JP2002504491A - インスリンのペプチドアナログを使用した糖尿病の処置のための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、天然（Ｂ）鎖の配列の残基（９〜２３）を含むペプチドに由来するインスリン（Ｂ）鎖のペプチドアナログに関する。このアナログは、位置（１２、１３、１５）および／または（１６）において天然の配列から変更され、そして位置（１９）および／または他の位置においてさらに変更され得る。これらのペプチドアナログを含む薬学的組成物が提供される。このペプチドアナログは、糖尿病の発症を処置および阻害するために有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、一般に、インスリンのペプチドアナログ、そしてより具体的には、
ヒトインスリンＢ鎖の残基９〜２３に由来するペプチドアナログを使用して、糖
尿病を処置するための方法に関する。

【０００２】 （発明の背景） インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、米国において異なる年齢群の１００
万近くの人々に発症する、器官特異的自己免疫疾患である。この疾患は、膵臓の
島におけるインスリン産生β細胞の広範な破壊、および明白な糖尿病を導くグル
コース代謝の調節不全により特徴付けられる。ＩＤＤＭを規定する特徴は、島の
リンパ球性浸潤である。浸潤細胞のなかでも、Ｔ細胞は、自己免疫破壊の主要な
メディエーターの１つのようである。

【０００３】 Ｉ型糖尿病は、抗原（インスリン、ＧＡＤ６５、ＧＡＤ６７およびＩＣＡ５１
２を含む）と関連した種々の島に対する抗体のレベルの増加によりさらに特徴付
けられる。これらの抗体を、明白な疾患のはるか前に検出し得、そしてこのよう
な抗体に対する免疫応答は、感受性の遺伝子（ＨＬＡ）ハプロタイプを有する患
者において糖尿病の進行を妨げるための予報物として使用され得る。

【０００４】 現在、患者は、正常血糖を維持するためにインスリン注射に依存する。インス
リンは、２つのジスルフィド結合鎖（Ａ鎖は、２１アミノ酸残基からなり、そし
てＢ鎖は、３０残基からなる）からなるポリペプチドホルモンである。インスリ
ンの投与は、糖尿病に罹患している患者に重要な利益を提供するが、インスリン
の短い血清半減期は、適切な投薬の維持することについての困難性を生じる。イ
ンスリンの使用はまた、種々の低血糖の副作用および中和抗体の生成を生じる。

【０００５】 糖尿病の既存の処置に関連する問題を考慮すると、より効果的でそしてこのよ
うな不利益と関連しない、改善された処置についての切実な必要性が存在する。
本発明は、効果的に糖尿病を処置するために、他の関連する利点をさらに提供し
つつ、インスリンに対するＴ細胞応答と拮抗するペプチドアナログの使用を開発
する。

【０００６】 （発明の要旨） 本発明は、糖尿病を処置および予防するための化合物および方法を提供する。
特定の局面では、本発明は、ヒトインスリンＢ鎖（配列番号２）の残基９〜２３
を含むペプチドアナログを提供し、ここでこのペプチドアナログは、１つ〜４つ
のアミノ酸の位置での置換に起因して、天然のヒトインスリンＢ鎖の残基９〜２
３と配列が異なる。このような置換は、他の残基でのさらなる置換を伴うかまた
は伴わないで、残基１２、１３、１５および１６からなる群から選択される１つ
以上の残基で作製され得る。特定の好ましい実施態様では、このような置換は、
インスリンＢ鎖の残基９〜２３内の２または３アミノ酸残基で生じ得る。置換は
また、残基１９で生じ得る。置換は、好ましくは非保存的であり、そしてアナロ
グ（ここで残基１２、１３、１５、１６および／または１９は、（例えば、アラ
ニンに）変更される）が好ましい。インスリンＢ鎖の残基２４をさらに含むアナ
ログもまた好ましい。特定の他の実施態様において、このペプチドアナログは、
ヒトインスリンＢ鎖の、１８残基以下、１６残基以下または１５残基以下を含む
。

【０００７】 さらなる実施態様では、ペプチドアナログは、本質的に、ヒトインスリンＢ鎖
（配列番号２）の残基９〜２３または９〜２４からなり、ここでこのペプチドア
ナログは、１つ〜４つのアミノ酸の位置での置換に起因して、天然のヒトインス
リンＢ鎖の残基９〜２３と配列が異なり、ここで少なくとも１つの置換が、残基
１２、１３、１５および１６からなる群から選択される残基で生じる。

【０００８】 さらなる局面では、生理的に受容可能なキャリアまたは希釈剤との組合せで、
上記のようなペプチドアナログを含む、薬学的組成物が提供される。

【０００９】 本発明は、治療的有効量の上記の薬学的組成物を患者に投与する工程を包含す
る、糖尿病の発症を処置および／または阻害するための方法をさらに提供する。

【００１０】 本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付された図面を
参照することで明らかになる。さらに、より詳細な特定の手順または組成物を記
載する種々の参考文献を以下に示す。これらの参考文献は、各々が個々に援用に
ついて記述するのと同様に、その全体が参考として本明細書中に援用される。

【００１１】 （発明の詳細な説明） 本発明を記載する前に、それを理解することおよび本明細書において用いられ
る特定の用語の定義を提供することは、有益であり得る。

【００１２】 「インスリンＢ鎖」とは、インスリンを構成する２つのジスルフィド連結ポリ
ペプチドの１つとして示される３０アミノ酸のポリペプチドをいう。ヒトインス
リンＢ鎖の配列は、配列番号１に提供され、そしてヒトＢ鎖の残基９〜２３の配
列は、図１および配列番号２に提供される。

【００１３】 インスリンＢ鎖の「ペプチドアナログ」は、ヒトインスリンＢ鎖（配列番号２
）の残基９〜２３残基に由来する少なくとも１５アミノ酸残基を含み、アナログ
と天然のＢ鎖との間ではアミノ酸配列において少なくとも１つの差異を有する。
ペプチドアナログ中において、アミノ酸配列の少なくとも１つの差異が残基１２
、１３、１５および／または１６で生じる。さらに、残基１９は、置換され得、
そして他の変化は、可能性がある。好ましくは、ペプチドアナログは、天然のイ
ンスリンＢ鎖（９〜２３）配列と比較して、残基９〜２３に１と４との間の置換
を含むが、より多くの置換（例えば、５または６）が可能性としてあり得る。イ
ンスリンＢ鎖由来のさらなる残基は、天然のＢ鎖の全３０残基まで、ペプチドア
ナログの好ましくは計２５残基まで、より好ましくは計１６または１８残基まで
含まれ得る。好ましい実施態様において、インスリンＢ鎖の残基２４はまた、ペ
プチドアナログに含まれる。インスリンＢ鎖に由来しない配列は、ペプチドアナ
ログのアミノ酸末端および／またはカルボキシ末端に存在し得るが、ただし存在
する必要はない。このような配列は、例えば、ペプチドアナログの合成、精製ま
たは可溶化を容易にするために用いられ得る。

【００１４】 他に示されない限り、指定されたアミノ酸はＬ型をいう。天然のペプチド配列
におけるＬアミノ酸残基は、通常、タンパク質において見出される２０種のＬア
ミノ酸の任意の１つ、まれなアミノ酸であるＤアミノ酸（例えば、４−ヒドロキ
シプロリンまたはヒドロキシリジン）に対応する任意の１つ、または非タンパク
質アミノ酸（例えば、βアラニンまたはホモセリン）へと変えられ得る。また、
本発明の範囲内に含まれるのは、メチル化（例えば、αメチルバリン）；エチル
アミン、エタノールアミンもしくはエチレンジアミンのようなアルキルアミンに
よるＣ末端アミノ酸のアミド化；および／またはアミノ酸側鎖機能のアシル化も
しくはメチル化（例えば、リジンのイプシロンアミノ基のアシル化）のような化
学的手段により変えられたアミノ酸を含むアナログである。

