CN102256992A - 胰岛素类似物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了全效价的胰岛素类似物，其中该类似物包括：在A链19位的酪氨酸残基的修饰。

Description

胰岛素类似物
相关申请的交叉引用
本申请要求美国临时专利申请61/139,221(2008年12月19日申请)的优先权，将其全部公开内容明确地结合到本文中作为参考。
背景
胰岛素是神奇的肽激素。在几乎所有形式的糖尿病中，它显示了无与伦比的降低葡萄糖的能力。令人遗憾的是，它的药理学不是葡萄糖敏感性的，并因此它能够过度起作用，导致危急生命的血糖过低症。矛盾的药理学是胰岛素疗法的特点，这种特点使得血糖正常而不出现血糖过低症是极其困难的。此外，天然的胰岛素是短时期作用的胰岛素，并且要求修饰，以便使其适合用于控制基础葡萄糖。胰岛素疗法的一个中心目标是设计能够提供一天一次定时作用的胰岛素制剂。延长胰岛素剂量的作用时间可以通过降低胰岛素在注射位点的溶解度来实现。
有三种被证实的和独特的分子方法来降低溶解度，它们包括：(1)用锌使胰岛素的制剂成为不能溶解的悬浮液，(2)通过加入阳离子型氨基酸，使它的等电点提高至生理pH值，(3)共价修饰，以便提供能够降低溶解度并结合白蛋白的疏水性配体。所有这些方法受到固有可变性的限制，这些可变性随着在注射位点出现沉淀，随后再溶解，并且以活性激素形式输送至血液而发生。
前体药物化学提供了另一种机理，这种机理可以在从给药位点廓清并以高度限定浓度在血浆中平衡之后，精确控制胰岛素作用的起始和持续时间。相对于目前长效胰岛素类似物和制剂，这种方法的主要优点是：胰岛素储存处不是发生注射的皮下脂肪组织，而是血液隔室。这种方法消除了沉淀和溶解中的可变性。它还能够通过非皮下注射途径来给予该肽激素。为了构成成功的前体药物-激素，需要活性位点结构地址，可以形成前体药物结构单元的可逆性连接的基础。该结构地址需要提供两个关键特征：(1)选择性化学修饰的潜力，和(2)在天然形式中，一旦除去前体药物结构单元，能够提供全活性。
胰岛素是两个链的杂二聚体，其是通过酶催过程、由低效价单链前胰岛素前体生物合成获得的。人胰岛素由两个肽链(“A链”(SEQ ID NO∶1)和“B链”(SEQ ID NO∶2))组成，它们通过二硫键结合在一起，并且总共具有51个氨基酸。B-链的C端区域和A-链的两个末端以三维结构形式结合，组装成与胰岛素受体结合的高亲合性位点。天然胰岛素结构在活性位点残基处具有限定的独特化学元素，可以用于选择性地组装酰胺连接的前体药物单元。可以被修饰从而提供连接前体药物单元的元素的两个位点包括：天然A链的19位的酪氨酸残基(“A19酪氨酸”)和天然B链的24位的苯丙氨酸残基(“B24苯丙氨酸”)。这两个氨基酸是胰岛素作用的中心重要环节。然而，这两个氨基酸还证实在可以引入的并且还保持全效价的结构改变的类型方面具有高度限制性。
正如本文所公开的那样，本申请人发现了全效价的胰岛素类似物，其在A19位被修饰，并且可以潜在地用于组装胰岛素前体药物衍生物。
概述
按照一个实施方案，提供了全效价胰岛素类似物，其中在不损失效价的情况下在胰岛素的活性位点内将一个氨基插入到肽中。更尤其是，在不损失胰岛素肽的效价的情况下，在天然酪氨酸的A链19位的位置处选择性地插入4-氨基苯丙氨酸的氨基酸部分。随后用特异性二肽将这种活性位点氨基化学酰胺化，可以显著地减小活性，并且充当合适的前体药物。
按照一个实施方案，提供了胰岛素类似物，其中胰岛素肽的A链包括序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO∶3)，B链包括序列X4LCGX5X6LVEALYLVCG ERGFF(SEQ ID NO∶4)，其中
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2是下列通用结构的氨基酸
Figure 157589DEST_PATH_IMAGE001
,
其中R4是-NH2或OCH3；
X3是天门冬酰胺或甘氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸，天门冬氨酸，谷氨酸，高磺基丙氨酸和磺基丙氨酸。在进一步实施方案中，B链包括序列X11VNQX4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFFYTX9 X10(SEQ ID NO: 5)，其中
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸，天门冬氨酸，谷氨酸，高磺基丙氨酸和磺基丙氨酸；
X9是天门冬氨酸（aspartate)-赖氨酸二肽，赖氨酸-脯氨酸二肽，或脯氨酸-赖氨酸二肽；
X10是苏氨酸，丙氨酸或苏氨酸-精氨酸-精氨酸三肽；
X11选自苯丙氨酸和去氨基-苯丙氨酸。
按照一个实施方案，提供了胰岛素类似物，其中胰岛素肽的A链包括序列GIVEQCCTSICSLYQLENX2CN(SEQ ID NO∶6)，B链包括选自HLCGSHLVEALYLVCGERGFF(SEQ ID NO∶7)、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ ID NO∶8)和FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT(SEQ ID NO∶9)的序列，其中
X2是下列通用结构的氨基酸
Figure 700828DEST_PATH_IMAGE002
。
按照一个实施方案，提供了单链A19胰岛素类似物。在该实施方案中，人胰岛素B链的羧基末端或其功能性类似物与本公开的A19 A链类似物的N-末端共价连接。在一个实施方案中，B链通过4-12或4-8个氨基酸的肽连接基与A链连接。
在另一个实施方案中，通过亲水性部分与肽的共价键连接，胰岛素类似物的溶解度提高。在一个实施方案中，亲水性部分连接B链的N端氨基酸上或SEQ ID NO∶9的28位的氨基酸上或SEQ ID NO∶8的29位的氨基酸上。在一个实施方案中，亲水性部分是聚乙二醇(PEG)链，具有选自大约500至大约40,000道尔顿范围的分子量。在一个实施方案中，聚乙二醇链具有选自大约500至大约5,000道尔顿范围的分子量。在另一个实施方案中，聚乙二醇链具有大约10,000至大约20,000道尔顿的分子量。
酰化或烷基化可以提高胰岛素肽在循环中的半衰期。酰化或烷基化可以有利地延迟对胰岛素受体的作用的起始和/或延长作用的持续期间。胰岛素类似物可以在连接亲水性部分的相同的氨基酸位置、或在不同的氨基酸位置被酰化或烷基化。
按照一个实施方案，提供了药物组合物，其包含本文公开的任何新的A19胰岛素类似物和可药用稀释剂、载体或赋形剂，优选，该胰岛素类似物的纯度水平至少为90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%。这种组合物可以含有本文公开的A19胰岛素类似物，其浓度至少为0.5 mg/ml，1 mg/ml，2 mg/ml，3 mg/ml，4 mg/ml，5 mg/ml，6 mg/ml，7 mg/ml，8 mg/ml，9 mg/ml，10 mg/ml，11 mg/ml，12 mg/ml，13 mg/ml，14 mg/ml，15 mg/ml，16 mg/ml，17 mg/ml，18 mg/ml，19 mg/ml，20 mg/ml，21 mg/ml，22 mg/ml，23 mg/ml，24 mg/ml，25 mg/ml或更高。在一个实施方案中，药物组合物包含消毒的水溶液，并且任选保存包含在各种包装容器之内。在其它实施方案中，药物组合物包含冷冻干燥粉末。可以进一步包装药物组合物，作为试剂盒的一部分，试剂盒包括给予患者该组合物的一次性装置。可以标明容器或试剂盒在环境室温下储存或在冷冻温度下储存。
按照一个实施方案，提供了调节胰岛素依赖性患者的血（葡萄）糖水平的改进的方法。该方法包括给予用于控制糖尿病的、治疗有效数量的本公开的A19胰岛素类似物的步骤。在一个实施方案中，用具有选自大约5,000至大约40,000道尔顿范围的分子量的PEG链将A19胰岛素类似物PEG化。
附图的简要说明
图1是制备人胰岛素的两步合成策略的图解概述。详细过程提供于实施例1中，步骤a试剂包括：2,2'-二硫基二(5-硝基吡啶)，DMSO，在室温下；步骤b试剂包括：胰岛素A(6、11和20位的Acm，和7位的SH)，DMSO，在室温下；步骤c试剂I2，80% AcOH。
图2是相对于纯天然胰岛素来比较合成人胰岛素与胰岛素受体的特异性结合的曲线。 结果表明，两种分子具有类似的结合活性。
图3是比较天然胰岛素和A19胰岛素类似物(胰岛素(p-NH2-F)19)的相对胰岛素受体结合的曲线。
详细说明
定义
在描述和主张本发明的过程中，按照下面列出的定义使用下列术语。
本文使用的术语“前体药物”定义为：进行化学修饰而后显示出药理学效果的任何化合物。
“生理活性多肽”是指能够产生体外和/或体内生物效果的多肽。
没有规定立体化学的氨基酸的符号包括氨基酸的L或D形式或外消旋混合物。
本文使用的术语“可药用载体”包括任何标准药物载体，例如，磷酸盐缓冲盐水溶液，水，乳状液，例如油/水或水/油乳化液，和各种类型的湿润剂。该术语还包括美国联邦政府的管理机构批准的任何试剂，或列于美国药典中用于动物(包括人)的任何试剂。
本文使用的术语“可药用盐”是指保持母体化合物的生物活性的化合物的盐，并且其不是生物学或其它方面不合需要的。由于存在氨基和/或羧基或与其类似的基团，本文公开的许多化合物能够形成酸和/或碱盐。
可药用碱加成盐可以由无机和有机碱制备。衍生自无机碱的盐包括例如钠、钾、锂、铵、钙和镁盐。衍生自有机碱的盐包括但不局限于伯、仲和叔胺的盐。
