SK12412000A3

SK12412000A3 - Metódy liečenia diabetu použitím peptidových analógov inzulínu

Info

Publication number: SK12412000A3
Application number: SK1241-2000A
Authority: SK
Inventors: Amitabh Gaur; Nicholas Ling; Paul J. Conlon
Original assignee: Neurocrine Biosciences, Inc.
Priority date: 1998-02-23
Filing date: 1999-02-23
Publication date: 2002-05-09
Also published as: CN1241942C; PL342517A1; US6197926B1; AU741037B2; HUP0100928A2; OA11453A; EA200000872A1; ID26788A; NZ506447A; HUP0100928A3; JP2002504491A; CA2321929A1; AU2783199A; IL137904A0; EA003944B1; WO1999042482A1; AP2000001888A0; BR9908178A; NO20004198D0; KR20010041238A

Description

Predkladaný vynález sa všeobecne týka peptidových analógov inzulínu, presnejšie sa týka spôsobov liečby diabetes mellitus pomocou peptidových analógov odvodených od zvyškov 9-23 B-reťazca ľudského inzulínu.

Doterajší stav techniky

Diabetes mellitus závislý od inzulínu (IDDM) je orgánovo špecifické autoimunitné ochorenie postihujúce takmer milión pacientov v rôznych vekových skupinách v Spojených štátoch amerických. Ochorenie je charakterizované rozsiahlou deštrukciou beta buniek v pankreatických ostrovčekoch produkujúcich inzulín a poruchou regulácie metabolizmu glukózy, ktorá vedie ku klinickému diabetu. Definujúcou vlastnosťou IDDM je lymfocytárna infiltrácia ostrovčekov. Z infiltrujúcich buniek sa zdajú byť T-lymfocyty jedným z hlavných mediátorov autoimunitnej deštrukcie.

Diabetes I. typu je ďalej charakterizovaný zvýšenou koncentráciou protilátok proti rôznym antigénom asociovaným s ostrovčekmi, vrátane inzulínu, GAD65, GAD67 a ICA512. Tieto protilátky môžu byť detegované so značným predstihom vzhľadom na klinické ochorenie a imunitnú odpoveď proti takýmto antigénom môže byť použitá ako predikčný znak vznikajúceho diabetu u pacientov s predisponujúcimi genetickými (HLA) haplotypmi.

V súčasnosti sú pacienti na udržiavanie normoglykémie závislí od injekcií inzulínu. Inzulín je polypeptidový hormón skladajúci sa z dvoch disulfidovou väzbou viazaných reťazcov, A reťazca skladajúceho sa z 21 aminokyselinových zvyškov a B reťazca skladajúceho sa z 30 zvyškov. Hoci znamená podávanie inzulínu značný prínos pre pacientov trpiacich diabetom, je z dôvodu krátkeho sérového polčasu inzulínu ťažké udržiavanie správneho dávkovania. Podávanie inzulínu môže viesť k rozvoju rôznych hypoglykemických vedľajších účinkov a ku tvorbe neutralizačných r r protilátok.

Z dôvodu problémov spojených s existujúcou liečbou diabetu trvá potreba zlepšenej liečby, ktorá by bola účinnejšia, a ktorá by nebola spojená s takými nevýhodami. Predkladaný vynález využíva peptidové analógy, ktoré antagonizujú odpoveď T-lymfocytov na inzulín, na účinnú liečbu diabetu a ďalej poskytuje s týmto účinkom súvisiace výhody.

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález poskytuje zlúčeniny a spôsoby na liečbu a prevenciu diabetu. V niektorých aspektoch poskytuje predkladaný vynález peptidové analógy obsahujúce zvyšky 9 až 23 B reťazca ľudského inzulínu (SEQ ID NO: 2), kde sekvencie týchto peptidových analógov sa líšia od sekvencie zvyškov 9 až 23 prirodzeného ľudského B reťazca inzulínu v substitúciách v 1 až 4 aminokyselinách. Také substitúcie môžu byť uskutočnené v jednom alebo viac zvyškoch vybraných zo skupiny skladajúcej sa zo zvyškov 12, 13, 15 a 16- s- alebo bez ďalších substitúcií v iných zvyškoch. V niektorých výhodných uskutočneniach môžu byť také substitúcie prítomné v dvoch alebo troch aminokyselinových zvyškoch vo vnútri zvyškov 9 až 23 B reťazca inzulínu. Substitúcie môžu byť prítomné tiež vo zvyšku 19. Substitúcie sú výhodne nekonzervatívne a výhodné sú analógy, v ktorých sú zmenené zvyšky 12, 13, 15, 16 a/alebo 19 (napríklad na alanín). Tiež sú výhodné analógy, ktoré ďalej obsahujú zvyšok 24 B reťazca inzulínu. V niektorých iných uskutočneniach obsahujú peptidové analógy nie viac ako 18 zvyškov, nie viac ako 16 zvyškov a nie viac ako 15 zvyškov B reťazca ľudského inzulínu.

V ďalších uskutočneniach sa skladajú peptidové analógy v podstate zo zvyškov 9 až 23 alebo 9 až 24 B reťazca ľudského inzulínu (SEQ ID NO: 2), kde sekvencie týchto peptidových analógov sa líšia od sekvencie zvyškov 9 až 23 prirodzeného ľudského B reťazca inzulínu v substitúciách v 1 až 4 aminokyselinách a kde je aspoň jedna substitúcia uskutočnená vo zvyšku vybranom zo skupiny skladajúcej sa zo zvyškov 12, 13, 15 a 16.

V ďalšom aspekte vynález poskytuje farmaceutické prostriedky obsahujúce peptidový analóg opísaný vyššie v kombinácii s fyziologicky prijateľným nosičom alebo rozpúšťadlom.

Predkladaný vynález ďalej obsahuje spôsob na liečbu a/alebo inhibíciu vzniku diabetu, ktorý obsahuje podanie terapeuticky účinného množstva farmaceutického prostriedku, ako bol opísaný vyššie, pacientovi.

Tieto a ďalšie aspekty vynálezu budú jasné z nasledujúceho podrobného opisu a pripojených výkresov. Ďalej sú v texte uvedené rôzne odkazy, ktoré podrobne opisujú niektoré postupy alebo prostriedky. Tieto odkazy sú tu všetky uvedené vo svojej úplnosti.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 ukazuje aminokyselinovú sekvenciu zvyškov 9-23 B reťazca inzulínu (SEQ ID NO: 2);

Obr. 2 je graf ukazujúci proliferatívnu odpoveď (meranú v cpm) klonu Tlymfocytov NOD myší na (9-23) peptid prirodzeného B reťazca inzulínu za prítomnosti rôznych množstiev reprezentatívnych peptidových analógov, v ktorých sú rôzne zvyšky substituované alanínom, ako je uvedené.

Obr. 3 je graf ukazujúci proliferatívnu odpoveď (meranú v cpm) klonu Tlymfocytov NOD myší na (9-23) peptid prirodzeného B reťazca inzulínu za prítomnosti rôznych množstiev reprezentatívnych peptidových analógov, v ktorých sú aminokyseliny v pozíciách 16 a 19 substituované alanínom (NBI-6024, štvorčeky). Na porovnanie je tiež uvedená proliferatívna odpoveď za prítomnosti nepríbuzného kontrolného peptidu odvodeného z myelínového bázického proteínu (NBI-5096, krúžky). Odpoveď je meraná ako priemer CPM ± SEM pre tri kultúry.

Obr. 4-6 sú histogramy ilustrujúce proliferatívnu odpoveď (meranú v cmp) bunkovej línie T-lymfocytov od pacientov s diabetom na (9-23) peptid prirodzeného B reťazca alebo na reprezentatívne peptidové analógy. Mononukleárne bunky periférnej krvi boli izolované od pacientov s diabetom a boli kultivované za prítomnosti (9-23) peptidu B reťazca inzulínu. Po troch cykloch restimulácie B reťazcom inzulínu (9-23) bolo do každej jamky s oblým dnom 96-jamkovej platne pridané v kompletnom médiu 1 x 10⁵ T-lymfocytov a 7 x 10⁴ ožiarených autológnych PBMC. Bunky boli kultivované počas 5 dní s NBI-6024 (inzulínový B reťazec 9-23 s e r alanínovými substitúciami v pozíciách 16 a 19), inzulínovým B reťazcom (9-23) alebo iba s médiom. V deň 4 boli bunky vystavené pulzu ³H-tymidínu a bola uskutočnená kultivácia počas ďalších 18 hodín. Kultúry boli potom zbierané, odčítané s použitím kvapalinového scintilačného počítača a dáta boli vyjadrené ako priemerný počet pulzov za minútu (cpm) pre opakovane uskutočnené vzorky ± štandardná odchýlka (SEM).