【００１５】 「残基１２」、「残基１３」、「残基１５」、「残基１６」および「残基１９
」（また、それぞれ、１２位、１３位、１５位、１６位、および１９位とも呼ば
れる）とは、図１に提示されるインスリンＢ鎖のアミノ酸１２、１３、１５、１
６および１９をいう。より詳細には、これらの残基についての番号付けシステム
は、ペプチドアナログの長さまたはそのアナログ内のアミノ酸位置にかかわらず
、天然のヒトタンパク質におけるアミノ酸位置に関する。残基１２、１３、１５
または１６でアラニン置換を有するペプチドアナログは、それぞれ、Ａ１２、Ａ
１３、Ａ１５またはＡ１６アナログと呼ばれる。

【００１６】 （インスリンＢ鎖のペプチドアナログ） 上記のように、本発明は、ヒトインスリンＢ鎖の少なくとも残基９〜２３を含
み、そして、天然に存在する１２位のＬ−バリン、１３位のＬ−グルタミン酸、
１５位のＬ−ロイシンおよび／または１６位のＬ−チロシンの別のアミノ酸への
変化を含むペプチドアナログを提供する。１つの実施態様では、ペプチドアナロ
グは、インスリンＢ鎖の１２、１３、１５、１６および／または１９位での１〜
３のＬ−アミノ酸のさらなる変化を含む。好ましくは、このペプチドアナログは
、置換される残基の１つが１９位である、２または３の変化を含む。

【００１７】 インスリンＢ鎖由来のペプチドアナログの部分は、代表的には１５〜３０残基
長、好ましくは、１５〜１８残基長、そしてより好ましくは、１５〜１６残基長
である。特に好ましいペプチドアナログは、インスリンＢ鎖由来の１５のアミノ
酸を含む。

【００１８】 上記のように、上記の位置で任意のアミノ酸変化を含むペプチドアナログは、
本発明の範囲内である。好ましいペプチドアナログは、非保存的置換（すなわち
、電荷、極性、疎水性および／またはかさ（ｂｕｌｋｉｎｅｓｓ）における差異
を有するアミノ酸への変化）を含む。特に好ましいアナログは、１つ以上の残基
のアラニンへの変化を含む。

【００１９】 ペプチドアナログは、自動化合成を含む標準的な化学技術により合成され得る
。一般に、ペプチドアナログは、固相ペプチド合成方法論により調製され得る。
この方法は、Ｃ末端アミドを有するペプチドを産生するためのジシクロヘキシル
カルボジイミドでの活性化による、樹脂支持体（好ましくは、４−メチル−ベン
ズヒドリルアミン樹脂）へのそれぞれの保護されたアミノ酸残基の結合を含む。
あるいは、クロロメチル樹脂（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ 樹脂）は、Ｃ末端で遊離
カルボン酸を有するペプチドを産生するために用いられ得る。側鎖官能基は、以
下のように保護され得る：セリンおよびトレオニンについてはベンジル；グルタ
ミン酸およびアスパラギン酸についてはシクロヘキシル；ヒスチジンおよびアル
ギニンについてはトシル；リジンについては２−クロロベンジルオキシカルボニ
ル；そしてチロシンについては２−ブロモベンジルオキシカルボニル。結合後、
付加されたアミノ酸のαアミノ官能基のｔ−ブチルオキシカルボニル保護基は、
トリフルオロ酢酸での処理、その後のジ−イソプロピルエチルアミンでの中和化
により除去され得る。次いで、次の保護残基は、遊離アミノ基上に結合され、ペ
プチド鎖を伸長する。最後の残基が結合した後、保護されたペプチド−樹脂は、
樹脂からペプチドを切断するため、そして側鎖官能基を脱保護するためにフッ化
水素で処理される。粗生成物は、周知の手順を用いて、ゲル濾過、ＨＰＬＣ、分
配クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製さ
れ得る。

【００２０】 本発明におけるペプチドアナログは、（ａ）天然のインスリンＢ鎖（９〜２３
）ペプチド（配列番号２）に特異的なＮＯＤマウスＴ細胞クローンを刺激しない
べきであるか、または天然のペプチドにより刺激されるレベルよりも低いレベル
でこのようなクローンを刺激するべきであり；（ｂ）患者由来のインスリンＢ鎖
（９〜２３）特異的ヒトＴ細胞を刺激しないべきであり；（ｃ）ＮＯＤマウスに
おいて免疫原性であるべきであり；（ｄ）ＮＯＤマウスにおいて糖尿病の発生率
を減少させるべきであり、そして（ｅ）天然のインスリンＢ鎖（９〜２３）ペプ
チド（配列番号２）に対して特異的なＴ細胞クローンの応答を阻害し得る。従っ
て、候補のペプチドアナログは、Ｔ細胞増殖、ＮＯＤマウスにおける免疫原性、
およびＮＯＤマウスにおけるこの疾患の発生率に対する効果を測定するアッセイ
により糖尿病を処置する能力についてスクリーニングされ得る。候補のペプチド
アナログを評価する際の使用のための特定の代表的なアッセイは、以下でより詳
細に議論される。上記の基準を満足するアナログは、有用な治療剤である。

【００２１】 候補のペプチドアナログは、天然のインスリンＢ鎖（９〜２３）ペプチド（配
列番号２）（クローン細胞株由来または患者から単離される）に対して特異的な
Ｔ細胞を刺激する能力について最初に試験され得る。このような試験は、天然の
Ｂ鎖（９〜２３）反応性Ｔ細胞株または患者から単離されたＴ細胞が標的細胞と
して用いられる直接の増殖アッセイを用いて実行され得る。Ｔ細胞株は、一般に
、Ｂ鎖（９〜２３）を注射しラットから得たリンパ節から、周知の技術を用いて
樹立され得る。リンパ節細胞は、単離され得、そしてＢ鎖（９〜２３）およびＩ
Ｌ−２とともに５〜８日間培養され得る。生存可能な細胞は、回収され、そして
刺激の２回目は、Ｂ鎖（９〜２３）および増殖因子の供給源として照射された脾
臓細胞を用いて実行され得る。この様式での５〜６継代後、それぞれの細胞株の
増殖能力が決定される。増殖アッセイを実行するため、Ｂ鎖（９〜２３）反応性
Ｔ細胞株は、種々の濃度のペプチドアナログおよび照射された自己の脾臓細胞と
ともに３日間培養され得る。３日後、０．５〜１．０μＣｉの［³Ｈ］−チミジ ンが、１２〜１６時間添加される。ついで、培養物は回収され、そして取り込ま
れたカウント数が決定される。平均ＣＰＭおよび平均の標準誤差は、３連培養物
から算出される。Ｂ鎖（９〜２３）の匹敵する濃度で平均応答の３標準偏差より
少ない結果を生じるペプチドアナログは、非刺激であると考えられる。２０〜５
０μＭ以下の濃度で増殖を刺激しないペプチドアナログは、さらなるスクリーニ
ングについて適切である。

【００２２】 Ｂ鎖（９〜２３）特異的Ｔ細胞を刺激しない、そして好ましくはインビトロに
おいてこのようなＴ細胞の応答を阻害する候補ペプチドは、ＮＯＤマウスにおけ
るその免疫原性についてさらに試験される。簡略にいえば、ＮＯＤマウスの群は
、１０〜１５日の期間内に３回、酢酸マンニトール緩衝液中で、皮下に候補ペプ
チド１００〜４００μｇを免疫され得る。最終の免疫後、リンパ節細胞および／
または脾臓細胞は、種々の濃度の免疫化ペプチドが３〜４日間、この細胞ととも
に培養される増殖アッセイにおいて用いられ得る。培養の最後の１８時間は、ト
リチウム化したチミジンを用いて実行され得る。次いで、細胞は、回収されそし
てシンチレーションカウンターで計測され得、そして増殖性応答は、ＣＰＭ±Ｓ
ＥＭとして表現され得る。２５μＭのペプチドでバックグラウンド（抗原なし）
よりも少なくとも２倍高い増殖を誘導する候補ペプチドは、免疫原性であるとみ
なされる。あるいは、候補ペプチドアナログは、それが、フロイント完全アジュ
バント中でのＮＯＤマウスの免疫化後に増殖性応答を惹起する場合、免疫原性で
あるとみなされる。リンパ節細胞または脾臓細胞の排出は、免疫化アナログの存
在下で培養される場合、２５μＭのペプチドでバックグラウンド（抗原なし）よ
りも少なくとも２倍高い増殖を誘導するべきである。

