CN107847588B - 具有靶向部分及效应部分的分子构建体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本揭示内容提出了多种分子构建体，这些分子构建体具有一靶向组件与一效应组件。此处亦揭示了利用所述分子构建体来治疗多种疾病的方法。

Description

具有靶向部分及效应部分的分子构建体及其应用
【技术领域】
本揭示内容是关于药学领域；更明确地说，是关于多功能的分子构建体，譬如具有靶向组件与效应组件以将效应组件(如治疗药物)递送至目标部位的分子构建体。
【现有技术】
近年来，本领域发展出多种筛检与选择以抗原为标的之单克隆抗体 (monoclonalantibodies，mAbs)的方法，进而带动许多治疗用抗体的研发，为一些不久前还被认为是不治之症的疾病带来曙光。根据治疗性抗体数据库(Therapeutic Antibody Database)的统计，有多达2,800种左右的抗体已经或即将投入人体临床试验研发，而由政府药物管理机构核准可用于临床治疗的抗体则约有80种。从与抗体疗效相关的大量数据中可知抗体是基于何种药理机制而发挥疗效。
以抗体作为治疗药剂时，其主要的药理机制是以抗体来中和或诱捕造成疾病的介质；所述介质可能是存在于血液循环、间质空间(interstitial space)或淋巴结中的细胞介素或免疫成分。中和所述介质的活性可抑制造成疾病的介质和其受体之间的互动。此外，可将细胞介素的可溶性受体或受体的细胞外部分和免疫球蛋白IgG的Fc部分制成融合蛋白，此种融合蛋白可利用类似中和抗体的机制来中和上述细胞介素或免疫因子；因此目前也开发出多种融合蛋白治疗剂。
另外，某些取得临床使用许可或正在进行临床研究的治疗性抗体则是采用了与上述主要抗体机制不同的机制，来发挥其药理作用，譬如可藉由和受体结合以阻断这些受体和其配体之间的互动。对此类抗体药物来说，其主要的药理机制并非由Fc-介导的机制(如抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)或是补体介导的细胞溶解(complement-mediated cytolysis， CMC)等)。
另一些治疗性抗体可和目标细胞上的某些表面抗原结合，并藉此在目标细胞上发挥Fc介导的功能以及其他机制。最重要的Fc介导的机制为抗体依赖性细胞毒性(ADCC)以及补体介导的细胞溶解(CMC)，这两种机制都会将与抗体结合的目标细胞溶解。这些抗体和特定的细胞表面抗原结合后，可使得与其结合的目标细胞发生细胞凋亡。
制备具有双重特异性的抗体的概念与方法，早在三十年前就已萌芽。近年来，随着重组抗体工程方法的进步、以及对于更好药物的需求驱使下，发展出多种具有不同结构构形的双特异性抗体。
举例来说，双价或多价抗体可能带有二或更多种抗原结合位。已知有多种方法可用以制备多价抗体，这些方法通常利用连接结构将三或四种抗原结合片段(antigen-binding fragment，Fab)共价连接在一起。举例来说，已透过重组工程制备出能表现三或四个串联(tandem)的Fab重复片段的抗体。
此外，利用合成的交联物(crosslinker)，透过化学方法将不同的抗体或结合部位连接在一起，以制造出多价抗体的方法也是本领域公知的技术。其中一种方式是利用不同的接合物(linker)，将三、四或更多个分离的Fab片段，透过化学交联的方式彼此接合。另一种方式是先制备一个具有多个Fab的构建体，将这些 Fab组装成一维的DNA支架(one-dimensional DNA scaffold)。这些经设计可和目标分子结合的各种多价抗体构建体彼此的尺寸、半衰期、构形弹性以及调节免疫系统的能力各不相同。
基于以上说明，已有部分研究着眼于制备效应组件数目固定的分子构建体或具有二或更多种不同功能性组件(譬如至少一靶向组件与至少一效应组件) 的分子构建体。然而，通常很难利用化学合成或重组技术等方法，来建立具有特定标的与效应组件组合的分子构建体。因此，本领域亟需一种新颖的分子平台，其可用以建构适用于多种疾病的各种分子。
【发明内容】
发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明具体实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。发明内容的唯一目的在于对此处揭示的某些概念提供简化的说明，以利理解后文所述的实施方式。
<I>含肽核的多臂接合物
本揭示内容的第一种态样是关于一种接合单元，其上连接了至少两种不同功能性组件。举例来说，所述接合单元可连接有：两种不同的效应组件、一种靶向组件与一种效应组件、或一种效应组件与可延长接合单元生命周期的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)链。本发明接合单元设计成带有至少两种不同的官能基，使得这些功能性组件能够和各别的官能基反应而连接到接合单元。因此，本发明接合单元可作为用以制备带有二或更多种功能性组件的分子构建体的平台。
根据本揭示内容多种实施方式，所述接合单元包含一中心核及复数个连接臂。中心核可以是多肽核，其包含2至15个赖氨酸(lysine，K)残基，其中每一个K残基和次一个K残基之间由一填充序列所隔开，所述填充序列包含甘氨酸 (glycine，G)与丝氨酸(serine，S)残基；或者是，所述多肽核的序列为(Xaa-K)n，其中Xaa是具有2至12个乙二醇(ethyleneglycol，EG)重复单元的聚乙二醇化氨基酸 (PEGylated amino acid)，且n为2至15的整数。在视需要而实施的实施方式中，填充序列是由2至20个氨基酸残基所组成。于多种实施方式中，填充序列可具有任一种以下序列：GS、GGS、GSG或序列编号：1-16所示序列。根据本揭示内容某些实施方式，中心核包含2至15个单元的G1-5SK序列；在较佳的情形中，中心核的序列为(GSK)2-15。每一连接臂藉由和K残基形成酰胺键而连接于中心核的K残基。连接臂的自由端(即，未连接于中心核的一端)有一顺丁烯二酰亚胺基(maleimide group)、N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimidyl，NHS)基、叠氮基(azide group)、炔基(alkyne group)、四嗪基(tetrazine group)、环辛烯基(cyclooctene group)或环辛炔基(cyclooctyne group)。此外，位于中心核N-或C-端的氨基酸残基有一叠氮基或炔基；或者是或额外地，令位于中心核N-或C-端的氨基酸残基是半胱氨酸(C)残基，且有一耦合臂透过此半胱氨酸残基的硫氢基而与其连接，此时所述耦合臂未和中心核连接的自由端有一叠氮基、炔基、四嗪基或环辛烯基或环辛炔基。
根据本揭示内容某些实施方式，当连接臂的自由端是叠氮基、炔基或环辛炔基时，则位于中心核N-或C-端的氨基酸残基为半胱氨酸残基，且耦合臂的自由端是四嗪基或环辛烯基。根据本揭示内容其他实施方式，当连接臂的自由端是四嗪基或环辛烯基时，则位于中心核N-或C-端的氨基酸残基有该叠氮基或炔基；或位于中心核N-或C-端的氨基酸残基是半胱氨酸残基，且耦合臂的自由端为叠氮基、炔基或环辛炔基。
在某些实施方式中，所述连接臂为一PEG链；在较佳情形中，其具有 2至20个EG重复单元。或者是，所述连接臂是具有2至20个EG重复单元的PEG链，且在其自由端(即，未和中心核K残基连接的一端)有一双硫键。于某些实施方式中，所述耦合臂为一PEG链；在较佳情形中，其具有2至12个EG重复单元。
带有叠氮基的氨基酸残基实例包括：L-叠氮高丙氨酸 (azidohomoalanine，AHA)、4-叠氮-L-苯丙氨酸(4-azido-L-phenylalanine)、4-叠氮-D- 苯丙氨酸(4-azido-D-phenylalanine)、3-叠氮-L-丙氨酸(3-azido-L-alanine)、3-叠氮-D- 丙氨酸(3-azido-D-alanine)、4-叠氮-L-高丙氨酸(4-azido-L-homoalanine)、4-叠氮-D- 高丙氨酸(4-azido-D-homoalanine)、5-叠氮-L-鸟氨酸(5-azido-L-ornithine)、5-叠氮 -D-鸟氨酸(5-azido-D-ornithine)、6-叠氮-L-赖氨酸(6-azido-L-lysine)以及6-叠氮-D- 赖氨酸(6-azido-D-lysine)。例示性的带有炔基氨基酸残基包括：L-高炔丙基甘氨酸 (L-homopropargylglycine，L-HPG)、D-高炔丙基甘氨酸(D-homopropargylglycine， D-HPG)以及β-高炔丙基甘氨酸(beta-homopropargylglycine、β-HPG)。
当位于中心核N-或C-端的氨基酸残基是半胱氨酸残基时，位于耦合臂自由端的环辛烯基可以是反式-环辛烯(trans-cyclooctene，TCO)基，而位于耦合臂自由端的环辛炔基则可以是二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne，DBCO)、二氟化环辛炔(difluorinatedcyclooctyne，DIFO)、二环壬炔(bicyclononyne，BCN)或二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne，DICO)基。另一方面，位于耦合臂自由端的四嗪基包括，但不限于：1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪以及1,2,4,5-四嗪基，以及其衍生物，譬如6-甲基四嗪基。
根据本揭示内容多种实施方式，所述接合单元更包含复数个第一组件。于某些实施方式中，藉由在连接臂和第一组件之间形成酰胺键，而将每一第一组件连接至连接臂。在其他实施方式中，透过发生在连接臂与第一组件之间的“铜催化的叠氮化物-炔羟环加成(copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)”、“应力促进的叠氮化物-炔羟链接化学(strain-promoted azide-alkyne click chemistry， SPAAC)”反应或“逆电子需求狄尔斯-阿德(inverse electron demand Diels–Alder， iEDDA)”反应，而将每一第一组件连接至连接臂。
在视需要的情形中，此处提出的接合单元更包含复数个衔接臂，其可透过CuAAC、SPAAC或iEDDA反应而各别连接至该些连接臂。根据本发明实施方式，每一衔接臂用于连接组件的一端(即，未与连接臂相连的一端)有一顺丁烯二酰亚胺基或NHS基。因此，每一第一组件和衔接臂之间可透过硫氢–顺丁烯二酰亚胺反应或藉由形成酰胺键而彼此连接。于某些实施方式中，每一衔接臂是一PEG 链，其较佳具有2至20个EG重复单元。在其他实施方式中，每一衔接臂是具有2 至20个EG重复单元的PEG链，且其组件连接端有一双硫键。
根据本揭示内容多种视需要而实施的实施方式，第一组件是可在个体体内发挥欲求效果(如，治疗效果)的效应组件；或者是，第一组件是能够将接合单元导引至目标部位的靶向组件。根据本发明实施方式，第一组件是芬戈莫德 (fingolimod)、芬戈莫德磷酸盐(fingolimod phosphate)、干扰素-β(interferon-β)或对整合素-α4(integrin-α4)、β-类淀粉蛋白(β-amyloid)、病毒蛋白或细菌蛋白特异的单链可变片段(single-chainvariable fragment，scFv)。
同样在有需要的情形中，接合单元更可包含与第一组件不同的第二组件。在某些实施方式中，第二组件带有叠氮基或炔基，使得其可和中心核或耦合臂的对应炔基或叠氮基进行CuAAC反应，进而与中心核或耦合臂耦接。或者是，在某些实施方式中，第二组件带有叠氮基或环辛炔基，使得其可和中心核或耦合臂的对应环辛炔基或叠氮基进行SPAAC反应，进而与中心核或耦合臂耦接。又或者是，于一些实施方式中，第二组件带有四嗪基或环辛烯基，而使得其可和中心核或耦合臂的对应环辛烯基或四嗪基进行iEDDA反应，进而与中心核或耦合臂耦接。根据某些实施方式，所述接合单元包含衔接臂，此衔接臂透过CuAAC或SPAAC反应而连接至连接臂；在这些情形中，中心核的N-或C-端或耦合臂的自由端有四嗪基或环辛烯基，而使得带有相应环辛烯基或四嗪基的第二组件可以透过iEDDA 反应而连接至中心核或耦合臂。根据其他实施方式，所述接合单元包含衔接臂，此衔接臂透过iEDDA反应而连接至连接臂；在这些情形中，中心核的N-或C-端或耦合臂的自由端有叠氮基、炔基或环辛炔基，而使得带有相应化学基团的第二组件可以透过CuAAC或SPAAC反应而连接至中心核或耦合臂。
在本揭示内容可任选的实施方式中，当第一组件为效应组件时，第二组件可以是另一种效应组件，其可和第一组件累加(additively)、协同(synergistically) 或独立(independently)作用；或者是，第二组件可以是靶向组件或能改善接合单元药动学性质(如溶解度、廓清率(clearance)、半衰期(half-life)与生物可用率 (bioavailability))的组件。在其他可任选的实施方式中，当第一组件为靶向组件时，第二组件较佳为效应组件或能改善接合单元药动学性质的组件。
于一些实施方式中，所述接合单元更包含视需要而加入的第三组件，此种第三组件和第一、第二组件不同。在第二组件直接与中心核连接的情形中，所述中心核的另一端(即，未与第二组件连接的自由端)可视需要而为半胱氨酸残基，此一残基可用以引入非必要的第三组件。具体来说，半胱氨酸残基的硫氢基可和一PEG链上的顺丁烯二酰亚胺基反应，而此一与中心核连接的PEG链在此称为“耦合臂”；上述耦合臂的自由端带有四嗪基或环辛烯基。如此一来，第三组件即可透过iEDDA反应而与耦合臂连接。在所述接合单元包含第二与第三组件的情形中，第一与第二组件其中至少一种较佳为一效应组件，而第三组件则可以是能改善接合单元药动学性质的组件。分子量为20,000至50,000道耳顿(daltons)的长 PEG链就是一种能改善接合单元药动学性质的组件。
<II>含肽核的多臂接合物的用途
在临床医学领域中，根据本揭示内容第一态样的接合单元可用于治疗多种疾病。因此，本揭示内容的第二种态样是关于治疗这些疾病的方法。根据本揭示内容多种实施方式，用以治疗特定疾病的方法包含以下步骤：对有需要的个体投予治疗有效量的接合单元，所述接合单元可以是根据本揭示内容上述态样与实施方式的任一种接合单元。当可理解，可将所述接合单元以药学配方的形式施用，此种药学配方除了包含本发明接合单元外，还包含适用于所欲给药方式的药学上可接受的赋型剂。
为了让本发明所属技术领域具有通常知识者能够理解本揭示内容的某些实施方式，下文举例说明可用以治疗某些特定疾病之接合单元所含的第一与第二组件的组合。
根据本揭示内容某些实施方式，此处提出的接合单元可用以治疗中枢神经系统(central nervous system，CNS)疾病，如多发性硬化症(multiple sclerosis) 与阿滋海默症。于治疗多发性硬化症时，第一组件可以是芬戈莫德、芬戈莫德磷酸盐、干扰素-β或对整合素-α4特异的scFv。于治疗阿滋海默症时，第一组件可以是对β-类淀粉蛋白特异的scFv。
根据本揭示内容其他实施方式，所述接合单元可用以治疗感染性疾病，此种接合单元包含以对病毒蛋白或细菌蛋白特异的scFv(作为第一组件)。在一较佳的实施方式中，所述病毒蛋白可以是呼吸道融合病毒(respiratory syncytial virus， RSV)的F蛋白、人类免疫缺陷病毒第I型(human immunodeficiency virus type 1HIV-1) 的gp120蛋白、A型流感病毒(influenza A virus)的血球凝集素A(hemagglutinin A， HA)蛋白或巨细胞病毒(cytomegalovirus)的醣蛋白；而细菌蛋白则可以是革兰氏阴性菌(Gram(-)bacteria)的内毒素(endotoxin)、困难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile) 的表面抗原、金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的壁脂酸(lipoteichoic acid)、炭疽杆菌(Bacillusanthracis)的炭疽毒素(anthrax toxin)或大肠杆菌(Escherichia coli)的第I型或第II型类志贺毒素(Shiga-like toxin type I or II)。
<III>具有靶向部分及效应部分的分子构建体
在第三态样中，本揭示内容是关于一种分子构建体，其包含二个彼此直接或间接耦接的接合单元，其中一接合单元的中心核可和至少一靶向组件连接，而另一接合单元的中心核则可和至少一效应组件连接。本发明分子构建体的优点在于上述二接合单元可透过iEDDA、SPAAC或CuAAC反应而彼此耦接。此一设计使得开发人员能够便捷地合成具有复杂结构的分子构建体。根据本揭示内容的原理与精神，可以独立地制备两种接合单元，其分别携带不同数目和/或类型的功能性组件，之后再将两者耦接到一起。如此一来，本发明所属技术领域具有通常知识者能够建构多个构建体库，其分别由携带不同功能性组件的分子构建体所组成，而后再视需求和/或所欲的应用，由这些构建体库中选择并结合两种分子构建体(或接合单元)，以得到所需的构建体。更可藉由调整中心核内特定官能基的数目，来控制每一接合单元所携带的功能性组件的数目。
根据本揭示内容的一实施方式，所述分子构建体包含一第一接合单元以及一第二接合单元。具体来说，第一接合单元包含(1)一第一中心核、(2)分别连接于第一中心核的一或多个连接臂(下文称为第一连接臂)、(3)视需要而加入的一耦合臂(下文称为第一耦合臂)以及(4)视需要而加入且分别连接于一或多第一连接臂的一或多个衔接臂(下文称为第一衔接臂)；第二接合单元包含(1)一第二中心核、 (2)分别连接于第二中心核的一或多个连接臂(下文称为第二连接臂)、(3)视需要而加入的一耦合臂(下文称为第二耦合臂)以及(4)视需要而加入且分别连接于一或多第二连接臂的一或多个衔接臂(下文称为第二衔接臂)。第一与第二接合单元透过发生在以下任一种情形间的iEDDA、SPAAC或CuAAC反应而彼此耦接：第一与第二中心核之间、第一耦合臂与第二中心核之间、第一与第二耦合臂之间或第一中心核与第二耦合臂之间。
根据本揭示内容的实施方式，第一与第二中心核都具有复数个氨基。每一连接臂藉由和中心核的氨基形成酰胺键，而连接于中心核；举例来说，可利用N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimidyl，NHS)和上述氨基反应。当连接于中心核之后，上述连接臂的自由端可带有NHS基、顺丁烯二酰亚胺基、叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基或环辛炔基。
当连接臂的自由端带有NHS基时，第一靶向组件与第一效应组件藉由形成于组件(即，第一靶向组件或第一效应组件)与连接臂(即，第一连接臂或第二连接臂)之间的酰胺键而分别连接于第一与第二连接臂。当连接臂的自由端带有顺丁烯二酰亚胺基、叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基或环辛炔基时，第一靶向组件与第一效应组件可透过组件(即，第一靶向组件或第一效应组件)与连接臂(即第一连接臂或第二连接臂)间的以下反应而分别连接于第一与第二连接臂：硫氢–顺丁烯二酰亚胺反应、CuAAC反应、iEDDA反应或SPAAC反应。
在有需要的情形中，此处提出的分子构建体的接合单元(即，第一或第二接合单元)更包含一或多个衔接臂(即，第一或第二衔接臂)，其分别透过 CuAAC、iEDDA或SPAAC反应而连接至一或多连接臂。根据本发明实施方式，每一衔接臂的自由端有一NHS基或顺丁烯二酰亚胺基。因此，每一组件(即，第一靶向组件或第一效应组件)可藉由形成于组件与衔接臂间的酰胺键或发生于组件与衔接臂间的硫氢–顺丁烯二酰亚胺、CuAAC、iEDDA或SPAAC反应，而连接于每一衔接臂。
根据本揭示内容某些实施方式，每一连接臂是一条具有2至20个EG重复单元的PEG链。或者是，每一连接臂是一条具有2至20个EG重复单元的PEG链，且其自由端(即，并未与中心核连接的一端)带有一双硫键。根据本揭示内容某些实施方式，每一耦合臂是一条具有2至12个EG重复单元的PEG链。根据本揭示内容某些实施方式，每一衔接臂为一PEG链，其具有2至20个EG重复单元。或者是，每一衔接臂是一条具有2至20个EG重复单元的PEG链，且其组件连接端(即，并未与连接臂连接的一端)带有一双硫键。
根据本揭示内容多种实施方式，第一或第二中心核可以是化合物核或多肽核。在某些例子中，第一与第二中心核都是化合物核，且两者可以采用相同或不同的化合物作为核心。在某些较佳的实施方式中，第一与第二中心核都是多肽核，且两者具有相同或不同的序列。或者是，两个核心其中一个是化合物核，而另一个是多肽核。
适合作为本发明化合物核的化合物包括但不限于：苯-1,3,5-三胺 (benzene-1,3,5-triamine)、2-(胺甲基)-2-甲基丙烷-1,3-二胺(2-(aminomethyl)- 2-methylpropane-1,3-diamine)、三(2-胺乙基)胺(tris(2-aminoethyl)amine)、苯-1,2,4,5- 四胺(benzene-1,2,4,5-tetraamine)、3,3’,5,5’-四胺-1,1’-联苯(3,3’,5,5’-tetraamine-1,1’-biphenyl)、四(2-胺乙基)甲烷(tetrakis(2-aminoethyl)methane)、四(乙胺)肼(tetrakis(ethylamine)hydrazine)、N,N,N’,N’,-四(胺乙基)乙二胺 (N,N,N’,N’,-tetrakis(aminoethyl)ethylene-diamine)、苯-1,2,3,4,5,6-六胺 (benzene-1,2,3,4,5,6-hexaamine)、1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-六(甲胺)-苯-1,3,5-三胺 (1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-hexakis(methylamine)-benzene-1,3,5-triamine)、 1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N,5-N,-八(甲胺)-苯-1,2,4,5-三胺 (1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N,5-N,-octakis(methylamine)-benzene-1,2,4,5-triamine) 以及N,N-二[(1-胺基-3,3-二胺乙基)戊基]甲烷二胺(N,N-bis[(1-amino-3,3- diaminoethyl)pentyl]methanediamine)。
在中心核为化合物核的例子中，耦合臂可藉由和中心核的多个氨基其中之一形成酰胺键，而连接到中心核。同时，耦合臂的自由端带有叠氮基、炔基、环辛烯基、环辛炔基或四嗪基。
根据本揭示内容某些实施方式，可作为本发明多肽核的多肽可包含2 至15个赖氨酸(K)残基。此外，每一个K残基和次一个K残基之间由一填充序列所隔开，所述填充序列包含甘氨酸(G)与丝氨酸(S)残基；在非必要的实施方式中，填充序列系由2至20个氨基酸残基所组成。于多种实施方式中，填充序列可具有任一种以下序列：GS、GGS、GSG或序列编号：1-16所示序列。在某些实施方式中，上述多肽包含2-15个单元的G1-5SK序列；譬如(GSK)2-15。在一实施方式中，多肽核的序列如序列编号：17、18、19、21、22、23或24所示。
或者是，所述多肽核具有(Xaa-K)n序列，其中Xaa为具有2至12个EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸，且n为2至15的整数。在一实施方式中，多肽核的序列如序列编号：25或26所示。
在中心核为多肽核的情形中，其N-或C-端可以是半胱氨酸残基。在这些例子中，耦合臂透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应而连接于中心核的半胱氨酸残基。上述耦合臂的自由端带有叠氮基、炔基、环辛烯基、环辛炔基或四嗪基。
第一与第二接合单元可透过多种构形而彼此耦接，端视第一与第二耦合臂是否存在，下文将进一步说明这些构形。对于采用化合物核的接合单元，较佳应透过耦合臂(即，第一或第二耦合臂)而和另一接合单元耦接；而对于采用多肽核的接合单元，耦合臂则不是必要的组件。
当第一与第二接合单元分别包含耦合臂时，一耦合臂(举例来说，第一耦合臂)的自由端带有四嗪基，而另一耦合臂(在本例中，第二耦合臂)的自由端带有环辛烯基，而使得二接合单元可透过发生于二耦合臂(即，第一与第二耦合臂) 之间的iEDDA反应而彼此耦接。在较佳的情形中，上述四嗪基为1,2,3,4-四嗪、 1,2,3,5-四嗪以及1,2,4,5-四嗪基或其衍生物，譬如6-甲基四嗪基；而环辛烯基为TCO 基。同样的情形亦适用于二耦合臂的自由端分别带有叠氮基与炔基的例子；此时，二接合单元是透过发生于二耦合臂(即，第一与第二耦合臂)之间的CuAAC反应而彼此耦接。或者是，一耦合臂(譬如，第一耦合臂)带有叠氮基，而另一耦合臂(在本实施例中，第二耦合臂)带有环辛炔基(在较佳的情形中，带有DBCO、DIFO、 BCN或DICO基)；因此，二耦合臂可透过SPAAC反应而耦接。当两个单元都是化合物核或多肽核时，或是当一接合单元为化合物核而另一单元为多肽核时，就可采用上述构形。
当只有一个接合单元具有耦合臂(譬如，第一接合单元带有第一耦合臂时)时，另一接合单元的中心核(譬如第二中心核)则为多肽核。在本例中，位于第二中心核N-或C-端的第一个氨基酸残基是带有叠氮基或炔基的氨基酸残基。在某些实施方式中，上述带有叠氮基或炔基的氨基酸残基会和第一接合单元的第一耦合臂所带的相应炔基或叠氮基进行CuAAC反应，因而将第一与第二接合单元接合在一起。或者是，第二中心核N-或C-端的第一个氨基酸残基带有叠氮基，其可位于第一接合单元的耦合臂自由端上的环辛炔基(在较佳的情形中，为DBCO、 DIFO、BCN或DICO基)进行SPAAC反应而相连接。此种构形可发生在两个单元都是多肽核或者是两者分别是化合物核和多肽核的情形中。
第一与第二接合单元也有可能不透过任何耦合臂(即，第一与第二耦合臂)而耦接。换句话说，第一与第二耦合臂彼此直接连接。此种构形主要发生在二个多肽核之间。具体来说，两个中心核其中之一(譬如第一中心核)的N-或C-端是带有叠氮基的氨基酸残基，而另一个中心核(如第二中心核)的N-或C-端则是带有炔基的基酸残基。如此一来，第一中心核的叠氮基会和第二中心核的炔基反应，进而将第一与第二接合单元耦接在一起。
带有叠氮基的氨基酸残基包括，但不限于：L-叠氮高丙氨酸(AHA)、 4-叠氮-L-苯丙氨酸、4-叠氮-D-苯丙氨酸、3-叠氮-L-丙氨酸、3-叠氮-D-丙氨酸、 4-叠氮-L-高丙氨酸、4-叠氮-D-高丙氨酸、5-叠氮-L-鸟氨酸、5-叠氮-D-鸟氨酸、 6-叠氮-L-赖氨酸以及6-叠氮-D-赖氨酸。带有炔基的氨基酸残基包括，但不限于： L-高炔丙基甘氨酸(L-HPG)、D-高炔丙基甘氨酸(D-HPG)以及β-高炔丙基甘氨酸 (β-HPG)。
根据本揭示内容某些实施方式，所述分子构建体的第一与第二接合单元其中之一更包含一额外的连接臂(下文称为第三连接臂)，连接于第一或第二接合单元。
和第一与第二连接臂相似，第三连接臂和一组件间可形成一酰胺键或可进行硫氢–顺丁烯二酰亚胺、CuAAC、iEDDA或SPAAC反应，进而与该组件连接。于某些实施方式中，此一额外的组件是第二靶向组件或第二效应组件，其可用以促进所述分子构建体的标的或治疗效果。或者是，所述额外组件可以是分子量约为20,000至50,000道耳顿的长PEG链，以便提升所述分子构建体的稳定性。
在其他实施方式中，本发明分子构建体更包含一第三接合单元。第三接合单元包含(1)一第三中心核、(2)连接至第三中心核的一或多个连接臂(下文称为第三连接臂)、(3)视需要而加入的一耦合臂(下文称为第三耦合臂)、以及(4)视需要而加入的一或多个衔接臂(下文称为第三衔接臂)。在本例中，第三接合单元透过发生在以下任一种情形的CuAAC反应、iEDDA反应或SPAAC反应而与第一或第二接合单元连接：发生在第一或第二耦合臂和第三耦合臂之间、第一或第二中心核和第三耦合臂之间、第一或第二耦合臂和第三中心核之间、或第一或第二中心核和第三中心核之间。
第三接合单元的第三连接臂在自由端可带有NHS基、顺丁烯二酰亚胺基、叠氮基、炔基、环辛烯基、环辛炔基或四嗪基。因此，第三连接臂与第二效应组件或靶向组件间可藉由形成酰胺键或进行硫氢–顺丁烯二酰亚胺、CuAAC、 iEDDA或SPAAC反应而直接连接。或者是，第三连接臂可透过CuAAC、iEDDA 或SPAAC反应而与第三衔接臂相连；而第二效应组件或靶向组件则和第三衔接臂之间则藉由形成酰胺键或进行硫氢–顺丁烯二酰亚胺反应而彼此连接。
当可理解，带有NHS官能基的标的/效应组件(譬如药物)可以透过NHS 基和K残基之间形成酰胺键，而直接连接到第一、第二和/或第三中心核的K残基，而不需使用连接臂(即，第一、第二或第三连接臂)。
根据本揭示内容多种实施方式，第一、第二以及非必要的第三中心核可以相同或不同。
<IV>具有靶向部分及效应部分的分子构建体的用途
在临床医学领域中，根据本揭示内容第三态样的分子构建体可用以治疗多种疾病。因此，本揭示内容的第四种态样是关于治疗这些疾病的方法。根据本揭示内容多种实施方式，治疗特定疾病的方法包含以下步骤：对有需要的个体投予治疗有效量的分子构建体，所述分子构建体可以是根据本揭示内容第三态样与其实施方式的任一种分子构建体。当可理解，可将所述分子构建体以药学配方的形式施用，此种药学配方除了包含本发明分子构建体之外，还包含适用于所欲给药方式的药学上可接受的赋型剂。
为了让本发明所属技术领域具有通常知识者能够理解本揭示内容的某些实施方式，下文举例说明可用以治疗某些特定疾病之分子构建体所含的第一与第二组件的组合。
根据本揭示内容某些实施方式，本发明分子构建体可用以治疗中枢神经系统(CNS)疾病，譬如，多发性硬化症与阿滋海默症。于治疗多发性硬化症时，第一组件可以是对运铁蛋白受体特异的scFv，而第二组件则可以是IFN-β、芬戈莫德、芬戈莫德磷酸盐或对整合素α4特异的scFv。于治疗阿滋海默症时，可分别使用对运铁蛋白受体特异的scFv以及对β-类淀粉蛋白特异的scFv作为第一与第二组件。
根据本揭示内容其他实施方式，本发明分子构建体可用以治疗感染性疾病。于一实施方式中，所述的感染性疾病是由病毒所引起，且第一组件是对病毒蛋白特异的scFv，而第二组件则是对CD16b或CD32特异的scFv。例示性的病毒蛋白包括：RSV的F蛋白、HIV-1的gp120蛋白、A型流感病毒的HA蛋白以及巨细胞病毒的醣蛋白。在另一实施方式中，所述感染性疾病是由细菌感染所造成，此时第一组件可以是对细菌蛋白特异的scFv，而第二组件可以是对CD16b或CD32特异的scFv。细菌蛋白的实施例包括但不限于：革兰氏阴性菌的内毒素、困难梭状芽孢杆菌的表面抗原、金黄葡萄球菌的壁脂酸、炭疽杆菌的炭疽毒素或大肠杆菌的第I型或第II型类志贺毒素。
<V>用以治疗中枢神经系统疾病的分子构建体及其用途
本揭示内容的第五态样是关于以可结晶片段(fragment crystallizable， Fc)为基础的分子构建体(下文称为Fc型分子构建体)，其具有直接或间接连接到免疫球蛋白CH2-CH3区域的至少一靶向组件与至少一效应组件。藉由审慎选择所述 Fc型分子构建体的标的与效应组件，所得到的Fc型分子构建体可用以治疗中枢神经系统(central nerveoussystem，CNS)疾病，或可用以制备用于治疗CNS疾病的药物。当可想见，利用此种Fc型分子构建体来治疗CNS疾病的方法亦属于本揭示内容的一种态样。
根据本揭示内容某些实施方式，Fc型分子构建体包含一对IgG.Fc的 CH2-CH3区段、一对效应组件及一对靶向组件。成对的效应组件可以是干扰素β1a (interferonβ1a，INF-β1a)或干扰素β1b(INF-β1b)或是对整合素α4(integrinα4)或β- 类淀粉蛋白(β-amyloid)特异的抗体片段，而成对靶向组件则可以是对人类运铁蛋白受体或人类胰岛素受体特异的抗体片段。
当成对效应组件连接于成对CH2-CH3区段的N-端时，成对靶向组件则连接于成对CH2-CH3区段的C-端，反之亦然。或者是，当成对效应组件与成对靶向组件都是单链可变片段(single-chain variable fragment，scFv)的形式时，则成对靶向组件以串联双抗体(tandem)或双抗体(diabody)的构形而连接于成对效应组件的N-端，因而形成一对连接于成对CH2-CH3区段N-端的双特异性scFv。
于一些实施方式中，该成对CH2-CH3区段衍生自人类IgG重链γ4或人类IgG重链γ1。
在某些例子中，成对的效应组件或成对的靶向组件形成抗原结合片段 (antigen-binding fragment，Fab)的构形(即，由VH-CH1区域以及VL-Cκ区域所组成)；此种Fab片段连接于第一与第二重链的N-端，而使得Fc型分子构建体形成IgG构形。在这些情形中，未采用Fab构形的该对组件则连接于成对CH2-CH3区段的C-端。
根据某些视需要而采用的实施方式，所述效应组件是INF-β1a、 INF-β1b或对整合素α4特异的scFv，而所述靶向组件则是对人类运铁蛋白受体特异的scFv。具体来说，此一分子构建体可用以治疗多发性硬化症。
根据其他视需要而采用的实施方式，所述效应组件是对β-类淀粉蛋白特异的，而所述靶向组件则是对人类运铁蛋白受体特异的scFv。具体来说，此种分子构建体适用于治疗阿滋海默症。
用以对有需要的个体治疗CNS疾病的方法包含以下步骤：对所述个体投予有效量的本态样之分子构建体。适用于此一治疗方法的CNS疾病包括多发性硬化症与阿滋海默症。
<VI>用以治疗感染性疾病的分子构建体
本揭示内容的第六态样是关于一种Fc型分子构建体，此种Fc型分子构建体具有直接或间接地连接到免疫球蛋白的CH2-CH3区域的至少一靶向组件与至少一效应组件。藉由选择本发明Fc型分子构建体的效应组件与靶向组件，所述分子构建体可用于治疗多种与病毒或细菌感染相关的疾病/症状，或可用以制备用于治疗所述感染疾病/症状的药物。当可想见，利用此种Fc型分子构建体来治疗病毒或细菌感染的方法亦属于本揭示内容的一种态样。
根据本揭示内容多种实施方式，所述Fc型分子构建体包含一对IgG.Fc 的CH2-CH3区段、一对效应组件及一对靶向组件。成对效应组件是对CD32或 CD16b特异的抗体片段，而成对靶向组件则是对病毒蛋白或细菌蛋白特异的抗体片段。
当成对效应组件连接于成对CH2-CH3区段的N-端时，成对靶向组件则连接于成对CH2-CH3区段的C-端，反之亦然。或者是，当成对效应组件与成对靶向组件都是单链可变片段(single-chain variable fragment，scFv)的形式时，则成对靶向组件以串联双抗体(tandem)或双抗体(diabody)的构形而连接于成对效应组件的N-端，因而形成一对连接于成对CH2-CH3区段N-端的双特异性scFv。
于一些实施方式中，上述成对的CH2-CH3区段是衍生自人类IgG重链γ4或人类IgG重链γ1。
在某些例子中，成对的效应组件或成对的靶向组件形成抗原结合片段 (antigen-binding fragment，Fab)的构形(即，由VH-CH1区域以及VL-Cκ区域所组成)；此种Fab片段连接于第一与第二重链的N-端，而使得Fc型分子构建体形成IgG构形。在这些情形中，未采用Fab构形的该对组件则连接于成对CH2-CH3区段的C-端。
根据某些视需要而采用的实施方式，效应组件是对CD32或CD16b特异的scFv，而靶向组件则是对病毒蛋白特异的scFv。譬如，病毒蛋白可以是呼吸道融合病毒(respiratorysyncytial virus，RSV)的F蛋白、人类免疫缺陷病毒第I型 (human immunodeficiencyvirus type 1HIV-1)的gp120蛋白、A型流感病毒(influenza A virus)的血球凝集素A(hemagglutinin A，HA)蛋白或巨细胞病毒(cytomegalovirus) 的醣蛋白。具体来说，此种分子构建体适用于治疗病毒感染。
根据其他视需要而采用的实施方式，效应组件是对CD32或CD16b特异的scFv，而靶向组件则是对细菌蛋白特异的scFv。而细菌蛋白的实施例包括但不限于：革兰氏阴性菌(Gram(-)bacteria)的内毒素(endotoxin)、困难梭状芽孢杆菌 (Clostridium difficile)的表面抗原、金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的壁脂酸 (lipoteichoic acid)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)的炭疽毒素(anthrax toxin)或大肠杆菌(Escherichiacoli)的第I型或第II型类志贺毒素(Shiga-like toxin type I or II)。具体来说，此种分子构建体适用于治疗细菌感染。
用以对有需要的个体治疗与感染(如，病毒与细菌感染)相关的疾病/ 症状的方法包含以下步骤：对所述个体投予有效量的本态样之分子构建体。
【附图说明】
为让本发明的上述与其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，兹将所附图式简单说明如下。
第1A图至第1N图为根据本揭示内容某些实施方式的接合单元的示意图。
第2图为包含化合物核的接合单元的示意图。
第3A图至第3D图为根据本揭示内容某些实施方式的T-E分子构建体的示意图。
第4图为根据本揭示内容某些实施方式，用以建构分子构建体的分子构建体库的示意图。
第5A图与第5B图为根据本揭示内容某些实施方式的分子构建体的示意图。
第6图为根据本揭示内容某些实施方式的分子构建体的示意图。
第7A图与第7B图为根据本揭示内容多种实施方式的分子构建体的示意图。
第8A图至8C为根据本揭示内容多种实施方式的Fc型分子构建体的示意图。
第9图为根据本揭示内容多种实施方式的Fc型分子构建体的示意图。
第10A图与10B图为根据本揭示内容多种实施方式的Fc型分子构建体的示意图。
第11图为一多肽核接合单元的基质辅助雷射脱附飞行时间质谱分析 (matrixassisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry， MALDI-TOF MS)结果，此多肽核接合单元带有一个含四嗪基的连接臂以及三个含顺丁烯二酰亚胺基的PEG连接臂。
第12图为NHS-PEG5-芬戈莫德复合物的MALDI-TOF MS分析结果。
第13图为一载药束的MALDI-TOF MS分析结果，此载药束由带有自由TCO官能基与一组五个芬戈莫德分子的接合单元所组成。
第14图为一载药束的MALDI-TOF MS分析结果，此载药束由带有自由TCO官能基与一组十个芬戈莫德分子的接合单元所组成。
第15图为一载药束的MALDI-TOF MS分析结果，此载药束由带有自由TCO官能基与一组五个芬戈莫德磷酸盐分子的接合单元所组成。
第16图为纯化人类CD32a胞外域(ectodomain)的SDS-PAGE分析结果。
第17图为纯化人类TfR1胞外域的SDS-PAGE分析结果。