可药用酸加成盐可以由无机和有机酸制备。衍生自无机酸的盐包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸的盐，等等。衍生自有机酸的盐包括乙酸，丙酸，羟基乙酸，丙酮酸，草酸，苹果酸，丙二酸，琥珀酸，马来酸，富马酸，酒石酸，枸橼酸，苯甲酸，肉桂酸，扁桃酸，甲磺酸，乙磺酸，对甲苯磺酸，水杨酸的盐，等等。
本文使用的术语“治疗”包括预防具体障碍或病症，或减轻与具体障碍或病症有关的症状，和/或预防或消除所述症状。例如，本文使用的术语“治疗糖尿病”通常是指保持葡萄糖血液水平接近正常水平，并且可以包括提高或降低血糖水平(根据特定环境)。
本文使用的胰岛素类似物的“有效”量或“治疗有效量”是指非毒性的但足以提供预期效果的胰岛素类似物的量。例如，一个预期效果是预防或治疗高血糖症。“有效”的量将根据患者的不同而改变，取决于个体的年龄和一般条件、给药模式，等等。由此，并不总是能够规定确切的“有效量”。然而，在任何个体病例中，合适的“有效”量可以由本领域普通技术人员使用常规实验来确定。
术语“肠胃外”是指不通过消化道但通过其它途径，例如鼻内，吸入，皮下，肌内，脊柱内或静脉内。
本文使用的术语“胰岛素肽”是通用术语，其表示包括SEQ ID NO : 1的A链和SEQ ID NO : 2的B链的51个氨基酸杂二聚体，以及其单链胰岛素类似物(包括，例如，公开在公开的国际申请WO96/34882和美国专利US 6,630,348中的那些，将其公开内容结合到本文中作为参考)，包括包含天然A链和/或B链的修饰衍生物的杂二聚体和单链类似物，包括在A19、B16或B25位将氨基酸修饰为4-氨基苯丙氨酸，或在选自下列的位置将一个或多个氨基酸替代：A5，A8，A9，A10，A12，A14，A15，A17，A18，A21，B1，B2，B3，B4，B5，B9，B10，B13，B14，B17，B20，B21，B22，B23，B26，B27，B28，B29和B30，或在B1-4和B26-30任何或所有位置上的缺失。
本文使用的术语“单链胰岛素类似物”包括一组结构上相关的蛋白，其中胰岛素A和B链通过多肽连接基共价连接。
本文使用的“A19 A链类似物”表示氨基酸，包括SEQ ID NO∶6的A链和SEQ ID NO∶6的修饰衍生物，其包括在选自A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、A21的位置处的一个或多个氨基酸替换。
“A19胰岛素类似物”是在天然胰岛素A链的19位将天然酪氨酸残基替换为4-氨基苯丙氨酸或4-甲氧基苯丙氨酸的胰岛素肽。
本文使用的氨基酸“修饰”是指氨基酸的替换，或通过在氨基酸上添加和/或从氨基酸中除去化学基团而进行的氨基酸的衍生，并且包括对通常存在于人蛋白中的任何20个氨基酸以及非典型性的或非天然存在的氨基酸的替换。非典型性氨基酸的商业渠道包括：Sigma-Aldrich(Milwaukee，WI)，ChemPep Inc.(Miami，FL)和Genzyme Pharmaceuticals(Cambridge，MA)。非典型性的氨基酸可以购买于商业供应商、合成脱氮(de novo)或化学修饰或由天然存在的氨基酸衍生。
本文使用的氨基酸“替换”是指用不同的氨基酸残基替代一个氨基酸残基。在整个申请中，用字母和数字(例如A5位)提及的具体氨基酸位置指的是在相应的天然人胰岛素A链(SEQ ID NO∶1)或B链(SEQ ID NO∶2)中的A链(例如A5位)或B链(例如B5位)在该位置的氨基酸，或其任何类似物中的相应的氨基酸位置。例如，本文谈到的没有(absent)更进一步加工的“B28位”是指胰岛素类似物的B链的相应的B27位，其中SEQ ID NO∶2的第一个氨基酸缺失。
本文使用的术语“保守氨基酸替代”本文定义为：在下列五组中的一组之内进行交换∶
I.    小的脂肪族、非极性或稍微极性的残基∶
Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;
II.  极性、带负电荷的残基和它们的酰胺∶
Asp, Asn, Glu, Gln;
III.  极性、带正电荷的残基∶
His, Arg, Lys; 鸟氨酸(Orn)
IV.  大的脂肪族非极性残基∶
Met, Leu, Ile, Val, Cys, 正亮氨酸(Nle), 高半胱氨酸
V.   大的芳烃残基∶
Phe, Tyr, Trp, 乙酰基苯丙氨酸
本文使用的通用术语“聚乙二醇链”或“PEG链”是指支链或直链形式的氧化乙烯和水的缩合聚合物的混合物，由通式H(OCH2CH2)nOH代表，其中n至少为9。 没有更进一步表征，该术语包括乙二醇的聚合物，具有选自500至80,000道尔顿范围的平均总分子量。“聚乙二醇链”或“PEG链”与数字后缀组合使用，表示其大约的平均分子量。例如，PEG-5,000是指具有大约5,000道尔顿的总平均分子量的聚乙二醇链。
本文使用的术语“PEG化的”和类似的术语是指通过将聚乙二醇链与化合物连接而修饰其天然状态的化合物。“PEG化的多肽”是具有与多肽共价结合的PEG链的多肽。
本文使用的“连接基”是结合两个相互分离单元的键、分子或分子的基团。连接基可以给两个单元提供最佳间隔，或可以进一步提供使两个单元彼此分开的不稳定的连接基。不稳定的连接基包括光可裂解的基团，酸不稳定的部分，碱不稳定的部分和酶可裂解的基团。
本文使用的“二聚体”是包括通过连接基相互共价结合的两个子单元的复合物。当没有使用任何定性语言时，术语二聚体包括同型二聚体和杂二聚体。同型二聚体包括两个相同的子单元，而杂二聚体包括两个不同的子单元，尽管两个子单元基本上相互类似。
本文使用的术语“C1-Cn烷基”，其中n可以是1至6，代表具有一个至规定数目碳原子的支链或直链烷基。典型的C1-C6烷基包括但不局限于：甲基，乙基，正丙基，异丙基，丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，戊基，己基等等。
本文使用的术语“C2-Cn烯基”，其中n可以是2至6，代表具有2至规定数目碳原子和至少一个双键的烯属不饱和支链或直链基团。这种基团的实例包括但不局限于：1-丙烯基，2-丙烯基(-CH2-CH=CH2)，1,3-丁二烯基，(-CH=CHCH=CH2)，1-丁烯基(-CH=CHCH2CH3)，己烯基，戊烯基，等等。
术语“C2-Cn炔基”，其中n可以是2至6，是指具有2至n个碳原子和至少一个三键的不饱和支链或直链基团。这种基团的实例包括但不局限于：1-丙炔基，2-丙炔基，1-丁炔基，2-丁炔基，1-戊炔基，等等。
本文使用的术语“芳基”是指具有一或两个芳香环的单或双环碳环系统，包括但不限于：苯基，萘基，四氢萘基，茚满基，茚基，等等。芳基环的大小和存在的取代基或连接基团由所提供的指定的碳数目来表示。例如，术语“(C1-C3烷基)(C6-C10芳基)”是指通过一至三元烷基链连接至母体部分的5至10元芳基。
本文使用的术语“杂芳基”是指含有一或两个芳香环和在芳香环中含有至少一个氮、氧或硫原子的单或双环系统。杂芳基环的大小和存在的取代基或连接基团由所指定的存在的碳数目来表示。例如，术语“(C1-Cn烷基)(C5-C6杂芳基)”是指通过一至“n”元烷基链连接至母体部分的5或6元杂芳基。
本文使用的术语“患者”(没有其它指称)包括任何温血脊椎驯养动物(包括，例如但不局限于：家畜，马，猫，狗及其它宠物)和人。
实施方案
本公开涉及胰岛素类似物，相对于天然胰岛素，其可以对胰岛素和/或IGF-1受体保持高活性。在一个实施方案中，该胰岛素类似物包括对存在于天然胰岛素A链的19位的酪氨酸残基的修饰，其中该类似物保持天然胰岛素的活性。这种类似物本文指的是“A19胰岛素类似物”。相对于天然胰岛素肽，A19胰岛素类似物可以包括额外的修饰，其中，相对于天然胰岛素，该胰岛素类似物对胰岛素受体显示出70%、80%、90%、95%、100%或更大的活性。
在一个实施方案中，制备胰岛素类似物，其中在不损失效价的情况下、在胰岛素的活性位点内将一个氨基插入到肽中。更特别地，在不损失胰岛素肽的效价的情况下，用4-氨基苯丙氨酸部分选择性地替代在A链的19位处的天然酪氨酸是可以被接受的。随后用前体药物部分将活性位点氨基化学酰胺化，可以显著地减小活性，并由此提供合适的胰岛素的前体药物。
在一个实施方案中，A19胰岛素类似物包含相对于天然胰岛素在下列位置上的一个或多个附加的氨基酸替换：A5，A8，A9，A10，A14，A15，A17，A18，A21，B1，B2，B3，B4，B5，B9，B10，B13，B14，B17，B20，B22，B23，B26，B27，B28，B29和B30，在一个实施方案中，那些氨基酸的替换是保守氨基酸的替换。在这些位置的合适的氨基酸替换(其不会不利地影响胰岛素的目标活性)对于本领域技术人员来说是已知的，例如，Mayer等人在Insulin Structure and Function，Biopolymers. 2007;88(5):687-713中所示范的那些，本文结合其公开内容作为参考。
在一个实施方案中，A19胰岛素类似物包括氨基或甲氧基的替换，其替代天然酪氨酸残基的芳香环上所存在的羟基，并且进一步包括1至15个、1至10个、1至8个、1至5个或1至3个在选自下列位置的氨基酸的替换：A5，A8，A9，A10，A14，A15，A17，A18，B1，B2，B3，B4，B5，B13，B14，B17，B20，B22，B23，B26，B27，B28，B29和B30。 在一个实施方案中，A19胰岛素类似物包括1至10个、1至8个、1至5个或1至3个在选自下列的位置上的氨基酸的替换：A5，A8，A9，A10，A14，A15，A17，A18，B1，B2，B3，B4，B5，B13，B14，B17，B20，B22，B23，B26，B27，B28，B29和B30，其中相对于天然胰岛素序列，通过从天然胰岛素B肽的B1-4和B26-30位置除去一个或多个氨基酸，进一步修饰该类似物。 在另一个实施方案中，A19胰岛素类似物包括1至8个、1至5个或1至3个在选自下列位置的氨基酸的替换：A5，A8，A9，A10，A14，A15，A17，A18，B1，B2，B3，B4，B5，B13，B14，B17，B20，B22，B23，B26，B27，B28，B29和B30，并且相对于天然胰岛素序列，通过除去氨基酸B1-4和/或B26-30，进一步修饰该类似物。
