CN111094989A - 用于胰岛素和胰岛素类似物的序列识别的肽图谱法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于诸如人胰岛素和胰岛素类似物的蛋白质的肽质量指纹术。胰岛素类似物可以改变至少一个氨基酸，这难以通过当前可用的分析方法来区分。本发明进一步允许肽的序列确认，其中该方法的运行时间为四十分钟。该方法可应用于最大为50kDa的分子。

Description

用于胰岛素和胰岛素类似物的序列识别的肽图谱法

技术领域

本发明涉及蛋白质组学和分析化学领域。更具体地，本发明涉及用于蛋白质的肽质量指纹术的开发方法，该方法用于同时确定身份和质量，这进一步允许进行肽序列确认。

背景技术

采用灵敏的仪器的使用凝胶电泳和质谱的方法因用于蛋白质的快速定量分析而闻名。这些方法包括：提取蛋白质，消化至少一部分蛋白质并制作样品，进行电泳，基于标记的肽样品中的肽通过质谱来检测样品中蛋白质在表达水平上的差异。该分析方法可用于蛋白质表达图谱的定性和定量分析。然而，该方法包括许多化学品和若干步骤，使该方法的成本巨增。因此，需要开发一种减少成本和时间的方法。

通过重组DNA技术获得的蛋白质通过肽图谱法(Peptide mapping method)来识别。肽图谱是一项有影响力的测试，其能够识别由于诸如点突变错误的事件而导致的单个氨基酸变化。肽图谱法可用于评估用于重组DNA产物的细胞的表达构建体的稳定性，和评定产物稳定性，以及确保蛋白质产物的身份，或检测蛋白质变体的存在。肽图谱还用于评估商业胰岛素产品的质量，并建立适用于筛选蛋白质(例如人胰岛素和胰岛素类似物)的肽图谱法。

US 7,622,273描述了逐步法，其中蛋白质直接结合至蛋白质微阵列(蛋白质芯片)，并随后进行化学处理/酶消化/化学消化。通过化学处理步骤进行的消化包括蛋白质变性、还原和烷基化。酶消化步骤包括使蛋白质去糖基化或去磷酸化和酶水解或化学水解蛋白质。为了快速进行蛋白质识别和结构表征，蛋白质微阵列上的所有反应均逐步进行。尽管该方法比耗时约24小时的传统方法花费更少的时间，但是仍然不能令人满意。更重要的是，复杂的样品(血浆、尿液、脑脊液等)在实施该方法之前可能需要进行分馏以获得靶蛋白分离物，从而增加了整体处理和持续时间。因此，导致样品制备和预期结果需要额外的成本和时间。

US 9,581,601描述了一种通过包含两个或更多个磺酰基基团的化合物使肽/蛋白质衍生的方法，并且在质谱仪的负操作模式下对衍生的分析物进行分析。该方法允许对长链肽/蛋白质的氨基酸序列进行分析。该方法还涉及衍生化合物5-甲酰基-苯-1,3-二磺酸的合成过程。新试剂的衍生非常耗时，并且具有与之相关的附加的成本。

常规脱盐一次允许检测单个片段，并且需要进行多次色谱运行，随后再对收集的单个峰进行脱盐。该方法花费最多两个工作日。

迄今为止，文献中可用的用于胰岛素及其类似物的肽图谱过程属于基于盐的方法，该方法与LC-MS的使用不兼容。因此，需要开发一种新的肽指纹图谱法(peptidemapping fingerprinting method)，该方法具有较短的运行时间并且与LC-MS兼容。由于胰岛素类似物相差1至3个氨基酸，因此难以以时间有效的方式进行蛋白质作图，尤其是这种肽。

