EA003944B1

EA003944B1 - Способы лечения диабета с помощью пептидных аналогов инсулина

Info

Publication number: EA003944B1
Application number: EA200000872A
Authority: EA
Inventors: Амитабх Гаур; Николас Линг; Пол Дж. Конлон
Original assignee: Ньюрокрайн Байосайенсиз Инк.
Priority date: 1998-02-23
Filing date: 1999-02-23
Publication date: 2003-10-30
Also published as: AP2000001888A0; AU741037B2; CA2321929A1; EP1056776A1; AU2783199A; HUP0100928A3; US6197926B1; CN1294597A; WO1999042482A1; IL137904A0; KR20010041238A; NO20004198L; EA200000872A1; TR200003048T2; CN1241942C; HUP0100928A2; OA11453A; ID26788A; JP2002504491A; NO20004198D0

Abstract

Настоящее изобретение относится к пептидным аналогам В-цепи инсулина, которые получены, главным образом, из пептидов, включающих остатки (9-23) последовательности нативной В-цепи. Эти аналоги отличаются от нативной последовательности в положениях 12, 13, 15 и/или 16 и могут дополнительно отличаться от нее в положении 19 и/или других положениях. Представлены фармацевтические композиции, содержащие эти пептидные аналоги. Эти пептидные аналоги пригодны для лечения и ингибирования развития диабета.

Description

Настоящее изобретение относится, главным образом, к пептидным аналогам инсулина, и более конкретно к способам лечения диабета с помощью пептидных аналогов, полученных из остатков 9-23 В-цепи человеческого инсулина.

Предпосылки к созданию изобретения

Инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД) представляет собой органоспецифичное аутоиммунное заболевание, которым страдает около миллиона человек различных возрастных групп в Соединенных Штатах. Это заболевание характеризуется обширным разрушением βклеток панкреатических островков, которые вырабатывают инсулин, и нарушением регуляции метаболизма глюкозы, которое приводит к клинической манифестации диабета. Определяющим признаком ИЗСД является лимфоцитарная инфильтрация островков. Среди прочих инвазирующих клеток, Т-клетки, как представляется, являются одними из главных медиаторов аутоиммунного разрушения.

Диабет I типа характеризуется также повышенными уровнями антител против различных антигенов, связанных с островками, включая инсулин, ΟΛΌ65, ΟΆΌ67 и 1СА512. Эти антитела можно выявить задолго до клинической манифестации заболевания, и иммунный ответ на такие антигены можно использовать как прогностический фактор угрозы развития диабета у пациентов с предрасположенными генетическими гаплотипами (НЬА).

В настоящее время пациенты зависят от инъекций инсулина для поддержания нормогликемии. Инсулин представляет собой полипептидный гормон, состоящий из двух цепей, связанных между собой дисульфидными мостиками, А-цепи, состоящей из 21 аминокислотных остатков, и В-цепи, состоящей из 30 остатков. В то время как введение инсулина оказывает значительное благоприятное действие на пациентов, страдающих диабетом, короткая продолжительность периода полужизни инсулина в сыворотке крови создает трудности для поддержания нужной дозы. Применение инсулина также может вызывать различные гипогликемические побочные эффекты, а также выработку нейтрализующих антител.

С учетом проблем, связанных с существующими способами лечения диабета, имеется настоятельная необходимость в разработке улучшенных способов лечения, которые являлись бы более эффективными и не имели бы перечисленных выше недостатков. Настоящее изобретение использует применение пептидных аналогов, которые противодействуют Тклеточному ответу на инсулин для эффективного лечения диабета, в то же время обеспечивая другие связанные с этой задачей преимущества.

Краткое описание существа изобретения

Настоящее изобретение относится к соединениям и способам для лечения и профилак тики диабета. В рамках определенных аспектов настоящее изобретение относится к пептидным аналогам, включающим остатки 9-23 В-цепи человеческого инсулина (8ЕО Ш № 2), которые отличаются по своей последовательности от остатков 9-23 В-цепи нативного человеческого инсулина благодаря замещениям между аминокислотными положениями от 2 до 4. Такие замещения могут осуществляться по двум или более остатков, выбранных из группы, состоящей из остатков 12, 13, 15 и 16, с дополнительными замещениями по другим остаткам или без них. В определенных предпочтительных вариантах осуществления, такие замещения могут наблюдаться по двум или трем аминокислотным остаткам в пределах остатков 9-23 В-цепи инсулина. Замещения могут также осуществляться по остатку 19. Замещения предпочтительно являются неконсервативными, и аналоги, в которых остаток 12, 13, 15, 16 и/или 19 изменен (например, замещен аланином), являются предпочтительными. Аналоги, дополнительно включающие остаток 24 В-цепи инсулина, также являются предпочтительными. В некоторых других вариантах осуществления пептидные аналоги включают не более 18 остатков, не более 16 остатков или не более 15 остатков В-цепи человеческого инсулина.

В других вариантах осуществления пептидные аналоги состоят, главным образом, из остатков 9-23 или 9-24 В-цепи человеческого инсулина (8ЕО Ш № 2), которые отличаются по своей последовательности от остатков 9-23 Вцепи нативного человеческого инсулина, благодаря замещениям между аминокислотными позициями от 2 до 4, и в которых по меньшей мере одно замещение осуществлено по остатку, выбранному из группы, состоящей из остатков 12, 13, 15 и 16.

В других аспектах представлены фармацевтические композиции, включающие пептидный аналог, описанный выше, в комбинации с физиологически приемлемым носителем или разбавителем.

Настоящее изобретение относится также к способам лечения и/или ингибирования развития диабета, включающим введение пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции, описанной выше.

Эти и другие аспекты настоящего изобретения будут очевидны при ознакомлении с последующим подробным описанием и прилагаемыми чертежами. Помимо этого, ниже приводятся различные ссылки, в которых более подробно описаны некоторые способы или композиции. Все эти ссылки включены в настоящий документ полностью, как если бы включение каждой из них отмечалось отдельно.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет аминокислотную последовательность остатков 9-23 В-цепи человеческого инсулина (8ЕО Ш № 2);

фиг. 2 - график, изображающий пролиферативный ответ (измеренный в срт * (импульсах в минуту)) Т-клеточного клона мышей ΝΟΌ на пептид В-цепи (9-23) нативного инсулина в присутствии варьирующих количеств репрезентативных пептидных аналогов, в которых различные остатки замещены аланином, как указано;

фиг. 3 - график, изображающий пролиферативный ответ (измеренный в срт) Тклеточного клона мышей ΝΘΌ на пептид Вцепи (9-23) нативного инсулина в присутствии различных количеств репрезентативного пептидного аналога, в котором аминокислотные остатки в положениях 16 и 19 замещены аланином (ΝΒΙ-6024; обозначен квадратиками). Для сравнения показан также пролиферативный ответ в присутствии неродственного контрольного пептида, полученного из основного белка миелина (ΝΒΙ-5096; обозначен кружочками). Ответ представлен как среднее СРМ±8ЕМ от трех повторностей культур;

фиг. 4-6 - гистограммы, иллюстрирующие пролиферативный ответ (измеренный в срт) Тклеточных линий от разных пациентов, страдающих диабетом, на нативный пептид В-цепи (9-23) или на репрезентативные пептидные аналоги. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) получали от пациентов, страдающих диабетом, и культивировали их в присутствии пептида В-цепи (9-23) инсулина. После трех циклов повторной стимуляции В-цепью (9-23) инсулина в каждую из лунок 96луночного планшета с круглыми донышками, содержащие полную среду, добавляли по 1 х 10⁵Т-клеток и 7 х 10⁴ облученных аутологичных РВМС. Клетки культивировали в течение 5 дней с ΝΒΙ-6024 (В-цепью инсулина 9-23 с замещениями аланином в положениях 16 и 19), с Вцепью инсулина (9-23) или только со средой. На 4 день клеткам сообщали импульс с помощью ³Н-тимидина и рекультивировали еще в течение 18 ч. Эти культуры затем собирали, производили подсчет с помощью жидкостной сцинтилляции, а полученные данные выражали как среднее количество импульсов за минуту (срт) повторных образцов ± стандартная ошибка среднего (кет);