在一个实施方案中，A19胰岛素包括用氨基或甲氧基替换存在于天然酪氨酸残基的芳香环上的羟基，并且进一步包括在A8位处用选自组氨酸、精氨酸和赖氨酸的氨基酸进行的氨基酸的替换(相对于天然胰岛素肽)。在进一步实施方案中，B10处的氨基酸是选自天门冬氨酸、谷氨酸、高谷氨酸、高磺基丙氨酸和磺基丙氨酸的氨基酸。在一个实施方案中，A19胰岛素类似物包括用氨基或甲氧基替换存在于天然酪氨酸残基的芳香环上的羟基，并且进一步包括在选自A8和B28-30位置的氨基酸的氨基酸替换(相对于天然胰岛素肽)。
按照一个实施方案，提供了胰岛素类似物，其包括A链多肽，该多肽包括序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO∶3)，其中
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2是下列通用结构的氨基酸
,
其中R4是NH2或OCH3；和
X3是天门冬酰胺，甘氨酸，丙氨酸，苏氨酸或丝氨酸，或其类似物，包括不同于SEQ ID NO : 3的序列，在选自A5、A8、A9、A10、A14、A15、A17、A18的位置具有1至9个、1至5个或1至3个氨基酸修饰。 在一个实施方案中，R4是NH2。在进一步实施方案中，X1是苏氨酸，X3是天门冬酰胺，R4是NH2。
更尤其是，在一个实施方案中，提供了A19胰岛素类似物，其包括GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO∶3)的A链序列和包括X4LCGX5X6LVEALYLVCG ERGFF(SEQ ID NO∶4)序列的B链序列，其中
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2是下列通用结构的氨基酸
Figure 938092DEST_PATH_IMAGE001
,
其中R4是NH2或OCH3；
X3是天门冬酰胺或甘氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸，天门冬氨酸，谷氨酸，高磺基丙氨酸和磺基丙氨酸，或其类似物，其中SEQ ID NO∶3和/或SEQ ID NO∶4由于1至3个氨基酸修饰而独立地不同于相应的SEQ ID NO∶3和/或SEQ ID NO∶4序列，修饰的位置选自位置A5，A8，A9，A10，A14，A15，A17，A18，A5，A8，A9，A10，A12，A14，A15，A17，A18，B1，B2，B3，B4，B5，B13，B14，B17，B20，B22，B23，B26，B27，B28，B29和B30。
在另一个实施方案中，提供了A19胰岛素类似物，其包括GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO∶3)的A链序列和包括X11VNQX4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFFYTX9 X10(SEQ ID NO∶5)序列的B链序列，其中
X1选自苏氨酸，组氨酸，精氨酸和赖氨酸；
X2是下列通用结构的氨基酸
Figure 752464DEST_PATH_IMAGE003
,
X3是天门冬酰胺或甘氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸，天门冬氨酸，谷氨酸，高磺基丙氨酸和磺基丙氨酸；
X9是天门冬氨酸（aspartate)-赖氨酸，赖氨酸-脯氨酸二肽，或脯氨酸-赖氨酸二肽；
X10是苏氨酸或苏氨酸-精氨酸-精氨酸三肽；
X11选自苯丙氨酸和去氨基-苯丙氨酸。在一个实施方案中，B链序列包括序列HLCGSHLVEALYLVCGERGFF(SEQ ID NO∶7)，在进一步实施方案中，B链选自FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ ID NO∶8)、FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT(SEQ ID NO∶9)和FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRR(SEQ ID NO∶10)。在进一步实施方案中，提供了A19胰岛素类似物，其包括GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO∶3)的A链序列和包括选自SEQ ID NO∶7、SEQ ID NO∶8和SEQ ID NO∶9序列的B链序列，其中X1选自苏氨酸和组氨酸，X2是下列通用结构的氨基酸：
Figure 637243DEST_PATH_IMAGE003
, X3是天门冬酰胺，在一个实施方案中，X1是苏氨酸，X2是4-氨基苯丙氨酸，X3是天门冬酰胺。
在一个实施方案中，提供了A19胰岛素类似物，其包括GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO∶3)的A链序列和包括FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ ID NO∶8)或FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT(SEQ ID NO∶9)序列的B链序列，其中
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2是下列通用结构的氨基酸
Figure 904276DEST_PATH_IMAGE001
,
其中R4是NH2或OCH3；和
X3是天门冬酰胺或甘氨酸； 在进一步实施方案中，R4是NH2，X3是天门冬酰胺，在一个实施方案中，R4是NH2，X1是苏氨酸，X3是天门冬酰胺。
按照一个实施方案，提供了单链胰岛素类似物，其中A19氨基酸被下列通用结构的氨基酸替代：
Figure 103177DEST_PATH_IMAGE001
,
其中R4是NH2或OCH3。按照一个实施方案，单链胰岛素类似物包括式B-P-A19的化合物，其中∶B代表胰岛素的B-链或其功能性类似物，A19代表本文公开的A19 A链类似物，P代表连接基，包括肽连接基，其共价连接A链的氨基-末端与B链的羧基-末端。在一个实施方案中，连接基是大约5至大约18个、或大约10至大约14个、或大约4至大约8个或大约6个氨基酸的肽连接基。
在一个实施方案中，单链胰岛素类似物包括式B-P-A19的化合物，其中∶
B代表包括X4LCGX5X6LVEALYLVCG ERGFF(SEQ ID NO∶4)的序列的B链序列；
A19代表包括GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO∶3)的序列的A链序列；和
P代表4至8个氨基酸的肽连接基，进一步的，其中
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2是下列通用结构的氨基酸
Figure 335837DEST_PATH_IMAGE001
,
其中R4是NH2或OCH3；
X3是天门冬酰胺或甘氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸，天门冬氨酸，谷氨酸，高磺基丙氨酸和磺基丙氨酸。按照一个实施方案，肽连接基是5至18个氨基酸长度，并且包括选自下列的序列∶Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO: 11)，Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr(SEQ ID NO: 12)，Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO: 21)，Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO: 13)，Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO: 14)，Gly-Gly-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO: 15)，Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO: 16)，Gly-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO: 17)，Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO: 18)，Gly-Gly-His-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO: 19)和Arg-Arg-His-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO: 20)。