因此，仍然需要一种不仅减少产生的时间和成本，而且提供可靠结果的方法。

发明目的

因此，本发明的目的是提供一种用于确定蛋白质/肽的身份和质量的时间和成本有效的肽指纹图谱法。

本发明的另一个目的是提供一种方法，其中该方法将蛋白质溶解在非盐缓冲液中，与常规方法相比，这导致运行时间大大减少。

本发明的另一个目的是提供一种方法，其中该方法还允许同时检测多个片段。

本发明的另一个目的是通过消除脱盐步骤并减少分析样品所需的时间来提供序列确认。

发明内容

本发明的一个方面是一种用于确定多肽(例如为0.4kDa至8kDa的胰岛素或胰岛素类似物(天冬胰岛素、赖脯胰岛素或甘精胰岛素))的氨基酸序列和质量的方法，其中多肽相差至少一个氨基酸。在还原条件下，所述方法包括步骤：通过添加内切蛋白酶Glu C来消化多肽样品；进行HPLC分析，随后进行质谱分析；并将该多肽的分子量与相应的已知多肽的分子量进行比较。本发明允许确定多肽的身份并且确认该肽的序列，其中本发明方法的运行时间为约四十分钟。

附图说明

图1表示工作标准品(内部)和商业产品的酶消化的流程图；

图2表示工作标准品(内部)和商业产品在还原条件下进行酶消化的流程图；

图3表示核酸内切酶Glu-C和DTT在人胰岛素上的作用点；

图4表示消化和还原后的胰岛素-肽片段；

图5表示在消化条件下胰岛素样品的叠加；

图6表示在消化和还原条件下胰岛素样品的叠加；

图7表示人胰岛素、甘精胰岛素、天冬胰岛素和赖脯胰岛素的消化图；

图8表示人胰岛素、甘精胰岛素、天冬胰岛素和赖脯胰岛素的消化-还原图；

图9表示消化后的人胰岛素的四个片段，确认了片段的质量；

图10表示消化后的甘精胰岛素的四个片段确认了片段的质量；

图11表示消化后的天冬胰岛素的四个片段确认了片段的质量；

图12表示消化后的赖脯胰岛素的四个片段确认了片段的质量；

图13表示消化后再还原的人胰岛素的六个片段确认了片段的质量；

图14表示消化后再还原的甘精胰岛素的六个片段确认了片段的质量；

图15表示消化后再还原的天冬胰岛素的六个片段确认了片段的质量；

图16表示消化后再还原的赖脯胰岛素的六个片段确认了片段的质量。

定义

术语“多肽”、“肽”均是指天然存在的或重组的、以化学方法或通过其他方式产生或修饰的肽和多肽，可以假定蛋白质的三维结构，该蛋白质的三维结构可以基本上与天然蛋白质的方式相同，在翻译后加工而成。

术语“肽图谱”是指通过使给定的多肽片段化而获得的并因此对所述多肽具有特异性的一组多肽。

术语“蛋白质样品”是指胰岛素和胰岛素类似物的内部工作标准品和商业产品，即天冬胰岛素(诺和锐，Novolog)、赖脯胰岛素(优泌乐，Humalog)、甘精胰岛素(来得时，Lantus)。

术语“消化”是指通过内切蛋白酶GluC来切割肽，该内切蛋白酶GluC在天冬氨酸残基处切割。

术语“还原”是指还原蛋白质的二硫键，以防止在蛋白质的半胱氨酸残基之间形成分子内和分子间二硫键。

术语“胰岛素”是指为51个氨基酸残基的多肽(5808道尔顿)的胰岛素，其在许多关键的细胞过程中起着重要的作用。该胰岛素参与刺激细胞生长和分化。该胰岛素还通过信号传导通路来发挥其调节功能(例如，将葡萄糖摄入细胞)，该信号传导通路是由将单体形式的激素与其二聚酪氨酸激酶型膜受体结合而引发。成熟形式的人胰岛素由51个氨基酸组成，排列成总分子量为5808Da的A链(GlyA1-AsnA21)和B链(PheB1-ThrB30)。该分子通过两个链间(A20-B19、A7-B7)和一个链内二硫键(A6-A11)而稳定。

胰岛素类似物“赖脯胰岛素”在一级结构上与人胰岛素相同，与胰岛素不同的是B28位置处的赖氨酸与B29位置处的脯氨酸进行了交换。赖脯胰岛素是一种短效胰岛素单体类似物。在溶液制剂中，赖脯胰岛素以固有的不稳定六聚体形式存在，但是当被注射时，赖脯胰岛素会自发地解离成单体形式。B链C末端的修饰减少了胰岛素单体之间的非极性接触和b-折叠相互作用，导致了较少的自缔合。

