TWI614023B - 具有標的部分及效應部分的胜肽核多臂接合物 - Google Patents

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Abstract

本揭示內容提出了多種分子構建體，這些分子構建體具有一標的元件與一效應元件。此處亦揭示了利用所述分子構建體來治療多種疾病的方法。

Description

具有標的部分及效應部分的胜肽核多臂接合物
本揭示內容是關於藥學領域；更明確地說，是關於多功能的分子構建體，譬如具有標的元件與效應元件以將效應元件(如治療藥物)遞送至標的部位的分子構建體。
近年來，本領域發展出多種篩檢與選擇以抗原為標的之單株抗體(monoclonal antibodies，mAbs)的方法，進而帶動許多治療用抗體的研發，為一些不久前還被認為是不治之症的疾病帶來曙光。根據治療性抗體資料庫(Therapeutic Antibody Database)的統計，有多達2,800種左右的抗體已經或即將投入人體臨床試驗研發，而由政府藥物管理機構核准可用於臨床治療的抗體則約有80種。從與抗體療效相關的大量數據中可知抗體是基於何種藥理機制而發揮療效。
以抗體作為治療藥劑時，其主要的藥理機制是以抗體來中和或誘捕造成疾病的介質；所述介質可能是存在於血液循環、間質空間(interstitial space)或淋巴結中的細胞介素或免疫成分。中和所述介質的活性可抑制造成疾病的介質和其受體之間的互動。此外，可將細胞介素的可溶性受體或受體的細胞外部分和免疫球蛋白IgG的Fc部分製成融合蛋白，此種融合蛋白可利用類似中和抗體的機制來中和上述細胞介素或免疫因子；因此目前也開發出多種融合蛋白治療劑。
另外，某些取得臨床使用許可或正在進行臨床研究的治療性抗體則是採用了與上述主要抗體機制不同的機制，來發揮其藥理作用，譬如可藉由和受體結合以阻斷這些受體和其配體之間的互動。對此類抗體藥物來說，其主要的藥理機制並非由Fc-介導的機制(如抗體依賴性細胞毒性(antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC)或是補體介導的細胞溶解(complement-mediated cytolysis，CMC)等)。
另一些治療性抗體可和目標細胞上的某些表面抗原結合，並藉此在目標細胞上發揮Fc介導的功能以及其他機制。最重要的Fc介導的機制為抗體依賴性細胞毒性(ADCC)以及補體介導的細胞溶解(CMC)，這兩種機制都會將與抗體結合的目標細胞溶解。這些抗體和特定的細胞表面抗原結合後，可使得與其結合的目標細胞發生細胞凋亡。
製備具有雙重專一性的抗體的概念與方法，早在三十年前就已萌芽。近年來，隨著重組抗體工程方法的進步、以及對於更好藥物的需求驅使下，發展出多種具有不同結構構形的雙專一性抗體。
舉例來說，雙價或多價抗體可能帶有二或更多種抗原結合位。已知有多種方法可用以製備多價抗體，這些方法通常利用連接結構將三或四種抗原結合片段(antigen-binding fragment，Fab)共價連接在一起。舉例來說，已透過重組工程製備出能表現三或四個串聯(tandem)的Fab重複片段的抗體。
此外，利用合成的交聯物(crosslinker)，透過化學方法將不同的抗體或結合部位連接在一起，以製造出多價抗體的方法也是本領域公知的技術。其中一種方式是利用不同的接合物(linker)，將三、四或更多個分離的Fab片段，透過化學交聯的方式彼此接合。另一種方式是先製備一個具有多個Fab的構建體，將這些Fab組裝成一維的DNA支架(one-dimensional DNA scaffold)。這些經設計可和目標分子結合的各種多價抗體構建體彼此的尺寸、半衰期、構形彈性以及調節免疫系統的能力各不相同。
基於以上說明，已有部分研究著眼於製備效應元件數目固定的分子構建體或具有二或更多種不同功能性元件(譬如至少一標的元件與至少一效應元件)的分子構建體。然而，通常很難利用化學合成或重組技術等方法，來建立具有特定標的與效應元件組合的分子構建體。因此，本領域亟需一種新穎的分子平台，其可用以建構適用於多種疾病的各種分子。
發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明具體實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。發明內容的唯一目的在於對此處揭示的某些概念提供簡化的說明，以利理解後文所述的實施方式。
＜ I ＞ 含胜肽核的多臂接合物
本揭示內容的第一種態樣是關於一種接合單元，其上連接了至少兩種不同功能性元件。舉例來說，所述接合單元可連接有：兩種不同的效應元件、一種標的元件與一種效應元件、或一種效應元件與可延長接合單元生命週期的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)鏈。本發明接合單元設計成帶有至少兩種不同的官能基，使得這些功能性元件能夠和各別的官能基反應而連接到接合單元。因此，本發明接合單元可作為用以製備帶有二或更多種功能性元件的分子構建體的平台。
根據本揭示內容多種實施方式，所述接合單元包含一中心核及複數個連接臂。中心核可以是多肽核，其包含2至15個離胺酸(lysine，K)殘基，其中每一個K殘基和次一個K殘基之間由一填充序列所隔開，所述填充序列包含甘胺酸(glycine，G)與絲胺酸(serine，S)殘基；或者是，所述多肽核的序列為(Xaa -K)n ，其中Xaa 是具有2至12個乙二醇(ethylene glycol，EG)重複單元的聚乙二醇化胺基酸(PEGylated amino acid)，且n為2至15的整數。在視需要而實施的實施方式中，填充序列是由2至20個胺基酸殘基所組成。於多種實施方式中，填充序列可具有任一種以下序列：GS、GGS、GSG或序列編號：1-16所示序列。根據本揭示內容某些實施方式，中心核包含2至15個單元的G1-5 SK序列；在較佳的情形中，中心核的序列為(GSK)2-15 。每一連接臂藉由和K殘基形成醯胺鍵而連接於中心核的K殘基。連接臂的自由端(即，未連接於中心核的一端)有一順丁烯二醯亞胺基(maleimide group)、N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimidyl，NHS)基、疊氮基(azide group)、炔基(alkyne group)、四嗪基(tetrazine group)、環辛烯基(cyclooctene group)或環辛炔基(cyclooctyne group)。此外，位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基有一疊氮基或炔基；或者是或額外地，令位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基是半胱胺酸(C)殘基，且有一耦合臂透過此半胱胺酸殘基的硫氫基而與其連接，此時所述耦合臂未和中心核連接的自由端有一疊氮基、炔基、四嗪基或環辛烯基或環辛炔基。
根據本揭示內容某些實施方式，當連接臂的自由端是疊氮基、炔基或環辛炔基時，則位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基為半胱胺酸殘基，且耦合臂的自由端是四嗪基或環辛烯基。根據本揭示內容其他實施方式，當連接臂的自由端是四嗪基或環辛烯基時，則位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基有該疊氮基或炔基；或位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基是半胱胺酸殘基，且耦合臂的自由端為疊氮基、炔基或環辛炔基。
在某些實施方式中，所述連接臂為一PEG鏈；在較佳情形中，其具有2至20個EG重複單元。或者是，所述連接臂是具有2至20個EG重複單元的PEG鏈，且在其自由端(即，未和中心核K殘基連接的一端)有一雙硫鍵。於某些實施方式中，所述耦合臂為一PEG鏈；在較佳情形中，其具有2至12個EG重複單元。
帶有疊氮基的胺基酸殘基實例包括：L-疊氮高丙胺酸(azidohomoalanine，AHA)、4-疊氮-L-苯丙胺酸(4-azido-L-phenylalanine)、4-疊氮-D-苯丙胺酸(4-azido-D-phenylalanine)、3-疊氮-L-丙胺酸(3-azido-L-alanine)、3-疊氮-D-丙胺酸(3-azido-D-alanine)、4-疊氮-L-高丙胺酸(4-azido-L-homoalanine)、4-疊氮-D-高丙胺酸(4-azido-D-homoalanine)、5-疊氮-L-烏胺酸(5-azido-L-ornithine)、5-疊氮-D-烏胺酸(5-azido-D-ornithine)、6-疊氮-L-離胺酸(6-azido-L-lysine)以及6-疊氮-D-離胺酸(6-azido-D-lysine)。例示性的帶有炔基胺基酸殘基包括：L-高炔丙基甘胺酸(L-homopropargylglycine，L-HPG)、D-高炔丙基甘胺酸(D-homopropargylglycine，D-HPG)以及β-高炔丙基甘胺酸(beta-homopropargylglycine、β-HPG)。
當位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基是半胱胺酸殘基時，位於耦合臂自由端的環辛烯基可以是反式-環辛烯(trans-cyclooctene，TCO)基，而位於耦合臂自由端的環辛炔基則可以是二苯并環辛炔(dibenzocyclooctyne，DBCO)、二氟化環辛炔(difluorinated cyclooctyne，DIFO)、二環壬炔(bicyclononyne，BCN)或二苯并環辛炔(dibenzocyclooctyne，DICO)基。另一方面，位於耦合臂自由端的四嗪基包括，但不限於：1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪以及1,2,4,5-四嗪基，以及其衍生物，譬如6-甲基四嗪基。
根據本揭示內容多種實施方式，所述接合單元更包含複數個第一元件。於某些實施方式中，藉由在連接臂和第一元件之間形成醯胺鍵，而將每一第一元件連接至連接臂。在其他實施方式中，透過發生在連接臂與第一元件之間的「銅催化的疊氮化物-炔羥環加成(copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition，CuAAC)」、「應力促進的疊氮化物-炔羥鏈接化學(strain-promoted azide-alkyne click chemistry，SPAAC)」反應或「逆電子需求狄爾斯-阿德(inverse electron demand Diels–Alder，iEDDA)」反應，而將每一第一元件連接至連接臂。
在視需要的情形中，此處提出的接合單元更包含複數個銜接臂，其可透過CuAAC、SPAAC或iEDDA反應而各別連接至該些連接臂。根據本發明實施方式，每一銜接臂用於連接元件的一端(即，未與連接臂相連的一端)有一順丁烯二醯亞胺基或NHS基。因此，每一第一元件和銜接臂之間可透過硫氫–順丁烯二醯亞胺反應或藉由形成醯胺鍵而彼此連接。於某些實施方式中，每一銜接臂是一PEG鏈，其較佳具有2至20個EG重複單元。在其他實施方式中，每一銜接臂是具有2至20個EG重複單元的PEG鏈，且其元件連接端有一雙硫鍵。
根據本揭示內容多種視需要而實施的實施方式，第一元件是可在個體體內發揮欲求效果(如，治療效果)的效應元件；或者是，第一元件是能夠將接合單元導引至目標部位的標的元件。根據本發明實施方式，第一元件是芬戈莫德(fingolimod)、芬戈莫德磷酸鹽(fingolimod phosphate)、干擾素-β (interferon-β)或對整合素-α4 (integrin-α4)、β-類澱粉蛋白(β-amyloid)、病毒蛋白或細菌蛋白專一的單鏈可變片段(single-chain variable fragment，scFv)。
同樣在有需要的情形中，接合單元更可包含與第一元件不同的第二元件。在某些實施方式中，第二元件帶有疊氮基或炔基，使得其可和中心核或耦合臂的對應炔基或疊氮基進行CuAAC反應，進而與中心核或耦合臂耦接。或者是，在某些實施方式中，第二元件帶有疊氮基或環辛炔基，使得其可和中心核或耦合臂的對應環辛炔基或疊氮基進行SPAAC反應，進而與中心核或耦合臂耦接。又或者是，於一些實施方式中，第二元件帶有四嗪基或環辛烯基，而使得其可和中心核或耦合臂的對應環辛烯基或四嗪基進行iEDDA反應，進而與中心核或耦合臂耦接。根據某些實施方式，所述接合單元包含銜接臂，此銜接臂透過CuAAC或SPAAC反應而連接至連接臂；在這些情形中，中心核的N-或C-端或耦合臂的自由端有四嗪基或環辛烯基，而使得帶有相應環辛烯基或四嗪基的第二元件可以透過iEDDA反應而連接至中心核或耦合臂。根據其他實施方式，所述接合單元包含銜接臂，此銜接臂透過iEDDA反應而連接至連接臂；在這些情形中，中心核的N-或C-端或耦合臂的自由端有疊氮基、炔基或環辛炔基，而使得帶有相應化學基團的第二元件可以透過CuAAC或SPAAC反應而連接至中心核或耦合臂。
在本揭示內容可任選的實施方式中，當第一元件為效應元件時，第二元件可以是另一種效應元件，其可和第一元件累加(additively)、協同(synergistically)或獨立(independently)作用；或者是，第二元件可以是標的元件或能改善接合單元藥動學性質(如溶解度、廓清率(clearance)、半衰期(half-life)與生物可用率(bioavailability))的元件。在其他可任選的實施方式中，當第一元件為標的元件時，第二元件較佳為效應元件或能改善接合單元藥動學性質的元件。