Obr. 7 je histogram ilustrujúci proliferatívnu odpoveď (meranú v cmp) bunkovej línie T-lymfocytov od pacientov s diabetom na (9-23) peptid prirodzeného B reťazca alebo na reprezentatívne peptidové analógy obsahujúce uvedené alanínové substitúcie. Mononukleárne bunky periférnej krvi boli izolované od pacientov s diabetom a boli kultivované za prítomnosti (9-23) peptidu B reťazca inzulínu. Po troch cykloch restimulácie B reťazcom inzulínu (9-23) bolo do každej jamky s oblým dnom 96-jamkovej platne pridané v kompletnom médiu 1 x 10⁵ Tlymfocytov a 7 x 10⁴ ožiarených autológnych PBMC. Bunky boli kultivované počas 5 dní s analógom, inzulínovým B reťazcom (9-23) alebo iba s médiom (BKG), ako je uvedené. V deň 4 boli bunky vystavené pulzu ³H-tymidínu a bola uskutočnená kultivácia počas ďalších 18 hodín. Kultúry boli potom zbierané, odčítané s použitím kvapalinového scintilačného merania a dáta boli vyjadrené ako priemerný počet pulzov za minútu (cpm) pre opakovane uskutočnené vzorky ± štandardná odchýlka (SEM).

Obr. 8 je graf ukazujúci percento samíc NOD myší, ktoré boli diabetické po 9 týždňoch liečby reprezentatívnymi peptidovými analógmi. 10 myší bolo liečených subkutánne ódo dňa 24 peptidovými analógmi B reťazca (9-23) obsahujúcimi alanínové substitúcie vo zvyšku 12 (prázdne trojuholníčky), 13 (štvorčeky) alebo 16 (plné trojuholníčky). Všetky myši liečené kontrolným peptidom, neurotenzínom (krúžky), mali diabetes.

Obr. 9 je graf ukazujúci rovnaké dáta ako obr. 8, ale zobrazuje iba skupinu liečenú A13 analógom a skupinu liečenú kontrolným peptidom (neurotenzínom).

Obr. 10 je graf ukazujúci percento samíc NOD myší, ktoré bolí diabetické po 13 týždňoch liečby reprezentatívnymi peptidovými analógmi. 10 myší bolo liečených subkutánne odo dňa 24 400 pg neurotenzínu (štvorčeky), B reťazcom (9-23) (kosoštvorčeky) alebo peptidovým analógom B reťazca (9-23) obsahujúcim alanínovú substitúciu vo zvyšku 13 (trojuholníčky).

Obr. 11 je graf ukazujúci efekt reprezentatívnych peptidových analógov na incidenciu diabetu u NOD myší. Štyri týždne staré samice NOD myší (n=9) boli liečené subkutánnymi injekciami 20 mg/kg NBI-6024 (A^16,19) v týždňových intervaloch počas 12 týždňov a potom každý druhý týždeň do veku 35 týždňov. Kontrolná skupina (n=10) sa skladala z neliečených zvierat. Myši s koncentráciou glukózy v krvi vyššou ako 200 mg/dl pri dvoch nasledujúcich meraniach boli považované za diabetické myši. Dáta sú vyjadrené ako percentá nediabetických myší v priebehu 35týždennej štúdie. Log-rank test bol použitý na hodnotenie toho, či sú výsledky pre dve liečebné skupiny štatisticky významne odlišné. Percento NOD myší, ktoré boli diabetické po liečbe NBI-6024 (A^16,19) je uvedené pre rôzne časy štvorčekmi a percento myší, ktoré boli diabetické v kontrolnej skupine, je uvedené kolieskami.

Obr. 12 je graf ukazujúci vplyv reprezentatívnych peptidových analógov na incidenciu diabetu u NOD myší. Štyri týždne staré samice NOD myší (n=13-15) boli liečené subkutánnymi injekciami 20 mg/kg NBI-6024 (A^16,19) alebo NBI-6201 (kontrolným peptidom, neurotenzínom) v týždenných intervaloch počas 12 týždňov a potom každý druhý týždeň do veku 35 týždňov. Ďalšia kontrolná skupina (n=8) sa skladala z neliečených zvierat. Myši s koncentráciou glukózy v krvi vyššou ako 200 mg/dl pri dvoch nasledujúcich meraniach boli považované za diabetické myši. Dáta sú vyjadrené ako percentá nediabetických myší v priebehu 35-týždennej štúdie. Logrank test bol použitý na hodnotenie toho, či sú výsledky pre dve liečebné skupiny štatisticky významne odlišné. Percento NOD myší, ktoré boli diabetické po liečbe NBI-6024 (A^16,19) je uvedené pre rôzne časy štvorčekmi, percento diabetických myší po liečbe neurotenzínom je uvedené trojuholníčkami a percento myší, ktoré boli diabetické v kontrolnej skupine, je uvedené kolieskami.

Obr. 13A-13D sú grafy ilustrujúce imunogenicitu reprezentatívnych peptidových analógov obsahujúcich zvyšky (9-23) B reťazca s alanínovými substitúciami vo zvyšku 12 (obr. 13A), zvyšku 13 (obr. 13B), zvyšku 15 (obr. 13C) alebo vo zvyšku 16 (obr. 13D). NOD myšiam bol injekčné podaný 2-4 krát podkožné peptidový analóg v solubilnej forme pred tým, ako bola testovaná proliferatívna odpoveď buniek lymfatických uzlín na rôzne koncentrácie peptidového analógu alebo peptidu (9-23) prirodzeného B reťazca. Proliferatívna odpoveď bola stanovená r c podľa množstva rádioaktívne značeného tymidínu inkorporovaného do buniek (v grafe uvedené ako priemerný počet pulzov za minútu (cpm) troch kultivačných jamiek), ktoré bolo stanovené v kvapalinovom scintilačnom počítači po dokončení kultivačnej periódy.

Obr. 14A-14F sú grafy ukazujúce imunogenicitu šiestich rôznych peptidových analógov u NOD myší. Peptidové analógy s dvoma alanínovými substitúciami (A12.13; A12.15; A12.16; A13.15; A13.16 a A15,16) boli injekčné podané NOD myšiam a po 10 dňoch boli ich bunky lymfatických uzlín použité v proliferačnom teste s použitím rôznych koncentrácií imunizačného peptidu ako stimulátora. Proliferatívna odpoveď bola stanovená podľa množstva rádioaktívne značeného tymidínu inkorporovaného do buniek (v grafe uvedené ako priemerný počet pulzov za minútu (cpm) troch kultivačných jamiek), ktoré bolo stanovené v kvapalinovom scintilačnom počítači po dokončení kultivačnej periódy.

Obr. 15A-15D sú grafy ilustrujúce imunogenicitu reprezentatívnych dvojito substituovaných peptidových analógov inzulínového B reťazca (9-23). Nasledujúce peptidy boli. testované na schopnosť vyvolávať imunitnú odpoveď u NOD myší: A12,19 (obr. 15A); A13,19 (obr. 15B); A15.19 (obr. 15C); A16,19 (obr. 15D). Je uvedená proliferatívna odpoveď (v počte pulzov za minútu) buniek spádovej lymfatické uzliny v reakcii na imunizačný analóg a tiež na peptid (9-23) prirodzeného inzulínového B reťazca.

Obr. 16 je graf ukazujúci schopnosť série trojnásobne substituovaných peptidov vyvolať proliferatívnu odpoveď T-lymfocytov u NOD myší. Myši boli imunizované jednotlivo reprezentatívnymi peptidovými analógmi obsahujúcimi nasledujúce kombinácie substitúcií: A12,13,19; A12,15,19; A12,16,19; A13,15,19; alebo A13,16,19; A15,16,19. Bunky lymfatických uzlín boli potom použité v proliferačnom teste a je uvedená reakcia na každý imunizačný peptid v rôznych koncentráciách.

Obr. 17A a 17B sú grafy ukazujúce schopnosť série dvojnásobne substituovaného peptidu (A^16,19) vyvolať imunitnú odpoveď. Päť samíc NOD myší bolo imunizovaných podkožné 20 mg/kg solubilného NBI-6024 v dňoch 1, 6 a 12. V deň 15 boli myši usmrtené, inguinálne lymfatické uzliny boli odstránené a bunky týchto uzlín sa kultivovali za prítomnosti rôznych koncentrácii (0-50 μΜ) buď N BIΊ

6024 (obr. 17Α) alebo peptidu (9-23) inzulínového B reťazca (obr. 17B). Rozsah proliferácie T-lymfocytov bol stanovený pomocou inkorporácie ³H-tymidínu. Reakcia je vyjadrená ako priemerný cpm ± SEM z troch kultúr.

Obr. 18 je histogram ukazujúci porovnanie cytokínov produkovaných imunitnými bunkami po indukcii A^16,19 (NBI-6024) peptidom za prítomnosti alebo za absencie pomocného činidla. Skupiny NOD myší boli imunizované NBI-6024 samostatne alebo v emulzii s CFA. Koncentrácia cytokínov IL-2 a IL-4, ako sú označené, boli merané pri 25 μΜ NBI-6024 a sú uvedené v pg/ml po odčítaní bazálnych hodnôt.

Pred opisom predkladaného vynálezu je pre jeho lepšie pochopenie vhodné uviesť definície niektorých termínov (pomenovanie pojmov).

Termín „inzulínový B reťazec“ označuje polypeptid s 30 aminokyselinami tvoriaci jeden z dvoch disulfidovou väzbou spojených polypeptidov v inzulíne. Sekvencia ľudského inzulínového reťazca je uvedená v SEQ ID NO: 1 a sekvencia zvyškov 9-23 ľudského B reťazca je uvedená na obr. 1 a v SEQ ID NO: 2.