胰岛素类似物“天冬胰岛素”的作用类似赖脯胰岛素。该速效类似物天冬胰岛素与人胰岛素的不同之处在于，天冬氨酸单一替换了B28位置处的脯氨酸。由于B链的羧基末端处的局部构象变化，该替换导致单体之间的电荷排斥和空间位阻，减少了六聚体和二聚体的形成，并从而提高了单体天冬胰岛素的吸收速率。

胰岛素类似物“甘精胰岛素”与人胰岛素的不同之处在于，天冬酰胺替换在A21处的甘氨酸，并B链的C末端添加了两个精氨酸残基。甘精胰岛素溶液是在pH 4.0下配制并注射的。这些修饰使等电点提高到更中性的pH，降低了生理条件下的溶解度，并导致甘精氨酸在注射部位沉淀，从而减缓吸收。甘精胰岛素是一种类似于特慢胰岛素的持续20-24小时的长效类似物，并且与中性鱼精蛋白锌(Neutral protamine Hagedorn，NPH)胰岛素相比，更好地减少了1型和2型糖尿病患者的夜间低血糖。

具体实施方式

本发明提供一种用于确定多肽或多肽混合物的氨基酸序列和质量的方法，所述方法包括以下步骤：

a)通过将多肽溶解在强酸HCl中并用Tris调节pH来制备多肽样品；

b)通过以1：25的酶-蛋白比例添加内切蛋白酶Glu C来消化步骤(a)的多肽样品；

c)通过添加1M二硫苏糖醇来还原步骤(b)的经消化的多肽；

d)对涉及有机溶剂的步骤(c)的多肽进行HPLC分析，随后进行质谱分析；

e)将经消化的多肽的分子量与相应的已知多肽的分子量进行比较，从而确定该多肽的身份，

其中有机溶剂是非盐缓冲液；并且

该方法允许同时对多个片段进行序列确认。

非盐缓冲液可以选自由乙腈、甲酸、TFA、或其组合组成的组。

在常规方法中，LC-MS检测使用基于盐的缓冲液，然而，本发明人发现，在使用与LCMS兼容的非基于盐的缓冲液时，导致步骤(d)和(e)所消耗的时间的显著减少，因此使当前处理时间和成本有效率。

令人惊讶地发现，在消化和还原以识别质量和序列的步骤之后的步骤(d)和(e)花费了约40分钟，而常规方法花费一至两天。

本方法可应用于分析和识别高达50kDa的多肽的质量和序列。

由于可电离基团的电荷和暴露增加，肽或蛋白质的消化可以改善质谱检测。在本发明中，蛋白质的还原涉及切割肽或蛋白质中的二硫键。随后添加烷化剂以减少和防止二硫键的重新形成(这可以导致二硫键不规则地生长，从而促进无定形聚集体)。

I.通过内切蛋白酶Glu-C以25：1(蛋白质比酶)的比例对蛋白质进行酶消化。

II.使用内切蛋白酶Glu-C以25：1(蛋白质与酶)的比例将蛋白质进行酶消化后，通过添加1M DTT进行酶消化和还原。

III.使用LC-MS(ESI)进行HPLC分析。

IV.使用蛋白质量指纹(PMF)图谱进行分析。

V.多个片段的检测和肽的序列确认。

VI.在消化阶段之后，本发明的时间为最多40至60分钟。

如实施例中所述，在本发明中使用以下材料和试剂。

1.使用0.01N HCl制备蛋白质/肽样品，而使用Tris-HCl缓冲液调节pH。

2.在所示实施例中，使用的有机溶剂是一种非基于盐的缓冲液，是来自J.T Baker的含有0.1％光谱级的甲酸(FA)(购自西格玛奥德里奇)的乙腈(ACN)，但也可以使用其他有机溶剂，例如甲醇(MeOH)、异丙醇(IPA)、或ACN、MeOH和IPA的混合物。

3.在所示实施例中，溶液包含还原剂，该还原剂包括二硫醇还原剂1M二硫苏糖醇(DTT)。但是，也可以使用三(2-羧乙基)膦(TCEP)、2-巯基乙醇(BME)、以及2-巯基乙醇胺(2-MEA)。