【００２３】 Ｂ鎖（９〜２３）により増殖を阻害し得る候補ペプチドは、さらに、ＮＯＤマ
ウスにおける糖尿病の発生率を低下させる能力について試験される。簡略にいえ
ば、ペプチドは、ＮＯＤマウスに可溶性形態で、または例えば、不完全フロイン
トアジュバント（ＩＦＡ）で乳化されて投与され得る。代表的には、約４００μ
ｇのペプチドの毎週の投与が十分である。次いで、処置されるマウスにおける、
ならびに処置されないマウスまたはコントロールマウスにおける糖尿病の発生率
は、血中グルコースレベル（血糖値）の毎週のモニタリングにより評価される。
２回の連続的な機会での２００ｍｇ／ｄｌ以上の血中グルコースレベルは、一般
に糖尿病の発現を示すとみなされる。ペプチドアナログは、約２５週までのモニ
タリング期間内に糖尿病を罹患したＮＯＤマウスのパーセントにおいて統計的に
有意な低下を生じるべきである。

【００２４】 上記のように、ペプチドアナログはまた、インビトロにおいてＢ鎖（９〜２３
）特異的ヒトＴ細胞の応答を阻害し得る。このような阻害は、候補のペプチドア
ナログが天然のＢ鎖（９〜２３）（配列番号２）により誘導されるＴ細胞増殖を
阻害する能力について試験される競合アッセイにより測定され得る。このような
アッセイでは、抗原提示細胞は、最初照射され、次いで競合的ペプチドアナログ
および天然Ｂ鎖（９〜２３）ペプチドとともにインキュベートされる。次いで、
Ｔ細胞が培養物に添加される。種々の濃度の候補のペプチドアナログが計４日間
インキュベートされ得る培養物中に含まれる。インキュベーション期間の後、そ
れぞれの培養物は、例えば、さらに１２〜１８時間、１μＣｉの［³Ｈ］−チミ ジンでパルスされる。次いで、培養物はファイバーガラスのフィルター上に回収
され、そして上記のように計測され得る。平均ＣＰＭおよび平均の標準誤差は、
３連培養物において決定されたデータから算出され得る。２０〜５０μＭの濃度
で、増殖を少なくとも２５％低下させるペプチドアナログが好ましい。

【００２５】 （糖尿病の処置および予防） 上記のように、本発明は、本明細書において記載されるように、インスリンＢ
鎖のペプチドアナログの治療的に有効な量を患者に投与することによりＩ型糖尿
病を処置および予防するための方法を提供する。このような処置に適切な糖尿病
患者は、臨床的に明確な糖尿病の診断を樹立するための当該分野で受け入れられ
ている基準により同定され得る。このような基準としては、静脈内耐糖能試験（
ＩＶＧＴＴ）後の低い（コントロールの１０分の１または第１百分位数より低い
）第１相インスリン分泌またはインスリン、ＧＡＤ６５および／もしくはＩＣＡ
５１２のような島抗原に対する高力価抗体の持続が挙げられ得るがこれに限定さ
れない。

【００２６】 予防的な処置から利点を得られ得る臨床的に明確な糖尿病を有さない患者は、
一般的に、当該分野で受け入れられている任意の予測的基準により同定され得る
。はっきりとは糖尿病でない患者は、以下の基準に基づいて、間もなく（１〜５
年）に糖尿病を発症すると予測され得る：ｉ）家族歴第１親等は、彼らが予防的
ＨＬＡ対立遺伝子を有さない限り、高危険性群に自動的に存在する；ｉｉ）遺伝
子的構成すなわち、糖尿病の高い危険性と関連するＨＬＡ対立遺伝子（例えば、
ＤＲ３／４；ＤＱ８）の存在または非存在；ｉｉｉ）任意の抗原またはすべての
抗原（インスリン、ＧＡＤ６５および／またはＩＣＡ５１２）に対する患者血液
中の高い力価の自己抗体の存在または非存在；ならびにｉｖ）静脈内耐糖能試験
（ＩＶＧＴＴ）：低い第１相インスリン分泌は、通常、正常コントロールの１０
分の１または第１百分位数未満と規定され、代表的には、Ｉ型糖尿病の発症より
１〜５年先に起きる。一般に、上記の基準のうちのいくつかが考慮され得る。例
えば、糖尿病を有する個体の第１親等が５年内に糖尿病を発症する見込みは、以
下であると見積もられる：上記に列挙した３つの自己抗体のすべてを有する親等
について１００％：２つの抗体を有する親等について４４％；１つの抗体を有す
る親等について１５％；そして抗体のない親等について０．５％。糖尿病の発症
後の、Ｉ型糖尿病を有する患者の５０人の第１親等のうち、４９／５０が上記に
列挙された自己抗体のうちの１つ以上を発現した。

【００２７】 糖尿病の有効な処置は、いくつかの異なる手段で決定され得る。以下の任意の
基準または当該分野において受け入れられる他の基準を満たすことが有効な処置
を証明する。基準としては、明白な高血糖症発症の遅延、高血糖事象の低い頻度
および／または患者の血中のＣ−ペプチドの正常レベルの延長が挙げられ得るが
これらに限定されない。

【００２８】 本発明のペプチドアナログは、単独でかまたは薬学的組成物としてのいずれか
で投与され得る。簡略にいえば、本発明の薬学的組成物は、本明細書において記
載される１つ以上のペプチドアナログを１つ以上の薬学的にまたは生理学的に受
容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含み得る。このような組
成物は、中性の緩衝化生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水などの緩衝液、グル
コース、マンノース、スクロースまたはデキストランのような炭水化物、マンニ
トール、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンのようなアミノ酸、抗酸化剤
、ＥＤＴＡまたはグルタチオンのようなキレート剤、アジュバント（例えば、水
酸化アルミニウム）ならびに保存剤を含み得る。さらに、本発明の薬学的組成物
はまた、１つ以上のさらなる活性成分（例えば、持続性送達系または他の免疫増
強剤）を含み得る。

【００２９】 本発明の組成物は、例えば、経口投与、経鼻投与、静脈投与、頭蓋内投与、腹
腔内投与、皮下投与または筋肉内投与を含む、示された投与の様式のために処方
され得る。本発明の他の実施態様において、本明細書において記載される組成物
は、持続放出移植片の一部として投与され得る。さらに他の実施態様において、
本発明の組成物は、凍結乾燥剤としておよび／または再水和後に安定性をもたら
す適切な賦形剤を利用して、凍結乾燥剤として処方され得る。

【００３０】 本発明の薬学的組成物は、処置される（または予防される）べき疾患に対して
適切な様式で投与され得る。投与の量および頻度は、患者の状態ならびに患者の
疾患の型および重篤度のような因子によって決定される。本発明の特に好ましい
実施態様において、このペプチドアナログは、０．１〜１００ｍｇ／ｋｇの範囲
にある投薬量で投与され得るが、適切な投薬量が、臨床試験により決定され得る
。患者は、上記のように明白な糖尿病への進行の遅延により治療的有効性につい
てモニターされ得、そして正常血糖を維持するためのインスリンの使用を持続し
得る。