於一些實施方式中，所述接合單元更包含視需要而加入的第三元件，此種第三元件和第一、第二元件不同。在第二元件直接與中心核連接的情形中，所述中心核的另一端(即，未與第二元件連接的自由端)可視需要而為半胱胺酸殘基，此一殘基可用以引入非必要的第三元件。具體來說，半胱胺酸殘基的硫氫基可和一PEG鏈上的順丁烯二醯亞胺基反應，而此一與中心核連接的PEG鏈在此稱為「耦合臂」；上述耦合臂的自由端帶有四嗪基或環辛烯基。如此一來，第三元件即可透過iEDDA反應而與耦合臂連接。在所述接合單元包含第二與第三元件的情形中，第一與第二元件其中至少一種較佳為一效應元件，而第三元件則可以是能改善接合單元藥動學性質的元件。分子量為20,000至50,000道耳頓(daltons)的長PEG鏈就是一種能改善接合單元藥動學性質的元件。
＜ II ＞ 含胜肽核的多臂接合物的用途
在臨床醫學領域中，根據本揭示內容第一態樣的接合單元可用於治療多種疾病。因此，本揭示內容的第二種態樣是關於治療這些疾病的方法。根據本揭示內容多種實施方式，用以治療特定疾病的方法包含以下步驟：對有需要的個體投予治療有效量的接合單元，所述接合單元可以是根據本揭示內容上述態樣與實施方式的任一種接合單元。當可理解，可將所述接合單元以藥學配方的形式施用，此種藥學配方除了包含本發明接合單元外，還包含適用於所欲給藥方式的藥學上可接受的賦型劑。
為了讓本發明所屬技術領域具有通常知識者能夠理解本揭示內容的某些實施方式，下文舉例說明可用以治療某些特定疾病之接合單元所含的第一與第二元件的組合。
根據本揭示內容某些實施方式，此處提出的接合單元可用以治療中樞神經系統(central nervous system，CNS)疾病，如多發性硬化症(multiple sclerosis)與阿滋海默症。於治療多發性硬化症時，第一元件可以是芬戈莫德、芬戈莫德磷酸鹽、干擾素-β或對整合素-α4專一的scFv。於治療阿滋海默症時，第一元件可以是對β-類澱粉蛋白專一的scFv。
根據本揭示內容其他實施方式，所述接合單元可用以治療感染性疾病，此種接合單元包含以對病毒蛋白或細菌蛋白專一的scFv (作為第一元件)。在一較佳的實施方式中，所述病毒蛋白可以是呼吸道融合病毒(respiratory syncytial virus，RSV)的F蛋白、人類免疫缺陷病毒第I型(human immunodeficiency virus type 1 HIV-1)的gp120蛋白、A型流感病毒(influenza A virus)的血球凝集素A (hemagglutinin A，HA)蛋白或巨細胞病毒(cytomegalovirus)的醣蛋白；而細菌蛋白則可以是革蘭氏陰性菌(Gram(-) bacteria)的內毒素(endotoxin)、困難梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficile )的表面抗原、金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus )的壁脂酸(lipoteichoic acid)、炭疽桿菌(Bacillus anthracis )的炭疽毒素(anthrax toxin)或大腸桿菌(Escherichia coli )的第I型或第II型類志賀毒素(Shiga-like toxin type I or II)。
為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。
為了便於說明，此處整理了說明書、實施例與附隨申請專利範圍中所用的某些詞彙。除非本說明書另有定義，此處所用的科學與技術詞彙的含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。
在不和上下文衝突的情形下，本說明書所用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型；而所用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。此外，在本說明書與申請專利範圍中，「至少一」與「一或更多」等表述方式的意義相同，兩者都代表包含了一、二、三或更多。更有甚者，在本說明書與申請專利範圍中，「A、B及C其中至少一者」、「A、B或C其中至少一者」以及「A、B和/或C其中至少一者」係指涵蓋了僅有A、僅有B、僅有C、A與B兩者、B與C兩者、與C兩者、以及A、B與C三者。
雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10%、5%、1%或0.5%之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。當可理解，除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一端點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。
本揭示內容一般係關於多種分子構建體，其中每一分子構建體包含一標的元件(T)與一效應元件(E)，在本說明書中有時將這些分子構建體稱為「T-E分子」、「T-E藥物」或「T-E藥品」。
在此處，「標的元件(targeting element)」一詞係指分子構建體能夠直接或間接結合到一目標標的(如，一細胞表面上的受體或一組織中的蛋白質)的部分，因而能夠協助將本發明分子構建體遞送到目標標的。在某些例子中，標的元件可將所述分子構建體導引至鄰近目標細胞處。在其他情形中，標的元件可專一地結合到目標細胞表面上的分子；或標的元件可和第二分子專一地結合，而此一第二分子能夠專一地結合到目標細胞表面上的分子。在某些例子中，一旦標的元件與目標標的接合之後，標的元件可將本發明分子構建體內化，而使其移動到目標細胞的細胞質內。標的元件可以是細胞表面受體的抗體或配體；或者是可和上述抗體或配體結合的分子，因而能夠間接地將本發明分子構建體標的到目標部位(譬如所選定的細胞表面)。相較於沒有標的功能的治療藥物，利用本發明分子構建體能夠加強或有利於效應元件(治療藥劑)在疾病部位的局部化(localization)。上述局部化是一種程度或相對的比例，而不是讓效應元件在疾病部位絕對或完全的局部化。
根據本發明，「效應元件(effector element)」一詞係指一旦分子構建體到達目標部位後，所述分子構建體中能夠發揮生物活性(譬如，誘發免疫反應、發揮細胞毒性及與其相似者)或其他功能活性(譬如招募其他經半抗原標記的治療用分子)的部分。「效應」可指治療性或診斷性的效果。效應元件包含能夠和細胞和/或細胞外免疫調節因子結合的元件。上述效應元件包含如蛋白質、核酸、脂質、碳水化合物、醣蛋白、藥物部分(包含小分子藥與生物製劑)、化合物元素及同位素等物質，也包含上述物質的片段。
雖然在此處利用「第一」、「第二、「第三」等詞彙來描述多種元件、部件、區域和/或區段，這些元件(以及部件、區域和/或區段)不受上述修飾詞的限制。此外，除非上下文有明示的說明，使用這些序數並未隱含序列或順序。反之，這些詞彙僅是用來區分各元件。因此，亦可將下文所述的第一元件命名為第二元件，而不會悖離例示性實施方式所揭示的內容。
在此處，「連接(link)」、「耦接(couple)」以及「複合(conjugate)」等詞可互換使用，且都是用來指稱透過直接或間接的連接關係，將兩個元件連接在一起。
「多肽(polypeptide)」一詞在此係指具有至少兩個胺基酸殘基的聚合物。一般來說，多肽包含2到200個胺基酸殘基；在較佳的情形中，是2到50個殘基。在本說明書中所提及的胺基酸序列涵蓋了此種序列的L-、D-或β-胺基酸等形式。多肽亦包括胺基酸聚合物，其中有一或多個胺基酸殘基是與一天然胺基酸相應的人工化學類似物，當然也包括天然產生的胺基酸聚合物。此外，此一詞彙亦涵蓋以多肽鏈或其他方式連接的胺基酸，上述其他方式如經修飾的連接(modified linkage)，譬如以α-酯(α-ester)、β-酯(β-ester)、硫醯胺(thioamide)、磷醯胺(phosphoramide)、氨基甲酸酯(carbomate)、羥基酯(hydroxylate)鍵、以及與其相似者來取代多肽鍵。
於一些實施方式中，本發明範圍亦涵蓋了其他相較於所述序列具有保守性置換的蛋白。於多種實施方式中，有一、二、三、四或五個不同的殘基經過置換。在此處，「保守性置換(conservative substitution)」一詞是指所述胺基酸置換不會明顯地改變分子活性(譬如生物或功能活性和/或專一性)。一般來說，保守性胺基酸置換是利用另一種具有相似化學性質(如電荷或疏水性)的胺基酸來取代某一胺基酸。某些保守性置換包括「類似物置換」，亦即以非標準(如罕見或合成等)胺基酸來取代標準胺基酸，而上述非標準胺基酸和被取代的原有胺基酸之間的差異極小。可由標準胺基酸經人工修飾而在不會大幅改變原有胺基酸結構的前提下，得到所述的胺基酸類似物，譬如異構物或代謝前驅物等皆屬之。
於一些實施方式中，本案的範圍亦涵蓋和任何所述序列具有至少80%序列相似度的任何序列，上述序列相似度較佳為至少85%或90%、更佳為至少95%或98%。
此處針對多肽序列所述的「胺基酸序列相似度百分比(Percentage (%) amino acid sequence identity)」係指候選序列的胺基酸殘基與參考多肽序列的胺基酸殘基完全相同的百分比；於進行上述比對時，可將所述的候選多肽片段與所述的特定多肽片段並排，並於必要時引入間隙，以使二序列形成最高的序列相似度；在計算相似度時，保守性置換的胺基酸殘基視為不同的殘基。相關領域已有多種方法可用以進行上述並排，譬如可公開取得的軟體如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)等。本發明所屬技術領域中具有通常知識者在進行並排時，可選擇適當的參數與計算方式，以得到最佳的排列方式。在本說明書中，二多肽序列間的序列比較是採用美國國家生物科技資訊中心(Nation Center for Biotechnology Information，NCBI)所提供的蛋白質-蛋白質BLAST分析資料庫Blastp來進行。候選多肽序列A相較於參考多肽序列B的胺基酸序列相似度(在本說明書中亦稱之為多肽序列A與多肽序列B具有特定百分比(%)的胺基酸序列相似度)的計算方式如下：
Figure TWI614023BD00001
% 其中X是利用BLAST序列並排程式對序列A、B進行排列後所得到的相同胺基酸殘基數目(identical matches)，而Y是A、B二序列中較短者的胺基酸殘基總數。
「聚乙二醇化胺基酸(PEGylated amino acid)」一詞在此係指帶有一個胺基(amino group)與一個羧基(carboxyl group)的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)鏈。一般來說，聚乙二醇化胺基酸的結構式為NH2 -(CH2 CH2 O)n -COOH。在本揭示內容中，n值介於1到20之間；較佳是介於2至12。
在此處一多肽的「端」係指位於該多肽N-或C-端點的胺基酸殘基。在描述一聚合物(譬如此處所述的聚乙二醇)的組成單元時時，「端」則是指在聚合物骨架末端的部分。在本說明書與申請專利範圍中，「自由端」一詞是用來指稱並未與另一個分子形成化學鍵結的末端胺基酸殘基或構成單元。
「抗原(antigen或Ag)」一詞係指能夠導致免疫反應的分子。此種免疫反應可能涉及分泌性(secretory)、荷爾蒙性(humoral)和/或細胞級(cellular)的抗原專一反應。在本揭示內容中，「抗原」一詞係指蛋白質、多肽(包括其突變株或具有生物活性的片段)、多醣、醣蛋白、醣脂質、核酸或上述之組合。
在本說明書與申請專利範圍中，「抗體(antibody)」一詞應以廣義方式解釋，且包含完整組裝的抗體、可和抗原結合的抗體片段，譬如抗原結合片段(Fab/Fab’)、F(ab’)2 片段(具有彼此以雙硫鍵連接的兩個Fab部分)、可變片段(variable fragment，Fv)、單鏈可變片段(scFv)、雙專一性單鏈可變片段(bi-scFv)、奈米抗體(nanobodies)、單抗體(unibodies)以及雙體抗體(diabodies)。「抗體片段」包含完整抗體的一部分，較佳為包括完整抗體的抗原結合區域或可變區域。在典型的例子中，「抗體」係指實質上由免疫球蛋白基因或其片段所編碼的一或多種多肽所組成的蛋白質。習知的免疫球蛋白基因包括κ (kappa)、λ (lambda)、α (alpha)、γ (gamma)、δ (gamma)、ε (epsilon)與μ (mu)等恆定區基因(constant region gene)、以及無數的免疫球蛋白可變區基因(variable region genes)。輕鏈通常歸類為κ (kappa)或λ (lambda)。重鏈通常歸類為γ (gamma)、μ (mu)、α (alpha)、δ (gamma)或ε (epsilon)，基於這些結構，定義出了以下類型的免疫球蛋白：IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE。典型的免疫球蛋白抗體結構是一種四聚物(tetramer)。每一個四聚物是由兩條相同的多肽鏈所組成，且每一對分別有一「輕」鏈(約25 kDa)與一「重」鏈(約50-70 kDa)。每一鏈的N-端界定了一個可變區域，包含約100至110個或更多的胺基酸，其主要負責抗原辨識。可變輕鏈(variable light chain，VL )與可變重鏈(variable heavu chain，VH )等詞就是分別指上述的輕鏈與重鏈。根據本揭示內容的實施方式，可藉由改變天然抗體或利用重組DNA方式重新合成上述抗體片段。於本揭示內容一些實施方式中，上述抗體和/或抗體片段可具有雙專一性，且可有多種不同的構形。舉例來說，雙專一性抗體可包含二個不同的抗原結合部位(可變區域)。於多種實施方式中，可利用融合瘤技術或重組DNA技術來製備雙專一性抗體。於一些實施方式中，雙專一性抗體對至少兩種不同的表位(epitope)有結合專一性。