在一个实施方案中，肽连接基包括选自下列的序列：AGRGSGK(SEQ ID NO: 24)，AGLGSGK(SEQ ID NO: 25)，AGMGSGK(SEQ ID NO: 26)，ASWGSGK(SEQ ID NO: 27)，TGLGSGQ(SEQ ID NO: 28)，TGLGRGK(SEQ ID NO: 29)，TGLGSGK(SEQ ID NO: 30)，HGLYSGK(SEQ ID NO: 31)，KGLGSGQ(SEQ ID NO: 32)，VGLMSGK(SEQ ID NO: 33)，VGLSSGQ(SEQ ID NO: 34)，VGLYSGK(SEQ ID NO: 35)，VGLSSGK(SEQ ID NO: 36)，VGMSSGK(SEQ ID NO: 37)，VWSSSGK(SEQ ID NO: 38)，VGSSSGK(SEQ ID NO: 39)，VGMSSGK(SEQ ID NO: 40)，TGLGSGR(SEQ ID NO: 41)，TGLGKGQ(SEQ ID NO: 42)，KGLSSGQ(SEQ ID NO: 43)，VKLSSGQ(SEQ ID NO: 44)，VGLKSGQ(SEQ ID NO: 45)，TGLGKGQ(SEQ ID NO: 46)和VGLSKGQ(SEQ ID NO: 47)。在一个实施方案中，肽连接基是7至12个氨基酸长度，并且包括序列Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO: 11)或Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr(SEQ ID NO: 12)。
在一个实施方案中，单链胰岛素类似物具有氨基酸序列∶
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Xaa-Cys-Asn(SEQ ID NO: 23)，其中Xaa是下列通用结构的氨基酸
Figure 329201DEST_PATH_IMAGE001
,
其中R4是NH2或OCH3。
可以进一步修饰本文公开的A19胰岛素类似物，以便提高肽在生理pH值下、在水溶液中的溶解度，同时通过防止肽的肾清除而提高肽的有效期间。肽容易清除，这是由于：当相比于血浆蛋白时，它们分子大小相对更小。肽的分子量提高至40 kDa以上，超过肾阈，并且显著地延长在血浆中的持续期间。相应地，在一个实施方案中，进一步修饰A19胰岛素类似物，以便包括共价连接的亲水性部分。在一个实施方案中，亲水性部分是血浆蛋白、聚乙烯链或免疫球蛋白的Fc部分。因此，在一个实施方案中，进一步修饰本公开的A19胰岛素类似物，以便包括一个或多个与氨基酸侧链共价连接的亲水基。
按照一个实施方案，如下修饰本文公开的A19胰岛素类似物：将亲水性部分连接至B链的N端氨基酸或位于B链的羧基末端的赖氨酸氨基酸的侧链，包括，例如，在SEQ ID NO∶9的28位或在SEQ ID NO∶8的29位。在一个实施方案中，提供了单链胰岛素类似物，其中肽连接基的一个氨基酸通过将亲水性部分连接至肽连接基的侧链而得到修饰。在一个实施方案中，修饰的氨基酸是半胱氨酸、赖氨酸或乙酰基苯丙氨酸。在一个实施方案中，肽连接基选自：TGLGSGQ(SEQ ID NO:28)，VGLSSGQ(SEQ ID NO:34)，VGLSSGK(SEQ ID NO:36)，TGLGSGR(SEQ ID NO: 41)，TGLGKGQ(SEQ ID NO: 42)，KGLSSGQ(SEQ ID NO: 43)，VKLSSGQ(SEQ ID NO: 44)，VGLKSGQ(SEQ ID NO: 45)，TGLGKGQ(SEQ ID NO: 46)和VGLSKGQ(SEQ ID NO: 47)，并且亲水性部分(例如，聚乙二醇)与肽连接基的赖氨酸侧链连接。在另一个实施方案中，通过将修饰的氨基酸加至A19胰岛素类似物的B链的羧基末端，进一步修饰本文公开的A19胰岛素类似物，其中修饰加到C-末端的氨基酸，以便包括与氨基酸连接的亲水性部分。在一个实施方案中，加到C-末端的氨基酸是修饰的半胱氨酸、赖氨酸或乙酰基苯丙氨酸。在一个实施方案中，亲水性部分选自血浆蛋白、聚氧化乙烯链和免疫球蛋白的Fc部分。
在一个实施方案中，亲水基是聚氧化乙烯链，在一个实施方案中，两个或多个聚氧化乙烯链与A19胰岛素类似物的两个或多个氨基酸侧链共价连接。按照一个实施方案，亲水性部分与本文公开的A19胰岛素类似物的氨基酸侧链在选自下列的位置共价连接：A9，A14，A15，B22，B28，B29和B链的C-末端或N-末端。对于具有多个聚氧化乙烯链的A19胰岛素类似物，聚氧化乙烯链可以连接在B链的N端氨基酸或位于B链羧基末端的赖氨酸氨基酸的侧链上，或在肽的C-末端加上单个氨基酸，其中加上的氨基酸具有与它的侧链连接的聚氧化乙烯链。
按照一个实施方案，本文公开的A19胰岛素类似物通过氨基酸的替换被进一步地修饰，其中替换氨基酸包括适合于与亲水性部分(包括例如，聚乙二醇)交联的侧链。在一个实施方案中，在A19胰岛素类似物的位置（其要连接亲水性部分）的氨基酸被天然或合成氨基酸替代(或在C-末端加入)，以便引入(或容易连接)亲水性部分。例如，在一个实施方案中，在选自A5、A8、A9、A10、A12、A14、A15、A17、A18、B1、B2、B3、B4、B5、B13、B14、B17、B21、B22、B26、B27、B28、B29和B30位置的天然氨基酸被赖氨酸、半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸残基替代(或将赖氨酸、半胱氨酸或乙酰基苯丙氨酸残基加到C-末端上)，以便共价连接聚氧化乙烯链。
在一个实施方案中，A19胰岛素类似物具有加到B链的氨基或羧基末端上的单一半胱氨酸残基，或A19胰岛素类似物被至少一个半胱氨酸残基取代，其中用硫醇反应性试剂(包括，例如，马来酰亚胺基，乙烯砜，2-吡啶基硫基，卤代烷基和卤代酰基)进一步修饰半胱氨酸残基的侧链。这些硫醇反应性试剂可以含有羧基、酮基、羟基和醚基团以及其它亲水性部分，例如聚乙二醇单元。在另一个实施方案中，A19胰岛素类似物具有加到B链的羧基末端上的单一赖氨酸残基，或A19胰岛素类似物被赖氨酸取代，并且使用胺反应性试剂(例如，羧酸的活性酯(琥铂酰亚胺基，酸酐，等等))或亲水性部分例如聚乙二醇的醛进一步修饰替代赖氨酸残基的侧链。
在那些实施方案中，如果A19胰岛素类似物包括聚乙二醇链，则聚乙烯链可以是直链形式，或它可以是支链形式。按照一个实施方案，聚乙二醇链具有选自大约20,000至大约60,000道尔顿范围的平均分子量。多个聚乙二醇链可以连接于A19胰岛素类似物，以便提供具有最佳溶解度和血液清除性能的A19胰岛素类似物。在一个实施方案中，A19胰岛素类似物连接单个聚乙二醇链，该聚乙二醇链具有选自大约20,000至大约60,000道尔顿范围的平均分子量。在另一个实施方案中，A19胰岛素类似物连接两个聚乙二醇链，其中两个链的合并平均分子量选自大约40,000至大约80,000道尔顿的范围。在一个实施方案中，具有20,000或60,000道尔顿的平均分子量的单个聚乙二醇链与A19胰岛素类似物连接。在另一个实施方案中，单个聚乙二醇链与A19胰岛素类似物连接，并且具有选自大约40,000至大约50,000道尔顿范围的平均分子量。在一个实施方案中，两个聚乙二醇链与A19胰岛素类似物连接，其中第一和第二个聚乙二醇链各自具有20,000道尔顿的平均分子量。在另一个实施方案中，两个聚乙二醇链与A19胰岛素类似物连接，其中第一和第二个聚乙二醇链各自具有40,000道尔顿的平均分子量。
在进一步实施方案中，提供了包括两个或多个与肽共价结合的聚乙二醇链的A19胰岛素类似物，其中聚乙二醇链的总分子量大约为40,000至大约60,000道尔顿。在一个实施方案中，PEG化的A19胰岛素类似物包括与一个或多个氨基酸连接的聚乙二醇链，连接位置选自B链的N-末端和/或SEQ ID NO∶9的28位或SEQ ID NO∶8的29位，其中PEG链的合并分子量大约为40,000至大约80,000道尔顿。
按照一个实施方案，提供了A19胰岛素类似物，其中血浆蛋白与肽的氨基酸侧链共价连接，以便提高A19胰岛素类似物的溶解度、稳定性和/或药物动力学。例如，血清白蛋白可以与本文提供的A19胰岛素类似物共价结合。血浆蛋白可以连接至B链的N-末端或A或B链的C-末端。在一个实施方案中，血浆蛋白与B链的N-末端和/或与相当于SEQ ID NO∶9的28位的氨基酸或在SEQ ID NO∶8的29位共价结合。
按照一个实施方案，提供了A19胰岛素类似物，其中代表免疫球蛋白分子的Fc部分的直链氨基酸序列与公开的A19胰岛素类似物的氨基酸侧链共价连接。利用Fc部分的连接可以提高A19胰岛素类似物的溶解度、稳定性和/或药物动力学。Fc部分可以连接至B链的N-末端或A或B链的C-末端。例如，代表免疫球蛋白分子的Fc部分的氨基酸序列可以与B链的C-末端共价结合，包括，例如，在相当于SEQ ID NO∶9的28位或在SEQ ID NO∶8的29位的氨基酸的连接。该Fc部分通常是从IgG中分离的Fc部分，但得自于任何免疫球蛋白的Fc肽片段应该起到等效作用。
在本发明的一个具体方面，通过直接酰化A19胰岛素类似物的氨基酸侧链的胺、羟基或硫醇，修饰A19胰岛素类似物，以便包括酰基。在一些实施方案中，通过氨基酸的侧链胺、羟基或硫醇，直接酰化A19胰岛素类似物。在一些实施方案中，在一个或多个选自A9、A14、A15、B22、B28或B29的位置进行酰化。在这方面，酰化的A19胰岛素类似物可以包括SEQ ID NO∶3的A链氨基酸序列和SEQ ID NO∶5的B链，或在A9、A14、A15、B22、B28或B29位的至少一个氨基酸被修饰为任何氨基酸(包括侧链胺、羟基或硫醇)的修饰的SEQ ID NO∶3和/或SEQ ID NO∶5的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，通过B28或B29位的氨基酸的侧链胺、羟基或硫醇，进行A19胰岛素类似物的直接酰化。 在一个进一步实施方案中，A19胰岛素类似物包括具有1-24个碳原子的羧酸的酰基，其与存在于B28或B29位的Lys的ε-氨基结合。