【００３１】 以下の実施例は、例証の目的で提供されそして制限する目的ではない。

【００３２】 （実施例１） （ペプチドの調製） この実施例は、代表的なペプチドアナログの合成を例証する。

【００３３】 ペプチドを、ペプチドシンセサイザー（Ｂｅｃｋｍａｎ モデル９９０）で固
相方法論により合成した。アミド化されたカルボキシル末端を有するペプチドを
、ｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂（ＭＢＨＡ樹脂）を用いて調製した；遊
離のカルボキシル末端を有するペプチドについては、適切に保護されたアミノ酸
と結合したメリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）樹脂を用いた。両方の樹脂
を、Ｂａｃｈｅｍ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ）
から入手した。合成において使用される誘導体化されたアミノ酸（Ｂａｃｈｅｍ
Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）は、他に特定されない限りＬ−立体配置であ
り、そしてｔ−ブチルオキシカルボニル基で独占的に保護されるＮ−α−アミノ
官能基である。側鎖官能基を、以下の様に保護した：セリンおよびトレオニンに
ついてはベンジル；グルタミン酸およびアスパラギン酸については、シクロヘキ
シル；ヒスチジンおよびアルギニンについてはトシル；リジンについては２−ク
ロロベンジルオキシカルボニルそしてチロシンについては２−ブロモベンジルオ
キシカルボニル。ＭＢＨＡ樹脂へのカルボキシル末端アミノ酸の結合は、ジシク
ロヘキシルカルボジイミドを用いて実行され、そして引き続くアミノ酸を、Ｌｉ
ｎｇら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：４３０２、１
９８４）に従いジシクロヘキシルカルボジイミドと結合させた。最後のアミノ酸
が組み込まれた後に、ｔ−ブチルオキシカルボニル保護基を除去し、そしてペプ
チド−樹脂結合体を１４ｍｌのフッ化水素酸（ＨＦ）、１．４ｍｌのアニソール
および樹脂結合体の１グラムあたり０．２８ｍｌのメチルエチルスルフィドの混
合物で、−２０℃で０．５時間そして０℃で０．５時間、処理した。ＨＦを減圧
下で０℃で除去し、そして得られたペプチドおよび樹脂の混合物をジエチルエー
テルで２回、そしてクロロホルムおよびジエチルエーテルで交互に２回洗浄した
。ペプチドを２Ｍの酢酸で５回抽出し、そして抽出物を凍結乾燥した。凍結乾燥
産物を、３０％酢酸中で展開されたＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ｆｉｎｅカラ
ム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−ＬＫＢ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で最初に精製
して、短縮型フラグメントおよび無機塩を除いた（Ｌｉｎｇら、１９８４）。次
に、ペプチドを、さらに、ＣＭ−３２カルボキシメチルセルロース陽イオン交換
クロマトグラフィーにより精製した（Ｌｉｎｇら、１９８４）。最終の精製をＳ
ｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５ ｆｉｎｅでの分配クロマトグラフィーにより達成し
た（Ｌｉｎｇら、１９８４）。あるいは、粗ペプチドは、Ｂｉｏｔａｇｅ ＫＰ
−１００勾配ＨＰＬＣシステム上の分取ＨＰＬＣにより精製し得る。合成生成物
を、アミノ酸分析、質量分析および逆相ＨＰＬＣにより特徴づけた。

【００３４】 （実施例２） （長期間Ｔ細胞株） 本実施例は、長期のインスリン特異的ＮＯＤ Ｔ細胞株の調製を実証する。

【００３５】 インスリン特異的ＮＯＤ Ｔ細胞株を、２５μｇ／ｍｌのブタインスリンなら
びに、抗原提示細胞としての照射されたＮＯＤ脾臓細胞の存在下での照射された
ＮＯＤ島細胞、およびサイトカインを用いるインビトロの刺激により島浸潤集団
から単離されたリンパ球を培養することにより樹立した。浸潤しているリンパ球
を得るために、以下の手順を実施した（Ｗｅｇｍａｎｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．２４：１８５３、１９９４を参照のこと）：ＮＯＤマウス由来の膵臓
をコラゲナーゼを用いて消化し、そして個々の島を手技的に単離した。次いで、
浸潤性リンパ球を、島の穏やかなトリプシン消化によって得た。インスリン特異
性Ｔ細胞株またはクローンを、ＮＯＤ脾臓細胞、ブタインスリンおよびリンホカ
インの存在下で連続刺激により増殖させた。クローンを、抗原提示細胞およびブ
タインスリン２５μｇ／ｍｌの存在下でＢ鎖（９〜２３）特異的Ｔ細胞株の限界
希釈により得た。限界希釈後、細胞の増殖集団を有するウェルを適切な培地中で
増加させ、そして１周期の増殖後、増殖応答を評価することによりインスリンの
Ｂ鎖（９〜２３）ペプチドに対する反応性について試験した。

【００３６】 （実施例３） （インスリン特異的ＮＯＤ Ｔ細胞クローンの増殖へのペプチドアナログの効
果） この実施例は、Ｔ細胞増殖に対する代表的なペプチドアナログの効果を例証す
る。

【００３７】 インスリンＢ鎖（９〜２３）（配列番号２）特異的なマウス（ＮＯＤ）Ｔ細胞
クローンを、実施例２に記載のように浸潤した島から単離した。単一のアラニン
置換を有するペプチドアナログを、実施例１に記載のように調製した。次いで、
Ｔ細胞増殖へのそれぞれのアナログの効果を、９６ウェル平底マイクロタイター
プレート中で実施されたアッセイを用いて評価した（Ｄａｎｉｅｌら、Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：１０５６、１９９５を参照のこと）。簡略に言えば
、１００万の照射されたＮＯＤ脾臓細胞とともに２５，０００個のＴ細胞クロー
ンを、５０μｇ／ｍｌのインスリンＢ鎖（９〜２３）ペプチドまたは以下に列挙
する任意のアラニンが置換されたペプチドの存在下で、３連セットで培養した。
このプレートを、培養の最後の６〜８時間、１μＣｉ／ウェルのトリチウム化チ
ミジンのパルスで７％二酸化炭素雰囲気において計７２時間、インキュベートし
た。細胞をガラスファイバーフィルター上に回収し、そして会合した放射能を液
体シンチレーションカウンターで計測した。結果を、３連ウェルの１分あたりの
平均カウント数として表現する。

【００３８】 ５つの別のＴ細胞クローンから得られたデータは、以下のアラニン置換アナロ
グの存在下で増殖の欠如かまたは増殖の有意な減少（インスリンＢ鎖の９〜２３
（配列番号２）の天然ペプチドに比べて）のいずれかを示した：Ａ１２、Ａ１３
，Ａ１５、Ａ１６、Ａ１７およびＡ１８。これらのデータを、以下の表１および
２に示す。

【００３９】

【表１】

【００４０】

【表２】 表３は、４つの異なるＮＯＤ由来のＴ細胞クローンの、二重アラニン置換ペプ
チドアナログＡ１６、Ａ１９（ＮＢＩ−６０２４；１６Ｙ＞Ａ／１９Ｃ＞Ａ）に
対する応答を示す。ＮＯＤ Ｔ細胞クローンを、５０μＭの天然のＢ鎖（９−２
３）ペプチドまたはＮＢＩ−６０２４のいずれかの存在下でインキュベートした
。表３におけるデータは、三連のサンプルの平均±平均の標準誤差を表す。表３
において、Ｓ．Ｉ．（刺激指数）＝ペプチドの存在下における増殖（ｃｐｍ）／
培地単独中の増殖（ｃｐｍ）である。これらのデータは、それらの細胞を、天然
のＢ鎖（９〜２３）ペプチドとともに培養した場合は有意な応答であるが、ＮＢ
Ｉ−６０２４存在下で培地単独（バックグラウンド）に対してほとんどまたは全
く増殖のないことを示す。

【００４１】

【表３】 （実施例４：Ｔ細胞増殖アッセイの拮抗作用） 本実施例は、Ｂ鎖（９−２３）特異的マウスＴ細胞クローンの、インスリンＢ
鎖（９−２３）ペプチドに対する応答の、代表的なペプチドアナログによる阻害
を示す。

【００４２】 アラニン置換を、残基１２、１３、１５または１６にて含むＢ鎖（９−２３）
のペプチドアナログあるいは１６位および１９位にて二重置換されたペプチド（
Ａ^16,19；ＮＢＩ−６０２４）を、実施例１に記載のように調製した。Ｔ細胞拮 抗作用を、そのペプチドアナログが天然のＢ鎖（９−２３）（配列番号２）によ
り誘導されるＴ細胞増殖を阻害する能力を評価することによって検出した。この
アッセイにおいて、抗原提示細胞をまず照射し、次いで、競合するペプチドアナ
ログおよび天然のＢ鎖（９−２３）ペプチドとともにインキュベートした。次い
で、Ｔ細胞を、その培養物に添加した。種々の濃度の候補ペプチドアナログを、
培養物に含ませ、これを、合計４日間インキュベートした。このインキュベート
期間の後、各培養物を１μＣｉの［³Ｈ］チミジンで、さらに１２〜１８時間パ ルス刺激した。次いで、培養物をファイバーガラスフィルター上に採取し、そし
て上記のように計数した。平均ＣＰＭおよび平均の標準誤差を、三連の培養物に
おいて決定したデータから計算した。図２に示す結果は、アラニン置換を、残基
１２、１３または１６に含むペプチドアナログが病原性インスリンＢ鎖（９−２
３）Ｔ細胞の応答を減弱化し得ることを示す。