фиг. 7 - гистограмму, иллюстрирующую пролиферативный ответ (измеренный в срт) Тклеточной линии от пациента, страдающего диабетом, на нативный пептид В-цепи (9-23) или на репрезентативные пептидные аналоги, содержащие замещения аланином, как было указано. Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) выделяли от пациентов, страдающих диабетом, и культивировали в присутствии пептида В-цепи (9-23) инсулина. После трех циклов повторной стимуляции В-цепью (9-23) инсулина в каждую из лунок 96луночного планшета с круглыми донышками, содержащие полную среду, добавляли по 1 х 10⁵Т-клеток и 7 х 10⁴ облученных аутологичных РВМС. Клетки культивировали в течение 5 дней с аналогом, с В-цепью инсулина (9-23) или только со средой (ΒΚΟ), как было указано. На 4 день клеткам сообщали импульс с помощью ³Нтимидина и рекультивировали еще в течение 18 ч. Эти культуры затем собирали, производили подсчет с помощью жидкостной сцинтилляции, а полученные данные выражали как среднее количество импульсов за минуту (срт) повторных образцов ± стандартная ошибка среднего (кет);

фиг. 8 - график, показывающий процент самок мышей ΝΟΌ, которые имели диабет после девяти еженедельных введений репрезентативных пептидных аналогов. Десять мышей получали подкожно, начиная с 24 дня, пептидные аналоги В-цепи (9-23), содержащие замещения аланином по остатку 12 (незакрашенные треугольники), 13 (квадратики) или 16 (закрашенные треугольники). У всех мышей, которые получали контрольный пептид, нейротензин (кружки), развился диабет;

фиг. 9 - график, показывающий те же данные, что на фиг. 8, но противопоставляющие группу, получавшую только аналог А13, группе, получавшей контрольный пептид (нейротензин);

фиг. 10 - график, показывающий процент мышей ΝΟΌ, которые имели диабет после 13 еженедельных введений репрезентативного пептидного аналога. Десять мышей получали подкожно, начиная с 24 дня, 400 мкг нейротензина (квадратики), В-цепи (9-23) (ромбики) или пептидного аналога В-цепи (9-23), содержащего замещение аланином по остатку 13 (треугольники);

фиг. 11 - график, показывающий влияние репрезентативных пептидных аналогов на частоту диабета у мышей ΝΟΌ. Четырехнедельных самок мышей ΝΟΌ (п=9) лечили подкожным введением 20 мг/кг ΝΒΙ-6024 (А^16,19) с недельными интервалами в течение 12 недель, после чего с двухнедельными интервалами до достижения животными возраста 35 недель. Контрольная группа (п=10) состояла из животных, не получавших лечения. Мыши, имевшие уровни глюкозы крови более 200 мг/дл при отборе крови в двух последовательных временных точках, рассматривались как страдающие диабетом. Эти данные выражали как процент животных, не имевших диабета, по истечении 35 недель исследования. Для оценки достоверности разницы между двумя экспериментальными группами использовали логарифмический ранговый критерий. Процент мышей ΝΟΌ, имевших диабет после лечения ΝΒΙ-6024 (А^16,19), в различных временных точках показан квадратиками, а процент мышей, имевших диабет в контрольной группе, показан кружками;

фиг. 12 - график, показывающий влияние репрезентативных пептидных аналогов на частоту диабета у мышей ΝΟΌ. Четырехнедельных самок мышей ΝΘΌ (п=13-15) лечили подкожным введением 20 мг/кг ΝΒΙ-6024 (А^16,19) или ΝΒΙ-6201 (контрольного пептида, нейротензина) с недельными интервалами в течение 12 недель, после чего с двухнедельными интервалами до достижения животными возраста 35 недель. Дополнительная контрольная группа (п=8) состояла из животных, не получавших лечения. Мыши, имевшие уровни глюкозы крови более 200 мг/дл при отборе крови в двух последовательных временных точках, рассматривались как страдающие диабетом. Эти данные выражали как процент животных, не имевших диабета, по истечении 35 недель исследования. Для оценки достоверности разницы между двумя экспериментальными группами использовали логарифмический ранговый критерий. Процент мышей ΝΘΌ, имевших диабет после лечения ΝΒΙ-6024 (А^16,19), в различных временных точках показан квадратиками, процент мышей, имевших диабет, после лечения пептидом нейротензином показан треугольниками, а процент нелеченных мышей, имевших диабет, показан кружками;

фиг. 13Α-13Ό - графики, иллюстрирующие иммуногенность репрезентативных пептидных аналогов, содержащих остатки В-цепи 9-23 с замещением аланином по остатку 12 (фиг. 13А), остатку 13 (фиг. 13В), остатку 15 (фиг. 13С) или остатку 16 (фиг. 13Ό). Мышам ΝΘΌ 2-4 раза подкожно инъецировали пептидный аналог в растворимой форме перед исследованием пролиферативного ответа клеток лимфатических узлов на различные концентрации пептидного аналога или пептида В-цепи (9-23) нативного инсулина. Пролиферативный ответ оценивали по количеству радиоактивного тимидина, инкорпорированного в клетки (нанесен на график в виде среднего количества импульсов за минуту (СРМ) в культуральных лунках в трех повторностях), путем подсчета на жидкостном сцинтилляционном счетчике по окончании периода культивирования;

фиг. 14А-14Р - графики, иллюстрирующие иммуногенность шести различных пептидных аналогов у мышей ΝΘΌ. Мышам ΝΘΌ инъецировали пептидные аналоги с двумя замещениями аланином (А12,13; А12,15; А12,16; А13,15; А13,16 и А15,16, как указано) и спустя 10 дней их лимфатические узлы использовали для исследования пролиферативного ответа, с использованием различных концентраций иммунизирующего пептида в качестве стимуляторов. Пролиферативный ответ оценивали по количеству радиоактивного тимидина, инкорпорированного в клетки (нанесен на график в виде среднего количества импульсов за минуту (СРМ) в культуральных лунках в трех повторностях), путем подсчета на жидкостном сцин тилляционном счетчике по окончании периода культивирования;

фиг. 15Α-15Ό - графики, иллюстрирующие иммуногенность репрезентативных пептидных аналогов В-цепи (9-23) инсулина с двойным замещением. Следующие пептиды испытывали на их способность вызывать иммунный ответ у мышей ΝΘΌ: А12,19 (фиг. 15 А); А13,19 (фиг. 15В); А15,19 (фиг. 15С); А16,19 (фиг. 15Ό). Пролиферативный ответ в виде количества импульсов в минуту в клетках, полученных дренированием лимфатических узлов, в ответ на иммунизирующий аналог, а также на пептид Вцепи (9-23) нативного инсулина;

фиг. 16 - график, показывающий способность ряда пептидов с тройным замещением вызывать Т-клеточный пролиферативный ответ у мышей ΝΘΌ. Мышей иммунизировали отдельно репрезентативными пептидными аналогами, содержащими следующие комбинации замещений: А12,13,19; А12,15,19; А12,16,19; А13,15,19 или А13,16,19; А15,16,19. Клетки лимфатических узлов затем использовали в исследовании пролиферации, и представлен ответ на каждый из иммунизирующих пептидов в различных концентрациях;

фиг. 17А и 17В - графики, показывающие способность пептида с двойным замещением (А^16,19) вызывать иммунный ответ. Пять самок мышей ΝΘΌ иммунизировали подкожным введением 20 мг/кг растворимого ΝΒΙ-6024 на 1, 6 и 12 день. На 15 день мышей умерщвляли, отбирали клетки паховых лимфатических узлов и культивировали их в присутствии различных концентраций (0-50 мкМ) ΝΒΙ-6024 (фиг. 17А) или пептида В-цепи (9-23) инсулина (фиг. 17В). Степень пролиферации Т-клеток определяли с помощью включения ³Н-тимидина. Ответ выражали в виде среднего СРМ ± 8ЕМ от трех повторностей культур;

фиг. 18 - гистограмму, показывающую сравнение цитокинов, выработанных иммунными клетками, индуцированных пептидом А^16,19(ΝΒΙ-6024) в присутствии или отсутствии адъюванта. Группы мышей ΝΟΌ иммунизировали ΝΒΙ-6024 отдельно или эмульгированным с помощью СЕА. Цитокины 1Ь-2 и 1Ь-4, как указано, определяли при 25 мкМ ΝΒΙ-6024 и выражали их количество в пг/мл после вычитания фоновых величин.

Подробное описание изобретения

Перед дальнейшим описанием настоящего изобретения может быть полезным для его понимания определения некоторых терминов, которые используются в настоящем документе.