「專一地結合(specifically bind)」一詞在此處係指抗體或其抗原結合片段能夠和抗原結合的能力，上述結合的解離常數(dissociation constant，Kd)小於約1×10− 6 M、1×10− 7 M、1×10− 8 M、1×10− 9 M、1×10− 10 M、1×10− 11 M或1×10− 12 M；或者是或額外地，相較於其對於非專一性抗原的結合親和力，上述抗體或其抗原結合片段與抗原結合的親和力為兩倍以上。
「治療(treatment)」一詞係指預防性(如，預防用藥)、療癒性或緩和性的處置，藉以達到所欲的藥學和/或生理學效果；而治療的行為在此包括上述預防性、療癒性或緩和性的處置。具體來說，治療在此係指對於可能患有一醫療疾患、症狀、疾病或與疾患相關的異常、或易於罹患一疾患的個體施用或投予本發明分子構建體或包含此分子構建體的藥學組合物，以期能部分地或完全地緩和、改善、減輕特定異常和/或病症的一或多種症狀或特徵，或是延緩其發生、阻礙其進展、減輕其嚴重性和/或減低發生率。亦可對尚未表出現疾病、異常和/或病症徵兆的個體和/或出現早期徵兆的個體進行治療，以期降低發展出與該疾病、異常和/或病症相關的病理變化的風險。
在此處，「有效量(effective amount)」一詞係指本發明分子構建體的用量足以招致所欲的治療反應。藥劑的有效量不必然能夠治癒疾病或病症，但能夠延緩、阻礙或防止該疾病或病症的發生，或是可緩減與疾病或病症相關的病徵。可將治療有效量可分成一、二或更多劑，而以適當的劑型在指定期間內施用一次、二次或更多次。具體的治療有效量取決於多種因素，例如欲治療的特定狀況、個體的生理條件(如，個體體重、年齡或性別)、接受治療的個體類型、治療持續時間、併行治療(如果有的話)的本質以及所用的具體配方和化合物或其衍生物的結構。舉例來說，可將治療有效量表示成活性成分的總重量，譬如以克、毫克或微克來表示；或表示成活性成分重量相對於體重的比例，譬如表示為每公斤體重多少毫克(mg/kg)。
所述「施用(application)」與「投予(administration)」等詞在此可交替使用，其係指將本發明之分子構建體或藥學組合物提供給需要治療的個體。
「個體(subject)」或「患者(patient)」等詞在此可交互使用，且是指可接受本揭示內容之分子構建體、藥學組合物和/或方法處置的動物(包含人類)。除非另有指明，「個體」或「患者」一般包含雄性與雌性。「個體」或「患者」包含任何可因本揭示內容的處置而獲益的哺乳類動物。所述「個體」或「患者」的例示包含，但不限於：人類、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴子、豬、山羊、牛、馬、狗、貓、鳥和禽類。在一實例中，所述患者為人類。所述哺乳類動物涵蓋哺乳動物綱的所有成員，包括人類、靈長類動物、家畜和農畜(如兔子、豬、綿羊和牛)、動物園動物或競賽用動物、寵物，以及齧齒類動物(如，小鼠和大鼠)。「非人類哺乳動物」一詞則涵蓋除了人類以外的所有哺乳動物綱成員。
本揭示內容至少部分是基於建構出了T–E藥物，此種T-E藥物可被遞送至目標細胞、目標組織或器官，且其在這些部位的比例相對高於在血液循環、淋巴系統以及其他細胞、組織和器官中的比例。當實現上述情境時，即可提升T-E藥物的療效，且其副作用與毒性的數目和嚴重性都會降低。相較於不含標的元件的藥物，以T-E分子的形式來投遞藥物時，發揮療效的效應物所用的濃度可能較低。因此，可在較低的劑量下施用治療用的效應物而不會減損其有效性，但卻能同時降低其副作用與毒性。
可因較佳藥物標的而獲益的疾病
若是可將藥物標的到疾病部位，亦即若是可使藥物在疾病部位(相對於在正常組織或器官)局部化或有較優勢的濃度，就能夠改善用以治療許多疾病的藥物，使其具備較佳的療效與安全性。某些抗體藥物是以感染性微生物或其毒素產物為標的，若使這些抗體藥物具備招募免疫細胞的能力，以吞噬或清除與抗體結合的粒子，就能夠提升其療效。下文提出一些主要的例示性疾病，若是能使得這些疾病所用藥物在疾病部位或細胞有較佳的分布比例或能夠招募可吞噬細胞的免疫細胞，就可以改善這些藥物。
I 中樞神經系統疾病
於治療中樞神經系統(CNS)疾病時，通常需要讓治療藥劑通過血腦障礙(blood-brain barrier，BBB)以進入中樞神經系統。某些治療藥劑不會進入中樞神經系統；此類藥物藉由調節周邊的某些活性(如免疫活性)，再藉由這些活性進一步調控中樞神經系統中的病況。BBB是由襯接CNS中微血管的內皮細胞所形成。和周邊組織與器官中的微血管不同，BBB中的微血管內皮細胞是由緊連蛋白(occludin)、密連蛋白(claudin)與間隙連接(junctional adhesion)分子形成的緊密連接(tight junction)將其連接在一起。
β-類澱粉蛋白是引發阿滋海默症的主因之一，目前臨床應用中已開發出至少六種對β-類澱粉蛋白專一的抗體，分別是：阿度卡尼單抗(aducanumab)、巴匹珠單抗(bapineuzumab)、克雷內治單抗(crenezumab)、蓋坦德單抗(gantenerumab)、拍珠單抗(ponezumab)與蘇蘭珠單抗(solanezumab)。這些抗體對於改善阿滋海默症的療效通常未臻理想。據信這是因為若要讓這些抗體發會療效，必須要有非常大量的抗體通過BBB進入CNS中的受損部位才行。然而，只有非常少量的抗體能夠通過BBB。
已知可運用干擾素-β-1a (IFN-β-1a)與干擾素-β-1b (IFN-β-1b)來治療多發性硬化症(MS)。IFN-β-1a是由哺乳類細胞所生產，而IFN-β-1b則是由大腸桿菌所生產；這些藥品是由166個胺基酸殘基所組成的單鏈蛋白，其帶有一個雙硫鍵。據稱上述治療藥劑可使受治療患者的MS復發率降低至18-38%。IFN-β-1a與IFN-β-1b的作用機制非常複雜且並未完全為研究人員所瞭解，其過程涉及了抗發炎免疫細胞與因子的正向調控以及促發炎T細胞與因子的負向調控。對MS患者施予IFN-β治療也會降低通過BBB的促發炎T細胞數量。但目前仍不明瞭IFN-β-1a與IFN-β-1b是否至少部分藉由進到CNS中的受損部位而發揮其藥效。
當將抗體或蛋白藥物施用至身體的周邊系統中時，僅有一小部分(約0.1%)會到達CNS，因為只有很小一部分的蛋白藥物能夠穿透BBB。然，已知在許多CNS疾病(包括阿滋海默症與多發性硬化症)中，在患病部位的發炎反應會使得BBB防線崩解，進而提升該部位的通透性。因此，本發明認為若可將較為大量的抗β-類澱粉蛋白或IFN-β-1a與IFN-β-1b抗體導引至BBB，治療藥劑就有較高的機會通過BBB進而提升療效。
更有甚者，已開發出一些治療藥劑能用以抑制發炎性免疫細胞通過BBB。最著名的例子之一就是對細胞黏著分子整合素α4專一的那他珠單抗(natalizumab)。所述抗體能夠抑制發炎性免疫細胞附著到襯接內皮層的BBB並穿透BBB，進而發揮其功能。雖然已證實那他珠單抗有一定的療效，但此種藥物有嚴重的免疫抑制副作用。具體來說，那他珠單抗會導致進行性多處腦白質病(progressive multifocal leukoencephalopathy)，這是由JC病毒(John Cunningham virus)引發的伺機性感染。因此，本發明認為若能將大量的抗整合素α4抗體招募至BBB，就可以在較低給藥劑量下達到較佳的療效，因而可降低副作用。
形成BBB的微血管中的內皮細胞能夠表現運鐵蛋白受器與胰島素受器，這些受器可分別調控運鐵蛋白與胰島素分子的胞吞轉送作用(transcytosis)而使其到達大腦薄壁(cerebral parenchyma)。當使用運鐵蛋白受器作為運輸通道時，僅有一小部分可穿透而剩餘的絕大多數都會被困住或降解。因為在脈管系統其他部分中襯接微血管的內皮細胞不會表現運鐵蛋白受器，BBB中內皮細胞上的運鐵蛋白受器可作為部位專一的抗原，而能夠用以招募所投予的治療藥劑。一旦治療藥劑集中在BBB中，就會有較高比例的治療藥劑能夠穿透微血管。
本發明亦體認到，一旦建立了將藥物導向至BBB的機制，就可以進一步探討利用各種抗發炎藥物來治療多種CNS疾病的療效；上述藥物譬如抗TNF-α、抗-IL12/IL-23、抗-IL17以及抗CD3。
對於對整合素α4專一的抗體藥物，可利用運鐵蛋白受器作為目標部位招募者。於治療阿滋海默症時，效應部分可以是數個對β-類澱粉蛋白專一的scFv；於治療多發性硬化症時，效應部分可以是數個IFN-β-1a或IFN-β-1b或數個對整合素α4專一的scFv。
本揭示內容的多種實施方式揭示了數種T-E分子，這些分子可以是單一個多臂接合物構形或是聯合接合物(joint-linker)構形，其各自帶有對運鐵蛋白受器專一的scFv (作為標的元件)以及IFN-β-1a或IFN-β-1b或對整合素α-4專一的scFv (作為效應元件)。替代性的實施方式揭露了多種T-E分子，這些分子可以是單一個多臂接合物構形或是聯合接合物構形，其各自帶有對運鐵蛋白受器專一的scFv (作為標的元件)以及對β-類澱粉蛋白專一的scFv (作為效應元件)。
芬戈莫德是一種免疫抑制藥物，這是一種分離自某些真菌的天然產物—多球殼菌素(myriocin)的衍生物。芬戈莫德已取得許可能用以減少復發-緩解型多發性硬化症的復發。在活體內，芬戈莫德會被磷酸化以形成芬戈莫德磷酸鹽，其結構與天然存在的神經鞘胺醇-1-磷酸鹽(sphingosine-1-phosphate，S1P)相似；芬戈莫德磷酸鹽是一種細胞外脂質介質，且可和5種S1P受器中的4種結合。S1P受器表現於淋巴細胞上，且參與了淋巴細胞遷移。芬戈莫德常見的藥理機制之一是抑制淋巴細胞離開淋巴樣組織而進入循環(並因此進入CNS)。芬戈莫德可以穿過BBB而進入CNS，且CNS中許多類型的細胞會表現S1P受器，這些受器與細胞擴增、型態與遷移等作用相關。據信芬戈莫德可直接作用於CNS上。施用芬戈莫德所導致的常見副作用包括頭痛、疲勞；也會造成嚴重的副作用如皮膚癌、黃斑部水腫與致命的感染(如出血性局部腦炎)。
一個芬戈莫德分子帶有一個NH2 基，可透過此官能基和帶有NHS基的雙功接合臂耦接。根據本揭示內容的一較佳實施方式，可製備一T-E構建體，其帶有一標的元件可將構建體遞送至BBB，並帶有一芬戈莫德的載藥束以作為效應元件。對於芬戈莫德載藥束，一接合單元中可加入5至10個芬戈莫德分子；譬如可利用可裂解接合臂(cleavable linker)或不可裂解合臂(non-cleavable linker)將芬戈莫德分子耦接至接合單元的連接臂。由於患者攝入芬戈莫德之後，會將其轉換成活性形式的芬戈莫德磷酸鹽(類似S1P)，因此也可利用芬戈莫德磷酸鹽來製備載藥束。可將帶有芬戈莫德或芬戈莫德磷酸鹽載藥束的接合單元耦接上一或兩個對運鐵蛋白受器I專一的scFv。在施用所述分子構建體之後，一部分的分子構建體會被帶到BBB。從可裂解接合臂上釋出的芬戈莫德分子可通過BBB並進入CNS。或者是，有部分完整的構建體可進入CNS。可運用多種裂解機制來設計可裂解接合臂。一種常見的方式是加入S-S鍵，在標的組織部位可藉由還原反應使S-S雙硫鍵裂解。在接合物設計的領域中，另一種常用的可裂解鍵是使用胺基酸之間對於蛋白酶(如基質金屬蛋白酶)敏感的多肽鍵。
某些例示性的T-E分子可以是單一個多臂接合物構形或是聯合接合物構形，其各自帶有一或兩個對運鐵蛋白受器專一的scFv (作為標的元件)以芬戈莫德(作為效應元件)。在所有此類分子構建體中，連接臂和效應元件之間的連接可以是不可裂解或可裂解鍵結。在施用本發明提出的分子構建體以治療各種CNS疾病時，標的部分可具有一或兩個對運鐵蛋白受器或胰島素受器專一的scFv。可使用一或兩個對運鐵蛋白受器或胰島素受器專一的scFv。若所用的scFv有相對較高的親和力(Kd ＜ 1x10-9 )，可使用一個scFv；若所用的scFv的親和力一般(1x10-9 ＜ Kd ＜ 5x10-8 )，可使用兩個scFv。在較佳的情形中，不會使用超過兩個的對運鐵蛋白受器或胰島素受器專一的scFv，以避免結合後藥物的受器交聯以及胞吞作用。
II 感染性疾病
雖然已針對各種會對人類或動物造成嚴重感染的病毒、細菌與真菌製備出大量的單株抗體，卻只有為數不多的單株抗體經許可能夠作為預防性或治療性藥物來對抗感染。此一不足可歸因於幾個主要因素，其中最主要的一個是這些感染性微生物及其產物有多種不同的血清型，且對於特定抗體會有不同的反應程度。另一個原因是所標的之微生物會發生突變，因而躲過特定抗體所引發的反應。
本發明提出的T-E分子設計亦可用於預防與治療感染性疾病。複數個連接臂可提升其對標的感染性微生物或其產物的結合親和力與專一性，並可誘發免疫功能以利廓清微生物及其產物。本發明認為提升結合親和力以及招致免疫廓清功能能夠在某種程度上克服血清型差異與突變的問題。此種改良能夠提升候選抗體預防與治療感染性疾病的效果。可根據本發明來重新設計許多在臨床試驗中無法達到預期效果的抗體，並再次測試其效果。
本發明一組較佳的實施方式使用了聯合接合物構形，其帶有一個用於標的之接合單元、以及一個用於招募效應功能的接合單元。另一組較佳的實施方式使用了單一接合單元，其具有複數個連接臂以供連接標的元件、以及一個耦合臂以供連接效應元件。所述標的元件可以是以下兩大類中的任一種：(1)對微生物表面成分或微生物的產物專一的scFv或sdAb，譬如人類免疫缺陷病毒第I型(HIV-1)的膜蛋白gp120、呼吸道融合病毒(RSV)F蛋白、困難梭狀芽孢桿菌或金黃葡萄球菌的表面抗原、或是革蘭氏陰性菌的內毒素或大腸桿菌的類志賀毒素；或(2)病毒的細胞表面受器的細胞外部分，譬如HIV-1的gp120-結合CD4域。
效應元件可以是一或兩個對IgG的Fc受器專一的scFv或sdAb；上述受器譬如：FcγRIIA (CD32)、FcγRIIIB (CD16b)或FcγRI (CD64)。這些受器表現於嗜中性白血球、巨噬菌體與嗜伊紅白血球上，且是調控與抗體結合之微生物的吞噬作用的主要分子。FcγRIIA與FcγRIIIB可和IgG結合，但親和力較低(Kd約為10-6 至10-7 )；而FcγRI可和IgG1與IgG3結合，且親和力較高(Kd約10-9 )。在較佳的情形中，可使用對FcγRIIA或FcγRIIIB專一的scFv或sdAb，因為這些分子在和IgG競爭與受器結合時較有優勢。