【００４３】 二重に置換したペプチドがＴ細胞によるインスリン依存性増殖を阻害する能力
を、表４および図３に示す。表４においては、コントロールペプチドであるＮＢ
Ｉ−５０９６は、ミエリン塩基性タンパク質由来の無関連のペプチドである。阻
害割合を、（１−実験上のｃｐｍ／インスリンペプチドｃｐｍ）×１００の％と
して計算した。

【００４４】

【表４】 ＮＢＩ−６０２４が、ＮＯＤ誘導ＴクローンのＢ鎖（９−２３）ペプチド誘発
刺激をブロックする能力は、天然のインスリンＢ鎖（９−２３）ペプチドの１６
位および１９位における変更が、そのアナログが病原性Ｔ細胞によって認識され
る能力を変更しないことを示唆する。さらに、これらの結果は、そのアナログが
また、ＭＨＣと、十分な親和性をもって結合して、インスリンＢ鎖（９−２３）
特異的Ｔ細胞による認識を可能にすることを示す。

【００４５】 （実施例５：糖尿病患者由来のＴ細胞株およびクローンの増殖に対するペプチ
ドアナログの効果） 本実施例は、代表的なペプチドアナログによる、糖尿病患者に由来するＴ細胞
株およびクローンの刺激の欠如を示す。

【００４６】 残基１３、１５、１６または１７にてアラニン置換を含むＢ鎖（９−２３）の
ペプチドアナログ、あるいは二重に置換したアラニンアナログＡ^16,19（ＮＢＩ −６０２４）を、実施例１に記載のように調製した。糖尿病患者からのＴ細胞株
を、その患者の血液からリンパ球を、その血液を密度勾配分離に供することによ
り単離することによって、調製した。次いで、単離したリンパ球を、５〜１０％
の自己血清の存在下でのインスリンＢ鎖（９−２３）ペプチド（１０μＭ）およ
び組換えヒトＩＬ−２の存在下で培養し、そして培養培地における自己末梢血リ
ンパ球を照射した。４〜５日後、細胞を採取し、そしてそのサイクルを２回また
は３回繰り返した。

【００４７】 天然のＢ鎖（９−２３）ペプチド（配列番号２）に対する、またはペプチドア
ナログに対する応答におけるＴ細胞株の増殖を、２５，０００〜１００，０００
のＴ細胞を、５０，０００〜２００，０００の照射した自己ＰＢＬおよび異なる
濃度のインスリンＢ鎖（９−２３）ペプチドもしくはペプチドアナログの存在下
で、三連の培養物中で培養することによって測定した。放射性チミジンとともに
最後に１８時間培養することを含む４〜５日間の培養後、細胞を採取し、そして
関連する放射能を液体シンチレーションカウンタで測定した。結果を、試験した
ペプチドアナログの各々について、１分間当たりの平均計数として表す。

【００４８】 図４〜７に示す結果は、天然のインスリンＢ鎖（９−２３）ペプチド（配列番
号２）に応答して増殖するＴ細胞株およびクローンがペプチドアナログによって
は刺激されないことを示す。これらの患者および他者からの結果を表５にまとめ
る。

【００４９】

【表５】 この結果は、インスリンＢ鎖（９−２３）ペプチドに応答性である糖尿病患者
からの細胞が、変更されたペプチドリガンドであるＮＢＩ−６０２４（これは、
１６位および１９位において置換を有する）に対して応答しないことを明らかに
示す。本発明者らはまた、ＡＰＬ ＮＢＩ−６０２４がＤＱ８抗原に対して同様
の親和性をもって結合すると決定した。したがって、ＮＢＩ−６０２４によって
糖尿病患者のＴ細胞の刺激がないことは、提示するＭＨＣ分子とそのペプチドと
の任意の不適合に起因するのではなく、Ｂ鎖（９−２３）特異的Ｔ細胞による認
識の変化に起因するようである。

【００５０】 （実施例６：ＮＯＤマウスにおける糖尿病の発生数の減少） 本実施例は、代表的なペプチドアナログがＮＯＤマウスにおいて糖尿病を予防
する能力を例示する。

【００５１】 ＮＯＤマウスは、約３月齢から開始して自然に糖尿病を発症する（Ｍａｋｉｎ
ｏら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉ
ｔｕｓ、Ｓａｋａｍｏｔｏら編、２５〜３２頁（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅ
ｒｄａｍ、１９８５））。この疾患は、１月齢でさえも開始するＴ細胞の膵臓へ
の細胞浸潤によって進行する。残基１２、１３または１６においてアラニン置換
を含むＢ鎖（９−２３）の可溶性ペプチドアナログを、ＮＯＤマウスに１週間お
きに皮下投与した。各処置において、４００μｇの各ペプチドを、１０匹の動物
に投与した。９回の処置の後、糖尿病になった各処置群におけるマウスの割合を
、１週間おきに糖測定器（ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ）を用いて血中グルコースレベ
ルを測定することによって評価した。２回連続した観察における、２００ｍｇ／
ｄｌを超える血中グルコースの読み取りを、明白な糖尿病の指標とみなした。

【００５２】 図８に示すように、アラニン置換したアナログの各々での処置は、糖尿病の発
生数における顕著な減少をもたらした。Ａ１３置換アナログについてのデータも
また、図９に示す。

【００５３】 別の実験において、Ｂ鎖（９−２３）、Ａ１３置換アナログまたはニューロテ
ンシン（コントロールとして）をＮＯＤマウスに、毎週皮下投与した。各処置に
おいて４００μｇの各ペプチドを、１０匹の動物に投与した。１３回の処置の後
、各処置群において、糖尿病になったマウスの割合を、上記のように評価した。
図１０において示すように、Ｂ鎖（９−２３）ペプチドは、糖尿病の発生数を減
じた。この減少は、Ａ１３置換アナログについてより顕著であった。

【００５４】 二重置換ペプチドＡ^16,19（ＮＢＩ−６０２４）がＮＯＤマウスにおいて糖尿 病の発症を制御する能力を決定するために、このペプチドを、初期の年齢にて動
物に投与した。したがって、雌性マウス（ｎ＝９、約４週齢）を２０ｍｇ／ｋｇ
（４００μｇ／マウス）のＮＢＩ−６０２４で、１２週間皮下処置し、次いで、
３５週目まで１週間おきに皮下処置した。次いで、９〜１０週齢から、マウスを
、高血糖についてモニターし、血中グルコースレベルを測定した。コントロール
として、１０匹の雌性マウスの一群を、未処置のままとした。この実験からの結
果を図１１に示す。理解され得るように、ＮＢＩ−６０２４での処置は、未処置
群に比して、約６０〜７０％、糖尿病の発生数を有意に減じた（ｐ＜０．００４
）。

【００５５】 次いで、この観察を、第二の実験において確認および拡張した。ここで、動物
（ｎ＝１３〜１５）を、ＮＢＩ−６０２４または無関係なペプチドであるニュー
ロテンシン、ＮＢＩ−６０２４のいずれかで上記のように処置した。さらなる群
（ｎ＝８）を未処置のままとした。図１２に示されるように、改変ペプチドであ
るＮＢＩ−６０２４の２０ｍｇ／ｋｇでの処置は、ニューロテンシンで処置した
群または未処置群のいずれと比較しても糖尿病の発生数を減じた。

【００５６】 これらの結果は、インスリンＢ鎖（９−２３）ペプチドの周りを設計した変更
したペプチドリガンドであるＮＢＩ−６０２４が、糖尿病を自然に発症する危険
性にある動物に対して、保護を付与し得ることを実証する。他の膵臓抗原を認識
するＴ細胞がこれらの動物に存在するようであるが、なお、それらもまた、イン
スリンＡＰＬによって調節されるようである。投与のタイミングは、自己反応性
リンパ球が、膵臓に浸潤を開始し、そして破壊プロセスを開始するのとほぼ同時
であった。これらの結果は、このＡＰＬでの初期の介入がヒトにおけるＩ型糖尿
病の発症を遅延または予防するに有用であることを証明し得るという希望を提供
する。