В-цепь инсулина относится к полипептиду из 30 аминокислот, который является одним из двух полипептидов, связанных между собой дисульфидными мостиками, которые вместе составляют инсулин. Последовательность В-цепи человеческого инсулина приводится в 8ЕО ΙΌ № 1, а последовательность ос003944 татков 9-23 человеческой В-цепи приводится на фиг. 1 и в 8ЕО ГО № 2.

Пептидные аналоги В-цепи инсулина включают по меньшей мере 15 аминокислотных остатков, полученных из остатков 9-23 В-цепи человеческого инсулина (8ЕО ГО № 2), с имеющимся по меньшей мере одним различием в аминокислотной последовательности между аналогом и нативной В-цепью. В самом пептидном аналоге по меньшей мере два различия в аминокислотной последовательности имеется по остатку 12, 13, 15 и/или 16. Помимо этого, остаток 19 может быть замещен, а также могут быть другие изменения. Предпочтительно пептидный аналог содержит от 2 до 4 замещений по остаткам 9-23, относительно последовательности (9-23) В-цепи нативного инсулина, хотя возможно и большее количество замещений (например, 5 или 6). Могут включаться дополнительные остатки, полученные из В-цепи инсулина, вплоть до полностью 30 остатков нативной В-цепи, предпочтительно всего до 25 остатков, более предпочтительно всего до 16 или 18 остатков в пептидном аналоге. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения в пептидный аналог включен также остаток 24 В-цепи инсулина. Последовательности, которые не получены из В-цепи инсулина, могут, но необязательно, присутствовать на амино- и/или карбоксиконце пептидного аналога. Такая последовательность (последовательности) может использоваться, например, для облегчения синтеза, очистки или солюбилизации пептидного аналога.

Если не указывается иное, названная аминокислота относится к Ь-форме. Ь-аминокислотный остаток в последовательности нативного пептиды может быть заменен на любую из 20 Ь-аминокислот, обычно встречающихся в белках, на любую из соответствующих Ό-аминокислот, редких аминокислот, таких как 4гидроксипролин или гидроксилизин, или на небелковую аминокислоту, такую как β-аланин или гомосерин. В объем настоящего изобретения также включены аналоги, включающие аминокислоты, которые были изменены химическими способами, такими как метилирование (например, α-метилвалин); амидирование Сконцевой аминокислоты алкиламином, таким как этиламин, этаноламин или этилендиамин; и/или ацилирование или метилирование функциональной группы боковой цепи аминокислоты (например, ацилирование ε-аминогруппы лизина).

Остаток 12, остаток 13, остаток 15, остаток 16 и остаток 19 (также называемые положение 12, положение 13, положение 15, положение 16 и положение 19 соответственно) относятся к аминокислотам 12, 13, 15, 16 и 19 Вцепи инсулина, как показано на фиг. 1. Более конкретно система порядковых номеров для этих остатков относится к позиции аминокислоты в нативном человеческом белке, независимо от длины пептидного аналога или положения аминокислоты в самом аналоге. Пептидные аналоги, имеющие замещение аланином по остатку 12, 13, 15 или 16, обозначаются как аналоги А12, А13, А15 или А16 соответственно.

Пептидные аналоги В-цепи инсулина

Как отмечалось выше, настоящее изобретение относится к пептидным аналогам, включающим, по меньшей мере, остатки 9-23 В-цепи человеческого инсулина и имеющим замену встречающегося в естественных условиях Ьвалина в положении 12, Ь-глутамата в положении 13, Ь-лейцина в положении 15 и/или Ьтирозина в положении 16, на другую аминокислоту. В одном варианте осуществления настоящего изобретения пептидные аналоги имеют дополнительные изменения от одной до трех Ьаминокислот в положении 12, 13, 15, 16 и/или 19 В-цепи инсулина. Предпочтительно, пептидные аналоги имеют от двух до трех изменений, из которых один из замещенных остатков находится в положении 19.

Часть пептидного аналога, которая получена из В-цепи инсулина, обычно имеет 15-30 остатков в длину, предпочтительно 15-18 остатков в длину и более предпочтительно 15-16 остатков в длину. Особенно предпочтительные пептидные аналоги содержат 15 аминокислот, полученных из В-цепи инсулина.

Как отмечалось выше, пептидные аналоги, включающие любое аминокислотное изменение (изменения) в положениях, перечисленных выше, включены в объем настоящего изобретения. Предпочтительные пептидные аналоги содержат неконсервативные замещения (т.е. изменения по аминокислотам, имеющие различия в заряде, полярности, гидрофобности и/или основной массе).

Особенно предпочтительные аналоги имеют замещения одного или более остатков аланином.

Пептидные аналоги можно синтезировать с помощью обычных химических методик, включая автоматизированный синтез. Обычно пептидные аналоги можно получать с помощью технологии твердофазного синтеза пептидов, в которой имеет место присоединение защищенного аминокислотного остатка к смоляной основе предпочтительно из 4-метилбензгидриламиновой смолы путем активации дициклогексилкарбодиимидом, с получением пептида с Сконцевым амидом. Альтернативно, для получения пептида со свободной карбоновой кислотой на С-конце может использоваться хлорметиловая смола (Меррифильдская смола). Боковые функциональные группы цепи можно защитить следующим образом: бензилом для серина и треонина; циклогексилом для глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты; тосилом для гистидина и аргинина; 2-хлорбензилокси карбонилом для лизина и 2-бромбензилоксикарбонилом для тирозина. После присоединения тбутилоксикарбонильная защитная группа на функциональной α-аминогруппе добавленной аминокислоты может быть удалена путем обработки трифторуксусной кислотой, а затем - нейтрализацией диизопропилэтиламином. Следующий защищенный остаток затем присоединяется к свободной аминогруппе, удлиняя пептидную цепь. После присоединения последнего остатка защищенный комплекс пептид-смола обрабатывают фтористым водородом для отщепления пептида от смолы и снятия защиты с функциональных боковых групп цепи. Сырой продукт затем можно очищать путем гельфильтрации, ЖХВР, распределительной хроматографии или ионообменной хроматографии, с помощью хорошо известных методик.

Пептидные аналоги по настоящему изобретению (а) не должны стимулировать Тклеточные клоны мышей ΝΘΌ, специфичные в отношении пептида (9-23) В-цепи нативного инсулина (8ЕС ΙΌ № 2) или должны стимулировать эти клоны до уровня ниже того, до которого их стимулирует нативный пептид; (Ь) не должны стимулировать специфичные в отношении В-цепи (9-23) инсулина человеческие Тклетки пациента; (с) должны быть иммуногенными для мышей ΝΘΌ; (б) должны снижать частоту диабета у мышей ΝΘΌ и (е) могут ингибировать ответ Т-клеточных клонов, специфичных в отношении пептида (9-23) В-цепи нативного инсулина (8ЕО ΙΌ № 2). Таким образом, пептидные аналоги-кандидаты могут отбираться на предмет их способности лечить диабет по результатам анализов, определяющих пролиферацию Т-клеток, иммуногенность для мышей ΝΘΌ и по влиянию на частоту заболевания мышей ΝΘΌ. Некоторые показательные анализы для использования при оценке пептидных аналогов-кандидатов более подробно обсуждаются ниже.

Те аналоги, которые соответствуют вышеперечисленным критериям, являются пригодными в качестве лекарственных средств.

Пептидные аналоги-кандидаты могут сначала изучаться на предмет их способности стимулировать Т-клетки, специфичные в отношении пептида (9-23) В-цепи нативного инсулина (8ЕО ΙΌ № 2) (из клональных клеточных линий или выделенные от пациента). Такие исследования могут осуществляться с помощью прямого изучения пролиферации, при котором Тклеточные линии, реактивные в отношении нативной В-цепи (9-23) или Т-клетки, выделенные от пациента, используются в качестве клетокмишеней. Устоявшиеся Т-клеточные линии могут быть получены с помощью хорошо известных методик из лимфатических узлов, взятых у крыс, которым инъецировали В-цепь (9-23). Клетки лимфатических узлов могут быть выделены и культивированы в течение 5-8 дней с В цепью (9-23) и 1Ь-2. После отбора жизнеспособных клеток можно осуществить второй цикл стимуляции с помощью В-цепи (9-23) облученных спленоцитов в качестве источника факторов роста. После 5-6 таких пассажей определяется пролиферативный потенциал каждой клеточной линии. Для выполнения исследования пролиферации Т-клеточные линии, реактивные в отношении В-цепи (9-23), можно культивировать в течение трех дней с различными концентрациями пептидных аналогов и облученными аутологичными спленоцитами. Через три дня добавляют 0,5-1,0 мкКи [³Н]-тимидина на период времени 12-16 ч. Культуры затем собирают и определяют количество инкорпорированной радиоактивности. Для трех повторностей культур подсчитывают среднее СРМ и стандартную ошибку среднего. Пептидные аналоги, для которых полученные результаты составляют менее трех стандартных отклонений от среднего ответа при сравнимых концентрациях В-цепи (9-23), рассматриваются как не стимулирующие. Пептидные аналоги, которые не стимулируют пролиферацию в концентрациях менее или равных 20-50 мкМ, подходят для дальнейшего скрининга.