Termín „peptidové analógy“ inzulínového B reťazca označuje aspoň 15 aminokyselinových zvyškov odvodených od zvyškov 9-23 ľudského inzulínového B reťazca (SEQ ID NO: 2), s aspoň jednou odlišnou aminokyselinou v sekvencií medzi analógom a prirodzeným B reťazcom. V peptidovom analógu sa aspoň jedna odlišnosť v aminokyselinovej sekvencií vyskytuje vo zvyšku 12, 13, 15 a/alebo 16. Ďalej môže byť substituovaný zvyšok 19 a aj ďalšie alterácie sú možné. Výhodne obsahuje peptidový analóg 1 až 4 substitúcie vo zvyškoch 9-23 vzhľadom na prirodzenú sekvenciu (9-23) inzulínového B reťazca, hoci je možný aj väčší počet substitúcií (napríklad 5 alebo 6). Môžu byť prítomné ďalšie zvyšky z inzulínového B reťazca, do kompletných 30 zvyškov prirodzeného B reťazca, výhodne do maximálne 25 zvyškov, lepšie do celkového počtu 16 alebo 18 zvyškov peptidového analógu. Vo výhodnom uskutočnení obsahuje peptidový analóg tiež zvyšok 24 inzulínového B reťazca. Sekvencie, ktoré nie sú odvodené od inzulínového B reťazca, môžu, ale nemusia, byť prítomné na amino a/alebo karboxylovom konci peptidového analógu. Takéto sekvencie môžu byť použité, napríklad, na uľahčenie syntézy, prečistenie alebo solubilizáciu peptidového analógu.

Pokiaľ nie je uvedené inak, sú uvedené aminokyseliny v L-forme. Lc r c r * r f r r

aminokyselinový zvyšok v prirodzenej peptidovej sekvencii môže byť alterovaný na akúkoľvek z 20 L-aminokyselín, ktoré sa bežne vyskytujú v proteínoch, na akúkoľvek z príslušných D-aminokyselín, vzácnych aminokyselín, ako je 4-hydroxyprolín alebo hydroxylyzín alebo na neproteínovú aminokyselinu, ako je β-alanín alebo homoserín. Do rozsahu predkladaného vynálezu patria tiež analógy obsahujúce aminokyseliny, ktoré boli pozmenené chemickými prostriedkami, ako je metylácia (napríklad metylvalín); amidácia C-koncovej aminokyseliny alkylamínom, ako je etylamín, etanolamín alebo etyléndiamín; a/alebo acylácia alebo metylácia skupiny vedľajšieho reťazca aminokyseliny (ako je napríklad acylácia epsilon-amino skupiny lyzínu).

Termíny „zvyšok 12“, „zvyšok 13“, „zvyšok 15“, „zvyšok 16“ a „zvyšok 19“ (tiež označované ako pozícia 12, pozícia 13, pozícia 15, pozícia 16 a pozícia 19, v príslušnom poradí) označujú aminokyseliny 12, 13, 15, 16 a 19 inzulínového B reťazca, ako je uvedené na obr. 1. Presnejšie, systém číslovania pre tieto zvyšky označuje aminokyselinové pozície v prirodzenom ľudskom proteíne, bez ohľadu na dĺžku peptidového analógu alebo na aminokyselinovú pozíciu v analógu. Peptidové ánälógy, ktoré majú alanínové substitúcie vo Zvyškoch 12, 13, 15 alebo 16 sa označujú ako A12, A13, A15 alebo A16, v príslušnom poradí.

Peptidové analógy inzulínového B reťazca

Ako bolo uvedené vyššie, predkladaný vynález poskytuje peptidové analógy obsahujúce aspoň zvyšky 9-23 ľudského inzulínového B reťazca a obsahujúce zmenu prirodzeného L-valínu v pozícii 12, L-glutamátu v pozícii 13, L-leucínu v pozícii 15 a/alebo L-tyrozínu v pozícii 16, na inú aminokyselinu. V jednom uskutočnení obsahujú peptidové analógy ďalšie alterácie jednej až troch Laminokyselín v pozíciách 12, 13, 15, 16 a/alebo 19 inzulínového B reťazca. Výhodne obsahujúce peptidové analógy dve alebo tri alterácie, v ktorých je jeden zo substituovaných zvyškov v pozícii 19.

Časť peptidového analógu, ktorá je odvodená od inzulínového B reťazca, má zvyčajne dĺžku 15-30 zvyškov, výhodne 15-18 zvyškov, ešte lepšie 15-16 zvyškov. Najmä výhodné peptidové analógy obsahujú 15 aminokyselín odvodených od inzulínového B reťazca.

Ako bolo uvedené vyššie, peptidové analógy obsahujúce akékoľvek zmeny aminokyselín v pozíciách uvedených vyššie spadajú do rozsahu predkladaného vynálezu. Výhodné peptidové analógy obsahujú nekonzervatívne substitúcie (to znamená substitúcie za aminokyselinu, ktorá má odlišný náboj, polaritu, hydrofóbnosť a/alebo veľkosť). Najmä výhodné analógy obsahujú substitúcie jedného alebo viac zvyškov alanínom.

Peptidové analógy môžu byť syntetizované štandardnými chemickými technikami, vrátane automatizovanej syntézy. Všeobecne, peptidové analógy môžu byť pripravené technikou peptidovej syntézy na pevnej fáze, ktorá obsahuje naviazanie každého chráneného aminokyselinového zvyšku na živicový nosič, výhodne na 4-metyl-benzhydrylamínovú živicu, pomocou aktivácie dicyklohexylkarbodiimidom, za získania peptidu s C-terminálnym amidom. Alternatívne môže byť použitá chlórmetylová živica (Merrifieldova živica), za získania peptidu s voľnou karboxylovou kyselinou na C-konci. Funkčné skupiny vedľajších reťazcov môžu byť chránené nasledujúcim spôsobom: benzylom pre serín a treonín; cyklohexylom pre kyselinu glutámovú a asparágovú; tozylom pre histidín a arginín; 2-chlórbenzyloxykarbonylom pre lyzín; a 2-brómbenzyloxykarbonylom pre tyrozín. Po kopulačnej reakcii môže byť t-butyloxykarbonylová chrániaca skupina na alfaamino skupine pridanej aminokyseliny odstránená reakcia s kyselinou trifluóroctovou, po ktorej nasleduje neutralizácia di-izopropyletylamínom. Ďalší chránený zvyšok je potom naviazaný na voľnú aminoskupinu, čo vedie k predlžovaniu peptidového reťazca. Po naviazaní posledného zvyšku sa chránený peptid-živica spracuje fluorovodíkom na odštiepenie peptidu zo živice a na odstránenie chrániacich skupín pre funkčné skupiny vedľajších reťazcov. Surový materiál môže byť ďalej prečistený gélovou filtráciou, HPLC, rozdeľovacou chromatografiou alebo iónomeničovou chromatografiou, s použitím dobre známych techník.

Peptidové analógy podľa predkladaného vynálezu by (a) nemali stimulovať klony T-lymfocytov NOD myší špecifické k prirodzenému (9-23) peptidu inzulínového

B reťazca (SEQ ID NO: 2), ani by nemali stimulovať také klony na úrovni, ktorá je nižšia ako úroveň stimulovaná prirodzeným peptidom; (b) nemali stimulovať ľudské

T-lymfocyty od pacientov špecifické pre inzulínový B reťazec (9-23); (c) nemali byť imunogénne u NOD myší; (d) mali by znižovať incidenciu diabetu u NOD myší a (e) mali by inhibovať reakciu klonov T-lymfocytov špecifických pre peptid (9-23) prirodzeného inzulínového B reťazca (SEQ ID NO: 2). Preto môžu byť potenciálne peptidové analógy vyšetrované na svoju schopnosť v liečbe diabetu pomocou testov merajúcich proliferáciu T-lymfocytov, imunogenicitu u NOD myší a efekt na incidenciu ochorení u NOD myší. Niektoré reprezentatívne testy na použitie pri hodnotení potenciálnych peptidových analógov sú podrobnejšie opísané ďalej. Tie analógy, ktoré spĺňajú vyššie uvedené kritéria, sú použiteľné terapeutické činidlá.

Potenciálne peptidové analógy môžu byť najskôr testované na schopnosť stimulovať T-lymfocyty špecifické k peptidu (9-23) prirodzeného inzulínového B reťazca (SEQ ID NO: 2) (z klonálnych bunkových línií alebo izolované od pacienta). Také testy môžu byť uskutočnené s použitím priameho proliferačného testu, v ktorom sú línie T-lymfocytov reaktívne s prirodzeným B reťazcom (9-23) alebo Tlymfocyty od pacienta použité ako cieľové bunky. Línie T-lymfocytov môžu byť získané, s použitím dobre známych techník, z lymfatických uzlín získaných od krýs, ktorým bol injekčné podaný B reťazec (9-23). Bunky lymfatických uzlín môžu byť izolované a kultivované počas 5 až 8 dní s B reťazcom (9-23) a IL-2. Životaschopné bunky sú izolované a môže byť uskutočnené druhé kolo stimulácie B reťazcom (923) a ožiarenými splenocytmi ako zdrojom rastových faktorov. Po 5 až 6 takýchto pasážach je stanovený proliferatívny potenciál každej bunkovej línie. Na uskutočnenie proliferačného testu môžu byť línie T-lymfocytov reaktívne s B reťazcom (9-23) kultivované počas 3 dní s rôznymi koncentráciami peptidových analógov a ožiarených autológnych splenocytov. Po troch dňoch je na 12-16 hodín pridané 0,5-1,0 pCi [³H]-tymidínu. Kultúry sú potom zbierané a stanovia sa inkorporácie rádioaktivity. Priemer cpm a štandardná odchýlka sa vypočítajú z troch kultúr. Peptidové analógy s výsledkami, ktoré sú menšie ako tri štandardné odchýlky od priemeru pre porovnateľnú koncentráciu B reťazca (9-23) šú považované za nestimulačné. Peptidové analógy, ktoré nestimulujú proliferáciu pri koncentráciách menších alebo rovných 20-50 μΜ sú vhodné na ďalšie testovanie.