4.使用内切蛋白酶Glu-C(1mg/ml)测序级(罗氏，目录号11047817001)来制备内部产品和商业产品的片段。

5.如示例中所示的，内部工作标准品使用人胰岛素、甘精胰岛素、天冬胰岛素以及赖脯胰岛素，而商业产品使用诺和灵-R(Novolin-R，诺和诺德的胰岛素)、来得时(安万特制造的甘精胰岛素)、诺和锐(诺和诺德制造的天冬胰岛素)以及优泌乐(礼来制造的赖脯胰岛素)。

在本发明中进行了两个独立的实验。在第一个实验中，对胰岛素和胰岛素类似物的蛋白质/肽样品仅进行了消化处理。在第二个实验中，对胰岛素和胰岛素类似物的蛋白质/肽样品进行了消化和还原处理。

两种样品均使用LC-MS(ESI)进行HPLC分析，并使用蛋白质量指纹(PMF)图谱进行分析。

本说明书进一步描述了该过程的最佳模式。

步骤1内部工作标准品和商业产品的酶消化

按照图1所示的逐步过程，其中，将蛋白质样品(1mg/mL)溶于0.01N HCl中，并用Tris-HCl缓冲液将pH调节至7.5-8.5。以25：1(蛋白质比酶)的比例添加内切蛋白酶Glu-C。将样品在37℃下孵育3小时，然后使用LC-MS(ESI)对最终样品进行HPLC分析和蛋白质量指纹图谱(Protein mass fingerprinting，PMF)分析。还将样品储存在-20℃下以备日后使用。

表1中列出了消化胰岛素分子后获得的肽片段。在蛋白酶V8消化后，人胰岛素产生了四种肽片段，并标记为片段I、片段II、片段III和片段IV。

表1：胰岛素经Glu C消化后的理论肽片段的列表

片段IV包含氨基酸A5-A17和B1-B13、片段III A18-A21和B14-B21、片段II B22-B30以及片段I A1-A4。这4种肽片段依次洗脱，较小的肽片段洗脱较快。在第10分钟内首先洗脱出4个氨基酸的片段I，并显示出最低的UV吸收。9个氨基酸的片段II在约第16分钟时洗脱出来，随后是包含12个氨基酸的片段III，比片段II约晚2.7分钟从柱上洗脱出来。含有26个氨基酸的片段IV在约第26分钟时洗脱出来，并显示出最高水平的UV吸收。

对于其余的类似物(天冬胰岛素、甘精胰岛素和赖脯胰岛素)，片段I和IV约在相同的保留时间内洗脱出来，因为与胰岛素相比，序列没有变化(在氨基酸数量方面)。天冬胰岛素和赖脯胰岛素的片段II(尽管在序列上有变化：天冬胰岛素-ProB28被AspB28取代；赖脯胰岛素-LysB29转换为ProB29)在与胰岛素的保留时间相同的保留时间上洗脱出来。由于序列(关于氨基酸数量)没有变化，天冬胰岛素和赖脯胰岛素的片段III在与胰岛素的保留时间相同的保留时间洗脱出来。与人胰岛素的保留时间相比，甘精胰岛素在片段II和III的保留时间上有显著转变。在甘精胰岛素上用Gly替换AsnA21使片段III的保留时间延迟。此外，在甘精胰岛素的片段II上添加2个精氨酸(ArgB31-32)带来先于人胰岛素的洗脱。

步骤2内部工作标准品和商业产品的酶消化并还原

按照图2所示的逐步过程，其中，将蛋白质样品(1mg/mL)溶于0.01N HCl中，并用Tris-HCl缓冲液将pH调节至7.5-8.5。

以25：1(蛋白质比酶)的比例添加内切蛋白酶Glu-C。将样品在37℃下孵育3小时。还原步骤为添加1M DTT，并在37℃下继续孵育1小时。然后最终样品使用LC-MS(ESI)进行HPLC分析，并使用蛋白质量指纹(PMF)图谱进行分析。还将样品储存在-20℃下以备将来使用。