Пептиды-кандидаты, которые не стимулируют Т-клетки, специфичные в отношении Вцепи (9-23), и предпочтительно ингибируют ответ таких Т-клеток ίη νίίτο, испытываются далее на предмет иммуногенности для мышей ΝΘΌ. Кратко, группы мышей ΝΘΌ можно иммунизировать 100-400 мкг пептидов-кандидатов в маннит-ацетатном буфере подкожно трижды за период 10-15 дней. После последней иммунизации клетки лимфатических узлов и/или клетки селезенки можно использовать для пролиферативных исследований, при которых клетки культивируют с различными концентрациями иммунизирующего пептида в течение 3-4 дней. Последние 18 ч культивирования можно осуществлять с меченным тритием тимидином. Клетки затем можно собирать и подсчитывать их радиоактивность с помощью сцинтилляционного счетчика, а пролиферативный ответ можно выражать в виде СРМ ± 8ЕМ. Пептидыкандидаты, индуцирующие пролиферацию, которая, по меньшей мере, в 2 раза выше фоновой (без антигена) при концентрации пептида 25 мкМ, считаются иммуногенными. Альтернативно, пептидный аналог-кандидат считают иммуногенным, если он вызывает пролиферативный ответ после иммунизации мышей ΝΘΌ в полном адъюванте Фрейнда. Дренированные клетки лимфатических узлов или клетки селезенки, при культивировании в присутствии иммунизирующего аналога, должны индуцировать пролиферацию, которая, по меньшей мере, в 2 раза выше фоновой (без антигена) при концентрации пептида 25 мкМ.

Пептиды-кандидаты, которые способны ингибировать пролиферацию посредством В цепи (9-23), далее испытывают на их способность понижать частоту диабета у мышей ΝΟΌ. Кратко, пептиды можно вводить мышам ΝΘΌ в растворимой форме или эмульгированными, например, в неполном адъюванте Фрейнда (ΙΕΆ).

Обычно еженедельное введение приблизительно 400 мкг пептида является достаточным. Частота диабета у леченных мышей, так же как и у нелеченных или контрольных мышей, затем оценивается путем еженедельного мониторинга уровней глюкозы в крови. Содержание глюкозы в крови 200 мг/дл или более при двух последовательных заборах крови обычно расценивают как показатель появления диабета. Пептидные аналоги должны приводить к статистически достоверному снижению процента мышей ΝΟΌ, имеющих диабет, в течение периода мониторинга приблизительно до 25 недель.

Как отмечалось выше, пептидные аналоги могут также ингибировать ответ человеческих Т-клеток, специфичных в отношении В-цепи (923), ίη νίίτο. Такое ингибирование можно измерить путем конкурентного анализа, при котором пептидные аналоги-кандидаты испытывают на их способность ингибировать пролиферацию Тклеток, индуцированную нативной В-цепью (923) (8ЕО ΙΌ № 2). При таком анализе антигенпрезентирующие клетки сначала облучают, а затем инкубируют с пептидным аналогом и пептидом (9-23) нативной В-цепи. В культуру затем добавляют Т-клетки. В культуру, которую можно инкубировать всего 4 дня, включают различные концентрации пептидных аналоговкандидатов. После периода инкубации каждую культуру загружают, например, 1 мкКи [³Н]тимидина в течение еще 12-18 ч. Культуры затем можно собирать с помощью фильтров из стекловолокна и подсчитывать радиоактивность, как описано выше. На основе данных для трех повторностей культур можно рассчитать среднее СРМ и стандартную ошибку среднего. Пептидные аналоги, которые снижают пролиферацию, по меньшей мере, на 25% в концентрации 20-50 мкМ, являются предпочтительными.

Лечение и профилактика диабета

Как отмечалось выше, настоящее изобретение относится к способам лечения и профилактики диабета Ι типа путем введения пациенту терапевтически эффективного количества пептидного аналога В-цепи инсулина, как описано выше. Пациенты, страдающие диабетом, которые подходят для такого лечения, могут выявляться с помощью критериев, принятых для постановки диагноза клинически выраженного диабета. Такие критерии могут включать, но не ограничиваться, низкую (менее десятого или первые контрольные проценты) секрецию инсулина первой фазы после внутривенного теста на толерантность к глюкозе (1УОТТ) или персистенцию высокого титра антител против островковых антигенов, таких как инсулин, ΟΛΌ65 и/или 1СА512.

Пациентов, не имеющих клинически выраженного диабета, которые могут выиграть от указанного профилактического лечения, обычно можно выявить с помощью любых прогностических критериев, принятых в данной области медицины. Для пациентов, не имеющих клинически выраженного диабета, можно предсказать развитие диабета через несколько лет (1-5 лет) на основе следующих критериев: ί) семейного анамнеза - родственники первой степени автоматически относятся к группе высокого риска, если у них нет защитного аллеля НЬА; ίί) генетического статуса - т.е., наличия или отсутствия аллеля НЬА, который связан с высоким риском диабета (например, ΌΚ3/4; ЭО8); ш) наличия или отсутствия высокого титра аутоантител в крови против любого или всех следующих антигенов: инсулина, САЭ65 и/или 1СА512; и ίν) внутривенного теста на толерантность к глюкозе (1УОТТ): низкая секреция инсулина первой фазы, обычно определяемая как менее десятого или первые проценты нормальных контролей, обычно предшествует развитию диабета Ι типа в течение последующих 1-5 лет. Обычно можно учитывать несколько из перечисленных выше критериев. Например, вероятность развития диабета в течение 5 лет у родственника первой степени индивидуума, страдающего диабетом, как установлено, составляет: 100% для родственников, имеющих все 3 вида аутоантител, перечисленных выше; 44% для родственников, имеющих 2 вида антител; 15% для родственников, имеющих один вид антител, и 0,5% для родственников, не имеющих антител. Из 50 родственников первой степени пациентов, страдающих диабетом Ι типа, у 49 имеется один или более перечисленных выше видов аутоантител.

Эффективность лечения диабета можно определить несколькими различными способами. Эффективное лечение удовлетворяет какимлибо из следующих критериев или другим критериям, принятым в данной области техники. Критерии могут включать, но не ограничиваться, задержку развития выраженной гипергликемии, пониженную частоту гипергликемических событий и/или пролонгирование нормальных уровней С-пептида в крови пациентов.

Пептидные аналоги по настоящему изобретению можно вводить как отдельно, так и в виде фармацевтической композиции. Кратко, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут включать один или более пептидных аналогов, описанных в настоящем документе, в комбинации с одним или более фармацевтически или физиологически приемлемых носителей, разбавителей или наполнителей. Такие композиции могут включать буферы, такие как нейтральный физиологический раствор с буфером, физиологический раствор с фосфатным буфером и т.п., углеводы, такие как глюкоза, манноза, сахароза или декстраны, маннит, белки, полипептиды или аминокислоты, такие как глицин, антиоксиданты, хелирующие агенты, такие как ЭДТА или глутатион, адъюванты (например, гидроксид алюминия) и консерванты. Помимо этого, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать также один или более дополнительных активных ингредиентов, таких как, например, системы, обеспечивающие замедленную доставку или другие иммунопотенцирующие вещества.

Композиции по настоящему изобретению могут изготавливаться для конкретного способа введения, включая, например, пероральное, назальное, внутривенное, внутричерепное, интраперитонеальное, подкожное или внутримышечное введение. В других вариантах осуществления настоящего изобретения композиции, описанные в настоящем документе, могут вводиться в виде части имплантата, обеспечивающего замедленное высвобождение активного агента. В еще одних вариантах осуществления настоящего изобретения композиции могут изготавливаться в лиофилизированном виде, с использованием соответствующих наполнителей, которые обеспечивают его стабильность как лифилизата и/или после регидратации.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут вводиться таким способом, который подходит для лечения (или профилактики) заболевания. Количество и частоту введений будут определять такие факторы как состояние пациента, а также тип и тяжесть заболевания пациента. В особенно предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения пептидный аналог можно вводить в дозе от 0,1 до 100 мг/кг, хотя соответствующие дозировки могут определяться в ходе клинических испытаний. Пациенты могут наблюдаться для оценки терапевтической эффективности по задержке прогрессирования клинически выраженного диабета и отсрочке применения инсулина для поддержания нормогликемии, как описано выше.