【００５７】 （実施例７：代表的なペプチドアナログの免疫原性） 本実施例は、代表的なペプチドアナログのＮＯＤマウスにおける免疫原性を例
示する。

【００５８】 ３〜４匹のＮＯＤマウスの群を、マンニトール酢酸緩衝液中の１００〜４００
μｇのペプチドアナログで、１０〜１５日の期間内に３回皮下免疫した。最後の
免疫後、リンパ節細胞および／または脾臓細胞を、増殖アッセイにおいて使用し
た。この増殖アッセイにおいて、異なる濃度の免疫するペプチドを、その細胞と
ともに３〜４日間培養した。培養の最後の１８時間に三重水素化チミジンを含ま
せた。細胞を採取し、そしてシンチレーション計数器中で計数し、そしてその応
答を、ＣＰＭ±ＳＥＭとして表現した。図１３〜１６において示すこれらの結果
は、これらの代表的なペプチドアナログが、マウスＭＨＣ分子に結合する能力を
有し、そして対応するＴ細胞によって認識される能力を有することを示す。

【００５９】 二重置換ペプチドＮＢＩ−６０２４（Ａ^16,19）がＮＯＤマウス系統において 細胞性免疫応答を誘発する能力を次に決定した。２匹の雌性ＮＯＤマウスを、１
０ｍｇ／ｋｇのＮＢＩ−６０２４で、水性懸濁液またはコントロールとして完全
フロイントアジュバント（ＣＦＡ）において乳濁化したものとしてかのいずれか
によって、免疫した。第８日目、最後の注射から３日後に、そのマウスを屠殺し
、脾臓および鼡径リンパ節細胞を取り出し、そしてこれをプールし、そして単細
胞懸濁物を調製した。細胞を、種々の濃度（０〜２５μＭ）のＮＢＩ−６０２４
の存在下で培養した。これらのリンパ系細胞がＮＢＩ−６０２４に応答して増殖
する能力を、インビトロで、［³Ｈ］チミジン取り込みによって測定した。

【００６０】 その結果を表６に示す。ここで、その応答を、三連培養物の平均ＣＰＭ±ＳＥ
Ｍとして表現する。ＣＦＡ中のアナログで免疫したマウスから単離したリンパ節
細胞は、用量依存性の様式で免疫アナログによるチャレンジに対する強力な増殖
応答を示した（表６）。これらの結果は、天然のインスリンＢ鎖（９−２３）配
列において、１６位および１９位で作製された変更が、そのペプチドがＮＯＤ疾
患関連ＭＨＣハプロタイプ分子に結合する能力に影響を与えず、そしてより重要
なことに、Ｔ細胞による認識を阻害しなかったことを示す。

【００６１】

【表６】 さらに、可溶性ペプチドの投与から単離された脾臓および鼡径リンパ節細胞の
両方が、インビトロでＮＢＩ−６０２４でチャレンジしたときにＡＰＬに対する
強力な増殖応答を示した（表７ならびに図１７Ａおよび図１７Ｂ）。さらにより
印象的なのは、その可溶性ペプチドで免疫したマウスからのＮＢＩ−６０２４由
来のリンパ球もまたインスリンＢ鎖（９−２３）に応答したという知見であった
。この交叉反応性の特徴は、ＣＦＡで乳化したペプチドでは見られなかった。可
溶性ペプチドが交叉反応性応答を誘導するというこの能力は、糖尿病を制御する
において所望され得る。なぜなら、この能力は、ＮＢＩ−６０２４特異的な防御
性Ｔ細胞を病原性標的組織へと動員するにおいて役立ち得るからである。

【００６２】

【表７】 可溶性ＮＢＩ−６０２４の投与の後に産生されたＴ細胞の型を決定するために
、免疫リンパ球細胞からの培養上清を、培養開始後４８時間で取り出し、そして
種々のサイトカインのレベルを、標準的なＥＬＩＳＡ技術を用いて測定した。驚
くべきことに、可溶性ＮＢＩ−６０２４で免疫したマウス由来のＴ細胞のサイト
カイン生成プロファイルは、Ｔｈ２サイトカインであるインターロイキン４（図
１８）およびインターロイキン５（表８）を生成し、そしてＴｈ１由来のインタ
ーロイキン２は生成しなかった。表８において、値を、三連の平均±ＳＥＭとし
てｐｇ／ｍｌで表現する。コントロールとして、ＣＦＡで乳化したＮＢＩ−６０
２４は、インビトロ刺激において免疫Ｔ細胞からの予測されたＴｈ１サイトカイ
ンプロファイル（ＩＬ−２）をまさに誘導した。

【００６３】

【表８】 ＮＢＩ−６０２４の可溶性皮下投与が、Ｔｈ２様細胞を誘導する能力は、所望
される特徴である。なぜなら、そのような細胞は、糖尿病および他の器官特異的
な自己免疫疾患からの回収と関連しているからである（Ｓａｒｖｅｔｎｉｃｋ、
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：１５９７−１６００,１９９６；Ｓｈａｗら、１ ９９７；Ｂａｌａｓａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：３８５−３９１，１９
９７）。これらのＴｈ２−誘導サイトカインは、疾患を媒介する炎症前サイトカ
イン分泌性自己反応性Ｔｈ１細胞の発生を抑制する、強力な抗炎症活性を有する
。

【００６４】 上記より、本発明の特定の実施態様が本明細書において本発明を例示する目的
で記載されてきたが、種々の改変が、本発明の精神および範囲を逸脱することな
くなされ得ることは明白である。従って、本発明は、添付の請求の範囲によるも
のを除いて限定されない。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、インスリンＢ鎖（配列番号２）の残基９〜２３のアミノ酸配列を示す
。

【図２】 図２は、種々の量の代表的なペプチドアナログ（ここで、示されるように、異
なる残基がアラニンで置換される）の存在下での、天然のインスリンＢ鎖（９〜
２３）ペプチドに対するＮＯＤマウスＴ細胞クローンの増殖応答（ｃｐｍで測定
）を示すグラフである。

【図３】 図３は、種々の量の代表的なペプチドアナログ（ここで、１６位および１９位
のアミノ酸は、アラニンで置換される）（ＮＢＩ−６０２４；四角で示す）の存
在下での、天然のインスリンＢ鎖（９〜２３）ペプチドに対するＮＯＤマウスＴ
細胞クローンの増殖応答（ｃｐｍで測定）を示すグラフである。比較のためにミ
エリン塩基性タンパク質由来の関連していないコントロールペプチド（ＮＢＩ−
５０９６；丸で示す）の存在下での、増殖応答もまた示される。この応答は、三
連の培養物の平均ＣＰＭ±ＳＥＭとして示される。

【図４】 図４は、天然のＢ鎖（９〜２３）ペプチドまたは代表的なペプチドアナログに
対する、異なる糖尿病患者由来のＴ細胞株の増殖応答（ｃｐｍで測定）を例示す
るヒストグラムである。末梢血の単核細胞を、糖尿病患者から単離し、そしてイ
ンスリンＢ鎖（９〜２３）の存在下で培養した。インスリンＢ鎖（９〜２３）で
の３回の再刺激後、１×１０⁵ Ｔ細胞および７×１０⁴照射の自己ＰＢＭＣを丸
底９６ウェルプレートの各ウェルの完全培地中に添加した。細胞を、ＮＢＩ−６
０２４（１６位および１９位でアラニンの置換を有するインスリンＢ鎖９〜２３
）、インスリンＢ鎖（９〜２３）、または培地のみで５日間培養した。４日目に
、この細胞を³Ｈ−チミジンでパルス刺激し、さらに１８時間再培養した。次い で、この培養物を収集し、液体シンチレーションを使用して計測し、そしてその
データを、複製サンプルの１分間当たりの平均カウント数（ｃｐｍ）±平均の標
準誤差（ｓｅｍ）として表した。