對細菌表面上的碳水化合物抗原專一的抗體通常親和力不佳，且主要表現於IgM上而非IgG上。IgM分子有10個Fv (抗原結合部位)。然而，一個IgM分子的分子量約為1,000 kDa，其無法穿過微血管而到達血管外空間。當使用本發明提出的構形時，帶有六個scFv或10個sdAb的分子構建體的分子量約為150 kDa。
於使用抗體藥物來消滅病毒時，關鍵之一在於藥物不能引發透過FcR介導進而促進病毒感染。在這類情形中，結合後的病毒粒子不會被吞噬與消化。有些病毒(譬如登革熱病毒)在吞噬細胞內會擴增。因此，若病毒粒子能夠接近細胞並進入結合後的細胞而不會被消滅，病毒就可在受感染細胞內擴增。因此，根據本發明一組較佳的實施方式，所述分子構建體帶有二或更多個對Fcγ受器專一的scFv，其可和吞噬細胞表面上多個Fcγ受器分子結合，而使得結合後的病毒分子必定會進入吞噬作用路徑中。
已有多種對病毒、細菌或其產物專一的抗體進入臨床試驗，但只有一種對RSV專一的抗體取得上市許可。即使是上述對於RSV專一的抗體，經許可的用途也僅限於預防而無法用以治療正在發生中的感染。本領域亟需設計出能夠用以治療已受感染的個體的抗-RSV抗體。其他抗體仍在臨床開發階段，或無法通過臨床試驗。利用本發明提出的分子構建體平台，可以使用這些抗體並改良其藥效。所述抗體至少包括以下抗體： (1) 對呼吸道融合病毒F蛋白專一的帕利珠單抗(palivizumab)與非維珠單抗(felvizumab)； (2) 對人類免疫缺陷病毒第I型gp120專一的蘇韋珠單抗(suvizumab)； (3)對B型肝炎病毒B型肝炎表面抗原(HBsAg)專一的利韋單抗(libivirumab)、艾韋單抗(exbivirumab)與妥韋單抗(tuvirumab)； (4) 對A型流感病毒血球凝集素A專一的CR6261單抗與非力弗單抗(firivumab)； (5) 對巨細胞病毒醣蛋白專一的瑞加韋單抗(regavirumab)與司韋單抗(sevirumab)； (6) 對狂犬病病毒醣蛋白專一的雷韋單抗(rafivirumab)； (7) 對困難梭狀芽孢桿菌表面抗原專一的阿克托克單抗(actoxumab)與貝挫妥單抗(bezlotoxumab)； (8) 對炭疽桿菌炭疽專一的歐必妥昔單抗(obiltoxaximab)與雷昔庫單抗(raxibacumab)； (9) 對綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa )血清型IATS O11專一的帕諾庫單抗(panobacumab；是一種人類IgM單株抗體)； (10) 對金黃葡萄球菌凝集因子A (clumping factor A)專一的替非珠單抗(tefibazumab)與托沙妥單抗(tosatoxumab)； (11) 對格蘭氏陰性菌內毒素專一的埃巴單抗(edobacomab；用以治療敗血症)； (12) 對金黃葡萄球菌壁脂酸專一的帕昔單抗(pagibaximab；用以治療葡萄球菌敗血症)； (13) 對炭疽毒素專一的雷昔庫單抗(raxibacumab；人類單株抗體)； (14) 對大腸桿菌第I型或第II型類志賀毒素專一的普托昔單抗(pritoxaximab)、司托昔單抗(setoxaximab)與烏珠單抗(urtoxazumab)。
根據本揭示內容數個實施方式，用以治療感染性疾病的T-E分子可採用聯合接合物構形，其包含對呼吸道融合病毒(RSV)的F蛋白或對人類免疫缺陷病毒第I型(HIV-1)之gp120專一的scFv以作為標的/捕獲元件，以及對FcγRIIA (CD32)或FcγRIIIB (CD16b)專一的scFv以作為效應/廓清元件。根據本揭示內容的實施方式，某些T-E分子可採用單一接合單元或聯合接合物構形，其包含對革蘭氏陰性菌內毒素或金黃葡萄球菌壁脂酸專一的scFv以作為標的/捕獲元件，以及對CD32或CD16b專一的scFv以作為效應/廓清元件。在革蘭氏陰性菌感染的過程中，對於可能造成生命威脅的敗血症狀，加速移除內毒素應可降低在細胞介素(如TNF-α、IL-1等)的大量釋出(即，細胞介素風暴)。在施用本發明所述的分子構建體平台來治療感染性疾病時，效應部分可帶有一或兩個對CD32或CD16b專一的scFv。可使用一或兩個對CD32 (CD32a或CD32b)或CD16b專一的scFv。若所用的scFv有相對較高的親和力(Kd ＜ 1x10-9 )，可使用一個scFv；若所用的scFv的親和力一般(1x10-9 ＜ Kd ＜ 5x10-8 )，可使用兩個scFv。在較佳的情形中，不會使用超過兩個的對CD32或CD16b專一的scFv，以避免結合後藥物的受器交聯以及胞吞作用。
第一節 用以治療特定疾病的多臂接合物
(i) 用於多臂接合物的多肽核
本揭示內容的第一態樣是關於一種接合單元，其包含：(1)一中心核，其包含2-15個離胺酸(K)殘基；以及(2) 2-15個連接臂，分別連接於中心核的各K殘基。本發明中心核的特徵在於其N-或C-端帶有疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基。
在製備本發明接合單元時，將一端帶有N-羥基琥珀醯亞胺(N-hydroxysuccinimydil，NHS)基且另一端帶有一官能基(如，NHS基、順丁烯二醯亞胺基、疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基)的PEG鏈連接到K殘基上；具體來說，利用上述NHS基和K殘基上的氨基形成醯胺鍵，進而將PEG鏈連接到中心核上。在本揭示內容中，將連接到K殘基之後的PEG鏈稱為連接臂，此連接臂的自由端帶有官能基。
根據本揭示內容的實施方式，上述中心核是多肽核，其長度為8-120個胺基酸殘基，且包含2至15個離胺酸(K)殘基，其中每一個K殘基和下一個K殘基之間以一填充序列隔開。
根據本揭示內容的實施方式，填充序列包含甘胺酸(glycine，G)與與絲胺酸(serine，S)殘基；在較佳的情形中，填充序列是由選自G、S及其組合的2-15個殘基所組成。舉例來說，填充序列可以是： GS、 GGS、 GSG、 GGGS (序列編號：1), GSGS (序列編號：2)、 GGSG (序列編號：3)、 GSGGS (序列編號：4)、 SGGSG (序列編號：5)、 GGGGS (序列編號：6)、 GGSGGS (序列編號：7)、 GGSGGSG (序列編號：8)、 SGSGGSGS (序列編號：9)、 GSGGSGSGS (序列編號：10)、 SGGSGGSGSG (序列編號：11)、 GGSGGSGGSGS (序列編號：12)、 SGGSGGSGSGGS (序列編號：13)、 GGGGSGGSGGGGS (序列編號：14)、 GGGSGSGSGSGGGS (序列編號：15)或 SGSGGGGGSGGSGSG (序列編號：16)。
兩個離胺酸殘基之間的填充序列可以由各種長度和組合的甘胺酸與絲胺酸殘基所組成。在離胺酸殘基數目較少的多肽核中，可使用較長的填充序列；在離胺酸殘基數目較多的多肽核中，則可使用較短的填充序列。除了甘胺酸與絲胺酸之外，可在填充序列中加入親水性胺基酸殘基，如天冬胺酸與組胺酸。除了由甘胺酸與絲胺酸殘基組成的填充序列之外，也可使用其他填充序列，譬如可使用常見人類血清蛋白(如白蛋白與免疫球蛋白)中的可撓性、可溶性環。
根據本揭示內容某些較佳的實施方式，中心核包含2-15個單元的G1-5 SK序列。或者是，此多肽核的序列為(GSK)2-15 ；即，多肽包含至少兩個連續的GSK單元。舉例來說，本發明中心核可包含下列胺基酸序列： Ac-CGGSGGSGGSKGSGSK (序列編號：17)、 Ac-CGGSGGSGGSKGSGSKGSK (序列編號：18)或 Ac-CGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSKGSK (序列編號：19)， 其中Ac代表乙醯基。
根據本揭示內容某些實施方式，中心核是序列為(Xaa -K)n 的多肽核，其中Xaa 是聚乙二醇化胺基酸，其具有2至12個乙二醇(EG)重複單元，且n是2至15的整數。
如上文所述，本發明中心核的特徵在於其N-或C-端帶有疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基。根據本揭示內容某些實施方式，本發明中心核的N-或C-端胺基酸殘基帶有疊氮基或炔基。帶有疊氮基的胺基酸殘基可以是：L-疊氮高丙胺酸(AHA)、4-疊氮-L-苯丙胺酸、4-疊氮-D-苯丙胺酸、3-疊氮-L-丙胺酸、3-疊氮-D-丙胺酸、4-疊氮-L-高丙胺酸、4-疊氮-D-高丙胺酸、5-疊氮-L-烏胺酸、5-疊氮-D-烏胺酸、6-疊氮-L-離胺酸或6-疊氮-D-離胺酸。舉例來說，本發明中心核可具有以下序列： Ac-(GSK)2-7 -(G2-4 S)1-8 -AAH 、 Ac-AAH -(SG2-4 )1-8 -(GSK)2-7 、 Ac-AAH -(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -C、 Ac-C-(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -AAH 、 Ac-K-(Xaa 2-12 -K)2-4 -Xaa 2-12 -AAH 、 Ac-AAH -Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)2-4 、 Ac-AAH -Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -C或 Ac-C-Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -AAH ， 其中Xaa 是帶有所述數目的EG重複單元的聚乙二醇化胺基酸，Ac代表乙醯基，而AAH 代表AHA殘基。
帶有炔基的胺基酸的例子包括，但不限於：L-高炔丙基甘胺酸(L-HPG)、D-高炔丙基甘胺酸(D-HPG)、或β-高炔丙基甘胺酸(β-HPG)。在本例中，本發明中心核可具有以下序列： Ac-(GSK)2-7 -(G2-4 S)1-8 -GHP 、 Ac-GHP -(SG2-4 )1-8 -(GSK)2-7 、 Ac-GHP -(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -C、 Ac-C-(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -GHP 、 Ac-K-(Xaa 2-12 -K)2-4 -Xaa 2-12 -GHP 、 Ac-GHP -Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)2-4 、 Ac-GHP -Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -C或 Ac-C-Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -GHP ， 其中Xaa 是帶有所述數目的EG重複單元的聚乙二醇化胺基酸，Ac代表乙醯基，而GHP 代表HPG殘基。
當可理解，目前已可透過商業管道取得多種側鏈帶有疊氮基或炔基的胺基酸與聚乙二醇化胺基酸，這些胺基酸可以帶有保護基團，如叔-丁氧羰基(tert-butyloxycarbonyl，t-boc)或茀甲氧羰基(9-fluorenylmethyloxycarbonyl，Fmoc)，故可輕易用於固態多肽合成。
根據本揭示內容某些實驗例，所用的中心核可包含以下序列： Ac-GHP GGSGGSGGSKGSGSK (序列編號：21)、 Ac-GHP GGSGGSGGSKGSGSKGSK (序列編號：22)、 Ac-AAH GGSGGSGGSKGSGSKGSK (序列編號：23)、 Ac-GHP GGSGGSGGSKGSGSKGSGSC (序列編號：24)、 Ac-C-Xaa 2 -K-Xaa 2 -K-Xaa 2 -K (序列編號：25)或 Ac-C-Xaa 6 -K-Xaa 6 -K-Xaa 6 -K-Xaa 6 -K-Xaa 6 -K (序列編號：26)、 其中Xaa 為帶有指定數目的EG重複單元的聚乙二醇化胺基酸、Ac代表乙醯基、AAH 代表AHA殘基且GHP 代表HPG殘基。
或者是，本發明中心核可和耦合臂連接，此耦合臂的自由端(即，未和中心核連接的一端)帶有一官能基(如，疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基)。在這些情形中，本發明中心核的N-或C-端為半胱胺酸殘基。在製備與耦合臂連接的接合單元時，將一端帶有順丁烯二醯亞胺基且另一端帶有上述官能基的PEG鏈與上述半胱胺酸殘基連接；具體來說，可透過PEG鏈的順丁烯二醯亞胺基和半胱胺酸殘基的硫氫基之間的硫氫-順丁烯二醯亞胺反應將兩者連接在一起。在本揭示內容中，連接到中心核末端半胱胺酸殘基上的PEG鏈稱為耦合臂，且其自由端帶有上述官能基。
在較佳的情形中，耦合臂的自由端帶有四嗪基或高應力炔基(如，環辛烯基或環辛炔基)。這些耦合臂具有2-12個EG單元。根據本揭示內容的實施方式，上述四嗪基為1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪1,2,4,5-四嗪或其衍生物。高應力炔基可以是環辛烯基或環辛炔基。根據本揭示內容的實驗例，所述環辛烯基可以是反式-環辛烯(TCO)基；而環辛炔基的實施例包括，但不限於：二苯并環辛炔(DBCO)、二氟化環辛炔(DIFO)、二環壬炔(BCN)與二苯并環辛炔(DICO)。根據本揭示內容某些實施方式，四嗪基為6-甲基-四嗪。
