマーの前述のリストは、全てを網羅しておらず、単に例示だと認識する。そして、上記の性質を有する全てのポリマー材料は、本発明における使用に好適であるように意図されている。
本発明のいくつかの実施形態では、ポリマー誘導体は「多機能性」である。このことは、ポリマー骨格は、少なくとも２つの末端を有し、約３００の末端を有する可能性があり、官能基により官能化または活性化される。多機能性ポリマー誘導体は、特に限定されないが、それぞれの末端に官能基（同一でも、異なっていてもよい）が結合した２つの末端を有する直鎖状ポリマーを含むことを意味している。
一実施形態では、ポリマー誘導体は以下の構造を有する：
Ｘ−Ａ−ＰＯＬＹ−Ｂ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（Ｎ＝Ｎ＝Ｎはアジド部分であり；
Ｂは連結部分であり、存在しても存在しなくてもよく；
ＰＯＬＹは水溶性で非抗原性のポリマーであり；
Ａは連結部分であり、存在しても存在しなくてもよく、Ｂと同一でも異なってもよく；
Ｘは第２官能基である）。
連結部分ＡおよびＢの例は、特に限定されないが、最大１８の多重官能基性のアルキル基を含み、１〜１０の間の炭素原子を含んでもよい。窒素、酸素、または硫黄のようなヘテロ原子は、アルキル鎖に含まれてよい。アルキル鎖は、ヘテロ原子において分岐してもよい。連結部分ＡおよびＢの他の例は、特に限定されないが、最大１０の多重官能基性のアリール基を含み、５〜６の炭素原子を含んでもよい。アリール基は、１つ以上の炭素原子、窒素、酸素、または硫黄原子に置換されてよい。好適な連結基の他の例は、米国特許第５，９３２，４６２号明細書；米国特許第５，６４３，５７５号明細書；および米国特許出願第２００３／０１４３５９６号明細書に記載されており、それぞれ本明細書において参照のために引用する。当業者は、連結部分の前記のリストは、全てを網羅しておらず、単に例示だと認識する。そして、上記した性質を有する全ての連結部分は、本発明における使用に好適であるように意図されている。
Ｘとして使用するための好適な官能基の例は、特に限定されないが、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシル、活性エステル（Ｎ−ヒドロキシスクシニジルエステルおよび１−ベンゾトリアゾリルエステル、活性炭酸塩（Ｎ−ヒドロキシスクシニジル炭酸塩および１−ベンゾトリアゾリル炭酸塩、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン（ｄｉｏｎｅｓ）、メシラート、トシレート、トレシレート、アルケン、ケトン、ならびにアジドを含む。当業者に理解されているように、選択されたＸ部分は、アジド基との反応を起こさないようにアジド基に相性がよいべきである。アジド含有ポリマー誘導体は、ホモ二官能性であってもよいし（第２官能基（すなわちＸ）もアジド部分であることを意味する）、あるいはヘテロ二官能性であってもよい（第２官能基は異なった官能基であることを意味する）。
用語「保護された」は、保護基、またはある反応条件下において化学的反応性官能基の反応を阻害する部分が存在することをいう。保護基は、保護される化学反応基の種類に応じて変えることができる。例えば、化学反応基がアミンまたはヒドラジドである場合、保護基はｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）および９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）の群から選ぶことができる。化学反応基が、チオールである場合、保護基は、オルソピリジルジスルフィドであってもよい。化学反応基が、カルボン酸（ブタン酸もしくはプロピオン酸など）、またはヒドロキシル基である場合、保護基は、ベンジル基またはアルキル基（メチル、エチル、またはｔｅｒｔ−ブチル）であってもよい。また、公知の他の保護基も本発明において用いてもよい。
文献に記載された末端官能基の具体例は、特に限定されないが、Ｎ−スクシニジル炭酸塩（例えば、米国特許出願第５，２８１，６９８号明細書、米国特許出願第５，４６８，４７８号明細書を参照のこと）、アミン（例えば、「BuckmannらMakromol.Chen.182:1379(1981)」、「ZalipskyらEur.Polym.J.19:1177(1983)」を参照のこと）、ヒドラジド(例えば、「AndreszらMakromol.Chem.179:301(1978)」を参照のこと)、スクシニジルプロピオン酸塩およびスクシニジルブタン酸塩（例えば、「Olsonら in Poly(ethylene glycol) Chemistry & Biological Applications, pp170-181」、「Harris&Zalipsky Eds. ACS, Washington, D.C. 1997」、米国特許出願第５，６７２，６６２号明細書を参照のこと）、スクシニジルコハク酸（例えば、「Abuchowski ら Cancer Biochem.Biophys.7:175(1984)」および「Joppich ら Makromol.Chem.180:1381(1979)」、スクシニジルエステル（例えば、米国特許出願第４，６７０，４１７号明細書を参照のこと）、ベンゾトリアゾール炭酸塩（例えば、米国特許出願第５，６５０，２３４号明細書を参照のこと）、グリシジルエーテル（例えば、「Pitha ら Eur.J Biochem.94:11(1979)」、「Elling らBiotech.Appl.Biochem.13:354(1991)」）、オキシカルボニルイミダゾール（例えば、「Beauchamp らAnal.Biochem.131:25(1983)」、「Tondelli ら J.Controlled Release 1:251(1985)」を参照のこと）、ｐ−ニトロフェニル炭酸塩（例えば、「Veronese, らAppl.Biochem.Biotech., 11:141(1985)」および「Sartore らAppl.Biochem.Biotech.,27:45(1991)」を参照のこと）、アルデヒド（例えば、「Harris らJ.Polym.Sci.Chem.Ed.22:341(1984)」、米国特許出願第５，８２４，７８４号明細書、米国特許出願第５，２５２，７１４号明細書）、マレイミド（例えば、「Goodson ら Bio/Technology 8:343(1990)」、「Romani らin Chemistry of peptides and Proteins 2:29(1984)」、および「Kogan, Synthetic Comn.22:2417(1992)」を参照のこと）、オルトピリジル−二硫化物（例えば、「WoghirenらBioconj.Chem.4:314(1993)」を参照のこと)、アクリルオル(例えば、「SawhneyらMacromolecules,26:581(1993)」を参照のこと）、ビニルスルホン（例えば、米国特許出願第５，９００，４６１号明細書を参照のこと）。上記の文献および特許は、本願に参照のために引用する。
本発明の特定の実施形態では、発明のポリマー誘導体は以下の構造を有するポリマー骨格を含む：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（Ｘは上記したような官能基であり；ｎは約２０〜約４０００である）。
他の実施形態では、本発明のポリマー誘導体は、以下の構造を有するポリマー骨格を含む：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｗ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（Ｗは１〜１０の間の炭素原子を含む脂肪族化合物または芳香族化合物リンカー部分であり；ｎは約２０〜約４０００であり；Ｘは上記した官能基である）。ｍは１〜１０の間である。
本発明のアジド含有ＰＥＧ誘導体は、公知のおよび／または本明細書で開示された多様な方法により作製できる。以下に示した方法では、平均分子量約８００Ｄａ〜約１００，００Ｄａを有する水溶性ポリマー骨格、第１の官能基に結合した第１末端を有するポリマー骨格、および好適な脱離基に結合した第２末端は、アジドアニオン（任意の数の好適な対イオン（ナトリウム、カリウム、ｔｅｒｔ−ブチルアンモニウムなど）に対を形成してよい）と反応する。離脱基は、求核置換を受け、所望のアジド含有ＰＥＧポリマーを利用可能にするアジド部分により置換される。
Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ ＋ Ｎ３ − → Ｘ−ＰＥＧ−Ｎ３
図のように、本発明の使用に好適なポリマー骨格は、一般式Ｘ−ＰＥＧ−Ｌを有し、ここで、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｘはアジド基と反応しない官能基であり、Ｌは好適な脱離基である。好適な官能基の例は、特に限定されないが、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アセタール、アルケニル、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、マレイミド、ジチオピリジンおよびビニルピリジン、ならびにケトンを含む。好適な脱離基の例は、特に限定されないが、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシラート、トレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、およびトシレートを含む。
本発明のアジド含有ポリマー誘導体の他の調製方法では、アジド機能性基を有する連結剤は、平均分子量約８００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａを有する水溶性ポリマー骨格に接触する。ここで、連結剤は、アジド含有ポリマー誘導体生産物を形成するためにＰＥＧポリマーの化学機能性基に選択的に反応する化学機能性基を有する。ここで、アジドは連結基によりポリマー骨格から分離される。
典型的なスキームを以下に示す：
Ｘ−ＰＥＧ−Ｍ ＋ Ｎ−リンカー−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ → ＰＧ−Ｘ−ＰＥＧ−リンカー−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（ＰＥＧは、ポリ（エチレングリコール）であり、Ｘは上記したようなアルコキシまたは官能基のような保護基であり；Ｍはアジド官能性基と反応しないが、Ｎ官能基と効率的および選択的に反応する官能基である）。
好適な官能基の例は、特に限定されないが、もしＮがアミンであれば、Ｍはカルボン酸、炭酸塩、または活性エステルである；Ｎがヒドラジドまたはアミノオキシ部分であれば、Ｍはケトンである；Ｎが求核試薬であれば、Ｍは離脱基である。
精製していない生産物の精製は、特に限定されないが、必要であればクロマトグラフィーによる生産物の沈殿を含む公知の方法により達成されてよい。
さらなる具体例を以下のＰＥＧジアミンの例に示す。ここで、アミンの１つは、ｔｅｒｔ−ブチル−Ｂｏｃのような保護基部分により保護され、生じる単保護ＰＥＧジアミンは、アジド官能性を有する連結部分に反応する：
ＢｏｃＨＮ−ＰＥＧ−ＮＨ２ ＋ ＨＯ２Ｃ−（ＣＨ２）３−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
この場合、モノアミンＰＥＧ誘導体およびアジドを有するリンカーの間にアミド結合を作製するために、チオニルクロライドまたはカルボジイミド試薬およびＮ−ヒドロキシスクシニミドまたはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールのような多様な活性化試薬を用いて、アミン基はカルボン酸に結合できる。アミド結合の作製後、生じるＮ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｂｏｃ−保護アジド含有誘導体は、生物活性分子を直接修飾するために使用することができる。また、該アジド含有誘導体は、他の有用な官能基を組み込むためにさらに作製することができる。例えば、Ｎ−ｔ−Ｂｏｃ基は、オメガ−アミノ−ＰＥＧ−アジドを作り出すために、強酸での処理により加水分解することができる。生じたアミンは、有用なヘテロ二官能性試薬の作製のためにマレイミド基、活性ジスルフィド、活性エステルなどのような他の有用な機能性基を組み込むために合成ハンドル（synthtic handle）として用いることができる。
ヘテロ二官能性誘導体は、ポリマーのそれぞれの末端へ異なる分子を取り付けることを目的とする場合に、特に有用である。例えば、オメガ−Ｎ−アミノ−Ｎ−アジドＰＥＧは、ＰＥＧの１末端およびＰＥＧの他の末端にアセチレン基を有する分子に対して、アルデヒド、ケトン、活性エステル、活性炭酸塩などのような活性親電子的基を有する分子の取り付けを可能にする。
本発明の他の実施形態では、ポリマー誘導体は以下の構造を有する：
Ｘ−Ａ−ＰＯＬＹ−Ｂ−Ｃ≡Ｃ−Ｒ
（Ｒは、Ｈもしくはアルキル、アルケン、アルコキシ、またはアリールもしくは置換アリール基のどれかであり；
Ｂは、連結部分であり、存在しても、存在しなくてもよく；
ＰＯＬＹは水溶性で非抗原性のポリマーであり；
Ａは連結部分であり、存在しても存在しなくてもよく、Ｂと同じか、またはＢと異なっていてもよく；
Ｘは第２官能基である）。
ＡおよびＢの連結部分の例は、特に限定されないが、最大１８の多官能性アルキル基を含み、１〜１０の間の炭素原子を含んでよい。窒素、酸素、または硫黄のようなヘテロ原子は、アルキル鎖に含まれてよい。アルキル鎖は、ヘテロ原子において分岐してもよい。ＡおよびＢの連結部分の他の例は、特に限定されないが、最大１０の多官能性アリール基を含み、５〜６の炭素原子を含んでよい。アリール基は、１つ以上の炭素原子、窒素酸素、硫黄原子で置換されてよい。好適な連結基の他の例は、それぞれ本明細書に参照のために引用される、米国特許第５，９３２，４６２号明細書、米国特許第５，６４３，５７５号明細書、および米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号明細書に記載された連結基を含む。当業者は、前記の連結部分のリストは、全てを網羅しておらず、単に例示だと認識する。そして、上記した性質を有する多様な連結部分は、本発明に有用であることを意図されている。
Ｘとしての使用に好適な官能基の例は、ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシル、活性エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステルおよび１−ベンゾトリアゾリルエステル）、活性炭酸塩、（Ｎ−ヒドロキシスクシニミジル炭酸塩および１−ベンゾトリアゾリル炭酸塩）、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシラート、トシレートならびにトレシレート、アルケン、ケトン、およびアセチレンを含む。理解されるように、アセチレン基との反応が起こらないようにＸ部分はアセチレン基と相性がよいべきである。アセチレン含有ポリマー誘導体は、ホモ二官能性であってもよいし（第２官能基（すなわちＸ）もアセチレン部分であることを意味する）、あるいはヘテロ二官能性であってもよい（第２官能基は異なる官能基であることを意味する）。
本発明の別の実施形態では、ポリマー誘導体は以下の構造を有するポリマー骨格を含む：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ
（Ｘは上記のような官能基であり；ｎは約２０〜約４０００であり；ｍは１〜１０の間である）。
それぞれのヘテロ二官能性ＰＥＧポリマーの具体例を以下に示す。
本発明のアセチレン含有ＰＥＧ誘導体は、当業者に公知の方法および／または本明細書で開示された方法を用いて作製できる。ある方法では、平均分子量約８００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａを有する水溶性ポリマー骨格（第１官能基に結合した第１末端、および好適な求核基に結合した第２末端を有する）は、アセチレン機能性基、およびＰＥＧ上の求核基に好適に反応する脱離基の両方を有する化合物に反応する。求核部分を有するＰＥＧポリマーおよび脱離基を有する分子が結合している場合、脱離基は、所望のアセチレン含有ポリマーを生じるために、求核置換を受け、求核部分により置換される。
Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ ＋ Ｌ−Ａ−Ｃ → Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ−Ａ−Ｃ≡ＣＲ’
示したように、反応に使用するのに好ましいポリマー骨格は、一般式Ｘ‐ＰＥＧ‐Ｎｕを有し、ここでＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｎｕは求核部分であり、ＸはＮｕ、Ｌ、またはアセチレン機能性基に反応しない官能基である。
Ｎｕの例は、特に限定されないが、ＳＮ２型機構により最初に反応するアミン、アルコキシ、アリールオキシ、スルヒドリル、イミノ、カルボン酸塩、ヒドラジド、およびアミノオキシ基を含む。Ｎｕ基の付加の例は、求核付加反応により最初に反応する官能基を含む。Ｌ基の例は、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシレート、トレシレートならびにトシレート、および求核置換を受ける、ケトン、アルデヒド、チオエステル、オレフィン、アルファベータ不飽和カルボニル基、炭酸塩、ならびに求核原子により付加を受けるものを除外した他の親電子基を含む。
本発明の別の実施形態では、Ａは１〜１０の間の炭素原子、または６〜１４の間の炭素原子の置換されたアリール環の脂肪族化合物リンカーである。Ｘはアジド基と反応しない官能基であり、Ｌは好適な脱離基である。
本発明のアセチレン含有ポリマー誘導体の他の作製方法では、ある末端の保護された官能基または保護試薬（capping agent）および他の末端の好適な脱離基のどちらかを有する平均分子量約８００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａを有するＰＥＧポリマーは、アセチレンアニオンにより接触される。
典型的なスキームを以下に示す：
Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ ＋ −Ｃ≡ＣＲ’ → Ｘ−ＰＥＧ−Ｃ≡ＣＲ’
（ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｘはアルコキシのような保護基または上記したような官能基であり；Ｒ’は、Ｈ、アルキル、アルコキシ、アリールもしくはアリールオキシ基、または置換アルキル、アルコキシ、アリールもしくはアリールオキシ基である）。
上記の例では、十分な濃度のアセチレンアニオンに接触する場合、脱離基ＬはＳＮ２型置換を受けるために十分な反応性を有するべきである。アセチレンアニオンによる脱離基のＳＮ２置換の達成のために要求される反応条件は、当業者に公知である。