在一个实施方案中，提供了通式B-P-A19的单链胰岛素类似物，其中修饰肽连接基的一个氨基酸，以便通过直接酰化肽连接基的氨基酸侧链的胺、羟基或硫醇而包括酰基。按照一个实施方案，单链胰岛素类似物的肽连接基选自：AGRGSGK(SEQ ID NO: 24)，AGLGSGK(SEQ ID NO: 25)，AGMGSGK(SEQ ID NO: 26)，ASWGSGK(SEQ ID NO: 27)，TGLGSGQ(SEQ ID NO: 28)，TGLGRGK(SEQ ID NO: 29)，TGLGSGK(SEQ ID NO: 30)，HGLYSGK(SEQ ID NO: 31)，KGLGSGQ(SEQ ID NO: 32)，VGLMSGK(SEQ ID NO: 33)，VGLSSGQ(SEQ ID NO: 34)，VGLYSGK(SEQ ID NO: 35)，VGLSSGK(SEQ ID NO: 36)，VGMSSGK(SEQ ID NO: 37)，VWSSSGK(SEQ ID NO: 38)，VGSSSGK(SEQ ID NO: 39)，VGMSSGK(SEQ ID NO: 40)，TGLGSGR(SEQ ID NO: 41)，TGLGKGQ(SEQ ID NO: 42)，KGLSSGQ(SEQ ID NO: 43)，VKLSSGQ(SEQ ID NO: 44)，VGLKSGQ(SEQ ID NO: 45)，TGLGKGQ(SEQ ID NO: 46)和VGLSKGQ(SEQ ID NO: 47)，其中A-链、B-链或连接肽中的至少一个赖氨酸残基通过酰化而被化学修饰。在一个实施方案中，酰化基团包括1-5、10-12或12-24个碳的链。
本公开还包括其它共轭物，其中任选通过共价键连接本发明的A19胰岛素类似物，并且任选通过连接基与共轭物连接。连接可以通过共价化学键、物理力(例如静电)、氢、离子、van der Waals或疏水或亲水作用实现。可以使用各种非共价偶合系统，包括生物素-卵白素，配体/受体，酶/基质，核酸/核酸结合蛋白，脂质/脂质结合蛋白，细胞粘附分子伴侣(partners)；或彼此具有亲合性的其任何结合伴侣或片段。
通过肽的靶向氨基酸残基与能够与所选择的侧链或这些靶向氨基酸的N-或C-末端残基反应的有机衍生化试剂的反应，本公开的A19胰岛素类似物可以通过直接共价键连接而连接共轭物部分。肽或共轭物部分上的反应基团包括，例如，醛，氨基，酯，硫醇，α-卤代乙酰基，马来酰亚胺基或肼基。衍生化试剂包括，例如，马来酰亚胺基苯甲酰基硫代琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基共轭)，N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)，戊二醛，琥珀酸酐或本领域已知的其它试剂。或者，共轭物部分可以间接地通过连接基或中间载体(例如多糖或多肽载体)与肽连接。多糖载体的实例包括氨基葡聚糖。合适多肽载体的实例包括聚赖氨酸，聚谷氨酸，聚天门冬氨酸，其共聚物和这些氨基酸与其它的(例如丝氨酸)的混合聚合物等等，以便在得到的荷载载体上赋予合乎需要的溶解性能。
示范性的共轭物部分包括但不局限于：异源的肽或多肽(包括，例如血浆蛋白)，靶向试剂，免疫球蛋白或其一部分(例如变量区域，CDR或Fc区域)，诊断标记物，例如放射性同位素、荧光团或酶催标记物，聚合物，包括水溶性的聚合物，或其它治疗或诊断试剂。在一个实施方案中，提供了共轭物，其包括本公开的A19胰岛素类似物和血浆蛋白，其中血浆蛋白选自白蛋白、转铁蛋白和纤维蛋白原。在一个实施方案中，共轭物的血浆蛋白部分是白蛋白或转铁蛋白。在一些实施方案中，A19胰岛素类似物通过连接基与共轭物部分结合，其中连接基包括1至大约60个原子的链，或1至30个原子或更长，2至5个原子，2至10个原子，5至10个原子或10至20个原子长度。在一些实施方案中，链原子都是碳原子。在一些实施方案中，连接基的主链中的链原子选自C、O、N和S。可以按照预期的溶解度(亲水性)来选择链原子和连接基，以便提供更可溶的共轭物。在一些实施方案中，连接基提供可通过存在于靶组织或器官或细胞中的酶或其它催化剂或水解条件而裂解的官能团。在一些实施方案中，连接基的长度足够降低空间位阻的效能。如果连接基是共价键或肽基键并且共轭物是多肽，则整个共轭物可以是融合蛋白。这种肽基连接基可以具有任何长度。示范性的连接基长度上具有大约1至50个氨基酸，5至50个、3至5个、5至10个、5至15个或10至30个氨基酸长度。利用本领域普通技术人员已知的重组体遗传工程方法，可以另外制备这种融合蛋白。
认为公开的A19胰岛素类似物适合于对先前胰岛素肽所描述的任何用途。相应地，本文所描述的A19胰岛素类似物可用于治疗高血糖症，或治疗由高血糖水平产生的其它新陈代谢病。相应地，本发明包括药物组合物，其包含本公开的A19胰岛素类似物和可药用载体，用于治疗患有高血糖水平的患者。按照一个实施方案，使用本文所公开的A19胰岛素类似物治疗的患者是驯养动物，在另一个实施方案中，治疗的患者是人。
按照本公开，治疗高血糖症的一个方法包括下列步骤：使用任何标准给药途径，包括胃肠外，例如静脉内、腹膜内、皮下或肌肉内、鞘内、透皮、直肠、口服、经鼻或吸入途径，给予患者本公开的A19胰岛素类似物。在一个实施方案中，皮下或肌肉内给予组合物。在一个实施方案中，胃肠外给予组合物，并且A19胰岛素类似物组合物预填在注射器中。
可以单独给予本发明的A19胰岛素类似物，或与其它抗糖尿病药剂组合给予。本领域已知的或在研究中的抗糖尿病药剂包括：天然胰岛素，天然胰高血糖素和其功能性的衍生物，磺酰脲，例如甲苯磺丁脲(Orinase)，醋酸己脲(Dymelor)，甲磺吖庚脲(Tolinase)，氯磺丙脲(Diabinese)，格列甲嗪(Glucotrol)，优降糖(Diabeta，Micronase，Glynase)，格列美脲(Amaryl)或格列齐特(Diamicron)；美格替耐类，例如瑞格列奈(Prandin)或那格列萘(Starlix)；双缩胍，例如二甲双胍(Glucophage)或苯乙双胍；噻唑烷二酮，例如罗格列酮(Avandia)，吡格列酮(Actos)或曲格列酮(Rezulin)，或其它PPARγ抑制剂；抑制碳水化合物消化的麦芽糖酶抑制剂，例如米格列醇(Glyset)，阿卡波糖(Precose/Glucobay)；艾塞那肽(exenatide)(Byetta)或普兰林肽；二肽基肽酶-4(DPP-4抑制剂，例如维格列汀(vildagliptin)或西他列汀(sitagliptin)；SGLT(钠依赖性葡萄糖转运体1)抑制剂；或FBPase(果糖1,6-二磷酸酶)抑制剂。
可以配制包含本文公开的A19胰岛素类似物的药物组合物，并可使用本领域技术人员已知的标准可药用载体和给药途径将组合物给予患者。相应地，本公开还包括药物组合物，在组合物中包含一种或多种本文公开的A19胰岛素类似物或其可药用盐与可药用载体结合。在一个实施方案中，在大约4.0至大约7.0的pH值下，在磷酸盐缓冲系统中，药物组合物包含1mg/ml浓度的A19胰岛素类似物。药物组合物可以包含A19胰岛素类似物作为唯一的药学活性组分，或A19胰岛素类似物可以与一种或多种额外活性剂组合。按照一个实施方案，提供了药物组合物，其包含一种本文公开的A19胰岛素类似物和可药用稀释剂、载体或赋形剂，优选，该胰岛素类似物是无菌的，并且优选其纯度水平至少为90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%。这种组合物可以含有A19胰岛素类似物，其中得到的活性肽的存在浓度至少为0.5 mg/ml，1 mg/ml，2 mg/ml，3 mg/ml，4 mg/ml，5 mg/ml，6 mg/ml，7 mg/ml，8 mg/ml，9 mg/ml，10 mg/ml，11 mg/ml，12 mg/ml，13 mg/ml，14 mg/ml，15 mg/ml，16 mg/ml，17 mg/ml，18 mg/ml，19 mg/ml，20 mg/ml，21 mg/ml，22 mg/ml，23 mg/ml，24 mg/ml，25 mg/ml或更高。在一个实施方案中，药物组合物包含消毒的水溶液，并且任选保存在各种容器之内。
按照一个实施方案，可以使用本发明的化合物来制备预先配制的溶液，准备好进行注射。在其它实施方案中，药物组合物包含冷冻干燥粉末。可以进一步包装药物组合物，作为试剂盒的一部分，试剂盒包括给予患者该组合物的一次性装置。可以标明容器或试剂盒在环境室温下储存或在冷冻温度下储存。
本文所描述的所有治疗方法、药物组合物、试剂盒及其它类似的实施方案预期：A19胰岛素类似物包括所有的其可药用盐。
在一个实施方案中，试剂盒具备给予患者A19胰岛素类似物组合物的装置。试剂盒可以进一步包括各种容器，例如，管形瓶，管，瓶，等等。优选，试剂盒还包括使用说明书。按照一个实施方案，试剂盒的装置是气雾剂分配装置，其中组合物预填在气雾剂装置内。在另一个实施方案中，试剂盒包括注射器和针头，在一个实施方案中，胰岛素类似物组合物预填在注射器之内。
可以利用标准合成方法、重组DNA技术或制备肽和融合蛋白的任何其它方法来制备本发明的化合物。尽管某些非天然的氨基酸不能用标准重组DNA技术表示，但制备它们的技术在本领域是已知的。除了标准肽化学反应之外，当合适的时候，还可以利用标准有机化学反应，合成包括非肽部分的本发明化合物。
实施例1
胰岛素A和 B链的合成