【図５】 図５は、天然のＢ鎖（９〜２３）ペプチドまたは代表的なペプチドアナログに
対する、異なる糖尿病患者由来のＴ細胞株の増殖応答（ｃｐｍで測定）を例示す
るヒストグラムである。末梢血の単核細胞を、糖尿病患者から単離し、そしてイ
ンスリンＢ鎖（９〜２３）の存在下で培養した。インスリンＢ鎖（９〜２３）で
の３回の再刺激後、１×１０⁵ Ｔ細胞および７×１０⁴照射の自己ＰＢＭＣを丸
底９６ウェルプレートの各ウェルの完全培地中に添加した。細胞を、ＮＢＩ−６
０２４（１６位および１９位でアラニンの置換を有するインスリンＢ鎖９〜２３
）、インスリンＢ鎖（９〜２３）、または培地のみで５日間培養した。４日目に
、この細胞を³Ｈ−チミジンでパルス刺激し、さらに１８時間再培養した。次い で、この培養物を収集し、液体シンチレーションを使用して計測し、そしてその
データを、複製サンプルの１分間当たりの平均カウント数（ｃｐｍ）±平均の標
準誤差（ｓｅｍ）として表した。

【図６】 図６は、天然のＢ鎖（９〜２３）ペプチドまたは代表的なペプチドアナログに
対する、異なる糖尿病患者由来のＴ細胞株の増殖応答（ｃｐｍで測定）を例示す
るヒストグラムである。末梢血の単核細胞を、糖尿病患者から単離し、そしてイ
ンスリンＢ鎖（９〜２３）の存在下で培養した。インスリンＢ鎖（９〜２３）で
の３回の再刺激後、１×１０⁵ Ｔ細胞および７×１０⁴照射の自己ＰＢＭＣを丸
底９６ウェルプレートの各ウェルの完全培地中に添加した。細胞を、ＮＢＩ−６
０２４（１６位および１９位でアラニンの置換を有するインスリンＢ鎖９〜２３
）、インスリンＢ鎖（９〜２３）、または培地のみで５日間培養した。４日目に
、この細胞を³Ｈ−チミジンでパルス刺激し、さらに１８時間再培養した。次い で、この培養物を収集し、液体シンチレーションを使用して計測し、そしてその
データを、複製サンプルの１分間当たりの平均カウント数（ｃｐｍ）±平均の標
準誤差（ｓｅｍ）として表した。

【図７】 図７は、天然のＢ鎖（９〜２３）ペプチドまたは示されるようなアラニンの置
換を含む代表的なペプチドアナログに対する、異なる糖尿病患者由来のＴ細胞株
の増殖応答（ｃｐｍで測定）を例示するヒストグラムである。末梢血の単核細胞
を、糖尿病患者から単離し、そしてインスリンＢ鎖（９〜２３）ペプチドの存在
下で培養した。インスリンＢ鎖（９〜２３）での３回の再刺激後、１×１０⁵ Ｔ細胞および７×１０⁴照射の自己ＰＢＭＣを丸底９６ウェルプレートの各ウェ ルの完全培地中に添加した。細胞を、示されるように、アナログ、インスリンＢ
鎖（９〜２３）、または培地のみ（ＢＫＧ）で５日間培養した。４日目に、この
細胞を³Ｈ−チミジンでパルス刺激し、さらに１８時間再培養した。次いで、こ の培養物を収集し、液体シンチレーションを使用して計測し、そしてそのデータ
を、複製サンプルの１分間当たりの平均カウント数（ｃｐｍ）±平均の標準誤差
（ｓｅｍ）として表した。

【図８】 図８は、代表的なペプチドアナログでの９回の１週間毎の処置後に、糖尿病で
ある雌性ＮＯＤマウスの百分率を示すグラフである。１０匹の各マウスを、２４
日目に開始して、残基１２（白三角）、残基１３（四角）または残基１６（黒四
角）でのアラニンの置換を含むＢ鎖（９〜２３）のペプチドアナログで皮下処置
した。コントロールペプチドであるニューロテンシン（丸）で処置した全てのマ
ウスが、糖尿病になった。

【図９】 図９は、図８と同じデータを示すが、Ａ１３アナログ処置群とコントロールペ
プチド（ニューロテンシン）処置群とを対比するのみであるグラフである。

【図１０】 図１０は、代表的なペプチドアナログでの１３回の１週間毎の処置後に、糖尿
病であるＮＯＤマウスの百分率を示す。１０匹のマウスを、２４日目に開始して
、４００μｇのニューロテンシン（四角）、Ｂ鎖（９〜２３）（菱形）または残
基１３でのアラニンの置換を含むＢ鎖（９〜２３）のペプチドアナログ（三角）
での皮下で処置した。

【図１１】 図１１は、ＮＯＤマウスにおける糖尿病の発生数への代表的なペプチドアナロ
グの効果を示すグラフである。４週齢の雌性ＮＯＤマウス（ｎ＝９）を、２０ｍ
ｇ／ｋｇのＮＢＩ−６０２４（Ａ^16,19）で、１２週までは１週間に１回、続い て３５週齢までは隔週で皮下処置した。コントロール群（ｎ＝１０）は、非処置
群からなる。２回の継続した時点で２００ｍｇ／ｄＬを超える血中グルコースを
有するマウスを、糖尿病であるとみなす。そのデータを、３５週間の研究に対し
て非糖尿病の百分率として表す。ログランク（ｌｏｇ−ｒａｎｋ）試験を使用し
て、２つの処置群の結果が有意に異なるか否か評価した。ＮＢＩ−６０２４（Ａ ^16,19 ）での処置後に糖尿病であったＮＯＤマウスの百分率を、種々の時点で四 角により示し、そしてコントロール群中の糖尿病であるマウスの百分率を、丸で
示す。

【図１２】 図１２は、ＮＯＤマウスにおける糖尿病の発生数への代表的なペプチドアナロ
グの効果を示すグラフである。４週齢の雌性ＮＯＤマウス（ｎ＝１３〜１５）を
、２０ｍｇ／ｋｇのＮＢＩ−６０２４（Ａ^16,19）またはＮＢＩ−６２０１（コ ントロールペプチド、ニューロテンシン）で、１２週までは１週間に１回、続い
て３５週齢までは隔週で皮下処置した。コントロール群（ｎ＝８）は、非処置群
からなる。２回の継続した時点で２００ｍｇ／ｄＬを超える血中グルコースを有
するマウスを、糖尿病であるとみなす。そのデータを、３５週間の研究に対して
非糖尿病の百分率として表す。ログランク（ｌｏｇ−ｒａｎｋ）試験を使用し、
２つの処置群の結果が有意に異なるか否か評価した。ＮＢＩ−６０２４（Ａ^{16,1 9} ）での処置後に糖尿病であったＮＯＤマウスの百分率を、種々の時点で四角に より示す。ニューロテンシンペプチドでの処置後、糖尿病であった百分率を三角
で示し、糖尿病であって、非処置マウスの百分率を丸で示す。

【図１３】 図１３Ａ〜図１３Ｄは、残基１２（図１３Ａ）、残基１３（図１３Ｂ）残基１
５（図１３Ｃ）または残基１６（図１３Ｄ）でのアラニンの置換を有する、Ｂ鎖
の残基９〜２３を含む代表的なペプチドアナログの免疫原性を例示するグラフで
ある。ＮＯＤマウスに、示されるように種々の濃度のペプチドアナログまたは天
然のインスリンＢ鎖（９〜２３）ペプチドに対するリンパ節細胞の増殖応答をア
ッセイする前に、可溶性形態のペプチドアナログを、２〜４回皮下に注射した。
増殖応答を、培養期間の終了後に液体シンチレーションカウンターで計数するこ
とにより、細胞中に取り込まれた放射性チミジンの量（三連の培養ウェルの１分
当たりの平均のカウント数（ＣＰＭ）としてプロットした）を決定することによ
って評価した。

【図１４】 図１４Ａ〜図１４Ｆは、ＮＯＤマウスにおいて６つの異なるペプチドアナログ
の免疫原性を示すグラフである。２つのアラニンの置換（示されるように、Ａ１
２、１３；Ａ１２、１５；Ａ１２、１６；Ａ１３、１５；Ａ１３、１６およびＡ
１５、１６）を有するペプチドアナログを、ＮＯＤマウスに注射し、そして１０
日後、それらのリンパ節細胞を、刺激剤として異なる濃度の免疫化タンパク質を
使用する増殖アッセイに使用した。増殖応答を、培養期間の終了後に液体シンチ
レーションカウンターで計数することにより、細胞中に取り込まれた放射性チミ
ジンの量（三連の培養ウェルの１分当たりの平均のカウント数（ＣＰＭ）として
プロットした）を決定することによって評価した。