第18A图为纯化对RSV蛋白F特异的scFv的SDS-PAGE分析结果；第 18B图为纯化对RSV蛋白F特异的scFv的ELISA分析结果；第18C图为纯化对内毒素特异的scFv的SDS-PAGE分析结果；第18D图为纯化对内毒素特异的scFv的ELISA 分析结果；第18E图为纯化对CD32a胞外域特异的scFv的SDS-PAGE分析结果；以及第18F图为纯化对CD32a胞外域特异的scFv的ELISA分析结果。
第19A图为纯化对大鼠TfR1胞外域特异的scFv的SDS-PAGE分析结果；第19B图为纯化对大鼠TfR1胞外域特异的scFv的ELISA分析结果；第19C图为纯化对β-类淀粉蛋白特异的scFv的SDS-PAGE分析结果；以及第19D图为纯化对β-类淀粉蛋白特异的scFv的ELISA分析结果。
第20A图为带有对人类CD32a胞外域特异的scFv之噬菌体的病毒效价数据；以及第20B图为对人类CD32a胞外域特异的噬菌体-呈现scFv的单菌落ELISA 分析结果。
第21A图为带有对人类TfR1胞外域特异的scFv之噬菌体的病毒效价数据；以及第21B图为对人类TfR1胞外域特异的噬菌体-呈现scFv的单菌落ELISA 分析结果。
第22A图与第22B图分别是TCO-对CD32a特异的scFv复合物的ELISA 分析结果与质谱分析结果。
第23A图与第23B图分别是四嗪-对TfR1特异的scFv复合物的ELISA 分析结果与质谱分析结果。
第24A图是所合成的标的接合单元以粒径筛析(size exclusion)管柱S75 进行FPLC所得的溶析曲线图，所述合成的标的接合单元是由带有一自由四嗪官能基和一组三个对内毒素特异的scFv(作为靶向组件)的接合单元所组成；第24B图与第24C图分别是第24A图所述合成的标的接合单元的SDS-PAGE分析结果与质谱分析结果。
第25图是所合成的标的接合单元的质谱分析结果；所述标的接合单元是由带有一自由四嗪官能基和一组三个对RSV蛋白F特异的scFv(作为靶向组件)的接合单元所组成。
第26A图是所合成的标的接合单元以阳离子交换管柱进行FPLC所得的溶析曲线图，所述合成的标的接合单元是由带有一个自由TCO官能基和一组三个对β-类淀粉蛋白特异的scFv(作为靶向组件)的接合单元所组成；第26B图与第 26C图分别是第26A图所述合成的标的接合单元的SDS-PAGE分析结果与ELISA分析结果。
第27A图为一单一接合单元分子构建体质谱分析结果，此单一接合单元分子构建体是以三个对内毒素特异的scFv作为靶向组件以及一个对CD32a胞外域特异的scFv作为效应组件；第27B图为另一单一接合单元分子构建体的的质谱分析结果，此单一接合单元分子构建体是以三个对内毒素特异的scFv作为靶向组件以及一个对CD32a胞外域特异的scFv作为效应组件；以及第27C图为又一单一接合单元分子构建体的质谱分析结果，此单一接合单元分子构建体是以一个对TfR1胞外域特异的scFv作为靶向组件以及三个对β-类淀粉蛋白特异的scFv作为效应组件。
第28A图与第28B图分别是一分子构建体的的SDS-PAGE分析结果与质谱分析结果，此分子构建体是由一个对TfR1胞外域特异的scFv以及一个带有五个芬戈莫德分子的载药束所组成。
第29A图是表现S1P1受体的人类B细胞的染色分析结果；以及第29B 图是芬戈莫德透过连接臂与多肽核复合后的转移盘移行分析(transwell migration assay)结果。
第30A图是纯化重组双链(scFvαRSV)-hIgG1.Fc-(scFvαCD32)融合蛋白的SDS-PAGE分析结果；而第30B图与第30C图的ELISA分析结果分别说明了第 30A图的纯化重组融合蛋白对RSV蛋白F(第30B图)与CD32a胞外域(第30C图)的结合活性。
第31A图是纯化重组双链(scFvα内毒素)-hIgG1.Fc-(scFvαCD32)融合蛋白的SDS-PAGE分析结果；而第31B图与第31C图的ELISA分析结果分别说明了第31A图的纯化重组融合蛋白对内毒素(第31B图)与CD32a胞外域(第31C图)的结合活性。
第32A图与第32B图分别是纯化重组双链(干扰素 -β-1a)-hIgG4.Fc-(scFvαTfR1)融合蛋白的SDS-PAGE分析结果与ELISA分析结果。
第33A图与第33B图分别是纯化重组双链(scFvα整合素α4)-hIgG4.Fc-(scFvαTfR1)融合蛋白的SDS-PAGE分析结果与染色结果。
第34图的ELISA分析结果说明了纯化重组双链(scFvα内毒素)-hIgG1.Fc-(scFvαCD32a)融合蛋白于抑制TNF-α分泌的效果。
根据惯常的作业方式，图中各种特征与组件并未依比例绘制，其绘制方式是为了以最佳的方式呈现与本发明相关的具体特征与组件。此外，在不同图式间，尽可能以相同或相似的组件符号来指称相似的组件/部件。
【具体实施方式】
为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施态样与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
为了便于说明，此处整理了说明书、实施例与附随申请专利范围中所用的某些词汇。除非本说明书另有定义，此处所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。
在不和上下文冲突的情形下，本说明书所用的单数名词涵盖该名词的复数型；而所用的复数名词时亦涵盖该名词的单数型。此外，在本说明书与申请专利范围中，“至少一”与“一或更多”等表述方式的意义相同，两者都代表包含了一、二、三或更多。更有甚者，在本说明书与申请专利范围中，“A、B及C 其中至少一者”、“A、B或C其中至少一者”以及“A、B和/或C其中至少一者”系指涵盖了仅有A、仅有B、仅有C、A与B两者、B与C两者、与C两者、以及A、B与C三者。
虽然用以界定本发明较广范围的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。然而，任何数值本质上不可避免地含有因个别测试方法所致的标准偏差。在此处，“约”通常系指实际数值在一特定数值或范围的正负10％、5％、1％或0.5％之内。或者是，“约”一词代表实际数值落在平均值的可接受标准误差之内，视本发明所属技术领域中具有通常知识者的考虑而定。当可理解，除了实验例之外，或除非另有明确的说明，此处所用的所有范围、数量、数值与百分比(例如用以描述材料用量、时间长短、温度、操作条件、数量比例及其他相似者)均经过“约”的修饰。因此，除非另有相反的说明，本说明书与附随申请专利范围所揭示的数值参数皆为约略的数值，且可视需求而更动。至少应将这些数值参数理解为所指出的有效位数与套用一般进位法所得到的数值。在此处，将数值范围表示成由一端点至另一端点或介于二端点之间；除非另有说明，此处所述的数值范围皆包含端点。
本揭示内容一般系关于多种分子构建体，其中每一分子构建体包含一靶向组件(T)与一效应组件(E)，在本说明书中有时将这些分子构建体称为“T-E分子”、“T-E药物”或“T-E药品”。
在此处，“靶向组件(targeting element)”一词系指分子构建体能够直接或间接结合到一目标标的(如，一细胞表面上的受体或一组织中的蛋白质)的部分，因而能够协助将本发明分子构建体递送到目标标的。在某些例子中，靶向组件可将所述分子构建体导引至邻近目标细胞处。在其他情形中，靶向组件可特异地结合到目标细胞表面上的分子；或靶向组件可和第二分子特异地结合，而此一第二分子能够特异地结合到目标细胞表面上的分子。在某些例子中，一旦靶向组件与目标标的接合之后，靶向组件可将本发明分子构建体内化，而使其移动到目标细胞的细胞质内。靶向组件可以是细胞表面受体的抗体或配体；或者是可和上述抗体或配体结合的分子，因而能够间接地将本发明分子构建体标的到目标部位(譬如所选定的细胞表面)。相较于没有标的功能的治疗药物，利用本发明分子构建体能够加强或有利于效应组件(治疗药剂)在疾病部位的局部化(localization)。上述局部化是一种程度或相对的比例，而不是让效应组件在疾病部位绝对或完全的局部化。
根据本发明，“效应组件(effector element)”一词系指一旦分子构建体到达目标部位后，所述分子构建体中能够发挥生物活性(譬如，诱发免疫反应、发挥细胞毒性及与其相似者)或其他功能活性(譬如招募其他经半抗原标记的治疗用分子)的部分。“效应”可指治疗性或诊断性的效果。效应组件包含能够和细胞和/或细胞外免疫调节因子结合的组件。上述效应组件包含如蛋白质、核酸、脂质、碳水化合物、醣蛋白、药物部分(包含小分子药与生物制剂)、化合物元素及同位素等物质，也包含上述物质的片段。
虽然在此处利用“第一”、“第二、“第三”等词汇来描述多种组件、部件、区域和/或区段，这些组件(以及部件、区域和/或区段)不受上述修饰词的限制。此外，除非上下文有明示的说明，使用这些序数并未隐含序列或顺序。反之，这些词汇仅是用来区分各组件。因此，亦可将下文所述的第一组件命名为第二组件，而不会悖离例示性实施方式所揭示的内容。
在此处，“连接(link)”、“耦接(couple)”以及“复合(conjugate)”等词可互换使用，且都是用来指称透过直接或间接的连接关系，将两个组件连接在一起。
“多肽(polypeptide)”一词在此系指具有至少两个氨基酸残基的聚合物。一般来说，多肽包含2到200个氨基酸残基；在较佳的情形中，是2到50个残基。在本说明书中所提及的氨基酸序列涵盖了此种序列的L-、D-或β-氨基酸等形式。多肽亦包括氨基酸聚合物，其中有一或多个氨基酸残基是与一天然氨基酸相应的人工化学类似物，当然也包括天然产生的氨基酸聚合物。此外，此一词汇亦涵盖以多肽链或其他方式连接的氨基酸，上述其他方式如经修饰的连接(modified linkage)，譬如以α-酯(α-ester)、β-酯(β-ester)、硫酰胺(thioamide)、磷酰胺 (phosphoramide)、氨基甲酸酯(carbomate)、羟基酯(hydroxylate)键、以及与其相似者来取代多肽键。
于一些实施方式中，本发明范围亦涵盖了其他相较于所述序列具有保守性置换的蛋白。于多种实施方式中，有一、二、三、四或五个不同的残基经过置换。在此处，“保守性置换(conservative substitution)”一词是指所述氨基酸置换不会明显地改变分子活性(譬如生物或功能活性和/或特异性)。一般来说，保守性氨基酸置换是利用另一种具有相似化学性质(如电荷或疏水性)的氨基酸来取代某一氨基酸。某些保守性置换包括“类似物置换”，亦即以非标准(如罕见或合成等)氨基酸来取代标准氨基酸，而上述非标准氨基酸和被取代的原有氨基酸之间的差异极小。可由标准氨基酸经人工修饰而在不会大幅改变原有氨基酸结构的前提下，得到所述的氨基酸类似物，譬如异构物或代谢前驱物等皆属之。
于一些实施方式中，本案的范围亦涵盖和任何所述序列具有至少80％序列相似度的任何序列，上述序列相似度较佳为至少85％或90％、更佳为至少95％或98％。
此处针对多肽序列所述的“氨基酸序列相似度百分比(Percentage(％) aminoacid sequence identity)”系指候选序列的氨基酸残基与参考多肽序列的氨基酸残基完全相同的百分比；于进行上述比对时，可将所述的候选多肽片段与所述的特定多肽片段并排，并于必要时引入间隙，以使二序列形成最高的序列相似度；在计算相似度时，保守性置换的氨基酸残基视为不同的残基。相关领域已有多种方法可用以进行上述并排，譬如可公开取得的软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN 或Megalign(DNASTAR)等。本发明所属技术领域中具有通常知识者在进行并排时，可选择适当的参数与计算方式，以得到最佳的排列方式。在本说明书中，二多肽序列间的序列比较是采用美国国家生物科技信息中心(Nation Centerfor Biotechnology Information，NCBI)所提供的蛋白质-蛋白质BLAST分析数据库Blastp来进行。候选多肽序列A相较于参考多肽序列B的氨基酸序列相似度(在本说明书中亦称之为多肽序列A与多肽序列B具有特定百分比(％)的氨基酸序列相似度) 的计算方式如下：
Figure BDA0001474511850000221
其中X是利用BLAST序列并排程序对序列A、B进行排列后所得到的相同氨基酸残基数目(identical matches)，而Y是A、B二序列中较短者的氨基酸残基总数。
“聚乙二醇化氨基酸(PEGylated amino acid)”一词在此系指带有一个胺基(amino group)与一个羧基(carboxyl group)的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)链。一般来说，聚乙二醇化氨基酸的结构式为NH2-(CH2CH2O)n-COOH。在本揭示内容中，n值介于1到20之间；较佳是介于2至12。
在此处一多肽的“端”系指位于该多肽N-或C-端点的氨基酸残基。在描述一聚合物(譬如此处所述的聚乙二醇)的组成单元时时，“端”则是指在聚合物骨架末端的部分。在本说明书与申请专利范围中，“自由端”一词是用来指称并未与另一个分子形成化学键结的末端氨基酸残基或构成单元。
“抗原(antigen或Ag)”一词系指能够导致免疫反应的分子。此种免疫反应可能涉及分泌性(secretory)、荷尔蒙性(humoral)和/或细胞级(cellular)的抗原特异反应。在本揭示内容中，“抗原”一词系指蛋白质、多肽(包括其突变株或具有生物活性的片段)、多醣、醣蛋白、醣脂质、核酸或上述之组合。
在本说明书与申请专利范围中，“抗体(antibody)”一词应以广义方式解释，且包含完整组装的抗体、可和抗原结合的抗体片段，譬如抗原结合片段 (Fab/Fab’)、F(ab’)2片段(具有彼此以双硫键连接的两个Fab部分)、可变片段(variable fragment，Fv)、单链可变片段(scFv)、双特异性单链可变片段(bi-scFv)、奈米抗体 (nanobodies)、单抗体(unibodies)以及双体抗体(diabodies)。“抗体片段”包含完整抗体的一部分，较佳为包括完整抗体的抗原结合区域或可变区域。在典型的例子中，“抗体”系指实质上由免疫球蛋白基因或其片段所编码的一或多种多肽所组成的蛋白质。习知的免疫球蛋白基因包括κ(kappa)、λ(lambda)、α(alpha)、γ(gamma)、δ(gamma)、ε(epsilon)与μ(mu)等恒定区基因(constant region gene)、以及无数的免疫球蛋白可变区基因(variable region genes)。轻链通常归类为κ(kappa)或λ(lambda)。重链通常归类为γ(gamma)、μ(mu)、α(alpha)、δ(gamma)或ε(epsilon)，基于这些结构，定义出了以下类型的免疫球蛋白：IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE。典型的免疫球蛋白抗体结构是一种四聚物(tetramer)。每一个四聚物是由两条相同的多肽链所组成，且每一对分别有一“轻”链(约25kDa)与一“重”链(约50-70kDa)。每一链的N-端界定了一个可变区域，包含约100至110个或更多的氨基酸，其主要负责抗原辨识。可变轻链(variable light chain，VL)与可变重链(variable heavu chain， VH)等词就是分别指上述的轻链与重链。根据本揭示内容的实施方式，可藉由改变天然抗体或利用重组DNA方式重新合成上述抗体片段。于本揭示内容一些实施方式中，上述抗体和/或抗体片段可具有双特异性，且可有多种不同的构形。举例来说，双特异性抗体可包含二个不同的抗原结合部位(可变区域)。于多种实施方式中，可利用融合瘤技术或重组DNA技术来制备双特异性抗体。于一些实施方式中，双特异性抗体对至少两种不同的表位(epitope)有结合特异性。
“特异地结合(specifically bind)”一词在此处系指抗体或其抗原结合片段能够和抗原结合的能力，上述结合的解离常数(dissociation constant，Kd)小于约1×10-6M、1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M或1×10-12M；或者是或额外地，相较于其对于非特异性抗原的结合亲和力，上述抗体或其抗原结合片段与抗原结合的亲和力为两倍以上。
“治疗(treatment)”一词系指预防性(如，预防用药)、疗愈性或缓和性的处置，藉以达到所欲的药学和/或生理学效果；而治疗的行为在此包括上述预防性、疗愈性或缓和性的处置。具体来说，治疗在此系指对于可能患有一医疗疾患、症状、疾病或与疾患相关的异常、或易于罹患一疾患的个体施用或投予本发明分子构建体或包含此分子构建体的药学组合物，以期能部分地或完全地缓和、改善、减轻特定异常和/或病症的一或多种症状或特征，或是延缓其发生、阻碍其进展、减轻其严重性和/或减低发生率。亦可对尚未表出现疾病、异常和/或病症征兆的个体和/或出现早期征兆的个体进行治疗，以期降低发展出与该疾病、异常和 /或病症相关的病理变化的风险。
在此处，“有效量(effective amount)”一词系指本发明分子构建体的用量足以招致所欲的治疗反应。药剂的有效量不必然能够治愈疾病或病症，但能够延缓、阻碍或防止该疾病或病症的发生，或是可缓减与疾病或病症相关的病征。可将治疗有效量可分成一、二或更多剂，而以适当的剂型在指定期间内施用一次、二次或更多次。具体的治疗有效量取决于多种因素，例如欲治疗的特定状况、个体的生理条件(如，个体体重、年龄或性别)、接受治疗的个体类型、治疗持续时间、并行治疗(如果有的话)的本质以及所用的具体配方和化合物或其衍生物的结构。举例来说，可将治疗有效量表示成活性成分的总重量，譬如以克、毫克或微克来表示；或表示成活性成分重量相对于体重的比例，譬如表示为每公斤体重多少毫克(mg/kg)。
所述“施用(application)”与“投予(administration)”等词在此可交替使用，其系指将本发明之分子构建体或药学组合物提供给需要治疗的个体。
“个体(subject)”或“患者(patient)”等词在此可交互使用，且是指可接受本揭示内容之分子构建体、药学组合物和/或方法处置的动物(包含人类)。除非另有指明，“个体”或“患者”一般包含雄性与雌性。“个体”或“患者”包含任何可因本揭示内容的处置而获益的哺乳类动物。所述“个体”或“患者”的例示包含，但不限于：人类、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴子、猪、山羊、牛、马、狗、猫、鸟和禽类。在一实例中，所述患者为人类。所述哺乳类动物涵盖哺乳动物纲的所有成员，包括人类、灵长类动物、家畜和农畜(如兔子、猪、绵羊和牛)、动物园动物或竞赛用动物、宠物，以及啮齿类动物(如，小鼠和大鼠)。“非人类哺乳动物”一词则涵盖除了人类以外的所有哺乳动物纲成员。
本揭示内容至少部分是基于建构出了T–E药物，此种T-E药物可被递送至目标细胞、目标组织或器官，且其在这些部位的比例相对高于在血液循环、淋巴系统以及其他细胞、组织和器官中的比例。当实现上述情境时，即可提升T-E 药物的疗效，且其副作用与毒性的数目和严重性都会降低。相较于不含靶向组件的药物，以T-E分子的形式来投递药物时，发挥疗效的效应物所用的浓度可能较低。因此，可在较低的剂量下施用治疗用的效应物而不会减损其有效性，但却能同时降低其副作用与毒性。
可因较佳药物标的而获益的疾病
若是可将药物标的到疾病部位，亦即若是可使药物在疾病部位(相对于在正常组织或器官)局部化或有较优势的浓度，就能够改善用以治疗许多疾病的药物，使其具备较佳的疗效与安全性。某些抗体药物是以感染性微生物或其毒素产物为标的，若使这些抗体药物具备招募免疫细胞的能力，以吞噬或清除与抗体结合的粒子，就能够提升其疗效。下文提出一些主要的例示性疾病，若是能使得这些疾病所用药物在疾病部位或细胞有较佳的分布比例或能够招募可吞噬细胞的免疫细胞，就可以改善这些药物。
I中枢神经系统疾病
于治疗中枢神经系统(CNS)疾病时，通常需要让治疗药剂通过血脑障碍(blood-brain barrier，BBB)以进入中枢神经系统。某些治疗药剂不会进入中枢神经系统；此类药物藉由调节周边的某些活性(如免疫活性)，再藉由这些活性进一步调控中枢神经系统中的病况。BBB是由衬接CNS中微血管的内皮细胞所形成。和周边组织与器官中的微血管不同，BBB中的微血管内皮细胞是由紧连蛋白 (occludin)、密连蛋白(claudin)与间隙连接(junctional adhesion)分子形成的紧密连接 (tight junction)将其连接在一起。
β-类淀粉蛋白是引发阿滋海默症的主因之一，目前临床应用中已开发出至少六种对β-类淀粉蛋白特异的抗体，分别是：阿度卡尼单抗(aducanumab)、巴匹珠单抗(bapineuzumab)、克雷内治单抗(crenezumab)、盖坦德单抗(gantenerumab)、拍珠单抗(ponezumab)与苏兰珠单抗(solanezumab)。这些抗体对于改善阿滋海默症的疗效通常未臻理想。据信这是因为若要让这些抗体发会疗效，必须要有非常大量的抗体通过BBB进入CNS中的受损部位才行。然而，只有非常少量的抗体能够通过BBB。
已知可运用干扰素-β-1a(IFN-β-1a)与干扰素-β-1b(IFN-β-1b)来治疗多发性硬化症(MS)。IFN-β-1a是由哺乳类细胞所生产，而IFN-β-1b则是由大肠杆菌所生产；这些药品是由166个氨基酸残基所组成的单链蛋白，其带有一个双硫键。据称上述治疗药剂可使受治疗患者的MS复发率降低至18-38％。IFN-β-1a与 IFN-β-1b的作用机制非常复杂且并未完全为研究人员所了解，其过程涉及了抗发炎免疫细胞与因子的正向调控以及促发炎T细胞与因子的负向调控。对MS患者施予IFN-β治疗也会降低通过BBB的促发炎T细胞数量。但目前仍不明了IFN-β-1a与 IFN-β-1b是否至少部分藉由进到CNS中的受损部位而发挥其药效。
当将抗体或蛋白药物施用至身体的周边系统中时，仅有一小部分(约 0.1％)会到达CNS，因为只有很小一部分的蛋白药物能够穿透BBB。然，已知在许多CNS疾病(包括阿滋海默症与多发性硬化症)中，在患病部位的发炎反应会使得 BBB防线崩解，进而提升该部位的通透性。因此，本发明认为若可将较为大量的抗β-类淀粉蛋白或IFN-β-1a与IFN-β-1b抗体导引至BBB，治疗药剂就有较高的机会通过BBB进而提升疗效。
更有甚者，已开发出一些治疗药剂能用以抑制发炎性免疫细胞通过 BBB。最著名的例子之一就是对细胞黏着分子整合素α4特异的那他珠单抗 (natalizumab)。所述抗体能够抑制发炎性免疫细胞附着到衬接内皮层的BBB并穿透 BBB，进而发挥其功能。虽然已证实那他珠单抗有一定的疗效，但此种药物有严重的免疫抑制副作用。具体来说，那他珠单抗会导致进行性多处脑白质病 (progressive multifocal leukoencephalopathy)，这是由JC病毒(John Cunningham virus) 引发的伺机性感染。因此，本发明认为若能将大量的抗整合素α4抗体招募至BBB，就可以在较低给药剂量下达到较佳的疗效，因而可降低副作用。
形成BBB的微血管中的内皮细胞能够表现运铁蛋白受体与胰岛素受体，这些受体可分别调控运铁蛋白与胰岛素分子的胞吞转送作用(transcytosis)而使其到达大脑薄壁(cerebral parenchyma)。当使用运铁蛋白受体作为运输通道时，仅有一小部分可穿透而剩余的绝大多数都会被困住或降解。因为在脉管系统其他部分中衬接微血管的内皮细胞不会表现运铁蛋白受体，BBB中内皮细胞上的运铁蛋白受体可作为部位特异的抗原，而能够用以招募所投予的治疗药剂。一旦治疗药剂集中在BBB中，就会有较高比例的治疗药剂能够穿透微血管。
本发明亦体认到，一旦建立了将药物导向至BBB的机制，就可以进一步探讨利用各种抗发炎药物来治疗多种CNS疾病的疗效；上述药物譬如抗TNF-α、抗-IL12/IL-23、抗-IL17以及抗CD3。
对于对整合素α4特异的抗体药物，可利用运铁蛋白受体作为目标部位招募者。于治疗阿滋海默症时，效应部分可以是数个对β-类淀粉蛋白特异的scFv；于治疗多发性硬化症时，效应部分可以是数个IFN-β-1a或IFN-β-1b或数个对整合素α4特异的scFv。
本揭示内容的多种实施方式揭示了数种T-E分子，这些分子可以是单一个多臂接合物构形或是联合接合物(joint-linker)构形，其各自带有对运铁蛋白受体特异的scFv(作为靶向组件)以及IFN-β-1a或IFN-β-1b或对整合素α-4特异的scFv (作为效应组件)。替代性的实施方式揭露了多种T-E分子，这些分子可以是单一个多臂接合物构形或是联合接合物构形，其各自带有对运铁蛋白受体特异的scFv(作为靶向组件)以及对β-类淀粉蛋白特异的scFv(作为效应组件)。
芬戈莫德是一种免疫抑制药物，这是一种分离自某些真菌的天然产物—多球壳菌素(myriocin)的衍生物。芬戈莫德已取得许可能用以减少复发-缓解型多发性硬化症的复发。在活体内，芬戈莫德会被磷酸化以形成芬戈莫德磷酸盐，其结构与天然存在的神经鞘胺醇-1-磷酸盐(sphingosine-1-phosphate，S1P)相似；芬戈莫德磷酸盐是一种细胞外脂质介质，且可和5种S1P受体中的4种结合。S1P受体表现于淋巴细胞上，且参与了淋巴细胞迁移。芬戈莫德常见的药理机制之一是抑制淋巴细胞离开淋巴样组织而进入循环(并因此进入CNS)。芬戈莫德可以穿过BBB而进入CNS，且CNS中许多类型的细胞会表现S1P受体，这些受体与细胞扩增、型态与迁移等作用相关。据信芬戈莫德可直接作用于CNS上。施用芬戈莫德所导致的常见副作用包括头痛、疲劳；也会造成严重的副作用如皮肤癌、黄斑部水肿与致命的感染(如出血性局部脑炎)。
一个芬戈莫德分子带有一个NH2基，可透过此官能基和带有NHS基的双功接合臂耦接。根据本揭示内容的一较佳实施方式，可制备一T-E构建体，其带有一靶向组件可将构建体递送至BBB，并带有一芬戈莫德的载药束以作为效应组件。对于芬戈莫德载药束，一接合单元中可加入5至10个芬戈莫德分子；譬如可利用可裂解接合臂(cleavable linker)或不可裂解合臂(non-cleavable linker)将芬戈莫德分子耦接至接合单元的连接臂。由于患者摄入芬戈莫德之后，会将其转换成活性形式的芬戈莫德磷酸盐(类似S1P)，因此也可利用芬戈莫德磷酸盐来制备载药束。可将带有芬戈莫德或芬戈莫德磷酸盐载药束的接合单元耦接上一或两个对运铁蛋白受体I特异的scFv。在施用所述分子构建体之后，一部分的分子构建体会被带到 BBB。从可裂解接合臂上释出的芬戈莫德分子可通过BBB并进入CNS。或者是，有部分完整的构建体可进入CNS。可运用多种裂解机制来设计可裂解接合臂。一种常见的方式是加入S-S键，在标的组织部位可藉由还原反应使S-S双硫键裂解。在接合物设计的领域中，另一种常用的可裂解键是使用氨基酸之间对于蛋白酶(如基质金属蛋白酶)敏感的多肽键。
某些例示性的T-E分子可以是单一个多臂接合物构形或是联合接合物构形，其各自带有一或两个对运铁蛋白受体特异的scFv(作为靶向组件)以芬戈莫德(作为效应组件)。在所有此类分子构建体中，连接臂和效应组件之间的连接可以是不可裂解或可裂解键结。在施用本发明提出的分子构建体以治疗各种CNS 疾病时，靶向部分可具有一或两个对运铁蛋白受体或胰岛素受体特异的scFv。可使用一或两个对运铁蛋白受体或胰岛素受体特异的scFv。若所用的scFv有相对较高的亲和力(Kd<1x10-9)，可使用一个scFv；若所用的scFv的亲和力一般(1x10-9< Kd<5x10-8)，可使用两个scFv。在较佳的情形中，不会使用超过两个的对运铁蛋白受体或胰岛素受体特异的scFv，以避免结合后药物的受体交联以及胞吞作用。
II感染性疾病
虽然已针对各种会对人类或动物造成严重感染的病毒、细菌与真菌制备出大量的单克隆抗体，却只有为数不多的单克隆抗体经许可能够作为预防性或治疗性药物来对抗感染。此一不足可归因于几个主要因素，其中最主要的一个是这些感染性微生物及其产物有多种不同的血清型，且对于特定抗体会有不同的反应程度。另一个原因是所标的之微生物会发生突变，因而躲过特定抗体所引发的反应。
本发明提出的T-E分子设计亦可用于预防与治疗感染性疾病。复数个连接臂可提升其对标的感染性微生物或其产物的结合亲和力与特异性，并可诱发免疫功能以利廓清微生物及其产物。本发明认为提升结合亲和力以及招致免疫廓清功能能够在某种程度上克服血清型差异与突变的问题。此种改良能够提升候选抗体预防与治疗感染性疾病的效果。可根据本发明来重新设计许多在临床试验中无法达到预期效果的抗体，并再次测试其效果。
本发明一组较佳的实施方式使用了联合接合物构形，其带有一个用于标的之接合单元、以及一个用于招募效应功能的接合单元。另一组较佳的实施方式使用了单一接合单元，其具有复数个连接臂以供连接靶向组件、以及一个耦合臂以供连接效应组件。所述靶向组件可以是以下两大类中的任一种：(1)对微生物表面成分或微生物的产物特异的scFv或sdAb，譬如人类免疫缺陷病毒第I型(HIV-1) 的膜蛋白gp120、呼吸道融合病毒(RSV)F蛋白、困难梭状芽孢杆菌或金黄葡萄球菌的表面抗原、或是革兰氏阴性菌的内毒素或大肠杆菌的类志贺毒素；或(2)病毒的细胞表面受体的细胞外部分，譬如HIV-1的gp120-结合CD4域。
效应组件可以是一或两个对IgG的Fc受体特异的scFv或sdAb；上述受体譬如：FcγRIIA(CD32)、FcγRIIIB(CD16b)或FcγRI(CD64)。这些受体表现于嗜中性白血球、巨噬菌体与嗜伊红白血球上，且是调控与抗体结合之微生物的吞噬作用的主要分子。FcγRIIA与FcγRIIIB可和IgG结合，但亲和力较低(Kd约为10-6至 10-7)；而FcγRI可和IgG1与IgG3结合，且亲和力较高(Kd约10-9)。在较佳的情形中，可使用对FcγRIIA或FcγRIIIB特异的scFv或sdAb，因为这些分子在和IgG竞争与受体结合时较有优势。
对细菌表面上的碳水化合物抗原特异的抗体通常亲和力不佳，且主要表现于IgM上而非IgG上。IgM分子有10个Fv(抗原结合部位)。然而，一个IgM分子的分子量约为1,000kDa，其无法穿过微血管而到达血管外空间。当使用本发明提出的构形时，带有六个scFv或10个sdAb的分子构建体的分子量约为150kDa。
于使用抗体药物来消灭病毒时，关键之一在于药物不能引发透过FcR 介导进而促进病毒感染。在这类情形中，结合后的病毒粒子不会被吞噬与消化。有些病毒(譬如登革热病毒)在吞噬细胞内会扩增。因此，若病毒粒子能够接近细胞并进入结合后的细胞而不会被消灭，病毒就可在受感染细胞内扩增。因此，根据本发明一组较佳的实施方式，所述分子构建体带有二或更多个对Fcγ受体特异的 scFv，其可和吞噬细胞表面上多个Fcγ受体分子结合，而使得结合后的病毒分子必定会进入吞噬作用路径中。
已有多种对病毒、细菌或其产物特异的抗体进入临床试验，但只有一种对RSV特异的抗体取得上市许可。即使是上述对于RSV特异的抗体，经许可的用途也仅限于预防而无法用以治疗正在发生中的感染。本领域亟需设计出能够用以治疗已受感染的个体的抗-RSV抗体。其他抗体仍在临床开发阶段，或无法通过临床试验。利用本发明提出的分子构建体平台，可以使用这些抗体并改良其药效。所述抗体至少包括以下抗体：
(1)对呼吸道融合病毒F蛋白特异的帕利珠单抗(palivizumab)与非维珠单抗(felvizumab)；
(2)对人类免疫缺陷病毒第I型gp120特异的苏韦珠单抗(suvizumab)；
(3)对B型肝炎病毒B型肝炎表面抗原(HBsAg)特异的利韦单抗(libivirumab)、艾韦单抗(exbivirumab)与妥韦单抗(tuvirumab)；
(4)对A型流感病毒血球凝集素A特异的CR6261单抗与非力弗单抗(firivumab)；
(5)对巨细胞病毒醣蛋白特异的瑞加韦单抗(regavirumab)与司韦单抗(sevirumab)；
(6)对狂犬病病毒醣蛋白特异的雷韦单抗(rafivirumab)；
(7)对困难梭状芽孢杆菌表面抗原特异的阿克托克单抗(actoxumab)与贝挫妥单抗(bezlotoxumab)；
(8)对炭疽杆菌炭疽特异的欧必妥昔单抗(obiltoxaximab)与雷昔库单抗(raxibacumab)；
(9)对绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)血清型IATS O11特异的帕诺库单抗(panobacumab；是一种人类IgM单克隆抗体)；
(10)对金黄葡萄球菌凝集因子A(clumping factor A)特异的替非珠单抗(tefibazumab)与托沙妥单抗(tosatoxumab)；
(11)对格兰氏阴性菌内毒素特异的埃巴单抗(edobacomab；用以治疗败血症)；
(12)对金黄葡萄球菌壁脂酸特异的帕昔单抗(pagibaximab；用以治疗葡萄球菌败血症)；
(13)对炭疽毒素特异的雷昔库单抗(raxibacumab；人类单克隆抗体)；
(14)对大肠杆菌第I型或第II型类志贺毒素特异的普托昔单抗(pritoxaximab)、司托昔单抗(setoxaximab)与乌珠单抗(urtoxazumab)。
根据本揭示内容数个实施方式，用以治疗感染性疾病的T-E分子可采用联合接合物构形，其包含对呼吸道融合病毒(RSV)的F蛋白或对人类免疫缺陷病毒第I型(HIV-1)之gp120特异的scFv以作为标的/捕获组件，以及对FcγRIIA(CD32) 或FcγRIIIB(CD16b)特异的scFv以作为效应/廓清组件。根据本揭示内容的实施方式，某些T-E分子可采用单一接合单元或联合接合物构形，其包含对革兰氏阴性菌内毒素或金黄葡萄球菌壁脂酸特异的scFv以作为标的/捕获组件，以及对CD32或 CD16b特异的scFv以作为效应/廓清组件。在革兰氏阴性菌感染的过程中，对于可能造成生命威胁的败血症状，加速移除内毒素应可降低在细胞介素(如TNF-α、IL-1 等)的大量释出(即，细胞介素风暴)。在施用本发明所述的分子构建体平台来治疗感染性疾病时，效应部分可带有一或两个对CD32或CD16b特异的scFv。可使用一或两个对CD32(CD32a或CD32b)或CD16b特异的scFv。若所用的scFv有相对较高的亲和力(Kd<1x10-9)，可使用一个scFv；若所用的scFv的亲和力一般(1x10-9<Kd <5x10-8)，可使用两个scFv。在较佳的情形中，不会使用超过两个的对CD32或 CD16b特异的scFv，以避免结合后药物的受体交联以及胞吞作用。
第一节用以治疗特定疾病的多臂接合物
(i)用于多臂接合物的多肽核
本揭示内容的第一态样是关于一种接合单元，其包含：(1)一中心核，其包含2-15个赖氨酸(K)残基；以及(2)2-15个连接臂，分别连接于中心核的各K残基。本发明中心核的特征在于其N-或C-端带有叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基。
在制备本发明接合单元时，将一端带有N-羟基琥珀酰亚胺 (N-hydroxysuccinimydil，NHS)基且另一端带有一官能基(如，NHS基、顺丁烯二酰亚胺基、叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基)的PEG链连接到K残基上；具体来说，利用上述NHS基和K残基上的氨基形成酰胺键，进而将PEG链连接到中心核上。在本揭示内容中，将连接到K残基之后的PEG链称为连接臂，此连接臂的自由端带有官能基。
根据本揭示内容的实施方式，上述中心核是多肽核，其长度为8-120 个氨基酸残基，且包含2至15个赖氨酸(K)残基，其中每一个K残基和下一个K 残基之间以一填充序列隔开。
根据本揭示内容的实施方式，填充序列包含甘氨酸(glycine，G)与与丝氨酸(serine，S)残基；在较佳的情形中，填充序列是由选自G、S及其组合的2-15 个残基所组成。举例来说，填充序列可以是：
GS、
GGS、
GSG、
GGGS(序列编号：1),
GSGS(序列编号：2)、
GGSG(序列编号：3)、
GSGGS(序列编号：4)、
SGGSG(序列编号：5)、
GGGGS(序列编号：6)、
GGSGGS(序列编号：7)、
GGSGGSG(序列编号：8)、
SGSGGSGS(序列编号：9)、
GSGGSGSGS(序列编号：10)、
SGGSGGSGSG(序列编号：11)、
GGSGGSGGSGS(序列编号：12)、
SGGSGGSGSGGS(序列编号：13)、
GGGGSGGSGGGGS(序列编号：14)、
GGGSGSGSGSGGGS(序列编号：15)或
SGSGGGGGSGGSGSG(序列编号：16)。
两个赖氨酸残基之间的填充序列可以由各种长度和组合的甘氨酸与丝氨酸残基所组成。在赖氨酸残基数目较少的多肽核中，可使用较长的填充序列；在赖氨酸残基数目较多的多肽核中，则可使用较短的填充序列。除了甘氨酸与丝氨酸之外，可在填充序列中加入亲水性氨基酸残基，如天冬胺酸与组胺酸。除了由甘氨酸与丝氨酸残基组成的填充序列之外，也可使用其他填充序列，譬如可使用常见人类血清蛋白(如白蛋白与免疫球蛋白)中的可挠性、可溶性环。
根据本揭示内容某些较佳的实施方式，中心核包含2-15个单元的 G1-5SK序列。或者是，此多肽核的序列为(GSK)2-15；即，多肽包含至少两个连续的GSK单元。举例来说，本发明中心核可包含下列氨基酸序列：
Ac-CGGSGGSGGSKGSGSK(序列编号：17)、
Ac-CGGSGGSGGSKGSGSKGSK(序列编号：18)或
Ac-CGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSK(序列编号：19)，
其中Ac代表乙酰基。
根据本揭示内容某些实施方式，中心核是序列为(Xaa-K)n的多肽核，其中Xaa是聚乙二醇化氨基酸，其具有2至12个乙二醇(EG)重复单元，且n是2至15 的整数。
如上文所述，本发明中心核的特征在于其N-或C-端带有叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基。根据本揭示内容某些实施方式，本发明中心核的N-或 C-端氨基酸残基带有叠氮基或炔基。带有叠氮基的氨基酸残基可以是：L-叠氮高丙氨酸(AHA)、4-叠氮-L-苯丙氨酸、4-叠氮-D-苯丙氨酸、3-叠氮-L-丙氨酸、3-叠氮-D-丙氨酸、4-叠氮-L-高丙氨酸、4-叠氮-D-高丙氨酸、5-叠氮-L-鸟氨酸、5-叠氮-D-鸟氨酸、6-叠氮-L-赖氨酸或6-叠氮-D-赖氨酸。举例来说，本发明中心核可具有以下序列：
Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-AAH、
Ac-AAH-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7、
Ac-AAH-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C、
Ac-C-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-AAH、
Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-AAH、
Ac-AAH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4、
Ac-AAH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C或
Ac-C-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-AAH，
其中Xaa是带有所述数目的EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸，Ac代表乙酰基，而AAH代表AHA残基。