精製されていない生産物の精製は、通常公知の方法により達成できる。前記の方法は、特に限定されないが、必要であれば、クロマトグラフィーによる生産物の沈殿を含む。
水溶性ポリマーは、本発明のポリペプチドに連結できる。水溶性ポリマーは、ポリペプチド中、または非天然もしくは天然にコードされたアミノ酸中に組み込まれた非天然にコードされたアミノ酸（または、非天然もしくは天然にコードされたアミノ酸に付加される任意の官能基もしくは置換基）を介して連結されてよい。また、水溶性ポリマーは、天然に生じたアミノ酸（特に限定されないが、例えば、システイン、リジン、またはＮ末端残基のアミン基を含む）を介して非天然にコードされたアミノ酸を組み込んだポリペプチドに連結される。ある場合では、本発明のポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０以上の非天然アミノ酸を含む。ここで、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸は、水溶性ポリマー（特に限定されないが、ＰＥＧおよび／またはオリゴサッカライドを含む）に連結される。ある場合では、本発明のポリペプチドは、さらに水溶性ポリマーに連結した１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０以上の天然にコードされたアミノ酸を含む。ある場合では、本発明のポリペプチドは、水溶性ポリマーに連結した１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸および水溶性ポリマーに連結した１つ以上の天然に生じたアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明に用いられる水溶性ポリマーは、非接合型と比べてポリペプチドの血中半減期を延長する。
本発明のポリペプチド（すなわち、ＰＥＧ化またはグリコシル化の伸長）に連結された多くの水溶性ポリマーは、生体内半減期のような変更（特に限定されないが、増加または減少）された薬理学的、薬物動態学的、または薬力学的特性を提供するために調整できる。
‐強い求核基（すなわち、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、またはセミカルバジド）を含有するＰＥＧ誘導体‐
本発明の一実施形態では、カルボニルを含む非天然にコードされたアミノ酸を含むポリペプチドは、直接ＰＥＧ骨格に連結された末端ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジド、またはセミカルバジド部分を含むＰＥＧ誘導体で修飾される。
いくつかの実施形態では、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は以下の構造を有する：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
（Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００（すなわち、平均分子量は５〜４０ｋＤａの間）である）。
いくつかの実施形態では、ヒドラジンまたはヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は以下の構造を有する：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００であり、Ｘは必要に応じて存在しても、存在しなくてもよいカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である）。
いくつかの実施形態では、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は以下の構造を有する：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
（Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００である）。
本発明の別の実施形態では、カルボニル含有アミノ酸を含むポリペプチドは、アミド連結によりＰＥＧ骨格に連結される末端ヒドロキシルアミン、ヒドラジド、ヒドラジン、またはセミカルバジド部分を含むＰＥＧ誘導体で修飾される。
いくつかの実施形態では、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は以下の構造を有する：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
（Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００（すなわち、平均分子量は５〜４０ｋＤａの間）である）。
いくつかの実施形態では、ヒドラジンまたはヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は以下の構造を有する：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００であり、Ｘは必要に応じて存在しても、存在しなくてもよいカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である）。
いくつかの実施形態では、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は以下の構造を有する：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
（Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００である）。
本発明の他の実施形態では、カルボニルを含むアミノ酸を含むポリペプチドは、分枝状ＰＥＧのそれぞれの鎖の分子量の範囲が１０〜４０ｋＤａ、および５〜２０ｋＤａである末端ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジド、またはセミカルバジド部分を含む分枝状ＰＥＧ誘導体で修飾される。
本発明の別の実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸を含むポリペプチドは、分枝構造を有するＰＥＧ誘導体で修飾される。例えば、いくつかの実施形態では、ヒドラジンまたはヒドラジド末端ＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有する：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
（Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００であり、Ｘは、存在しても、存在しなくてもよく、任意にカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である）。
いくつかの実施形態では、セミカルバジド基を含むＰＥＧ誘導体は以下の構造を有する：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２
（Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、Ｘは任意にＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）であるか、または存在せず、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００である）。
いくつかの実施形態では、ヒドロキシルアミンを含むＰＥＧ誘導体は、以下の構造を有する：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２
（Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、Ｘは任意にＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）または存在せず、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００である）。
ｈＧＨポリペプチドに連結された水溶性ポリマーの等級および部位は、部位ＩにおけるｈＧＨポリペプチド受容体へのｈＧＨポリペプチドの結合を調節できる。いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＰＥＧにオキシム結合で連結したポリペプチド（例えば、ｈＧＨ）を提供する。ここで、オキシム結合を形成する反応に用いられるＰＥＧは、直鎖状であり、３０ｋＤａモノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）−２−アミノオキシエチルアミンカルバメート塩酸塩である。
一例として、ＰＥＧ試薬は、型または種類に限定されず、本明細書に記載した組成、方法、技術、および戦略に用いられてよい。
さらなる水溶性ポリマーの例（例えば、本発明に有用なＰＥＧ（例えば、オキシム結合の形成を可能にするための修飾型ＰＥＧ））は、米国特許出願第６０／６３８，４１８号明細書；米国特許出願第６０／６３８，５２７号明細書；および「Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides,」と題された米国特許出願第６０／６３９，１９５号明細書（２００４年１２月２２日提出）に見出され、本明細書に参照のために引用される。また、それらは米国特許出願第６０／６９６，２１０号明細書；米国特許出願第６０／６９６，３０２号明細書；および「Compositions containing, methods involving, and uses of non-natural amino acids and polypeptides,」と題された米国特許出願第６０／６９６，０６８号明細書（２００５年７月１日提出）に記載され、本明細書に参照のために引用される。
水溶性ポリマーがＧＨ（例えばｈＧＨ）ポリペプチドに連結される程度および位置によって、ＧＨ（例えばｈＧＨ）ポリペプチドの部位Ｉにおける、当該ＧＨ（例えばｈＧＨ）ポリペプチド受容体に対する結合性が調節され得る。いくつかの実施形態では、上記連結は、ＧＨ（例えばｈＧＨ）ポリペプチドが、部位Ｉにおいて、当該ＧＨ（例えばｈＧＨ）ポリペプチド受容体に、「SpencerらJ. Biol, Chem., 263:7862-7867 (1988) 」などに記載された平衡結合分析により測定された約４００ｎｍ以下のＫｄ、１５０ｎＭ以下のＫｄ、またある場合では１００ｎＭ以下のＫｄでもって結合するように配置される。
ポリマーの活性化、同様にペプチドの接合のための方法および化学的性質は、文献に記載されており、当業者に公知である。ポリマーの活性化に通常用いられる方法は、特に限定されないが、臭化シアン、過ヨウ素酸塩、グルタルアルデヒド、バイエポキシド、エピクロルヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、ハロゲン化スルホニル、トリクロロトリアジンなど（「R. F. Taylor, (1991) PROTEIN IMMOBILISATION. FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS, Marcel Dekker, N.Y.」；「S. S. Wong, (1992), CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING, CRC Press, Boca Raton」;「G. T. Hermansonら(1993), IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES, Academic Press, N.Y.」;「Dunn, R.LらEds. POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991」を参照のこと）を含む。
ＰＥＧの機能化および接合の種々の評論および研究論文が利用可能である。例えば、「Haris,Macromol.Chem.Phys.C25:325-373(1985)」;「Scouten, Metods in Enzymology 135:30-65(1987)」;「WongらEnzyme Microb.Technol.14:866-874(1992)」;「DelgadoらCritical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9:249-304(1992)」;「Zalipsky, Bioconjugate Chem.6:150-165(1995)」を参照のこと。
ポリマーの活性化の方法は、国際公開第９４／１７０３９号パンフレット、米国特許第５，３２４，８４４号明細書、国際公開第９４／１８２４７号パンフレット、国際公開第９４／０４１９３号パンフレット、米国特許第５，２１９，５６４号明細書、米国特許第５，１２２，６１４号明細書、国際公開第９０／１３５４０号パンフレット、米国特許第５，２８１，６９８号明細書、および国際公開第９３／１５１８９号パンフレットなどを参照することができる。また、活性化ポリマーと酵素との接合については、例えば特に特に限定されないが、当該酵素が、凝固因子Ｖ ＩＩＩである場合は国際公開第９４／１５６２５号パンフレット、ヘモグロビンである場合は国際公開第９４／０９０２７号パンフレット、酸素運搬分子である場合は米国特許第４，４１２，９８９号明細書、リボヌクレアーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼである場合は「VeroneseらApp.Biochem.Biotech.11:141-52(1985)」を参照のこと。引用された文献およと特許文献の全ては、参照によって本明細書に組み込まれる。
ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンのような非天然にコードされたアミノ酸を含むポリペプチドのＰＥＧ化（すなわち、任意の水溶性ポリマーの付加）は、任意の使いやすい方法で実行される。例えば、ポリペプチドはアルキン終末ｍＰＥＧ誘導体でＰＥＧ化される。簡単に紹介すると、固体のｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨの過剰量をｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅ含有ポリペプチドの水溶液に室温で攪拌しながら添加する。特に、水溶液は、反応が実行されるｐＨ（一般的に約ｐＨ４〜１０）に近いｐＫａを有する緩衝液で緩衝される。ｐＨ７．５でのＰＥＧ化に好適な緩衝液の例は、例えば、特に限定されないが、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、ホウ酸塩、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ＥＰＰＳ、およびＴＥＳを含む。該ｐＨは、継続的に観察され、必要であれば、調整される。反応は、通常、約１〜４８時間の間、継続してもよい。
その後、反応生産物が疎水性相互作用クロマトグラフィーに供される。これによって、遊離のｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ、および、ブロックされていないＰＥＧが分子の両方の末端において活性化されることにより、ポリペプチドのバリアント分子を架橋するときに形成され得るＰＥＧ化ポリペプチドの任意の高分子量複合体から、ＰＥＧ化ポリペプチドのバリアントが分離される。疎水相互作用クロマトグラフィーの間の条件は、遊離のｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨをカラムに通し、任意の架橋されたＰＥＧ化ポリペプチドバリアント複合体が、１つ以上のＰＥＧ基に接合したポリペプチドバリアント分子を含む所望のものが形成された後に溶出される。好適な条件は、架橋された複合体に対する所望の接合体の相対的大きさに依存して変化し、当業者により容易に決定される。所望の接合体を含む溶離剤は、限外ろ過により濃縮され、ダイアフィルトレーションにより脱塩される。
必要であれば、本明細書に記載したＰＥＧ化された非天然アミノ酸ポリペプチドは、当業者に公知の１つ以上の手段により精製できる疎水性クロマトグラフィーから得られ、以下に特に限定されないが、アフィニティクロマトグラフィー；陰イオン−、または陽イオン−交換クロマトグラフィー（特に限定されないが、DEAE SEPHAROSEを含む）；シリカクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；ゲルろ過（特に限定されないが、SEPHADEX G-75の使用を含む）；疎水相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／ダイアフィルトレーション；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿；クロマト分画；置換クロマトグラフィー；電気泳動法（特に限定されないが、等電点電気泳動を含む）、不等溶解（特に限定されないが、硫酸アンモニウム沈殿を含む）、または抽出を含む。正確な分子量は、球形タンパク質基準（Preneta AZ,PROTEIN PURIFICATION METHODS,A PRACTICAL APPROACH(Harris&Angal,Eds.)IRL Press 1989,293-306)との比較によるＧＰＣにより計算されてよい。ポリペプチド−ＰＥＧ接合体の純度は、質量分析によるタンパク質分解（特に限定されないが、トリプシン切断を含む）により評価されてよい。「Pepinsky RB, らJ.Pharmacol.&Exp.Ther.297(3):1059-66(2001)」を参照のこと。
カルボニル基（例えば、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン）を含んでいる非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドのＰＥＧ化（すなわち任意の水溶性ポリマーの付加）も全ての便利な方法により実行される。包括的な例として、カルボニルを含有する非天然にコードされたアミノ酸（例えば、ｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン）を含んでいるポリペプチドは、分子量約０．１〜１００ｋＤａ、または約１〜１００ｋＤａ、または約１０〜５０ｋＤａ、または約２０〜４０ｋＤａ、または例えば３０ｋＤａのアミノオキシエチルアミン炭酸塩ｍＰＥＧ誘導体でＰＥＧ化される。簡単に説明すると、固体ＭＰＥＧ−オキシアミン（例えば、ｍＰＥＧ（３０，０００）−Ｏ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＯＮＨ３ ＋（直鎖状３０ｋＤａのモノメトキシ−ポリ（エチレングリコール）−２−アミノオキシエチルアミン炭酸塩ハイドロクロライド、３０Ｋ ＭＰＥＧ−オキシアミン）の過剰量は、室温で攪拌されながらｐ−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン含有ポリペプチド水溶液に添加される。ＰＥＧ：ポリペプチド（例えば、ｈＧＨ）のモル比は、約２〜１５、または約５〜１０、または約５、６、７、８、９、もしくは１０である。通常、水溶液は、反応が実行されるｐＨ（一般的に約ｐＨ２〜８）に近いｐＫａを有する緩衝液で緩衝される。例えば、ｐＨ４．０でのＰＥＧ化に好適な緩衝液の例は、特に限定されないが、例えば、酢酸を加えてｐＨを４．０に調整した酢酸ナトリウム／グリシン緩衝液を含む。反応は、通常１〜６０時間、または約１０〜５０時間、または約１８〜４８時間、または約３９〜５０時間の間、室温で穏やかに攪拌しながら持続できる。ＰＥＧ化はＳＤＳゲルによって確認できる。