图3和图4描绘了当在还原条件下消化胰岛素或胰岛素类似物的蛋白质样品时，Glu-C和DTT上的作用点以及产生的片段。

在还原条件下Glu-C消化后，从人胰岛素分子中产生了六种肽片段。在第5.2分钟内首先洗脱出4个氨基酸的片段I；4个氨基酸的片段II在约第9.7分钟时洗脱出来，其显示出最低的UV吸收，随后是包含13个氨基酸的片段III，比片段II约晚5.0分钟从柱上洗脱出来。含有9个氨基酸的片段IV在约第15.5分钟时洗脱出来；8个氨基酸的片段V在约第23.8分钟时洗脱出来，并且最后13个氨基酸的片段VI在约第28.5分钟时洗脱出来。

表2：在还原条件下经Glu-C消化后获得的胰岛素肽片段的理论质量的列表

在赖脯胰岛素中，除了片段IV在第14.4分钟时大量洗脱出来，比人胰岛素片段IV的洗脱提前大约1分钟以外，片段的洗脱图案没有变化。

对于甘精胰岛素，由于序列没有变化，因此片段II、片段III、片段V以及片段VI的洗脱图案没有变化。由于序列发生变化(Gly替换了AsnA21)，因此片段I在第5.8分钟时洗脱出来。与人胰岛素和赖脯胰岛素相比，片段IV在第11.4分钟时提前洗脱出来，因为添加了2个精氨酸(ArgB31-32)，序列发生了变化。

天冬胰岛素使用80％ACN作为洗脱液B进行肽质量指纹术。在第5.3分钟内首先洗脱出4个氨基酸的片段I；4个氨基酸的片段II在约第10.4分钟时洗脱出来，显示出最低的UV吸收，随后是包含13个氨基酸的片段III，比片段II约晚5.5分钟从柱上洗脱出来。含有9个氨基酸的片段IV在约第16.2分钟时洗脱出来；8个氨基酸的片段V在约第26.9分钟时洗脱出来，以及最后13个氨基酸的片段VI在约第30.5分钟时洗脱出来。

步骤3：反相高效液相色谱(RP-HPLC)

使用连接至质谱仪(Bruker HCT)的二极管阵列检测器(美国)在Agilent1200HPLC系统上进行RP-HPLC。采用梯度系统，流速为1.0mL/min。

如表3所示，流动相包括100％水和0.1％FA作为洗脱液A，以及90％乙腈作为洗脱液B[用于胰岛素和胰岛素类似物(消化)和用于胰岛素、甘精胰岛素、赖脯胰岛素(消化和还原)]。在天冬胰岛素(消化和还原)的情况下，使用80％ACN作为洗脱液B。

表3：反相高效液相色谱(RP-HPLC)条件

时间	洗脱液B
		初始条件	5％
0-12分钟	5％-20％
		12-18分钟	20％-21％
18-25分钟	21％-30％
		25-34分钟	30％-70％
34-34.10分钟	70％-5％
		34.10-40分钟	5％(洗涤)

表4：反相高效液相色谱(RP-HPLC)条件

初始条件为5％洗脱液B，然后0-12分钟为5％-20％洗脱液B，12-18分钟为20％-21％洗脱液B，18-25分钟为21％-30％洗脱液B，以及25-34分钟为30％-70％洗脱液B，以及34-34.10分钟为70％-5％洗脱液B，并且再放置6.0分钟以重新平衡(表4)。

注射5微升经消化的样品溶液并在保持40℃柱温的ACE C18-300柱(4.6×250mm，5μm粒径；亚伯丁，苏格兰)上进行分析。通过220nm处的UV吸收来检测分级的胰岛素和胰岛素类似物肽。

步骤4：质谱

使用布鲁克高容量阱(Bruker High Capacity Trap)以进行质谱分析，以下参数作为分析参考；

1.离子源类型-ESI+(ESI Positive)，

2.质量范围模式–超扫描，

3.离子极性-+(Positive)，

4.扫描范围-50-2200m/z，自动MSⁿ-开启。

用步骤1和步骤2的方案进行肽质量指纹术。

对所有分析的样品进行了消化、消化和还原的HPLC色谱图的检查。另外，还获得了质谱数据以确认取得的峰的质量。肽图谱技术能够比液相色谱法更有效地区分人胰岛素和各种类型的胰岛素类似物，确保并展示了揭示难以捕捉的差异的能力。