带有炔基的氨基酸的例子包括，但不限于：L-高炔丙基甘氨酸 (L-HPG)、D-高炔丙基甘氨酸(D-HPG)、或β-高炔丙基甘氨酸(β-HPG)。在本例中，本发明中心核可具有以下序列：
Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-GHP、
Ac-GHP-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7、
Ac-GHP-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C、
Ac-C-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-GHP、
Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-GHP、
Ac-GHP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4、
Ac-GHP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C或
Ac-C-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-GHP，
其中Xaa是带有所述数目的EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸，Ac代表乙酰基，而GHP代表HPG残基。
当可理解，目前已可透过商业管道取得多种侧链带有叠氮基或炔基的氨基酸与聚乙二醇化氨基酸，这些氨基酸可以带有保护基团，如叔-丁氧羰基 (tert-butyloxycarbonyl，t-boc)或茀甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，Fmoc)，故可轻易用于固态多肽合成。
根据本揭示内容某些实验例，所用的中心核可包含以下序列：
Ac-GHPGGSGGSGGSKGSGSK(序列编号：21)、
Ac-GHPGGSGGSGGSKGSGSKGSK(序列编号：22)、
Ac-AAHGGSGGSGGSKGSGSKGSK(序列编号：23)、
Ac-GHPGGSGGSGGSKGSGSKGSGSC(序列编号：24)、
Ac-C-Xaa2-K-Xaa2-K-Xaa2-K(序列编号：25)或
Ac-C-Xaa6-K-Xaa6-K-Xaa6-K-Xaa6-K-Xaa6-K(序列编号：26)、
其中Xaa为带有指定数目的EG重复单元的聚乙二醇化氨基酸、Ac代表乙酰基、AAH代表AHA残基且GHP代表HPG残基。
或者是，本发明中心核可和耦合臂连接，此耦合臂的自由端(即，未和中心核连接的一端)带有一官能基(如，叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基)。在这些情形中，本发明中心核的N-或C-端为半胱氨酸残基。在制备与耦合臂连接的接合单元时，将一端带有顺丁烯二酰亚胺基且另一端带有上述官能基的PEG链与上述半胱氨酸残基连接；具体来说，可透过PEG链的顺丁烯二酰亚胺基和半胱氨酸残基的硫氢基之间的硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应将两者连接在一起。在本揭示内容中，连接到中心核末端半胱氨酸残基上的PEG链称为耦合臂，且其自由端带有上述官能基。
在较佳的情形中，耦合臂的自由端带有四嗪基或高应力炔基(如，环辛烯基或环辛炔基)。这些耦合臂具有2-12个EG单元。根据本揭示内容的实施方式，上述四嗪基为1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪1,2,4,5-四嗪或其衍生物。高应力炔基可以是环辛烯基或环辛炔基。根据本揭示内容的实验例，所述环辛烯基可以是反式- 环辛烯(TCO)基；而环辛炔基的实施例包括，但不限于：二苯并环辛炔(DBCO)、二氟化环辛炔(DIFO)、二环壬炔(BCN)与二苯并环辛炔(DICO)。根据本揭示内容某些实施方式，四嗪基为6-甲基-四嗪。
根据多种实施例，用以与耦合臂连接的中心核包括，但不限于：
Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-四嗪、
Ac-(GSK)2-7-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-高应力炔基、
Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-C-Xaa2-12-四嗪、
Ac-K-(Xaa2-12-K)2-4-Xaa2-12-C-Xaa2-12-高应力炔基、
四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7、
高应力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)1-8-(GSK)2-7、
四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4以及
高应力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)2-4。
或者是，中心核的一端带有叠氮基或炔基，而另一端则接上了带有四嗪基或高应力炔基的耦合臂，兹举例如下：
Ac-AAH-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-四嗪、
Ac-AAH-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-高应力炔基、
四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-AAH、
高应力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-AAH、
Ac-AAH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-四嗪、
Ac-AAH-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-高应力炔基、
四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-AAH、
高应力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-AAH、
Ac-GHP-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-四嗪、
Ac-GHP-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-C-Xaa2-12-高应力炔基、
四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-GHP、
高应力炔基-Xaa2-12-C(AC)-(SG2-4)0-7-(GSK)2-6-(G2-4S)1-8-GHP、
Ac-GHP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-四嗪、
Ac-GHP-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-C-Xaa2-12-高应力炔基、
四嗪基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-GHP以及
高应力炔基-Xaa2-12-C(Ac)-Xaa2-12-K-(Xaa2-12-K)1-3-Xaa2-12-GHP。
也可利用重组技术来合成上述多肽，再利用细菌或哺乳类宿主细胞来表现指定的基因区段。如果多肽核的赖氨酸残基数目较多且长度较长，利用重组蛋白技术较佳。这是因为当多肽长度变长时，使用固态合成法发生错误的机率会增加，且其纯度和/或产量会降低。要运用细菌或哺乳类宿主细胞来产生多肽核时，可在两个K残基之间插入长度为2至20个氨基酸残基的填充序列。此外，由于 AHA和HPG并非可由遗传密码子编码的天然氨基酸，这些重组多肽的N-端或C- 端残基可以是半胱氨酸。在表现出重组蛋白并将其纯化之后，可使末端的半胱氨酸残基和短的双功交联物反应；上述双功交联物的一端带有可和半胱氨酸残基的 SH基反应的顺丁烯二酰亚胺基，另一端则带有炔基、叠氮基、四嗪基或高应力炔基。
相较于利用常规氨基酸(如甘氨酸与丝氨酸残基)来合成多肽核，使用聚乙二醇化氨基酸来合成多肽核的步骤较少。此外，可采用不同长度的聚乙二醇化氨基酸(即，带有不同EG重复单元者)，一方面可提供可挠性与水溶性，另一方面亦可在相邻的赖氨酸残基之间提供间隔。除了聚乙二醇化氨基酸之外，中心核也可包含人工氨基酸，如D-构形氨基酸、高氨基酸、N-甲基氨基酸等。在较佳的情形中，可使用带有不同长度聚乙二醇(PEG)的聚乙二醇化氨基酸来建构中心核，因为胺基分子中所含的PEG部分可提供构形上的可挠性，并在用以接合的基团间提供了适当的间隔，还可以提升其水溶性；另外，一般来说，PEG的免疫源性较低。合成带有聚乙二醇化氨基酸的中心核的方法和合成常规多肽相似。
视需要，本发明中心核可更带有一乙酰基，以保护位于N端的氨基酸残基，进而提升其稳定性。
当可理解，连接于中心核的连接臂的数目主要取决于连接于中心核中所含赖氨酸残基的数目。由于本发明中心核包含至少两个赖氨酸残基，所述接合单元可包含复数个连接臂。
参照第1A图。如图所示，接合单元10A包含中心核11a，其带有一个 HPG(GHP)残基以及四个赖氨酸(K)残基，其间分别以填充序列(以下各图式中以“···”表示)隔开。HPG残基和K残基之间或任两个K残基之间的填充序列可以是相同或不同的氨基酸序列。在本实施例中，四个连接臂20a-20d藉由NHS基和赖氨酸残基的氨基间所形成的酰胺键而连接到各个赖氨酸残基。当可理解，本说明书所述的多种接合单元间可能有一些共通的特征，因此针对上述接合单元10A或下述各接合单元所述的某些或全部特征可能也适用于下文提出的实施例，除非其明显有悖于特定实施方式的脉络。为求简洁，下文可能不会重复说明这些共通特征。
第1B图绘示了根据本揭示内容另一种实施方式的接合单元10B。中心核11b有一个半胱氨酸(C)残基以及六个赖氨酸(K)残基，这些残基之间分别以填充序列隔开。在本实施例中，接合单元10B包含连接到各个赖氨酸残基的六个连接臂20a-20f。根据本揭示内容的实施方式，连接臂是具有2至20个EG重复单元的PEG 链。
接合单元1B与第1A图的接合单元10A不同之处在于接合单元1B更包含耦合臂60。如上文所述，可利用一端带有顺丁烯二酰亚胺基而另一端带有一特殊官能基的PEG链来形成耦合臂60。如此一来，耦合臂60可透过硫氢–顺丁烯二酰亚胺反应而连接到中心核11b的半胱氨酸残基。在本实施例中，耦合臂60的自由端带有的特殊官能基是四嗪基72。根据本揭示内容的实施方式，耦合臂是具有2至12 个EG重复单元的PEG链。
当需要在目标部位释放效应组件时，可以在连接臂中加入一个可裂解键；上述裂解键可经酸/碱水解、还原/氧化或酵素作用而裂解。举例来说，可利用 NHS-PEG2-20-S-S-顺丁烯二酰亚胺作为此处所述的耦合臂，这是一种可裂解PEG链，其中的S-S双硫键会被缓慢的还原，而NHS基可用来和中心核的氨基接合，进而将 PEG链连接到中心核上。另外，可利用叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基来取代位在连接臂自由端的顺丁烯二酰亚胺基。根据本揭示内容某些实施方式，所述连接臂是带有2至20个EG重复单元的PEG链，且其自由端(即，未与中心核连接的该端)有一双硫键。接着参照第1C图，图中所示的五个连接臂21a-21f分别连接到中心核11b的K残基，这些连接臂是自由端带有双硫键的PEG链。
根据本发明实施方式，连接到中心核的K残基的连接臂在自由端带有一官能基(即，顺丁烯二酰亚胺基、NHS基、叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基)。在较佳的情形中，当连接臂的自由端是叠氮基、炔基或环辛炔基时，位于中心核 N-或C-端的氨基酸残基是半胱氨酸残基，且耦合臂的自由端是四嗪基或环辛烯基。或者是，当连接臂的自由端是四嗪基或环辛烯基时，位于中心核N-或C-端的氨基酸残基带有叠氮基或炔基；或者是位于中心核N-或C-端的氨基酸残基是半胱氨酸残基，且耦合臂的自由端带有叠氮基、炔基或环辛炔基。
随着位于连接臂自由端上官能基(即，顺丁烯二酰亚胺基、NHS基、叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基)的不同，可以设计带有相应官能基的功能性组件(譬如，靶向组件、效应组件或用以改善药动学性质的组件)，而使得所述功能性组件可透过任一种下列化学反应而连接到连接臂的自由端：
(1)形成酰胺键：在此情形中，连接臂的自由端有一NHS基，且功能性组件有一氨基；
(2)硫氢–顺丁烯二酰亚胺反应：在此情形中，连接臂的自由端有一顺丁烯二酰亚胺基，且功能性组件有一硫氢基；
(3)一价铜催化的叠氮化物-炔羟环加成(copper(I)-catalyzed azide-alkynecycloaddition；CuAAC，或简称为“炼接”反应)：连接臂的自由端和功能性组件其中之一带有叠氮基，而另一个则带有炔基；CuAAC反应如反应式1所示；
(4)逆电子需求狄尔斯-阿德(inverse electron demand Diels–Alder，iEDDA)：连接臂的自由端和功能性组件其中之一带有四嗪基，而另一个则带有环辛烯基； iEDDA反应如反应式2所示；或
(5)应力促进的叠氮化物-炔羟链接化学(strain-promoted azide-alkyne clickchemistry，SPAAC)：连接臂的自由端和功能性组件其中之一带有叠氮基，而另一个则带有环辛炔基；SPAAC反应如反应式3所示。
CuAAC反应会产生1,5-二取代1,2,3-三唑(1,5-disubstituted 1,2,3-triazole)。炔基和叠氮基之间的反应选择性极高，且天然生物分子不含炔基和叠氮基。再者，上述反应快速且对pH值不敏感。已知除了利用一价铜(如溴化铜 (I)或碘化铜(I))来催化链接反应之外，较佳可使用二价铜和还原剂(如抗坏血酸钠) 的混合物以在反应系统中原位(in situ)产生一价铜。或者是，可利用不含铜的反应，将第二组件连接到中心核的N-或C-端，此反应可利用环戊烷基环戊二烯基氯化钌复合物(pentamethylcyclopentadienylruthenium chloride complex)作为催化剂，以催化叠氮基-炔环加成反应。
<<反应式1CuAAC反应>>
Figure BDA0001474511850000391
<<反应式2iEDDA反应>>
Figure BDA0001474511850000401
<<反应式3SPAAC反应>>
Figure BDA0001474511850000402
为了方便说明，和连接臂相连的功能性组件称为第一组件。当可理解，本发明接合单元可携带的第一组件的数目取决于中心核的K残基的数目(且因此，取决于连接臂的数目)。因此，本发明所属技术领域具有通常知识者可调整所述接合单元中第一组件的数目，以达到所欲的标的或治疗效果。
如第1D图所示，例示性的接合单元10D包含第一组件。除了下文所述的特征之外，第1D所示结构与第1B图相似。首先，中心核11d有五个K残基，且因此有五个连接臂20a-20e分别与这些K残基相连。其次，接合单元10D有五个第一组件30a-30e，分别连接于每一连接臂20a-20e。如下文所述，视需要加入的四嗪基72使得所述接合单元可和额外的功能性组件或另一个分子构建体(参见下文第二节或第三节)耦接。
第1E图是一种替代性的实施例，所示的接合单元10E结构类似接合单元1D，不同之处在于每一连接臂21a-21e的组件连接端(即，与第一组件30a-30e相连的一端)带有一双硫键。
或者是，此处提出的接合单元更包含复数个衔接臂，其一端带有一官能基(即，顺丁烯二酰亚胺基、NHS基、叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基)，另一端则带有NHS或顺丁烯二酰亚胺基。衔接臂与连接臂间的连接方式和上文第一组件与连接臂间的连接方式类似，藉由选用对应的官能基，衔接臂和连接臂可藉由形成酰胺键或透过硫氢–顺丁烯二酰亚胺、CuAAC、iEDDA或SPAAC反应而彼此耦接。因此，连接于连接臂的衔接臂在自由端(或称组件连接端；也就是并未与连接臂相连的一端)带有NHS基或顺丁烯二酰亚胺基；之后，第一组件和衔接臂的组件连接端形成酰胺键或进行硫氢–顺丁烯二酰亚胺反应而与其连接。
接着参照第1F图，所示的连接臂利用和第1D图类似的方式连接到中心核11d的K残基。与接合单元10D相比，接合单元10F更包含衔接臂25，其透过 SPAAC反应而连接到连接臂22。接着，第一组件30和衔接臂25可藉由形成酰胺键或透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应而彼此连接。第1F图所示的菱形点90代表连接臂 22与衔接臂25之间因为SPAAC反应所形成的化学键结。
根据本揭示内容某些实施方式，衔接臂是带有2至20个EG重复单元的 PEG链。或者是，衔接臂是带有2至20个EG重复单元的PEG链，且其组件连接端(即，未与连接臂连接的自由端)有一双硫键。
在一实验例中，衔接臂带有三个EG重复单元，且衔接臂的自由端(亦称为组件连接端)有一双硫键。在本例中，当以还原剂处理时，可以有效地使连接至衔接臂组件连接端的第一组件由此处提出的接合单元释出。
根据本揭示内容某些较佳实施方式，第一组件可以是芬戈莫德、芬戈莫德磷酸盐、干扰素-β或对整合素-α4、β-类淀粉蛋白、病毒蛋白或细菌蛋白特异的单链可变片段(scFv)。
非限制性的病毒蛋白包括：呼吸道融合病毒(RSV)的F蛋白、人类免疫缺陷病毒第I型(HIV-1)的gp120蛋白、A型流感病毒的血球凝集素A(HA)蛋白与巨细胞病毒的醣蛋白。
细菌蛋白的实施例包括但不限于：革兰氏阴性菌的内毒素、困难梭状芽孢杆菌的表面抗原、金黄葡萄球菌的壁脂酸、炭疽杆菌的炭疽毒素或大肠杆菌的第I型或第II型类志贺毒素。
为了要进一步增加所需的效果(如，疗效)，本发明接合单元除了第一组件之外还可以包含第二组件。举例来说，第二组件可以是靶向组件或效应组件。在本揭示内容可任选的实施方式中，第一组件是效应组件，而第二组件可以是另一种效应组件，两者可以累加地或加乘地作用，亦可独立作用。在另一种例子中，第一与第二组件可发挥不同的性质；譬如，第一组件是靶向组件，而第二组件是效应组件，反之亦然。或者是，第一组件是效应组件，而第二组件则能够改善接合单元的药动学特性，如水溶性、廓清率、半衰期与生物可用率。在选择所述接合单元(或多臂接合物)所含的特定第一组件和/或第二组件时，需考虑所欲的应用。下文第一节第(iii)部分讨论了这些功能性组件的实施例。
在结构上，第二组件可连接到中心核N-或C-端的叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基。具体来说，当有需要时，可将第二组件和短PEG链(较佳为具有2至12个EG重复单元)复合，之后再将其连接到位在N-或C-端的带有叠氮基或炔基的氨基酸残基(譬如AHA残基或HPG残基)。或者是，当有需要时，可将第二组件和短PEG链复合，且之后再将其连接于中心核的耦合臂。
根据本揭示内容某些实施方式，中心核的N-或C-端是带有叠氮基(譬如AHA残基)的氨基酸残基；且因此，带有炔基的第二组件就可以透过CuAAC反应而连接到中心核的N-或C-端。根据本揭示内容其他实施方式，上述中心核的N- 或C-端是带有炔基(譬如HPG残基)的氨基酸残基；而带有叠氮基的第二组件就可以透过CuAAC反应而连接到中心核的N-或C-端。
第1G图绘示根据本发明实施例的另一种接合单元10G，其携带了复数个第一组件与一个第二组件。在本实施例中，中心核11c包含一个HPG(GHP)残基以及五个赖氨酸(K)残基。五个连接臂20a-20e分别连接到中心核11c的五个K残基；而五个第一组件30a-30e则透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应连接到各个连接臂 20a-20e。除了第一组件之外，所述接合单元10G更包含一个第二组件50，其系连接于短PEG链62的一端。在和中心核11c复合之前，短PEG链62的另一端带有叠氮基。如此一来，叠氮基可和带有炔基的HPG残基进行CuAAC反应，而使得第二组件50连接至中心核11c。第1G图所示的实心圆点40代表HPG残基和叠氮基间因为 CuAAC反应所形成的化学键结。
或者是，第二组件透过耦合臂而和中心核连接。根据本揭示内容某些实施方式，耦合臂带有四嗪基，因此可透过iEDDA反应而有效率地连接到带有TCO 的第二组件。根据本揭示内容其他实施方式，耦合臂带有TCO基，而第二组件可带有四嗪基，故两者可透过iEDDA反应而互相连接。相较于位在端点的炔基， iEDDA反应中所采用的应变环辛烯基的活化能明显较低，且因此iEDDA反应不需使用额外催化剂。
接着参照第1H图，其中接合单元10H的中心核11d包含位于N端的半胱氨酸(C)残基和五个赖氨酸(K)残基。如第1H图所示，这五个连接臂20a-20e分别连接到中心核11d的五个K残基，而五个第一组件30a-30e则透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应而分别连接到五个连接臂20a-20e。半胱氨酸残基连接于耦合臂60；在接上第二组件之前，耦合臂60的自由端带有四嗪基或TCO基。在本实施例中，第二组件50可和带有相应TCO或四嗪基的短PEG链62连接，再透过iEDDA反应而连接到耦合臂60。第1H图所示的椭圆点70代表耦合臂60和短PEG链62间进行iEDDA反应所产生的化学键结。
根据本揭示内容其他实施方式，在和第二组件接合之前，耦合臂带有叠氮基；当第二组件和自由端带有环辛炔基(譬如DBCO、DIFO、BCN或DICO基) 的短PEG链连接时，耦合臂和第二组件就可以透过SPAAC反应而连接，反之亦然。
接着参照第1I图，其中接合单元10I的结构和第1H图的接合单元10H 相近，不同之处在于耦合臂60带有叠氮基或环辛炔基(譬如DBCO、DIFO、BCN 或DICO基)而不是四嗪基或TCO基。因此，第二组件50要和带有相应环辛炔基(譬如DBCO、DIFO、BCN或DICO)或叠氮基的短PEG链62连接，而使得第二组件50 和耦合臂60可透过SPAAC反应而连接。第1I图所示的菱形点90代表耦合臂60与短 PEG链62之间因为SPAAC反应所形成的化学键结。
反应式4为制备本发明接合单元的例示性流程。在步骤1，先制备中心核，其氨基酸序列包含(GSK)3，且C端为L-叠氮高丙氨酸(AHA)残基。在步骤2，透过在NHS基与氨基间形成酰胺键，而将三个连接臂分别连接到中心核的赖氨酸 (K)残基，连接到中心核的连接臂在自由端带有顺丁烯二酰亚胺(Mal)基。在步骤3，透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应将三个抗A抗原scFv(scFvαA)连接到各连接臂上，此处的scFvαA即为第一组件。同时，在步骤4，将一个抗B抗原scFv(scFvαB)和自由端带有DBCO基的短PEG链连接，上述短PEG链有4个EG重复单元，此处的 scFvαB即为第二组件。最后，在步骤5，透过SPAAC反应将第二组件连接到中心核的AHA残基。
<<反应式4透过连接臂与C-端氨基酸残基连接两种不同scFv的接合单元的制备方法>>
Figure BDA0001474511850000451
反应式5绘示制备本发明接合单元的另一种例示性流程。在步骤1，先制备中心核，其氨基酸序列包含(K-Xaa)3且C-端有一半胱氨酸残基。在步骤2，将一端带有顺丁烯二酰亚胺(Mal)基另一端带有四嗪基的PEG链(作为耦合臂)透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应连接到半胱氨酸残基。之后，在步骤3，将三个连接臂分别连接到中心核的赖氨酸(K)残基。接着，如步骤4所示，透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应将三个抗A抗原scFv(scFvαA)连接到各连接臂上，此处的scFvαA即为第一组件。同时，在步骤5，将一个抗B抗原scFv(scFvαB)和自由端带有TCO基的短 PEG链连接，上述短PEG链有3个EG重复单元，此处的scFvαB即为第二组件。最后，在步骤6，透过iEDDA反应将第二组件连接到耦合臂。
<<反应式5透过连接臂与耦合臂连接两种不同scFv的接合单元的制备方法>>
Figure BDA0001474511850000461
聚乙二醇化(PEGylation)是将PEG链附接或连接到分子(如，药物或蛋白)的方法。聚乙二醇化可以改善多种重要的药理学特性，譬如提升水溶性、延长生命周期以及减少蛋白质分解降解。根据本揭示内容一实施方式，第二组件是PEG 链，其分子量约为20,000到50,000道耳顿。
第1J图绘示了另一种例示性的接合单元10J，其中五个第一组件30分别透过连接臂20连接到赖氨酸残基，且中心核11e的HPG(GHP)残基透过CuAAC反应与PEG链80连接。第1J图所示的实心圆点40代表HPG残基与PEG链80间因为 CuAAC反应所形成的化学键结。
第1K图是本揭示内容的另一种实施例，接合单元10K的中心核11d的 N-端是与耦合臂60相连接的半胱氨酸残基。可透过iEDDA反应而有效率地将PEG 链80连接到耦合臂60。接合单元10K的椭圆点70代表耦合臂60与PEG链80之间因为iEDDA反应所形成的化学键结。
第1L图是本发明接合单元的另一种实施例，所示的接合单元10L结构与第1J图的接合单元10J相似，不同之处在于PEG链80是透过SPAAC反应连接到耦合臂60。第1L图所绘示的菱形点90代表耦合臂60与PEG链80之间因为SPAAC反应所形成的化学键结。
根据本揭示内容某些实施方式，除了第一与第二组件之外，本发明接合单元更包含第三组件。在此种实施例中，中心核的N-或C-端是带有叠氮基或炔基的氨基酸残基，而另一端是半胱氨酸残基。中心核的赖氨酸残基分别和连接臂相连接，且每一条连接臂的自由端带有顺丁烯二酰亚胺基；而中心核的半胱氨酸残基则和自由端带有四嗪基或高应力炔基的耦合臂相连。如此一来，第一组件可透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应连接于连接臂，而第二组件则可透过iEDDA反应和耦合臂相连接。另外，第三组件则是透过CuAAC反应或SPAAC反应而连接到带有叠氮基或炔基的末端氨基酸残基。
接着参照第1M图的接合单元10M，其中心核11f的N-端为HPG(GHP) 残基，而C-端是半胱氨酸残基。连接臂20和耦合臂60分别连接到中心核11f的赖氨酸(K)残基以及半胱氨酸(C)残基。此外，五个第一组件30分别连接到五个连接臂 20，第二组件(即，PEG链)80和耦合臂60连接，而第三组件50则透过短PEG链62 连接到HPG残基。实心圆点40代表HPG残基和短PEG链62之间因为CuAAC反应所形成的化学键结；而椭圆点70代表耦合臂60与PEG链80之间因为iEDDA反应所形成的化学键结。
第1N图绘示了本揭示内容的另一种实施方式；接合单元10N的结构与第1M图所示的接合单元10M相似，不同之处在于短PEG链62是透过SPAAC反应而连接到HPG残基，而非透过iEDDA反应。第1N图的菱形点90代表短PEG链62和 HPG残基之间因为SPAAC反应所形成的化学键结。
在本揭示内容较佳的实施方式中，连接臂的自由端带有顺丁烯二酰亚胺基，以便和带有硫氢基的第一组件透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应而连接。此外，多肽核的一端可以是半胱氨酸残基或带有叠氮基或炔基的氨基酸残基，以供和耦合臂接合，进而连接第二组件。
本发明所属技术领域具有通常知识者当可想见，可对上述结构进行各种修改。举例来说，在连接臂的自由端可采用顺丁烯二酰亚胺基以外的官能基(譬如叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基)，以便透过CuAAC、iEDDA或SPAAC反应来连接第一组件。此外，半胱氨酸残基(或带有叠氮基或炔基的氨基酸残基)可以位在多肽核N-或C-端以外的位置。更有甚者，可在多肽核中加入二或更多个上述残基，以供接合多个耦合臂，并进一步连接多个第二组件。
(ii)用于多臂接合物的化合物核
除了本揭示内容第一节第(i)部分所述的述接合单元之外，此处亦揭示了另一种接合单元，其使用化合物(而非多肽)作为中心核。具体来说，所述化合物可以是苯-1,3,5-三胺、2-(胺甲基)-2-甲基丙烷-1,3-二胺、三(2-胺乙基)胺、苯 -1,2,4,5-四胺、3,3’,5,5’-四胺-1,1’-联苯、四(2-胺乙基)甲烷、四(乙胺)肼、N,N,N’,N’,- 四(胺乙基)乙二胺、苯-1,2,3,4,5,6-六胺、1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-六(甲胺)-苯 -1,3,5-三胺、1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N,5-N,-八(甲胺)-苯-1,2,4,5-三胺、苯 -1,2,3,4,5,6-六胺或N,N-二[(1-胺基-3,3-二胺乙基)戊基]甲烷二胺。上述化合物均带有至少三个相等或对称构形的氨基。因此，当一化合物的其中一个氨基与一耦合臂复合时，所有由该化合物形成的分子都具有相同的构形。
此处所述的化合物和本揭示内容第一节第(i)部分所述的接合单元相似，都分别包含复数个氨基，且因此，可将复数个带有NHS基的PEG链透过氨基和NHS基之间所形成的酰胺键而连接到化合物核上；利用此方式接上来的PEG链即为本案所述的连接臂，此连接臂的自由端带有一官能基(如，NHS基、顺丁烯二酰亚胺基、叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基或环辛炔基)。同时，所述化合物核有至少一个氨基连接到另一PEG链，此PEG链一端带有NHS基且另一端带有一官能基(如，叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基或环辛炔基)；化合物核与此种PEG 链同样透过酰胺键结来连接，接上后的此一PEG链称为耦合臂，其自由端带有上述特殊官能基。
因此，可藉由以下方式将第一组件连接到连接臂上：(1)在两者间形成酰胺键键；(2)透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应；(3)透过CuAAC反应；(4)透过 iEDDA反应；或(5)透过SPAAC反应。同时，可透过CuAAC反应、iEDDA反应或 SPAAC反应将第二组件连接到耦合臂上。
根据本揭示内容某些实施方式，连接臂是具有2至20个EG重复单元的 PEG链；在较佳的情形中，连接臂是是具有2至20个EG重复单元的PEG链且在其自由端(即，未与中心核连接的该端)带有一双硫键。耦合臂则是具有2至12个EG 重复单元的PEG链。在一实施方式中，连接臂和耦合臂都具有12个EG重复单元，其中在接合前，耦合臂的一端是NHS基，而另一端是炔基。
根据本揭示内容一替代性实施方式，接合单元更包含复数个衔接臂，分别连接到各别的连接臂。之后，复数个第一组件分别连接到这些衔接臂。于一实施方式中，衔接臂是具有2至20个EG重复单元的PEG链。在另一实施方式中，衔接臂是具有2至20个EG重复单元的PEG链，且在未与连接臂相连的组件连接端有一双硫键。
反应式6、7分别绘示了中心化合物核和连接臂之间以及中心化合物核和耦合臂之间的连接关系，其中NHS代表NHS酯类、Mal代表顺丁烯二酰亚胺基、azide代表叠氮基且alkyne代表炔基。
作为中心核的化合物应有多对称且有相同方向的氨基，其理由如下：当利用其中一个胺基来连接一个双功接合臂(即，一端带有N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)酯基且另一端带有炔基、叠氮基、四嗪基或高应力炔基)时，可以得到均质的产物(也就是接有耦合臂的中心核，且耦合臂带有炔基、叠氮基、四嗪基或高应力炔基)，故可轻易将其纯化。之后可利用此种产物来制备多臂接合单元，将剩余的氨基都接上自由端带有顺丁烯二酰亚胺基或其他耦合基团的连接臂。若带有多个氨基的化合物是不对称的化合物，此种化合物和双功接合臂/耦合臂接合后所得到的产物就不是均质的产物。
<<反应式6将分别带有顺丁烯二酰亚胺基与叠氮基的连接臂与耦合臂连接到中心核>>
Figure BDA0001474511850000501
<<反应式7将分别带有顺丁烯二酰亚胺基与炔基的连接臂与耦合臂连接到中心核>>
Figure BDA0001474511850000502
可进一步修饰上述对称化合物，以使得其可和更多的连接臂/耦合臂连接。举例来说，四(2-胺乙基)甲烷是可从一般化合物合成或商业购得的化合物，可利用此种化合物来建构连接了四个连接臂/耦合臂的接合单元。将四(2-胺乙基) 甲烷和双硫代琥珀酰亚胺辛二酸酯(bis(sulfosuccinimidyl)suberate)进行缩合反应，所得到的产物是N,N-二[(1-胺基-3,3-二胺乙基)戊基]甲烷二胺，此一产物有两个四 (2-胺乙基)甲烷单元，并可用以连接六个连接臂/耦合臂。此处所述的接合单元分别带有三个、四个与六个连接臂/耦合臂，对于建构具有标的/效应分子的联合接合物来说，上述连接臂/耦合臂的数目应相当充足。
当可理解，连接臂和/或耦合臂的数目还有与其连接的组件数目都取决于中心核中所含的氨基数目。在某些较佳的实施方式中，连接臂/耦合臂的数目还有与其连接的组件数目是1到7个。
参照第2图，其中绘示了带有四个氨基的苯-1,2,4,5-四胺；其中三个氨基分别和连接臂20相连，而另一个氨基则和耦合臂60相连，且耦合臂60的自由端带有叠氮基。之后，透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应将三个第一组件30分别连接到三个连接臂20上，并透过CuAAC反应将一个第二组件50连接到耦合臂60上。第2 图中所示的实心圆点40代表耦合臂60与第二组件50之间因为CuAAC反应所形成的化学键结。
(iii)适用于多臂接合物的功能性组件
当接合单元(或多臂接合物)仅包含第一组件而不带有第二和/或第三组件时，第一组件是一效应组件，其可于患者体内发挥治疗的效果。另一方面，当此处提出的接合单元包含除了第一组件以外的其他组件时，则这两种组件中应有至少一种是效应组件，而另一者可以是另一效应组件、一靶向组件或能够改善接合单元药动学特性(如，溶解度、廓清率、半衰期与生物可用率)的组件。譬如，接合单元可带有两种不同的效应组件、一效应组件与一靶向组件或一提升药动学特性的组件、两种不同的靶向组件与一种效应组件、两种不同的效应组件与一种靶向组件；或是可带有一种靶向组件、一种效应组件以及一种可改善接合单元药动学特性的组件。
根据本揭示内容某些实施方式，靶向组件或效应组件为芬戈莫德、芬戈莫德磷酸盐、干扰素-β或对整合素-α4、β-类淀粉蛋白、病毒蛋白或细菌蛋白特异的单链可变片段(scFv)。
病毒蛋白的实施例包括但不限于：呼吸道融合病毒(RSV)的F蛋白、人类免疫缺陷病毒第I型(HIV-1)的gp120蛋白、A型流感病毒的血球凝集素A(HA) 蛋白与巨细胞病毒的醣蛋白。
细菌蛋白的例示性实施例包括：革兰氏阴性菌的内毒素、困难梭状芽孢杆菌的表面抗原、金黄葡萄球菌的壁脂酸、炭疽杆菌的炭疽毒素或大肠杆菌的第I型或第II型类志贺毒素。
分子量为20,000至50,000道耳顿(daltons)的长PEG链就是一种能改善接合单元药动学性质的组件。
下文举例说明可用以治疗某些特定疾病之多臂接合物所含的功能性组件。
于治疗CNS疾病(如多发性硬化症)时，例示性的接合单元可使用芬戈莫德、芬戈莫德磷酸盐、干扰素-β或对整合素-α4特异的scFv作为第一组件(效应组件)。于治疗阿滋海默症时，此处提出的接合单元可使用对β-类淀粉蛋白特异的scFv 作为第一组件(效应组件)。在视需要的情形中，用以治疗多发性硬化症、阿滋海默症或其他CNS疾病的接合单元可更包含一第二组件，譬如以对运铁蛋白受体特异的scFv作为靶向组件。
相似地，于治疗病毒或细菌引发的感染时，可利用对病毒或细菌蛋白特异的scFv作为靶向组件(第一组件)。在这些情形中，接合单元可包括视需要而加入的第二组件，例如对CD32或CD16b特异的scFv以作为效应组件。
(iv)多臂接合物的用途
本揭示内容亦关于利用适当接合单元来治疗各种疾病的方法。一般来说，所述方法包含以下步骤：对需要治疗个体投予有效量的根据本揭示内容实施方式的接合单元。
相较于既有的治疗性构建体，第一节以上段落所述的接合单元至少有以下的优点：
(1)可以视需求和/或用途来调整功能性组件的数目。根据不同用途的需求，本发明接合单元可包含二种组件(即，第一与第二组件)或三种组件(即，第一、第二与第三组件)，上述需求包括欲治疗的疾病、接合单元的给药方法、接合单元所携抗体的结合力与亲和力等等。举例来说，当要将接合单元直接投递到特定组织/ 器官(譬如，治疗眼睛)时，可以只使用一种组件作为效应组件，而不需加入靶向组件。然而，当透过周边给药途径来投递接合单元时，譬如经口服、肠胃道、鼻腔、局部或黏膜给药、或以肌肉内、静脉内或腹膜内注射，本发明接合单元就需要包含靶向组件，以便将接合单元特异地标的到病灶部位；此外，接合单元还应该包含效应组件，以便在病灶部位发挥治疗效果。为了要提高接合单元的标的或治疗效果或提升其稳定度，本发明接合单元还可进一步包含第三组件；所述的第三组件可以是第二种靶向组件、第二种效应组件或PEG链。
(2)第一组件是以成束(bundle)的形式存在。如上文所述，第一组件的数目取决于中心核所包含的赖氨酸残基的数目。如果中心核中赖氨酸残基的数目是2到15，则每一接合单元可带有至少两个第一组件。因此，相较于传统治疗性构建体仅能携带单一个分子(譬如单一个细胞毒性药物或抗体分子)，本发明接合单元可同时提供更多的功能性组件(不论是靶向组件或效应组件)，进而可大幅提升疗效。
在某些治疗应用中，可能想要采用单一份的标的或效应组件。譬如，可使用单一份靶向组件来避免因为靶向组件结合力太强而导致不理想的副作用；当所用的scFv对标的抗原有相对较高的亲和力，且当标的抗原是正常细胞(而非所标的的染病细胞)上的细胞表面抗原时，上述考虑更显重要。在一实施例中，当使用对CD3或CD16a特异的scFv来招募T细胞或NK细胞以消灭所标的之细胞(譬如葛瑞夫兹氏症患者的甲状腺细胞)时，较佳可使用单一份对CD3或CD16a特异的scFv，因而能够避免因为CD3或CD16a交联而产生的不良副作用。相似地，在使用对CD3 或CD16b特异的scFv来招募吞噬性嗜中性白血球与巨噬菌体来清除与抗体结合的病毒或细菌粒子或其产物时，较佳可使用单一份scFv。此外，在使用对运铁蛋白受体特异的scFv来携带效应药物分子至BBB以治疗CNS疾病时，较佳可使用单一份对运铁蛋白受体特异的scFv。在又一种例子中，可能想要加入单一份的长链PEG，以提升接合单元的药动学特性；因为使用两个或更多的长PEG链可能会使得PEG 链缠结而影响标的或效应组件的结合力。
第二节用以治疗特定疾病的联合接合物分子构建体