使用Boc化学方法，在4-甲基二苯甲基胺(MBHA)树脂或4-羟甲基-苯乙酰胺基甲基(PAM)树脂上合成胰岛素A和 B链。在0℃，1小时，使用HF/对甲酚(95:5)从树脂上将肽断裂。除去HF并将醚沉淀之后，肽溶解到50%乙酸水溶液中，并冷冻干燥。或者，使用Fmoc化学过程合成肽。在室温下，使用三氟乙酸(TFA)/三异丙基硅烷(TIS)/水(95:2.5:2.5)，从树脂上将肽断裂(2小时)。通过加入过量的二乙醚将肽沉淀，并将颗粒溶解在酸性缓冲水溶液中。用RP-HPLC监控肽的质量，并用质谱(ESI或MALDI)确定。
合成胰岛素A链，其在氨基酸7处具有单个游离半胱氨酸，并将所有其它半胱氨酸以乙酰胺基甲基A-(SH)7(Acm)6,11,20的形式保护。合成胰岛素B链，其在7位具有单个游离半胱氨酸，并将其它半胱氨酸以乙酰胺基甲基B-(SH)7(Acm)19的形式保护。用常规RP-HPLC纯化粗品肽。
按照图1列出的一般方法，合成的A和B链通过它们的天然二硫键连接基而相互连接。在室温下，通过在DMF或DMSO中溶解，并以1:1摩尔比与2,2'-二硫基二(5-硝基吡啶)(Npys)反应，相应的B链活化为Cys7-Npys衍生物。用RP-HPLC监控活化过程，并用ESI-MS确定产物。
通过以1:1摩尔比溶解相应的A-(SH)7(Acm)6,11,20和B-(Npys)7(Acm)19，达到10 mg/ml的总肽浓度，形成第一个B7-A7二硫键。当链结合反应完成时，将混合物稀释至50%乙酸水溶液的浓度。通过加入碘，同时形成最后两个二硫键。将40倍摩尔过量的碘加入到溶液中，并在室温下额外搅拌该混合物1小时。通过加入抗环血酸水溶液来终止反应。用RP-HPLC纯化混合物，用MALDI-MS确定最终化合物。如图2和表1数据所示，按照该方法制备的合成胰岛素可与纯胰岛素就胰岛素受体结合较好地相类似。
使用能够将非编码的氨基酸结合到蛋白中的系统(包括，例如，美国专利US 7,045,337和7,083,970讨论的系统)，还可以体内合成包括修饰氨基酸(例如，A19位的4-氨基苯丙氨酸)的胰岛素肽。
表1∶相对于天然胰岛素的合成胰岛素的活性
Figure 145847DEST_PATH_IMAGE004
实施例2
通过还原烷基化将氨基(N-末端和赖氨酸)PEG化
a. 合成
将胰岛素(或胰岛素类似物)、mPEG20k-醛和NaBH3CN以1:2:30的摩尔比溶解在pH4.1-4.4的乙酸缓冲液中。该反应溶液由0.1N NaCl、0.2N乙酸和0.1N Na2CO3组成。 胰岛素肽浓度大约为0.5 mg/ml。在室温下进行该反应历时六个小时。用RP-HPLC监控反应完成程度，反应的产率大约为50%。
b. 纯化
用0.1% TFA将反应混合物稀释2-5倍，并施加到制备RP-HPLC柱上。HPLC条件∶C4柱；流速10 ml/min；A缓冲液：10% ACN和0.1% TFA/水；B缓冲液：0.1% TFA/ACN；A线性梯度：B%从0-40%(0-80 min)；在大约35%缓冲液B的时候洗脱出PEG-胰岛素或类似物。通过亚硫酸盐解(sulftolysis)或胰蛋白酶(trypsin)降解进行化学修饰之后，用MAIDI-TOF证实目标化合物。
通过N-羟基琥珀酰亚胺酰化将氨基(N-末端和赖氨酸)PEG化
a. 合成
将胰岛素(或胰岛素类似物)与mPEG20k-NHS一起以1:1的摩尔比溶解在0.1N Bicine缓冲液(pH8.0)中。胰岛素肽浓度大约为0.5 mg/ml。用HPLC监控反应进度。在室温下2小时之后，反应的产率大约为90%。
b. 纯化
将反应混合物稀释2-5倍，并加载到RP-HPLC柱上。
HPLC条件∶C4柱；流速10 ml/min；A缓冲液：10% ACN和0.1% TFA/水；B缓冲液：0.1% TFA/ACN；A线性梯度：B%从0-40%(0-80 min)；在大约35% B的时候收集PEG-胰岛素或类似物。通过亚硫酸盐解或胰蛋白酶降解进行化学修饰之后，用MAIDI-TOF证实目标化合物。
苯丙氨酸的芳香环上的乙酰基的还原胺化PEG化
a.  合成
将胰岛素(或胰岛素类似物)、mPEG20k-酰肼和NaBH3CN以1:2:20的摩尔比溶解在乙酸缓冲液(pH4.1至4.4)中。该反应溶液由0.1N NaCl、0.2N乙酸和0.1N Na2CO3组成。在室温下24小时，胰岛素或胰岛素类似物浓度大约为0.5 mg/ml。用HPLC监控反应过程。反应的转化率大约为50%。(通过HPLC计算)
b.  纯化
将反应混合物稀释2-5倍，并加载到RP-HPLC柱上。
HPLC条件∶C4柱；流速10 ml/min；A缓冲液：10% ACN和0.1% TFA/水；B缓冲液：0.1% TFA/ACN；A线性梯度：B%从0-40%(0-80 min)；在大约35% B的时候收集PEG-胰岛素或PEG-胰岛素类似物。通过亚硫酸盐解或胰蛋白酶降解进行化学修饰之后，用MAIDI-TOF证实目标化合物。
实施例3
胰岛素受体结合试验∶
每个肽对胰岛素或IGF-1受体的亲合性是使用闪烁近似技术、在竞争结合试验中测定的。在Tris-Cl缓冲液(0.05M Tris-HCl，pH7.5，0.15M NaCl，0.1% w/v牛血清白蛋白)中制备肽的系列3倍稀释物，并在96孔板(Corning Inc., Acton，MA)中与0.05 nM(3-[125I]-碘代酪氨酰)A TyrA14胰岛素或(3-[125I]-碘代酪氨酰)IGF-1(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)混合。在每个孔中提供1-6微克质膜片段的等分样品(由过表达人胰岛素或IGF-1受体的细胞制备)，并加入0.25 mg/孔聚乙烯亚胺处理的小麦胚芽凝集素A型闪烁近似测定珠粒(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。在800 rpm下摇动五分钟之后，将板在室温下培养12小时，并用MicroBeta1450液体闪烁计数器(Perkin-Elmer，Wellesley，MA)测定放射性。用比试验样品最高浓度过量四倍浓度的“冷”天然配体，测定孔中的非特异性结合(NSB)放射性。在没有竞争者的条件下，检测孔中的总结合放射性。百分比特异性结合计算如下∶%特异性结合=(结合-NSB/总结合-NSB)x 100。使用Origin软件(OriginLab，Northampton，MA)，测定IC50值。
实施例4
胰岛素受体磷酸化试验∶
为了测定胰岛素或胰岛素类似物的受体磷酸化作用，将受体转染的HEK293细胞涂覆在96孔组织培养板(Costar #3596，Cambridge，MA)中，并在37℃、5% CO2和90%湿度下，在补充有100 IU/ml青霉素、100mg/ml链霉素、10 mM HEPES和0.25%牛生长血清(HyClone SH30541，Logan，UT)的Dulbecco's改进的Eagle培养基(DMEM)中培养16-20小时。在补充有0.5%牛血清白蛋白(Roche Applied Science #100350，Indianapolis，IN)的DMEM中制备胰岛素或胰岛素类似物的系列稀释物，并加入到含有粘附细胞的孔中。在含有5% CO2的湿润空气中、在37℃培养15分钟之后，在室温下，用5%低聚甲醛固定细胞20分钟，用磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)洗涤两次，并用2%牛血清白蛋白（在PBS中）阻滞1小时。然后将板洗涤三次，并充满抗磷酸酪氨酸的辣根过氧化物酶-共轭抗体(Upstate biotechnology #16-105，Temecula，CA)(按照生产商建议，在PBS中与2%牛血清白蛋白重组)。在室温下培养3小时之后，将板洗涤4次，并将0.1 ml TMB单一溶液基质(Invitrogen，#00-2023，Carlbad，CA)加入到每个孔中。5分钟后，通过加入0.05 ml 1N HCl，终止显色。在450 nm，在Titertek Multiscan MCC340(ThermoFisher，Pittsburgh，PA)上测定吸光度。绘制吸光度相对于肽浓度的剂量响应曲线，并使用Origin软件(OriginLab，Northampton，MA)测定EC50值。
实施例5
合成胰岛素在A19位的特异性类似物，并表征它们对胰岛素受体的活性。鉴定了在A19位的两个高活性结构的类似物，其中在第二个活性位点芳烃残基(B24)的可比的结构变化在相似的全活性胰岛素类似物的鉴定方面不成功。表2和3举例说明了对于胰岛素受体全活性的A19位的高度结构保守性。表2说明，只有两个在A19处具有修饰的胰岛素类似物具有与天然胰岛素类似的受体结合活性。对于4-氨基Phe胰岛素类似物，提供了三个独立实验的数据。标明“活性(试验中)”的栏比较了两个同时进行的独立实验的胰岛素类似物的百分比结合(相对于天然胰岛素)。标明“活性(0.60 nM)”的栏是胰岛素类似物的相对百分比结合(相对于使用该试验的胰岛素结合所得到的历史平均值)。在任何一个分析中，两个A19胰岛素类似物(4-氨基苯丙氨酸和4-甲氧基苯丙氨酸)表明了大约相当于天然胰岛素的受体结合。图3是表明天然胰岛素和A19胰岛素类似物与胰岛素受体的各自特异性结合的曲线。表3提供了数据，该数据说明两个A19胰岛素类似物(4-氨基和4-甲氧基)，其具有与天然胰岛素等效的结合活性，还表明了对胰岛素受体的等效磷酸化活性。
表2∶A19胰岛素类似物的胰岛素受体结合活性
Figure 882859DEST_PATH_IMAGE005
表3∶A19胰岛素类似物的胰岛素受体磷酸化活性
Figure 406244DEST_PATH_IMAGE006
                         序列表
 