Potenciálne vhodné peptidy, ktoré nestimulujú T-lymfocyty špecifické pre B reťazec (9-23), a ktoré výhodne inhibujú reakcie takýchto T-lymfocytov in vitro, sú ďalej testované na ich imunogenicitu u NOD myší. Stručne, skupiny NOD myší môžu byť imunizované 100-400 pg potenciálne použiteľných peptidov podkožné v manitolacetátovom pufre trikrát v priebehu 10-15 dní. Po poslednej imunizácii môžu byť bunky lymfatických uzlín a/alebo sleziny použité v proliferačnom teste, v ktorom sú rôzne koncentrácie imunizačného peptidu kultivované s bunkami počas 3-4 dní. Posledných 18 hodín kultivácie môže byť uskutočnené s tríciom značeným tymidínom. Bunky môžu byť potom zbierané a odčítané v scintilačnom počítači a proliferačná odpoveď môže byť vyjadrená ako CPM ± SEM. Potenciálne použiteľné peptidy, ktoré indikujú proliferáciu, ktorá je aspoň 2-krát vyššia ako pozadie (bez antigénu) pri 25 μΜ peptidu, sú považované za imunogénne. Alternatívne, potenciálne peptidový analóg je považovaný za imunogénny vtedy,· pokiaľ vyvolá proliferatívnu odpoveď po imunizácii NOD myší v kompletnom Freundovom adjuvans. Bunky drenážnej lymfatickej uzliny alebo sleziny, keď sú kultivované za prítomnosti imunizujúceho analógu, by mali indukovať proliferáciu, ktorá je aspoň 2krát vyššia ako základná proliferácia (bez antigénu) pri 25 μΜ peptidu.

Potenciálne použiteľné peptidy, ktoré môžu inhibovať proliferáciu indukovanú B reťazcom (9-23), sú ďalej testované na schopnosť znižovať incidenciu diabétu u NOD myší. Stručne, peptidy môžu byť podané NOD myšiam v solubilnej forme alebo v emulzii napríklad s nekompletným Freundovým adjuvans (IFA). Zvyčajne je dostatočné týždenné podávanie približne 400 μ9 peptidu. Incidencia diabetu u liečených myší, rovnako ako u neliečených alebo kontrolných myší, je potom hodnotená týždenným sledovaním koncentrácie glukózy v krvi. Hodnota 200 mg/dl alebo viac glukózy v krvi v dvoch nasledujúcich meraniach ukazuje na prítomnosť diabetu. Peptidové analógy by mali viesť ku štatisticky významnému zníženiu percenta NOD myší postihnutých diabetom v priebehu sledovania dĺžky približne 25 týždňov.

Ako bolo uvedené vyššie, peptidové analógy môžu tiež inhibovať odpoveď ľudských T-lymfocytov špecifických pre B reťazec (9-23) in vitro. Taká inhibícia môže byť meraná kompetitívnymi testami, v ktorých sú potenciálne použiteľné peptidové analógy testované na schopnosť inhibovať proliferáciu T buniek indukovanú prirodzeným B reťazcom (9-23) (SEQ ID NO: 2). V takom teste sú antigénr r

prezentujúce bunky najskôr ožiarené a potom sú inkubované s kompetujúcim peptidovým analógom a peptidom (9-23) prirodzeného B reťazca. T-lymfocyty sú potom pridané do kultúry. Kultúry obsahujú rôzne koncentrácie testovaných peptidových analógov a môžu byť inkubované celkovo počas 4 dní. Po inkubácii je každá kultúra vystavená pulzu, napríklad, 1 pCi [³H]-tymidínu počas ďalších 12-18 hodín. Kultúry môžu byť potom zbierané na filtroch zo sklených vláken a môžu byť odčítané spôsobom uvedeným vyššie. Z dát získaných z troch kultúr môžu byť stanovené priemerné cpm a štandardná odchýlka. Výhodné sú tie peptidové analógy, ktoré znižujú proliferáciu o aspoň 25 % pri koncentrácii 20-50 μΜ.

Liečba a prevencia diabetu

Ako bolo uvedené vyššie, predkladaný vynález poskytuje spôsoby liečby a prevencie diabetu I. typu, pri ktorých je pacientom podané terapeuticky účinné množstvo peptidového analógu inzulínového B reťazca, ako je tu opísané. Diabetickí pacienti vhodní pre takúto liečbu môžu byť identifikovaní podľa kritérií na diagnostiku klinického diabetu. Medzi takéto kritéria patria, napríklad, nízka (nižšia ako 10 alebo 1 percentil kontrol) prvá fáza sekrécie inzulínu pri intravenóznom glukózovom tolerančnom teste (IVGTT) alebo perzistencia vysokého titru protilátok k antigénom ostrovčekov, ako je inzulín, GAD65 a/alebo ICA512.

Pacienti bez klinického diabetu, pre ktorých môže byť prínosom profylaktická liečba, môžu byť identifikovaní podľa akéhokoľvek v odbore prijímaného predikatívneho kritéria. U pacientov bez klinického diabetu je možné predpokladať vznik diabetu v nasledujúcich rokoch (1-5 rokov) podľa nasledujúcich kritérií: (i) rodinná anamnéza - príbuzný prvého stupňa sú automaticky vysoko rizikovou skupinou, pokiaľ nemajú protektívnu HLA alelu; (ii) genetický „make-up“ - to znamená prítomnosť alebo neprítomnosť HLA alely, ktorá je asociovaná s vysokým rizikom vzniku diabetu (napríklad DR3/4; DQ8); (iii) prítomnosť alebo neprítomnosť vysokého titra autoprotilátok v krvi proti akémukoľvek z antigénov: inzulínu, GAD65 a/alebo ICA512; a (iv) intravenózny glukózový tolerančný test (IVGTT): nízka prvá fáza sekrécie inzulínu, zvyčajne definovaná ako desiaty alebo prvý percentil normálnych kontrol, zvyčajne predchádza vzniku diabetu I. typu o 1-5 rokov.

r r

Zvyčajne sa berie do úvahy niekoľko z vyššie uvedených kritérií. Napríklad, riziko vzniku diabetu v nasledujúcich 5 rokoch pre príbuzných jedincov s diabetom prvého stupňa je : 100 % pre príbuzných so všetkými 3 autoprotilátkami uvedenými vyššie; 44 % pre príbuzných s dvoma protilátkami; 15 % pre príbuzných s jednou protilátkou; a 0,5 % pre príbuzných bez protilátky. Medzi 50 príbuznými prvého stupňa k pacientovi s diabetom I. typu po vzniku diabetu bola prítomná u 49/50 jedna alebo viac z vyššie uvedených autoprotilátok.

Účinná liečba diabetu môže byť stanovená niekoľkými rôznymi spôsobmi. Splnenie akéhokoľvek z nasledujúcich kritérií alebo iných kritérií prijímaných v odbore, dokazuje účinnú liečbu. Medzi kritéria patria, bez obmedzenia, oddialenie vzniku klinickej hyperglykémie, zníženie frekvencie hyperglykemičkých stavov a/alebo predĺženie prítomnosti normálnych hladín C-peptidu v krvi pacientov.

Peptidové analógy podľa predkladaného vynálezu môžu byť podané buď samostatne alebo vo forme farmaceutického prostriedku. Stručne, farmaceutické prostriedky podľa predkladaného vynálezu môžu obsahovať jeden alebo viac peptidových analógov podľa predkladaného vynálezu, v kombinácii s jedným alebo viacerými farmaceutický alebo fyziologicky prijateľnými nosičmi, rozpúšťadlami alebo prísadami. Takéto prostriedky môžu obsahovať pufre ako je neutrálny pufrovaný salinický roztok, fosfátom pufrovaný salinický roztok a podobne, karbohydráty, ako je glukóza, manóza, sacharóza alebo dextrány, manitol, proteíny, polypeptidy alebo aminokyseliny ako je glycín, antioxidačné činidlá, chelačné činidlá ako je EDTA alebo glutatión, adjuvans (napríklad hydroxid hlinitý) a konzervačné činidlá. Okrem toho môžu farmaceutické prostriedky podľa predkladaného vynálezu tiež obsahovať jednu alebo viac ďalších aktívnych zložiek, ako sú napríklad systémy na predĺžené podanie alebo iné imunopotenciačné činidlá.