本揭示内容的另一态样是关于包含至少两个接合单元的分子构建体，其中一接合单元带有一或多个靶向组件，而另一接合单元带有一或多个效应组件或可提升药动学特性的组件。在本揭示内容中，将带有标的与效应部分(可以是治疗效果或药动学效果)的分子构建体称为联合接合物分子构建体。根据本揭示内容各种实施方式，此种联合接合物分子构建体中所含的每一接合单元可以是含多肽核或化合物核的多臂接合物，如上文第一节所述。根据本揭示内容某些实施方式，本发明分子构建体的至少一个接合单元包含多肽核。在较佳的情形中，本发明分子构建体的至少两个接合单元包含多肽核。在更佳的情形中，本发明分子构建体的所有接合单元分别包含多肽核。
(i)联合接合物分子构建体的结构
根据本揭示内容某些实施方式，所述分子构建体包含两个接合单元，且这些接合单元间透过CuAAC反应(以铜或环戊烷基环戊二烯基氯化钌复合物为催化剂)、SPAAC反应或iEDDA反应彼此连接。在一些实施方式中，两个接合单元中其中一个连接有复数个第一组件(作为靶向组件)，而另一个连接有复数个第二组件(作为效应组件)。
根据本揭示内容其他实施方式，所述分子构建体包含三个接合单元，其中第一与第二接合单元彼此透过iEDDA反应而连接，而之后再透过CuAAC反应将第三接合单元接合到第一或第二接合单元。或者是，第一与第二接合单元彼此透过iEDDA反应连接，而第三接合单元则透过SPAAC反应而接到第一或第二接合单元。在一些实施方式中，第一、第二与第三接合单元分别带有复数个第一、第二与第三组件，其中第一、第二与第三组件彼此不同。根据一实施方式，上述三种组件(即，第一、第二与第三组件)中的其中两种是靶向组件，而另一种则是效应组件。根据另一实施方式，三种组件组件中有两种是效应组件，而另一种是靶向组件。根据又另一种实施方式，三种组件中有一种是靶向组件、第二种组件是效应组件，而另一种组件则可改善所述分子构建体的药动学特性，如水溶性、廓清率、半衰期与生物可用率。
首先参照第3A至3D图，这些图式分别绘示了两个接合单元之间的连接方式。第3A图所示的分子构建体包含两个接合单元(100A、200A)，彼此间透过 iEDDA反应连接。第一接合单元100A包含第一中心核110a、连接臂120(下称第一连接臂)以及耦合臂130a(下称第一耦合臂)，其中连接臂与耦合臂分别以一端连接于第一中心核110a。相似地，第二接合单元200A包含第二中心核210a、连接臂220 (下称第二连接臂)以及耦合臂230a(下称第二耦合臂)，其中连接臂与耦合臂分别以一端连接于第二中心核210a。耦合臂130a、230a其中之一的自由端带有四嗪基，而另一个的自由端则带有TCO基。具体来说，若耦合臂130a的自由端(即，未连接到第一中心核110a的一端)带有四嗪基152，则耦合臂230a的自由端(即，未连接到第二中心核210a的一端)就带有TCO基154，反之亦然。因此，这两个接合单元(100A 与200A)就会透过发生在耦合臂130a与230a的自由端间的iEDDA反应而彼此连接。第3A图所示的椭圆点156代表耦合臂130a与230a间因为iEDDA反应而产生的化学键结。
在所绘示的实施方式中，连接臂120、220的自由端各带有顺丁烯二酰亚胺基。因此，各自带有硫氢基的第一靶向组件140与第一效应组件240就可透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应分别连接到连接臂120、220。
根据一实施方式，第3A图所示的第一与第二中心核110a、210a都是多肽核。根据另一实施方式，第3A图所示的第一与第二中心核110a、210a都是化合物核。根据又一实施方式，第3A图所示的第一与第二中心核110a、210a其中之一是多肽核，而另一个则是化合物核。
第3B图绘示根据本揭示内容的替代性实施方式，其中第一与第二中心核110b、210b都是多肽核，且分别透过连接臂120、220跟第一靶向组件140与第一效应组件240相连。本实施方式的特点在于，中心核110b、210b其中之一的N- 或C-端是带有叠氮基的氨基酸残基(譬如AHA残基)，而另一者的N-或C-端则是带有炔基的氨基酸残基(譬如HPG残基)，此种构形使得中心核110a、210a能够直接地彼此连接，亦即，不需透过第3A图所示的耦合臂来连接。具体来说，若中心核110b 的N-或C-端为带有叠氮基162的氨基酸残基，则中心核210b的N-或C-端为带有炔基164的氨基酸残基，反之亦然。因此，接合单元100B与200B可透过发生在中心核110b、210b的上述N-或C-端氨基酸残基间的CuAAC反应而直接连接。第3B图所示的实心圆点166代表上述N-或C-端氨基酸残基间形成的化学键结。
第3C图是本揭示内容的另一种实施方式。接合单元100C与200C的结构和接合单元100A与200A类似，不同之处在于耦合臂130b、230b分别带有叠氮基 162与DBCO基172，而非如第3A图的接合单元100A、200A一般带有叠氮基152与炔基154。具体来说，中心核110a和自由端带有叠氮基162的耦合臂130b(下称第一耦合臂)连接；而中心核210a则和自由端带有DBCO基172的耦合臂230b(下称第二耦合臂)连接。接着，所述接合单元100C与200C可透过发生在耦合臂130b、230b 之间的SPAAC反应相连接；两者间形成的化学键结182以菱形表示。
在一实施方式中，第3C图所示的第一与第二中心核110a、210a都是多肽核。在另一实施方式中，第3C图所示的第一与第二中心核110a、210a都是化合物核。在又一实施方式中，第3C图所示的第一与第二中心核110a、210a其中之一是多肽核，而另一个则是化合物核。
当可理解，两个接合单元也可透过发生在中心核与耦合臂之间的 CuAAC反应而彼此连接。接着参照第3D图，中心核110b的N-或C-端是带有叠氮基 162的氨基酸残基(譬如AHA残基)，而中心核210a与自由端带有TCO基172的耦合臂230b连接。因此，接合单元100B与200C可透过发生在中心核110b与耦合臂230b 之间的SPAAC反应而彼此连接；两者间形成的化学键结182以菱形表示。
根据一实施方式，第3D图所示的接合单元100B、200C分别包含多肽核。根据另一实施方式，第3D图所示的中心核100B为多肽核，而中心核200C则为化合物核。
或者是，一接合单元的N-或C-端为带有炔基的氨基酸残基(譬如HPG 残基)，且另一接合单元包含自由端带有叠氮基的耦合臂，故两者可透过中心核与耦合臂之间的CuACC反应而连接。
当可理解，本发明分子构建体有至少一个接合单元可更包含一衔接臂，此衔接臂的一端与连接臂相连，另一段与功能性组件(可以是靶向组件或效应组件) 相连，如第一节所述。譬如，所述分子构建体可包含两个接合单元，其第一组件直接与第一连接臂相连，而第二组件则透过衔接臂而与第二连接臂连。或者是，所述分子构建体可包含两个接合单元，其第一与第二组件分别透过第一与第二衔接臂而和第一与第二连接臂相连。
在较佳的情形中，当第一与第二连接臂其中至少一者是透过CuAAC 或SPAAC反应而和衔接臂/功能性组件相连时，第一与第二接合单元彼此可透过 iEDDA反应而耦接。或者是，当第一与第二连接臂其中至少一者是透过iEDDA反应而和衔接臂/功能性组件相连时，第一与第二接合单元彼此可透过CuAAC或 SPAAC反应而耦接。
根据某些实施方式，衔接臂是具有2至20个EG重复单元的PEG链。根据其他实施方式，衔接臂是具有2至20个EG重复单元的PEG链，且其未与连接臂相连的组件连接端有一双硫键。
根据本揭示内容一实施方式，第一组件是对运铁蛋白受体特异的scFv，且第二组件是干扰素-β(IFN-β)、芬戈莫德、芬戈莫德磷酸盐或对整合素α4或β-类淀粉蛋白特异的scFv。根据本揭示内容另一实施方式，第一组件是对病毒蛋白或细菌蛋白特异的scFv，而第二组件是对CD16b或CD32特异的scFv。
与其他治疗性构建体相较之下，本发明分子构建体至少有以下三种优点：
(1)可独立制备带有特定数目和/或类型之标的/效应组件的接合单元，之后再透过CuAAC反应、iEDDA反应或SPAAC反应将这些接合单元彼此连接在一起；
(2)可基于特定应用的需求(譬如欲治疗的疾病、以及标的和/或效应组件的结合亲和力(binding avidity)和/或亲和力(affinity)等)，来调整标的和/或效应组件的数目与种类。可根据具体的需求与应用来调整标的与效应组件。可随着各种因素，譬如欲治疗的症状、患者的生理状况和/或欲治疗的疾病种类等，来改变本发明标的与效应组件。临床治疗时，可结合最适当的靶向组件与最适当的效应组件，以便达到最理想的治疗效果。根据本揭示内容的实施方式，靶向组件可以是生长因子、肽类激素、细胞介素或抗体片段；而效应组件可以是免疫调节剂、与放射性核种复合的螯合剂、细胞毒性药物、细胞介素、可溶性受体或抗体片段；以及
(3)在接合任两个接合单元时，此处提出的CuAAC反应、iEDDA反应或SPAAC 反应的接合效率优于其他接合反应。
接着参照第4图，可单独制备图中绘示的六个构建体库。在本实施方式中，构建体库1-6分别包含复数个接合单元300A、300B、300C、400A、400B与 400C，而每一种接合单元连接有不同数目和/或种类的功能性组件。接合单元300A、 300B与300C的结构类似；其中接合单元300A、300B与300C各自包含一个中心核 310、一条与中心核连接的耦合臂330，且耦合臂330的自由端带有四嗪基350，还有不同数目的连接臂320(如图所示)。举例来说，接合单元300A有四条连接臂320，且因此，有四个靶向组件340a分别连接到这四条连接臂320。相似地，两个靶向组件340b与五个靶向组件340c则分别连接到接合单元300B与300C。靶向组件340a、 340b与340c可以相同或不同。至于接合单元400A、400B与400C则分别有一中心核410、一条与其相连的耦合臂430，且耦合臂430的自由端带有高应力炔基450，另外还有不同数目的连接臂420。如图所示，三个效应组件440a、五个效应组件440b 以及八个效应组件440c分别连接到接合单元400A、400B与400C。效应组件440a、 440b与440c可以相同或不同。可分别制备构建体库1-6。本发明所属技术领域具有通常知识者可以从构建体库1、2与3中选择第一接合单元，并从构建体库4、5与6 中选择第二接合单元，接着再透过发生在四嗪基350与高应力炔基450之间的 iEDDA反应，而将第一与第二接合单元连接在一起，因此，所得到的分子构建体即具有指定数目的标的与效应组件。
从上述构建体库的概念出发，可基于所选的构建体库得到具有不同构形的分子构建体。第5A图是所述分子构建体的一种实施例，其中第一与第二中心核(310、410)各自连接了三条连接臂(320、420)与一条耦合臂(330、430)。三个第一靶向组件340分别连接到每一连接臂320；而三个第一效应组件440则分别连接到连接臂420。这两个接合单元透过耦合臂330、430间因为iEDDA反应所形成的化学键结356而彼此连接。透过这种构形，所得到的分子构建体可带有多个相同数目的标的和/或效应组件。
第5B图是上述分子构建体的另一种实施例，其中第一与第二中心核分别带有不同数目的氨基(譬如赖氨酸残基)，且因此，所述分子构建体带有不同数目的标的与效应组件。在图中所示的实施例中，第一中心核310连接有一条耦合臂330与两条连接臂320。第二中心核410则接有一条耦合臂430与五条连接臂420。因此，有两个靶向组件340分别连接到两条连接臂320上；并有五个效应组件440 分别连接到五条连接臂420上。第5B图中的椭圆点356代表耦合臂330、430之间的键结。
在可选的实施方式中，本发明分子构建体可更包含相对较长的PEG链，此一长PEG链和第一或第二中心核连接，而使得在施用至一个体后，本发明分子构建体可远离网状内皮细胞(reticuloendothelial)系统而能有较长的半衰期。在利用 PEG链修饰蛋白质以改善其药动学特性和/或降低免疫源性的时候，较佳可使用分子量最高为20,000-50,000道耳顿的PEG。因此，在本发明较佳的实施方式中，会使用相对较短的PEG链作为连接标的与效应组件所用的连接臂，而要提升分子构建体在活体内的半衰期时，则会将分子量为20,000到50,000道耳顿的PEG链连接到任一接合单元。
在某些实施方式中，可利用多个scFv片段作为标的和/或效应组件，以建构本发明分子构建体。对于以含有scFv片段的分子构建体为基础的靶向组件/ 效应组件药物，其所含的scFv片段的活体内半衰期应该比个别的抗体片段来得长。在某些临床应用中，药物的半衰期越长越好，因此就不需要经常施用这些药物，此时可利用分子量为20,000到50,000道耳顿的PEG链作为连接臂，以连接作为标的或效应组件的scFv片段。可利用上述长度的PEG来修饰多种治疗性蛋白，以延长其半衰期。
根据本揭示内容某些实施方式，所述接合单元可包含分别连接了不同功能性组件的两条连接臂。参照第6图，其中所述分子构建体包含两个接合单元 100A与200D。第一与第二功能性组件140、240(一个作为靶向组件，而另一个作为效应组件)分别透过连接臂120与220连接到第一中心核110a与第二中心核210c；而两个中心核110a与210c则透过发生在耦合臂130a与230a间的iEDDA反应彼此连接，其中椭圆点156代表上述反应所形成的化学键结。除了功能性组件240之外，第二中心核210c更连接了一条PEG链260。具体来说，第二中心核210c带有一AHA 残基，其可透过SPAAC反应和带有高应力炔基的PEG链260反应并与其相连，其中菱形点182代表由SPAAC反应所形成的化学键结。随着实际应用的情形，第三组件可以是第二靶向组件、第二效应组件或能够改善分子构建体药学特性的组件。根据本揭示内容的一实施方式，PEG链260的分子量约为20,000到50,000道耳顿。
基于以上的概念，一个接合单元可包含复数条连接臂，而这些连接臂可分别和功能性组件连接。举例来说，接合单元可包含5-到12条连接臂，因此可以连接5到12个功能性组件。以小分子药物(如治疗性药物或类铎受体(TLR)促效剂) 作为功能性组件时，上述特性的优势更为突出。下文将带有多个治疗性药物分子的接合单元称为载药束。
此外，可利用多肽中心核来制备包含三个接合单元的分子构建体。因此，本揭示内容的另一态样是关于包含三个接合单元的分子构建体。在所述的三个接合单元中，其中两个接合单元彼此透过iEDDA反应连接，而第三接合单元则可透过SPAAC反应或CuAAC反应连接到另两个接合单元其中任一单元。建构多接合单元(譬如三个接合单元)的主要考虑是可以纳入两种不同的靶向组件或二种不同的效应组件。
接着参照第7A图，图中所示的分子构建体包含三个接合单元(500、 600与700A)。接合单元500、600与700A各自有一个中心核(510、610、710)，而带有功能性组件(540、640、740)的连接臂(520、620、720)则分别与这些中心核相连。接合单元600的特征在于其N-或C-端的半胱氨酸残基和耦合臂630相接，而另一端则是带有叠氮基或炔基的氨基酸残基。在接合前，耦合臂530、630其中之一的自由端带有四嗪基，另一者的自由端则带有高应力炔基。因此，接合单元500、600 可透过发生在耦合臂530与630间的iEDDA反应而彼此连接，其连接方式如第3A图所示。关于接合单元700A的连接方式，当中心核610的N-或C-端是带有叠氮基的氨基酸残基(譬如AHA残基)时，中心核710的N-或C-端是带有炔基的氨基酸残基 (譬如HPG残基)；或者是，当中心核610的N-或C-端是带有炔基的氨基酸残基(譬如 HPG残基)时，则中心核710的N-或C-端是带有叠氮基的氨基酸残基(譬如AHA残基)。因此，接合单元600、700A可透过发生在中心核610与710的N-或C-端氨基酸残基间的CuAAC反应直接彼此连接，而不需透过耦合臂，如第3B图所示的连接方式。第7A图所示的椭圆点560与实心圆点670分别代表因iEDDA反应与CuAAC反应所形成的化学键结。
或者是，三个接合单元中的两个接合单元可透过iEDDA反应彼此连接，而第三接合单元则是透过SPAAC反应连接到另两个单元其中一单元。以第7B 图为例，接合单元500、600是透过iEDDA反应而彼此连接，其连接方式类似第7A 图所示；而接合单元700B则是透过中心核610与耦合臂730间的SPAAC反应而连接到接合单元600。第7B图所示的菱形点672代表因SPAAC反应而产生的化学键结。
当可理解，随着所欲的应用不同，连接到接合单元500、600与700A 或700B上的功能性组件540、640、740的数目也可以随之改变。利用第4图提出的构建体库概念，可将带有不同数目和/或类型的功能性组件的接合单元分别制备成不同的构建体库，而本发明所属技术领域具有通常知识者就可以根据不同的需求，从多个构建体库中选择适当的二或多个接合单元并将其结合。
基本上，可将上述态样和/或实施方式中所讨论的分子构建体的“一端带有叠氮基、炔基、四嗪基或高应力炔基的耦合臂”设计成一条有2至12个EG 重复单元的PEG链；而所述的连接臂则是有2至20个EG重复单元的PEG链；在较佳的情形中，连接臂是有2至20个EG重复单元的PEG链，且在未与中心核连结的自由端带有一双硫键。
使用多肽作为中心核使得本发明分子构建体具有更大的设计弹性，因为可在单一构建体中携带多份或多种标的/效应组件；因此能够提升药物递送的特异性以及其在预定目标部位的功效。可利用包含多个接合单元的分子构建体而得到多种不同的构形。举例来说：第一接合单元可携带三个scFv靶向组件，而第二接合单元可携带五个治疗性药物；第一接合单元可携带三个scFv靶向组件，而第二接合单元可携带三个scFv效应组件；第一接合单元可携带两个scFv以作为第一组靶向组件、第二接合单元可携带两个scFv以作为第二组靶向组件，而第三接合单元可携带五个治疗性药物；第一接合单元可携带两个双特异性scFv靶向组件，而第二接合单元可携带两个scFv效应组件；或第一接合单元可携带三个scFv靶向组件、第二接合单元可携带两个scFv效应组件，并透过连接臂而连接分子量为20,000-50,000道耳顿的长PEG以提升其药动学特性。
在本发明的某些实施方式中，可利用双功PEG作为连接臂，以将作为标的或效应组件的抗体或其抗原结合片段连接到位于多肽核中的氨基。每一条 PEG的一端可带有NHS基，另一端则带有顺丁烯二酰亚胺基。NHS基可和多肽核中的氨基耦接，而顺丁烯二酰亚胺基则可和抗体的scFv、双特异性scFv或Fab 片段的半胱氨酸残基的硫氢基耦接。可设计scFv与双特异性scFv使其C-端带有一多肽接合链且最末端为半胱氨酸残基。可利用胃蛋白酶(pepsin)裂解完整IgG以得到Fab片段，且可利用温和的还原反应将链间的双硫键反应产生自由硫氢基。
反应式8-12提供了多种耦接与制备所述接合单元的实施例。
反应式8是根据本揭示内容一实施方式来制备分子构建体的概要反应式，其中NHS代表NHS酯、Mal代表顺丁烯二酰亚胺基、AAH代表L-叠氮高丙氨酸 (AHA)残基，GHP代表高炔丙基甘氨酸(HPG)残基、Ac代表乙酰基且scFv代表单链可变片段。在步骤1，分别制备第一中心核与第二中心核，其中第一中心核包含(GSK)3序列且其C-端为AHA残基；而第二中心核序列为(GSK)5且其C-端为HPG。为了使多肽更为稳定，利用乙酰基来修饰第一与第二中心核的N-端。在步骤2，透过形成酰胺键，将每一连接臂分别连接到第一与第二中心核中的赖氨酸残基；连接于中心核的连接臂的自由端带有顺丁烯二酰亚胺基。在步骤3，透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应，将带有硫氢基(如，半胱氨酸残基)的第一靶向组件(即，抗体) 连接到与第一中心核连接的连接臂；相似地，透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应，将带有硫氢基的效应组件(即，药物)连接到和第二中心核相连的连接臂。在步骤4，透过发生在AHA与HPG残基间的CuAAC反应，将两个接合单元耦接在一起。
<<反应式8透过C-端氨基酸残基来耦接接合单元>>
Figure BDA0001474511850000621
可视需要而利用不同方法将标的/效应组件连接到中心核上。如反应式9，先将连接臂连接到中心核，之后再透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应将效应组件(即，药物)连接到连接臂上，进而使效应组件与多肽核耦接。
<<反应式9透过连接臂将效应组件与多肽核耦接>>
Figure BDA0001474511850000631
反应式10则是另一种替代方式，先将效应组件(即，药物)和连接臂相接，以得到连接臂-效应组件复合物(即，PEG-药物)；接着，透过形成于赖氨酸残基与NHS酯之间的酰胺键，将连接臂-效应组件复合物连接到中心核。
<<反应式10先将效应组件和PEG链接合后再连接到多肽核中赖氨酸残基的氨基>>
Figure BDA0001474511850000632
或者是，联合接合物构形的连接臂也可以用来连接双特异性scFv，其可作为靶向组件或效应组件。这些构形可提升靶向组件的特异性和/或效应组件的有效性。
反应式11是制备本发明分子构建体的一种实施例，此分子构建体包含两个接合单元；每一个接合单元的序列包含(K-Xaa4)3，且其C-端为半胱氨酸(C)残基。
<<反应式11透过耦合臂间的iEDDA反应来制备分子构建体>>
Figure BDA0001474511850000641
在步骤1，将两条耦合臂分别连接到这两个接合单元末端的C残基，其中一条耦合臂一端带有顺丁烯二酰亚胺(Mal)基且另一端带有四嗪基，而另一条耦合臂的两端分别带有Mal基和TCO基。在步骤2，透过在连接臂与K残基间形成酰胺键，将连接臂分别连接到赖氨酸(K)残基。之后，在步骤3，透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应，将三个抗A抗原scFv(scFvαA)与三个抗B抗原scFv(scFvαB)分别连接到这两个接合单元的连接臂。最后，在步骤4，透过发生在四嗪基与TCO基间的iEDDA反应，将两个接合单元彼此耦接。
反应式12是制备包含三个接合单元的分子构建体的实施例，其中两个接合单元分别连接了scFvαA与scFvαB，且这两个接合单元彼此透过iEDDA反应而耦接，如反应式11所述；而第三接合单元则透过CuAAC反应和第二接合单元耦接。
<<反应式12制备由带有三种功能性组件的三个接合单元组成的分子构建体>>
Figure BDA0001474511850000651
在本实施例中，第三接合单元是一个载药束。然而，此一反应式也可以适用于选用其他组件(如scFv)的第三接合单元。在本发明例子中，位在中心的接合单元(即，第二接合单元)在其N-端为HPG残基(GHP)，且因此，可透过发生于HPG 与AHA残基之间的CuAAC反应，将带有AHA残基(AAH)的载药束连接到第二接合单元。或者是，中心接合单元的N-或C-端可带有AHA残基，若第三接合单元的耦合臂带有DBCO或其他高应力炔基，两者就可以透过SPAAC反应而耦接。反应式 12中所示的分子构建体有三种功能性组件：scFvαA、scFvαB与药物分子。此种由三个接合单元组成的分子构建体亦可携带三组scFv，其中两组作为靶向组件而一组作为效应组件，或其中一组作为靶向组件而另两组作为效应组件。
当标的与效应组件都是scFv，且使用600道耳顿(12个EG单元)的PEG 链作为连接臂时，此种分子构建体共有六个scFv，且其总分子量约为170,000道耳顿。带有七个scFv的分子构建体的分子量约为200,000道耳顿，而带有八个scFv的分子构建体的分子量为230,000道耳顿。根据本揭示内容所制备的大多数分子构建体的分子量小于200,000道耳顿，有一小部分的分子构建体的分子量介于 200,000-250,000道耳顿之间。
当想要建构带有四组不同的scFv的分子构建体时，较佳可使一个接合单元带有接合的单链双特异性scFv(bi-scFv)，譬如scFv1-scFv2(如抗HER2与 HER3)，而另外两个接合单元则分别带有一种scFv(即，分别带有scFv3与scFv4)。有两种方法能够建构上述双特异性的scFv1-scFv2。在“串联(tandem)”构形中，抗体片段的排列方式为VL1-VH1-VL2-VH2或VH1-VL1-VH2-VL2；在“双抗体 (diabody)”构形中，抗体片段则是排列成VL2-VL1-VH1-VH2或VH2-VH1-VL1-VL2。可在免疫球蛋白区域间加入多肽接合链，如GGGGS(序列编号：6)重复或其他序列。
由发明人的经验推知，在经过长时间储存后，带有顺丁烯二酰亚胺与叠氮基的多肽或PEG接合链可能会因为顺丁烯二酰亚胺与叠氮基间自发的接合反应而形成聚合物。因此，在较佳的情形中，最好分别制备新鲜的各种接合单元，接着再实时将标的或效应组件连接到所述接合单元上，并透过链接反应将这些接合单元连接到一起。另一种较佳的实施方式是将靶向组件和效应组件都接合到带有炔基的接合单元上，而后再将其中一种接合单元的炔基转变为叠氮基，譬如可利用一条两端都带有叠氮基的短同型双功接合物。之后就可将分别带有炔基与叠氮基的两种接合单元透过链接反应而耦接。
适用于本发明的连接臂较佳为PEG链。连接臂的长度取决于多种因素。连接臂的长度应足以对所连接的scFv或其他类型的功能性组件提供适当的弹性，使其能够在不受到立体结构限制的情形下，接近目标细胞表面上的标的抗原位置；但连接臂的长度又不应过长，以免造成连接臂和其上连接的scFv片段或功能性组件发生分子间与分子内缠结，或使得分子构建体的分子量过大而无法轻易穿透组织。过长的连接臂可能无法拉动抗原分子以形成较密实的团簇，但在某些细胞凋亡或其他细胞层次的效应中可能会需要此种团簇以启动讯息传导过程。本发明所属技术领域具有通常知识者可在不需过度实验的前提下，针对标的抗原和其结合剂的不同组合类型，决定理想的连接臂长度。在根据本揭示内容的多种分子构建体中，较佳的连接臂是NHS-(PEG)12-顺丁烯二酰亚胺(约500道耳顿)。完全伸展后的(PEG)12链长度约为
Figure BDA0001474511850000671
适用于本发明的连接臂与耦合臂不限于PEG链。举例来说，可使用包含甘氨酸、丝氨酸以及其他亲水性氨基酸残基的多肽、多醣与其他生物可兼容的线性聚合物，并修饰上述高分子使其带有NHS基与顺丁烯二酰亚胺基。
在某些治疗应用中，可能需要将分子构建体的效应组件从连接臂释放出来，而使得效应组件能够进入标的位置的细胞(包括与靶向组件结合的细胞或其周围的细胞)，以引发药学效应。在这些情形中，可在连接臂中加入可裂解键。目前已开发出多种可裂解键，这些可裂解键会因为水解、酸解、还原裂解或酵素裂解等作用而被切开。举例来说，在发炎组织中会出现基质金属蛋白酶，已设计出会受此种酵素作用而裂解的多肽片段，并将其用于建构治疗用构建体。本发明的一实施方式中使用的PEG接合链为NHS-PEG2-12-S-S-顺丁烯二酰亚胺，在邻近顺丁烯二酰亚胺基处设有会被缓慢还原而裂解的S-S双硫键。
根据本揭示内容某些实施方式，上文实施方式中所述的靶向组件可选自以下物质所组成的群组：生长因子、肽类激素、细胞介素与抗体；而效应组件可以是免疫调节剂、与放射性核种复合的螯合剂、治疗性药物、细胞介素、可溶性受体或抗体。
在一些实施方式中，所述抗体可采用以下任一种形式：抗原结合片段 (Fab)、可变片段(Fv)、单链可变片段(scFv)、单一区域抗体(sdAb)或双特异性单链可变片段(双特异性scFv)。根据一实施方式，双特异性scFv是双特异性串联scFv 或双特异性双抗体scFv。
为了保持分子构建体的扩散能力，其分子量以小于250,000道耳顿为宜。因此，在大多数的实施方式中较佳应采用scFv片段。在DNA层级，可建构基因序列以将VL与VH连接成单一多肽链，其顺序为VL-VH或VH-VL，且两者间以一多肽连接链连接，上述多肽延伸物以甘氨酸与丝氨酸为主要残基，且其长度为 10-25个氨基酸。此外，在上述多肽链的C-端加入一段短的延伸物，其包括甘氨酸与丝氨酸，且末端为半胱氨酸。可用以生产上述重组scFv与双特异性scFv的宿主细胞包括：细菌，如大肠杆菌与恋臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；酵母菌，如毕氏巴斯德酵母(Pichia pastoris)；与哺乳动物细胞，如CHO与HEK293细胞系。
本案发明人已利用HEK293与CHO细胞产制出大量的IgG抗体、Fab、 scFv与各种抗体片段、Fc构型蛋白与其他重组抗体，以供活体外系统与动物模型试验用。本案发明人亦已开发出多种细胞系，以产制用于人类临床试验的抗体。在实验室研究阶段，只要使用几个1-2公升的烧瓶，即可轻易地制备HEK293暂时表现系统，进而生产1克左右的IgG或抗体片段。一般来说，适用于本发明所述分子构建体的scFv片段通常不带有醣类修饰，而且醣类修饰也不是scFv与其抗原标的结合所必须的。更有甚者，所述的scFv片段中只有一个双硫键以及一个位在末端的半胱氨酸残基。因此，也可利用小规模的细菌表现系统来制备scFv。使用大肠杆菌时，可选用能从细胞内包涵体(intracellular inclusion bodies)或胞外质(periplasm)中收取scFv或可收取分泌性scFv的表现系统。在大多数的情形中，可利用蛋白L(Protein L)以亲和管柱法来纯化scFv，上述蛋白L可和大多数κ轻链的VH互动；而在其他情形中则可使用离子交换管柱。
根据本发明多个实施例，所述的联合接合物平台主要运用scFv与Fab 作为标的和/或效应组件。然而，亦可从sdAb或其他抗体片段所组成的大型抗体库中筛选出特定的结合分子。有些结合分子并不是以免疫球蛋白区域为基础，但其针对所选的标的分子有特异结合亲和力，因而有和抗体类似的功能，这些结合分子包括以下类型：(1)适配体(aptamer)，包含可和目标分子结合的寡核苷酸或短肽； (2)Fyn激酶衍生物(fynomer)，包含衍生自人类Fyn激酶SH3区域的小的结合蛋白； (3)黏合素(affimer)，包含衍生自半胱氨酸蛋白抑制剂(cystatin)家族的结合蛋白；以及(4)经设计的锚蛋白重复蛋白(designedankyrin repeat protein，DARPin)，此类蛋白是利用遗传工程设计，设计出包含三、四或五个由天然锚蛋白衍生的结构的重复区段。上述这些抗体拟似物的分子量约约为10K至20K道耳顿。
(ii)适用于联合接合物分子构建体的功能性组件
如上文所述，本发明提出的联合接合物包含至少两个接合单元，其第一接合单元带有一或多靶向组件，而第二接合单元带有一或多效应组件或促进药动学特性的组件，反之亦然。下文举例说明可用以治疗某些特定疾病之联合接合物分子构建体所含的功能性组件。
于治疗中枢神经系统(CNS)疾病时，可使用对运铁蛋白受体特异的 scFv作为所述联合接合物分子构建体的靶向组件，并搭配适合治疗特定CNS疾病的效应组件。譬如，用以治疗多发性硬化症的联合接合物分子构建体可以使用芬戈莫德、芬戈莫德磷酸盐、干扰素-β或对整合素-α4特异的scFv作为效应组件。欲治疗阿滋海默症时，例示性的联合接合物分子构建体可使用对β-类淀粉蛋白特异的scFv作为效应组件。
针对与感染相关的疾病或症状，可以使用对CD16b或CD32特异的 scFv作为效应组件，而靶向组件则取决于感染源。具体来说，对于病毒引发的感染，可以使用对病毒蛋白特异的scFv作为靶向组件；而对于细菌引发的感染，可以使用对细菌蛋白特异的scFv作为靶向组件。例示性的病毒蛋白实施例包括但不限于：呼吸道融合病毒(respiratorysyncytial virus，RSV)的F蛋白、人类免疫缺陷病毒第I型(human immunodeficiencyvirus type 1HIV-1)的gp120蛋白、A型流感病毒 (influenza A virus)的血球凝集素A(hemagglutinin A，HA)蛋白或巨细胞病毒 (cytomegalovirus)的醣蛋白。细菌蛋白的非限制性实施例包括：革兰氏阴性菌的内毒素、困难梭状芽孢杆菌的表面抗原、金黄葡萄球菌的壁脂酸、炭疽杆菌的炭疽毒素或大肠杆菌的第I型或第II型类志贺毒素。
(iii)联合接合物分子构建体的用途
本揭示内容亦关于利用适当联合接合物分子构建体治疗各种疾病的方法。一般来说，所述方法包含以下步骤：对需要治疗个体投予有效量的根据本揭示内容实施方式的联合接合物分子构建体。
第三节用以治疗中枢神经系统疾病或感染性疾病的Fc型分子构建体
(i)Fc型分子构建体的结构
以广义的Fc构形来看，可利用免疫球蛋白抗体作为一标的或效应组件的基础，并将与其搭配的效应或靶向组件以scFv区域的形式引入其两条γ重链的C- 端。以传统的“Fc”构形来看，可利用双链IgG.Fc作为分子平台的基础。每一多肽链可和一或两个靶向组件以及一或两个效应组件融合，使得每一链共带有二至三个组件。具有Fc构形的T-E分子总计可带有四至六个组件(譬如scFv或任何其他抗体片段)。在可任选的实施方式中，所述分子构建体的Fc部分亦带有Fc介导的效应功能，如ADCC和/或补体介导的活化作用。然而在某些其他应用中，不会出现此种Fc介导的效应功能。
在设计Fc型分子构建体时，靶向组件可位于N-或C-端。若效应组件透过和细胞表面组件结合而发挥功用，应将效应组件设于构建体的末端。若效应组件是透过和可溶性因子结合并中和其功效而发挥作用，则可位于末端的标的或效应组件和CH2-CH3之间。
藉由挑选本案Fc型分子构建体的T-E组件，所得到的分子构建体可用于治疗中枢神经系统(CNS)疾病或感染性疾病。在某些实施方式中，本揭示内容的优点还包括使用了本揭示内容第一态样所述的接合单元，因而提供了一种能够轻易控制处提出的Fc型分子构建体的标的与效应组件数量的方法。随着所选用的标的和/或效应组件不同，本Fc型分子构建体可采用不同的构形，兹分述如下。
在本案提出的Fc型分子构建体中，靶向组件与效应组件都是抗体或其片段。
第8A图绘示了根据本揭示内容某些实施方式的Fc型分子构建体800A。如图所示，Fc型分子构建体800A包含两条相同的CH2-CH3链810、连接于CH2-CH3 链810的N-端的一对效应组件E1、以及连接于CH2-CH3链810的C-端的一对靶向组件T1。在此一例示性的构形中，靶向组件T1与效应组件E1都是scFv。
第8B图所示的Fc型分子构建体800B与第8A图的Fc型分子构建体 800A结构非常相似，不同之处在于两个效应组件E1分别连接于CH2-CH3链810的 C-端，而两个靶向组件T1则分别连接于CH2-CH3链810的N-端。
根据某些实施方式，效应组件和靶向组件两者皆连接于CH2-CH3链的N-端。举例来说，当效应组件与靶向组件都是单链可变片段(scFv)时，可将效应组件与靶向组件以串联双抗体(tandem)或双抗体(diabody)的构形连接，因而形成连接于CH2-CH3链N-端的双特异性scFv。
Fc型分子构建体800C(第8C图)包含一Fc部分，且因此，每一CH2-CH3 链810的N-端上接有T1-E1双特异性scFv。
在某些例子中，成对的效应组件或成对的靶向组件形成Fab构形(即，由VH-CH1区域与VL-Cκ区域组成)；此种Fab片段系连接于CH2-CH3链的N-端，而使得Fc型分子构建体成为IgG构形。在这些情形中，不具备Fab构形的该对组件可连接于成对CH2-CH3区段的C-端。
举例来说，在第9图所示的Fc型分子构建体900中，两个靶向组件T1 分别包含VH-CH1区域820与VL-Cκ区域825，因而形成连接于CH2-CH3链810的N- 端的Fab构形830，而使得Fc型分子构建体900成为IgG构形。在本例中，成对的效应组件E1是连接于成对CH2-CH3链810的C-端。
根据某些实施方式，本发明Fc型分子构建体的效应组件为多肽。
譬如，根据本揭示内容某些实施方式，效应组件可以是具有一定疗效的多肽，而靶向组件则是抗体或其片段(参见，第10A与10B图)。如第10A图所示， Fc型分子构建体1000A包含连接于成对CH2-CH3链1210之N-端的一对靶向组件T1 (此组件为一scFv)，以及连接于成对CH2-CH3链1210之C-端的一对效应组件E1(此组件为治疗性多肽)。
相似地，在第10B图的Fc型分子构建体1000B中，成对的靶向组件T1 (此组件为一scFv)系连接于CH2-CH3链1210之C-端；而成对的效应组件E1(此组件为治疗性多肽)则是连接于成对CH2-CH3链1210之N-端。
当可理解，对于使用多肽作为效应组件的Fc型分子构建体，可将靶向组件构建为Fab片段的形式，而使得此分子构建体具有IgG构形。
在第8A至10B图所绘示的构形中，CH2-CH3链是来自人类免疫球蛋白γ1或γ4。一般来说，当想要发挥Fc介导的功能(如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)以及补体介导活性(发炎活化或目标细胞溶解))时，可以选择γ1。当想要避免Fc介导的功能时，可以选用γ4来建构本发明Fc型分子构建体。
(ii)适用于Fc型分子构建体的功能性组件
在讨论了本案Fc型分子构建体的基本结构之后，下文进一步说明某些由特定效应组件(们)与靶向组件(们)所形成的组合。
欲治疗中枢神经系统(CNS)疾病时，可使用对运铁蛋白受体特异的抗体(或其片段)作为靶向组件，并搭配适用于治疗特定CNS疾病的效应组件。譬如，用以治疗多发性硬化症的Fc型分子构建体可使用对整合素-α4特异的scFv作为效应组件。于治疗阿滋海默症时，例示性的型分子构建体可使用对β-类淀粉蛋白特异的scFv作为效应组件。上述可用以治疗CNS疾病的Fc型分子构建体可采用第8A 至8C图以及第9图任一者所示的构形。
用以治疗多发性硬化症的Fc型分子构建体也可以使用INF-β1a或 INF-β1b作为效应组件。在这种情形中，Fc型分子构建体可采用如第10A与10B图所示的构形。
在构建用以治疗与感染(如病毒感染或细菌感染)相关的疾病/症状的 Fc型分子构建体时，可以使用对病毒蛋白或细菌蛋白特异的抗体(或其片段)作为靶向组件。用于治疗感染的效应组件则可以使用对CD32或CD16b特异的抗体(或其片段)。这些Fc型分子构建体可采用第8A至8C图以及第9图任一者所示的构形。
本发明的精髓在于采用特定标的与效应组件的组合或搭配。在较佳的实施方式中，所述分子构建体采用了Fc融合构形。本发明所属技术领域具有通常知识者当可想见，亦可利用其他分子平台来连接此处提出的标的与效应组件的组合；上述分子平台诸如多肽、蛋白质(譬如白蛋白)、聚醣、聚乙二醇以及其他类型的聚合物，只要其能够作为连接多个分子组件的结构基础即可。
(iii)Fc型分子构建体的用途
本揭示内容亦涉及了利用适当Fc型分子构建体来治疗CNS疾病的方法。一般来说，上述方法涉及了对需要此一治疗的个体投予治疗有效量的Fc型分子构建体，所述Fc型分子构建体可以是根据本揭示内容各实施方式所述的任一种 Fc型分子构建体。
本揭示内容也涉及了利用适当Fc型分子构建体来治疗感染的方法。一般来说，上述方法涉及了对需要此一治疗的个体投予治疗有效量的Fc型分子构建体，所述Fc型分子构建体可以是根据本揭示内容各实施方式所述的任一种Fc 型分子构建体。
实验例
实验例1：合成作为多肽核的多肽1(序列编号：18)、多肽2(序列编号：27)以及多肽3(序列编号：19)，并将半胱氨酸残基的SH基和作为耦合臂的顺丁烯二酰亚胺-PEG3-反式-环辛烯(TCO)复合
利用相似的方法来处理合成多肽1、2与3(Chinapeptide Inc.，上海，中国)。将各别多肽溶解于100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0；含50mM NaCl与5mM EDTA)，最终浓度2mM。利用1mM三(2-羧乙基)膦(tris(2-carboxyethyl)phosphine，简称TCEP)使溶解的多肽还原，反应温度25℃、时间2小时。将多肽和顺丁烯二酰亚胺-PEG3-TCO(Conju-probe Inc.)以1/7.5的莫耳比混合，并在pH 7.0、25℃的条件下反应18小时，以使半胱氨酸残基的SH基和顺丁烯二酰亚胺-PEG3-TCO复合而带有功能性连接基团TCO。利用反相HPLC来纯化TCO-多肽复合物；使用Supelco C18 管柱(250mm X 10mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸、线性梯度为0％至100％乙腈、30分钟，流速1.0mL/min、管柱温度25℃。