Следующие примеры предлагаются для иллюстрации настоящего изобретения и не ограничивают его.

Пример 1. Получение пептидов.

Этот пример иллюстрирует синтез репрезентативных пептидных аналогов.

Пептиды синтезировали с помощью твердофазной методики на синтезаторе пептидов (модель Весктап 990). Пептиды с амидированным карбоксильным концом получали с помощью п-метилбензгидриламиновой смолы (смолы МВНА); для пептидов со свободным карбоксильным концом использовали смолу Меррифильда в соединении с соответствующим образом защищенной аминокислотой. Обе смолы получали от компании Васйет Рте Сйетюак (Тоггапсе, СА). Производные аминокислоты (Васйет Рте СйетюаП), которые использовались при синтезе, имели Ь-конфигурацию, если не указывается иное, и функциональную Ν-αаминогруппу, защищенную исключительно тбутилоксикарбонильной группой. Боковые функциональные группы защищали следующим образом: бензилом для серина и треонина; циклогексилом для глутаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты; тосилом для гистидина и аргинина; 2-хлорбензилоксикарбонилом для лизина и 2-бромбензилоксикарбонилом для тирозина. Присоединение аминокислоты с карбоксилом на конце к смоле МВНА осуществляли с помощью дициклогексилкарбодиимида, а последующие аминокислоты присоединяли с помощью дициклогексилкарбодиимида, согласно Ьшд е! а1. (Ргос. №И. Асаб. 8ск И8А 81:4302, 1984). После включения последней аминокислоты т-бутилоксикарбонильную защитную группу удаляли, а конъюгат пептида и смолы обрабатывали смесью 14 мл фтористо-водородной кислоты (НР), 1,4 мл анизола и 0,28 мл метилэтилсульфида на грамм конъюгата при -20°С в течение 0,5 ч и при 0°С в течение 0,5 ч. НР удаляли в вакууме при 0°С и полученную смесь пептида и смолы промывали дважды диэтиловым эфиром и дважды - попеременно хлороформом и диэтиловым эфиром. Пептид экстрагировали пять раз 2 М уксусной кислотой, а экстракт лиофилизировали. Лиофилизированный продукт сначала очищали на колонке с Сефадексом 0-25 Ппе (Рйаттас1а-ЬКВ, Р1кса1а^ау, N1) с применением 30% уксусной кислоты, для удаления усеченных фрагментов и неорганических солей (Ьтд е! а1., 1984). Затем пептиды подвергали дальнейшей очистке с помощью катионообменной хроматографии на карбоксиметилцеллюлозе СМ-32 (Ьтд е! а1., 1984). Конечной очистки достигали посредством распределительной хроматографии на колонке с Сефадексом 0-25 йпе (Ыпд е! а1., 1984). Альтернативно, неочищенный пептид можно очищать с помощью препаративной ЖХВР на градиентной системе Вю!аде КР-100. Этот синтетический продукт изучался с помощью аминокислотного анализа, масс-спектрометрического анализа и ЖХВР с обращенной фазой.

Пример 2. Долгосрочные Т-клеточные линии.

Этот пример иллюстрирует получение долгосрочных Т-клеточных линий ΝΟΌ, специфичных в отношении инсулина.

Специфичные в отношении инсулина Тклеточные линии ΝΟΌ получали путем культивирования лимфоцитов, выделенных из популяций, инфильтрирующих островки, путем стимуляции ίη νίίτο свиным инсулином в концентрации 25 мкг/мл или облученными островковыми клетками ΝΟΌ в присутствии облученных селезеночных клеток ΝΟΌ в качестве антигенпрезентирующих клеток и цитокинов. Для получения инфильтрирующих лимфоцитов ис пользовали следующую процедуру (см. \Уедтапп е! а1., Еиг. 1. 1ттипо1. 24:1853, 1994): поджелудочную железу мышей N00 подвергали ферментативному расщеплению коллагеназой, а отдельные островки выделяли вручную. Инфильтрирующие лимфоциты затем получали с помощью мягкого ферментативного расщепления островков трипсином. Инсулинспецифичные Т-клеточные линии или клоны размножали путем серийной стимуляции в присутствии селезеночных клеток Ν0Ό. свиного инсулина и лимфокинов. Клоны получали путем ограниченного разведения Т-клеточных линий, специфичных в отношении В-цепи (9-23), в присутствии антиген-презентирующих клеток и свиного инсулина в концентрации 25 мкг/мл. Содержимое лунок с растущей популяцией клеток после ограниченного разведения переносили в подходящую среду, и после одного цикла роста тестировали на реактивность в отношении пептида (9-23) В-цепи инсулина путем оценки пролиферативного ответа.

Пример 3. Влияние пептидных аналогов на пролиферацию специфичных в отношении инсулина Т-клеточных клонов Ν0Ό.

Этот пример иллюстрирует влияние репрезентативных пептидных аналогов на пролиферацию Т-клеток.

Т-клеточные клоны мышей (Ν0Ό). специфичные в отношении В-цепи (9-23) инсулина (8ЕЦ ГО № 2), выделяли из инфильтрированных островков, как описано в примере 2. Пептидные аналоги с одним замещением аланином получали, как описано в примере 1. Влияние каждого аналога на пролиферацию Т-клеток затем оценивали с помощью анализа, который выполнялся на 96-луночных микротитрационных планшетах с плоским дном (см. Эаше1 е! а1., Еиг. 1. 1ттипо1. 25:1056, 1995). Кратко, 25000 Тклеточных клонов вместе с 1 миллионом облученных селезеночных клеток Ν0Ό культивировали в присутствии 50 мкг/мл пептида 9-23 Вцепи инсулина или любого из пептидов с замещением аланином, перечисленных ниже, в трех повторностях. Планшеты инкубировали в течение в целом 72 ч в атмосфере 7% диоксида углерода, с нагрузкой 1мкКи тимидина, содержащего тритий, в течение последних 6-8 ч культивирования. Клетки собирали на фильтр из стекловолокна и связанную радиоактивность подсчитывали с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика. Результаты выражали в виде среднего количества импульсов в минуту от трех повторностей культур.

Данные, полученные по пяти отдельным Тклеточным клонам, показали или отсутствие пролиферации, или достоверное снижение пролиферации (относительно нативного пептида 923 В-цепи инсулина; 8ЕЦ ГО № 2) в присутствии следующих аналогов с замещением аланином: А12, А13, А15, А16, А17 и А18. Эти данные представлены в табл. 1 и 2 ниже.

Таблица 1

Ответ (срт) специфичных в отношении инсулина Т-клеточных клонов N00

Измененная позиция	Нативный остаток	Замещение	Т-клеточный клон
ΡΏ6-4.3	ΡΏ12-2.40
9	8	А	12861	42234
10	Н	А	12507	1409
11	ь	А	14148	2594
12	V	А	8292	671
13	Е	А	142	519
14	А	нет
15	Ь	А	161	1422
16	Υ	А	98	539
17	ь	А	553	19321
18	V	А	234	44785
19	С	А	7678	34212
20	о	А	2440	38685
21	Е	А	91	39087
22	К.	А	6555	51722
23	о	А	14304	75441

без антигена			163	682
Нативный 9-23			10463	32221

Таблица 2

Ответ (срт) специфичных в отношении инсулина

Т-клеточных клонов мышей N00

Измененная позиция	Нативный остаток	Замещение	Т-клеточный клон
ΡΏ12-4.4	ΡΏ12- 4.29	ΡΏ12- 4.34
9	8	А	1000	18422	259
10	Н	А	823	15484	356
11	ь	А	474	18416	190
12	V	А	1129	15041	194
13	Е	А	373	891	179
14	А	нет
15	Ь	А	675	809	191
16	Υ	А	779	636	202
17	ь	А	332	1460	4360
18	V	А	225	1193	721
19	С	А	4295	6054	689
20	о	А	1323	13736	466
21	Е	А	7900	4904	773
22	К.	А	1313	12635	1555
23	о	А	3228	18422	791

без антигена			350	789	231
Нативный 9-23			10000	14820	3614

Табл. 3 показывает ответ четырех различных Т-клеточных клонов Ν0Ό на пептидный аналог с двойным замещением аланином А16, А19 (ΝΒΙ-6024; 16У>А/190С>А). Т-клеточные клоны Ν0Ό инкубировали в присутствии 50 мкМ пептида (9-23) нативной В-цепи или ΝΒΙ-6024. Данные в табл. 3 представлены в виде среднего значения от трех повторностей образца ± стандартная ошибка среднего. В табл. 3 И. С. означает индекс стимуляции = пролиферация (срт) в присутствии пептида/пролиферация (срт) только в среде. Эти данные показывают статистически значимый ответ в случае, когда клетки культивировали с пептидом (9-23) нативной Вцепи, и отсутствие пролиферации или незначительную пролиферацию в случае использования только среды (фон) в присутствии ΝΒΙ-6024.