<110>  DiMarchi, Richard
       Jie, Han
      
 
<120>  胰岛素类似物
 
<130>  29920-210273
 
<150>  US 61/139,221
<151>  2008-12-19
 
<160>  47       
 
<170>  PatentIn 3.5版
 
<210>  1
<211>  21
<212>  PRT
<213>  智人
 
<400>  1
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1               5                   10                  15     
 
 
Glu Asn Tyr Cys Asn
            20     
 
 
<210>  2
<211>  30
<212>  PRT
<213>  智人
 
<400>  2
 
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1               5                   10                  15     
 
 
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
            20                  25                  30 
 
 
<210>  3
<211>  21
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  胰岛素A链类似物
 
 
<220>
<221>  杂项特征
<222>  (8)..(8)
<223>  在8位的Xaa是苏氨酸或组氨酸
 
<220>
<221>  杂项特征
<222>  (19)..(19)
<223>  在19位的Xaa是4 -氨基苯丙氨酸或4 -甲氧基苯丙氨酸
 
<220>
<221>  杂项特征
<222>  (21)..(21)
<223>  在21位的Xaa是天门冬酰胺，甘氨酸，丙氨酸，谷酰胺，谷氨酸，苏氨酸，或丝氨酸
 
<400>  3
 
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1               5                   10                  15     
 
 
Glu Asn Xaa Cys Xaa
            20     
 
 
<210>  4
<211>  21
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  胰岛素B链类似物
 
 
<220>
<221>  杂项特征
<222>  (1)..(1)
<223>  在1位的Xaa是组氨酸或苏氨酸
 
<220>
<221>  杂项特征
<222>  (5)..(5)
<223>  在5位的Xaa是丙氨酸，甘氨酸或丝氨酸
 
<220>
<221>  杂项特征
<222>  (6)..(6)
<223>  在6位的Xaa是组氨酸，天门冬氨酸，谷氨酸，高磺基丙氨酸或磺基丙氨酸
 
<400>  4
 
Xaa Leu Cys Gly Xaa Xaa Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly
1               5                   10                  15     
 
 
Glu Arg Gly Phe Phe
            20     
 
 
<210>  5
<211>  29
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  胰岛素B链类似物
 
 
<220>
<221>  杂项特征
<222>  (1)..(1)
<223>  在1位的Xaa是苯丙氨酸或去氨基-苯丙氨酸。
 
<220>
<221>  杂项特征
<222>  (5)..(5)
<223>  在5位的Xaa是组氨酸和苏氨酸
 
<220>
<221>  杂项特征
<222>  (9)..(9)
<223>  在9位的Xaa是丙氨酸，甘氨酸或丝氨酸
 
<220>
<221>  杂项特征
<222>  (10)..(10)
<223>  在10位的Xaa是组氨酸，天门冬氨酸，谷氨酸，高磺基丙氨酸或磺基丙氨酸
 
<220>
<221>  杂项特征
<222>  (28)..(28)
<223>  在28位的Xaa是天门冬氨酸-赖氨酸二肽，赖氨酸-脯氨酸二肽，或脯氨酸-赖氨酸二肽
 
<220>
<221>  杂项特征
<222>  (29)..(29)
<223>  在29位的Xaa是苏氨酸，丙氨酸或苏氨酸-精氨酸-精氨酸三肽
 
<400>  5
 
Xaa Val Asn Gln Xaa Leu Cys Gly Xaa Xaa Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1               5                   10                  15     
 
 
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Xaa
            20                  25                 
 
 
<210>  6
<211>  21
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  胰岛素a链类似物
 
 
<220>
<221>  杂项特征
<222>  (19)..(19)
<223>  在19位的Xaa是4 -氨基苯丙氨酸
 
<400>  6
 
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1               5                   10                  15     
 
 
Glu Asn Xaa Cys Asn
            20     
 
 
<210>  7
<211>  21
<212>  PRT
<213>  智人
 
<400>  7
 
His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly
1               5                   10                  15     
 
 
Glu Arg Gly Phe Phe
            20     
 
 
<210>  8
<211>  30
<212>  PRT
<213>  智人
 
<400>  8
 
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1               5                   10                  15     
 
 
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
            20                  25                  30 
 
 
<210>  9
<211>  30
<212>  PRT
<213>  智人
 
<400>  9
 
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1               5                   10                  15     
 
 
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr
            20                  25                  30 
 
 
<210>  10
<211>  32
<212>  PRT
<213>  智人
 
<400>  10
 
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1               5                   10                  15     
 
 
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
            20                  25                  30         
 
 
<210>  11
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  11
 
Gly Gly Gly Pro Gly Lys Arg
1               5          
 
 
<210>  12
<211>  12
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  12
 
Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr
1               5                   10         
 
 
<210>  13
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  13
 
Gly Gly Gly Gly Gly Lys Arg
1               5          
 
 
<210>  14
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  14
 
Arg Arg Gly Gly Gly Gly Gly
1               5          
 
 
<210>  15
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  15
 
Gly Gly Ala Pro Gly Asp Val Lys Arg
1               5                  
 
 
<210>  16
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  16
 
Arg Arg Ala Pro Gly Asp Val Gly Gly
1               5                  
 
 
<210>  17
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  17
 
Gly Gly Tyr Pro Gly Asp Val Lys Arg
1               5                  
 
 
<210>  18
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  18
 
Arg Arg Tyr Pro Gly Asp Val Gly Gly
1               5                  
 
 
<210>  19
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  19
 
Gly Gly His Pro Gly Asp Val Lys Arg
1               5                  
 
 
<210>  20
<211>  9
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  20
 
Arg Arg His Pro Gly Asp Val Gly Gly
1               5                  
 
 
<210>  21
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  21
 
Arg Arg Gly Pro Gly Gly Gly
1               5          
 
 
<210>  22
<211>  51
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  单链人胰岛素类似物
 
 
<220>
<221>  杂项特征
<222>  (49)..(49)
<223>  在49位的Xaa是4-氨基苯丙氨酸或4-甲氧基苯丙氨酸
 
<400>  22
 
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1               5                   10                  15     
 
 
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Gly Ile
            20                  25                  30         
 
 
Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn
        35                  40                  45             
 
 
Xaa Cys Asn
    50     
 
 
<210>  23
<211>  63
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  单链人胰岛素类似物
 
 
<220>
<221>  杂项特征
<222>  (61)..(61)
<223>  在61位的Xaa是4-氨基苯丙氨酸或4-甲氧基苯丙氨酸
 
<400>  23
 
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1               5                   10                  15     
 
 
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Gln Pro
            20                  25                  30         
 
 
Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys
        35                  40                  45             
 
 
Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Xaa Cys Asn
    50                  55                  60             
 