以MALDI-TOF质谱分析来确认所合成的TCO-多肽(如下所示)。由中国台湾地区“中央研究院” 分子生物研究所(中国台湾，台北)的核心设施单位进行质谱分析。以BrukerAutoflex III MALDI-TOF/TOF质谱分析仪(Bruker Daltonics,Bremen, Germany)进行测量。
所述合成TCO-多肽1(如下所示)的分子量为2,078.9道耳顿。
Figure BDA0001474511850000731
所述合成TCO-多肽2(如下所示)的分子量为2020.09道耳顿。
Figure BDA0001474511850000732
所述TCO-多肽3(如下所示)的分子量为3,381.85道耳顿。
Figure BDA0001474511850000733
实验例2：合成作为多肽核的多肽1，并将半胱氨酸残基的SH基和作为耦合臂的顺丁烯二酰亚胺-PEG4-四嗪复合
将合成多肽1(Chinapeptide Inc.，上海，中国)溶解于100mM磷酸钠缓冲液(pH7.0；含50mM NaCl与5mM EDTA)，最终浓度2mM。利用1mM TCEP 使溶解的多肽还原，反应温度25℃、时间2小时。将多肽和顺丁烯二酰亚胺-PEG4- 四嗪(Conju-probe Inc.)以1/5的比例混合，并在pH 7、4℃的条件下反应18小时，以使半胱氨酸残基的SH基和顺丁烯二酰亚胺-PEG4-四嗪复合而带有功能性连接基团四嗪。利用反相HPLC来纯化四嗪-多肽复合物；使用Supelco C18管柱(250mm X 10mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸、线性梯度为0％至100％乙腈、 30分钟，流速1.0mL/min、管柱温度25℃。
所述合成四嗪-多肽1(如下所示)的分子量为2,185.2道耳顿。
Figure BDA0001474511850000741
实验例3：将作为连接臂的NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺和TCO-多肽1的氨基复合以合成接合单元
将三个PEG12-顺丁烯二酰亚胺连接臂连接到多肽核TCO-多肽1。交联物NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺(琥珀酰亚胺-[(N-顺丁烯二酰亚胺基-丙酰胺基)- 十二乙二醇]酯(succinimidyl-[(N-maleimido-propionamido)-dodecaethyleneglycol] ester)系购自Thermo Fisher Scientific Inc.(Waltham,USA)。根据制造商的指示进行接合。简言之，将带有赖氨酸残基的多肽溶解于复合缓冲液磷酸盐缓冲液(PBS； pH 7.5)中，浓度100mM。在溶解的多肽中加入NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺交联物，最终浓度1mM(比起0.1mM多肽溶液，莫耳数过量10倍)。使反应混合物在室温下反应18小时。以反相HPLC纯化顺丁烯二酰亚胺-PEG12-TCO-多肽1复合物；使用Supelco C18管柱(250mm X 4.6mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸、线性梯度为0％至100％乙腈、30分钟，流速1.0mL/min、管柱温度 25℃。
以MALDI-TOF质谱分析来确认所合成的顺丁烯二酰亚胺 -PEG12-TCO-多肽1复合物。
所述合成顺丁烯二酰亚胺-PEG12-TCO-多肽1复合物的分子量为4,332 道耳顿。如下所示，顺丁烯二酰亚胺-PEG12-TCO-多肽1复合物是一种采用多肽核的接合单元，其上接有一条带有TCO基的耦合臂以及三条带有顺丁烯二酰亚胺基的PEG连接臂。
Figure BDA0001474511850000751
实验例4：将作为连接臂的NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺和四嗪-多肽 1的氨基复合以合成接合单元
将三个PEG12-顺丁烯二酰亚胺连接臂连接到多肽核四嗪-多肽1。交联物NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺(琥珀酰亚胺-[(N-顺丁烯二酰亚胺基-丙酰胺基)- 十二乙二醇]酯(购自Thermo Fisher Scientific Inc.,Waltham,USA)。根据制造商的指示进行接合。简言之，将带有赖氨酸残基的多肽溶解于复合缓冲液磷酸盐缓冲液(PBS；pH 7.5)中，浓度100mM。在溶解的多肽中加入NHS-PEG12-顺丁烯二酰亚胺交联物，最终浓度1mM(比起0.1mM多肽溶液，莫耳数过量10倍)。使反应混合物在室温下反应18小时。以反相HPLC纯化顺丁烯二酰亚胺-PEG12-四嗪- 多肽1复合物；使用Supelco C18管柱(250mm X 4.6mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸、线性梯度为0％至100％乙腈、30分钟，流速1.0mL/min、管柱温度25℃。
所述合成顺丁烯二酰亚胺-PEG12-四嗪-多肽1复合物(如下所示)是一种采用多肽核的接合单元，其上接有一条带有四嗪基的耦合臂以及三条带有顺丁烯二酰亚胺基的PEG连接臂。第11图的MALDI-TOF分析结果指出此一构建体的分子量为4,461道耳顿。
Figure BDA0001474511850000761
实验例5：将芬戈莫德与芬戈莫德磷酸盐分子与NHS-PEG5-NHS交联物复合
芬戈莫德系购自Biotang Inc.(Lexington,USA)，而芬戈莫德磷酸盐则是购自KM3Scientific Corporation(中国台湾，新北市)。使芬戈莫德分子的NH2基和同型双功(homo-bifunctional)交联物NHS-PEG5-NHS反应，如反应式13所示。将芬戈莫德和NHS-PEG5-NHS各自溶于100％DMSO中，两者的最终浓度分别是 10mM与250mM。将6％(v/v)的碱性磷酸钠缓冲液(pH12.7)加入芬戈莫德溶液中
将芬戈莫德磷酸盐和NHS-PEG5-NHS各自溶于100％DMSO中，两者的最终浓度分别是5mM与250mM。将NHS-PEG5-NHS交联物加入至溶解的芬戈莫德磷酸盐溶液中，最终浓度15mM(比起5mM的芬戈莫德溶液，莫耳数过量3倍)。将反应混合物在室温下培育3小时；接着加入18％(v/v)的酸性磷酸钠缓冲液(pH＝0.88)以淬灭反应。在真空下使溶剂蒸发。
<<反应式13芬戈莫德分子与NHS-PEG5-NHS交联物的复合>>
Figure BDA0001474511850000762
将NHS-PEG5-芬戈莫德复合物与NHS-PEG5-芬戈莫德复合物磷酸盐溶于30％乙腈，之后以反相HPLC进行纯化；使用Supelco C18管柱(250mm X 4.6 mm；5μm)，流动相使用乙腈与0.1％三氟乙酸、线性梯度为30％至100％乙腈、 30分钟，流速1.0mL/min、管柱温度25℃。
根据第12图的分析结果，所述合成NHS-PEG5-芬戈莫德复合物(如反应式13所示)的分子量为725.41道耳顿。
所述合成NHS-PEG5-芬戈莫德复合物磷酸盐(如下所示)的分子量为 803.3道耳顿。
Figure BDA0001474511850000771
实验例6：将芬戈莫德分子与NHS-S-S-PEG3-叠氮连接臂复合
使芬戈莫德分子的NH2基和异型双功(hetero-bifunctional)可裂解交联物NHS-S-S-PEG3-azido(Conju-probe Inc.)以1：3的莫耳比反应。利用HPLC纯化产物迭氮-PEG3-S-S-芬戈莫德，以移除多余、未反应的芬戈莫德分子。复合与纯化的方法与上文实施例所述相近。
所述合成迭氮-PEG3-S-S-芬戈莫德复合物(如下所示)的分子量为 629.33道耳顿。
Figure BDA0001474511850000772
实验例7：将迭氮-PEG3-S-S-芬戈莫德复合物分子与NHS-PEG4-二苯并环辛炔(DBCO)交联物复合
将迭氮-PEG3-S-S-芬戈莫德复合物分子和NHS-PEG4-DBCO交联物各自溶于100％DMSO，两者的最终浓度分别是10mM和250mM。于100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)中，将5μl的NHS-PEG4-DBCO交联物加入400μl溶解的迭氮 -PEG3-S-S-芬戈莫德复合物溶液，最终莫耳比为1：3.2([NHS-PEG4-DBCO]：[迭氮-PEG3-S-S-芬戈莫德复合物])。将反应混合物在室温下培育3小时。
所述合成NHS-PEG4-PEG3-S-S-芬戈莫德复合物(如下所示)的分子量为1,278.61道耳顿。在MS光谱中可以见到两个同位素峰，其位置为1,279.64与 1,280.635，分别和[M+H+1]+以及[M+H+2]+相对应。
Figure BDA0001474511850000781
实验例8：将NHS-PEG5-芬戈莫德复合物分子和TCO-多肽2与3复合
将TCO-多肽2溶于100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)中，浓度20mM；并将NHS-PEG5-芬戈莫德复合物溶于100％DMSO中，浓度50mM。在100％ DMSO中，将TCO-多肽2与NHS-PEG5-芬戈莫德复合物以1/42的莫耳比混合，并在室温下培育3小时。接着，在100％DMSO中，将额外的TCO-多肽2加入反应溶液，使其最终莫耳比为1：13.5([TCO-多肽2]：[NHS PEG5-芬戈莫德复合物])。再将混合物在室温下培育3小时。第13图的数据显示由TCO-多肽2和芬戈莫德所形成的载药束的分子量为5,069道耳顿。
将TCO-多肽3溶于100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)中，浓度10mM；并将NHS-PEG5-芬戈莫德复合物溶于100％DMSO中，浓度50mM。在100％ DMSO中，将TCO-多肽2与NHS-PEG5-芬戈莫德复合物以1/42的莫耳比混合，并在室温下反应一晚。第14图的数据显示由TCO-多肽3和芬戈莫德所形成的载药束的分子量为9,479道耳顿，这代表芬戈莫德分子确实复合至TCO-多肽3接合单元上。
所合成的载药束(如下所示)是由带有一个自由TCO官能基和一组五个芬戈莫德分子的接合单元所组成。
Figure BDA0001474511850000791
所合成的第二种载药束(如下所示)是由带有一个自由TCO官能基和一组十个芬戈莫德分子的接合单元所组成。
Figure BDA0001474511850000792
实验例9：将NHS-PEG5-芬戈莫德复合物磷酸盐分子和TCO-多肽2 复合
在100mM磷酸钠缓冲液(pH 7.5)中，将TCO-多肽2和NHS-PEG5- 芬戈莫德复合物磷酸盐以1/42的莫耳比混合，并在室温下反应3小时。质谱分析结果显示TCO-多肽2和芬戈莫德磷酸盐形成的载药束的分子量为5,379.16道耳顿 (第15图)。
所合成的载药束(如下所示)是由带有一个自由TCO官能基和一组五个芬戈莫德磷酸盐分子(p芬戈莫德，作为效应组件)的接合单元所组成。
Figure BDA0001474511850000801
实验例10：将NHS-PEG4-PEG3-S-S-芬戈莫德复合物分子和TCO- 多肽2复合
将五个NHS-PEG4-PEG3-S-S-芬戈莫德复合物分子连接到TCO-多肽2 上。利用和上文实施例所述相似的方法，将NHS-PEG4-PEG3-S-S-芬戈莫德复合物分子复合到TCO-多肽2赖氨酸残基的NH2基上。利用MALDI-TOF质谱分析来确认产物。
所合成的载药束(如下所示)的分子量为7,815道耳顿；其系由带有一个自由TCO官能基和一组五个芬戈莫德分子的接合单元所构成。
Figure BDA0001474511850000802
实验例11：利用HEK293F过表现系统制备重组人类CD32a胞外域
将编码目标蛋白的基因序列置入pG1K表现匣中。所表现的人类 CD32a的细胞外部分是带有组胺酸标签的重组蛋白，其氨基酸序列如序列编号： 28所示。在FreeStyle 293F悬浮培养细胞表现系统与培养基(Invitrogen,Carlsbad, USA)中表现重组人类CD32a胞外域。将FreeStyle 293F细胞以每毫升2.0×106个活细胞的密度播于600mL毫升的Expi293F表现培养基中，并维持18至24小时后进行转染，以确保进行转染时细胞处于分裂状态。进行转染时，将带有1.0×107个细胞的96mL培养基置于2-L艾氏烧瓶中，并加入平均分子量为25kDa的线性聚乙烯亚胺(linear polyethylenimine；购自Polysciences,Warrington,USA)作为转染试剂。于转染后，将转染细胞在37℃下以定轨摇动器(125rpm)培育4小时；之后利用新鲜培养基将细胞密度调整到2.5×106个细胞/ml，并培育4至5天。收集培养上清液，并使用镍亲和力层析法纯化培养基中的蛋白。第16图是纯化人类 CD32a胞外域蛋白的SDS-PAGE分析结果。
实验例12：利用HEK293F过表现系统制备重组人类转铁蛋白-1受体(TfR)胞外域
将编码目标蛋白的基因序列置入pG1K表现匣中。所表现的人类TfR1 胞外域是带有组胺酸标签的重组蛋白，其氨基酸序列如序列编号：29所示。在 FreeStyle 293F悬浮培养细胞表现系统与培养基中表现重组人类TfR1胞外域。将 FreeStyle 293F细胞以每毫升1.0×106个活细胞的密度播于600mL毫升的 Expi293F表现培养基中，并维持18至24小时后进行转染，以确保进行转染时细胞处于分裂状态。进行转染时，将带有1.0×107个细胞的96mL培养基置于2-L 艾氏烧瓶中，并加入平均分子量为25kDa的线性聚乙烯亚胺作为转染试剂。于转染后，将转染细胞在37℃下以定轨摇动器(125rpm)培育4小时；之后利用新鲜培养基将细胞密度调整到2.5×106个细胞/ml，并培育4至5天。收集培养上清液，并使用镍亲和力层析法纯化培养基中的蛋白。第16图是纯化人类TfR1胞外域蛋白的SDS-PAGE分析结果。
实验例13：利用Expi293F过表现系统制备对RSV蛋白F特异单抗、对内毒素特异单抗与对CD32a胞外域特异单抗的scFv
对RSV蛋白F特异的scFv的VL与VH系来自单克隆抗体帕利珠单抗；对内毒素特异的scFv的VL与VH系来自单克隆抗体WN1 222-5(美国专利US 5,858,728)；对CD32a胞外域特异的scFv的VL与VH系来自MDE-8(美国专利申请公开案US 2007/0253958)。衍生自上述抗体的scFv经过特殊设计而在C-端带有可挠性接合物(GGGGSGGGGS)与末端的半胱氨酸残基。半胱氨酸残基的硫氢基可和位于各接合单元连接臂自由端的顺丁烯二酰亚胺基接合。于制备对RSV蛋白F 特异的单克隆抗体、对内毒素特异的单克隆抗体与对CD32a胞外域特异的单克隆抗体等的scFv时，使用编码上述三种抗体VL与VH的DNA序列并进行密码子优化(codonoptimization)。合成编码以下序列的的DNA序列： VL-GSTSGSGKPGSGEGSTKG-VH-(GGGGS)2-C。本发明各实验例中所制备的对 RSV蛋白F特异的单克隆抗体、对内毒素特异的单克隆抗体与对CD32a胞外域特异的单克隆抗体等的scFv之氨基酸序列分别如序列编号：30至32所示。
于利用哺乳类动物表现系统来制备scFv蛋白时，使用以Expi293FTM细胞系为基础的过度表现系统来制备。此系统使用ExpiFectamineTM 293转染套组 (Life Technologies,Carlsbad,USA)，其包含Expi293FTM细胞株、阳离子脂质系 ExpiFectamineTM 293试剂、ExpiFectamineTM 293转染强化剂1与2、以及表现系统所用的培养基(Gibco,New York,USA)。
将编码scFv的序列置于pG1K表现匣中。将Expi293F细胞以每毫升2.0 ×106个活细胞的密度播于Expi293F表现培养基中，并维持18至24小时后进行转染，以确保进行转染时细胞处于分裂状态。进行转染时，将带有7.5×108个细胞的255 毫升培养基置于2-L艾氏烧瓶中，并加入ExpiFectamineTM 293转染试剂。于转染后，将转染细胞在37℃下以定轨摇动器(125rpm)培育16至18小时；之后在烧瓶中加入 ExpiFectamineTM 293转染强化剂1与强化剂2，并继续培育5到6天。收集培养上清液，并使用蛋白L亲和力层析法纯化培养基中的scFv蛋白。
第18A与18B图分别是纯化对RSV蛋白F特异单抗的scFv之 SDS-PAGE与ELISA分析结果；第18C与18D图分别是纯化对内毒素特异单抗的 scFv之SDS-PAGE与ELISA分析结果；第18E与18F图分别是纯化对CD32a胞外域特异单抗的scFv之SDS-PAGE与ELISA分析结果。在96孔ELISA盘(Greiner Bio-one) 上分别涂覆5μg/ml的RSV蛋白F、10μg/ml的内毒素与5μg/ml的CD32a胞外域。利用HRP标记的蛋白L以1：5000的比例来侦测纯化scFv。
ELISA分析结果显示每一种纯化scFv蛋白都可和其各别抗原(RSV蛋白F、内毒素或CD32a胞外域)特异地结合，以上分析使用阿达木单抗(adalimumab) 的scFv(抗-TNF-αscFv)作为阴性对照组。
实验例14：利用Expi293F过表现系统制备对TfR1胞外域特异单抗与对β-类淀粉蛋白特异单抗的scFv
对TfR1胞外域特异的scFv的VL与VH系来自单克隆抗体OX26；对β-类淀粉蛋白特异的scFv的VL与VH系来自巴匹珠单抗。衍生自上述抗体的scFv 经过特殊设计而在C-端带有可挠性接合物(GGGGSGGGGS)与末端的半胱氨酸残基。半胱氨酸残基的硫氢基可和位于各接合单元连接臂自由端的顺丁烯二酰亚胺基接合。于制备对TfR1胞外域特异单抗与对β-类淀粉蛋白特异单抗的scFv时，使用编码上述两种抗体VL与VH的DNA序列并进行密码子优化。合成编码以下序列的的DNA序列：VL-GSTSGSGKPGSGEGSTKG-VH-(GGGGS)2-C。本发明各实验例中所制备的对TfR1胞外域特异单抗与对β-类淀粉蛋白特异单抗的scFv之氨基酸序列分别如序列编号：33与34所示。
于利用哺乳类动物表现系统来制备scFv蛋白时，使用以Expi293FTM细胞系为基础的过度表现系统来制备。此系统使用ExpiFectamineTM 293转染套组 (Life Technologies,Carlsbad,USA)，其包含Expi293FTM细胞株、阳离子脂质系 ExpiFectamineTM 293试剂、ExpiFectamineTM 293转染强化剂1与2、以及表现系统所用的培养基(Gibco,New York,USA)。
将编码scFv的序列置于pG1K表现匣中。将Expi293F细胞以每毫升2.0 ×106个活细胞的密度播于Expi293F表现培养基中，并维持18至24小时后进行转染，以确保进行转染时细胞处于分裂状态。进行转染时，将带有7.5×108个细胞的255 毫升培养基置于2-L艾氏烧瓶中，并加入ExpiFectamineTM 293转染试剂。于转染后，将转染细胞在37℃下以定轨摇动器(125rpm)培育16至18小时；之后在烧瓶中加入 ExpiFectamineTM 293转染强化剂1与强化剂2，并继续培育5到6天。收集培养上清液，并使用蛋白L亲和力层析法纯化培养基中的scFv蛋白。第19A与19B图分别是纯化对TfR1胞外域特异单抗的scFv之SDS-PAGE与ELISA分析结果；第19C与19D 图分别是纯化对β-类淀粉蛋白特异单抗的scFv之SDS-PAGE与ELISA分析结果。在 96孔ELISA盘(Greiner Bio-one)上分别涂覆5μg/ml的TfR1胞外域与5μg/ml的β-类淀粉蛋白。利用HRP标记的蛋白L以1：5000的比例来侦测纯化scFv。
ELISA分析结果显示每一种纯化scFv蛋白都可和其各别抗原(TfR1 胞外域或β-类淀粉蛋白)特异地结合，以上分析单独使用HRP标记的蛋白L作为阴性对照组。
实验例15：构建与选择对人类CD32a胞外域特异的噬菌体-呈现scFv
经双方协议，由中国台湾地区“中央研究院” 基因体研究中心(中国台湾，台北)杨安绥博士研究室取得带有对人类CD32a胞外域特异的scFv的噬菌体株。GH2 scFv抗体库的框架序列(framework sequence)衍生自G6抗-VEGF Fab(蛋白库编码： 2FJG)，将其选殖到噬质体载体pCANTAB5E(GE Healthcare)的限制位SfiI与NotI 间，上述噬质体载体带有胺苄青霉素(ampicillin)抗性基因、lacZ启动子、有助于将scFv片段分泌至培养上清液中的pelB引导序列(leader sequence)、用于侦测的 E-标签。基于寡核苷定点突变(oligonucleotide-directed mutagenesis)技术将scFv模板的VH与VL域多样化；将每一可变区域中的三个CDR同时多样化。使用带有超过109个选殖株的scFv抗体库在CD32a胞外域上进行筛选。
在Maxisorp 96孔盘(Nunc)上涂覆重组CD32a蛋白(每孔涂覆1μg/100 μL PBS)，以淘选出抗CD32a抗体。简言之，在孔盘上涂覆人类CD32a时，可将涂覆溶液注入孔中，并在室温下摇晃2小时。之后在室温下，以阻隔缓冲液处理经CD32a涂覆的孔盘，阻隔缓冲液是以5％脱脂牛奶溶于PBST(带有0.1％tween-20 的磷酸延缓冲液)，处理时间1小时。将阻隔缓冲液中的重组噬菌体稀释到每毫升 8x1011菌落形成单位(colony-forming unit，CFU)的浓度后，加入经涂覆CD32a的孔盘中，并温和摇晃1小时。接着以PBST剧烈地清洗孔盘十次，再以PBS冲洗六次，以移除未特异结合的噬菌体。利用0.1M HCl/甘氨酸缓冲液(pH 2.2)来冲提结合的噬菌体，并立刻以2M三碱(Tris-base)缓冲液(pH 9.0)中和冲提液。利用大肠杆菌品系ER2738(OD600＝～0.6)在37℃下进行噬菌体感染，处理时间30分钟；利用胺苄青霉素处理30分钟，以移除未受感染的大肠杆菌。在胺苄青霉素处理后，加入带有康霉素(kanamycin)抗性的辅助噬菌体M13KO7继续培育1小时。从大肠杆菌培养物中选择可被辅助噬菌体拯救的噬菌体，将其在带有康霉素的环境中于 37℃下剧烈摇晃一晚，以扩增所选的噬菌体。在PEG/NaCl中使扩增的噬菌体析出，之后再重新悬浮于PBS中，以用于下一次的选择-扩增循环。重复上述选择- 扩增循环，以在CD32a胞外域上连续进行三次淘选。
经噬菌体感染的ER2738菌落盘于系列稀释后，计算其数目与噬菌体效价，以得到每一淘选回合后每毫升的输出效价(output titer/ml；CFU/ml)。经过三回合淘选后，噬菌体输出效价由1.6E+04CFU/孔提升了超过1000倍而达到 2.2E+07CFU/孔。第20A图显示每一回合的噬菌体输出/输入效价比。Y轴显示每一淘选回合的噬菌体输出/输入效价比。经过三回合的淘选后，阳性菌落的比例明显提升。相较于第一回合，第三回合的输出/输入效价比提高了100倍，而结合的菌落也逐渐成为抗体库中的优势族群。
在一般的选择程序中，于涂覆人类CD32a的ELISA孔盘上进行三回合的抗原淘选后，约有80％经结合的噬菌体粒子在ELISA分析中可特异地与所涂覆的CD32a结合。
实验例16：对人类CD32a胞外域特异的噬菌体-呈现scFv的单菌落 ELISA分析
大肠杆菌品系ER2738经单一菌落噬菌体感染后，分别获取了各别噬菌体的噬质体内的所选scFv基因；在深孔中加入2YT培养液(含16g/L胰化蛋白、 10g/L酵母抽出物以及5g/L NaCl；pH 7.0)以及100μg/ml胺苄青霉素，在37℃下摇晃，以将这些大肠杆菌培养到中对数期(mid-log phase)。在培养液的OD600达到1.0时，加入IPTG，使其最终浓度为1μg/ml。在剧烈摇晃、37℃下将孔盘培育一晚；其后，以4,000g在4℃下将孔盘离心15分钟。
利用ELISA来进行可溶性scFv结合试验。简言之，将Maxisorp 96- 孔盘(Nunc)涂覆CD32a胞外域(每孔0.5μg/100μl PBS)或人类转铁蛋白-1受体(作为阴性对照组)，在4℃下摇晃18小时。在以300μl的阻隔缓冲液处理1小时后，将100μl含可溶性scFv的上清液和100μl的阻隔缓冲液混合，而后将此混和物加入经涂覆的孔盘再处理1小时。将山羊抗-E-标签抗体(与HRP复合，1：4000，型录编号AB19400，Abcam)加入孔盘处理1小时。将TMB基质(每孔50μl)加入孔盘，并于加入1N HCl(每孔50μl)使反应停止后，测量在450nm下的吸光值。
在经过三轮淘选后，共选出192株噬菌体进行本实验例的分析。其中有12株scFv和CD32a结合后的OD450差异(differential of OD450)大于10，进一步定序编码这12株scFv的基因序列，并识别出6种不同的DNA序列。第20B图是 scFv株22D1的ELISA分析结果。scFv株22D1和人类CD32a结合的OD450为0.8，其氨基酸序列如序列编号：35所示。
实验例17：构建与选择对人类TfR1胞外域特异的噬菌体-呈现scFv
经双方协议，由中国台湾地区“中央研究院” 基因体研究中心(中国台湾，台北)杨安绥博士研究室取得带有对人类TfR1胞外域特异的scFv之噬菌体株。GH2 scFv 抗体库的框架序列衍生自G6抗-VEGF Fab(蛋白库编码：2FJG)，将其选殖到噬质体载体pCANTAB5E(GE Healthcare)的限制位SfiI与NotI间，上述噬质体载体带有胺苄青霉素抗性基因、lacZ启动子、有助于将scFv片段分泌至培养上清液中的 pelB引导序列、用于侦测的E-标签。基于寡核苷定点突变技术将scFv模板的VH与VL域多样化；将每一可变区域中的三个CDR同时多样化。使用带有超过109个选殖株的scFv抗体库在TfR1胞外域上进行筛选。
芬戈莫德系购自Biotang Inc.(Lexington,USA)，而芬戈莫德磷酸盐则是购自KM3Scientific Corporation(中国台湾，新北市)。使芬戈莫德分子的NH2基和同型双功(homo-bifunctional)交联物NHS-PEG5-NHS反应，如反应式13所示。将芬戈莫德和NHS-PEG5-NHS各自溶于100％DMSO中，两者的最终浓度分别是 10mM与250mM。将6％(v/v)的碱性磷酸钠缓冲液(pH12.7)加入芬戈莫德溶液中并培育10分钟，以活化芬戈莫德的NH2基。将NHS-PEG5-NHS交联物加入至溶解的芬戈莫德溶液中，最终浓度30mM(比起10mM的芬戈莫德溶液，莫耳数过量3倍)。将反应混合物在室温下培育3小时。
在Maxisorp 96孔盘(Nunc)上涂覆重组TfR1蛋白(每孔涂覆1μg/100 μL PBS)，以淘选出抗TfR1抗体。简言之，在孔盘上涂覆人类TfR1时，可将涂覆溶液注入孔中，并在室温下摇晃2小时。之后在室温下，以阻隔缓冲液处理经 TfR1涂覆的孔盘，阻隔缓冲液是以5％脱脂牛奶溶于PBST(带有0.1％tween-20的磷酸延缓冲液)，处理时间1小时。将阻隔缓冲液中的重组噬菌体稀释到8x1011 CFU/mL的浓度后，加入经涂覆TfR1的孔盘中，并温和摇晃1小时。接着以PBST 剧烈地清洗孔盘十次，再以PBS冲洗六次，以移除未特异结合的噬菌体。利用0.1M HCl/甘氨酸缓冲液(pH 2.2)来冲提结合的噬菌体，并立刻以2M三碱(Tris-base)缓冲液(pH 9.0)中和冲提液。利用大肠杆菌品系ER2738(OD600＝～0.6)在37℃下进行噬菌体感染，处理时间30分钟；利用胺苄青霉素处理30分钟，以移除未受感染的大肠杆菌。在胺苄青霉素处理后，加入带有康霉素抗性的辅助噬菌体M13KO7 继续培育1小时。从大肠杆菌培养物中选择可被辅助噬菌体拯救的噬菌体，将其在带有康霉素的环境中于37℃下剧烈摇晃一晚，以扩增所选的噬菌体。在 PEG/NaCl中使扩增的噬菌体析出，之后再重新悬浮于PBS中，以用于下一次的选择-扩增循环。重复上述选择-扩增循环，以在TfR1胞外域上连续进行三次淘选。
经噬菌体感染的ER2738菌落盘于系列稀释后，计算其数目与噬菌体效价，以得到每一淘选回合后每毫升的输出效价(output titer/ml；CFU/ml)。经过三回合淘选后，噬菌体输出效价由3.74E+03CFU/孔提升了超过1万倍而达到 1.5E+08CFU/孔。第21A图显示每一回合的噬菌体输出/输入效价比。Y轴显示每一淘选回合的噬菌体输出/输入效价比。经过三回合的淘选后，阳性菌落的比例明显提升。相较于第一回合，第三回合的输出/输入效价比提高了1万倍，而结合的菌落也逐渐成为抗体库中的优势族群。
在一般的选择程序中，于涂覆人类TfR1的ELISA孔盘上进行三回合的抗原淘选后，约有80％与TfR1结合的噬菌体粒子在ELISA分析中可特异地与所涂覆的TfR1结合。
实验例18：对人类TfR1胞外域特异的噬菌体-呈现scFv的单菌落 ELISA分析
大肠杆菌品系ER2738经单一菌落噬菌体感染后，分别获取了各别噬菌体的噬质体内的所选scFv基因；在深孔中加入2YT培养液(含16g/L胰化蛋白、 10g/L酵母抽出物以及5g/L NaCl；pH 7.0)以及100μg/ml胺苄青霉素，在37℃下摇晃，以将这些大肠杆菌培养到中对数期(mid-log phase)。在培养液的OD600达到1.0时，加入IPTG，使其最终浓度为1μg/ml。在剧烈摇晃、37℃下将孔盘培育一晚；其后，以4,000g在4℃下将孔盘离心15分钟。
利用ELISA来进行可溶性scFv结合试验。简言之，将Maxisorp 96- 孔盘(Nunc)涂覆TfR1胞外域(每孔0.5μg/100μl PBS)或CD16b(作为阴性对照组)，在4℃下摇晃18小时。在以300μl的阻隔缓冲液处理1小时后，将100μl含可溶性scFv的上清液和100μl的阻隔缓冲液混合，而后将此混和物加入经涂覆的孔盘再处理1小时。将山羊抗-E-标签抗体(与HRP复合，1：4000，型录编号AB19400， Abcam)加入孔盘处理1小时。将TMB基质(每孔50μl)加入孔盘，并于加入1N HCl (每孔50μl)使反应停止后，测量在450nm下的吸光值。
在经过三轮淘选后，共选出192株噬菌体进行本实验例的分析。其中有23株scFv和TfR1结合后的OD450差异大于10，进一步定序编码这23株scFv 的基因序列，并识别出16种不同的DNA序列。第21B图是scFv株12A1的ELISA 分析结果。scFv株12A1和人类TfR1结合的OD450为1.7，其氨基酸序列如序列编号：36所示。
实验例19：制备TCO-对CD32a胞外域特异的scFv复合物
如上文实验例所示，合成编码序列编号：32蛋白质的DNA序列并使其表现。将抗-CD32a单抗的纯化scFv和5mM二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT) 在室温下以温和摇晃培育4小时，以使位于C-端的半胱氨酸残基还原，以利与 Mal-PEG3-TCO(Conju-probe,Inc.)复合。利用NAP-10Sephadex G-25管柱，将还原scFv蛋白的缓冲液置换为磷酸钠缓冲液(100mM磷酸钠(pH7.0)、50mM NaCl 与5mM EDTA)。在还原反应与缓冲液交换后，使莫耳比10：1([Mal-PEG3-TCO]： [scFv])的反应物于室温下反应一晚以进行复合。利用去盐管柱移除过量的交联物，并分析TCO-scFv复合产物。
MALDI-TOF质谱分析结果指出TCO-对CD32a特异的scFv复合物的分子量为27,337道耳顿。用12％SDS-PAGE以考玛斯(Coomassie)染色来分析TCO- 对CD32a特异的scFv复合物的纯度。第22A图与第22B图分别是TCO-对CD32a 特异的scFv复合物的ELISA与质谱分析结果，并以未修饰的对CD32a特异的scFv 作为阳性对照组。ELISA结果显示，TCO-对CD32a特异的scFv复合物可结合至重组人类CD32a胞外域。
实验例20：制备四嗪-对TfR1胞外域特异的scFv复合物
如上文实验例所示，合成编码序列编号：33蛋白质的DNA序列并使其表现。将抗-TfR1单的纯化scFv和5mM二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)在室温下以温和摇晃培育4小时，以使位于C-端的半胱氨酸残基还原，以利与 Mal-PEG4-四嗪(Conju-probe,Inc.)复合。利用NAP-10Sephadex G-25管柱，将还原scFv蛋白的缓冲液置换为磷酸钠缓冲液(100mM磷酸钠(pH7.0)、50mM NaCl 与5mM EDTA)。在还原反应与缓冲液交换后，使莫耳比10：1([Mal-PEG4-四嗪]： [scFv])的反应物于室温下反应一晚以进行复合。利用去盐管柱移除过量的交联物，并分析四嗪-scFv复合产物。
MALDI-TOF质谱分析结果指出四嗪-对TfR1特异的scFv复合物的分子量为27,086道耳顿。用12％SDS-PAGE以考玛斯(Coomassie)染色来分析四嗪- 对TfR1特异的scFv复合物的纯度。第23A图与第23B图分别是四嗪-对TfR1特异的scFv复合物的ELISA与质谱分析结果，并以未修饰的对TfR1特异的scFv 作为阳性对照组。ELISA结果显示，四嗪-对TfR1特异的scFv复合物可结合至重组人类TfR1胞外域。
实验例21：将三个对内毒素特异的scFv复合至四嗪-多肽1核的三个顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂
本实验例揭示可将三个scFv复合至四嗪-多肽1核上的三个PEG12- 顺丁烯二酰亚胺连接臂。在与带有三条PEG12-顺丁烯二酰亚胺连接臂的四嗪-多肽 1核复合之前，将对内毒素特异的scFv和DTT以莫耳比2：1([DTT]：[scFv])的比例在25℃下以温和摇晃培育4小时，以使位于C-端的半胱氨酸残基还原。接着，利用NAP-10Sephadex G-25管柱(GEHealthcare)，将经还原的对内毒素特异的scFv的缓冲液置换为顺丁烯二酰亚胺-SH耦合反应缓冲液(100mM磷酸钠 (pH7.0)、50mM NaCl与5mM EDTA)。在还原反应与缓冲液交换后，使莫耳比1： 4([接合物]：[蛋白])的反应物于4℃下反应一晚以使其与带有三条顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂的四嗪-多肽1核复合。
利用粒径筛析管柱S75，将与三个对内毒素特异的scFv复合的PEG12- 顺丁烯二酰亚胺-四嗪-多肽1复合物和游离的scFv、游离的PEG12-顺丁烯二酰亚胺-四嗪-多肽1复合物以及与一个或两个对内毒素特异的scFv复合的PEG12-顺丁烯二酰亚胺-四嗪-多肽1复合物互相分离。
第24A图是所合成的标的接合单元的FPLC溶析曲线图；滞留体积 (retentionvolume)为9.5毫升；所述合成的标的接合单元是由带有一个自由四嗪官能基和一组三个对内毒素特异的scFv(作为靶向组件)的接合单元所组成。产物(即，带有一个自由四嗪官能基和一组三个对内毒素特异的scFv的PEG12-顺丁烯二酰亚胺-四嗪-多肽1复合物)纯化于溶析份(elution fraction)中，以10％SDS-PAGE分离后，此产物为第24B图电泳条4箭头所指处。
实验例22：标的接合单元的MALDI-TOF分析；此标的接合单元带有连接于四嗪-多肽1核上三条顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂的三个对内毒素特异的scFv
将带有连接于四嗪-多肽1核上三条顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂的三个对内毒素特异的scFv的标的接合单元样本进行MALDI-TOF分析。实验所得的中位数分子量和三个对内毒素特异的scFv与带有三条顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂的四嗪-多肽1核耦合产物的理论中位数分子量相符。根据第24C图所示的质谱分析结果，此一标的接合单元的中位数分子量为81,727道耳顿。
如下图所示，此处合成的标的接合单元带有一个自由四嗪官能基和一组三个对内毒素特异的scFv作为靶向组件。
Figure BDA0001474511850000901
实验例23：制备由四嗪-多肽1核和带有三个对RSV F蛋白特异的 scFv组成的标的接合单元
利用上文实验例所述的方法，将scFv与接合单元复合并于纯化后进一步分析。
第25图为所述合成标的接合单元的质谱分析结果，此接合单元包含一个自由四嗪官能基和一组三个scFv对RSV F蛋白特异的scFv(如下图所示)。如第25图所示，此一标的接合单元的分子量为81,978道耳顿。
Figure BDA0001474511850000902
实验例24：将三个对β-类淀粉蛋白特异的scFv耦合至带有三条顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂的TCO-多肽1核
本实验例揭示可将三个scFv复合至TCO-多肽1核上的三个顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂。在与带有三条顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂的TCO-多肽1 核复合之前，将对β-类淀粉蛋白特异的scFv和DTT以莫耳比2：1([DTT]：[scFv]) 的比例在室温下以温和摇晃培育4小时，以使位于C-端的半胱氨酸残基还原。接着，利用NAP-10Sephadex G-25管柱(GEHealthcare)，将经还原的对β-类淀粉蛋白特异的scFv的缓冲液置换为顺丁烯二酰亚胺-SH耦合反应缓冲液(100mM磷酸钠(pH7.0)、50mM NaCl与5mM EDTA)。在还原反应与缓冲液交换后，使莫耳比 1：4([接合物]：[蛋白])的反应物于4℃下反应一晚以使其与带有三条顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂的TCO-多肽1核复合。
将前述实验例的反应混合物调整至pH 5.0，之后加入至以(5mM EDTA与50mM醋酸钠(pH 5.0)预平衡的(pre-equilibrated)阳离子交换管柱SP Sepharose FF(GEHealthcare)。利用0至500mM的氯化钠线性梯度在每分钟0.5 毫升的流率、100分钟的条件下，使和三个对β-类淀粉蛋白特异的scFv复合的顺丁烯二酰亚胺-PEG12-TCO-多肽1复合物析出。利用阳离子交换管柱SP Sepharose FF，将与三个对β-类淀粉蛋白特异的scFv复合的顺丁烯二酰亚胺-PEG12-TCO-多肽1复合物和游离的scFv、游离的顺丁烯二酰亚胺-PEG12-TCO-多肽1复合物以及与一个或两个对β-类淀粉蛋白特异的scFv复合的顺丁烯二酰亚胺-PEG12-TCO- 多肽1复合物互相分离。浓缩纯化产物，即与三个对β-类淀粉蛋白特异的scFv复合的顺丁烯二酰亚胺-PEG12-TCO-多肽1复合物，并将其缓冲液置换为链接反应缓冲液(100mM磷酸钾，pH 7.0)。