その後、反応産物は、遊離の３０Ｋ ＭＰＥＧ−オキシアミン、およびブロックされていないＰＥＧが分子の両方の末端において活性化されることにより、ポリペプチドのバリアント分子を架橋するときに形成され得るＰＥＧ化ポリペプチドの任意の高分子量複合体から、精製される。任意の好適な精製方法（例えば、ＳｏｕｒｃｅＱ緩衝液ＡおよびＳｏｕｒｃｅＱ緩衝液Ｂを通すＳｏｕｒｃｅＱカラムのようなカラムクロマトグラフィー）が用いられてよい。反応混合物は、ＴＲＩＳおよびＳｏｕｒｃｅＱ緩衝液ならびにＭｉｌｌｉＱ水で、カラムに注入される前に希釈されてよい。所望の接合体を含む抽出物は、さらに限外ろ過により濃縮、およびダイアフィルトレーションにより脱塩できる。
もし必要であれば、カラムクロマトグラフィーから得られたＰＥＧ化ポリペプチドは、さらに１つ以上の当業者に公知の手段および本明細書に記載された手段により精製可能である（例えば、上記参照）。最終的にＰＥＧ化されたポリペプチドは、５０、６０、７０、８０、９０、９９．９、または９９．９９％以上の精製度で得られてよい。精製度は、公知の方法により決定される。精製度の評価の限定されない典型例は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡ法を用いるポリペプチド測定、ブラフォード分析、質量分析（特に限定されないが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを含む）、ＲＰ−ＨＰＬＣ法のようなＨＰＬＣ法、陽イオン交換ＨＰＬＣ、およびゲルろ過ＨＰＬＣ、ならびに当業者に公知のタンパク質の特性を示す方法を含む。
本発明のポリペプチドのアミノ酸に連結した水溶性ポリマーは、制限なくさらに誘導体化、または置換されることができる。
（アジド含有ＰＥＧ誘導体）
本発明の別の実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸の側鎖上に存在するアルキン部分に反応するアジド部分を含んでいるポリペプチドはＰＥＧ誘導体で修飾される。一般的に、ＰＥＧ誘導体は平均分子量１〜１００ｋＤａを有し、いくつかの実施形態では、１０〜４０ｋＤａである。
いくつかの実施形態では、アジド末端ＰＥＧ誘導体は以下の構造を有する：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｎ３
（Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００である（すなわち、平均分子量は５〜４０ｋＤａの間である））。
別の実施形態では、アジド末端ＰＥＧ誘導体は以下の構造を有する：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ３
（Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｐは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００である（すなわち、平均分子量は約５〜４０ｋＤａの間である））。
本発明の別の実施形態では、アルケン含有アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、分子量約１０〜４０ｋＤａおよび約５〜２０ｋＤａを有する分枝状ＰＥＧのそれぞれの鎖に末端アジド部分を含んでいる分枝状ＰＥＧ誘導体で修飾される。例えば、いくつかの実施形態では、アジド末端ＰＥＧ誘導体は以下の構造を有する：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐＮ３
（Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｐは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００であり、Ｘは任意にＯ、Ｎ、Ｓ、またはカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であり、いずれの場合もＸは存在してもよく、存在しなくてもよい）。
（アルキン含有ＰＥＧ誘導体）
本発明の他の実施形態では、ポリペプチドは、非天然にコードされたアミノ酸の側鎖上に存在するアジド部分に反応するアルキン部分を含有するＰＥＧ誘導体で修飾される。
いくつかの実施形態では、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は以下の構造を有する：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ
（Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００である（すなわち、平均分子量は、約５〜４０ｋＤａの間である））。
本発明の別の実施形態では、アルキン含有非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドは、アミド連結によりＰＥＧ骨格に連結した末端アジドまたは末端アルキン部分を含むＰＥＧ誘導体で修飾される。
いくつかの実施形態では、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は以下の構造を有する：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ）ｐ−Ｃ≡ＣＨ
（Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）であり、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００である）。
本発明の別の実施形態では、アジド含有アミノ酸を含んでいるポリペプチドは、１０−４０ｋＤａの範囲（５〜２０ｋＤａの範囲でもよい）の分子量を有する分枝状ＰＥＧのそれぞれの鎖に末端アルキン部分を含んでいる分枝状ＰＥＧ誘導体で修飾される。例えば、いくつかの実施形態では、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は以下の構造を有する：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ）ｐＣ≡ＣＨ
（Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど）、ｍは２〜１０であり、ｎは１００〜１，０００であり、Ｘは任意にＯ、Ｎ、Ｓ、もしくはカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であるか、または存在しない）。
（ホスフィン含有ＰＥＧ誘導体）
本発明の別の実施形態では、ポリペプチドは、非天然にコードされたアミノ酸の側鎖上に存在するアジド部分に反応するアリールホスフィン基をさらに含んでいる活性化された官能基（特に限定されないが、エステル、炭酸塩などを含む）を含むＰＥＧ誘導体で修飾される。ＰＥＧ誘導体は、一般的に、１−１００ｋＤａの範囲の平均分子量を有し、いくつかの実施形態では、１０−４０ｋＤａである。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ誘導体は以下の構造を有する：
Figure 2009523815
 （ｎは１−１０であり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、もしくはＳであり得るか、または存在し得ず、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性ポリマーである）。
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ誘導体は以下の構造を有する：
Figure 2009523815
 （Ｘは、Ｏ、Ｎ、もしくはＳであり得るか、または存在し得ず、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性ポリマーであり、ＲはＨ、アルキル、アリール、置換アルキル、および置換アリール基である）。典型的なＲ基は、特に限定されないが、−ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＮ、および−ＮＯ２を含む。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’は、それぞれ独立して水素、置換もしくは非置換へテロアルキル、置換もしくは非置換アリール、特に限定されないが、１〜３のハロゲンで置換されたアリール、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を含む。例えば、本発明の化合物が１つ以上のＲ基を含む場合、それぞれのＲ基は独立して、それぞれＲ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’基から選択される（１つ以上のこれらの基が存在する場合）。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に接着する場合、それらは、窒素原子と組み合わさって、５−、６−、７−員環を形成することができる。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、特に限定されないが、１−ピロリジニル、および４−モルホリニルを含むことを意図されている。置換基についての上記の考察から、当業者は、「アルキル」という用語は、ハロアルキル（特に限定されないが、−ＣＦ３および−ＣＨ２ＣＦ３を含む）、およびアシル（特に限定されないが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などを含む）のような、水素以外の基に結合した炭素原子を含む基を意味することを理解する。
（その他のＰＥＧ誘導体および一般的なＰＥＧ化技術）
他の典型的なＧＨに連結してもよいＰＥＧ分子（例えば、ｈＧＨポリペプチド）は、例えば、本明細書に参照のために引用される、米国特許出願公開第２００４／０００１８３８号明細書；米国特許出願公開第２００２／００５２００９号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１６２９４９号明細書；米国特許出願公開第２００４／００１３６３７号明細書；米国特許出願公開第２００３／０２２８２７４号明細書；米国特許出願公開第２００３／０２２０４４７号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１５８３３３号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１４３５９６号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１１４６４７号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１０５２７５号明細書；米国特許出願公開第２００３／０１０５２２４号明細書；米国特許出願公開第２００３／００２３０２３号明細書；米国特許出願公開第２００２／０１５６０４７号明細書；米国特許出願公開第２００２／００９９１３３号明細書；米国特許出願公開第２００２／００８６９３９号明細書；米国特許出願公開第２００２／００８２３４５号明細書；米国特許出願公開第２００２／００７２５７３号明細書；米国特許出願公開第２００２／００５２４３０号明細書；米国特許出願公開第２００２／００４００７６号明細書；米国特許出願公開第２００２／００３７９４９号明細書；米国特許出願公開第２００２／０００２２５０号明細書；米国特許出願公開第２００１／００５６１７１号明細書；米国特許出願公開第２００１／００４４５２６号明細書；米国特許出願公開第２００１／００２１７６３号明細書；米国特許第６，６４６，１１０号明細書；米国特許第５，８２４，７７８号明細書；米国特許第５，４７６，６５３号明細書；米国特許第５，２１９，５６４号明細書；米国特許第５，６２９，３８４号明細書；米国特許第５，７３６，６２５号明細書；米国特許第４，９０２，５０２号明細書；米国特許第５，２８１，６９８号明細書；米国特許第５，１２２，６１４号明細書；米国特許第５，４７３，０３４号明細；米国特許第５，５１６，６７３号明細書；米国特許第５，３８２，６５７号明細書；米国特許第６，５５２，１６７号明細書；米国特許第６，６１０，２８１号明細書；米国特許第６，５１５，１００号明細書；米国特許第６，４６１，６０３号明細書；米国特許第６，４３６，３８６号明細書；米国特許第６，２１４，９６６号明細書；米国特許第５，９９０，２３７号明細書；米国特許第５，９００，４６１号明細書；米国特許第５，７３９，２０８号明細書；米国特許第５，６７２，６６２号明細書；米国特許第５，４４６，０９０号明細書；米国特許第５，８０８，０９６号明細書；米国特許第５，６１２，４６０号明細書；米国特許第５，３２４，８４４号明細書；米国特許第５，２５２，７１４号明細書；米国特許第６，４２０，３３９号明細書；米国特許第６，２０１，０７２号明細書；米国特許第６，４５１，３４６号明細書；米国特許第６，３０６，８２１号明細書；米国特許第５，５５９，２１３号明細書；米国特許第５，７４７，６４６号明細書；米国特許第５，８３４，５９４号明細書；米国特許第５，８４９，８６０号明細書；米国特許第５，９８０，９４８号明細書；米国特許第６，００４，５７３号明細書；米国特許第６，１２９，９１２号明細書；国際公開第９７／３２６０７号パンフレット、欧州特許出願公開第２２９，１０８号明細書、欧州特許出願公開第４０２，３７８号明細書、国際公開第９２／１６５５５号パンフレット、国際公開第９４／０４１９３号パンフレット、国際公開第９４／１４７５８号パンフレット、国際公開第９４／１７０３９号パンフレット、国際公開第９４／１８２４７号パンフレット、国際公開第９４／２８０２４号パンフレット、国際公開第９５／００１６２号パンフレット、国際公開第９５／１１９２４号パンフレット、国際公開第９５／１３０９０号パンフレット、国際公開第９５／３３４９０号パンフレット、国際公開第９６／０００８０号パンフレット、国際公開第９７／１８８３２号パンフレット、国際公開第９８／４１５６２号パンフレット、国際公開第９８／４８８３７号パンフレット、国際公開第９９／３２１３４号パンフレット、国際公開第９９／３２１３９号パンフレット、国際公開第９９／３２１４０号パンフレット、国際公開第９６／４０７９１号パンフレット、国際公開第９８／３２４６６号パンフレット、国際公開第９５／０６０５８号パンフレット、欧州特許出願公開第４３９，５０８号明細書、国際公開第９７／０３１０６号パンフレット、国際公開第９６／２１４６９号パンフレット、国際公開第９５／１３３１２号パンフレット、欧州特許出願公開第９２１，１３１号明細書、国際公開第９８／０５３６３号パンフレット、欧州特許出願公開第８０９，９９６号明細書、国際公開第９６／４１８１３号パンフレット、国際公開第９６／０７６７０号パンフレット、欧州特許出願公開第６０５，９６３号明細書、欧州特許出願公開第５１０，３５６号明細書、欧州特許出願公開第４００，４７２号明細書、欧州特許出願公開第１８３，５０３号明細書、および欧州特許出願公開第１５４，３１６号明細書に記載されているＰＥＧ化方法を含む。本明細書に記載した全てのＰＥＧ分子は、任意の形状で使用されてよく、例えば、特に限定されないが、一本鎖、分枝鎖、マルチアームド鎖、単官能性、二官能性、多官能性、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
（血清アルブミンの親和性の向上）
血清中のポリペプチドの半減期を調節するために、多様な分子を本発明のポリペプチドに融合させることもできる。いくつかの実施形態では、動物中の内在性血清アルブミンの親和性を向上させるために、様々な分子に本発明のポリペプチドが連結または融合する。
例えば、数々の場合では、ポリペプチドの融合および組換え融合、ならびにアルブミン結合配列が作製される。典型的なアルブミン結合配列は、特に限定されないが、連鎖球菌タンパク質Ｇ由来のアルブミン結合ドメイン（例えば、「MakridesらJ. Pharmacol. Exp. Ther. 277(l):534-542 (1996) 」、および「Sjolanderら J, Immunol. Methods 201:115-123 (1997)」を参照のこと)、またはアルブミン結合ペプチド(例えば、「Dennisら J. Biol. Chem. 277(38):35035-35043 (2002)」に記載されるような）を含む。
他の実施形態では、本発明のポリペプチドは、脂肪酸によりアシル化される。数々の場合では、脂肪酸は血清アルブミンとの結合を促進する。例えば、「Kurtzhalsら Biochem. J. 312:725-731 (1995) 」を参照のこと。
他の実施形態では、本発明のポリペプチドは、血清アルブミンに直接融合する（特に限定されないが、ヒト血清アルブミンを含む）。技術的に普通の当業者は、多様な他の分子が、血清アルブミンまたは他の血清組成物への結合を調節するために、本発明において連結することができることを認識する。
＜Ｘ．ポリペプチドのグリコシル化＞
本明細書に記載の方法および組成物は、サッカライド残基を有する１つ以上の非天然アミノ酸を組み込むポリペプチドを含む。サッカライド残基は、天然（例えば、Ｎ−アセチルグルコサミン）または非天然（例えば、３−フルロガラクトース）のどちらであってもよい。上記サッカライドは、Ｎ−連結型またはＯ−連結型のグリコシド連結（例えば、Ｎ−アセチルガラクトース−Ｌ−セリン）または非天然連結（例えば、オキシム、または対応するＣ−もしくはＳ−連結グリコシド）のいずれかによって、非天然アミノ酸に連結してもよい。
上記サッカライド（例えば、グリコシル）部分は、インビボまたはインビトロのどちらかで、非天然アミノ酸ポリペプチドに添加されることができる。本発明のいくつかの実施形態では、カルボニル含有非天然アミノ酸を包含するポリペプチドは、アミノオキシ基で誘導体化された上記サッカライドによって修飾され、オキシム連結を介して連結された対応するグリコシル化ポリペプチドを生成する。一度非天然アミノ酸に接触されると、上記サッカライドは、グリコシルトランスフェラーゼおよび他の酵素で処理され、さらに合成され、非天然アミノ酸ポリペプチドに結合したオリゴサッカライドを生成する。例えば、「H. Liuら. J. Am. Chem. Soc. 125:1702-1703(2003)」を参照のこと。