 
<210>  24
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  24
 
Ala Gly Arg Gly Ser Gly Lys
1               5          
 
 
<210>  25
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  25
 
Ala Gly Leu Gly Ser Gly Lys
1               5           
 
 
<210>  26
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  26
 
Ala Gly Met Gly Ser Gly Lys
1               5          
 
 
<210>  27
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  27
 
Ala Ser Trp Gly Ser Gly Lys
1               5          
 
 
<210>  28
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  28
 
Thr Gly Leu Gly Ser Gly Gln
1               5          
 
 
<210>  29
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  29
 
Thr Gly Leu Gly Arg Gly Lys
1               5          
 
 
<210>  30
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  30
 
Thr Gly Leu Gly Ser Gly Lys
1               5          
 
 
<210>  31
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  31
 
His Gly Leu Tyr Ser Gly Lys
1               5          
 
 
<210>  32
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  32
 
Lys Gly Leu Gly Ser Gly Gln
1               5          
 
 
<210>  33
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  33
 
Val Gly Leu Met Ser Gly Lys
1               5          
 
 
<210>  34
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  34
 
Val Gly Leu Ser Ser Gly Gln
1               5          
 
 
<210>  35
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  35
 
Val Gly Leu Tyr Ser Gly Lys
1               5          
 
 
<210>  36
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  36
 
Val Gly Leu Ser Ser Gly Lys
1               5          
 
 
<210>  37
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  37
 
Val Gly Met Ser Ser Gly Lys
1               5          
 
 
<210>  38
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  38
 
Val Trp Ser Ser Ser Gly Lys
1               5          
 
 
<210>  39
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  39
 
Val Gly Ser Ser Ser Gly Lys
1               5          
 
 
<210>  40
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  40
 
Val Gly Met Ser Ser Gly Lys
1               5          
 
 
<210>  41
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  41
 
Thr Gly Leu Gly Ser Gly Arg
1               5          
 
 
<210>  42
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  42
 
Thr Gly Leu Gly Lys Gly Gln
1               5          
 
 
<210>  43
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  43
 
Lys Gly Leu Ser Ser Gly Gln
1               5          
 
 
<210>  44
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  44
 
Val Lys Leu Ser Ser Gly Gln
1               5          
 
 
<210>  45
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  45
 
Val Lys Leu Ser Ser Gly Gln
1               5          
 
 
<210>  46
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  46
 
Thr Gly Leu Gly Lys Gly Gln
1               5          
 
 
<210>  47
<211>  7
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  肽连接基
 
<400>  47
 
 
Val Gly Leu Ser Lys Gly Gln
1               5          

Claims (22)

1.多肽，其包括序列GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO∶3)，其中
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2是下列通用结构的氨基酸
Figure 26272DEST_PATH_IMAGE001
,
其中R4是NH2或OCH3；和
X3是天门冬酰胺，甘氨酸或丙氨酸；或其类似物，其包括不同于SEQ ID NO : 3的序列，不同之处是在选自A5、A8、A9、A10、A14、A15、A17、A18的位置具有1至3个氨基酸修饰。
2.权利要求1的胰岛素类似物，其中R4是NH2。
3.胰岛素类似物，包括
包括GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO∶3)的序列的A链序列；和
包括X4LCGX5X6LVEALYLVCG ERGFF(SEQ ID NO∶4)的序列的B链序列，其中
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2是下列通用结构的氨基酸
,
其中R4是NH2或OCH3；
X3是天门冬酰胺或甘氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸，天门冬氨酸，谷氨酸，高磺基丙氨酸和磺基丙氨酸。
4.权利要求3的胰岛素类似物，其中B链序列包括序列X11VNQX4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFFYTX9 X10(SEQ ID NO∶5)，其中
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸，天门冬氨酸，谷氨酸，高磺基丙氨酸和磺基丙氨酸；
X9是天门冬氨酸(aspartate)-赖氨酸二肽，赖氨酸-脯氨酸二肽，或脯氨酸-赖氨酸二肽；
X10是苏氨酸，丙氨酸或苏氨酸-精氨酸-精氨酸三肽；
X11选自苯丙氨酸和去氨基-苯丙氨酸。
5.权利要求3的胰岛素类似物，其中A链序列包括序列GIVEQCCTSICSLYQLENX2CN(SEQ ID NO∶6)，其中
X2是下列通用结构的氨基酸
Figure 723150DEST_PATH_IMAGE002
。
6.权利要求5的胰岛素类似物，其中B链序列包括序列HLCGSHLVEALYLVCGERGFF(SEQ ID NO∶7)。
7.权利要求5的胰岛素类似物，其中B链序列包括序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT(SEQ ID NO∶8)。
8.权利要求5的胰岛素类似物，其中B链序列包括序列FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT(SEQ ID NO∶9)。
9.权利要求3的胰岛素类似物，进一步包括：亲水性部分与B链的氨基酸连接。
10.权利要求9的胰岛素类似物，其中亲水性部分与B链的N-末端氨基酸连接。
11.权利要求7的胰岛素类似物，其中亲水性部分连接B链的N-末端氨基酸或连接SEQ ID NO∶8的29位的氨基酸。
12.权利要求8的胰岛素类似物，其中亲水性部分连接B链的N-末端氨基酸或连接SEQ ID NO∶9的28位的氨基酸。
13.权利要求9-12的胰岛素类似物，其中亲水性部分是聚乙二醇。
14.单链胰岛素类似物包括式B-P-A19的化合物，其中∶
B代表包括X4LCGX5X6LVEALYLVCG ERGFF(SEQ ID NO∶4)的序列的序列；
A19代表包括GIVEQCCX1SICSLYQLENX2CX3(SEQ ID NO∶3)的序列的序列；和
P代表大约4至大约14个氨基酸的肽连接基，进一步的，其中
X1选自苏氨酸和组氨酸；
X2是下列通用结构的氨基酸
Figure 180676DEST_PATH_IMAGE001
,
其中R4是NH2或OCH3；
X3是天门冬酰胺或甘氨酸；
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸，天门冬氨酸，谷氨酸，高磺基丙氨酸和磺基丙氨酸。
15.权利要求14的单链胰岛素类似物，其中肽连接基选自：
Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO: 11)，Gly-Tyr-Gly-Ser-Ser-Ser-Arg-Arg-Ala-Pro-Gln-Thr(SEQ ID NO: 12)，Arg-Arg-Gly-Pro-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO: 21)，Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-Arg(SEQ ID NO: 13)，Arg-Arg-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(SEQ ID NO: 14)，Gly-Gly-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO: 15)，Arg-Arg-Ala-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO: 16)，Gly-Gly-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO: 17)，Arg-Arg-Tyr-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO: 18)，Gly-Gly-His-Pro-Gly-Asp-Val-Lys-Arg(SEQ ID NO: 19)和Arg-Arg-His-Pro-Gly-Asp-Val-Gly-Gly(SEQ ID NO: 20)。
16.权利要求15的单链胰岛素类似物，其中R4是NH2。
17.权利要求14的单链胰岛素类似物，其中
R4是NH2；
B链包括X11VNQX4LCGX5X6LVEALYLVCGERGFFYTX9 X10(SEQ ID NO∶5)的序列；和
肽连接基具有4至8个氨基酸长度，进一步的，其中
X4选自组氨酸和苏氨酸；
X5选自丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；
X6选自组氨酸，天门冬氨酸，谷氨酸，高磺基丙氨酸和磺基丙氨酸；
X9是天门冬氨酸(aspartate)-赖氨酸二肽，赖氨酸-脯氨酸二肽，或脯氨酸-赖氨酸二肽；
X10是苏氨酸，丙氨酸或苏氨酸-精氨酸-精氨酸三肽；
X11选自苯丙氨酸和去氨基-苯丙氨酸。
18.权利要求17的单链胰岛素类似物，其中肽连接基包括下列序列∶GGGPGKR(SEQ ID NO: 11)，AGRGSGK(SEQ ID NO: 24)；AGLGSGK(SEQ ID NO: 25)；AGMGSGK(SEQ ID NO: 26)；ASWGSGK(SEQ ID NO: 27)；TGLGSGQ(SEQ ID NO: 28)；TGLGRGK(SEQ ID NO: 29)；TGLGSGK(SEQ ID NO: 30)；HGLYSGK(SEQ ID NO: 31)；KGLGSGQ(SEQ ID NO: 32)；VGLMSGK(SEQ ID NO: 33)；VGLSSGQ(SEQ ID NO: 34)；VGLYSGK(SEQ ID NO: 35)，VGLSSGK(SEQ ID NO: 36)；VGMSSGK(SEQ ID NO: 37)；VWSSSGK(SEQ ID NO: 38)，VGSSSGK(SEQ ID NO: 39)和VGMSSGK(SEQ ID NO: 40)。
19.权利要求3-8或14-18的任一项的胰岛素类似物，其中通过A9、A14、A15、B22、B28、B29位的氨基酸侧链、B链的C-末端或N-末端或肽连接基的赖氨酸侧链连接亲水性部分。
20.权利要求1-18的任一项的胰岛素类似物，其中在选自A9、A14、A15、B22、B28或B29的一个或多个位置将所述类似物酰化。
21.药物组合物，其包含权利要求3或14的胰岛素类似物和可药用载体。
22.治疗糖尿病的方法，所述方法包括：给予有效量的权利要求21的药物组合物。
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