第26A图是在阳离子交换管柱SP Sepharose FF上进行FPLC后，所合成的效应接合单元的溶析曲线图；所述合成的效应接合单元是由带有一个自由 TCO官能基和一组三个对β-类淀粉蛋白特异的scFv(作为效应组件)的接合单元所组成。第26A图所示的#1与#2分别代表与两个和三个对β-类淀粉蛋白特异的scFv 复合的顺丁烯二酰亚胺-PEG12-TCO-多肽1复合物的析出峰。纯化产物(即，带有一个自由TCO官能基和一组三个对β-类淀粉蛋白特异的scFv的顺丁烯二酰亚胺 -PEG12-TCO-多肽1复合物)，以8％SDS-PAGE分离后，此产物为第26B图电泳条所示。
实验例25：效应接合单元的MALDI-TOF分析；此效应接合单元带有连接于TCO-多肽1核上三条顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂的三个对β-类淀粉蛋白特异的scFv
将带有连接于TCO-多肽1核上三条顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂的三个对β-类淀粉蛋白特异的scFv的效应接合单元样本进行MALDI-TOF分析。实验所得的中位数分子量和三个对β-类淀粉蛋白特异的scFv与带有三条顺丁烯二酰亚胺-PEG12连接臂的TCO-多肽1核耦合产物的理论中位数分子量相符。根据第 26C图所示的质谱分析结果，此一效应接合单元的中位数分子量为87,160道耳顿。
如下图所示，此处合成的效应接合单元带有一个自由TCO官能基和一组三个对人类β-类淀粉蛋白特异的scFv作为靶向组件。
Figure BDA0001474511850000921
实验例26：制备分子构建体；此分子构建体带有作为靶向组件的三个对RSV F蛋白特异的scFv以及作为效应组件的一个对CD32a胞外域特异的 scFv
于本实验例中，使上述实验例所制得之标的接合单元的四嗪基和 TCO-对CD32a胞外域特异的scFv复合物的TCO基进行iEDDA反应，而将两者接合。具体来说，所述标的接合单元带有三个对RSV F蛋白特异的scFv以及一个自由四嗪基。
根据制造商(Jena Bioscience GmbH,Jena,Germany)的说明进行四嗪 -TCO接合。简言之，将100μl的标的接合单元(0.3mg/ml)加入含有效应组件的溶液中，两者的莫耳比为1：1.2([四嗪]：[TCO])。在室温下将反应混合物培育1小时。对产物进行质谱分析，结果显示产物的分子量为113,036道耳顿(第27A图)。
此一产物(如下所示)是一种单一接合单元分子构建体，其具有三个对 RSV F蛋白特异的scFv(作为靶向组件)以及一个对CD32a胞外域特异的scFv(作为效应组件)。
Figure BDA0001474511850000931
实验例27：制备分子构建体；此分子构建体带有作为靶向组件的三个对内毒素特异的scFv以及作为效应组件的一个对CD32a胞外域特异的scFv
使上述实验例所制得之标的接合单元的四嗪基和TCO-对CD32a胞外域特异的scFv复合物的TCO基进行iEDDA反应，而将两者接合。
根据上述实验例所述的方式进行四嗪-TCO接合。所得产物(如下所示) 是一种单一接合单元分子构建体，其具有三个对内毒素特异的scFv(作为靶向组件)以及一个对CD32a胞外域特异的scFv(作为效应组件)。第27B图所示的质谱分析结果显示此一分子构建体的分子量为113,761道耳顿。
Figure BDA0001474511850000932
实验例28：制备分子构建体；此分子构建体带有作为靶向组件的一个对TfR1胞外域特异的scFv以及作为效应组件的三个对β-类淀粉蛋白特异的 scFv
使上述实验例所制得之标的接合单元的TCO和四嗪-对TfR1胞外域特异的scFv复合物的四嗪基进行iEDDA反应，而将两者接合。
根据制造商(Jena Bioscience GmbH,Jena,Germany)的说明进行四嗪 -TCO接合。简言之，将12.6μl的靶向组件(5.65mg/ml)加入含有带有效应组件的接合单元溶液中，两者的莫耳比为10：1([四嗪]：[TCO])。在室温下将反应混合物培育3小时。对产物进行质谱分析，结果显示产物的分子量为114,248道耳顿(第 27C图)。
此一产物(如下所示)是一种单一接合单元分子构建体，其具有一个对 TfR1胞外域特异的scFv(作为靶向组件)以及三个对β-类淀粉蛋白特异的scFv(作为效应组件)。
Figure BDA0001474511850000941
实验例29：制备联合接合物分子构建体；此联合接合物分子构建体带有作为靶向组件的一个对TfR1胞外域特异的scFv以及作为效应组件的五个芬戈莫德分子
于本实验例中，建构带有一个对TfR1胞外域特异的scFv与五个芬戈莫德分子构成的载药束之子构建体。建构分子构建体时，运用TCO-四嗪基间的 iEDDA反应。根据制造商(Jena Bioscience GmbH,Jena,Germany)的说明进行四嗪 -TCO接合。简言之，将227μl的效应接合单元(0126μmole)加入含有带有靶向组件(一个对TfR1胞外域特异的scFv)的溶液中，两者的莫耳比为5：1([TCO]：[四嗪])。在室温下将反应混合物培育3小时。
此一产物(如下所示)是一种分子构建体，其具有一个对TfR1胞外域特异的scFv以及一个带有五个芬戈莫德分子的载药束。第28A图与第28B图分别是所述分子构建体的SDS-PAGE与质谱分析结果。在第28A图中，箭头#1所指处为由一个对TfR1胞外域特异的scFv和一个有五个芬戈莫德分子的载药束所组成的分子构建体；而箭头#2则是未复合的对TfR1胞外域特异的scFv。
质谱分析结果显示，由一个对TfR1胞外域特异的scFv和一个有五个芬戈莫德分子的载药束所组成的分子构建体的分子量为32,105道耳顿。
Figure BDA0001474511850000951
实验例30：芬戈莫德透过连接臂与多肽核复合后的生物活性分析
利用上述实验例中合成的经修饰芬戈莫德分子(NHS-PEG5-芬戈莫德复合物以及带有一个自由TCO官能基与五个芬戈莫德分子的载药束)。利用分离自人类周边血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，简称PBMC)的原代B 细胞(primary B cell)进行S1P引发的转移盘移行分析，以探究三种化合物的生物活性。
于制备人类初代B细胞时，利用B细胞分离套组(Myltenyi Biotech) 由人类PBMC分离出人类B细胞。之后，将分离的B细胞播于15公分的培养盘上，并维持于添加10％胎牛血清(Gibco)与20ng/ml IL2(Peprotech Inc.)的IMDM 培养基中。
第29A图为所分离的可表现S1P1的人类B细胞之染色分析，将2x105个B细胞和10μg/ml的抗-S1P1受体抗体(AbD Serotec)培育于含1％BSA的PBS 中。冲洗细胞后，以FITC-复合山羊抗-小鼠IgG(以1：200的比例稀释于PBS/BSA 中)在冰上于黑暗中培育30分钟。接着以FACS(FACSCanto II,BD Biosciences)分析细胞。
于进行趋化性分析时，将100μl经保持的人类B细胞(4x105细胞)转移到1.5毫升的微量离心管中，于其中分别加入芬戈莫德、芬戈莫德磷酸盐、 NHS-PEG5-芬戈莫德复合物或带有一个自由TCO官能基与五个芬戈莫德分子的载药束，最终浓度为1与10μM，并在37℃下反应4小时。接着，将100μl经处理的B细胞加入至设有5μm孔聚酯膜嵌套(Corning)的6.5毫升转移盘之上层空间，而转移盘的下层空间含有500μl的IMDM培养基且含有最终浓度10nM的神经鞘胺醇-1-磷酸盐分子。3小时后，收集下层空间中的移行细胞，以台酚蓝进一步染色后，利用血球计计算数目。每一次测量时，比迁移率(specific migration)的计算方式如下：[(下层细胞数目)/(下层与上层细胞总数)x 100]-(在0nM贴附时的细胞迁移百分比)]。第29B图摘要整理了比迁移细胞百分比。
第29B图为NHS-PEG5-芬戈莫德复合物与带有一个自由TCO官能基与五个芬戈莫德分子的载药束之生物活性分析结果。此一结果显示，芬戈莫德和连接臂复合后，在阻挡B细胞移行的生物活性与未经修饰的芬戈莫德相近。
实验例31：构建编码有对RSV蛋白F特异的scFv与对CD32a胞外域特异的scFv之双链IgG1.Fc融合蛋白的基因片段
藉由融合两个scFv来建构scFv1-CH2-CH3-scFv2(人类γ1)重组链；其中透过一个可挠性铰链区(flexible hinge region)将对RSV蛋白F特异的scFv连接到 IgG1.Fc的CH2域N-端；并透过可挠性接合物((GGGGS)3)将对CD32a胞外域特异的 scFv连接到CH3域C-端。
上述两个scFv的方向都是VL-接合物-VH。这两个scFv中各别的VL与 VH是透过亲水性接合物(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)而连接。IgG1.Fc融合蛋白分子构建体中重组链的序列如序列编号：37所示。
上述双链Fc-融合分子构建体(scFvαRSV)-hIgG1.Fc-(scFvαCD32a) 的构形如下图所示。
Figure BDA0001474511850000961
实验例32：重组双链(scFvαRSV)-hIgG1.Fc-(scFvαCD32)融合蛋白的表现与纯化
在本实验例中，将编码的基因序列置于pcDNA3表现匣中。将 Expi293F细胞以每毫升2.0×106个活细胞的密度播于Expi293F表现培养基中，并维持18至24小时后进行转染，以确保进行转染时细胞处于分裂状态。进行转染时，将带有7.5×108个细胞的255毫升培养基置于2-L艾氏烧瓶中，并加入 ExpiFectamineTM 293转染试剂。于转染后，将转染细胞在37℃下以定轨摇动器(125 rpm)培育16至18小时；之后在烧瓶中加入ExpiFectamineTM 293转染强化剂1与强化剂2，并继续培育7天。收集培养上清液，并使用蛋白A亲和力层析法纯化培养基中的重组双链(scFvαRSV)-hIgG1.Fc-(scFvαCD32a)融合蛋白。将缓冲液置换为PBS，之后利用12％SDS-PAGE测定(scFvαRSV)-hIgG1.Fc-(scFvαCD32a) 蛋白的浓度并进行分析；参见第30A图。在约85kDa的位置观察到含Fc-融合分子构建体的主要电泳条，其大小与预期相符。
实验例33：重组双链(scFvαRSV)-hIgG1.Fc-(scFvαCD32)融合蛋白结合力的ELISA分析
透过ELISA来分析重组双链(scFvαRSV)-hIgG1.Fc-(scFvαCD32a)融合蛋白对RSV蛋白F与CD32a胞外域的结合能力。以2μg/mL的RSV蛋白F(ino biological Inc.)涂覆在ELISA盘上。利用HRP标记的山羊抗人类IgG1.Fc来侦测重组双链(scFvαRSV)-hIgG1.Fc-(scFvαCD32a)融合蛋白。第30B图的ELISA结果显示，重组双链(scFvαRSV)-hIgG1.Fc-(scFvαCD32a)融合蛋白可和RSV蛋白F 结合；此处以阿达木单抗scFv为对照组scFv。
第30C图是重组Fc融合蛋白对CD32a胞外域的结合活性。以5μg/mL 的重组CD32a胞外域涂覆在ELISA盘上。利用HRP标记的山羊抗人类IgG1.Fc 来侦测重组双链(scFvαRSV)-hIgG1.Fc-(scFvαCD32a)融合蛋白。第30C图的 ELISA结果显示，重组双链(scFvαRSV)-hIgG1.Fc-(scFvαCD32a)融合蛋白可和 CD32a胞外域结合；此处以重组双链(scFvα内毒素)-IgG1.Fc蛋白为对照组scFv。
实验例34：制备带有对内毒素特异的scFv与对CD32a胞外域特异的scFv之双链IgG1.Fc融合蛋白
藉由融合两个scFv来建构scFv1-CH2-CH3-scFv2(人类γ1)重组链；其中透过一个可挠性铰链区(flexible hinge region)将对内毒素特异的scFv连接到 IgG1.Fc的CH2域N-端；并透过可挠性接合物((GGGGS)3)将对CD32a胞外域特异的 scFv连接到CH3域C-端。
上述两个scFv的方向都是VL-接合物-VH。这两个scFv中各别的VL与 VH是透过亲水性接合物(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)而连接。
IgG1.Fc融合蛋白分子构建体中重组链的序列如序列编号：38所示。利用上文实验例所述的方法，在Expi293F细胞中表现所建构的基因并纯化所表现的融合蛋白。利用SDS-PAGE与ELISA分析来定性所制备的新构建体。第31A图的 SDA-PAGE结果显示新构建体的重组链大小约为85kDa，和预期大小相符。
第31B图的ELISA结果则显示上述重组双链(scFvα内毒素)-(scFvα CD32a)-hIgG1.Fc对大肠杆菌人类LPS 0111:B4(Sigma Aldrich)有结合活性。以50 μg/ml的聚-L-赖氨酸涂覆ELISA盘。接着，进一步以10μg/ml的大肠杆菌人类LPS 0111:B4涂覆于上述覆有聚-L-赖氨酸的ELISA盘上。利用HRP标记的山羊抗人类 IgG1.Fc来侦测重组融合蛋白。第31C图显示，重组Fc融合蛋白可和CD32a胞外域结合。
上述双链Fc-融合分子构建体(scFvα内毒素)-hIgG1.Fc-(scFvαCD32a) 的构形如下图所示。
Figure BDA0001474511850000981
实验例35：构建编码有对干扰素-β-1a特异的scFv与对TfR1胞外域特异的scFv之双链IgG4.Fc融合蛋白的基因片段
在重组链中配置(干扰素-β-1a)-CH2-CH3-(scFvαTfR1)(人类γ4)以制备双链IgG.Fc融合蛋白。透过连接物(GGGGSGGGASGGS)将干扰素-β-1a的C-端融合到CH2的N-端。透过可挠性连接物((GGGGS)3)将对TfR1受体胞外域对特异的 scFv连接到CH3域的C-端。
上述scFv(对TfR1受体胞外域对特异的scFv)的方向是VL-接合物-VH。此scFv中的VL与VH是透过亲水性接合物(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)而连接。 IgG4.Fc融合蛋白分子构建体中重组链的序列如序列编号：39所示。
上述双链(干扰素-β-1a)-IgG4.Fc-(scFvαTfR1)分子构建体的构形如下图所示。
Figure BDA0001474511850000991
实验例36：重组双链(干扰素-β-1a)-hIgG4.Fc-(scFvαTfR1)融合蛋白的表现与纯化
在本实验例中，将编码的基因序列置于pcDNA3表现匣中。将 Expi293F细胞以每毫升2.0×106个活细胞的密度播于Expi293F表现培养基中，并维持18至24小时后进行转染，以确保进行转染时细胞处于分裂状态。进行转染时，将带有7.5×108个细胞的255毫升培养基置于2-L艾氏烧瓶中，并加入 ExpiFectamineTM 293转染试剂。于转染后，将转染细胞在37℃下以定轨摇动器(125 rpm)培育16至18小时；之后在烧瓶中加入ExpiFectamineTM 293转染强化剂1与强化剂2，并继续培育7天。收集培养上清液，并使用蛋白A亲和力层析法纯化培养基中的重组双链(干扰素-β-1a)-hIgG4.Fc-(scFvαTfR1)融合蛋白。将缓冲液置换为PBS，之后利用8％SDS-PAGE测定(干扰素-β-1a)-hIgG4.Fc-(scFvαTfR1)蛋白的浓度并进行分析；参见第32A图。在约80kDa的位置观察到含Fc-融合分子构建体的主要电泳条，其大小与预期相符。
实验例37：利用ELISA和流式细胞仪来分析重组双链(干扰素 -β-1a)-hIgG1.Fc-(scFvαTfR1)融合蛋白的结合力
透过ELISA来分析重组(干扰素-β-1a)-hIgG4.Fc-(scFvαTfR1)的结合能力。在96孔盘上涂覆5μg/mL的重组(干扰素-β-1a)-hIgG4.Fc-(scFvαTfR1)蛋白，每孔100μl。以对TfR1胞外域特异的scFv作为阴性对照组。利用HRP标记的兔抗人类干扰素-β多株抗体(Santa Cruz Biotechnology,Dallas,USA)来侦测重组双链 (干扰素-β-1a)-hIgG1.Fc-(scFvαTfR1)。接着，加入50μl的TMB受质以进行显色。加入50μl的1M HCl使反应停止。利用盘式仪测量450nm下的吸光值。每一直方条的数据是两次试验的平均OD450值。
第32B图的ELISA结果显示，(干扰素-β-1a)-hIgG4.Fc-(scFvαTfR1) 融合蛋白可特异地和重组TfR1胞外域结合。
实验例38：制备带有对整合素α4特异的scFv与对TfR1胞外域特异的scFv的双链IgG4.Fc融合蛋白
对整合素α4特异的scFv的VL与VH来自那他珠单抗。在重组链中配置 (scFvα整合素α4)-CH2-CH3-(scFvαTfR1)(人类γ4)以制备双链IgG.Fc融合蛋白。透过连接物(GGGGSGGGASGGS)将对整合素α4特异的scFv融合到CH2的N-端。透过可挠性连接物((GGGGS)3)将对TfR1受体胞外域对特异的scFv连接到CH3域的C- 端。第33A图所示的8％SDS-PAGE分析结果显示，此一新颖构建体之重组链大小约为85kDa(如箭头所指)，与预期大小相符
上述两个scFv的方向都是VL-接合物-VH。这两个scFv中各别的VL与 VH是透过亲水性接合物(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)而连接。IgG4.Fc融合蛋白分子构建体中重组链的序列如序列编号：40所示。
上述双链(scFvα整合素α4)-IgG4.Fc-(scFvαTfR1)分子构建体的构形如下图所示。
Figure BDA0001474511850001011
为了研究重组双链(scFvα整合素α4)-IgG4.Fc-(scFvαTfR1)蛋白对表现整合素α4的Jurkat T细胞的结合能力，利用流式细胞分析技术来进行细胞结合分析。
将1x106个Jurkat T细胞以1x105的密度维持在添加10％FBS的 RPMI1640培养基中。将细胞置于37℃含5％CO2的加湿腔室中。以结合缓冲液 (PBS添加0.1％FBS、2mM EDTA与and 20ng/ml NaN3)将1x106个Jurkat T细胞冲洗两次。将10μg/ml的Human BD FcblockTM(BD Biosciences,San Jose,US)加入冲洗后的Jurkat T细胞，以阻断Fc受体介导的Ig Fc结合。冲洗细胞后将其10 μg/ml的重组(scFvα整合素α4)-IgG4.Fc-(scFvαTfR1)蛋白在冰上培育15分钟，并以重组双链(干扰素-β-1a)-IgG4.Fc-(scFvαTfR1)作为阴性对照组。再次冲洗细胞，并和FITC-复合山羊抗-人IgG.Fc(Caltag,Buckingham,UK)(以阻断缓冲液稀释1： 200倍)在冰上于黑暗中培育15分钟。利用FACSCanto II流式细胞仪(BDBiosciences)来分析染色的细胞。
第33B图是重组双链(scFvα整合素α4)-IgG4.Fc-(scFvαTfR1)蛋白在表现整合素α4的Jurkat T细胞上的细胞染色分析结果。构建体实质上可正向地与 Jurkat T细胞结合。
实验例39：带有对内毒素特异的scFv与对CD32a胞外域特异的scFv 之双链IgG1.Fc在似巨噬细胞U937细胞上的生物活性分析
为了测试重组双链(scFvα内毒素)-hIgG1.Fc-(scFvαCD32a)融合蛋白抑制TNF-α分泌的效果，进行ELISA以决定似巨噬菌细胞U937细胞上分泌至上清液中的分泌性TNF-α量。
将U937细胞维持在RPMI1640培养基中(添加10％FBS(Gibco)与100 U/ml盘尼西林-链霉素(Gibco))，细胞密度为每毫升3x105至2x106个。将细胞置于 37℃含5％CO2的加湿腔室中。将每毫升1x106个U937细胞和10ng/ml的13乙酸-12肉豆蔻酸佛波醇酯(phorbol12-myristate 13-acetate，简称PMA，购自Sigma Aldrich)一起培育，以促使U937细胞分化为似巨噬细胞。经过48小时后，移除未贴附细胞，并于冲洗贴附细胞后将其播于96孔盘上。
在分析前一天，以每孔5x104个细胞的密度将分化的U937细胞播于 96孔盘上。利用以下成分刺激细胞：单独给予1μg/ml的E.coli LPS 0111:B4(Sigma Aldrich)，或LPS与10μg/ml之(scFvα内毒素)-hIgG1Fc、15μg/ml之(scFvα内毒素)-hIgG1Fc-(scFvαCD32a)或2.5μg/ml之抗-CD32a scFv的预混物。上述刺激进行两小时候，收集上清液。利用商用ELISA套组(Biolegend)测量TNF-α产量。
利用来自R&D Systems的ELISA套组测量U937上清液中的TNF-α含量。以4μg/mL的捕获抗体(于PBS中)在4℃下将ELISA盘(Greiner Bio-One) 处理一夜，以使蛋白涂覆于孔盘上。随后将其置于0.5％的PBS中1小时，以使反应终止，再以稀释的培养上清液培育2小时。使用400ng/mL的生物素-标记侦测抗体，随后加入卵白素-HRP，以侦测结合的TNF-α。使用TMB基质(Clinical Science Products)进行显色反应，之后加入1N HCl使反应停止。于450nm下测量孔盘的吸光值。利用制造商提供的标准蛋白稀释液得到四-参数逻辑拟和标准曲线 (four-parameter logistic fit standard curves)，再以外插法决定TNF-α浓度。
第34图的数据显示，相较于对照组抗体双链(scFvα内毒素)-hIgG1Fc 蛋白与抗-CD32a scFv或单独使用培养基，重组双链(scFvα内毒素)-hIgG1Fc-(scFv αCD32a)可显著降低由E.coli LPS 0111:B4刺激的TNF-α分泌。
当可理解，上文实施方式的说明仅为例示，且本发明所属技术领域具有通常知识者可对其进行各种修饰。上文的说明、实验例与数据完整地说明了本发明例示性实施方式的结构与用途。虽然上文实施方式中揭露了本发明的具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不悖离本发明之原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此本发明之保护范围当以附随申请专利范围所界定者为准。
序列表
<110> 免疫功坊股份有限公司(Immunwork Inc.)
<120> 具有靶向部分及效应部分的分子构建体及其应用
<130> P2919-PCT
<150> US 62/308,349
<151> 2016-03-16
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<151> 2016-01-18
<150> US 62/213,012
<151> 2015-09-01
<150> US 62/164,400
<151> 2015-05-20
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1
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Gly Gly Gly Gly Ser
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Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly
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Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser
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1 5 10 15
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<220>
<223> 多肽核-2
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Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys
1 5 10 15
Gly Ser Lys
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Cys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys
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Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys
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Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys
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<223> Xaa是高炔丙基甘氨酸
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<221> MOD_RES
<222> 1
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Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys
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Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys
1 5 10 15
Gly Ser Lys
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<223> Xaa是高炔丙基甘氨酸
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<221> MOD_RES
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Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys
1 5 10 15
Gly Ser Gly Ser Cys
20
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> MOD_RES
<222> 1
<223> ACETYLATION
<220>
<223> 多肽核-8
<220>
<221> MOD_RES
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<223> Xaa是具有2个EG单元的PEG化氨基酸
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Cys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys
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<213> 人工序列
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<221> MOD_RES
<222> 1
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<223> 多肽核-9
<220>
<221> MOD_RES
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<223> Xaa是具有6个EG单元的PEG化氨基酸
<400> 26
Cys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys
1 5 10
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<223> 5xdrug
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人转铁蛋白-1受体
<400> 28
Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro Gly Glu Asp Phe
1 5 10 15
Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys Arg Lys Leu Ser
20 25 30
Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Ser Thr Ile Lys Leu Leu Asn
35 40 45
Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln Lys Asp Glu Asn
50 55 60
Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe Lys Leu Ser Lys
65 70 75 80
Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val Lys Asp Ser Ala
85 90 95
Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg Leu Val Tyr Leu
100 105 110
Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys Ala Ala Thr Val
115 120 125
Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys Lys Asp Phe Glu
130 135 140
Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile Val Arg Ala Gly
145 150 155 160
Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu Ser Leu Asn Ala
165 170 175
Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe Pro Ile Val Asn
180 185 190
Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly Thr Gly Asp Pro
195 200 205
Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln Phe Pro Pro Ser
210 215 220
Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr Ile Ser Arg Ala
225 230 235 240
Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp Cys Pro Ser Asp
245 250 255
Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser Glu Ser Lys Asn
260 265 270
Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile Lys Ile Leu Asn
275 280 285
Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp His Tyr Val Val
290 295 300
Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala Ala Lys Ser Gly
305 310 315 320
Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met Phe Ser Asp Met
325 330 335
Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile Ile Phe Ala Ser
340 345 350
Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr Glu Trp Leu Glu
355 360 365
Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr Tyr Ile Asn Leu
370 375 380
Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val Ser Ala Ser Pro
385 390 395 400
Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn Val Lys His Pro
405 410 415
Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp Ala Ser Lys Val
420 425 430
Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe Leu Ala Tyr Ser
435 440 445
Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp Thr Asp Tyr Pro
450 455 460
Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu Ile Glu Arg Ile
465 470 475 480
Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu Val Ala Gly Gln
485 490 495
Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn Leu Asp Tyr Glu
500 505 510
Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp Leu Asn Gln Tyr
515 520 525
Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln Trp Leu Tyr Ser
530 535 540
Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu Thr Thr Asp Phe
545 550 555 560
Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys Lys Leu Asn Asp
565 570 575
Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro Tyr Val Ser Pro
580 585 590
Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser Gly Ser His Thr
595 600 605
Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys Gln Asn Asn Gly
610 615 620
Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala Leu Ala Thr Trp
625 630 635 640
Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp Val Trp Asp Ile
645 650 655
Asp Asn Glu Phe His His His His His His
660 665
<210> 29
<211> 192
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD32
<400> 29
Gln Ala Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp
1 5 10 15
Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala
20 25 30
Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu
35 40 45
Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn
50 55 60
Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp
65 70 75 80
Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro
85 90 95
His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser
100 105 110
Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys
115 120 125
Ser Gln Lys Phe Ser Arg Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala
130 135 140
Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr
145 150 155 160
Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser
165 170 175
Met Gly Ser Ser Ser Pro Met Gly Ile Ile His His His His His His
180 185 190
<210> 30
<211> 256