根據多種實施例，用以與耦合臂連接的中心核包括，但不限於： Ac-(GSK)2-7 -(G2-4 S)1-8 -C-Xaa 2-12 -四嗪、 Ac-(GSK)2-7 -(G2-4 S)1-8 -C-Xaa 2-12 -高應力炔基、 Ac-K-(Xaa 2-12 -K)2-4 -Xaa 2-12 -C-Xaa 2-12 -四嗪、 Ac-K-(Xaa 2-12 -K)2-4 -Xaa 2-12 -C-Xaa 2-12 -高應力炔基、 四嗪基-Xaa 2-12 -C(Ac)-(SG2-4 )1-8 -(GSK)2-7 、 高應力炔基-Xaa 2-12 -C(Ac)-(SG2-4 )1-8 -(GSK)2-7 、 四嗪基-Xaa 2-12 -C(Ac)-Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)2-4 以及 高應力炔基-Xaa 2-12 -C(Ac)-Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)2-4 。
或者是，中心核的一端帶有疊氮基或炔基，而另一端則接上了帶有四嗪基或高應力炔基的耦合臂，茲舉例如下： Ac-AAH -(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -C-Xaa 2-12 -四嗪、 Ac-AAH -(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -C-Xaa 2-12 -高應力炔基、 四嗪基-Xaa 2-12 -C(Ac)-(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -AAH 、 高應力炔基-Xaa 2-12 -C(Ac)-(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -AAH 、 Ac-AAH -Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -C-Xaa 2-12 -四嗪、 Ac-AAH -Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -C-Xaa 2-12 -高應力炔基、 四嗪基-Xaa 2-12 -C(Ac)-Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -AAH 、 高應力炔基-Xaa 2-12 -C(Ac)-Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -AAH 、 Ac-GHP -(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -C-Xaa 2-12 -四嗪、 Ac-GHP -(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -C-Xaa 2-12 -高應力炔基、 四嗪基-Xaa 2-12 -C(Ac)-(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -GHP 、 高應力炔基-Xaa 2-12 -C(AC)-(SG2-4 )0-7 -(GSK)2-6 -(G2-4 S)1-8 -GHP 、 Ac-GHP -Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -C-Xaa 2-12 -四嗪、 Ac-GHP -Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -C-Xaa 2-12 -高應力炔基、 四嗪基-Xaa 2-12 -C(Ac)-Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -GHP 以及 高應力炔基-Xaa 2-12 -C(Ac)-Xaa 2-12 -K-(Xaa 2-12 -K)1-3 -Xaa 2-12 -GHP 。
也可利用重組技術來合成上述多肽，再利用細菌或哺乳類宿主細胞來表現指定的基因區段。如果多肽核的離胺酸殘基數目較多且長度較長，利用重組蛋白技術較佳。這是因為當多肽長度變長時，使用固態合成法發生錯誤的機率會增加，且其純度和/或產量會降低。要運用細菌或哺乳類宿主細胞來產生多肽核時，可在兩個K殘基之間插入長度為2至20個胺基酸殘基的填充序列。此外，由於AHA和HPG並非可由遺傳密碼子編碼的天然胺基酸，這些重組多肽的N-端或C-端殘基可以是半胱胺酸。在表現出重組蛋白並將其純化之後，可使末端的半胱胺酸殘基和短的雙功交聯物反應；上述雙功交聯物的一端帶有可和半胱胺酸殘基的SH基反應的順丁烯二醯亞胺基，另一端則帶有炔基、疊氮基、四嗪基或高應力炔基。
相較於利用常規胺基酸(如甘胺酸與絲胺酸殘基)來合成多肽核，使用聚乙二醇化胺基酸來合成多肽核的步驟較少。此外，可採用不同長度的聚乙二醇化胺基酸(即，帶有不同EG重複單元者)，一方面可提供可撓性與水溶性，另一方面亦可在相鄰的離胺酸殘基之間提供間隔。除了聚乙二醇化胺基酸之外，中心核也可包含人工胺基酸，如D-構形胺基酸、高胺基酸、N-甲基胺基酸等。在較佳的情形中，可使用帶有不同長度聚乙二醇(PEG)的聚乙二醇化胺基酸來建構中心核，因為胺基分子中所含的PEG部分可提供構形上的可撓性，並在用以接合的基團間提供了適當的間隔，還可以提升其水溶性；另外，一般來說，PEG的免疫源性較低。合成帶有聚乙二醇化胺基酸的中心核的方法和合成常規多肽相似。
視需要，本發明中心核可更帶有一乙醯基，以保護位於N端的胺基酸殘基，進而提升其穩定性。
當可理解，連接於中心核的連接臂的數目主要取決於連接於中心核中所含離胺酸殘基的數目。由於本發明中心核包含至少兩個離胺酸殘基，所述接合單元可包含複數個連接臂。
參照第1A圖。如圖所示，接合單元10A包含中心核11a，其帶有一個HPG (GHP )殘基以及四個離胺酸(K)殘基，其間分別以填充序列(以下各圖式中以「···」表示)隔開。HPG殘基和K殘基之間或任兩個K殘基之間的填充序列可以是相同或不同的胺基酸序列。在本實施例中，四個連接臂20a-20d藉由NHS基和離胺酸殘基的氨基間所形成的醯胺鍵而連接到各個離胺酸殘基。當可理解，本說明書所述的多種接合單元間可能有一些共通的特徵，因此針對上述接合單元10A或下述各接合單元所述的某些或全部特徵可能也適用於下文提出的實施例，除非其明顯有悖於特定實施方式的脈絡。為求簡潔，下文可能不會重複說明這些共通特徵。
第1B圖繪示了根據本揭示內容另一種實施方式的接合單元10B。中心核11b有一個半胱胺酸(C)殘基以及六個離胺酸(K)殘基，這些殘基之間分別以填充序列隔開。在本實施例中，接合單元10B包含連接到各個離胺酸殘基的六個連接臂20a-20f。根據本揭示內容的實施方式，連接臂是具有2至20個EG重複單元的PEG鏈。
接合單元1B與第1A圖的接合單元10A不同之處在於接合單元1B更包含耦合臂60。如上文所述，可利用一端帶有順丁烯二醯亞胺基而另一端帶有一特殊官能基的PEG鏈來形成耦合臂60。如此一來，耦合臂60可透過硫氫–順丁烯二醯亞胺反應而連接到中心核11b的半胱胺酸殘基。在本實施例中，耦合臂60的自由端帶有的特殊官能基是四嗪基72。根據本揭示內容的實施方式，耦合臂是具有2至12個EG重複單元的PEG鏈。
當需要在標的部位釋放效應元件時，可以在連接臂中加入一個可裂解鍵；上述裂解鍵可經酸/鹼水解、還原/氧化或酵素作用而裂解。舉例來說，可利用NHS-PEG2-20 -S-S-順丁烯二醯亞胺作為此處所述的耦合臂，這是一種可裂解PEG鏈，其中的S-S雙硫鍵會被緩慢的還原，而NHS基可用來和中心核的氨基接合，進而將PEG鏈連接到中心核上。另外，可利用疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基來取代位在連接臂自由端的順丁烯二醯亞胺基。根據本揭示內容某些實施方式，所述連接臂是帶有2至20個EG重複單元的PEG鏈，且其自由端(即，未與中心核連接的該端)有一雙硫鍵。接著參照第1C圖，圖中所示的五個連接臂21a-21f分別連接到中心核11b的K殘基，這些連接臂是自由端帶有雙硫鍵的PEG鏈。
根據本發明實施方式，連接到中心核的K殘基的連接臂在自由端帶有一官能基(即，順丁烯二醯亞胺基、NHS基、疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基)。在較佳的情形中，當連接臂的自由端是疊氮基、炔基或環辛炔基時，位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基是半胱胺酸殘基，且耦合臂的自由端是四嗪基或環辛烯基。或者是，當連接臂的自由端是四嗪基或環辛烯基時，位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基帶有疊氮基或炔基；或者是位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基是半胱胺酸殘基，且耦合臂的自由端帶有疊氮基、炔基或環辛炔基。
隨著位於連接臂自由端上官能基(即，順丁烯二醯亞胺基、NHS基、疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基)的不同，可以設計帶有相應官能基的功能性元件(譬如，標的元件、效應元件或用以改善藥動學性質的元件)，而使得所述功能性元件可透過任一種下列化學反應而連接到連接臂的自由端： (1) 形成醯胺鍵：在此情形中，連接臂的自由端有一NHS基，且功能性元件有一氨基； (2) 硫氫–順丁烯二醯亞胺反應：在此情形中，連接臂的自由端有一順丁烯二醯亞胺基，且功能性元件有一硫氫基； (3) 一價銅催化的疊氮化物-炔羥環加成(copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition；CuAAC，或簡稱為「鍊接」反應)：連接臂的自由端和功能性元件其中之一帶有疊氮基，而另一個則帶有炔基；CuAAC反應如反應式1所示； (4) 逆電子需求狄爾斯-阿德(inverse electron demand Diels–Alder，iEDDA)：連接臂的自由端和功能性元件其中之一帶有四嗪基，而另一個則帶有環辛烯基；iEDDA反應如反應式2所示；或 (5) 應力促進的疊氮化物-炔羥鏈接化學(strain-promoted azide-alkyne click chemistry，SPAAC)：連接臂的自由端和功能性元件其中之一帶有疊氮基，而另一個則帶有環辛炔基；SPAAC反應如反應式3所示。＜＜ 反應式 1 CuAAC 反應 ＞＞
Figure TWI614023BD00002
CuAAC反應會產生1,5-二取代1,2,3-三唑(1,5-disubstituted 1,2,3-triazole)。炔基和疊氮基之間的反應選擇性極高，且天然生物分子不含炔基和疊氮基。再者，上述反應快速且對pH值不敏感。已知除了利用一價銅(如溴化銅(I)或碘化銅(I))來催化鏈接反應之外，較佳可使用二價銅和還原劑(如抗壞血酸鈉)的混合物以在反應系統中原位(in situ )產生一價銅。或者是，可利用不含銅的反應，將第二元件連接到中心核的N-或C-端，此反應可利用環戊烷基環戊二烯基氯化釕複合物(pentamethylcyclopentadienyl ruthenium chloride complex)作為催化劑，以催化疊氮基-炔環加成反應。＜＜ 反應式 2 iEDDA 反應 ＞＞
Figure TWI614023BD00003
＜＜ 反應式 3 SPAAC 反應 ＞＞
Figure TWI614023BD00004
為了方便說明，和連接臂相連的功能性元件稱為第一元件。當可理解，本發明接合單元可攜帶的第一元件的數目取決於中心核的K殘基的數目(且因此，取決於連接臂的數目)。因此，本發明所屬技術領域具有通常知識者可調整所述接合單元中第一元件的數目，以達到所欲的標的或治療效果。
如第1D圖所示，例示性的接合單元10D包含第一元件。除了下文所述的特徵之外，第1D所示結構與第1B圖相似。首先，中心核11d有五個K殘基，且因此有五個連接臂20a-20e分別與這些K殘基相連。其次，接合單元10D有五個第一元件30a-30e，分別連接於每一連接臂20a-20e。如下文所述，視需要加入的四嗪基72使得所述接合單元可和額外的功能性元件或另一個分子構建體耦接。
第1E圖是一種替代性的實施例，所示的接合單元10E結構類似接合單元1D，不同之處在於每一連接臂21a-21e的元件連接端(即，與第一元件30a-30e相連的一端)帶有一雙硫鍵。
或者是，此處提出的接合單元更包含複數個銜接臂，其一端帶有一官能基(即，順丁烯二醯亞胺基、NHS基、疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基)，另一端則帶有NHS或順丁烯二醯亞胺基。銜接臂與連接臂間的連接方式和上文第一元件與連接臂間的連接方式類似，藉由選用對應的官能基，銜接臂和連接臂可藉由形成醯胺鍵或透過硫氫–順丁烯二醯亞胺、CuAAC、iEDDA或SPAAC反應而彼此耦接。因此，連接於連接臂的銜接臂在自由端(或稱元件連接端；也就是並未與連接臂相連的一端)帶有NHS基或順丁烯二醯亞胺基；之後，第一元件和銜接臂的元件連接端形成醯胺鍵或進行硫氫–順丁烯二醯亞胺反應而與其連接。
接著參照第1F圖，所示的連接臂利用和第1D圖類似的方式連接到中心核11d的K殘基。與接合單元10D相比，接合單元10F更包含銜接臂25，其透過SPAAC反應而連接到連接臂22。接著，第一元件30和銜接臂25可藉由形成醯胺鍵或透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應而彼此連接。第1F圖所示的菱形點90代表連接臂22與銜接臂25之間因為SPAAC反應所形成的化學鍵結。
根據本揭示內容某些實施方式，銜接臂是帶有2至20個EG重複單元的PEG鏈。或者是，銜接臂是帶有2至20個EG重複單元的PEG鏈，且其元件連接端(即，未與連接臂連接的自由端)有一雙硫鍵。