Таблица 3

Пролиферативный ответ Т-клеточных клонов мыши, специфичных в отношении В-цепи (9-23) инсулина, на 50 мкМ В-цепи (9-23) или аналога А^16,19 (ΝΒΙ-6024)

Т-клеточный клон	Экс. №	Только среда	В-цепь (9-23) инсулина	ΝΒΙ-6024 (А¹⁶·¹⁹)
ср.срт±§ет	И.С.	ср.срт±§ет	И.С.
ΡΌ12-2.35	1	688±227	120886±7171	175,7	841±88	1,22
	2	493±20	100521±1581	203,8	452±179	0,91
ΡΌ12-2.40	1	170±8	16730±3835	98,4	272±34	1,16
	2	1834±638	176359±36306	96,16	1863±451	1,01
ΡΌ12-4.1	1	215±17	28593±4664	132,99	566±30	2,63
ΡΌ12-4.9	1	9111±1889	45541±5222	4,99	12313±1372	1,35
	2	7202±2773	65624±4979	9,1	6171±725	0,85

Пример 4. Исследование антагонизма Тклеточной пролиферации.

Этот пример иллюстрирует ингибирование репрезентативными пептидными аналогами ответа мышиных Т-клеточных клонов, специфичных в отношении В-цепи (9-23), на пептид (923) В-цепи инсулина.

Пептидные аналоги В-цепи (9-23), имеющие замещения аланином по остаткам 12, 13, 15 или 16, или пептид с двойным замещением по позициям 16 и 19 (А^16,19; ΝΒΙ-6024) получали как описано в примере 1. Т-клеточный антагонизм выявляли по оценке способности пептидных аналогов ингибировать пролиферацию Тклеток, индуцированную нативной В-цепью (923) (8ЕО ΙΌ № 2). В этом исследовании антигенпрезентирующие клетки сначала облучали, а затем инкубировали с конкурирующими пептидным аналогом и пептидом (9-23) нативной В-цепи. К культуре затем добавляли Т-клетки. В культуры были включены различные концентрации пептидных аналогов-кандидатов, которые инкубировали в течение в сумме 4 дней.

После периода инкубации каждую культуру загружали 1 мкКи [³Н]-тимидина в течение дополнительных 12-18 ч. Культуры затем собирали с помощью фильтров из стекловолокна и подсчитывали радиоактивность, как описано выше. На основе данных для трех повторностей культур рассчитывали среднее СРМ и стандартную ошибку среднего. Результаты, представленные на фиг. 2, показывают, что пептидные аналоги, имеющие замещения аланином по остатку 12, 13 или 16, способны ослаблять ответ патогенных Т-клеток, специфичных в отношении В-цепи (9-23) инсулина.

Способность пептида с двойным замещением ингибировать инсулинзависимую пролиферацию Т-клеток показана в табл. 4 и на фиг. 3. В табл. 4 контрольный пептид, ΝΒΙ-5096, представляет из себя неродственный пептид из основного белка миелина. Процент ингибирования рассчитывали как (1-экспериментальное значение срт/срт для пептида инсулина) х 100%.

Таблица 4

Ингибирование ответа на В-цепь (9-23) инсулина двух Т-клеточных клонов мышей ΝΘΌ пептидным аналогом

Клон	Условия	СРМ ± 8ЕМ	% ингибирования
ΡΌ12-2.35	Только среда	213±17
	В(9-23) 5 мкМ	7840±528
	В(9-23) 5 мкМ+10 мкМ ΝΒΙ-6024	4441±626	43,0
	В(9-23) 5 мкМ+50 мкМ ΝΒΙ-6024	1389±218	82,0
	В(9-23) 5 мкМ+10 мкМ ΝΒΙ-5096	10089±1113	н/п
	В(9-23) 5 мкМ+50 мкМ ΝΒΙ-5096	10125±887	н/п
ΡΌ12-2.40	Только среда	305±13
	В(9-23) 5 мкМ	9149±1062
	В(9-23) 5 мкМ+10 мкМ ΝΒΙ-6024	6379±1485	30,0
	В(9-23) 5 мкМ+50 мкМ ΝΒΙ-6024	4305±941	52,9
	В(9-23) 5 мкМ+10 мкМ ΝΒΙ-5096	12336±1556	н/п
	В(9-23) 5 мкМ+50 мкМ ΝΒΙ-5096	17988±584	н/п

н/п = не применимы, поскольку ингибирования не наблюдается.

Способность ΝΒΙ-6024 блокировать стимуляцию Т-клонов мышей ΝΘΌ, индуцированную пептидом (9-23) В-цепи, позволяет предположить, что изменения по позициям 16 и 19 пептида (9-23) В-цепи нативного инсулина не изменяют способности аналога распознаваться патогенными Т-клетками. Более того, эти результаты показывают, что аналог также связывается с МНС с достаточной степенью сродства, чтобы происходило распознавание Т-клетками, специфичными в отношении В-цепи (9-23) инсулина.

Пример 5. Влияние пептидных аналогов на пролиферацию Т-клеточных линий и клонов пациентов, страдающих диабетом.

Этот пример иллюстрирует отсутствие стимуляции Т-клеточных линий и клонов, полученных от пациентов, страдающих диабетом, репрезентативными пептидными аналогами.

Пептидные аналоги (9-23) В-цепи, имеющие замещения аланином по остаткам 13, 15, 16 или 17, или двойные замещения аланином А^16,19(ΝΒΙ-6024), получали как описано в примере 1. Т-клеточные линии от пациентов, страдающих диабетом, получали путем выделения лимфоцитов из крови пациента с помощью сепарации крови в градиенте плотности. Выделенные лимфоциты затем культивировали в присутствии пептида (9-23) В-цепи инсулина (10 мкМ) и рекомбинантного человеческого 1Ь-2 в присутствии 5-10% аутологичной сыворотки крови и облучали аутологичные лимфоциты периферической крови в культуральной среде. Спустя четыре-пять дней клетки собирали и весь цикл повторяли еще 2-3 раза.

Пролиферацию Т-клеточной линии в ответ на пептид (9-23) нативной В-цепи (8ЕО ΙΌ № 2) или на пептидные аналоги измеряли путем культивирования 25000-100000 Т-клеток в присутствии 50000-200000 облученных аутологичных лимфоцитов периферической крови и различных концентраций пептида (9-23) В-цепи инсулина или пептидного аналога в трех повторностях культур. Через 4-5 дней культивирования, включая последние 18 ч с радиоактивным тимидином, клетки собирали и связанную радиоактивность подсчитывали на жидкостном сцинтилляционном счетчике. Результаты представлены в виде среднего количества импульсов за минуту для каждого из изучавшихся пептидных аналогов.

Результаты, представленные на фиг. 4-7, показывают, что Т-клеточные линии и клоны, которые пролиферируют в ответ на пептид (9-23) Вцепи нативного инсулина (8ЕО ΙΌ № 2), не стимулируются пептидными аналогами. Результаты по этим и другим пациентам суммированы в табл. 5.