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗RSV mAb的scFv
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Cys Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Thr
115 120 125
Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr
130 135 140
Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Ser
145 150 155 160
Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala
165 170 175
Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
180 185 190
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Lys
195 200 205
Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys
245 250 255
<210> 31
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗内毒素mAb的scFv
<400> 31
Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ile Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Ile Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val
115 120 125
Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
130 135 140
Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met
145 150 155 160
Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu Ala Leu
165 170 175
Ile Arg Asn Lys Arg Asn Gly Asp Thr Ala Glu Tyr Ser Ala Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr Ser Arg Ser Ile Leu His
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Val Arg Gln Gly Arg Gly Tyr Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Cys
<210> 32
<211> 255
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD32a mAb的scFv
<400> 32
Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Ser Ala
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro His
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val
115 120 125
His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met
145 150 155 160
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val
165 170 175
Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Tyr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln
195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Asp Leu Gly Ala Ala Ala Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys
245 250 255
<210> 33
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗转铁蛋白-1受体mAb的scFv
<400> 33
Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ile Leu Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val
115 120 125
Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Ala Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Met
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr Trp Met
145 150 155 160
Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Leu Ile Gly Met
165 170 175
Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Val Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys Asp
180 185 190
Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln
195 200 205
Leu Asn Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Phe Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys
245 250
<210> 34
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗β-类淀粉蛋白巴匹珠单抗的scFv
<400> 34
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly
85 90 95
Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
130 135 140
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
145 150 155 160
Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Glu Trp Val Ala Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser
180 185 190
Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn
195 200 205
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
210 215 220
Tyr Tyr Cys Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Ser Cys
260
<210> 35
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 噬菌体呈现的抗人TfR的B6 scFv
<400> 35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asp Ser Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Tyr Ser Gly Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Gly Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Ser Ile Glu Gly Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val
115 120 125
Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser
130 135 140
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Gly Asn Ser Ser Ile His Trp Val
145 150 155 160
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Trp Pro
165 170 175
Phe Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
180 185 190
Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser
195 200 205
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ser Tyr
210 215 220
Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
225 230 235
<210> 36
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 噬菌体呈现的抗人CD32的scFv
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Asn Gly
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Phe Gly Thr Ser Gly Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Gly Gly Pro Met
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Ser Ser
100 105 110
Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val
115 120 125
Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
130 135 140
Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Asn Gly Gly Ile
145 150 155 160
His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly
165 170 175
Ile Trp Pro Phe Gly Gly Phe Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly
180 185 190
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Ser Trp Phe Ser Trp Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
225 230 235 240
Val Ser Ser
<210> 37
<211> 737
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (抗RSV scfv)-IgG1.Fc-(抗CD32 scFv)
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Cys Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Thr
115 120 125
Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr
130 135 140
Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Ser
145 150 155 160
Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala
165 170 175
Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
180 185 190
Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Lys
195 200 205
Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg
210 215 220
Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
245 250 255
Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
260 265 270
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
275 280 285
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
290 295 300
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
305 310 315 320
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
325 330 335
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Asp Tyr Lys Cys
340 345 350
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
355 360 365
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
370 375 380
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Arg Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
385 390 395 400
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
405 410 415
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
420 425 430
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
435 440 445
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
450 455 460
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly
465 470 475 480
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile Gln
485 490 495
Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val
500 505 510
Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Ser Ala Leu Ala Trp
515 520 525
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala
530 535 540
Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
545 550 555 560
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe
565 570 575
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro His Thr Phe Gly
580 585 590
Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly
595 600 605
Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val His Leu Val
610 615 620
Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser
625 630 635 640
Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val
645 650 655
Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr
660 665 670
Asp Gly Ser Asn Tyr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr
675 680 685
Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser
690 695 700
Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu Gly
705 710 715 720
Ala Ala Ala Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
725 730 735
Ser
<210> 38
<211> 738
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (抗内毒素scfv)-IgG1.Fc-(抗CD32 scFv)
<400> 38
Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Ile Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Ile Trp
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Val Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val
115 120 125
Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu
130 135 140
Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met
145 150 155 160
Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu Ala Leu
165 170 175
Ile Arg Asn Lys Arg Asn Gly Asp Thr Ala Glu Tyr Ser Ala Ser Val
180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr Ser Arg Ser Ile Leu His
195 200 205
Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys
210 215 220
Val Arg Gln Gly Arg Gly Tyr Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
245 250 255
Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
260 265 270
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
275 280 285
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
305 310 315 320
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
325 330 335
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Asp Tyr Lys
340 345 350
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
355 360 365
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
370 375 380
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Arg Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
420 425 430
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
435 440 445
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
450 455 460
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly
465 470 475 480
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile
485 490 495
Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
500 505 510
Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Ser Ala Leu Ala
515 520 525
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp
530 535 540
Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
545 550 555 560
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
565 570 575
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro His Thr Phe
580 585 590
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser Gly Ser
595 600 605
Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val His Leu
610 615 620
Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu
625 630 635 640
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp
645 650 655
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp
660 665 670
Tyr Asp Gly Ser Asn Tyr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
675 680 685
Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn
690 695 700
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Leu
705 710 715 720
Gly Ala Ala Ala Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
725 730 735
Ser Ser
<210> 39
<211> 658
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (IFN-β)Avonex-IgG4.Fc-(抗TfR scFv)
<400> 39
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50 55 60
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser
165 170 175
Gly Gly Ser Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
180 185 190
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
195 200 205
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
210 215 220
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
225 230 235 240
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
245 250 255
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
260 265 270
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
275 280 285
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
290 295 300
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
305 310 315 320
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
325 330 335
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
340 345 350
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
355 360 365
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
370 375 380
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
385 390 395 400
Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
405 410 415
Gly Ser Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
420 425 430
Leu Gly Asp Thr Ile Leu Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn
435 440 445
Val Trp Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Lys Leu
450 455 460
Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe
465 470 475 480
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
485 490 495
Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr
500 505 510
Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser
515 520 525
Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly
530 535 540
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Ala Leu Val Arg Pro Gly Ala
545 550 555 560
Ser Met Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr
565 570 575
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Leu Ile
580 585 590
Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Val Arg Leu Asn Gln Lys Phe
595 600 605
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
610 615 620
Met Gln Leu Asn Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
625 630 635 640
Ala Arg Phe Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
645 650 655
Ser Ser
<210> 40
<211> 738
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> (抗整合素a4 scfv)--IgG4.Fc-(抗TfR scFv)
<400> 40
Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Thr Asn Asp
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Val Lys
115 120 125
Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys
130 135 140
Leu Phe Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His
145 150 155 160
Trp Val Lys Gln Arg Pro Gln Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg Ile
165 170 175
Asp Pro Ala Ser Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Val Lys
180 185 190
Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Trp Leu Gln Leu
195 200 205
Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Asp Gly
210 215 220
Met Trp Val Ser Thr Gly Tyr Ala Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Ser
245 250 255
Gly Gly Ser Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly
260 265 270
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
275 280 285
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln
290 295 300
Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
305 310 315 320
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr
325 330 335
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
340 345 350
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile
355 360 365
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
370 375 380
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
385 390 395 400
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
405 410 415
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
420 425 430
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val
435 440 445
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
450 455 460
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
465 470 475 480
Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
485 490 495
Gly Ser Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser
500 505 510
Leu Gly Asp Thr Ile Leu Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn
515 520 525
Val Trp Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Lys Leu
530 535 540
Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe
545 550 555 560
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
565 570 575
Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr
580 585 590
Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser
595 600 605
Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly
610 615 620
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Ala Leu Val Arg Pro Gly Ala
625 630 635 640
Ser Met Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr
645 650 655
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Leu Ile
660 665 670
Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Val Arg Leu Asn Gln Lys Phe
675 680 685
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
690 695 700
Met Gln Leu Asn Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
705 710 715 720
Ala Arg Phe Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
725 730 735
Ser Ser

Claims (84)

1.一种接合单元，包含：一中心核以及复数个连接臂，其中：
该中心核包含：(1)一第一多肽，包含复数个赖氨酸(lysine，K)残基，其中每一个K残基和其下一个K残基间是由一填充序列所隔开，该填充序列由甘氨酸(glycine，G)以及丝氨酸(serine，S)残基所组成，且该K残基的数目为2至15；或(2)一第二多肽，包含(Xaa-K)n序列，其中每一Xaa为一聚乙二醇化氨基酸其具有2至12个乙二醇(ethylene glycol，EG)重复单元，且n为2至15的整数；
该些连接臂分别连接于该中心核的该K残基，其中所述复数个连接臂中的每一个连接臂为一聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)链，其具有2至20个EG重复单元，且每一该些连接臂的自由端有一顺丁烯二酰亚胺基、叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基或环辛炔基；以及
位于该中心核N-或C-端的氨基酸残基有叠氮基或炔基、或位于该中心核N-或C-端的氨基酸残基为半胱氨酸残基，其中，当该中心核N-或C-端的氨基酸残基为该半胱氨酸残基时，该接合单元还包含一耦合臂，且该半胱氨酸残基的硫氢基与该耦合臂连接，其中该耦合臂为一具有2至12个EG重复单元的聚乙二醇链，且该耦合臂的自由端有该叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基或环辛炔基，其中，
当该连接臂的自由端为该叠氮基、该炔基或该环辛炔基时，该位于中心核N-或C-端的氨基酸残基为半胱氨酸残基，且该耦合臂的该自由端为四嗪基或环辛烯基；或