本発明のいくつかの実施形態では、カルボニルを含んでいる非天然にコードされたアミノ酸を含有するポリペプチドは、アミノオキシ誘導体として作製される規定の構造を有するグリカンで直接修飾される。当業者は、他の機能性基（アジド、アルキン、ヒドラジド、ヒドラジン、およびセミカルバジドを含む）は、非天然にコードされたアミノ酸にサッカライドを連結するために用いることができることを認識する。
本発明のいくつかの実施形態では、アジドまたはアルキニルを含んでいる非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドは、特に限定されないが、アルキニルまたはアジド誘導体をそれぞれ含む、［３＋２］型の付加環化反応（Ｈｕｉｓｇｅｎ反応）により修飾できる。この方法は、タンパク質を極めて高い選択性で修飾することを可能にする。
＜ＸＩ．ポリペプチドダイマーおよびマルチマー＞
本発明は、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ホモマルチマー、またはヘテロマルチマー（すなわち、トリマー、テトラマーなど）のようなポリペプチドの組み合わせ（特に限定されないが、ＧＨスーパーファミリーの一員であるＧＨ（例えば、ｈＧＨおよびｈＧＨ類似体）を含む）。ここで、非天然にコードされたアミノ酸を１つ以上含んでいるポリペプチドは、ポリペプチド骨格に直接結合するか、またはリンカーを介して別ポリペプチドまたはそれらの類似体に結合する。モノマーに比べて分子量が増加するため、ポリペプチドダイマーまたはマルチマー接合体は、特に限定されないが、単量ポリペプチドに比べて異なる薬理的、薬物動態的、薬力学的、調節された治療半減期、または調節された血中半減期を含む新規または所望の特性を示してよい。いくつかの実施形態では、本発明のポリペプチドダイマーは、ポリペプチド受容体のダイマー化を調節する。他の実施形態では、本発明のポリペプチドダイマーまたはマルチマーは、ポリペプチド受容体アンタゴニスト、アゴニスト、または調節因子として働く。
いくつかの実施形態では、ＧＨ（例えばｈＧＨ）を含むダイマーまたはマルチマーに存在する１つ以上のＧＨ（例えばｈＧＨ）分子は、部位ＩＩ結合領域内に存在する水溶性ポリマーに連結した非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる。従って、ダイマーまたはマルチマーのそれぞれのＧＨ（例えば、ｈＧＨ）分子は、部位Ｉ接触点を介してＧＨ（例えば、ｈＧＨ）ポリペプチド受容体への結合のために接近できるが、部位ＩＩ接触点を介して第２のＧＨ（例えば、ｈＧＨ）ポリペプチド受容体への結合はできない。従って、上記ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）ポリペプチドダイマーまたはマルチマーは、２つの異なったＧＨ（例えば、ｈＧＨ）ポリペプチド受容体のそれぞれの部位Ｉ結合部位と結合することができる。しかし、当該ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）分子は、部位ＩＩ領域中に存在する非遺伝的にコードされたアミノ酸に接着した水溶性ポリマーを有するので、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）ポリペプチド受容体は、上記ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）ポリペプチドリガンドの上記部位ＩＩ領域に結合することができない。それ故、上記ダイマーまたはマルチマーは、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）ポリペプチドアンタゴニストとして機能する。いくつかの実施形態では、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）ポリペプチド含有ダイマーまたはマルチマーに存在するＧＨ（例えば、ｈＧＨ）分子の１つ以上では、部位Ｉ結合領域内に存在する非天然にコードされたアミノ酸に水溶性ポリマーが連結されている。このため、当該ダイマーまたはマルチマーは部位ＩＩ領域へ結合することができる。また、いくつかの実施形態では、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）ポリペプチド含有ダイマーまたはマルチマーに存在するＧＨ（例えば、ｈＧＨ）分子の１つ以上では、部位Ｉ結合領域内または部位ＩＩ結合領域内ではない部位に存在する非天然にコードされたアミノ酸に水溶性ポリマーが連結されている。このため、部位Ｉ結合領域および部位ＩＩ結合領域の両方を結合に利用することができる。いくつかの実施形態では、結合のために利用することができる部位Ｉ、部位ＩＩまたはその両方を有するＧＨ（例えば、ｈＧＨ）分子の組み合わせが用いられる。少なくとも１つが結合に利用できる部位Ｉを有し、少なくとも１つが結合に利用できる部位ＩＩを有するＧＨ（例えば、ｈＧＨ分子）の組み合わせは、所望の活性または特性を有する分子を提供してよい。加えて、結合に利用できる部位Ｉおよび部位ＩＩを有するＧＨ（ｈＧＨ）分子の組み合わせは、スーパーアゴニストＧＨ（例えば、ｈＧＨ）分子を形成し得る。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドはＡｓｎ−Ｌｙｓのアミド連結、またはＣｙｓ−Ｃｙｓのジスルフィド結合などを介して、直接連結される。いくつかの実施形態では、連結されたポリペプチドは、ダイマー化を促進する非天然にコードされた異なるアミノ酸を含み、特に限定されないが、第１ポリペプチドの非天然にコードされたアミノ酸中のアルキンおよび第２ポリペプチドの非天然にコードされた第２アミノ酸中のアジドは、［３＋２］型の付加環化反応（Ｈｕｉｓｇｅｎ反応）を介して接合される。また、ケトンを含んでいる非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる第１ポリペプチドは、ヒドロキシルアミンを含んでいる非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる第２ポリペプチドに接合でき、ポリペプチドは対応するオキシムの形成を介して反応する。
また、２つのポリペプチドはリンカーを介して連結される。任意のヘテロまたはホモ二官能性リンカーは、同一または異なる一次配列を有するポリペプチドに連結できる。ある場合では、ポリペプチドを共につなぐリンカーは、二官能性ＰＥＧ試薬であり得る。リンカーは、広範囲の分子量または分子長を有してよい。大きな、もしくは小さな分子量のリンカーはポリペプチド間、もしくはポリペプチドの１つとその受容体もしくは結合パートナーとの間、または連結体とポリペプチドの受容体もしくは結合パートナーとの間に所望の空間的関係もしくは立体構造を提供するためにも用いられてよい。長い分子長もしくは短い分子長を有するリンカーは、ポリペプチド間、もしくはポリペプチドとその受容体との間、または連結体とポリペプチドの間に所望の空間または柔軟性を提供するためにも用いられてよい。同様に、特定の形状または立体構造を有するリンカーは、ポリペプチドが標的に到達する前または後のポリペプチドまたは連結体に特定の形状または立体構造構造を与えるために用いられてよい。このポリペプチドと連結体との間の空間関係を最適化することにより新規の調節されたまたは所望の性質が分子に提供され得る。
いくつかの実施形態では、本発明は以下のダンベル構造を有する水溶性二官能性リンカーを提供する：ａ）アジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、または少なくともポリマー骨格の第１末端上のカルボニル含有部分；およびｂ）少なくともポリマー骨格の第２末端上の第２官能基を含んでいる。第２官能基は、第１官能基と同一または異なっている。いくつかの実施形態では、第２官能基は、第１官能基と反応しない。いくつかの実施形態では、本発明は、分枝状の分子構造の腕を少なくとも１つ含む水溶性化合物を提供する。例えば、分枝状の分子構造は樹枝状である。
いくつかの実施形態では、本発明は、水溶性活性化ポリマーに反応することで形成される１つ以上のポリペプチドを含む、以下の構造を有するマルチマーを提供する：
Ｒ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ
ここで、ｎは５〜３，０００であり、ｍは２〜１０であり、Ｘはアジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、アミノオキシ基、ヒドロキシルアミン、アセチル、またはカルボニル含有部分であり、およびＲはＸと同一または異なる保護基、官能基、または脱離基である。Ｒは、例えば、以下からなる群から選択された官能基である（ヒドロキシル、保護されたヒドロキシル、アルコキシル、Ｎ−ヒドロキシスクシニジルエステル、１−ベンゾトリアゾリルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシニジル炭酸塩、１−ベンゾトリアゾリル、炭酸塩、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護されたアミン、ヒドラジド、保護されたヒドラジド、保護されたチオール、カルボン酸、保護されたカルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨードアセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシラート、トシレート、ならびにトレシレート、アルケン、およびケトンを含む）。
＜ＸＩＩ．ポリペプチドへの抗体形成の測定および免疫原性の前臨床試験＞
抗体の構造の測定および評価の分析は、特に限定されないが、バイオアッセイおよび結合分析が含まれる。バイオアッセイは、特に限定されないが、中和している抗体を検出するために動物試料または患者の血清を使用して分析する。内在性分子の生物学的活性を中和する血清の効果が測定される。例えば、細胞に基づくバイオアッセイは、増殖、細胞毒性、シグナル、またはサイトカイン放出を測定してよい。中和された抗体および中和されていない抗体の両者を検出する結合分析は、外因性のタンパク質に結合する血清の能力を測定する。該抗体の測定方法は、特に限定されないが、ＥＬＩＳＡを含む。これらの抗体の両者の存在の重要性は、本明細書に参照のために引用される「Schellekens, HらClinical Therapeutics 2002; 24(11): 1720-1740」において考察されている。
参照のために引用される「Schellekens, HらClinical Therapeutics 2002; 24(1 1): 1720- 1740」は、インビトロ実験方法はもとより内在性ヒトタンパク質を発現するヒト以外の霊長類および遺伝子組み換えマウスモデルにおける動物実験についても考察している。本明細書に参照のために引用される「Whiteleyらin J. Clin. Invest. 1989; 84:1550-1554」は、ヒトインスリンの免疫原性研究における遺伝子組み換えマウスの使用について考察されている。本明細書に参照のために引用される「Wadhwa, MらJ of Immunol Methods 2003; 278:1-17」には、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ；Ｂｉａｃｏｒｅ）、放射性免疫沈降法分析（ＲＩＰＡ）、免疫学的測定（固相結合免疫学的測定）、架橋および競合ＥＬＩＳＡ、ならびに免疫ブロット法のような免疫原性の検出および測定のための多くの技術について考察されている。他の技術は、特に限定されないが、電気化学発光（ＥＣＬ）を含む。
本明細書において参照のために引用される、「ChirinoらDDT 2004; 9(2):82-90」には、タンパク質治療の免疫原性の検査のためのエキソビボにおけるＴ細胞活性化分析について記載されている。
本発明のポリペプチドの評価について、さらなる方法が当業者に公知である。
ＸＩＩ．ポリペプチド活性およびポリペプチド受容体へのポリペプチド親和性の測定
ｈＧＨ受容体は、「McFarlandらScience, 245:494-499 (1989) 」および「Leung, DらNature, 330:537-543 (1987)」に記載されたように調製できる。ｈＧＨポリペプチド活性は、標準的な公知のインビトロ分析またはインビボ分析を用いて決定できる。例えば、ｈＧＨの存在下において増殖する細胞株（例えば、ｈＧＨ受容体または乳腺刺激性受容体を発現している細胞株）は、ｈＧＨ受容体結合を観察するために用いられる。例えば、「Clark, RらJ. Biol. Chem. 271(36):21969 (1996)」; 「WadaらMoI. Endocrinol. 12:146-156 (1998); Gout, P. WらCancer Res. 40, 2433-2436 (1980)」；国際公開第９９／０３８８７号パンフレットを参照のこと。ＰＥＧ化されていない、またはＰＥＧ化された非天然アミノ酸を含んでいるｈＧＨポリペプチドについて、その受容体のホルモン親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて測定することができる。例えば、米国特許第５，８４９，５３５号明細書；「Spencer, S. Aら J. Biol. Chem., 263:7862-7867 (1988) 」を参照のこと。ｈＧＨ活性実験のインビボ動物モデルは、例えば、「ClarkらJ. Biol. Chem. 271(36):21969-21977(1996) 」の記載を含む。１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるｈＧＨの２量体化能力の分析は、「Cunningham, Bら Science, 254:821-825 (1991)」および「Fun, Gら Science, 256:1677-1680 (1992) 」に記載されているように行うことができる。修飾型ｈＧＨポリペプチドの生物学的活性を評価するために、その受容体とのｈＧＨの相互作用の下流マーカーを測定する分析が用いられてよい。ｈＧＨとその内在性に産生される受容体との相互作用は、シグナルトランスデューサー（signal transducer）および翻訳因子構成員の活性化物質（ヒトＩＭ−９リンパ球細胞株におけるＳＴＡＴ５）のチロシンのリン酸化を導く。ＳＴＡＴ５の２つの形態、ＳＴＡＴ５ＡおよびＳＴＡＴ５Ｂは、ヒトＩＭ−９リンパ球細胞株から同定された。「SilvaらMoI. Endocrinol. (1996) 10(5):508-518」を参照のこと。全ての引用された文献および特許は、本明細書に参照のために組み込まれる。参照のために組み込まれる米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書にｈＧＨポリペプチドの特性を調べるための追加の分析について記載されている。
ポリペプチドの特性を調べるための分析およびそれらの受容体または結合パートナーは当業者に公知である。
分析の方法論のための文献の編集物は完全ではなく、当業者は所望の最終産物の検査のために有用な他の分析を認識する。
＜ＸＩＩＩ．効能、インビボでの機能半減期、および薬物動態パラメータの測定＞
本発明の重要な態様は、水溶性ポリマー部分へポリペプチドを接合するか、またはしないことにより、ポリペプチドを構築することによって得られた、延長された生物学的半減期である。ポリペプチドの血中濃度の早い減少は、接合および非接合のポリペプチドならびにそのバリアントによる治療に対する、生物学的反応を評価するために重要とされてきた。本発明の接合および非接合のポリペプチド、ならびにそのバリアントは、皮下または静脈内投与後にも延長された血中半減期を有してよい。前記血中半減期は、例えば、ＥＬＩＳＡ法により、または一次スクリーニング分析により測定できる。BioSource International(Camarillo, CA)、またはDiagnostic Ststems Laboratories (Webster,TX）のどちらかのＥＬＩＳＡキットまたはＲＩＡキットが用いられてよい。インビボにおける生物学的半減期の測定は、本明細書に記載されたように実行される。
非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるｈＧＨのようなポリペプチドのインビボにおける半減期の効能および機能性は、「Clark, Rら J. Biol. Chem. 271(36):21969-21977 (1996)」に記載のプロトコールに従って決定することができる。
非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるｈＧＨポリペプチドのようなポリペプチドの薬物動態パラメータは、通常のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ雄ラット（処理群あたりＮ＝５）において評価できる。例えば、実験動物は、静脈内投与２５μｇ／ラット、または皮下投与５０μｇ／ラット大単位容量の投与を受ける。そして、あらかじめ決められた経時変化に従って、約５〜７血液試料が採取される。前記経時変化は、一般的に水溶性ポリマーに接合していない非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるＧＨ（例えば、ｈＧＨ）ポリペプチドについて約６時間、および水溶性ポリマーに接合した非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるＧＨ（例えば、ｈＧＨ）ポリペプチドについて４日間に渡る。ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）ポリペプチドの薬物動態学的データは、数々の種において研究されており、非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるＧＨ（例えば、ｈＧＨ）ポリペプチドで得られたデータと直接比較できる。ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）に関連した研究である「Mordenti JらPharm. Res. 8(11): 1351- 59 (1991) 」を参照のこと。
薬物動態パラメータは、霊長類（例えば、カニクイザル）でも評価できる。通常は、単回投与は、皮下投与または静脈内投与され、血中ポリペプチド濃度は長期に観察される。
本発明のポリペプチドの特定の活性は、公知の様々な分析方法で決定できる。本発明に従って得られ、精製されたポリペプチドのムテインまたはその断片の生物学的活性は、本明細書に記載もしくは参照した方法、または当業者に公知の方法により検査できる。
＜ＸＩＶ．投与および薬学的組成物＞
本発明のポリペプチドまたはタンパク質（特に限定されないが、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）、シンテターゼ、１つ以上の非天然アミノ酸を含んでいるタンパク質などを包含する）は、任意に治療的使用（特に限定されないが、好適な薬学的担体の組み合わせが含まれる）に用いられる。例えば、該組成物は、治療的有効量の化合物および薬学的に許容可能な担体または賦形剤を含む。該担体または賦形剤は、特に限定されないが、食塩水、緩衝食塩水、Ｄ型グルコース、水、グリセロール、エタノール、および／またはそれらの組み合わせが含まれる。製剤は、投与の様式に適するように作製される。一般的に、タンパク質の投与の方法は、当業者に公知であり、本発明のポリペプチドの投与に適応できる。
いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも１つの水溶性ポリマーに対して共有結合により連結したポリペプチドを含む薬学的組成物を提供する。ここで、共有結合はオキシム結合であり；および、薬学的に許容可能な賦形剤を含む。前記ポリペプチドは、ｈＧＨでもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、カルボニルを含む非天然にコードされたアミノ酸のような非天然にコードされたアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸は、ケトンを含むアミノ酸（例えば、パラアセチルフェニルアラニン）である。いくつかの実施形態では、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、非天然にコードされたアミノ酸（例えば、米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２のアミノ酸３５に対応するＧＨ（例えば、ｈＧＨ）の位置において置換されたパラアセチルフェニルアラニン）を含む。水溶性ポリマーはＰＥＧであってよい。好適なＰＥＧは、直鎖状および分枝状ＰＥＧを含む；本明細書に記載された全てのＰＥＧが使用されてよい。特定の実施形態では、ＰＥＧは約０．１〜１００ｋＤａ、約１〜１００ｋＤａ、約１０〜５０ｋＤａ、または約２０〜４０ｋＤａ、もしくは約３０ｋＤａの直鎖ＰＥＧである。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、オキシム結合により３０ｋＤａＰＥＧに連結したＧＨ（例えば、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）を含む。ここで、オキシム結合は、米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２のアミノ酸３５に対応するＧＨ中の位置に局在するパラアセチルフェニルアラニン、およびＰＥＧの間に存在する。
本発明の１つ以上のポリペプチドを含んでいる治療的組成物は、当該分野における当業者に周知の方法に従って、有効性、および組織代謝の確認、ならびに用量の評価のために、適切なインビトロおよび／またはインビボの疾患動物モデルにおいて、任意に試験される。特に用量は、天然アミノ酸相同物に対する非天然アミノ酸相同物の活性、安定性、または他の好適な指標（以下に限定されないが、天然アミノ酸ポリペプチドに対する１つ以上の非天然アミノ酸を含む修飾型ポリペプチドの比較を含む）、すなわち関連性分析によって最初に決定されてもよい。
投与は、血液または組織細胞に最終的に接触する分子の導入に通常使用されるあらゆる経路で行われる。本発明の非天然アミノ酸ポリペプチドは、必要に応じて１つ以上の薬学的に許容可能な担体と一緒に、あらゆる好適な方法で投与される。本発明に記載されているような、該ポリペプチドの患者に対する投与の好適な方法が利用可能であり、且つ２つ以上の経路が特定の組成物の投与に使用されてもよいが、特定の経路は、多くの場合において他の経路より即効性、且つ効果的な作用または反応を提供し得る。
薬学的に許容可能な担体は、投与される特定の組成物だけでなく、当該組成物の投与に使用される特定の方法によって部分的に決定される。従って、本明細書に記載されている薬学的組成物について多種類の好適な製剤がある。
本発明のポリペプチドは、特に限定されないが、ＰＥＧ化ｈＧＨを含み、タンパク質またはペプチドにとって好適な任意の従来の経路（例えば、特に限定されないが、非経口的（例えば、以下に限定されないが、皮下もしくは静脈内、または注入もしくは点滴の他のあらゆる形態を含む注入）を含む）によって投与されてよい。ポリペプチドの薬学的組成物は、以下に限定されないが、経口的な、静脈内の、腹腔内の、筋肉内の、経皮的な、皮下的な、局所的な、舌下の、または直腸を含む多くの経路によって投与され得る。修飾型または非修飾型の非天然アミノ酸を含む組成物は、リポソームを介して投与されてもよい。そのような投与経路および適切な製剤は、一般的に当業者に公知である。非天然にコードされたアミノ酸を含むポリペプチドは、特に限定されないが、ＰＥＧ化ｈＧＨを含み、単独または薬学的な担体といった他の好適な成分と組み合わせて使用されてもよい。
単独の、または他の好適な成分と組み合わせの、非天然アミノ酸を含むポリペプチドは、吸入を介して投与される噴霧製剤（すなわち、それらは「噴霧化」可能である）に作製されてもよい。噴霧製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、および窒素といった加圧された受容可能な噴霧剤に入れることができる。
例えば、関節内（関節）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、および皮下といった非経口的な投与に好適な製剤は、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、および意図される受容者の血液に等張性の製剤を提供する溶質を含み得る、水性および非水性の無菌等張性注入溶液、ならびに可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および防腐剤を含み得る水性および非水性の無菌懸濁液を含む。ポリペプチドの製剤は、アンプルおよびバイアルといった、単位用量または多用量の密封された容器に存在していてもよい。
非経口投与および静脈投与は、投与の好ましい方法である。特に、現在利用されている製剤と一緒に、天然アミノ酸相同治療物（以下に限定されないが、ＥＰＯ、ＧＨ、Ｇ−ＣＦＳ、ＧＭ−ＣＦＳ、ＩＦＮｓ、インターロイキン、抗体、および／またはあらゆる治療的に実現するタンパク質を含む）に使用されている投与経路は、本発明のポリペプチドにとって、好ましい投与経路および製剤を提供する。
本明細書に記載されている組成物および方法に即して、患者に投与される用量は、やがて患者に有益な治療的反応、または薬剤の使用に依存する他の適した活性を有するために十分な量である。当該用量は、特定のベクターまたは製剤の有効性および採用された非天然アミノ酸ポリペプチドの活性、安定性、または血中半減期および患者の状態だけでなく、処置される患者の体重または体表面積によって決定される。また、当該用量は、特定の患者における、特定のベクター、または製剤などの投与に伴って生じるあらゆる有害な副作用の存在、性質および程度によって決定される。
疾患（以下に限定されないが、がん、遺伝性疾患、糖尿病、またはＡＩＤＳなどを含む）の処置または予防において投与されるベクター、または製剤の効果的な量の決定において、医師は、循環血漿量、製剤の毒性、疾患の進行および／または関連する場合には、抗非天然アミノ酸ポリペプチド抗体の産生を調べる。
例えば、７０キログラムの体重の患者に投与される用量は、通常、現在使用されている治療タンパク質の用量と等しい範囲において、該当する組成物の変化した活性または血清半減期に関して調製される。本明細書に記載されているベクター、または薬学的組成物は、抗体投与、ワクチン投与、細胞毒性薬、天然アミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチド類似体、生体反応修飾因子の投与などを含む、あらゆる周知の従来の治療によって、処置条件を補うことができる。
投与に関して、本明細書に記載されている薬学的組成物は、該当する製剤のＬＤ−５０もしくはＥＤ−５０、および／または非天然アミノ酸ポリペプチドのあらゆる副作用の観察によって決定される割合において、以下に限定されないが、患者の大部分および全般的な健康に適合されることを含むような、種々の濃度で投与される。投与は、単一用量または分割用量によって達成されてもよい。
製剤の注入を受けた患者が発熱、悪寒または筋肉痛を生じるのであれば、彼／彼女は、好適な濃度のアスピリン、イブプロフェン、アセトアミノフェンまたは他の痛み／熱制御薬を投与される。注入に対して、発熱、筋肉痛および悪寒といった反応を経験する患者は、後の注入の３０分前に、アスピリン、アセトアミノフェン、または以下に限定されないが、ジフェンヒドラミンを含む、いずれかを用いて前投与（future infusion）される。メペリジンは、解熱剤および抗ヒスタミン剤にすぐに反応しない、より深刻な悪寒および筋肉痛に使用される。細胞注入は、反応の深刻さに依存して遅らせられるか、または中断される。
本明細書のポリペプチドは、哺乳類の対象に対して直接に投与されてもよい。投与は、対象に対するポリペプチドの導入に通常に使用されるあらゆる経路による。本発明の実施形態によるポリペプチド組成は、経口投与、直腸投与、局所投与、吸入投与（以下に限定されないが、噴霧剤を介する投与を含む）、口腔投与（以下に限定されないが、舌下投与を含む）、膣投与、非経口投与（以下に限定されないが、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、関節内投与、胸膜内投与、腹腔内投与、大脳内投与、動脈内投与、または静脈内投与を含む）、局所投与（すなわち、肌の表面および気道の表面を含む粘膜の表面の両方）、ならびに経皮投与に好適なものを含むが、あらゆる任意の場合において最も好適な経路は、処置される条件の性質および深刻さに依存する。投与は、局所または全身のいずれかであってもよい。製剤は、アンプルまたはバイアルといった単一用量または多用量を密閉した容器に存在していてもよい。本発明のポリペプチドは、薬学的に許容可能な担体を有する単一用量の注入可能な形態（以下に限定されないが、溶液、懸濁液、または乳剤を含む）における混合物に調製されてもよい。また、本発明のポリペプチドは、連続的な注入（以下に限定されないが、浸透圧ポンプのようなミニポンプを用いて）、単一の急速投与、持続的放出するデポー製剤（depot formulation）によって投与されてもよい。
投与に好適な製剤は、水性溶液および非水性溶液、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤および溶質を含有する等張性の無菌溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および防腐剤を含有する、水性無菌懸濁液および非水性無菌懸濁液を含む。溶液および懸濁液は、上述した種類の無菌の粉剤、顆粒剤および錠剤から調製されてもよい。
フリーズドライ（freeze-drying）は、標的タンパク質調製物からの水の除去に役立つ、標的タンパク質を提供するために通常に採用される技術である。フリーズドライ、または凍結乾燥は、乾燥される材料がまず凍結され、且つそれから氷または凍結溶質が減圧環境において除去される工程である。賦形剤が、フリーズドライ工程の間に安定性を増強するために、および／または保存に関する凍結乾燥産物の安定性を向上するために前凍結乾燥された製剤に含まれてもよい。「Pikal, M. Biopharm. 3(9)26-30 (1990)」および「Arakawaら Pharm. Res. 8(3):285-291 (1991)」。
また、調合薬の噴霧乾燥は、当該分野における通常の当業者に周知である。例えば、「Broadhead, J.ら“The Spray Drying of Pharmaceuticals,” in Drug Dev. Ind. Pharm, 18 (11 & 12), 1169-1206 (1992) 」を参照すればよい。小分子調合薬に加えて、多様な生物学的材料が噴霧乾燥され、且つこれらは、酵素、血清、血漿、微生物、および酵母を含む。噴霧乾燥は、１段階過程で、液体の薬学的調製物を純度の高い、ほこりのない、または凝集された粉体に転換することができるため有用な技術である。基本的な技術は、以下の４つの段階を包含する：（ａ）供給溶液を噴霧に霧化する；（ｂ）噴霧に空気を接触させる；（ｃ）噴霧を乾燥させる；および（ｄ）乾燥気体から乾燥された産物を分離する。米国特許第６，２３５，７１０号明細書および米国特許第６，００１，８００号明細書は、噴霧乾燥による組み換えエリスロポエチンの調製について記載しており、これらは参照のために本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載されている薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤を備えていてもよい。薬学的に許容可能な担体は、投与される特定の組成物と同様に、組成物を投与するために使用される特定の方法によって、部分的に決定される。従って、本明細書に記載されている薬学的組成物（任意の薬学的に許容可能な担体、賦形剤または安定剤を含む）の好適な製剤は多様である（例えば、「Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed.1985」を参照のこと）。
好適な担体は、特に限定されないが、コハク酸塩、リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳ、クエン酸塩、イミダゾール、酢酸塩、ジカルボン酸塩、および他の有機酸を含有する緩衝液；酸化防止剤（特に限定されないが、アスコルビン酸を含む）；低分子量ポリペプチド（特に限定されないが、１０残基未満のポリペプチドを含む）；タンパク質（以下に限定されないが、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンを含む）；親水性ポリマー（特に限定されないが、ポリビニルピロリドンを含む）；アミノ酸（特に限定されないが、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、ヒスチジンもしくはヒスチジン誘導体、メチオニン、グルタミン、またはリジンを含む）；単糖、２糖、または他の炭水化物（特に限定されないが、トレハロース、スクロース、グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（特に限定されないが、ＥＤＴＡおよびエデト酸ナトリウムを含む）；２価の金属イオン（特に限定されないが、亜鉛、コバルト、または銅を含む）；糖アルコール（特に限定されないが、マンニトールまたはソルビトールを含む）；塩形成対イオン（特に限定されないが、ナトリウムを含む）；および／または、非イオン性の界面活性剤（特に限定されないが、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）（特に限定されないが、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリソルベート ８０）およびＴｗｅｅｎ２０（ポリソルベート ２０））、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）、ならびに他のプルロン酸（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄｓ）（特に限定されないが、プルロン酸 Ｆ６８（ポリキサマー １８８）またはＰＥＧを含む）を含む。好適な界面活性剤は、例えば、以下に限定されないが、ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）（すなわち、ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯ）、もしくはポリ（プロピレンオキシド）−ポリ（エチレンオキシド）−ポリ（プロピレンオキシド）（すなわち、ＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯ）、またはこれらの組み合わせに基づくポリエーテルを含む。ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯおよびＰＰＯ−ＰＥＯ−ＰＰＯは、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）、Ｒ−Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）、Ｔｅｔｒｏｎｉｃｓ（登録商標）およびＲ−Ｔｅｔｒｏｎｉｃｓ（登録商標）という商標名において市販されており（BASF Wyandotte Corp., Wyandotte, Mich.）、且つ参照のために本明細書に組み入れられる米国特許第４，８２０，３５２号明細書にさらに記載されている。他のエチレン／ポリプロピレンブロックポリマーは、好適な界面活性剤であり得る。界面活性剤または界面活性剤の組み合わせは、１つ以上の負荷（特に限定されないが、攪拌の結果生じる負荷を含む）に対して、ポリペプチドを安定化するために使用してもよい。上述のいくつかは、「充填剤」と呼ばれてもよい。また、いくつかは、「張性修飾剤」と呼ばれてもよい。抗菌性保存剤は、生成物の安定性および抗菌的な有効性にも適用されてよい；好適な保存剤は、特に限定されないが、ベンジルアルコール、ベンズアルコニウム塩化物、メタクレゾール、メチル／プロピルパラベン、クレゾール、およびフェノール、またはそれらの組み合わせを含む。
ＰＥＧのような水溶性ポリマーに連結したものを含む本発明のポリペプチドは、持続放出系の一部によって、または持続放出系の一部として投与されてもよい。持続放出組成物は、以下に限定されないが、成型品の形状（以下に限定されないが、薄膜または微小カプセルを含む）における半透過性のポリマー基質を含む。持続放出基質は、ポリ（２−ヒドロキシエチル メタクリレート）（「Langerら, J. Biomed. Mater. Res., 15: 267-277 (1981)」;「Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)」)、エチレンビニル酢酸塩(上述の「Langerら」）、またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシブチル酸（欧州特許出願公開第１３３，９８８号明細書）、ポリラクタイド（ポリ乳酸）（米国特許第３，７７３，９１９号明細書；欧州特許出願公開第５８，４８１号明細書）、ポリグリコリド（グリコール酸の重合体）、ポリラクタイドコグリコリド（酪酸およびグリコール酸の共重合体）ポリ無水物、Ｌ−グルタミン酸およびガンマ−エチル−Ｌ−グルタミン酸塩（「Sidmanら, Biopolymers, 22, 547-556 (1983)」）、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸塩、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンといったアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン、ならびにシリコンのような生物学的適合性材料を含む。また、持続放出組成物は、リポソームに閉じ込められた組成物であってもよい。当該組成物を含有するリポソームは、独国特許出願公開第３，２１８，１２１号明細書；「Eppsteinら, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985)」；「Hwangら, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 77: 4030-4034 (1980)」；欧州特許出願公開第５２，３２２号明細書；欧州特許出願公開第３６，６７６号明細書；米国特許出願第４，６１９，７９４号明細書；欧州特許出願公開第１４３，９４９号明細書；米国特許出願第５，０２１，２３４号明細書；日本国特許出願公開第８３−１１８００８号明細書；米国特許第４，４８５，０４５号明細書；米国特許第４，５４４，５４５号明細書；および欧州特許出願第１０２，３２４号明細書によって周知の方法によって調製される。上述したすべての参考文献および特許文献は、参照によって本明細書に組み込まれる。