Prostriedky podľa predkladaného vynálezu môžu byť vo forme vhodné na orálne, nazálne, venózne, intrakraniálne, intraperitoneálne, podkožné alebo inramuskulárne podanie. Ďalej môžu byť prostriedky podľa predkladaného vynálezu podané ako súčasť implantátu s predĺženým uvoľňovaním. V ešte iných uskutočneniach môžu byť prostriedky podľa predkladaného vynálezu pripravené vo forme lyofilizovaných prostriedkoch, s použitím vhodných prísad vhodných na dosiahnutie stability lyofilizovanej formy a/alebo po rehydratácii.

r λ

Farmaceutické prostriedky podľa predkladaného vynálezu môžu byť podané spôsobom, ktorý je vhodný na liečenie ochorenia. Množstvá a frekvencia podania bude stanovená podľa takých faktorov, ako je celkový stav pacienta a typ a závažnosť ochorenia pacienta. V jednom uskutočnení predkladaného vynálezu môže byť peptidový analóg podaný v dávke v rozmedzí od 0,1 do 100 mg/kg, hoci vhodné dávkovanie môže byť stanovené v klinických pokusoch. Pacienti môžu byť sledovaní na terapeutickú účinnosť podľa oddialenia progresie klinického diabetu a obmedzenia užívania inzulínu na udržiavanie normoglykémie.

Nasledujúce príklady sú iba ilustratívne a nijako neobmedzujú rozsah predkladaného vynálezu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1: Príprava peptidov

Tento príklad opisuje syntézu reprezentatívnych peptidových analógov.

Peptidy boli syntetizované technikou syntézy na pevnej fáze na peptidovom syntezátore (Beckman model 990). Peptidy s amidovaným karboxylovým koncom boli pripravené s p-metylbenzhydrylamínovou živicou (MBHA živica); pre peptidy s voľným karboxylovým koncom bola použitá Merrifieldova živica s vhodne chránenou aminokyselinou. Obidve živice boli získané od Bachem Fine Chemicals (Torrance, CA). Derivatizované aminokyseliny (Bachem Fine Chemicals) použité v syntéze boli L-konfigurácie, pokiaľ nie je uvedené inak a mali N-alfa-amino funkciu chránenú výlučne t-butyloxykarbonylovou skupinou. Funkčné skupiny vedľajších reťazcov boli chránené nasledujúcim spôsobom: benzylom pre serín a treonín; cyklohexylom pre kyselinu glutámovú a asparágovú; tozylom pre histidín a arginín; 2chlórbenzyloxykarbonylom pre lyzín a 2-brómbenzyloxykarbonylom pre tyrozín. Naviazanie karboxy-koncovej aminokyseliny na MBHA živice bolo uskutočnené pomocou dicyklohexylkarbodiimidu a ďalšie aminokyseliny boli naviazané pomocou dicyklohexylkarbodiimidu podľa Ling a kol. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4302, 1984). Po inkorporácii poslednej aminokyseliny bola t-butyloxykarbonylová chrániaca skupina odstránená a konjugát peptid-živice reagoval so zmesou 14 ml kyseliny fluorovodíkovej (HF), 1,4 ml anizolu a 0,28 ml metyletylsufidu na gram živicového konjugátu pri -20 °C počas 0,5 hodiny a pri 0 °C počas 0,5 hodiny. H F bola odstránená vo vákuu pri 0 °C a výsledná zmes peptidu a živice sa premyla dvakrát dietyléterom a dvakrát chloroformom a dietyléterom striedavo. Peptid bol extrahovaný päťkrát 2 M kyselinou octovou a extrakt bol lyofilizovaný. Lyofilizovaný materiál bol najskôr prečistený na kolóne Sephadex G-25 fine (Pharmacia-LKB, Piscataway, NJ) vyvíjanej v 30 % kyseline octovej na odstránenie skrátených fragmentov a anorganických solí (Ling a kol., 1984). Peptidy boli ďalej prečistené CM-32 karboxymetylcelulózou katiónovou iónomeničovou chromatografiou (Ling a kol., 1984). Konečné prečistenie bolo uskutočnené rozdeľovacou chromatografiou na Sephadex G-25 fine (Ling a kol. 1984). Alternatívne môže byť surový peptid prečistený preparatívnou HPLC na Biotage KP-100 gradientovom HPLC systéme. Syntetický materiál bol charakterizovaný aminokyselinovou analýzou, hmotnostnou spektrometriou a HPLC s reverznou fázou.

Príklad 2: Dlhodobé línie T-lymfocytov

Tento príklad ilustruje prípravu dlhodobých línií T-lymfocytov špecifických pre inzulín od NOD myší.

Inzulín-špecifické línie NOD T-lymfocytov boli pripravené kultiváciou lymfocytov izolovaných z populácií infiltrujúcich ostrovčeky pomocou in vitro stimulácie prasačím inzulínom v dávke 25 pg/ml a ožiarených buniek NOD ostrovčekov ako antigén-prezentujúcich buniek a cytokínov. Na získanie infiltrujúcich lymfocytov boli uskutočnené nasledujúce procedúry (pozri Wegmann a kol., Eur. J. Immunol. 24: 1853, 1994): pankreas od NOD myší bol trávený kolagenázou a jednotlivé ostrovčeky boli izolované manuálne. Infiltrujúce lymfocyty boli potom získané miernym trávením ostrovčekov trypsínom. Inzulín-špecifické T-lymfocytárne línie alebo klony boli propagované sériovou stimuláciou za prítomnosti NOD buniek sleziny, prasačieho inzulínu a lymfokínov. Klony boli získané limitným riedením línií T-lymfocytov špecifických pre B reťazec (9-23) za prítomnosti antigén prezentujúcich buniek a prasačieho inzulínu v dávke 25 pg/ml. Jamky s rastúcou populáciou buniek po limitnom riedení boli expandované vo vhodnom médiu a po jednom rastovom * ft cykle boli testované na reaktivitu k peptidu (9-23) B reťazca inzulínu pomocou hodnotenia proliferačnej odpovede.

Príklad 3: Vplyv peptidových analógov na proliferáciu inzulín-špecifických klonov NOD T-lymfocytov

Tento príklad ilustruje vplyv reprezentatívnych peptidových analógov na proliferáciu T-lymfocytov.

Klony myších (NOD) T-lymfocytov špecifických pre inzulínový B reťazec (923) (SEQ ID NO: 2) boli izolované z infiltrujúcich lymfocytov spôsobom opísaným v príklade 2. Peptidové analógy s jednými alanínovými substitúciami boli pripravené spôsobom opísaným v príklade 1. Vplyv každého analógu na proliferáciu Tlymfocytov bol potom hodnotený s použitím testu uskutočneného v 96-jamkových platniach s plochým dnom (pozri Daniel a kol., Eur. J. Immunol. 25: 1056, 1995). Stručne, 25 000 T-lymfocytov s 1 000 000 ožiarených NOD buniek sleziny bolo trojmo kultivované za prítomnosti 50 pg/ml peptidu 9-23 inzulínového B reťazca alebo za prítomnosti akéhokoľvek alanínom substituovaného peptidu uvedeného ďalej. Platne boli inkubované počas celkom 72 hodín v atmosfére 7 % oxidu uhličitého s pulzom 1 pCi/jamka tríciovaného tymidínu počas posledných 6-8 hodín kultivácie. Bunky boli zozbierané na filtri zo skleného vlákna a asociovaná rádioaktivita bola odčítaná v kvapalinovom scintilačnom počítači. Výsledky sú vyjadrené ako priemerný počet pulzov za minútu pre tri jamky.

Dáta získané od piatich samostatných klonov T-lymfocytov ukazujú buď chýbanie proliferácie alebo významné zníženie proliferácie, (vzhľadom na prirodzený 9-23 peptid inzulínového B reťazca; SEQ ID NO: 2) za prítomnosti nasledujúcich alanínom-substituovaných analógov: A12, A13, A15, A16, A17 a A18. Tieto dáta sú uvedené v tabuľkách 1 a 2.