Таблица 5 Нролифератавный ответ лимфоцитов периферической крови пациентов на пептид нативного инсулина или аналог ΝΒΙ-6024

Номер пациента	ГО пациента	Индекс стимуляции*
В (9-23) инсулина [50 мкМ]	ΝΒΙ-6024 [50 мкМ]
1	100	9,9	0,9
2	200	5,3	1,2
3	400	7,8	1,0
4	500	2,1	0,9
5	600	5,8	1,6
6	700	3,2	1,5
7	900	2,6	0,9
8	1100	3,7	0,8

* Индекс стимуляции = СРМ с антигеном/СРМ только в среде (без антигена)

Эти результаты ясно показывают, что клетки, взятые от пациентов, страдающих диабетом, которые отвечают на пептид (9-23) Вцепи инсулина, не реагировали на лиганд измененного пептида, ΝΒΙ-6024, который имел замещения в положениях 16 и 19. Авторы также установили, что АРЬ (измененный пептидный лиганд) ΝΒΙ-6024 с тем же сродством связывается с антигенами ЭО8. Таким образом, отсутствие стимуляции Т-клеток, полученных от пациентов, страдающих диабетом, пептидом ΝΒΙ6024 происходит не из-за какой бы то ни было несовместимости пептида с молекулами, презентирующими МНС, а благодаря более вероятно измененному распознаванию Т-клетками, специфичными в отношении В-цепи (9-23).

Пример 6. Снижение частоты диабета у мышей ΝΘΌ.

Этот пример иллюстрирует способность репрезентативных пептидных аналогов предотвращать развитие диабета у мышей ΝΘΌ.

У мышей ΝΘΌ диабет развивается спонтанно, начиная приблизительно с 3-месячного возраста (Макшо е! а1., Ситгеп! Торюк ίη Сйшеа1 аиб Ехрептеп1а1 Акрее!к о! Э|аЬе1ек Ме11йик, 8акатобо е! а1., ебк., р. 25-32 (Е1кеу1ет, Атк1етбат, 1985)). Этому заболеванию предшествует инфильтрация поджелудочной железы Тклетками, которая начинается уже в возрасте одного месяца. Растворимые пептидные аналоги В-цепи (9-23), имеющие замещения аланином по остаткам 12, 13 или 16, вводили подкожно мышам ΝΘΌ с недельными интервалами. Десяти животным каждый раз вводили по 400 мкг каждого пептида. После 9 введений оценивали процент мышей в каждой экспериментальной группе, у которых развился диабет, путем измерения с недельными интервалами уровней глюкозы в крови с помощью глюкометра. Величины более 200 мг/дл глюкозы крови по результатам двух последовательных измерений рассматривались как показатель клинически выраженного диабета.

Как показано на фиг. 8, лечение каждым из аналогов с замещением аланином приводило к выраженному снижению частоты диабета. Данные по замещенному аналогу А13 также представлены на фиг. 9.

В другом эксперименте В-цепь (9-23), замещенный аналог А13 или нейротензин (в качестве контроля) вводили подкожно мышам ΝΘΌ с недельными интервалами. Десяти животным каждый раз вводили по 400 мкг каждого пептида. После 13 введений процент мышей в каждой экспериментальной группе, у которых развился диабет, оценивали, как описано выше. Как показано на фиг. 10, пептид (9-23) В-цепи снижал частоту диабета. Это снижение было более выраженным при использовании замещенного аналога А13.

Для определения способности пептида с двойным замещением А^16,19 (ΝΒΙ-6024) контро21 лировать развитие диабета у мышей ΝΘΌ пептид вводили животным в раннем возрасте. Так, самок мышей (п=9, приблизительно 4недельного возраста) лечили подкожным введением 20 мг/кг (400 мкг на мышь) ΝΒΙ-6024 в течение 12 недель, а затем введением один раз в две недели до достижения ими возраста 35 недель. Начиная с 9-10-недельного возраста у мышей ежедневно проверяли наличие гипергликемии, измеряя уровни глюкозы в крови. В качестве контроля брали группу из 10 самок мышей без лечения. Результаты этого эксперимента представлены на фиг. 11. Как можно видеть, лечение ΝΒΙ-6024 достоверно снижало частоту диабета приблизительно на 60-70% по сравнению с нелеченной группой (р < 0,004).

Эти наблюдения затем были подтверждены и расширены в ходе второго эксперимента. Животных (п=13-15) лечили ΝΒΙ-6024 или неродственным пептидом, нейротензином, ΝΒΙ6201, как описано выше. Дополнительную группу (п=8) оставили без лечения. Как показано на фиг. 12, лечение 20 мг/кг измененного пептида, ΝΒΙ-6024, приводило к снижению частоты диабета по сравнению как с группой, получавшей нейротензин, так и нелеченной группой.

Эти результаты показывают, что измененный пептидный лиганд ΝΒΙ-6024, построенный на основе пептида (9-23) В-цепи инсулина, был способен обеспечить защиту животных группы риска спонтанного развития диабета. Вероятно, у этих животных имеются Т-клетки, которые распознают другие антигены поджелудочной железы, хотя они, как представляется, также регулируются АРЬ инсулина. Время введения было приблизительно тем же, когда аутореактивные лимфоциты начинают инфильтрировать поджелудочную железу и инициировать процесс разрушения. Эти результаты вселяют надежду на то, что раннее вмешательство с помощью этого АРЬ может оказаться полезным для отсрочки или предотвращения проявления диабета Ι типа у людей.

Пример 7. Иммуногенность репрезентативных пептидных аналогов.

Этот пример иллюстрирует иммуногенность репрезентативных пептидных аналогов у мышей ΝΘΌ.

Группы из 3-4 мышей ΝΘΌ иммунизировали подкожным введением 100-400 мкг пептидных аналогов в маннит-ацетатном буфере три раза за период времени 10-15 дней. После последней иммунизации клетки лимфатических узлов и/или клетки селезенки использовали для пролиферативных исследований, при которых клетки культивировали с различными концентрациями иммунизирующего пептида в течение 3-4 дней. Последние 18 ч культивирования осуществляли с меченным тритием тимидином. Клетки затем собирали и подсчитывали их радиоактивность с помощью сцинтилляционного счетчика, а ответ выражали в виде СРМ ± 8ЕМ. Эти результаты, представленные на фиг. 13-16, показывают, что эти репрезентативные пептидные аналоги обладают способностью связываться с молекулами МНС мышей и распознаваться соответствующими Т-клетками.

Затем определяли способность пептида с двойным замещением ΝΒΙ-6024 (А^16,19) индуцировать клеточный иммунный ответ у мышей линии ΝΘΌ. Двух самок мышей ΝΘΌ иммунизировали 10 мг/кг ΝΒΙ-6024 в виде водной суспензии или в качестве контроля в эмульгированном в полном адъюванте Фрейнда (СЕА) виде. На 8 день, спустя три дня после последней инъекции, мышей умерщвляли, удаляли и объединяли клетки селезенки и паховых лимфатических узлов и приготавливали однородные клеточные суспензии. Клетки культивировали в присутствии различных концентраций (0-25 мкМ) ΝΒΙ-6024. Способность этих лимфоидных клеток пролиферировать в ответ на ΝΒΙ-6024 определяли ίη νίΐτο с помощью включения [³Н]тимидина.

Результаты представлены в табл. 6 и выражены в виде среднего СРМ ± 8ЕМ от трех повторностей культур. Клетки лимфатических узлов, выделенные от мышей, иммунизированных аналогом в СЕА, демонстрировали мощный дозозависимый пролиферативный ответ на введение иммунизирующего аналога (табл. 6). Эти результаты показывают, что изменения, сделанные в последовательности (9-23) В-цепи нативного инсулина по позициям 16 и 19, не влияли на способность пептида присоединяться к связанной с заболеванием молекуле гаплотипа МНС мышей ΝΘΌ и, что более важно, не мешали распознаванию Т-клетками.

Таблица 6 Пролиферативный ответ клеток лимфатических узлов на ΝΒΙ-6024 мышей ΝΘΌ, иммунизированных ΝΒΙ-6024 в СЕА

ΝΒΙ-6024, мкМ	Пролиферативный ответ (СРМ ± 8ЕМ)
0	2445 ±137
1	140061 ± 7289
5	187711±2548
25	218149 ± 4462

Помимо этого, клетки как селезенки, так и паховых лимфатических узлов, выделенные из растворимого введенного пептида, демонстрировали мощный пролиферативный ответ на АРЬ при введении ίη νίΐτο ΝΒΙ-6024 (табл. 7 и фиг. 17А и 17В). Еще более впечатляющим является тот факт, что лимфоциты мышей, производные от ΝΒΙ-6024, иммунизированные растворимым пептидом, также реагировали на В-цепь (9-23) инсулина. Это свойство перекрестного реагирования не наблюдалось в случае эмульгированного в СЕА пептида. Эта способность растворимого пептида индуцировать перекрестное реагирование может быть желательным для кон23 троля диабета, поскольку оно может помочь мобилизовать защитные Т-клетки, специфичные в отношении ΝΒΙ-6024, в патогенную тканьмишень.