以下实施例用于说明本发明的某些优选实施方案和方面，并且不应解释为限制其范围。

实施例1：胰岛素分子的消化

在蛋白酶V8消化后，从人胰岛素产生了四种肽片段。片段IV包含氨基酸A5-A17和B1-B13，片段III包含A18-A21和B14-B21，片段II包含B22-B30，以及片段IV包含A1-A4。这4种肽片段依次洗脱，较小的肽片段洗脱较快。在第10分钟内首先洗脱出4个氨基酸的片段I，并显示出最低的UV吸收。9个氨基酸的片段II在约第16分钟时洗脱出来，随后是包含12个氨基酸的片段III，比片段II约晚2.7分钟从柱上洗脱出来。含有26个氨基酸的片段IV在约第26分钟时洗脱出来，并显示出最高水平的UV吸收。

图5表示在消化条件下胰岛素样品(内部产品Insugen和商业产品诺和灵)的叠加。图7显示了通过消化过程产生的片段的UV色谱图，而图9确认了片段的质量。

实施例2：天冬胰岛素的消化

在蛋白酶V8消化后，从人胰岛素产生四种肽片段。片段IV包含氨基酸A5-A17和B1-B13，片段III包含A18-A21和B14-B21，片段II包含B22-B30，以及片段IV包含A1-A4。片段I和片段IV在与胰岛素分子的保留时间大致相同的保留时间洗脱出来，因为与胰岛素相比，序列没有变化。天冬胰岛素的片段II(尽管在序列上有变化：天冬胰岛素-ProB28被AspB28取代)在与胰岛素的保留时间相同的保留时间上洗脱出来。由于序列没有变化，天冬胰岛素的片段III在与胰岛素的保留时间相同的保留时间上洗脱出来。

图7表示通过消化过程产生的片段的UV色谱图，而图11确认了片段的质量。

实施例3：赖脯胰岛素的消化

在蛋白酶V8消化后，从人胰岛素产生四种肽片段。片段IV包含氨基酸A5-A17和B1-B13，片段III包含A18-A21和B14-B21，片段II包含B22-B30，并且片段IV包含A1-A4。片段I和片段IV在与胰岛素分子的保留时间大致相同的保留时间洗脱出来，因为与胰岛素相比，片段的序列没有变化。赖脯胰岛素的片段II(尽管在序列上有变化：赖脯胰岛素-LysB29转换为ProB29)在与胰岛素的保留时间相同的保留时间洗脱出来。由于序列没有变化，赖脯胰岛素的片段III在与胰岛素的保留时间相同的保留时间洗脱出来。

图7表示通过消化过程产生的片段的UV色谱图，而图12确认了片段的质量。

实施例4：甘精胰岛素的消化

在蛋白酶V8消化后，从人胰岛素产生了四种肽片段。片段IV包含氨基酸A5-A17和B1-B13，片段III包含A18-A21和B14-B21，片段II包含B22-B30，以及片段IV包含A1-A4。与人胰岛素的保留时间相比，甘精胰岛素在片段II和III的保留时间上有显著转变。在甘精胰岛素上用Gly替换AsnA21使片段III的保留时间延迟。此外，在甘精胰岛素的片段II上添加2个精氨酸(ArgB31-32)带来先于人胰岛素的洗脱。图7显示了通过消化过程产生的片段的UV色谱图，而图10确认了片段的质量。

实施例5：在还原条件下的胰岛素分子的消化

在还原条件下Glu-C消化后，从人胰岛素分子中产生了六种肽片段。在第5.2分钟内首先洗脱出4个氨基酸的片段I；4个氨基酸的片段II在约第9.7分钟时洗脱出来，其显示出最低的UV吸收，随后是包含13个氨基酸的片段III，比片段II约晚5.0分钟从柱上洗脱出来。含有9个氨基酸的片段IV在约第15.5分钟时洗脱出来；8个氨基酸的片段V在约第23.8分钟时洗脱出来，并且最后13个氨基酸的片段VI在约第28.5分钟时洗脱出来。