Tabuľka 1: Odpoveď (cpm) klonov NOD T-lymfocytov špecifických pre inzulín

Modifikovaná			Kloň T-lymfocytov
pozícia	Prirodzený zvyšok	Substitúcia	PD6-4.3	PD12-2.40

9	S	A	12861	42234
10	H	A >	12507	1409
11	L	A	14148	2594
12	V	A	8292	671
'13	E	A	142	519
14	A	žiadna
15	L	A	161	1422
16	Y	A	98	539
17	L	A	553	19321
18	V	A	234	44785
19	C	A	7678	34212
20	G	A	2440	38685
21	E	A	91	39087
22	R	A	6555	51722
23	G	A	14304	75441

Bez antigénu Natívne 9-23			163 10463	682 32221

Tabuľka 2: Odpoveď (cpm) klonov myších NOD T-lymfocytov špecifických pre inzulín

Modifikovaná pozícia	Prirodzený zvyšok	Substitúcia	Kloň T-lymfocytov
PD12-4.4	PD12-4.29 1	PD12-4.34
9	S	A	1000	18422	259
10	H	A	823	15484	356
11	L	A	474	18416 ,	190
12	V	A	1129	15041	194
13	E	A	373	891	179
14	A	žiadna
15	L	A	675	809	191

16	Y	A	779	636	202
17	L	A	332	1460	4360
18	V	A	225	1193	721
19	C	A	4295	6054	689
20	G	A	1323	13736	466
21	E	A	7900	4904	773
22	R	A	1313	12635	1555
23	G	A	3228	18422	791

Bez antigénu			350	789	231
Natívne 9-23			10000	14820	3614

Tabuľka 3 ukazuje odpoveď štyroch rôznych klonov T-lymfocytov získaných od NOD myší na dvojito alanínom substituovanom peptidovom analógu A16, A19 (NBI-6024; 16Y > A/19C > A). Klony NOD T-lymfocytov boli inkubované za prítomnosti 50 μΜ buď peptidu (9-23) prirodzeného B reťazca alebo NBI-6024. Dáta v tabuľke 3 predstavujú priemer troch vzoriek ± štandardná odchýlka od priemeru. V tabuľke 3 S.l. (stimulačný index) = proliferácia (cpm) za prítomnosti peptidu/proliferácia (cpm) v médiu samotnom. Tieto dáta ukazujú významnú odpoveď vtedy, keď sú bunky kultivované s peptidom (9-23) prirodzeného B reťazca, alebo slabú alebo žiadnu proliferáciu proti samotnému médiu (základná hodnota) za prítomnosti NBI-6024.

Tabuľka 3: Proliferatívna odpoveď myších klonov T-lymfocytov špecifických pre inzulínový B reťazec (9-23) na 50 μΜ B reťazca (9-23) alebo analóg A^16,19 (NBI6024)

Kloň T- lymfocytov	Pokus č.	Iba médium	Inzulínový B reťazec(9-23)	NBI-6024 (A^16,19)
Priemer cpm ± sem	S.l.	Priemer cpm ± sem	S.l.
PD12-2.35	1	688 ±227	120,886 ± 7,171	175.7	841 ± 88	1.22
	2	493 ± 20	100,521 ±1,581	203.89	452 ±179	0.91

PD12-2.40	1	170 + 8	16,730 + 3,835	98.4	272 ± 34	1.16
	2	1,834 + 638	176,359 + 36,306	96.16	1,863+451 ,·	1.01
PD12-4.1	1	215 + 17	28,593+4664	132.99	566 ± 30	2.63
D12-4.9	1	9,111 ±1,889	45,541 ±5,222	4.99	12,313+1,372	1.35
	2	7,202 ± 2,773	65,624 + 4,979	9.1	6,171 ±725	0.85

Príklad 4: Antagonizovanie proliferačného testu T-lymfocytov

Tento príklad ilustruje inhibíciu odpovede myších klonov T-lymfocytov špecifických pre peptid (9-23) B reťazca inzulínu reprezentatívnymi peptidovými analógmi.

Peptidové analógy B reťazca (9-23) obsahujúce alanínové substitúcie vo zvyšku 12, 13, 15 alebo 16 alebo dvojité substitúcie v pozíciách 16 a 19 (A^16,19; NBI6024), boli pripravené spôsobom opísaným v príklade 1. Antagonistické pôsobenie na T-lymfocyty bolo detegované hodnotením schopnosti peptidových analógov inhibovať proliferáciu T-lymfocytov indukovanú prirodzeným B reťazcom (9-23) (SEQ ID NO: 2). V tomto teste boli antigén-prezentujúce bunky najskôr ožiarené a potom inkubované s kompetitívnym peptidovým analógom a peptidom (9-23) prirodzeného B-reťazca. T-lymfocyty boli potom pridané do kultúry. Rôzne koncentrácie potenciálnych peptidových analógov boli obsiahnuté v kultúrach, ktoré boli inkubované počas 4 dní. Po tejto inkubačnej perióde bola každá kultúra vystavená pulzu 1 pCi [³H]-tymidínu počas ďalších 12-18 hodín. Bunky boli potom zbierané na filtroch zo skleného vlákna a boli odčítané spôsobom opísaným vyššie. Priemerný cpm a štandardná odchýlka boli vypočítané z dát získaných v troch pokusoch. Výsledky, uvedené na obr. 2, ukazujú, že peptidové analógy obsahujúce alanínové substitúcie vo zvyšku 12, 13, alebo 16, sú schopné zmierniť odpoveď, patogénnych T-lymfocytov špecifických pre inzulínový B reťazec (9-23).

Schopnosť dvojito substituovaného peptidu inhibovať inzulín-dependentnú proliferáciu T buniek je uvedená v tabuľke 4 a na obr. 3. V tabuľke 4 je kontrolným peptidom NBI-5096 nepríbuzný peptid z myelínového bázického proteínu. Percento inhibície bolo vypočítané ako: (1-pokusné cpm/cpm pre inzulínový peptid) x 100%.

I í 20 r f e· r r r n r c C

Tabuľka 4: Inhibícia odpovede na peptid (9-23) inzulínového B reťazca u dvoch myších NOD klonov T-lymfocytov peptidovým analógom

Kloň	Podmienky	CPM ± SEM	% Inhibície
PD12-2.35	iba médium	213±17
	B(9-23) 5μΜ	7,840 ± 528
	B(9-23) 5μΜ + 10μΜ NBI-6024	4,441 ±626	43.0
	B(9-23) 5μΜ + 50μΜ NBI-6024	1,389 ±218	82.0
	B(9-23) 5μΜ + 10μΜ NBI-5096	10,089 ± 1,113	N/A
	B(9-23) 5μΜ + 50μΜ NBI-5096	10,125 ±887	N/A
PD12-2.40	iba médium	305 ±13
	B (9-23) 5μΜ	9,149 ±1,062
	B(9-23) 5μΜ + 10μΜ NBI-6024	6,379 ±1,485	30.0
	B(9-23) 5μΜ + 50μΜ NBI-6024	4,305 ± 941	52.9
	B(9-23) 5μΜ + 10μΜ NBI-5096	12,336 ±1,556	N/A
	B(9-23) 5μΜ + 50μΜ NBI-5096	17,988 ±584	N/A

N/A - nepoužiteľné, pretože nebola pozorovaná žiadna inhibícia

Schopnosť NBI-6024 blokovať peptidom (9-23) B reťazca indukovanú stimuláciu klonov T-lymfocytov získaných z NOD myší naznačuje, že alterácia v pozíciách 16 a 19 peptidu (9-23) prirodzeného inzulínového B reťazca nemení rozpoznávanie analógu patogénnymi T-lymfocytmi. Okrem toho tieto výsledky naznačujú, že analóg sa tiež viaže na MHC s dostatočnou afinitou pre rozpoznávanie T-lymfocytmi špecifickými pre inzulínový B reťazec (9-23).

Príklad 5: Vplyv peptidových analógov na proliferáciu línií T-lymfocytov a klonov od diabetických pacientov

Tento príklad ukazuje chýbanie stimulácie T-lymfocytárnych línií a klonov získaných od diabetických pacientov reprezentatívnymi peptidovými analógmi.

Peptidové analógy B reťazca (9-23) obsahujúce alanínové substitúcie vo < r zvyškoch 13, 15, 16 alebo 17 alebo dvojito alanínom substituovaný analóg A^16,19(NBI-6024) boli pripravené spôsobom opísaným v príklade 1. Línie T-lymfocytov od diabetických pacientov boli pripravené izoláciou lymfocytov z krvi pacientov, tak, že krv bola spracovaná separáciou podľa hustoty. Izolované lymfocyty boli potom kultivované za prítomnosti peptidu (9-23) inzulínového B reťazca (10 μΜ) a rekombinantného ľudského IL-2 za prítomnosti 5-10 % autológneho séra a ožiarených autológnych lymfocytov periférnej krvi v kultivačnom médiu. Za štyri alebo päť dní boli bunky pozbierané a cyklus bol opakovaný 2 až 3-krát.

Proliferácia línie T-lymfocytov, v odpovedi na peptid (9-23) prirodzeného B reťazca (SEQ ID NO: 2) alebo na peptidové analógy, bola meraná kultiváciou 25000 až 100 000 T-lymfocytov za prítomnosti 50 000 - 200 000 ožiarených autológnych PBL a rôznych koncentrácií peptidu (9-23) , inzulínového B reťazca alebo peptidového analógu v troch kultúrach. Po 4-5 dňoch kultivácie, vrátane posledných 18 hodín s rádioaktívne značeným tymidínom, boli bunky pozbierané a asociovaná rádioaktivita bola meraná v kvapalinovom scintilačnom počítači. Výsledky sú uvedené ako priemerný počet pulzov za minútu pre každý testovaný peptidový analóg.

Výsledky, uvedené na obr. 4-7, ukazujú, že klony a línie T-lymfocytov, ktoré proliferujú v odpovedi na peptid (9-23) prirodzeného inzulínového B reťazca (SEQ ID NO:2), nie sú stimulované peptidovými analógmi. Výsledky od týchto a od iných pacientov sú zhrnuté v tabuľke 5.