当该连接臂的自由端为四嗪基或环辛烯基时，该位于中心核N-或C-端的氨基酸残基带有叠氮基或炔基，或该位于中心核N-或C-端的氨基酸残基为半胱氨酸残基，且该耦合臂的自由端为叠氮基、炔基或环辛炔基。
2.如权利要求1所述的接合单元，其中该填充序列的序列为GS、GGS、GSG、或如序列编号：1-16所示任一序列。
3.如权利要求1所述的接合单元，其中该第一多肽包含2-15单元的G1-5SK序列。
4.如权利要求3所述的接合单元，其中该第一多肽包含(GSK)2-15序列。
5.如权利要求1所述的接合单元，其中该些连接臂的每一者的自由端带有一双硫键。
6.如权利要求1所述的接合单元，其中具有叠氮基的该氨基酸残基为L-叠氮高丙氨酸、4-叠氮-L-苯丙氨酸、4-叠氮-D-苯丙氨酸、3-叠氮-L-丙氨酸、3-叠氮-D-丙氨酸、4-叠氮-L-高丙氨酸、4-叠氮-D-高丙氨酸、5-叠氮-L-鸟氨酸、5-叠氮-D-鸟氨酸、6-叠氮-L-赖氨酸或6-叠氮-D-赖氨酸。
7.如权利要求1所述的接合单元，其中具有炔基的该氨基酸残基为L-高炔丙基甘氨酸、D-高炔丙基甘氨酸或β-高炔丙基甘氨酸。
8.如权利要求1所述的接合单元，其中该环辛烯基为反式-环辛烯；且该环辛炔基为二苯并环辛炔、二氟化环辛炔、二环壬炔或二苯并环辛炔。
9.如权利要求1所述的接合单元，其中该四嗪基为1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪或1,2,4,5-四嗪基、或6-甲基四嗪基。
10.如权利要求1所述的接合单元，其中，所述接合单元还包含复数个第一组件，其分别透过以下方式而连接于该些连接臂：于其间形成一酰胺键或透过铜催化的叠氮化物-炔羟环加成(copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)反应、应力促进的叠氮化物-炔羟链接化学(strain-promoted azide-alkyne click chemistry，SPAAC)反应或逆电子需求狄尔斯-阿德(inverse electron demand Diels–Alder，iEDDA)反应。
11.如权利要求10所述的接合单元，其中，所述接合单元还包含一第二组件，其透过任一种以下方式而连接于该中心核：
发生于该叠氮基或炔基与该第二组件间的CuAAC反应；
发生于该叠氮基或环辛炔基与该第二组件间的SPAAC反应；以及
发生于该环辛烯基或四嗪基与该第二组件间的iEDDA反应。
12.如权利要求11所述的接合单元，其中：
该些第一组件分别透过和该些连接臂间形成一酰胺键而与其连接；以及
该第二组件透过CuAAC反应而连接至位于该中心核该N-或C-端氨基酸的该叠氮基或炔基。
13.如权利要求12所述的接合单元，其中，所述接合单元还包含一第三组件，其透过iEDDA反应而连接于该耦合臂。
14.如权利要求11所述的接合单元，其中：
该些第一组件分别透过和该些连接臂间形成一酰胺键而与其连接；以及
该第二组件透过SPAAC反应而连接至位于该中心核该N-或C-端氨基酸的该叠氮基。
15.如权利要求14所述的接合单元，其中，所述接合单元还包含一第三组件，其透过iEDDA反应而连接于该耦合臂。
16.如权利要求1所述的接合单元，其中，所述接合单元还包含复数个衔接臂，分别透过CuAAC反应、SPAAC反应或iEDDA反应而连接于该些连接臂，其中每一该些衔接臂的自由端有一顺丁烯二酰亚胺或NHS基。
17.如权利要求16所述的接合单元，其中每一该些衔接臂为一PEG链，其具有2至20个EG重复单元。
18.如权利要求16所述的接合单元，其中每一该些衔接臂为一PEG链，其具有2至20个EG重复单元，且在未连接于该连接臂之端带有一双硫键。
19.如权利要求16所述的接合单元，其中，所述接合单元还包含复数个第一组件，其分别透过以下方式而连接于该些衔接臂：透过硫氢–顺丁烯二酰亚胺反应或于其间形成一酰胺键。
20.如权利要求19所述的接合单元，其中，所述接合单元还包含一第二组件，其透过任一种以下方式而连接于该中心核：
发生于该叠氮基或炔基与该第二组件间的CuAAC反应；
发生于该叠氮基或环辛炔基与该第二组件间的SPAAC反应；以及
发生于该环辛烯基或四嗪基与该第二组件间的iEDDA反应。
21.如权利要求10所述的接合单元，其中该第一组件为芬戈莫德、芬戈莫德磷酸盐、干扰素-β或对整合素-α4、β-类淀粉蛋白、病毒蛋白或细菌蛋白特异的单链可变片段(single-chain variable fragment，scFv)。
22.如权利要求11所述的接合单元，其中当该第一组件为该芬戈莫德、芬戈莫德磷酸盐、干扰素-β或对整合素-α4或β-类淀粉蛋白对特异的该scFv时，该第二组件为一对运铁蛋白受体特异的scFv。
23.如权利要求11所述的接合单元，其中当该第一组件为对病毒蛋白或细菌蛋白特异的该scFv时，该第二组件为一对CD32或CD16b特异的scFv。
24.如权利要求23所述的接合单元，其中该病毒蛋白为呼吸道融合病毒的F蛋白、人类免疫缺陷病毒第I型的gp120蛋白、A型流感病毒的血球凝集素A蛋白或巨细胞病毒的醣蛋白。
25.如权利要求23所述的接合单元，其中该细菌蛋白是革兰氏阴性菌的内毒素、困难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)的表面抗原、金黄葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的壁脂酸、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)的炭疽毒素(anthrax toxin)或大肠杆菌(Escherichia coli)的第I型或第II型类志贺毒素。
26.一种接合单元在制备药物中的用途，该药物用以治疗一有需要个体的中枢神经系统疾病，其中所述接合单元如权利要求21所述。
27.如权利要求26所述的用途，其中：
该中枢神经系统疾病为多发性硬化症，且该第一组件为该芬戈莫德、芬戈莫德磷酸盐、干扰素-β或对整合素-α4特异的该scFv；或
该中枢神经系统疾病为阿滋海默症，且该第一组件为对β-类淀粉蛋白特异的该scFv。
28.一种接合单元在制备药物中的用途，该药物用以治疗一有需要个体的感染性疾病，其中所述接合单元如权利要求23所述。
29.如权利要求28所述的用途，其中该病毒蛋白是呼吸道融合病毒的F蛋白、人类免疫缺陷病毒第I型的gp120蛋白、A型流感病毒的血球凝集素A蛋白或巨细胞病毒的醣蛋白。
30.如权利要求28所述的用途，其中该细菌蛋白是革兰氏阴性菌的内毒素、困难梭状芽孢杆菌的表面抗原、金黄葡萄球菌的壁脂酸、炭疽杆菌的炭疽毒素或大肠杆菌的第I型或第II型类志贺毒素。
31.一种接合单元，包含：
一中心核，包含：(1)一第一多肽，包含复数个赖氨酸(lysine，K)残基，其中每一个K残基和其下一个K残基间是由一填充序列所隔开，该填充序列由甘氨酸(glycine，G)以及丝氨酸(serine，S)残基所组成，且该K残基的数目为2至15；或(2)一第二多肽，包含(Xaa-K)n序列，其中每一Xaa为一聚乙二醇化氨基酸(PEGylated amino acid)其具有2至12个乙二醇(ethylene glycol，EG)重复单元，且n为2至15的整数，其中该中心核N-或C-端至少一者的氨基酸残基有叠氮基或炔基、或为半胱氨酸残基，其中当该中心核N-或C-端的氨基酸残基为半胱氨酸残基时，该接合单元更包含一耦合臂，该耦合臂为一具有2至12个EG重复单元的聚乙二醇链，其中该耦合臂透过该半胱氨酸残基的硫氢基而与其连接，且该耦合臂的自由端有叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基或环辛炔基；
复数个连接臂，分别连接于该中心核的该K残基，其中所述复数个连接臂中的每一个连接臂为一具有2至20个EG重复单元的聚乙二醇链；
以及
复数个第一组件，分别透过以下方式而连接于该些连接臂：于其间形成一酰胺键、或透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应、CuAAC反应、SPAAC反应或iEDDA反应；其中
每一该些第一组件为芬戈莫德、芬戈莫德磷酸盐、干扰素-β或对整合素-α4、β-类淀粉蛋白、病毒蛋白或细菌蛋白特异的scFv；以及
当该些连接臂是透过CuAAC反应或SPAAC反应而连接于该些第一组件时，该位于中心核N-或C-端的氨基酸残基为半胱氨酸残基，且该耦合臂的自由端为四嗪基或环辛烯基；或
当该些连接臂是透过iEDDA反应而连接于该些第一组件时，该位于中心核N-或C-端的氨基酸残基有叠氮基或炔基、或该位于中心核N-或C-端的氨基酸残基为半胱氨酸残基，且该耦合臂的自由端为该叠氮基、炔基或环辛炔基。
32.一种接合单元，包含：
一中心核，包含：(1)一第一多肽，包含复数个赖氨酸(lysine，K)残基，其中每一个K残基和其下一个K残基间是由一填充序列所隔开，该填充序列是由甘氨酸(glycine，G)以及丝氨酸(serine，S)残基所組成，且该K残基的数目为2至15；或(2)一第二多肽，包含(Xaa-K)n序列，其中每一Xaa为一聚乙二醇化氨基酸其具有2至12个乙二醇(ethylene glycol，EG)重复单元，且n为2至15的整数，其中该中心核N-或C-端至少一者的氨基酸残基有叠氮基或炔基、或为半胱氨酸残基，其中当该中心核N-或C-端的氨基酸残基为半胱氨酸残基时，该接合单元更包含一耦合臂，该耦合臂为一具有2至12个EG重复单元的聚乙二醇链，其中该耦合臂透过该半胱氨酸残基的硫氢基而与其连接，且该耦合臂的自由端有叠氮基、炔基、四嗪基、环辛烯基或环辛炔基；
复数个连接臂，分别连接于该中心核的该K残基，其中所述复数个连接臂中的每一个连接臂为一具有2至20个EG重复单元的聚乙二醇链；
复数个衔接臂，分别透过CuAAC反应、SPAAC反应或iEDDA反应而连接于该些连接臂，其中所述复数个衔接臂中的每一个衔接臂为一具有2至20个EG重复单元PEG链；以及
复数个第一组件，分别透过以下方式而连接于该些衔接臂：于其间形成一酰胺键、或透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应，其中
每一该些第一组件为芬戈莫德、芬戈莫德磷酸盐、干扰素-β或对整合素-α4、β-类淀粉蛋白、病毒蛋白或细菌蛋白特异的scFv；以及
当该些连接臂是透过CuAAC反应或SPAAC反应而连接于该些衔接臂时，该位于中心核N-或C-端的氨基酸残基为半胱氨酸残基，且该耦合臂的自由端为四嗪基或环辛烯基；或
当该些连接臂是透过iEDDA反应而连接于该些衔接臂时，该位于中心核N-或C-端的氨基酸残基有叠氮基或炔基、或该位于中心核N-或C-端的氨基酸残基为半胱氨酸残基，且该耦合臂的自由端为该叠氮基、炔基或环辛炔基。
33.如权利要求31或32所述的接合单元，其中该填充序列的序列为GS、GGS、GSG、或如序列编号：1-16所示任一序列。
34.如权利要求31或32所述的接合单元，其中该第一多肽包含2-15单元的G1-5SK序列。
35.如权利要求34所述的接合单元，其中该第一多肽包含(GSK)2-15序列。
36.如权利要求31或32所述的接合单元，其中该些连接臂的每一者的自由端带有一双硫键。
37.如权利要求31或32所述的接合单元，其中具有叠氮基的该氨基酸残基为L-叠氮高丙氨酸、4-叠氮-L-苯丙氨酸、4-叠氮-D-苯丙氨酸、3-叠氮-L-丙氨酸、3-叠氮-D-丙氨酸、4-叠氮-L-高丙氨酸、4-叠氮-D-高丙氨酸、5-叠氮-L-鸟氨酸、5-叠氮-D-鸟氨酸、6-叠氮-L-赖氨酸或6-叠氮-D-赖氨酸。
38.如权利要求31或32所述的接合单元，其中具有炔基的该氨基酸残基为L-高炔丙基甘氨酸、D-高炔丙基甘氨酸或β-高炔丙基甘氨酸。
39.如权利要求31或32所述的接合单元，其中该环辛烯基为反式-环辛烯；且该环辛炔基为二苯并环辛炔、二氟化环辛炔、二环壬炔或二苯并环辛炔。
40.如权利要求31或32所述的接合单元，其中该四嗪基为1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪或1,2,4,5-四嗪基、或6-甲基四嗪基。
41.如权利要求31或32所述的接合单元，其中该病毒蛋白为呼吸道融合病毒的F蛋白、人类免疫缺陷病毒第I型的gp120蛋白、A型流感病毒的血球凝集素A蛋白或巨细胞病毒的醣蛋白。
42.如权利要求31或32所述的接合单元，其中该细菌蛋白是革兰氏阴性菌的内毒素、困难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)的表面抗原、金黄葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的壁脂酸、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)的炭疽毒素或大肠杆菌(Escherichiacoli)的第I型或第II型类志贺毒素。
43.如权利要求31或32所述的接合单元，其中，所述接合单元还包含一第二组件，其透过任一种以下方式而连接于该中心核：
发生于该叠氮基或炔基与该第二组件间的CuAAC反应；
发生于该叠氮基或环辛炔基与该第二组件间的SPAAC反应；以及
发生于该环辛烯基或四嗪基与该第二组件间的iEDDA反应。
44.如权利要求43所述的接合单元，其中：
当该第一组件为该芬戈莫德、芬戈莫德磷酸盐、干扰素-β或对整合素-α4或β-类淀粉蛋白特异的该scFv时，该第二组件为一对运铁蛋白受体特异的scFv；或
当该第一组件为对病毒蛋白或细菌蛋白特异的该scFv时，该第二组件为一对CD32或CD16b特异的scFv。
45.如权利要求44所述的接合单元，其中：
该些第一组件分别透过以下方式而连接于该些连接臂：于其间形成一酰胺键、或透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应；以及
该第二组件是透过CuAAC反应而连接于该中心核N-或C-端氨基酸残基的叠氮基或炔基。
46.如权利要求45所述的接合单元，其中，所述接合单元还包含一第三组件，透过iEDDA反应而连接于该耦合臂。
47.如权利要求44所述的接合单元，其中：
该些第一组件分别透过以下方式而连接于该些连接臂：于其间形成一酰胺键、或透过硫氢-顺丁烯二酰亚胺反应；以及
该第二组件是透过SPAAC反应而连接于该中心核N-或C-端氨基酸残基的叠氮基或环辛炔基。
48.如权利要求47所述的接合单元，其中，所述接合单元还包含一第三组件，透过iEDDA反应而连接于该耦合臂。
49.一种接合单元在制备药物中的用途，该药物用以治疗一有需要个体的中枢神经系统疾病，其中该接合单元如权利要求44所述。
50.如权利要求49所述的用途，其中：
该中枢神经系统疾病为多发性硬化症，且该第一组件为该芬戈莫德、芬戈莫德磷酸盐、干扰素-β或对整合素-α4特异的该scFv；或
该中枢神经系统疾病为阿滋海默症，且该第一组件为对β-类淀粉蛋白特异的该scFv。
51.一种接合单元在制备药物中的用途，该药物用以治疗一有需要个体的感染性疾病，其中接合单元如权利要求44所述。
52.如权利要求51所述的用途，其中该病毒蛋白是呼吸道融合病毒的F蛋白、人类免疫缺陷病毒第I型的gp120蛋白、A型流感病毒的血球凝集素A蛋白或巨细胞病毒的醣蛋白。
53.如权利要求51所述的用途，其中该细菌蛋白是革兰氏阴性菌的内毒素、困难梭状芽孢杆菌的表面抗原、金黄葡萄球菌的壁脂酸、炭疽杆菌的炭疽毒素或大肠杆菌的第I型或第II型类志贺毒素。
54.一种分子构建体，包含一第一接合单元与一第二接合单元，其中：
该第一接合单元包含：一第一中心核，包含权利要求1所述之第一多肽或第二多肽，
复数个第一连接臂，连接于该第一中心核，其中所述复数个第一连接臂中的每一个第一连接臂为一具有2至20个EG重复单元的聚乙二醇链，
复数个第一组件，连接于该复数个第一连接臂，以及一第一耦合臂，连接于该第一中心核，其中所述第一耦合臂为一具有2至12个EG重复单元的聚乙二醇链；以及
该第二接合单元包含：
一第二中心核，其为一化合物核或一多肽核，其中
该化合物核系选自以下物质所组成的群组：苯-1,3,5-三胺、2-(胺甲基)-2-甲基丙烷-1,3-二胺、三(2-胺乙基)胺、3,3’,5,5’-四胺-1,1’-联苯、四(2-胺乙基)甲烷、四(乙胺)肼、N,N,N’,N’,-四(胺乙基)乙二胺、苯-1,2,3,4,5,6-六胺、1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-六(甲胺)-苯-1,3,5-三胺、1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N,5-N,-八(甲胺)-苯-1,2,4,5-三胺以及N,N-二[(1-胺基-3,3-二胺乙基)戊基]甲烷二胺，以及
该多肽核为权利要求1所述之第一多肽或第二多肽，
一第二连接臂，连接于该第二中心核，其中所述第二连接臂为一具有2至20个EG重复单元的聚乙二醇链，
一第二组件，连接于该第二连接臂，以及
一第二耦合臂，连接于该第二中心核，其中所述第二耦合臂为一具有2至12个EG重复单元的聚乙二醇链；其中：
该第一与第二接合单元透过发生于以下位置间的CuAAC反应、SPAAC反应或iEDDA彼此连接：该第一与第二中心核间、该第一耦合臂与该第二中心核间、该第一与第二耦合臂间、或该第一中心核与该第二耦合臂间；其中：
当该第一组件为一对运铁蛋白受体特异的scFv时，该第二组件为干扰素-β、芬戈莫德、芬戈莫德磷酸盐或一对整合素α4或β-类淀粉蛋白特异的scFv；或
当该第一组件为一对病毒蛋白或细菌蛋白特异的scFv时，该第二组件为一对CD16b或CD32特异的scFv。
55.如权利要求54所述的分子构建体，其中该第二接合单元包含与其连接的复数个第二连接臂。
56.如权利要求55所述的分子构建体，其中，所述分子构建体还包含复数个第二组件，分别连接于该第二连接臂。
57.如权利要求54所述的分子构建体，其中：
每一该些第一与第二连接臂的自由端有一双硫键。
58.如权利要求54所述的分子构建体，其中：
该第一与第二耦合臂其中之一的自由端有叠氮基，且另一者的自由端有炔基或环辛炔基；以及
该第一与第二中心核接合单元透过发生于该第一与第二耦合臂间的CuAAC反应或SPAAC反应而彼此耦接。
59.如权利要求58所述的分子构建体，其中该环辛炔基为DBCO、DIFO、BCN或DICO。
60.如权利要求54所述的分子构建体，其中：
该第一与第二耦合臂其中之一的自由端有四嗪基，且另一者的自由端有环辛烯基；以及
该第一与第二中心核接合单元透过发生于该第一与第二耦合臂间的iEDDA而彼此耦接。
61.如权利要求60所述的分子构建体，其中该四嗪为1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪或1,2,4,5-四嗪或6-甲基四嗪基。
62.如权利要求54所述的分子构建体，其中该第二中心核为该化合物核，其中连接于该化合物核的该第二耦合臂是透过和该化合物核的该些氨基其中之一形成一酰胺键而与其连接，且该第二耦合臂的自由端有叠氮基、炔基、高应力炔基或四嗪基。
63.如权利要求62所述的分子构建体，其中：
该第一中心核的N-或C-端氨基酸残基为L-叠氮高丙氨酸、4-叠氮-L-苯丙氨酸、4-叠氮-D-苯丙氨酸、3-叠氮-L-丙氨酸、3-叠氮-D-丙氨酸、4-叠氮-L-高丙氨酸、4-叠氮-D-高丙氨酸、5-叠氮-L-鸟氨酸、5-叠氮-D-鸟氨酸、6-叠氮-L-赖氨酸或6-叠氮-D-赖氨酸；以及
该第一与第二中心核接合单元透过发生于该耦合臂与该N-或C-端氨基酸残基之间的SPAAC反应而彼此耦接。
64.如权利要求54所述的分子构建体，其中该第一多肽的该填充序列的序列为GS、GGS、GSG或如序列编号：1-16所示任一序列。
65.如权利要求54所述的分子构建体，其中该第一多肽包含2-15单元的G1-5SK序列。
66.如权利要求65所述的分子构建体，其中该第一多肽包含(GSK)2-15序列。
67.如权利要求54所述的分子构建体，其中该第二中心核为该多肽核。
68.如权利要求67所述的分子构建体，其中该第一与第二中心核的N-端皆经过一乙酰基修饰。
69.如权利要求67所述的分子构建体，其中：
该第一与第二中心核其中之一的该N-或C-端氨基酸残基为AHA、4-叠氮-L-苯丙氨酸、4-叠氮-D-苯丙氨酸、3-叠氮-L-丙氨酸、3-叠氮-D-丙氨酸、4-叠氮-L-高丙氨酸、4-叠氮-D-高丙氨酸、5-叠氮-L-鸟氨酸、5-叠氮-D-鸟氨酸、6-叠氮-L-赖氨酸或6-叠氮-D-赖氨酸；
该第一与第二中心核其中另一者的该N-或C-端氨基酸残基为L-HPG、D-HPG或β-HPG；以及
该第一与第二接合单元透过发生于该些N-或C-端氨基酸残间的CuAAC反应而彼此耦接。
70.如权利要求67所述的分子构建体，其中每一该些第一与第二中心核的N-或C-端有一半胱氨酸残基，且该第一与第二耦合臂分别透过硫氢–顺丁烯二亚酰胺反应而连接于该第一与第二中心核的半胱氨酸残基。
71.如权利要求67所述的分子构建体，其中：
该第一与第二中心核其中之一的N-或C-端氨基酸残基为L-叠氮高丙氨酸、4-叠氮-L-苯丙氨酸、4-叠氮-D-苯丙氨酸、3-叠氮-L-丙氨酸、3-叠氮-D-丙氨酸、4-叠氮-L-高丙氨酸、4-叠氮-D-高丙氨酸、5-叠氮-L-鸟氨酸、5-叠氮-D-鸟氨酸、6-叠氮-L-赖氨酸或6-叠氮-D-赖氨酸；
该第一与第二中心核中另一者的N-或C-端有一半胱氨酸残基，其中该第一或第二耦合臂系透过硫氢–顺丁烯二亚酰胺反应而连接于该半胱氨酸残基，且其自由端有一DBCO、DIFO、BCN或DICO基；以及
该第一与第二接合单元透过发生于该第一中心核与该第二耦合臂或该第二中心核与该第一耦合臂间的SPAAC反应而彼此耦接。
72.如权利要求54所述的分子构建体，其中该病毒蛋白是呼吸道融合病毒的F蛋白、人类免疫缺陷病毒第I型的gp120蛋白、A型流感病毒的血球凝集素A蛋白或巨细胞病毒的醣蛋白。
73.如权利要求54所述的分子构建体，其中该细菌蛋白是革兰氏阴性菌的内毒素、困难梭状芽孢杆菌的表面抗原、金黄葡萄球菌的壁脂酸、炭疽杆菌的炭疽毒素或大肠杆菌的第I型或第II型类志贺毒素。
74.如权利要求54所述的分子构建体，其中，所述分子构建体还包含一第三连接臂，连接于该第一或第二接合单元。
75.如权利要求74所述的分子构建体，其中该第三连接臂的自由端有一顺丁烯二亚酰胺基，且该分子构建体还包含一第三组件透过硫氢-顺丁烯二亚酰胺反应而连接于该第三连接臂。
76.如权利要求75所述的分子构建体，其中该第三组件分别与该第一组件与该第二组件不同。
77.一种分子构建体在制备药物中的用途，该药物用以治疗罹患或可能中枢神经系统疾病的个体，其中，该分子构建体如权利要求54所述。
78.如权利要求77所述的用途，其中：
该中枢神经系统疾病为多发性硬化症；
该第一组件为对运铁蛋白受体特异的该scFv；以及
该第二组件为该芬戈莫德、芬戈莫德磷酸盐、干扰素-β或对整合素-α4特异的该scFv。
79.如权利要求77所述的用途，其中：
该中枢神经系统疾病为阿滋海默症；
该第一组件为对运铁蛋白受体特异的该scFv；以及
该第二组件为对β-类淀粉蛋白特异的该scFv。
80.一种分子构建体在制备药物中的用途，该药物用以治疗一有需要个体的感染性疾病，其中，该分子构建体如权利要求54所述。
81.如权利要求80所述的用途，其中：
该感染性疾病是由一病毒所引起；
该第一组件为对该病毒蛋白特异的该scFv；以及
该第二组件为对CD16b或CD32特异的该scFv。
82.如权利要求81所述的用途，其中该病毒蛋白是呼吸道融合病毒的F蛋白、人类免疫缺陷病毒第I型的gp120蛋白、A型流感病毒的血球凝集素A蛋白或巨细胞病毒的醣蛋白。
83.如权利要求80所述的用途，其中：
该感染性疾病是由一细菌所引起；
该第一组件为对该细菌蛋白特异的该scFv；以及
该第二组件为对CD16b或CD32特异的该scFv。
84.如权利要求80所述的用途，其中该细菌蛋白是革兰氏阴性菌的内毒素、困难梭状芽孢杆菌的表面抗原、金黄葡萄球菌的壁脂酸、炭疽杆菌的炭疽毒素或大肠杆菌的第I型或第II型类志贺毒素。
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Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3081058C (en) * 2015-01-16 2024-02-20 Academia Sinica Linker units and their uses in configuring pharmaceutical molecules
US9994638B2 (en) * 2015-05-20 2018-06-12 Immunwork Inc. Peptide core-based multi-arm linkers for treating infectious diseases
WO2017036255A1 (en) * 2015-09-01 2017-03-09 Tse-Wen Chang Molecular constructs for preventing the formation of blood clot and/or treating thrombosis
MA44334A (fr) 2015-10-29 2018-09-05 Novartis Ag Conjugués d'anticorps comprenant un agoniste du récepteur de type toll
WO2018009916A1 (en) 2016-07-07 2018-01-11 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Antibody adjuvant conjugates
US10143187B2 (en) 2017-02-17 2018-12-04 Denali Therapeutics Inc. Transferrin receptor transgenic models
US10457717B2 (en) * 2017-02-17 2019-10-29 Denali Therapeutics Inc. Engineered polypeptides
IL269328B2 (en) * 2017-03-16 2023-11-01 Immunwork Inc Binding units and molecules containing them
BR112019019973A2 (pt) * 2017-03-24 2020-04-28 Orpheus Bioscience Inc pantlds para tratamento de transtornos autoimunes
CA3070272A1 (en) * 2017-07-20 2019-01-24 Aptevo Research And Development Llc Antigen binding proteins binding to 5t4 and 4-1bb and related compositions and methods
RU2753880C1 (ru) * 2017-09-19 2021-08-24 Иммунворк Инк. Фармацевтические конструкции с повышенной аффинностью связывания с альбумином
CN111936513A (zh) * 2018-01-31 2020-11-13 威斯塔解剖学和生物学研究所 用于抗呼吸道合胞病毒的核酸抗体构筑体
JP2022525594A (ja) 2019-03-15 2022-05-18 ボルト バイオセラピューティクス、インコーポレーテッド Ｈｅｒ２を標的とする免疫結合体
CN113493517B (zh) * 2020-04-02 2023-05-02 重庆精准生物技术有限公司 双特异性单链抗体及其构建的嵌合抗原受体和应用
JP2023524812A (ja) * 2020-05-08 2023-06-13 エムペグ エルエイ リミテッド ライアビリティ カンパニー リンカー化合物
CN114874332B (zh) * 2022-03-30 2023-01-10 呈诺再生医学科技(珠海横琴新区)有限公司 经修饰的rnf112作为治疗als药物的应用
CN117510828A (zh) * 2022-07-28 2024-02-06 厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司 一种含氨基酸残基的三臂聚乙二醇衍生物

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007104789A2 (en) * 2006-03-15 2007-09-20 Novo Nordisk A/S Amylin derivatives
WO2010093395A1 (en) * 2009-02-13 2010-08-19 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
WO2011029008A2 (en) * 2009-09-04 2011-03-10 Arizona Board Of Regents Acting For And On Behalf Of Arizona State University Synbodies to akt1
WO2011045668A1 (en) * 2009-10-14 2011-04-21 The Governors Of The University Of Alberta Compounds having peptides conjugated to bone targeting moieties and methods of making and using thereof
WO2012007896A1 (en) * 2010-07-12 2012-01-19 Covx Technologies Ireland, Ltd. Multifunctional antibody conjugates
WO2013004607A1 (en) * 2011-07-01 2013-01-10 Bayer Intellectual Property Gmbh Relaxin fusion polypeptides and uses thereof

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5858728A (en) 1991-03-13 1999-01-12 Common Services Agency Monoclonal antibody against LPS core
US5432260A (en) * 1991-05-03 1995-07-11 Washington University High affinity mannose receptor ligands
WO2001071005A2 (en) * 2000-03-24 2001-09-27 Micromet Ag Multifunctional polypeptides comprising a binding site to an epitope of the nkg2d receptor complex
CA2456193A1 (en) * 2001-08-03 2003-03-27 Medarex, Inc. Compositions comprising immunostimulatory oligonucleotides and uses thereof to enhance fc receptor-mediated immunotherapies
US7429472B2 (en) * 2003-01-31 2008-09-30 Promega Corporation Method of immobilizing a protein or molecule via a mutant dehalogenase that is bound to an immobilized dehalogenase substrate and linked directly or indirectly to the protein or molecule
JP2008516586A (ja) 2004-09-30 2008-05-22 メダレックス インコーポレーティッド Ｆｃγ受容体ＩＩ（ＣＤ３２）に対するヒトモノクローナル抗体
RU2318500C2 (ru) * 2005-10-18 2008-03-10 Общество С Ограниченной Ответственностью "Митотехнология" Способ воздействия на организм путем адресной доставки биологически активных веществ в митохондрии, фармацевтическая композиция для его осуществления и соединение, применяемое для этой цели
US20080267988A1 (en) * 2007-04-11 2008-10-30 Enteron Limited Partnership Myelin specific IgE unencumbered by corresponding blocking antibodies as a causative factor in multiple sclerosis
JP5539993B2 (ja) * 2008-09-23 2014-07-02 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 薬物送達のためのナノ担体
BR112012004274A2 (pt) * 2009-08-31 2016-11-16 Ibc Pharmaceuticals Inc composições e métodos de uso de imunotoxinas compreendendo ranpirnase (rap) mostram potente atividade citotóxica
EA034333B1 (ru) 2010-11-30 2020-01-29 Дженентек, Инк. Варианты антитела для переноса соединения через гематоэнцефалический барьер
WO2014036492A1 (en) * 2012-08-31 2014-03-06 Sutro Biopharma, Inc. Modified amino acids comprising an azido group
JP6501270B2 (ja) * 2013-03-14 2019-04-17 ザ カリフォルニア インスティテュート フォー バイオメディカル リサーチ 標的化剤抗体抱合体およびその使用
UY35671A (es) * 2013-07-25 2015-02-27 Novartis Ag Bioconjugados de polipéptidos de apelina sintética
CA2918795A1 (en) * 2013-07-25 2015-01-29 Cytomx Therapeutics, Inc. Multispecific antibodies, multispecific activatable antibodies and methods of using the same
BR112016013849A2 (pt) * 2014-01-03 2017-10-10 Hoffmann La Roche conjugados de anticorpos biespecíficos antihapteno/antirreceptores da barreira hematoencefálica, seus usos, e formulação farmacêutica
RU2724530C2 (ru) * 2014-02-06 2020-06-23 Экс4 Фамасьютиклз (Остриэ) ГмбХ Выделенное антитело (варианты), способ получения антитела, выделенная нуклеиновая кислота, экспрессионная кассета (варианты), плазмида (варианты), клетка-хозяин, фармацевтический препарат, набор, способ лечения больного, подверженного риску или страдающего от инфекции e.coli, и способ диагностики определения инфекций e.coli
CA3081058C (en) * 2015-01-16 2024-02-20 Academia Sinica Linker units and their uses in configuring pharmaceutical molecules
US9994638B2 (en) * 2015-05-20 2018-06-12 Immunwork Inc. Peptide core-based multi-arm linkers for treating infectious diseases

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007104789A2 (en) * 2006-03-15 2007-09-20 Novo Nordisk A/S Amylin derivatives
WO2010093395A1 (en) * 2009-02-13 2010-08-19 Immunomedics, Inc. Immunoconjugates with an intracellularly-cleavable linkage
WO2011029008A2 (en) * 2009-09-04 2011-03-10 Arizona Board Of Regents Acting For And On Behalf Of Arizona State University Synbodies to akt1
WO2011045668A1 (en) * 2009-10-14 2011-04-21 The Governors Of The University Of Alberta Compounds having peptides conjugated to bone targeting moieties and methods of making and using thereof
WO2012007896A1 (en) * 2010-07-12 2012-01-19 Covx Technologies Ireland, Ltd. Multifunctional antibody conjugates
WO2013004607A1 (en) * 2011-07-01 2013-01-10 Bayer Intellectual Property Gmbh Relaxin fusion polypeptides and uses thereof

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