在一實驗例中，銜接臂帶有三個EG重複單元，且銜接臂的自由端(亦稱為元件連接端)有一雙硫鍵。在本例中，當以還原劑處理時，可以有效地使連接至銜接臂元件連接端的第一元件由此處提出的接合單元釋出。
根據本揭示內容某些較佳實施方式，第一元件可以是芬戈莫德、芬戈莫德磷酸鹽、干擾素-β或對整合素-α4、β-類澱粉蛋白、病毒蛋白或細菌蛋白專一的單鏈可變片段(scFv)。
非限制性的病毒蛋白包括：呼吸道融合病毒(RSV)的F蛋白、人類免疫缺陷病毒第I型(HIV-1)的gp120蛋白、A型流感病毒的血球凝集素A (HA)蛋白與巨細胞病毒的醣蛋白。
細菌蛋白的實施例包括但不限於：革蘭氏陰性菌的內毒素、困難梭狀芽孢桿菌的表面抗原、金黃葡萄球菌的壁脂酸、炭疽桿菌的炭疽毒素或大腸桿菌的第I型或第II型類志賀毒素。
為了要進一步增加所需的效果(如，療效)，本發明接合單元除了第一元件之外還可以包含第二元件。舉例來說，第二元件可以是標的元件或效應元件。在本揭示內容可任選的實施方式中，第一元件是效應元件，而第二元件可以是另一種效應元件，兩者可以累加地或加乘地作用，亦可獨立作用。在另一種例子中，第一與第二元件可發揮不同的性質；譬如，第一元件是標的元件，而第二元件是效應元件，反之亦然。或者是，第一元件是效應元件，而第二元件則能夠改善接合單元的藥動學特性，如水溶性、廓清率、半衰期與生物可用率。在選擇所述接合單元(或多臂接合物)所含的特定第一元件和/或第二元件時，需考量所欲的應用。下文第一節第(iii)部分討論了這些功能性元件的實施例。
在結構上，第二元件可連接到中心核N-或C-端的疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基。具體來說，當有需要時，可將第二元件和短PEG鏈(較佳為具有2至12個EG重複單元)複合，之後再將其連接到位在N-或C-端的帶有疊氮基或炔基的胺基酸殘基(譬如AHA殘基或HPG殘基)。或者是，當有需要時，可將第二元件和短PEG鏈複合，且之後再將其連接於中心核的耦合臂。
根據本揭示內容某些實施方式，中心核的N-或C-端是帶有疊氮基(譬如AHA殘基)的胺基酸殘基；且因此，帶有炔基的第二元件就可以透過CuAAC反應而連接到中心核的N-或C-端。根據本揭示內容其他實施方式，上述中心核的N-或C-端是帶有炔基(譬如HPG殘基)的胺基酸殘基；而帶有疊氮基的第二元件就可以透過CuAAC反應而連接到中心核的N-或C-端。
第1G圖繪示根據本發明實施例的另一種接合單元10G，其攜帶了複數個第一元件與一個第二元件。在本實施例中，中心核11c包含一個HPG (GHP )殘基以及五個離胺酸(K)殘基。五個連接臂20a-20e分別連接到中心核11c的五個K殘基；而五個第一元件30a-30e則透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應連接到各個連接臂20a-20e。除了第一元件之外，所述接合單元10G更包含一個第二元件50，其係連接於短PEG鏈62的一端。在和中心核11c複合之前，短PEG鏈62的另一端帶有疊氮基。如此一來，疊氮基可和帶有炔基的HPG殘基進行CuAAC反應，而使得第二元件50連接至中心核11c。第1G圖所示的實心圓點40代表HPG殘基和疊氮基間因為CuAAC反應所形成的化學鍵結。
或者是，第二元件透過耦合臂而和中心核連接。根據本揭示內容某些實施方式，耦合臂帶有四嗪基，因此可透過iEDDA反應而有效率地連接到帶有TCO的第二元件。根據本揭示內容其他實施方式，耦合臂帶有TCO基，而第二元件可帶有四嗪基，故兩者可透過iEDDA反應而互相連接。相較於位在端點的炔基，iEDDA反應中所採用的應變環辛烯基的活化能明顯較低，且因此iEDDA反應不需使用額外催化劑。
接著參照第1H圖，其中接合單元10H的中心核11d包含位於N端的半胱胺酸(C)殘基和五個離胺酸(K)殘基。如第1H圖所示，這五個連接臂20a-20e分別連接到中心核11d的五個K殘基，而五個第一元件30a-30e則透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應而分別連接到五個連接臂20a-20e。半胱胺酸殘基連接於耦合臂60；在接上第二元件之前，耦合臂60的自由端帶有四嗪基或TCO基。在本實施例中，第二元件50可和帶有相應TCO或四嗪基的短PEG鏈62連接，再透過iEDDA反應而連接到耦合臂60。第1H圖所示的橢圓點70代表耦合臂60和短PEG鏈62間進行iEDDA反應所產生的化學鍵結。
根據本揭示內容其他實施方式，在和第二元件接合之前，耦合臂帶有疊氮基；當第二元件和自由端帶有環辛炔基(譬如DBCO、DIFO、BCN或DICO基)的短PEG鏈連接時，耦合臂和第二元件就可以透過SPAAC反應而連接，反之亦然。
接著參照第1I圖，其中接合單元10I的結構和第1H圖的接合單元10H相近，不同之處在於耦合臂60帶有疊氮基或環辛炔基(譬如DBCO、DIFO、BCN或DICO基)而不是四嗪基或TCO基。因此，第二元件50要和帶有相應環辛炔基(譬如DBCO、DIFO、BCN或DICO)或疊氮基的短PEG鏈62連接，而使得第二元件50和耦合臂60可透過SPAAC反應而連接。第1I圖所示的菱形點90代表耦合臂60與短PEG鏈62之間因為SPAAC反應所形成的化學鍵結。
反應式4為製備本發明接合單元的例示性流程。在步驟1，先製備中心核，其胺基酸序列包含(GSK)3 ，且C端為L-疊氮高丙胺酸(AHA)殘基。在步驟2，透過在NHS基與氨基間形成醯胺鍵，而將三個連接臂分別連接到中心核的離胺酸(K)殘基，連接到中心核的連接臂在自由端帶有順丁烯二醯亞胺(Mal)基。在步驟3，透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應將三個抗A抗原scFv (scFv α A)連接到各連接臂上，此處的scFv α A即為第一元件。同時，在步驟4，將一個抗B抗原scFv (scFv α B)和自由端帶有DBCO基的短PEG鏈連接，上述短PEG鏈有4個EG重複單元，此處的scFv α B即為第二元件。最後，在步驟5，透過SPAAC反應將第二元件連接到中心核的AHA殘基。＜＜ 反應式 4 透過連接臂與 C- 端胺基酸殘基連接兩種不同 scFv 的接合單元的製備方法 ＞＞
Figure TWI614023BD00005
反應式5繪示製備本發明接合單元的另一種例示性流程。在步驟1，先製備中心核，其胺基酸序列包含(K-Xaa )3 且C-端有一半胱胺酸殘基。在步驟2，將一端帶有順丁烯二醯亞胺(Mal)基另一端帶有四嗪基的PEG鏈(作為耦合臂)透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應連接到半胱胺酸殘基。之後，在步驟3，將三個連接臂分別連接到中心核的離胺酸(K)殘基。接著，如步驟4所示，透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應將三個抗A抗原scFv (scFv α A)連接到各連接臂上，此處的scFv α A即為第一元件。同時，在步驟5，將一個抗B抗原scFv (scFv α B)和自由端帶有TCO基的短PEG鏈連接，上述短PEG鏈有3個EG重複單元，此處的scFv α B即為第二元件。最後，在步驟6，透過iEDDA反應將第二元件連接到耦合臂。＜＜ 反應式 5 透過連接臂與耦合臂連接兩種不同 scFv 的接合單元的製備方法 ＞＞
Figure TWI614023BD00006
聚乙二醇化(PEGylation)是將PEG鏈附接或連接到分子(如，藥物或蛋白)的方法。聚乙二醇化可以改善多種重要的藥理學特性，譬如提升水溶性、延長生命週期以及減少蛋白質分解降解。根據本揭示內容一實施方式，第二元件是PEG鏈，其分子量約為20,000到50,000道耳頓。
第1J圖繪示了另一種例示性的接合單元10J，其中五個第一元件30分別透過連接臂20連接到離胺酸殘基，且中心核11e的HPG (GHP )殘基透過CuAAC反應與PEG鏈80連接。第1J圖所示的實心圓點40代表HPG殘基與PEG鏈80間因為CuAAC反應所形成的化學鍵結。
第1K圖是本揭示內容的另一種實施例，接合單元10K的中心核11d的N-端是與耦合臂60相連接的半胱胺酸殘基。可透過iEDDA反應而有效率地將PEG鏈80連接到耦合臂60。接合單元10K的橢圓點70代表耦合臂60與PEG鏈80之間因為iEDDA反應所形成的化學鍵結。
第1L圖是本發明接合單元的另一種實施例，所示的接合單元10L結構與第1J圖的接合單元10J相似，不同之處在於PEG鏈80是透過SPAAC反應連接到耦合臂60。第1L圖所繪示的菱形點90代表耦合臂60與PEG鏈80之間因為SPAAC反應所形成的化學鍵結。
根據本揭示內容某些實施方式，除了第一與第二元件之外，本發明接合單元更包含第三元件。在此種實施例中，中心核的N-或C-端是帶有疊氮基或炔基的胺基酸殘基，而另一端是半胱胺酸殘基。中心核的離胺酸殘基分別和連接臂相連接，且每一條連接臂的自由端帶有順丁烯二醯亞胺基；而中心核的半胱胺酸殘基則和自由端帶有四嗪基或高應力炔基的耦合臂相連。如此一來，第一元件可透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應連接於連接臂，而第二元件則可透過iEDDA反應和耦合臂相連接。另外，第三元件則是透過CuAAC反應或SPAAC反應而連接到帶有疊氮基或炔基的末端胺基酸殘基。
接著參照第1M圖的接合單元10M，其中心核11f的N-端為HPG (GHP )殘基，而C-端是半胱胺酸殘基。連接臂20和耦合臂60分別連接到中心核11f的離胺酸(K)殘基以及半胱胺酸(C)殘基。此外，五個第一元件30分別連接到五個連接臂20，第二元件(即，PEG鏈)80和耦合臂60連接，而第三元件50則透過短PEG鏈62連接到HPG殘基。實心圓點40代表HPG殘基和短PEG鏈62之間因為CuAAC反應所形成的化學鍵結；而橢圓點70代表耦合臂60與PEG鏈80之間因為iEDDA反應所形成的化學鍵結。
第1N圖繪示了本揭示內容的另一種實施方式；接合單元10N的結構與第1M圖所示的接合單元10M相似，不同之處在於短PEG鏈62是透過SPAAC反應而連接到HPG殘基，而非透過iEDDA反應。第1N圖的菱形點90代表短PEG鏈62和HPG殘基之間因為SPAAC反應所形成的化學鍵結。
在本揭示內容較佳的實施方式中，連接臂的自由端帶有順丁烯二醯亞胺基，以便和帶有硫氫基的第一元件透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應而連接。此外，多肽核的一端可以是半胱胺酸殘基或帶有疊氮基或炔基的胺基酸殘基，以供和耦合臂接合，進而連接第二元件。
本發明所屬技術領域具有通常知識者當可想見，可對上述結構進行各種修改。舉例來說，在連接臂的自由端可採用順丁烯二醯亞胺基以外的官能基(譬如疊氮基、炔基、四嗪基或高應力炔基)，以便透過CuAAC、iEDDA或SPAAC反應來連接第一元件。此外，半胱胺酸殘基(或帶有疊氮基或炔基的胺基酸殘基) 可以位在多肽核N-或C-端以外的位置。更有甚者，可在多肽核中加入二或更多個上述殘基，以供接合多個耦合臂，並進一步連接多個第二元件。
(ii) 用於多臂接合物的化合物核
除了本揭示內容第一節第(i)部分所述的述接合單元之外，此處亦揭示了另一種接合單元，其使用化合物(而非多肽)作為中心核。具體來說，所述化合物可以是苯-1,3,5-三胺、2-(胺甲基)-2-甲基丙烷-1,3-二胺、三(2-胺乙基)胺、苯-1,2,4,5-四胺、3,3’,5,5’-四胺-1,1’-聯苯、四(2-胺乙基)甲烷、四(乙胺)肼、N,N,N’,N’,-四(胺乙基)乙二胺、苯-1,2,3,4,5,6-六胺、1-N,1-N,3-N,3-N,5-N,5-N-六(甲胺)-苯-1,3,5-三胺、1-N,1-N,2-N,2-N,4-N,4-N,5-N,5-N,-八(甲胺)-苯-1,2,4,5-三胺、苯-1,2,3,4,5,6-六胺或N,N-二[(1-胺基-3,3-二胺乙基)戊基]甲烷二胺。上述化合物均帶有至少三個相等或對稱構形的氨基。因此，當一化合物的其中一個氨基與一耦合臂複合時，所有由該化合物形成的分子都具有相同的構形。
此處所述的化合物和本揭示內容第一節第(i)部分所述的接合單元相似，都分別包含複數個氨基，且因此，可將複數個帶有NHS基的PEG鏈透過氨基和NHS基之間所形成的醯胺鍵而連接到化合物核上；利用此方式接上來的PEG鏈即為本案所述的連接臂，此連接臂的自由端帶有一官能基(如，NHS基、順丁烯二醯亞胺基、疊氮基、炔基、四嗪基、環辛烯基或環辛炔基)。同時，所述化合物核有至少一個氨基連接到另一PEG鏈，此PEG鏈一端帶有NHS基且另一端帶有一官能基(如，疊氮基、炔基、四嗪基、環辛烯基或環辛炔基)；化合物核與此種PEG鏈同樣透過醯胺鍵結來連接，接上後的此一PEG鏈稱為耦合臂，其自由端帶有上述特殊官能基。
因此，可藉由以下方式將第一元件連接到連接臂上：(1)在兩者間形成醯胺鍵鍵；(2)透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應；(3)透過CuAAC反應；(4)透過iEDDA反應；或(5)透過SPAAC反應。同時，可透過CuAAC反應、iEDDA反應或SPAAC反應將第二元件連接到耦合臂上。
根據本揭示內容某些實施方式，連接臂是具有2至20個EG重複單元的PEG鏈；在較佳的情形中，連接臂是是具有2至20個EG重複單元的PEG鏈且在其自由端(即，未與中心核連接的該端)帶有一雙硫鍵。耦合臂則是具有2至12個EG重複單元的PEG鏈。在一實施方式中，連接臂和耦合臂都具有12個EG重複單元，其中在接合前，耦合臂的一端是NHS基，而另一端是炔基。
根據本揭示內容一替代性實施方式，接合單元更包含複數個銜接臂，分別連接到各別的連接臂。之後，複數個第一元件分別連接到這些銜接臂。於一實施方式中，銜接臂是具有2至20個EG重複單元的PEG鏈。在另一實施方式中，銜接臂是具有2至20個EG重複單元的PEG鏈，且在未與連接臂相連的元件連接端有一雙硫鍵。