リポソームに閉じ込められたポリペプチドは、例えば、独国特許出願公開第３，２１８，１２１号明細書；「Eppsteinら, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 82: 3688-3692 (1985)」;「Hwangら, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 77: 4030-4034 (1980)」；欧州特許出願公開第５２，３２２号明細書；欧州特許出願公開第３６，６７６号明細書；米国特許出願第４，６１９，７９４号明細書；欧州特許出願公開第１４３，９４９号明細書；米国特許第５，０２１，２３４号明細書；日本国特許出願公開第８３−１１８００８号明細書；米国特許第４，４８５，０４５号明細書；米国特許第４，５４４，５４５号明細書；および欧州特許出願公開第１０２，３２４号明細書に記載されている方法によって調製されてもよい。リポソームの組成および大きさは、当該分野の通常の当業者によって経験的に容易に決定され得ることは、周知である。例えば、「Park JW,ら, Proc. Natl. Acad. ScL USA 92:1327-1331 (1995)」;「Lasic D および Papahadjopoulos D (eds): MEDICAL APPLICATIONS OF LIPOSOMES (1998)」;「Drummond DC,ら, Liposomal drug delivery systems for cancer therapy, in Teicher B (ed): CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT (2002)」;「Park JW,ら, Clin. Cancer Res. 8:1172-1181 (2002)」;「Nielsen UB,ら, Biochim. Biophys. Acta 1591(1-3): 109-118 (2002)」;および「Mamot C,ら, Cancer Res. 63: 3154-3161 (2003)」にリポソームのいくつかの例が記載されている。上述したすべての参考文献および特許文献は、参照のために本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載されている組成物、製剤および方法に従って、患者に投与される用量は、ゆっくり時間をかけて対象に有益な反応を生じさせるために十分な量であるべきである。一般的に、用量ごとに非経口的に投与される本発明のポリペプチドの薬学的有効量は、患者の体重に対して、約０．０１μｇ／ｋｇ／日〜約１００μｇ／ｋｇ、または約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇの範囲であるが、これは治療上の裁量に依存する。また、用量の頻度は、治療上の裁量に依存し、ヒトへの使用を認められた市販の産物よりも高い頻度、または低い頻度であってもよい。一般的に、本発明のポリペプチドは、上記の全ての投与経路により投与することができる。いくつかの実施形態では、本発明は、任意のポリペプチドを含む組成、保存のために十分に安定である本明細書に記載の薬学的組成物、および本明細書に記載した投薬計画を提供する。安定性を検査する方法は技術的に公知である。
＜ＸＶ．本発明のＧＨ（例えば、ｈＧＨ）ポリペプチドの治療的使用＞
本発明のＧＨ（例えば、ｈＧＨ）ポリペプチドは、広範囲の疾患の治療に有用である。
本発明のＧＨ（例えば、ｈＧＨ）アゴニストポリペプチドは、例えば、発育不全の治療、免疫障害、および心臓機能の興奮にとって有用である。発育不全の個人（例えば、ターナー症候群、ＧＨ欠損した患者（子供を含む）、彼らの成長板終了前約２〜３年の通常の成長曲線において、発育遅延（ｓｌｏｗｉｎｇ）または精神遅滞（ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ）を経験した子供（「低身長児」（short normal children）として知られている）、およびＧＨへのインスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ）の反応を化学的に阻害させた（すなわち、グルココルチコイド処理により）、または自然条件により減少した個人（例えば、ＧＨへのＩＧＦ−Ｉ反応が天然に減少した成人患者のような）を含む。本発明のｈＧＨポリペプチドは、以下の条件で患者に使用されてよい：特異的成長ホルモン欠乏、特異的小人症、幼児期発症の成人成長ホルモン欠乏、成人発症の成人成長ホルモン欠乏、または第２成長ホルモン欠乏。成人期に成長ホルモン欠乏と診断された成人は、下垂体部腫瘍または放射線治療の経験を有しているかもしれない。病気は、特に限定されないが、代謝症候群、熱傷、肥満症、骨粗しょう症、またはうつ病を含み、成人において成長ホルモン欠乏症様の症状をもたらすかもしれない。
ＧＨのアゴニスト（例えば、ｈＧＨ）のバリアントは、その免疫機能の向上により哺乳類の免疫系を刺激するために作用してよい。前記免疫機能の向上は、抗体を介したものであろうと細胞を介したものであろうと、免疫系が、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）ポリペプチドで処理された宿主に内在性であろうと、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）ポリペプチドを供与者から宿主移植者へ移植されたもの（骨髄移植のように）であろうと、哺乳類の免疫系を刺激するために作用してよい。「免疫障害」は、通常よりも抗原への抗体または細胞の反応が減少した個人の免疫系における全ての病気を含む。前記個人は、薬剤治療（例えば、化学的療法）のために免疫性の低下した小さな脾臓（small spleens）を有する個人を含む。免疫疾患を有する個人の例は、例えば、高齢の患者、化学治療または放射線治療を受けた個人、重病から回復した患者もしくは手術を行おうとしている個人、ＡＩＤＳに感染した個人、先天的および後天的低ガンマグロブリンのようなＢ細胞欠乏の患者、共通の多様な無ガンマグロブリンおよび選択的免疫グロブリン欠乏（例えば、ＩｇＡ欠乏、患者の免疫反応より短い培養時間を有する狂犬病ウイルスのようなウイルスに感染した患者）；およびダイジョージ症候群（diGeorge syndrome）のような遺伝性の疾患を有する個人）を含む。
本発明のＧＨ（例えば、ｈＧＨ）アンタゴニストポリペプチドは、巨人症および末端肥大症、糖尿病および糖尿病との合併症（糖尿病性網膜症、糖尿病性神経障害）、眼血管疾患（vascular eye diseases）（例えば、新血管形成を含む）、腎症、ならびにＧＨ応答性悪性腫瘍の治療に有用であってよい。
眼血管疾患は、例えば、網膜症（例えば、成熟前または鎌状赤血球貧血による）および黄斑変性を含む。
ＧＨ応答性悪性腫瘍は、例えば、ウィルム腫瘍（Wilm’s tumor）、肉腫（例えば、骨原性肉腫）、胸、結腸、前立腺、ならびに甲状腺癌およびＧＨ受容体ｍＲＮＡを発現している組織の癌（すなわち、胎盤、胸腺、脳、唾液腺、前立腺、骨髄、骨格筋、気管、脊髄、網膜、リンパ節、およびバーキットリンパ腫（Burkitt’s lymphoma）、結腸直腸癌、肺癌、リンパ芽球性白血病、および黒色種）を含む。
本発明のＧＨ（例えば、ｈＧＨ）アゴニストポリペプチドは、例えば、慢性腎不全、慢性腎機能不全（ＣＲＩ）に関連する成長障害、ターナー症候群に関連する小人症、小児プラダ−ウィリ症候群（Prader-Willi Syndrome）（ＰＷＳ）、消耗性（ｗａｓｔｉｎｇ）または悪液質（ｃａｃｈｅｘｉａ）のＨＩＶ患者、妊娠週令の短い出生児（ＳＧＡ）、肥満症、および骨粗しょう症の治療に有用であり得る。
ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）の平均数量は、多様でよく、特に有資格医師の推薦および処方に基づくべきである。ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）の正確な量は、治療する病気の正確な型、治療する患者の状態、のみならず組成物中の他の含有物のような要因に依存する好みの問題である。本発明は、別の活性試薬の治療的に有効な量の投与も提供する。与えられた量は、ｈＧＨによる治療に基づいて当業者により容易に決定されてよい。
本発明の薬学的組成物は、標準の方法で製造されてよい。
本発明のいくつかの実施形態では、患者への投与において治療に必要な、水溶性ポリマーの少なくとも１つに対して共有結合により連結した成長ホルモン（ＧＨ）を含むホルモン組成の有効量を含む治療方法を提供する。ここで、共有結合はオキシム結合である。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、個人（例えば、ヒト）へのＧＨ（例えば、ｈＧＨ）の投与を含む。いくつかの実施形態では、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、カルボニルを含有する非天然にコードされたアミノ酸のような非天然にコードされたアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、非天然にコードされたアミノ酸は、ケトン（例えば、パラアセチルフェニルアラニン）を含むアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、非天然にコードされたアミノ酸（例えば、パラアセチルフェニルアラニン）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２のアミノ酸３５に対応するＧＨ（例えば、ｈＧＨ）の位置において置換された非天然にコードされたアミノ酸（例えば、パラアセチルフェニルアラニン）を含む。水溶性ポリマーはＰＥＧであってよい。好適なＰＥＧは、直鎖状ＰＥＧおよび分枝状ＰＥＧを含む；本明細書に記載された全てのＰＥＧが使用されてよい。特定の実施形態では、ＰＥＧは約０．１〜１００ｋＤａの直鎖ＰＥＧ、約１〜１００ｋＤａ、約１０〜５０ｋＤａ、約２０〜４０ｋＤａ、または約３０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、オキシム結合により３０ｋＤａＰＥＧに連結したＧＨ（（例えば、ＧＨ）例えば、ｈＧＨ）を含み、ここで、オキシム結合は、米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２のアミノ酸３５に対応する位置のパラアセチルフェニルアラニンの間に局在する。いくつかの実施形態では、個人は、小児成長ホルモン欠乏、特有の小人症、成人において幼児発症の成長ホルモン欠乏、成人において成人発症の成長ホルモン欠乏、または二次成長ホルモン欠乏による病気を治療される。
ＧＨ（例えば、ｈＧＨ）は、本明細書の記載および公知の技術のように、任意の好適な形状、投与法、濃度、頻度、および持続時間で個人に投与できる。いくつかの実施形態では、本発明は治療方法を提供する。少なくとも１つの水溶性ポリマーに共有結合で連結している成長ホルモン（ＧＨ）を含むホルモン組成物の有効量での治療を必要としている個人への投与を含む。ここで、水溶性ポリマーは直鎖ポリマーであり、ここで、ホルモンの組成物は約１日置きに１回、３、４、５、もしくは６日置きに１回、１週間に１回、８、９、１０、１１、１２、もしくは１３日に１回、２週間に１回、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０日に１回、３週間に１回、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０日に１回、１月に１回、または１月に約１回よりも少ない頻度で与えられる。投与の頻度は、個人の裁量で変更されてよく、または通常、専門家によれば、任意の頻度の組み合わせが用いられてよい。いくつかの実施形態では、ＧＨ組成物は、わずか約１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、１月に１回投与される。いくつかの実施形態では、ＧＨ組成物は、わずか１週間に１回、２週間に１回、または１月に１回投与される。いくつかの実施形態では、ＧＨ組成物は、わずか１週間に１回投与される。いくつかの実施形態では、ＧＨ組成物は、わずか約２週間に１回投与される。いくつかの実施形態では、ＧＨ組成物は、わずか約１月に１回投与される。
本発明は、本発明のｈＧＨと一緒に治療的有効量の他の活性試薬を投与することを提供する。与えられる量は、ｈＧＨによる治療に基づいて当業者により容易に決定されてよい。
〔実施例〕
以下の実施例は、具体例を提供するが、本発明を限定するものではない。
＜実施例１＞
ｈＧＨを発現しているトランスジェニックマウスは、非天然アミノ酸置換を有するメチオニルｈＧＨポリペプチド、および非天然アミノ酸が置換されている位置においてＰＥＧ化されたメチオニルｈＧＨポリペプチドの免疫原性を調べるために用いられた。「Sweetser, D. A.らin PNAS 1988; 85:9611-9615 」および「in Genes & Development 1988; 2:1318-1332」には、ｈＧＨ遺伝子を有する脂肪酸結合タンパク質の融合タンパク質構築物を介してｈＧＨを発現するトランスジェニックマウスについて記載されている。２匹のｈＧＨトランスジェニックマウスのヘテロ接合体のつがいをJackson Laboratoryから購入した。ｈＧＨ導入遺伝子の多様な領域を増幅するプライマーセットＡ、Ｃ、およびＦをｈＧＨ導入遺伝子の存在の確認のために用いた。２つ以上のプライマーセットが所望のＰＣＲ産物を生じた場合に、マウスはｈＧＨ導入遺伝子に陽性であると判断した。図１は、３つのプライマーと共に脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）−ｈＧＨ融合導入遺伝子の略図を示す。血漿ｈＧＨ濃度は、Diagnostic Systems Laboratories(Webster,Texas)から市販されているＥＬＩＳＡキットを用いて、製造業者の使用説明書に従って測定した。ＰＣＲによりｈＧＨ導入遺伝子に陽性とされ、ＥＬＩＳＡにより血漿ｈＧＨ濃度の上昇を示した第１世代の子マウス（Ｆ１）を、ｈＧＨトランスジェニックと見なした。トランスジェニックマウス（Ｆ１）を、実験に十分に使用できる動物を得るために、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスで戻し交配した。本研究では、ｈＧＨを発現する寛容動物（tolerant animal）との比較にＰＣＲおよびＥＬＩＳＡによりｈＧＨに陰性であった同腹子をナイーブ動物として用いた。
ｈＧＨの寛容マウスおよびナイーブマウスの免疫反応を、メチノイルｈＧＨ（（ｍｅｔ）−ｈＧＨ）；位置３５で置換された非天然アミノ酸（ｐ−アセチルフェニルアラニン）を有するメチノイルｈＧＨ（（ｍｅｔ）−ａｈＧＨ；（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨ）；非天然アミノ酸でＰＥＧ化され、位置３５で置換された非天然アミノ酸（ｐ−アセチルフェニルアラニン）を有するメチノイルｈＧＨ（（ｍｅｔ）−ａｈＧＨ−ＰＥＧ；ＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨ；ＰＥＧ−ａｈＧＨ）、または偽薬について評価した。ｈＧＨのトランスジェニックマウスおよびナイーブマウスへの薬剤投与計画は、表２（アジュバントを用いない投与計画）および表３（不完全フロインドアジュバントを用いる投与計画）に示した。
Figure 2009523815
 血漿試料を０日目（採血前のバックグラウンド）および５６日目（最後の注入の１３日後）に採取した。ＥＬＩＳＡを０日目および５６日目の両方の試料に対して抗ｈＧＨ抗体の存在および血漿ｈＧＨ濃度）を検出するために行った（Diagnostic System Laboratories(Webster, Tezas)）。
Figure 2009523815
 血漿試料を０日目（採血前）および５５日目（最後の注入から１１日後）に採取した。ＥＬＩＳＡを０日目および５５日目の両方の試料に対して抗ｈＧＨ抗体の存在および血漿ｈＧＨ濃度を検出するために行った（Diagnostic System Laboratories(Webster, Tezas)）。
抗ｈＧＨ抗体を検出するために、ＥＬＩＳＡプレートは（ｍｅｔ）−ｈＧＨ、（ｍｅｔ）−ａｈＧＨ（（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨ）、または（ｍｅｔ）−ａｈＧＨ−ＰＥＧ（ＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨ）のいずれかで４時間室温でコートした。続いて、プレートをＰＢＳ＋５％ＢＳＡ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を用いて４℃で一晩ブロックする前にＰＢＳで一度洗浄した。一晩培養後、血漿試料を様々な濃度の希釈液に加える前にプレートを２度洗浄した。血漿試料を添加した後、プレートは室温で１時間静置し、続いて４回洗浄した。ＨＲＰが接合したｇｏａｔ抗マウスＩｇＧを添加し、プレートを２時間室温で培養した。前記プレートを４回洗浄した。続いてＴＭＢ基質を添加し、プレートを室温で１５〜２０分間培養した。１Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加し、反応を止め、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（ｈＧＨトランスジェニックマウスの特性）
全６３匹のマウスについて、ＰＣＲによりｈＧＨ導入遺伝子の存在およびｈＧＨに特異的なＥＬＩＳＡにより血漿ｈＧＨ濃度を調べた。６３匹中３０匹のマウスは、ＰＣＲおよびｈＧＨのＥＬＩＳＡの両方により、非トランスジェニックマウスであると確認された。従って、本実験ではこれらのマウスをｈＧＨナイーブ動物とした。３３匹のマウスがＰＣＲによりｈＧＨ陽性とされた。しかし、ｈＧＨの遺伝子導入に陽性である３３匹の動物中の２匹は、血漿中に検出可能なｈＧＨ濃度を示さず、本実験から除外した。ｈＧＨの遺伝子導入に陽性で、血漿ｈＧＨ濃度が上昇した３１匹のマウスは、本実験においてｈＧＨ寛容動物とした。
（ｈＧＨナイーブマウスおよびトランスジェニックマウスの抗体反応性）