Tabuľka 5: Proliferatívna odpoveď PBL pacienta na prirodzený inzulínový peptid alebo na analóg NBI-6024

Číslo pacienta	ID pacienta	Stimulačný index*
Inzulín B (9-23) [50 μΜ]	NBI-6024 [50 μΜ]
1	100	9.9	0.9
2	200	5.3	1.2
3	400	7.8	1.0
4	500	2.1	0.9
5	600	5.8	1.6

6	700	3.2	1.5
7	900	2.6	0.9
8	1100	3.7	0.8

* Stimulačný index = cpm s antigénom/cpm s médiom samotným (bez antigénu)

Výsledky jasne ukazujú, že bunky od diabetických pacientov, ktoré sú reaktívne na peptid (9-23) inzulínového B reťazca, nereagujú na alterovaný peptidový ligand NBI-6024, ktorý má substitúciu v pozíciách 16 a 19. Tiež sme zistili, že APL NBI-6024 sa viažu s podobnou afinitou na DQ8 antigény. Preto nie je neprítomnosť stimulácie T-lymfocytov diabetických pacientov NBI-6024 spôsobená akoukoľvek inkompatibilitou peptidu s prezentujúcimi MHC molekulami, ale skôr pozmeneným rozpoznávaním T-lymfocytov špecifických pre B reťazec (9-23).

Príklad 6: Zníženie incidencie diabetu u NOD myší

Tento príklad ilustruje schopnosť reprezentatívnych peptidových analógov brániť vzniku diabetu u NOD myší.

U NOD myší sa spontánne vyvíja diabetes približne v 3. mesiaci veku (Makino a kol., Current Topics in Clinical and Experimental Aspects of Diabetes mellitus, Sakamoto a kol., ed., str. 25-32 (Elsevier, Amsterdam, 1985)). Vzniku ochorenia predchádza bunková infiltrácia T-lymfocytov do pankreasu, ku ktorej dochádza už v 1 mesiaci veku. Solubilné peptidové analógy B reťazca (9-23) obsahujúce alanínové substitúcie vo zvyškoch 12, 13 alebo 16 boli podávané NOD myšiam v týždenných intervaloch. V každej dávke bolo každému z desiatich zvierat podané 400 μg každého peptidu. Po 9 cykloch bolo v každej skupine stanovené percento myší, u ktorých vznikol diabetes, podľa meraní koncentrácie glukózy v krvi v týždenných intervaloch pomocou glukometra. Hodnoty koncentrácie glukózy v krvi vyššej ako 200 mg/dl v dvoch nasledujúcich meraniach boli považované za ukazovateľ klinického diabetu.

Ako je uvedené na obr. 8, liečba každým z alanínom-substituovaných analógov viedla k významnému zníženiu incidencie diabetu. Dáta pre A13 substituovaný analóg sú uvedené tiež na obr. 9.

I

e. e r

C r

r r ' r \f inom pokuse boli B reťazec (9-23), A13 substituovaný analóg alebo neurotenzín (ako kontrola) podávané podkožné NOD myšiam v týždenných intervaloch. V každej dávke bolo každému z desiatich zvierat podané 400 pg každého peptidu. Po 13 cykloch bolo v každej skupine stanovené percento myší, u ktorých vznikol diabetes, použitím spôsobu opísaného vyššie. Ako je uvedené na obr. 10, peptid (9-23) B reťazca znižoval incidenciu diabetu. Toto zníženie bolo najvýraznejšie pre A13 substituovaný analóg.

Na stanovenie schopnosti dvojito substituovaného peptidu A^16,19 (NBI-6024) kontrolovať vznik diabetu u NOD myší bol peptid podávaný zvieratám nízkeho veku. Samice myší (n=9, staré približne 4 týždne) boli liečené podkožnými injekciami 20 mg/kg (40 pg/myš) NBI-6024 počas 12 týždňov a potom každý druhý týždeň do týždňa 35. Od veku 9-10 týždňov boli myši jeden krát týždenne sledované na hyperglykémiu pomocou merania koncentrácie glukózy v krvi. Ako kontrola bola použitá skupina 10 neliečených myší. Ako je vidieť, liečba NBI-6024 významne znížila incidenciu diabetu o približne 60-70 % v porovnaní s neliečenou skupinou (p < 0,004).

Tieto pozorovania boli potom potvrdené a rozšírené v druhom pokuse. V tomto pokuse boli zvieratá (n=13-15) liečené buď NBI-6024, alebo nepríbuzným peptidom, neurotenzínom, NBI-6201, spôsobom uvedeným vyššie. Ďalšia skupina (n=8) bola neliečená. Ako je uvedené na obr. 12, liečba 20 mg/kg pozmeneného peptidu NBI-6024 viedla ku zníženiu incidencie diabetu v porovnaní s neurotenzínom liečenou skupinou alebo neliečenou skupinou.

Tieto výsledky ukazujú, že alterovaný peptidový ligand NBI-6024, odvodený od peptidu (9-23) inzulínového B reťazca, je schopný brániť spontánnemu vzniku diabetu u rizikových zvierat. Je pravdepodobné, že T-lymfocyty, ktoré rozpoznávajú iné pankreatické antigény, sú u týchto zvierat prítomné, ale sú tiež pravdepodobne regulované inzulínovými APL. Podanie bolo pravdepodobne uskutočnené v rovnaký čas, v ktorom autoreaktívne lymfocyty začínajú infiltrovať pankreas a iniciujú deštruktívny proces. Tieto výsledky dávajú nádej, že včasná intervencia s použitím týchto APL môže byť účinná v oddialení alebo zabránení vzniku diabetu I. typu u ľudí.

• o e r » e ♦ * e e * f e f « c e r r -» f <» e r r »· c r r c r ?

e r· o ,-.- c r r r r i · r r

Príklad 7: Imunogenicita reprezentatívnych peptidových analógov

Tento príklad ilustruje imunogenicitu reprezentatívnych peptidových analógov u NOD myší.

Skupiny 3-4 myší boli imunizované 100-400 pg peptidových analógov subkutánne v manitol - acetátovom pufre trikrát v priebehu 10-15 dní. Po poslednej imunizácii boli bunky lymfatickej uzliny a/alebo bunky sleziny použité v proliferačnom teste, v ktorom boli kultivované s rôznymi koncentráciami imunizačného peptidu počas 3-4 dní. Na posledných 18 hodín bol do kultúry pridaný tríciom značený tymidín. Bunky boli zbierané a odčítané v scintilačnom počítači a odpoveď je vyjadrená ako cpm ± sem. Tieto výsledky, uvedené na obr. 13-16, ukazujú, že tieto reprezentatívne peptidové analógy sa môžu viazať na myšie MHC molekuly a môžu byť rozpoznávané príslušnými T-lymfocytmi.

Potom bola stanovená schopnosť dvojito substituovaného peptidu NBI-6024 (A^16,19) indukovať bunkovú imunitnú odpoveď u NOD myší. Dve samice NOD myší boli imunizované 10 mg/kg NBI-6024 buď vo forme vodnej suspenzie, alebo - na kontrolu - vo forme emulzie s kompletným Freundovým adjuvans (CFA). V deň 8, tri dni po poslednej injekcii, boli myši usmrtené, bunky sleziny a inguinálnej lymfatickej uzliny boli odstránené a zhromaždené a bola pripravená suspenzia jednotlivých buniek. Bunky boli kultivované za prítomnosti rôznych koncentrácií (0-25 μΜ) NBI6024. Schopnosť proliferácie lymfoidných buniek po stimulácii NBI-6024 bola meraná in vitro podľa inkorporácie [³H]-tymidínu.

Výsledky sú uvedené v tabuľke 6, v ktorej je odpoveď vyjadrená ako priemerný cpm ± sem z troch kultivácií. Bunky lymfatických uzlín izolované z myši imunizované analogóm v CFA mali silnú proliferatívnu odpoveď na stimuláciu imunizujúcim analógom, ktorá bola závislá od dávky (tabuľka 6). Tieto výsledky naznačujú, že alterácie uskutočnené v sekvencii (9-23) inzulínového B reťazca v pozíciách 16 a 19 nemali vplyv na schopnosť peptidu viazať sa na molekulu MHC haplotypu asociovanú s ochorením u NOD myší a - čo je významnejšie - že nebolo narušené rozpoznávanie T-lymfocytmi.

V r f r ti r r r r- r C.

r. r fTabuľka 6: Proliferatívna odpoveď buniek lymfatickej uzliny na NBI-6024 u NOD myší imunizovaných NBI-6024 v CFA

NBI-6024 (μΜ)	Proliferatívna odpoveď (CPM ± SEM)
0	2, 445 ±137
1	140, 061 ±7, 289
5	187, 711 ±2, 548
25	218, 149 ±4, 462

Ďalej, ako bunky sleziny, tak lymfatické uzliny izolované od myší, ktorým bol podaný solubilný peptid, vykazovali silnú proliferatívnu odpoveď na APL po stimulácii NBI-6024 in vitro (tabuľka 7 a obr. 17A a 17B). Ešte významnejšie bolo zistenie, že NBI-6204-reaktívne lymfocyty od myší imunizovaných solubilným peptidom tiež reagovali na inzulínový B reťazec (9-23). Táto skrížená reaktivita nebola pozorovaná pre peptid emulzifikovaný v CFA. Táto schopnosť solubilného peptidu indukovať skríženú reaktivitu môže byť užitočná pri kontrole diabetu, pretože môže napomôcť mobilizácii prôtektívnych NBI-6024 špecifických T-lymfocytov do patogénneho cieľového tkaniva.