图6表示在消化与还原条件下胰岛素样品(内部产品Insugen和商业产品诺和灵)的叠加。图8表示通过消化随后还原的过程产生的片段的UV色谱图，并且图13确认了片段的质量。

实施例6：在还原条件下的天冬胰岛素的消化

对于天冬胰岛素，使用80％ACN作为洗脱液B进行了肽质量指纹术。在第5.3分钟内首先洗脱出4个氨基酸的片段I；4个氨基酸的片段II在约第10.4分钟时洗脱出来，其显示出最低的UV吸收，随后是包含13个氨基酸的片段III，比片段II约晚5.5分钟从柱上洗脱出来。含有9个氨基酸的片段IV在约第16.2分钟时洗脱出来；8个氨基酸的片段V在约第26.9分钟时洗脱出来，并且最后13个氨基酸的片段VI在约第30.5分钟时洗脱出来。图8表示通过消化随后还原的过程产生的片段的UV色谱图，并且图15确认了片段的质量。

实施例7：在还原条件下的赖脯胰岛素的消化

在赖脯胰岛素中，除了片段IV在约第14.4分钟时大量洗脱出来，比人胰岛素片段IV的洗脱提前大约1分钟之外，片段的洗脱图案没有变化。图8表示通过消化随后还原的过程产生的片段的UV色谱图，其中图16确认了片段的质量。

实施例8：在还原条件下的甘精胰岛素的消化

对于甘精胰岛素，由于序列没有变化，因此片段II、片段III、片段V以及片段VI的洗脱图案没有变化。由于序列发生变化(Gly替换了AsnA21)，因此片段I在第5.8分钟时洗脱出来。与人胰岛素和赖脯胰岛素相比，片段IV在第11.4分钟时提前洗脱出来，因为序列发生了变化；添加了2个精氨酸(ArgB31-32)。图8表示通过消化随后还原的过程产生的片段的UV色谱图。图14确认了6个片段的质量。

实施例9：肽图谱的比较

测试的分析的内部产品的肽图谱与参考产品相同。此外，各种胰岛素类似物与人胰岛素的PMF的比较显示，即使单个氨基酸变化也可以通过肽图谱检测到。关于人胰岛素与赖脯胰岛素，赖脯胰岛素的片段IV早于人胰岛素的片段IV洗脱暗示了氨基酸重排可能诱导构象变化并改变肽片段的保留时间。

由用AsnA21替换Gly引起的甘精胰岛素的片段I极性降低导致了保留时间延迟。相反，在片段IV上另外的2个精氨酸增加极性，缩短了保留时间。因此，我们推断，胰岛素类似物的类型只能通过PMF进行有效识别，因为胰岛素类似物与人胰岛素之间存在的最大差异只有3个氨基酸。图7和图8的色谱图表示肽图谱的对比，从中得出了结论。

通过这两个处理均过程了质量检测，但是，其中最大差异只有3个氨基酸的多肽序列的确认通过将多肽消化随后还原的过程来实现。

Claims (8)

1.一种用于确定多肽或多肽混合物的氨基酸序列和质量的方法，所述方法包括步骤：

a)通过将所述多肽溶解在HCl中并用Tris调节pH来制备多肽样品；

b)通过以25：1的比例添加内切蛋白酶Glu C来消化所述多肽样品；

c)通过添加1M二硫苏糖醇来还原步骤(b)的经消化的样品；

d)对步骤(c)的多肽进行HPLC分析，随后进行质谱分析；

e)将所述多肽的分子量与相应的已知多肽的分子量进行比较，从而确定所述多肽的身份；

其中在步骤(d)中使用的有机溶剂是非盐缓冲液，并且所述方法允许同时对多个片段进行序列确认。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，将所述pH调节为7.5至8.5。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非于基盐的缓冲液选自乙腈、甲酸、TFA或其组合。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(d)和(e)所需的时间为约40分钟。

5.根据前述任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述多肽是胰岛素或胰岛素类似物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述多肽选自由天冬胰岛素、赖脯胰岛素和甘精胰岛素组成的组。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多肽可以至少相差一个氨基酸。

8.根据前述任一权利要求所述的方法，其特征在于，步骤(e)的多肽的经分析的片段的质量范围为0.4kDa至8kDa。

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