ｈＧＨナイーブ（ｎｏｎ−ｔｇ）および（ｍｅｔ）−ｈＧＨで免疫されたトランスジェニックマウスの抗体反応を図２〜４に示す。（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨで免疫されたｈＧＨナイーブマウスおよびトランスジェニックマウスの抗体反応を図５〜７に示す。ＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨで免疫されたｈＧＨナイーブマウスおよびトランスジェニックマウスの抗体反応を図８〜１０に示す。不完全フロインドアジュバント中の（ｍｅｔ）−ｈＧＨで免疫されたｈＧＨナイーブマウスおよびトランスジェニックマウスの抗体反応を図１１〜１３に示す。不完全フロインドアジュバント中の（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨで免疫されたｈＧＨナイーブマウスおよびトランスジェニックマウスのｈＧＨ抗体反応を図１４〜１６に示す。不完全フロインドアジュバント中のＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨで免疫されたｈＧＨナイーブマウスおよびトランスジェニックマウスのｈＧＨ抗体反応を図１７〜１９に示す。ＥＬＩＳＡプレートは、（ｍｅｔ）−ｈＧＨ、（ｍｅｔ）−ａｈＧＨ（（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨ）、または（ｍｅｔ）−ａｈＧＨ−ＰＥＧ（ＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨ）でコートした。図２および図８の比較において、ＰＥＧ化ｈＧＨは、ｈＧＨを発現しているトランスジェニックマウスにおいて、免疫原性ではないことを示す。また、図１１および図１７の比較では、ＰＥＧ化ｈＧＨは、ＰＥＧ化ｈＧＨは不完全フロインドアジュバントと共に製剤された場合、ｈＧＨを発現するトランスジェニックマウスにおいて、免疫原性ではないことを示している。
実験の開始時および終了時の血漿ｈＧＨ濃度は、表４（アジュバントなし）および表５（不完全フロインドアジュバントあり）に示される。
Figure 2009523815
Figure 2009523815
 図２０は、免疫原性のデータ（抗体力価）の概要を示す図である。表６および７は、アジュバントを用いずに、動物に免疫したときの抗体力価の概略を示している。
Figure 2009523815
 表８および表９に、フロイント不完全アジュバントで免疫した動物の抗体力価をまとめる。アジュバントの存在下における免疫反応は、アジュバントの非存在下において導かれた反応よりも強固である。寛容マウスにおいて、（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより導かれる低い抗体力価は、ＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨで免疫された寛容マウスでは観察されなかった。このことは、ＰＥＧ化はｈＧＨ寛容マウスにおけるアジュバントが誘導する反応を消去することを示す。寛容マウスは、アジュバントを使用しない実験において、ＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨに対する検出可能な抗体反応を全く生じなかった。寛容マウスは、アジュバントを用いた実験において、ＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨに対する検出可能な抗体反応を生じなかった。
Figure 2009523815
＜実施例２＞
図２２のＢに示したように、ウサギへの免疫原性接合型が存在する場合、パラアセチルフェニルアラニンは免疫原性ではなかった。その上、ｐ−アセチルフェニルアラニンは、ウサギ抗体の産生物に含まれる天然アミノ酸と同様に免疫原性を示さない。Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）、およびＤＮＰの脱アミノ化誘導体を、ＥＤＣ結合法により、ウサギを原産とする担体タンパク質、およびウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）に接合させた。アミノ基はジペプチド、およびトリペプチド構造の発生を防ぐために除去した。そして、アミノ酸はＲＳＡ上のリシン側鎖に連結させた。
３種のウサギ／群を、５０μｇ／動物のフロイント不完全アジュバント接合体で免疫した。前記の動物にアジュバントを２度投与し、免疫付与前８週で血清を採取した。血清を対応するＫＬＨ−接合アミノ酸に対してＥＬＩＳＡを用いて試験した。ＤＮＰの結果は、図２２のＡに示す；Ｐｈｅの結果は、図２２のＣに示す；およびＴｙｒの結果は、図２２のＤに示す。ＲＳＡ、ＲＳＡ−Ｐｈｅ、ＲＳＡ−Ｔｙｒ、ＲＳＡ−ｐ−アセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）、およびＲＳＡ−ＤＮＰのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を図２１に示す。ＲＳＡについては、分子量は６６．２ｋＤａであり、ａａ／ＲＳＡは０であった。ＲＳＡ−Ｐｈｅについては、分子量は６８．４ｋＤａであり、ａａ／ＲＳＡは１５であった。ＲＳＡ−Ｔｙｒについては、分子量は６８．３ｋＤａであり、ａａ／ＲＳＡは１３であった。ＲＳＡ−ｐＡＦについては、分子量は６９．６ｋＤａであり、ａａ／ＲＳＡは１８であった。ＲＳＡ−ＤＮＰについては、分子量は６８．３ｋＤａであり、ａａ／ＲＳＡは８であった。
＜実施例３＞
この実施例では、ｈＧＨに非天然にコードされたアミノ酸を組み込む好ましい位置の選択基準の多くの潜在的例の１つを記載する。
この実施例では、非天然にコードされたアミノ酸の導入のためにｈＧＨポリペプチド内の好ましい部位をどのように選択するかについて示す。受容体の細胞外ドメインの２つの分子を有するｈＧＨ複合体（ｈＧＨｂｐ）からできている結晶構造３ＨＨＲは、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸を導入できる好ましい部位の決定に用いられていた。他のｈＧＨ構造（例えば、１ＡＸＩ）は、結晶構造データベース間の第１構造要素および第２構造要素の潜在的多様性を調べるために利用されてきた。これらの構造の組み合わせは、タンパク質データバンク（Protein Data Bank(PDB)）（「BernsteinらJ. MoI. Biol. 1997, 112, pp 535」）、または「The Research Collaborator for Structural Bioinformatics PDB(the World Wide Web at rcsb.org)」から入手できる。結晶構造３ＨＨＲは、１４８〜１５３番目の残基を除外し、および結晶の秩序を乱すためにＣ末のＦ１９１残基を除外したｈＧＨの成熟した全長２２ｋＤａ配列を含む。２つのジスルフィド結合が存在し、Ｃ５３およびＣ１６５、ならびにＣ１８２およびＣ１８５に形成される。この実施例における配列番号は、米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２に示された、成熟ｈＧＨ（２２ｋＤａバリアント）のアミノ酸配列に対応している。
以下の基準は、非天然にコードされたアミノ酸の導入のためのｈＧＨのそれぞれの部位を評価するために用いた：（ａ）残基は、３ＨＨＲ、１ＡＸＩ、および１ＨＷＧ（ｈＧＨｂｐモノマーまたはダイマーと接合したするｈＧＨの結晶構造）の構造分析に基づいて、ｈＧＨｂｐの結合を妨害するべきではない、（ｂ）残基は、アラニンスキャニング突然変異誘発またはホモログスキャニング突然変異誘発により影響を受けるべきではない（「CunninghamらScience (1989) 244:1081-1085」および「CunninghamらScience (1989) 243:1330-1336」）、（ｃ）残基は、露出された表面であるべきであり、当該残基と周辺の残基とが相互作用するファンデルワールス力または水素結合が最小値を示すべきである、（ｄ）残基は、ｈＧＨバリアントにおいて、削除または変化されるべきである（例えば、Ｔｙｒ３５、Ｌｙｓ３８、Ｐｈｅ９２、Ｌｙｓ１４０）、（ｅ）残基を、非天然にコードされたアミノ酸で置換したときに、保存的変換が生じる、および（ｆ）残基は、高度に柔軟な領域（特に限定されないが、ＣＤループを含む）または構造的に硬質の領域（例えば、特に限定されないが、Ｂへリックスを含む）のどちらかに見出される。加えて、Ｃｘプログラム（「Pintarら(2002) Bioinformatics, 18, pp 980」）を利用して各タンパク質原子突出部の伸長を測定するために、ｈＧＨ分子についてさらに演算が実行される。結果として、いくつかの実施形態では、特に限定されないが、ｈＧＨの以下の位置の１つ以上において、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸が組み込まれる：位置１より前（すなわち、Ｎ末端）、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）。
いくつかの実施形態では、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸は、１つ以上の以下の位置において置換される：２９、３０、３３、３４、３５、３７、３９、４０、４９、５７、５９、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２２、１２６、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１５９、１８３、１８６、および１８７（米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）。
いくつかの実施形態では、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸は、１つ以上の以下の位置において置換される：２９、３３、３５、３７、３９、４９、５７、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０，１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１８６、および１８７（米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）。
いくつかの実施形態では、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸は、１つ以上の以下の位置において置換される：３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１０３、１１１、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４３、１４５、および１５５（米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）。
いくつかの実施形態では、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸は、１つ以上の以下の位置において置換される：３０、７４、１０３（米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）。
いくつかの実施形態では、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸は１つ以上の以下の位置において置換される：３５、９２、１４３、１４５（米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）。
いくつかの実施形態では、１つ以上のこれらの位置に配置された非天然に生じたアミノ酸は、以下の位置において水溶性ポリマーに連結する（以下の位置に限定されない）：位置１より前（すなわち、Ｎ末端）、１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５２、５５、５７、５９、６５、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１１、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２２、１２３、１２６、１２７、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１，１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５８、１５９、１６１、１６８、１７２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２（すなわち、タンパク質のカルボキシル末端）（米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）。いくつかの実施形態では、１つ以上のこれらの位置に配置された非天然に生じたアミノ酸は、以下の位置において水溶性ポリマーに連結される（以下の位置に限定されない）：２９、３０、３３、３４、３５、３７、３９、４０、４９、５７、５９、６６、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２２、１２６、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１５９、１８３、１８６、および１８７（米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）。
いくつかの実施形態では、１つ以上のこれらの位置に配置された非天然に生じるアミノ酸は、以下の位置において水溶性ポリマーに連結される（以下の位置に限定されない）：２９、３３、３５、３７、３９、４９、５７、６９、７０、７１、７４、８８、９１、９２、９４、９５、９８、９９、１０１、１０３、１０７、１０８、１１１、１２９、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４５、１４７、１５４、１５５、１５６、１８６、および１８７（米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）。
いくつかの実施形態では、１つ以上のこれらの位置に配置された非天然に生じるアミノ酸は、以下の位置において水溶性ポリマーに連結される（以下の位置に限定されない）：３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１０３、１１１、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４３、１４５、および１５５（米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）。
いくつかの実施形態では、１つ以上のこれらの位置に配置された非天然に生じるアミノ酸は、以下の位置において水溶性ポリマーに連結される（以下の位置に限定されない）：３０、７４、１０３（米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）。いくつかの実施形態では、１つ以上のこれらの位置に配置された非天然に生じたアミノ酸は、以下の位置において水溶性ポリマーに連結される（以下の位置に限定されない）：３０、３５、７４、９２、１０３、１４３、１４５（米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）。いくつかの実施形態では、１つ以上のこれらの位置に配置された非天然に生じたアミノ酸は、以下の位置において水溶性ポリマーに連結される（以下の位置に限定されない）：３５、９２、１４３、１４５（米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸）。
ｈＧＨアンタゴニストの創出のための部位は以下を含む：１、２、３、４、５、８、９、１１、１２、１５、１６、１９、２２、１０３、１０９、１１２、１１３、１１５、１１６、１１９、１２０、１２３、１２７、もしくは位置１より前またはそれらの任意の組み合わせ（米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２または配列番号１もしくは３の対応するアミノ酸、もしくは任意の他のＧＨ配列）。これらの部位は、基準（ｃ）〜（ｅ）のアゴニスト設計図を利用して選択した。アゴニスト設計図は、ｈＧＨｂｐへの結合親和性の増加のための部位１残基の部位直接的な修飾も含む。
＜実施例４＞
この実施例では、Ｅ．ｃｏｌｉで非天然にコードされたアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドのクローニングおよび発現を説明する。
ｈＧＨおよびその断片のクローニング方法は、本明細書に参照のために引用される米国特許第４，６０１，９８０号明細書；米国特許第４，６０４，３５９号明細書；米国特許第４，６３４，６７７号明細書；米国特許第４，６５８，０２１号明細書；米国特許第４，８９８，８３０号明細書；米国特許第５，４２４，１９９号明細書；および米国特許第５，７９５，７４５号明細書に詳述される。全長ｈＧＨをコードするｃＤＮＡまたはＮ末端シグナル配列を欠くｈＧＨの成熟型が、米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２１および配列番号２２にそれぞれ示されている。
直交化ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）、および直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）からなる導入翻訳系は、非天然にコードされたアミノ酸を含むｈＧＨを発現するために用いられている。Ｏ−ＲＳは、非天然にコードされたアミノ酸でＯ−ｔＲＮＡを好ましくはアミノアシル化する。同様に翻訳系は、コードされたセレクタコドンに応じて、ｈＧＨに非天然にコードされたアミノ酸を挿入する。
Figure 2009523815
 修飾型ｈＧＨ遺伝子および直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡ対（所望の非天然にコードされたアミノ酸）を含むプラスミドを用いたＥ．ｃｏｌｉの形質転換は、ｈＧＨポリペプチドへの非天然にコードされたアミノ酸の部位特異的な組み込みを可能にする。形質転換されたＥ．ｃｏｌｉは、０．０１〜１００ｍＭの間の特定の非天然にコードされたアミノ酸を含む培地中において３７℃で増殖し、極めて忠実、且つ効率的に修飾されたｈＧＨを発現する。ｈＧＨの精製および分析の方法は、当業者に公知であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット分析、またはエレクトロスプレーイオン化質量分析などにより確認される。
＜実施例５＞
この実施例は、カルボニル含有アミノ酸の導入およびその後のアミノオキシ含有ＰＥＧとの反応について説明する。