Tabuľka 7: Proliferatívna odpoveď T-lymfocytov od NOD myší imunizovaných rozpustným NBI-6024 na NBI-6024 alebo na prirodzený inzulínový B reťazec (9-23)

NBI-6024 indukovaná bunková línia	Kone. peptidu [μΜ]	CPM ± SEM NBI-6024	CPM ± SEM Inzulín B (9-23)
Myš # 1	0	19, 130 ±2191	19, 130 ± 2191
	1	48, 319 ±1918	16, 870 ±4469
	5	160, 673 ±2269	21, 292 ±3216
	25	268, 005 ±11198	33, 317 ± 3619

Myš # 2	0	21, 588 ±2326	21, 588 ±2326
	1	54, 519 ±5666	17, 262 ±602
	5	126, 123 ±13851	19, 648 ±2169

	25	202, 707 ±8125	30, 612 ±3557

Myš # 3	0	24, 006 ± 2803	24, 006 ±2803
	1	64, 239 ± 9493	25,825 ± 3841
	5	140, 836 ±11778	58, 567 ± 2737
	25	240, 278 ±15015	113, 366 ±515

Na určenie typu T-lymfocytov produkovaných po podaní rozpustného NBI6024 boli supernatanty kultúr imunitných lymfoidných buniek odstránené 48 hodín po začatí kultivácie a s použitím štandardnej ELI SA technológie boli merané koncentrácie rôznych cytokínov. Prekvapivo bolo zistené, že T-lymfocyty od myší imunizovaných rozpustným NBI-6024 produkovali Th2 cytokíny, interleukín-4 (obr. 18) a interleukín-5 (tabuľka 8), a nie Th1 cytokín interleukín-2. V tabuľke 8 sú hodnoty uvedené v pg/ml ako priemer z troch pokusov ± SEM. Ako kontrola bol použitý NBI-6024 v emulzii s CFA, ktorý indukoval očakávaný Th1-profil cytokínov (IL-2) v imunitných T-lymfocytoch po stimulácii in vitro:

Tabuľka 8: Cytokínová odpoveď T-lymfocytov indukovaných rozpustným NBI-6024 na NBI-6024

NBI-6024 [mM]	Cytokín (pg/ml)
IL-2	IL-4	IL-5
0	< 15 pg/ml	134 ±0	1, 814 ±332
1	< 15 pg/ml	684 ± 92	9, 999 ± 503
5	< 15 pg/ml	1, 653±51	23, 496 ±684
25	< 15 pg/ml	2, 102 ±85	28, 062 ±141

Možnosť indukcie Th-2 podobných lymfocytov podkožným podaním rozpustného NBI-6024 je žiaducou vlastnosťou, pretože také bunky sú asociované s uzdravením pri diabete a iných orgánovo špecifických autoimunitných ochorení (Sarventick, J. Exp. Med. 184: 1597-1600, 1996; Shaw a kol., 1997; Balasa a kol. J. Exp. Med. 186: 385-391, 1997). Tieto cytokíny odvodené od Th2 lymfocytov majú silné prótizápalové účinky, ktoré potlačujú vznik autoreaktívnych Th1 lymfocytov produkujúcich prozápalové cytokíny, ktoré spôsobujú ochorenia.

Z uvedeného opisu je jasné, že i keď boli opísané špecifické uskutočnenia vynálezu, existujú rôzne jeho modifikácie, ktoré sa neodchyľujú od rozsahu a duchu predkladaného vynálezu. V súlade s tým je vynález vymedzený iba pripojenými patentovými nárokmi.

Zoznam sekvencii < 110 > Neurocrine Biosciences, Inc.

< 120 > Spôsob liečby diabetes mellitus využívajúci peptidové analógy inzulínu < 130 > 690068.448PC < 140 > PCT <141 >23 .2. 1999 <160 >2 < 170 > Patent In ver. 2.0 <210> 1 <211 >30 < 212 > PRT < 213 > Homo sapiens < 220 >

< 223 > B reťazec ľudského inzulínu <400>1

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr

5 10 15

Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr 20 25 30 <210>2 <211 > 15 <212> PRT < 213 > Homo sapiens f C t' C C f r <220>

< 223 > Zvyšky 9-23 B reťazca ľudského inzulínu < 400 > 2

Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly 1 5 10 15 e r r * ti * ~ r f C r r r r r r f r r · z: e r r

Γ r f; r < *· ^r

U, f,.

77^ ΛΟΌΟ

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims

1. Peptidový analóg obsahujúci zvyšky 9 až 23 ľudského B reťazca inzulínu, ktorý sa líši od sekvencie zvyškov 9 až 23 prirodzeného ľudského B reťazca inzulínu substitúciami v T až 4 aminokyselinových pozíciách, kde aspoň jedna substitúcia je prítomná vo zvyšku vybranom zo skupiny skladajúcej sa zo zvyškov 12, 13, 15 a 16.

2. Peptidový analóg podľa nároku 1, ktorý má sekvenciu, ktorá sa líši od prirodzeného ľudského B reťazca inzulínu v dvoch aminokyselinových zvyškoch.

3. Peptidový analóg podľa nároku 1, ktorý má sekvenciu, ktorá sa líši od prirodzeného ľudského B reťazca inzulínu v troch aminokyselinových zvyškoch.

4. Peptidový analóg podľa nároku 1, v ktorom je aminokyselinová substitúcia prítomná vo zvyšku 19.

5. Peptidový analóg podľa nároku 1, v ktorom je aspoň jedna aminokyselinová substitúcia nekonzervatívna.

6. Peptidový analóg podľa nároku 1, v ktorom je zvyšok 12 substituovaný.

7. Peptidový analóg podľa nároku 6, v ktorom je zvyšok 12 alanínový zvyšok.

8. Peptidový analóg podľa nároku 1, v ktorom je zvyšok 13 substituovaný.

9. Peptidový analóg podľa nároku 8, v ktorom je zvyšok 13 alanínový zvyšok.

10. Peptidový analóg podľa nároku 1, v ktorom je zvyšok 15 substituovaný.

11. Peptidový analóg podľa nároku 10, v ktorom je zvyšok 15 alanínový zvyšok.

12. Peptidový analóg podľa nároku 1, v ktorom je zvyšok 16 substituovaný.

13. Peptidový analóg podľa nároku 12, v ktorom je zvyšok 16 alanínový zvyšok.

14. Peptidový analóg podľa akéhokoľvek z nárokov 6-13, v ktorom je zvyšok 19 substituovaný.

15. Peptidový analóg podľa nároku 14, v ktorom je zvyšok 19 alanínový zvyšok.

16. Peptidový analóg podľa nároku 1, ktorý ďalej obsahuje zvyšok 24 ľudského B reťazca inzulínu.

17. Peptidový analóg podľa nároku 1, ktorý neobsahuje viac ako 18 zvyškov ľudského B reťazca inzulínu.

18. Peptidový analóg podľa nároku 1, ktorý neobsahuje viac ako 16 zvyškov ľudského B reťazca inzulínu.

19. Peptidový analóg podľa nároku 1, ktorý neobsahuje viac ako 15 zvyškov ľudského B reťazca inzulínu.

20. Peptidový analóg skladajúci sa v podstate zo zvyškov 9 až 23 ľudského B reťazca inzulínu, ktorý sa líši od sekvencie zvyškov 9 až 23 prirodzeného ľudského B reťazca inzulínu substitúciami v 1 až 4 aminokyselinových pozíciách, kde aspoň jedna substitúcia je prítomná vo zvyšku vybranom zo skupiny skladajúcej sa zo zvyškov 12, 13, 15, 16.

21. Peptidový analóg skladajúci sa v podstate zo zvyškov 9 až 24 ľudského reťazca inzulínu, ktorý sa líši od sekvencie zvyškov 9 až 23 prirodzeného ľudského B reťazca inzulínu substitúciami v 1 až 4 aminokyselinových pozíciách, kde aspoň r r jedna substitúcia je prítomná vo zvyšku vybranom zo skupiny skladajúcej sa zo zvyškov 12, 13, 15 a 16.

22. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje peptidový analóg podľa akéhokoľvek z nárokov 1-19 v kombinácii s farmaceutický prijateľným nosičom alebo riedidlom.

23. Spôsob na inhibíciu vzniku diabetu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje podanie terapeuticky účinného množstva farmaceutického prostriedku podľa nároku 22 pacientovi.

24. Spôsob na liečbu diabetu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje podanie terapeuticky účinného množstva farmaceutického prostriedku podľa nároku 22 pacientovi.

25. Peptidový analóg obsahujúci zvyšky 9 až 23 ľudského B reťazca inzulínu, ktorý sa líši od sekvencie zvyškov 9 až 23 prirodzeného ľudského B reťazca inzulínu substitúciami vo zvyškoch 16 a 19.

26. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje peptidový analóg podľa nároku 25 v kombinácii s farmaceutický prijateľným nosičom alebo riedidlom.

27; Spôsob na inhibíciu vzniku diabetu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje podanie terapeuticky účinného množstva farmaceutického prostriedku podľa nároku 26 pacientovi.