【図１５】 図１５Ａ〜図１５Ｄは、インスリンＢ鎖(９〜２３）の代表的な二重に置換さ れたペプチドアナログの免疫原性を例示するグラフである。以下のペプチドを、
ＮＯＤマウスでの免疫応答を誘発するそれらの能力について試験した：Ａ１２、
１９（図１５Ａ）；Ａ１３、１９（図１５Ｂ）；Ａ１５、１９（図１５Ｃ）；Ａ
１６、１９（図１５Ｄ）。排出してくるリンパ節細胞の１分間あたりのカウント
数としての増殖応答を、免疫化アナログおよびまた天然のインスリンＢ鎖（９〜
２３）ペプチドに対応させて、示す。

【図１６】 図１６は、一連の三連に置換されたペプチドがＮＯＤマウスにおいてＴ細胞増
殖応答を誘起する能力を示すグラフである。マウスを、以下の置換の組合せを含
む代表的なペプチドアナログで別々に免疫化した：Ａ１２、１３、１９；Ａ１２
、１５、１９；Ａ１２、１６、１９；Ａ１３、１５、１９；またはＡ１３、１６
、１９；Ａ１５、１６、１９。次いで、リンパ節細胞を、増殖アッセイに使用し
、そして異なる濃度での各々の免疫化ペプチドの応答を示す。

【図１７】 図１７Ａおよび図１７Ｂは、二重に置換されたペプチド（Ａ^16.19）が免疫応 答を誘起する能力を示すグラフである。５匹の雌性ＮＯＤマウスを、１日目、６
日目および１２日目に２０ｍｇ／ｋｇの可溶性ＮＢＩ−６０２４を用いて皮下に
免疫した。１５日目に、このマウスを屠殺し、鼡径部のリンパ節細胞を取り出し
、そして種々の濃度（０〜５０μＭ）のＮＢＩ−６０２４（図１７Ａ）またはイ
ンスリンＢ鎖（９〜２３）ペプチド（図１７Ｂ）のいずれかの存在下で培養した
。Ｔ細胞増殖の程度を、³Ｈチミジン取り込みを使用して決定した。この応答を 、三連の培養物の平均ＣＰＭ±ＳＥＭとして示す。

【図１８】 図１８は、アジュバントの存在下または非存在下で、Ａ^16.19（ＮＢＩ−６０ ２４）ペプチドにより誘導される免疫細胞により産生されるサイトカインの比較
を示すヒストグラムである。ＮＯＤマウスの群を、ＮＢＩ−６０２４単独または
ＣＦＡで乳化したＮＢＩ−６０２４で免疫した。示されるようなサイトカインＩ
Ｌ−２およびＩＬ−４を、２５μＭのＮＢＩ−６０２４で測定し、そしてバック
グランドの値を差し引いた後のｐｇ／ｍＬとして表した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 リング， ニコラス アメリカ合衆国 カリフォルニア 92122， サン ディエゴ， ブロック ストリー ト 5324 (72)発明者 コンロン， ポール ジェイ． アメリカ合衆国 カリフォルニア 92075， ソラナ ビーチ， サンタ ドミンガ 450 Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA03 AA07 BA02 DB34 NA14 ZC352 4H045 AA10 AA30 BA09 CA40 DA37 EA27 FA34 FA61 GA22 GA23

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトインスリンＢ鎖の残基９〜２３を含むペプチドアナログ
   であって、ここで該ペプチドアナログは、１つ〜４つのアミノ酸の位置での置換
   に起因して、天然のヒトインスリンＢ鎖の残基９〜２３と配列が異なり、ここで
   少なくとも１つの置換が、残基１２、１３、１５および１６からなる群から選択
   される残基で生じる、ペプチドアナログ。
2. 【請求項２】 前記ペプチドアナログが、２つのアミノ酸残基で天然のヒト
   インスリンＢ鎖と異なる配列を有する、請求項１に記載のペプチドアナログ。
3. 【請求項３】 前記ペプチドアナログが、３つのアミノ酸残基で天然のヒト
   インスリンＢ鎖と異なる配列を有する、請求項１に記載のペプチドアナログ。
4. 【請求項４】 アミノ酸の置換が残基１９で生じる、請求項１に記載のペプ
   チドアナログ。
5. 【請求項５】 少なくとも１つのアミノ酸の置換が非保存的である、請求項
   １に記載のペプチドアナログ。
6. 【請求項６】 残基１２が置換されている、請求項１に記載のペプチドアナ
   ログ。
7. 【請求項７】 残基１２がアラニン残基である、請求項６に記載のペプチド
   アナログ。
8. 【請求項８】 残基１３が置換されている、請求項１に記載のペプチドアナ
   ログ。
9. 【請求項９】 残基１３がアラニン残基である、請求項８に記載のペプチド
   アナログ。
10. 【請求項１０】 残基１５が置換されている、請求項１に記載のペプチドア
    ナログ。
11. 【請求項１１】 残基１５がアラニン残基である、請求項１０に記載のペプ
    チドアナログ。
12. 【請求項１２】 残基１６が置換されている、請求項１に記載のペプチドア
    ナログ。
13. 【請求項１３】 残基１６がアラニン残基である、請求項１２に記載のペプ
    チドアナログ。
14. 【請求項１４】 残基１９が置換されている、請求項６〜１３のいずれか１
    項に記載のペプチドアナログ。
15. 【請求項１５】 残基１９がアラニン残基である、請求項１４に記載のペプ
    チドアナログ。
16. 【請求項１６】 ヒトインスリンＢ鎖の残基２４をさらに含む、請求項１に
    記載のペプチドアナログ。
17. 【請求項１７】 前記ペプチドアナログが、ヒトインスリンＢ鎖の１８残基
    以下を含む、請求項１に記載のペプチドアナログ。
18. 【請求項１８】 前記ペプチドアナログが、ヒトインスリンＢ鎖の１６残基
    以下を含む、請求項１に記載のペプチドアナログ。
19. 【請求項１９】 前記ペプチドアナログが、ヒトインスリンＢ鎖の１５残基
    以下を含む、請求項１に記載のペプチドアナログ。
20. 【請求項２０】 本質的にヒトインスリンＢ鎖の残基９〜２３からなるペプ
    チドアナログであって、ここで該ペプチドアナログが、１つ〜４つのアミノ酸位
    置での置換に起因して、天然のヒトインスリンＢ鎖の残基９〜２３と配列が異な
    り、ここで少なくとも１つの置換が、残基１２、１３、１５および１６からなる
    群から選択される残基で生じる、ペプチドアナログ。
21. 【請求項２１】 本質的にヒトインスリンＢ鎖の残基９〜２４からなるペプ
    チドアナログであって、ここで該ペプチドアナログが、１つ〜４つのアミノ酸位
    置での置換に起因して、天然のヒトインスリンＢ鎖の残基９〜２３と配列が異な
    り、ここで少なくとも１つの置換が、残基１２、１３、１５および１６からなる
    群から選択される残基で生じる、ペプチドアナログ。
22. 【請求項２２】 生理的に受容可能なキャリアまたは希釈剤との組合せで、
    請求項１〜１９のいずれか１項に記載のペプチドアナログを含む、薬学的組成物
    。
23. 【請求項２３】 治療的有効量の請求項２２に記載の薬学的組成物を患者に
    投与する工程を包含する、糖尿病の発症を阻害するための方法。
24. 【請求項２４】 治療的有効量の請求項２２に記載の薬学的組成物を患者に
    投与する工程を包含する、糖尿病を処置するための方法。
25. 【請求項２５】 ヒトインスリンＢ鎖の残基９〜２３を含むペプチドアナロ
    グであって、該ペプチドアナログが、残基１６および残基１９での置換に起因し
    て、天然のヒトインスリンＢ鎖と配列が異なる、ペプチドアナログ。
26. 【請求項２６】 生理的に受容可能なキャリアまたは希釈剤との組合せで、
    請求項２５に記載のペプチドアナログを含む、薬学的組成物。
27. 【請求項２７】 治療的有効量の請求項２６に記載の薬学的組成物を患者に
    投与する工程を包含する、糖尿病の発症を阻害するための方法。