反應式6、7分別繪示了中心化合物核和連接臂之間以及中心化合物核和耦合臂之間的連接關係，其中NHS代表NHS酯類、Mal代表順丁烯二醯亞胺基、azide代表疊氮基且alkyne代表炔基。＜＜ 反應式 6 將分別帶有順丁烯二醯亞胺基與疊氮基的連接臂與耦合臂連接到中心核 ＞＞
Figure TWI614023BD00007
作為中心核的化合物應有多對稱且有相同方向的氨基，其理由如下：當利用其中一個胺基來連接一個雙功接合臂(即，一端帶有N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)酯基且另一端帶有炔基、疊氮基、四嗪基或高應力炔基)時，可以得到均質的產物(也就是接有耦合臂的中心核，且耦合臂帶有炔基、疊氮基、四嗪基或高應力炔基)，故可輕易將其純化。之後可利用此種產物來製備多臂接合單元，將剩餘的氨基都接上自由端帶有順丁烯二醯亞胺基或其他耦合基團的連接臂。若帶有多個氨基的化合物是不對稱的化合物，此種化合物和雙功接合臂/耦合臂接合後所得到的產物就不是均質的產物。＜＜ 反應式 7 將分別帶有順丁烯二醯亞胺基與炔基的連接臂與耦合臂連接到中心核 ＞＞
Figure TWI614023BD00008
可進一步修飾上述對稱化合物，以使得其可和更多的連接臂/耦合臂連接。舉例來說，四(2-胺乙基)甲烷是可從一般化合物合成或商業購得的化合物，可利用此種化合物來建構連接了四個連接臂/耦合臂的接合單元。將四(2-胺乙基)甲烷和雙硫代琥珀醯亞胺辛二酸酯(bis(sulfosuccinimidyl)suberate)進行縮合反應，所得到的產物是N,N-二[(1-胺基-3,3-二胺乙基)戊基]甲烷二胺，此一產物有兩個四(2-胺乙基)甲烷單元，並可用以連接六個連接臂/耦合臂。此處所述的接合單元分別帶有三個、四個與六個連接臂/耦合臂，對於建構具有標的/效應分子的聯合接合物來說，上述連接臂/耦合臂的數目應相當充足。
當可理解，連接臂和/或耦合臂的數目還有與其連接的元件數目都取決於中心核中所含的氨基數目。在某些較佳的實施方式中，連接臂/耦合臂的數目還有與其連接的元件數目是1到7個。
參照第2圖，其中繪示了帶有四個氨基的苯-1,2,4,5-四胺；其中三個氨基分別和連接臂20相連，而另一個氨基則和耦合臂60相連，且耦合臂60的自由端帶有疊氮基。之後，透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應將三個第一元件30分別連接到三個連接臂20上，並透過CuAAC反應將一個第二元件50連接到耦合臂60上。第2圖中所示的實心圓點40代表耦合臂60與第二元件50之間因為CuAAC反應所形成的化學鍵結。
(iii) 適用於多臂接合物的功能性元件
當接合單元(或多臂接合物)僅包含第一元件而不帶有第二和/或第三元件時，第一元件是一效應元件，其可於患者體內發揮治療的效果。另一方面，當此處提出的接合單元包含除了第一元件以外的其他元件時，則這兩種元件中應有至少一種是效應元件，而另一者可以是另一效應元件、一標的元件或能夠改善接合單元藥動學特性(如，溶解度、廓清率、半衰期與生物可用率)的元件。譬如，接合單元可帶有兩種不同的效應元件、一效應元件與一標的元件或一提升藥動學特性的元件、兩種不同的標的元件與一種效應元件、兩種不同的效應元件與一種標的元件；或是可帶有一種標的元件、一種效應元件以及一種可改善接合單元藥動學特性的元件。
根據本揭示內容某些實施方式，標的元件或效應元件為芬戈莫德、芬戈莫德磷酸鹽、干擾素-β或對整合素-α4、β-類澱粉蛋白、病毒蛋白或細菌蛋白專一的單鏈可變片段(scFv)。
病毒蛋白的實施例包括但不限於：呼吸道融合病毒(RSV)的F蛋白、人類免疫缺陷病毒第I型(HIV-1)的gp120蛋白、A型流感病毒的血球凝集素A (HA)蛋白與巨細胞病毒的醣蛋白。
細菌蛋白的例示性實施例包括：革蘭氏陰性菌的內毒素、困難梭狀芽孢桿菌的表面抗原、金黃葡萄球菌的壁脂酸、炭疽桿菌的炭疽毒素或大腸桿菌的第I型或第II型類志賀毒素。
分子量為20,000至50,000道耳頓(daltons)的長PEG鏈就是一種能改善接合單元藥動學性質的元件。
下文舉例說明可用以治療某些特定疾病之多臂接合物所含的功能性元件。
於治療CNS疾病(如多發性硬化症)時，例示性的接合單元可使用芬戈莫德、芬戈莫德磷酸鹽、干擾素-β或對整合素-α4專一的scFv作為第一元件(效應元件)。於治療阿滋海默症時，此處提出的接合單元可使用對β-類澱粉蛋白專一的scFv作為第一元件(效應元件)。在視需要的情形中，用以治療多發性硬化症、阿滋海默症或其他CNS疾病的接合單元可更包含一第二元件，譬如以對運鐵蛋白受器專一的scFv作為標的元件。
相似地，於治療病毒或細菌引發的感染時，可利用對病毒或細菌蛋白專一的scFv作為標的元件(第一元件)。在這些情形中，接合單元可包括視需要而加入的第二元件，例如對CD32或CD16b專一的scFv以作為效應元件。
(iv) 多臂接合物的用途
本揭示內容亦關於利用適當接合單元來治療各種疾病的方法。一般來說，所述方法包含以下步驟：對需要治療個體投予有效量的根據本揭示內容實施方式的接合單元。
相較於既有的治療性構建體，第一節以上段落所述的接合單元至少有以下的優點： (1)可以視需求和/或用途來調整功能性元件的數目。根據不同用途的需求，本發明接合單元可包含二種元件(即，第一與第二元件)或三種元件(即，第一、第二與第三元件)，上述需求包括欲治療的疾病、接合單元的給藥方法、接合單元所攜抗體的結合力與親和力等等。舉例來說，當要將接合單元直接投遞到特定組織/器官(譬如，治療眼睛)時，可以只使用一種元件作為效應元件，而不需加入標的元件。然而，當透過周邊給藥途徑來投遞接合單元時，譬如經口服、腸胃道、鼻腔、局部或黏膜給藥、或以肌肉內、靜脈內或腹膜內注射，本發明接合單元就需要包含標的元件，以便將接合單元專一地標的到病灶部位；此外，接合單元還應該包含效應元件，以便在病灶部位發揮治療效果。為了要提高接合單元的標的或治療效果或提升其穩定度，本發明接合單元還可進一步包含第三元件；所述的第三元件可以是第二種標的元件、第二種效應元件或PEG鏈。 (2)第一元件是以成束(bundle)的形式存在。如上文所述，第一元件的數目取決於中心核所包含的離胺酸殘基的數目。如果中心核中離胺酸殘基的數目是2到15，則每一接合單元可帶有至少兩個第一元件。因此，相較於傳統治療性構建體僅能攜帶單一個分子(譬如單一個細胞毒性藥物或抗體分子)，本發明接合單元可同時提供更多的功能性元件(不論是標的元件或效應元件)，進而可大幅提升療效。
在某些治療應用中，可能想要採用單一份的標的或效應元件。譬如，可使用單一份標的元件來避免因為標的元件結合力太強而導致不理想的副作用；當所用的scFv對標的抗原有相對較高的親和力，且當標的抗原是正常細胞(而非所標的的染病細胞)上的細胞表面抗原時，上述考量更顯重要。在一實施例中，當使用對CD3或CD16a專一的scFv來招募T細胞或NK細胞以消滅所標的之細胞(譬如葛瑞夫茲氏症患者的甲狀腺細胞)時，較佳可使用單一份對CD3或CD16a專一的scFv，因而能夠避免因為CD3或CD16a交聯而產生的不良副作用。相似地，在使用對CD3或CD16b專一的scFv來招募吞噬性嗜中性白血球與巨噬菌體來清除與抗體結合的病毒或細菌粒子或其產物時，較佳可使用單一份scFv。此外，在使用對運鐵蛋白受器專一的scFv來攜帶效應藥物分子至BBB以治療CNS疾病時，較佳可使用單一份對運鐵蛋白受器專一的scFv。在又一種例子中，可能想要加入單一份的長鏈PEG，以提升接合單元的藥動學特性；因為使用兩個或更多的長PEG鏈可能會使得PEG鏈纏結而影響標的或效應元件的結合力。
實驗例
實驗例 1 ：合成作為多肽核的多肽 1 ( 序列編號： 18) 、多肽 2 ( 序列編號： 27) 以及多肽 3 ( 序列編號： 19) ，並將半胱胺酸殘基的 SH 基和作為耦合臂的順丁烯二醯亞胺 -PEG3 - 反式 - 環辛烯 (TCO) 複合
利用相似的方法來處理合成多肽1、2與3 (Chinapeptide Inc.，上海，中國)。將各別多肽溶解於100 mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.0；含50 mM NaCl與5 mM EDTA)，最終濃度2 mM。利用1 mM三(2-羧乙基)膦(tris (2-carboxyethyl)phosphine，簡稱TCEP)使溶解的多肽還原，反應溫度25°C、時間2小時。將多肽和順丁烯二醯亞胺-PEG3 -TCO (Conju-probe Inc.)以1/7.5的莫耳比混合，並在pH 7.0、25°C的條件下反應18小時，以使半胱胺酸殘基的SH基和順丁烯二醯亞胺-PEG3 -TCO複合而帶有功能性連接基團TCO。利用反相HPLC來純化TCO-多肽複合物；使用Supelco C18管柱(250 mm X 10 mm；5 μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸、線性梯度為0%至100%乙腈、30分鐘，流速1.0 mL/min、管柱溫度25°C。
以MALDI-TOF質譜分析來確認所合成的TCO-多肽(如下所示)。由中央研究院分子生物研究所(臺灣臺北)的核心設施單位進行質譜分析。以Bruker Autoflex III MALDI-TOF/TOF質譜分析儀(Bruker Daltonics, Bremen, Germany)進行測量。
Figure TWI614023BD00009
 所述合成TCO-多肽1 (如下所示)的分子量為2,078.9道耳頓。
Figure TWI614023BD00010
 所述合成TCO-多肽2 (如下所示)的分子量為2,020.09道耳頓。
Figure TWI614023BD00011
 所述TCO-多肽3 (如下所示)的分子量為3,381.85道耳頓。
實驗例 2 ：合成作為多肽核的多肽 1 ，並將半胱胺酸殘基的 SH 基和作為耦合臂的順丁烯二醯亞胺 -PEG4 - 四嗪複合
將合成多肽1 (Chinapeptide Inc.，上海，中國)溶解於100 mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.0；含50 mM NaCl與5 mM EDTA)，最終濃度2 mM。利用1 mM TCEP使溶解的多肽還原，反應溫度25°C、時間2小時。將多肽和順丁烯二醯亞胺-PEG4 -四嗪 (Conju-probe Inc.)以1/5的比例混合，並在pH 7、4°C的條件下反應18小時，以使半胱胺酸殘基的SH基和順丁烯二醯亞胺-PEG4 -四嗪複合而帶有功能性連接基團四嗪。利用反相HPLC來純化四嗪-多肽複合物；使用Supelco C18管柱(250 mm X 10 mm；5 μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸、線性梯度為0%至100%乙腈、30分鐘，流速1.0 mL/min、管柱溫度25°C。
所述合成四嗪-多肽1 (如下所示)的分子量為2,185.2道耳頓。
Figure TWI614023BD00012
實驗例 3 ：將作為連接臂的 NHS-PEG12 - 順丁烯二醯亞胺和 TCO- 多肽 1 的氨基複合以合成接合單元
將三個PEG12 -順丁烯二醯亞胺連接臂連接到多肽核TCO-多肽1。交聯物NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺(琥珀醯亞胺-[(N-順丁烯二醯亞胺基-丙醯胺基)-十二乙二醇]酯(succinimidyl-[(N-maleimido-propionamido)- dodecaethyleneglycol] ester)係購自Thermo Fisher Scientific Inc. (Waltham, USA)。根據製造商的指示進行接合。簡言之，將帶有離胺酸殘基的多肽溶解於複合緩衝液磷酸鹽緩衝液(PBS；pH 7.5)中，濃度100 mM。在溶解的多肽中加入NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺交聯物，最終濃度1 mM (比起0.1 mM多肽溶液，莫耳數過量10倍)。使反應混合物在室溫下反應18小時。以反相HPLC純化順丁烯二醯亞胺-PEG12 -TCO-多肽1複合物；使用Supelco C18管柱(250 mm X 4.6 mm；5 μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸、線性梯度為0%至100%乙腈、30分鐘，流速1.0 mL/min、管柱溫度25°C。
以MALDI-TOF質譜分析來確認所合成的順丁烯二醯亞胺-PEG12 -TCO-多肽1複合物。
Figure TWI614023BD00013
 所述合成順丁烯二醯亞胺-PEG12 -TCO-多肽1複合物的分子量為4,332道耳頓。如下所示，順丁烯二醯亞胺-PEG12 -TCO-多肽1複合物是一種採用多肽核的接合單元，其上接有一條帶有TCO基的耦合臂以及三條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。
實驗例 4 ：將作為連接臂的 NHS-PEG12 - 順丁烯二醯亞胺和四嗪 - 多肽 1 的氨基複合以合成接合單元