Таблица 7

Пролиферативный ответ на ΝΒΙ-6024 или В-цепь (9-23) нативного инсулина Т-клеток мышей ΝΘΌ, иммунизированных растворимым ΝΒΙ-6024

Т-клеточная линия, индуцированная ΝΒΙ-6024	Концентрация пептида [мкМ]	СРМ ± 8ЕМ ΝΒΙ-6024	СРМ ± 8ЕМ В-цепь (9-23)инсулина
Мышь № 1	0	19130±2191	19130±2191
	1	48319± 1918	16870 ± 4469
	5	160673 ± 2269	21292±3216
	25	268005± 11198	33317±3619

Мышь № 2	0	21588±2326	21588±2326
	1	54519±5666	17262 ± 602
	5	126123± 13851	19648±2169
	25	202707±8125	30612±3557

Мышь № 3	0	24006 ± 2803	24006 ± 2803
	1	64239 ± 9493	25825±3841
	5	140836± 11778	58567 ± 2737
	25	240278± 15015	113366±515

Для определения типа Т-клеток, полученных после введения растворимого ΝΒΙ-6024, культуральные супернатанты от иммунных лимфоидных клеток удаляли спустя 48 ч после инициации культуры и определяли уровни различных цитокинов с помощью стандартной методики ЕЫ8А. Неожиданно оказалось, что цитокины, которые вырабатывались Т-клетками мышей, иммунизированных растворимым ΝΒΙ6024, принадлежат к цитокинам Т112. интерлейкину-4 (фиг. 18) и интерлейкину-5 (табл. 8), а не к интерлейкину-2, полученному от ТЫ. В табл. 8 величины выражены в пг/мл в виде среднего от трех повторностей ± 8ЕМ. В качестве контроля, ΝΒΙ-6024, эмульгированный в СЕА, действительно индуцировал ожидаемый профиль цитокинов ТЫ (ΙΕ-2) у иммунных Т-клеток после стимуляции ίη νίίτο.

Таблица 8

Цитокиновый ответ индуцированных ΝΒΙ-6024 Т-клеток, культивированных ΝΒΙ-6024

ΝΒΙ-6024 [мкМ]	Цитокин, пг/мл
ΙΕ-2	Щ-4	ΙΕ-5
0	< 15 пг/мл	134 ± 0	1814±332
1	< 15 пг/мл	684 ± 92	9999 ± 503
5	< 15 пг/мл	1653±51	23496 ± 684
25	< 15 пг/мл	2102 ± 85	28062±141

Способность подкожного введения ΝΒΙ6024 в растворенном виде индуцировать ТИ2подобные клетки является желательным свойством, поскольку эти клетки связаны с выздоровлением от диабета и других органоспецифичных аутоиммунных заболеваний (8а1Уе1шск, 1. Ехр. Моб. 184:1597-1600, 1996; 8Иаи е1 а1., 1997; НаЕка е1 а1., 1. Ехр. Меб. 186:385-391, 1997). Эти цитокины, производные от ТИ2, обладают мощным противовоспалительным действием, которое подавляет развитие провоспалительных ци токин-секретирующих аутореактивных клеток ТИ1, которые опосредуют заболевание.

Из всего вышеизложенного очевидно, что, несмотря на то, что конкретные варианты осуществления настоящего изобретения описаны с целью иллюстрации настоящего изобретения, возможны различные модификации без отступления от идеи и объема настоящего изобретения. Соответственно настоящее изобретение ограничивается только прилагаемой формулой изобретения.

Перечень аминокислотных последовательностей <110> КеигосгЬпе В1озс1епсе5у 1пс.

<120> СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ДИАБЕТА С ПОМОЩЬЮ ПЕПТИДНЫХ АНАЛОГОВ

ИНСУЛИНА <130> 690068.448РС <140 РСТ <141> 1999-02-23 <160> 2 ' <170 РаОпБ1п Уег. 2.0 <210 1 <211> ЗС <212> РР.Т <213> Ното зарбепз <220>

<223> В-	-цепь	человеческого инсулина
<400> 1									С
РЬе Уа1	Азп	С1п	Нхз	Ьеи	Суз С1у	5ег	Нхз	Ьеи	Уа1	С1и АХа	Ьеи
1			5				10				15
Туг Ьеи	Уа1	Суз	С1у	01и	Агд С1у	РЬе	РЬе	Туг	ТЬг	Рго Ьуз	ТЬг
			20			25					30

<210> 2 <211> 15 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз <220 <223> Остатки 9-23 В-цепи человеческого инсулина <400> 2

Зег Ηί3 Ьеи Уа1 С1и А1а Ьеи Туг Ьеи Уа1 Суз С1у 61и Агд 01у

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Пептидный аналог, включающий остатки с 9 по 23 В-цепи человеческого инсулина, отличающийся по своей последовательности от остатков с 9 по 23 В-цепи нативного человеческого инсулина вследствие замещений по 2-4 положениям аминокислот, причем, по меньшей мере одно замещение имеется по остатку, выбранному из группы, состоящей из остатков 12, 13, 15 и 16.
2. Пептидный аналог по п.1, отличающийся тем, что пептидный аналог имеет последовательность, отличающуюся от В-цепи нативного человеческого инсулина по двум аминокислотным остаткам.
3. Пептидный аналог по п.1, отличающийся тем, что пептидный аналог имеет последовательность, отличающуюся от В-цепи нативного человеческого инсулина по трем аминокислотным остаткам.
4. Пептидный аналог по п.1, отличающийся тем, что аминокислотное замещение имеется по остатку 19.
5. Пептидный аналог по п.1, отличающийся тем, что по меньшей мере одно аминокислотное замещение является неконсервативным.
6. Пептидный аналог по п.1, отличающийся тем, что остаток 12 замещен.
7. Пептидный аналог по п.6, отличающийся тем, что остаток 12 представляет собой остаток аланина.
8. Пептидный аналог по п.1, отличающийся тем, что остаток 13 замещен остатком аланина.
9. Пептидный аналог по п.1, отличающийся тем, что остаток 15 замещен.
10. Пептидный аналог по п.9, отличающийся тем, что остаток 15 представляет собой остаток аланина.
11. Пептидный аналог по п.1, отличающийся тем, что остаток 16 замещен.
12. Пептидный аналог по п.11, отличающийся тем, что остаток 16 представляет собой остаток аланина.
13. Пептидный аналог по любому из пп.612, отличающийся тем, что остаток 19 замещен.
14. Пептидный аналог по п.13, отличающийся тем, что остаток 19 представляет собой остаток аланина.
15. Пептидный аналог по п.1, дополнительно включающий остаток 24 В-цепи человеческого инсулина.
16. Пептидный аналог по п.1, отличающийся тем, что пептидный аналог включает не более 18 остатков В-цепи человеческого инсулина.
17. Пептидный аналог по п.1, отличающийся тем, что пептидный аналог включает не более 16 остатков В-цепи человеческого инсулина.
18. Пептидный аналог по п.1, отличающийся тем, что пептидный аналог включает не более 15 остатков В-цепи человеческого инсулина.
19. Пептидный аналог, по существу состоящий из остатков с 9 по 23 В-цепи человеческого инсулина, отличающийся по своей последовательности от остатков с 9 по 23 В-цепи нативного человеческого инсулина вследствие замещений по 2-4 положениям аминокислот, причём по меньшей мере одно замещение имеется по остатку, выбранному из группы, состоящей из остатков 12, 13, 15 и 16.
20. Пептидный аналог, по существу состоящий из остатков с 9 по 24 В-цепи человеческого инсулина, отличающийся по своей последовательности от остатков с 9 по 23 В-цепи нативного человеческого инсулина вследствие замещений по 2-4 положениям аминокислот, причём по меньшей мере одно замещение имеется по остатку, выбранному из группы, состоящей из остатков 12, 13, 15 и 16.
21. Фармацевтическая композиция, включающая пептидный аналог по любому из пп.118 в сочетании с физиологически приемлемым носителем или разбавителем.
22. Способ ингибирования развития диабета, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.21.
23. Способ лечения диабета, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.21.
24. Пептидный аналог, включающий остатки с 9 по 23 В-цепи человеческого инсулина, отличающийся по своей последовательности от остатков с 9 по 23 В-цепи нативного человеческого инсулина вследствие замещений по остаткам 16 и 19.
25. Фармацевтическая композиция, включающая пептидный аналог по п.24 в сочетании с физиологически приемлемым носителем или разбавителем.
26. Способ ингибирования развития диабета, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.25.