この実施例は、約５，０００の分子量のアミノオキシ含有ＰＥＧに続いて反応するケトンを含有する非天然にコードされたアミノ酸を組み込むｈＧＨポリペプチドの創出の方法を示す。実施例３（ｈＧＨ）の基準に従って同定した各残基３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１０３、１１１、１２０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３９、１４０、１４３、１４５、および１５５は、以下の構造を有する非天然にコードされたアミノ酸で単独に置換される：
Figure 2009523815
 ｈＧＨへのｐ−アセチル−フェニルアラニンの部位特異的な組み込みに利用可能な配列は、上記の実施例４に記載された米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２（ｈＧＨ）、ならびに配列番号４（ｍｕｔｔＲＮＡ，Ｍ．Ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ｍｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ）、および１６、１７、または１８（ＴｙｒＲＳ ＬＷ１、５、または６）である。
一度修飾された、カルボニルを含むアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドバリアントは、以下の構造を有するアミノオキシ含有ＰＥＧ誘導体に反応する：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
ここで、Ｒはメチルであり、ｎは３であり、Ｎは約分子量５，０００である。ｐＨ６．０の２５ｍＭ ＭＥＳ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）、ｐＨ７．０の２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）、またはｐＨ４．５の１０ｍＭ酢酸ナトリウム（Sigma Chemical, St. Louis, MO）中に１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解したｐ−アセチルフェニルアラニンを含む精製されたｈＧＨを、１０〜１００倍の過剰のアミノオキシ含有ＰＥＧに反応させた。続いて、１０〜１６時間、室温で攪拌した（Jencks, W. J. Am. Chem. Soc. 1959, 81 , pp 475）。ＰＥＧ−ｈＧＨは、直後の精製および分析のために、続いて好適な緩衝液で希釈した。
＜実施例６＞
ヒドロキシルアミン基からなるＰＥＧの接合体をアミド連結を介してＰＥＧに連結させた。
以下の構造を有するＰＥＧ試薬は、実施例５に記載した手順を用いてケトンを含有する非天然にコードされたアミノ酸に結合する：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２
ここで、Ｒ＝メチル、ｎ＝４、およびＮは分子量約２０，０００である。反応、精製、および分析条件は、実施例５に記載したように行った。
＜実施例７＞
この実施例は、ヒドラジド含有ＰＥＧへのｈＧＨポリペプチドの接合、およびそれに続くｉｎ ｓｉｔｕ還元反応について説明する。
カルボニル含有アミノ酸に組み込まれたｈＧＨポリペプチドは、実施例４および５に記載した手順に従って作製される。一度修飾すれば、以下の構造を有するヒドラジド含有ＰＥＧは、ｈＧＨポリペプチドに接合する：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２
ここで、Ｒ＝メチルであり、ｎ＝２であり、およびＮ＝分子量１０，０００であり、Ｘはカルボニル（Ｃ＝Ｏ）基である。ｐ−アセチルフェニルアラニンを含む精製されたｈＧＨを、ｐＨ６．０の２５ｍＭ ＭＥＳ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）、ｐＨ７．０の２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）、またはｐＨ４．５の１０ｍＭ 酢酸ナトリウム（Sigma Chemical, St. Louis, MO）に０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの間の濃度で溶解させ、１〜１００倍過剰量のヒドラジド含有ＰＥＧに反応させた。関連するヒドラジンは、１Ｍ ＮａＣＮＢＨ３（Sigma Chemical, St. Louis, MO）の添加によってｉｎ ｓｉｔｕで還元し、水で希釈し、最終濃度を１０〜５０ｍＭとした。反応は、４℃から室温で１８〜２４時間暗所で実行した。反応を、約ｐＨ７．６の１Ｍのトリス（Sigma Chemical, St. Louis, MO）で最終的なトリス濃度が５０ｍＭになるように添加して終わらせ、または次の精製に好適な緩衝液で希釈した。
＜実施例８＞
本実施例は、アルキン含有アミノ酸のｈＧＨポリペプチドへの導入、およびｍＰＥＧアジドによる誘導体化を説明する。
以下の残基、３５、８８、９１、９２、９４、９５、９９、１０１、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１４０、１４３、１４５、および１５５は、それぞれ以下の非天然にコードされたアミノ酸で置換される（ｈＧＨ；米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２）：
Figure 2009523815
 部位特異的にｈＧＨに組み込まれたｐ−プロパジル−チロシンの利用のための配列は、上記の実施例４に記載した米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２（ｈＧＨ）、配列番号４（ｍｕｔｔＲＮＡ，Ｍ．ｊｃｍｎａｓｃｈｉｉ ｍｔＲＮＡＴｙｒ ＣＵＡ）、および９、１０または１１である。プロパジルチロシンを含むｈＧＨポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉで発現され、実施例５に記載の条件を用いて精製した。
プロパジル−チロシンを含む精製されたｈＧＨは、０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの間の濃度でＰＢ緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ＝８）に溶解し、１０〜１０００倍過剰のアジド含有ＰＥＧを反応混合物に添加した。ＣｕＳｏ４およびＣｕワイヤーの酵素学的量を、続いて反応混合物に添加した。混合物を培養後（特に限定されないが、室温または３７℃で約４時間、または４℃で一晩を含む）、水を添加し、混合物を透析膜に通してろ過した。試料は、特に限定されないが、実施例５に記載した手段と同様に、追加に分析できる。
本実施例ではＰＥＧは以下の構造を有する：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｎ３
ここで、Ｒはメチルであり、ｎは４であり、Ｎは分子量１０，０００である。
＜実施例９＞
この実施例は、プロパジルチロシンを有するｈＧＨポリペプチド中の大きな疎水性アミノ酸の置換について説明する。
Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、またはＴｙｒ残基は、以下のｈＧＨの領域内に存在する：１〜５（Ｎ末端）、６〜３３（Ａへリックス）、３４〜７４（ＡヘリックスおよびＢヘリックス間の領域、Ａ−Ｂループ）、７５〜９６（Ｂヘリックス）、９７〜１０５（ＢヘリックスおよびＣヘリックス間の領域、Ｂ−Ｃループ）、１０６〜１２９（Ｃヘリックス）、１３０〜１５３（ＣヘリックスおよびＤヘリックスの間の領域、Ｃ−Ｄループ）、１５４〜１８３（Ｄヘリックス）、１８４〜１９１（Ｃ末端）（米国特許出願公開第２００５／０１７０４０４号明細書の配列番号２）は、以下の実施例８に記載した非天然にコードされたアミノ酸で置換される：
Figure 2009523815
 一度修飾されれば、ＰＥＧはアルキン含有アミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドバリアントに接着するする。該ＰＥＧは以下の：
Ｍｅ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ３
の構造を有し、結合手段は実施例８の記載に従う。このＰＥＧは、ポリペプチド内の固有の部位においてＰＥＧ誘導体で修飾された、１つの天然に生じた大きな疎水性アミノ酸に対してほぼ等比体積である、非天然にコードされたアミノ酸を含むｈＧＨポリペプチドバリアントを生じる。
＜実施例１０＞
実施例１に記載した位置３５でパラアセチルフェニルアラニン（ｐＡＦ）により置換されたメチオニルｈＧＨポリペプチドを、モノメトキシ−ＰＥＧ−２−アミノオキシエチルアミンカルバミン酸塩酸塩（３０Ｋ ＰＥＧ）に接合させた。ｐ−アセチルフェニルアラニンおよび直交化ｔＲＮＡ−アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ対を発現している構築物を用いて、ｈＧＨポリペプチドをＥｃｏｌｉ宿主細胞において発現させた。以下の手順はｈＧＨポリペプチドおよびＰＥＧの間にオキシム結合を形成するために実行した。使用した３０ＫのＭＰＥＧ−オキシムの量は、ＰＥＧ：Ｙ３５ｐＡＦｈＧＨポリペプチドについてモル比８を用いて決定した。ＰＥＧ粉体を秤量し、室温で穏やかに攪拌されている８．８６ｍｇ／ｍｌのＹ３５ｐＡＦｈＧＨ溶液に、約３倍量添加した。固体ＰＥＧの大きな部分は手作業で砕いた。反応混合物を、初回および２回目の添加後、２８℃で１０分間培養した。最後の添加に続いて、反応混合物を２８℃で４０時間穏やかに攪拌した。
本明細書に記載されている実施例および実施形態が、例証のみを目的としており、かつそれらの軽微な種々の修飾または変化が、当該分野における通常の当業者に示唆されており、かつ本出願および精神の、ならびに添付の特許請求の範囲に含まれることが、理解される。本明細書で引用した全ての刊行物、特許、特許出願、および／または他の文書は、全ての目的のためにその全体が参照によって組み込まれ、同様に、個々の刊行物、特許、特許出願、および／または他の文書は、その目的のために個々に参照によって組み込まれる。
脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）−ｈＧＨの融合導入遺伝子の略図である。 ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、（ｍｅｔ）−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。 ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、（ｍｅｔ）−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。 ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、（ｍｅｔ）−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。 ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。 ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。 ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。 ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、ＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。 ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、ＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。 ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、ＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。 ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、フロイント不完全アジュバントに溶解した（ｍｅｔ）−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。 ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、フロイント不完全アジュバントに溶解した（ｍｅｔ）−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。 ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、フロイント不完全アジュバントに溶解した（ｍｅｔ）−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。 ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、フロイント不完全アジュバントに溶解した（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。 ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、フロイント不完全アジュバントに溶解した（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。 ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、フロイント不完全アジュバントに溶解した（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。 ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、フロイント不完全アジュバントに溶解したＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。 ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、フロイント不完全アジュバントに溶解したＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。 ｈＧＨが遺伝子導入されていないマウス（非ｔｇマウス）および、ｈＧＨのトランスジェニックマウス（ｔｇマウス）に対して、フロイント不完全アジュバントに溶解したＰＥＧ−（ｍｅｔ）Ｙ３５ｐＡＦ−ｈＧＨにより免疫したときの、非ｔｇマウスの抗体反応（パネルＡ）およびｔｇマウスの抗体反応（パネルＢ）を示す図である。 マウスにおける免疫原性のデータ（抗体力価）の概要を示す図である。 ウサギの血清アルブミンの接合体に関するマトリクス支援レーザー脱離イオン化質量分析を示す図である。 ウサギにおけるＤＮＰの免疫反応（パネルＡ）、ｐ−アセチルフェニルアラニンの免疫反応（パネルＢ）、Ｐｈｅの免疫反応（パネルＣ）、およびＴｙｒの免疫反応（パネルＤ）の比較を示す図である。

Claims (20)

  1. ポリペプチドの免疫原性を調節する方法であって、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸により、上記ポリペプチドにおける１つ以上の任意の天然に生じるアミノ酸を置換する工程を含んでいる方法。
  2. １つ以上の翻訳後修飾により上記ポリペプチドを修飾する工程をさらに含んでいる、請求項１に記載の方法。
  3. 上記ポリペプチドをリンカー、ポリマーまたは生物活性分子に連結もしくは結合させる工程をさらに含んでいる、請求項１に記載の方法。
  4. 上記ポリペプチドが水溶性ポリマーに連結または結合される、請求項３に記載の方法。
  5. 上記水溶性ポリマーがポリ（エチレングリコール）部分を含んでいる、請求項４に記載の方法。
  6. 上記ポリペプチドが、水溶性ポリマーに、上記非天然にコードされたアミノ酸と上記水溶性ポリマーとの間におけるオキシム結合を介して、連結または結合される、請求項４に記載の方法。
  7. ポリペプチドの免疫原性を調節する方法であって、
    １つ以上の非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを生成する工程と、
    １つ以上の非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる上記ポリペプチドをコードする上記ポリヌクレオチド、直交化ＲＮＡシンテターゼ、および直交化ｔＲＮＡを含有する細胞を、１つ以上の非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドが発現することができる条件下において培養する工程と、
    １つ以上の非天然にコードされたアミノ酸を含んでいる上記ポリペプチドを精製する工程とを含んでいる方法。
  8. 上記非天然にコードされたアミノ酸がカルボニル基を含んでいる、請求項１または７に記載の方法。
  9. 上記非天然にコードされたアミノ酸がケトンを含んでいる、請求項８に記載の方法。
  10. 上記非天然にコードされたアミノ酸がパラ−アセチルフェニルアラニンである、請求項８に記載の方法。
  11. 上記ポリペプチドがヒト成長ホルモンである、請求項１または７に記載の方法。
  12. １つ以上の非天然にコードされたアミノ酸を含み、免疫原性が調節されたポリペプチド。
  13. １つ以上の非天然にコードされたアミノ酸を含んでいるポリペプチドであって、当該ポリペプチドの１つ以上の特定のエピトープに関する免疫原性が、野生型ポリペプチドと比べて調節されている、ポリペプチド。
  14. 上記ポリペプチドの１つ以上の特定のエピトープに関する免疫原性が、野生型ポリペプチドと比べて増加している、請求項１３に記載のポリペプチド。
  15. 上記ポリペプチドの１つ以上の特定のエピトープに関する免疫原性が、野生型ポリペプチドと比べて減少している、請求項１３に記載のポリペプチド。
  16. 請求項１２または１３に記載のポリペプチド、および薬学的に許容可能な担体を含んでいる組成物。
  17. 治療的有効量の請求項１６に記載の組成物を被検体に投与する工程を含んでいる、当該被検体を治療する方法。
  18. 免疫原性を有するポリペプチドの免疫原性の削除、免疫原の免疫原性を含有または刺激するためのワクチンとしての使用、ポリペプチドに結合する抗体のブロック、および１つ以上の自己免疫疾患の治療から成る群から選択される、請求項１２または１３に記載のポリペプチドの使用。
  19. 上記ポリペプチドの免疫原性が、野生型ポリペプチドよりも増加している、請求項１２に記載のポリペプチド。
  20. 上記ポリペプチドの免疫原性が、野生型ポリペプチドよりも減少している、請求項１２に記載のポリペプチド。
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