將三個PEG12 -順丁烯二醯亞胺連接臂連接到多肽核四嗪-多肽1。交聯物NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺(琥珀醯亞胺-[(N-順丁烯二醯亞胺基-丙醯胺基)-十二乙二醇]酯(購自Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, USA)。根據製造商的指示進行接合。簡言之，將帶有離胺酸殘基的多肽溶解於複合緩衝液磷酸鹽緩衝液(PBS；pH 7.5)中，濃度100 mM。在溶解的多肽中加入NHS-PEG12 -順丁烯二醯亞胺交聯物，最終濃度1 mM (比起0.1 mM多肽溶液，莫耳數過量10倍)。使反應混合物在室溫下反應18小時。以反相HPLC純化順丁烯二醯亞胺-PEG12 -四嗪-多肽1複合物；使用Supelco C18管柱(250 mm X 4.6 mm；5 μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸、線性梯度為0%至100%乙腈、30分鐘，流速1.0 mL/min、管柱溫度25°C。
所述合成順丁烯二醯亞胺-PEG12 -四嗪-多肽1複合物(如下所示)是一種採用多肽核的接合單元，其上接有一條帶有四嗪基的耦合臂以及三條帶有順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。第2圖的MALDI-TOF分析結果指出此一構建體的分子量為4,461道耳頓。
Figure TWI614023BD00014
實驗例 5 ：將芬戈莫德與芬戈莫德磷酸鹽分子與 NHS-PEG5 -NHS 交聯物複合
芬戈莫德係購自Biotang Inc. (Lexington, USA)，而芬戈莫德磷酸鹽則是購自KM3 Scientific Corporation (新北市，臺灣)。使芬戈莫德分子的NH2 基和同型雙功(homo-bifunctional)交聯物NHS-PEG5 -NHS反應，如反應式8所示。將芬戈莫德和NHS-PEG5 -NHS各自溶於100% DMSO中，兩者的最終濃度分別是10 mM與250 mM。將6% (v/v)的鹼性磷酸鈉緩衝液(pH12.7)加入芬戈莫德溶液中並培育10分鐘，以活化芬戈莫德的NH2 基。將NHS-PEG5 -NHS交聯物加入至溶解的芬戈莫德溶液中，最終濃度30 mM (比起10 mM的芬戈莫德溶液，莫耳數過量3倍)。將反應混合物在室溫下培育3小時。
將芬戈莫德磷酸鹽和NHS-PEG5 -NHS各自溶於100% DMSO中，兩者的最終濃度分別是5 mM與250 mM。將NHS-PEG5 -NHS交聯物加入至溶解的芬戈莫德磷酸鹽溶液中，最終濃度15 mM (比起5 mM的芬戈莫德溶液，莫耳數過量3倍)。將反應混合物在室溫下培育3小時；接著加入18% (v/v)的酸性磷酸鈉緩衝液(pH=0.88)以淬滅反應。在真空下使溶劑蒸發。
Figure TWI614023BD00015
 ＜＜ 反應式 8 芬戈莫德 分子與 NHS-PEG5 -NHS 交聯物的複合 ＞＞
將NHS-PEG5 -芬戈莫德複合物與NHS-PEG5 -芬戈莫德複合物磷酸鹽溶於30%乙腈，之後以反相HPLC進行純化；使用Supelco C18管柱(250 mm X 4.6 mm；5 μm)，流動相使用乙腈與0.1%三氟乙酸、線性梯度為30%至100%乙腈、30分鐘，流速1.0 mL/min、管柱溫度25°C。
根據第3圖的分析結果，所述合成NHS-PEG5 -芬戈莫德複合物(如反應式8所示)的分子量為725.41道耳頓。
Figure TWI614023BD00016
 所述合成NHS-PEG5 -芬戈莫德複合物磷酸鹽(如下所示)的分子量為803.3道耳頓。
實驗例 6 ：將芬戈莫德分子與 NHS-S-S-PEG3 - 疊氮連接臂複合
使芬戈莫德分子的NH2 基和異型雙功(hetero-bifunctional)可裂解交聯物NHS-S-S-PEG3 -azido(Conju-probe Inc.)以1：3的莫耳比反應。利用HPLC純化產物疊氮-PEG3 -S-S-芬戈莫德，以移除多餘、未反應的芬戈莫德分子。複合與純化的方法與上文實施例所述相近。
所述合成疊氮-PEG3 -S-S-芬戈莫德複合物(如下所示)的分子量為629.33道耳頓。
Figure TWI614023BD00017
實驗例 7 ：將疊氮 -PEG3 -S-S- 芬戈莫德複合物分子與 NHS-PEG4 - 二苯并環辛炔 (DBCO) 交聯物複合
將疊氮-PEG3 -S-S-芬戈莫德複合物分子和NHS-PEG4 -DBCO交聯物各自溶於100% DMSO，兩者的最終濃度分別是10 mM和250 mM。於100 mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.5)中，將5 μl的NHS-PEG4 -DBCO交聯物加入400 μl溶解的疊氮-PEG3 -S-S-芬戈莫德複合物溶液，最終莫耳比為1：3.2 ([NHS-PEG4 -DBCO]：[疊氮-PEG3 -S-S-芬戈莫德複合物])。將反應混合物在室溫下培育3小時。
Figure TWI614023BD00018
 所述合成NHS-PEG4 -PEG3 -S-S-芬戈莫德複合物(如下所示)的分子量為1,278.61道耳頓。在MS光譜中可以見到兩個同位素峰，其位置為1,279.64與1,280.635，分別和[M+H+1]+ 以及[M+H+2]+ 相對應。
實驗例 8 ：將 NHS-PEG5 - 芬戈莫德複合物分子和 TCO- 多肽 2 與 3 複合
將TCO-多肽2溶於100 mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.5)中，濃度20 mM；並將NHS-PEG5 -芬戈莫德複合物溶於100% DMSO中，濃度50 mM。在100% DMSO中，將TCO-多肽2與NHS-PEG5 -芬戈莫德複合物以1/42的莫耳比混合，並在室溫下培育3小時。接著，在100%DMSO中，將額外的TCO-多肽2加入反應溶液，使其最終莫耳比為1：13.5 ([TCO-多肽2]：[NHS PEG5 -芬戈莫德複合物])。再將混合物在室溫下培育3小時。第4圖的資料顯示由TCO-多肽2和芬戈莫德所形成的載藥束的分子量為5,069道耳頓。
將TCO-多肽3溶於100 mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.5)中，濃度10 mM；並將NHS-PEG5 -芬戈莫德複合物溶於100% DMSO中，濃度50 mM。在100% DMSO中，將TCO-多肽2與NHS-PEG5 -芬戈莫德複合物以1/42的莫耳比混合，並在室溫下反應一晚。第5圖的資料顯示由TCO-多肽3和芬戈莫德所形成的載藥束的分子量為9,479道耳頓，這代表芬戈莫德分子確實複合至TCO-多肽3接合單元上。
所合成的載藥束(如下所示)是由帶有一個自由TCO官能基和一組五個芬戈莫德分子的接合單元所組成。
Figure TWI614023BD00019
所合成的第二種載藥束(如下所示)是由帶有一個自由TCO官能基和一組十個芬戈莫德分子的接合單元所組成。
Figure TWI614023BD00020
實驗例 9 ： 將 NHS-PEG5 - 芬戈莫德複合物磷酸鹽分子和 TCO- 多肽 2 複合
在100 mM磷酸鈉緩衝液(pH 7.5)中，將TCO-多肽2和NHS-PEG5 -芬戈莫德複合物磷酸鹽以1/42的莫耳比混合，並在室溫下反應3小時。質譜分析結果顯示TCO-多肽2和芬戈莫德磷酸鹽形成的載藥束的分子量為5,379.16道耳頓(第6圖)。
所合成的載藥束(如下所示)是由帶有一個自由TCO官能基和一組五個芬戈莫德磷酸鹽分子(p芬戈莫德，作為效應元件)的接合單元所組成。
Figure TWI614023BD00021
實驗例 10 ：將 NHS -PEG4 -PEG3 -S-S- 芬戈莫德複合物分子和 TCO- 多肽 2 複合
將五個NHS-PEG4 -PEG3 -S-S-芬戈莫德複合物分子連接到TCO-多肽2上。利用和上文實施例所述相似的方法，將NHS-PEG4 -PEG3 -S-S-芬戈莫德複合物分子複合到TCO-多肽2離胺酸殘基的NH2 基上。利用MALDI-TOF質譜分析來確認產物。
所合成的載藥束(如下所示)的分子量為7,815道耳頓；其係由帶有一個自由TCO官能基和一組五個芬戈莫德分子的接合單元所構成。
Figure TWI614023BD00022
實驗例 11 ：利用 HEK293F 過表現系統製備重組人類 CD32a 胞外域
將編碼目標蛋白的基因序列置入pG1K表現匣中。所表現的人類CD32a的細胞外部分是帶有組胺酸標籤的重組蛋白，其胺基酸序列如序列編號：28所示。在FreeStyle 293F懸浮培養細胞表現系統與培養基(Invitrogen, Carlsbad, USA)中表現重組人類CD32a胞外域。將FreeStyle 293F細胞以每毫升2.0 × 106 個活細胞的密度播於600 mL毫升的Expi293F表現培養基中，並維持18至24小時後進行轉染，以確保進行轉染時細胞處於分裂狀態。進行轉染時，將帶有1.0×107 個細胞的96 mL培養基置於2-L艾氏燒瓶中，並加入平均分子量為25 kDa的線性聚乙烯亞胺(linear polyethylenimine；購自Polysciences, Warrington, USA)作為轉染試劑。於轉染後，將轉染細胞在37°C下以定軌搖動器(125 rpm)培育4小時；之後利用新鮮培養基將細胞密度調整到2.5×106 個細胞/ml，並培育4至5天。收集培養上清液，並使用鎳親和力層析法純化培養基中的蛋白。第7圖是純化人類CD32a胞外域蛋白的SDS-PAGE分析結果。
實驗例 12 ：利用 HEK293F 過表現系統製備重組人類轉鐵蛋白 -1 受器 (TfR) 胞外域
將編碼目標蛋白的基因序列置入pG1K表現匣中。所表現的人類TfR1胞外域是帶有組胺酸標籤的重組蛋白，其胺基酸序列如序列編號：29所示。在FreeStyle 293F懸浮培養細胞表現系統與培養基中表現重組人類TfR1胞外域。將FreeStyle 293F細胞以每毫升1.0 × 106 個活細胞的密度播於600 mL毫升的Expi293F表現培養基中，並維持18至24小時後進行轉染，以確保進行轉染時細胞處於分裂狀態。進行轉染時，將帶有1.0×107 個細胞的96 mL培養基置於2-L艾氏燒瓶中，並加入平均分子量為25 kDa的線性聚乙烯亞胺作為轉染試劑。於轉染後，將轉染細胞在37°C下以定軌搖動器(125 rpm)培育4小時；之後利用新鮮培養基將細胞密度調整到2.5×106 個細胞/ml，並培育4至5天。收集培養上清液，並使用鎳親和力層析法純化培養基中的蛋白。第7圖是純化人類TfR1胞外域蛋白的SDS-PAGE分析結果。
實驗例 13 ：利用 Expi293F 過表現系統製備對 RSV 蛋白 F 專一單抗、對內毒素專一單抗與對 CD32a 胞外域專一單抗的 scFv
對RSV蛋白F專一的scFv的VL 與VH 係來自單株抗體帕利珠單抗；對內毒素專一的scFv的VL 與VH 係來自單株抗體WN1 222-5 (美國專利US 5,858,728)；對CD32a胞外域專一的scFv的VL 與VH 係來自MDE-8 (美國專利申請公開案US 2007/0253958)。衍生自上述抗體的scFv經過特殊設計而在C-端帶有可撓性接合物(GGGGSGGGGS)與末端的半胱胺酸殘基。半胱胺酸殘基的硫氫基可和位於各接合單元連接臂自由端的順丁烯二醯亞胺基接合。於製備對RSV蛋白F專一的單株抗體、對內毒素專一的單株抗體與對CD32a胞外域專一的單株抗體等的scFv時，使用編碼上述三種抗體VL 與VH 的DNA序列並進行密碼子優化(codon optimization)。合成編碼以下序列的的DNA序列：VL -GSTSGSGKPGSGEGSTKG-VH -(GGGGS)2 -C。本發明各實驗例中所製備的對RSV蛋白F專一的單株抗體、對內毒素專一的單株抗體與對CD32a胞外域專一的單株抗體等的scFv之胺基酸序列分別如序列編號：30至32所示。
於利用哺乳類動物表現系統來製備scFv蛋白時，使用以Expi293F™細胞系為基礎的過度表現系統來製備。此系統使用ExpiFectamine™ 293轉染套組(Life Technologies, Carlsbad, USA)，其包含Expi293F™細胞株、陽離子脂質系ExpiFectamine™ 293試劑、ExpiFectamine™ 293轉染強化劑1與2、以及表現系統所用的培養基(Gibco, New York, USA)。
將編碼scFv的序列置於pG1K表現匣中。將Expi293F細胞以每毫升2.0 × 106 個活細胞的密度播於Expi293F表現培養基中，並維持18至24小時後進行轉染，以確保進行轉染時細胞處於分裂狀態。進行轉染時，將帶有7.5×108 個細胞的255毫升培養基置於2-L艾氏燒瓶中，並加入ExpiFectamine™ 293轉染試劑。於轉染後，將轉染細胞在37°C下以定軌搖動器(125 rpm)培育16至18小時；之後在燒瓶中加入ExpiFectamine™ 293轉染強化劑1與強化劑2，並繼續培育5到6天。收集培養上清液，並使用蛋白L親和力層析法純化培養基中的scFv蛋白。
第9A與9B圖分別是純化對RSV蛋白F專一單抗的scFv之SDS-PAGE與ELISA分析結果；第9C與9D圖分別是純化對內毒素專一單抗的scFv之SDS-PAGE與ELISA分析結果；第9E與9F圖分別是純化對CD32a胞外域專一單抗的scFv之SDS-PAGE與ELISA分析結果。在96孔ELISA盤(Greiner Bio-one)上分別塗覆5 μg/ml的RSV蛋白F、10 μg/ml的內毒素與5 μg/ml的CD32a胞外域。利用HRP標記的蛋白L以1：5000的比例來偵測純化scFv。
ELISA分析結果顯示每一種純化scFv蛋白都可和其各別抗原(RSV蛋白F、內毒素或CD32a胞外域)專一地結合，以上分析使用阿達木單抗(adalimumab)的scFv (抗-TNF-α scFv)作為陰性對照組。
實驗例 14 ：利用 Expi293F 過表現系統製備對 TfR1 胞外域專一單抗與對 β- 類澱粉蛋白專一單抗的 scFv
對TfR1胞外域專一的scFv的VL 與VH 係來自單株抗體OX26；對β-類澱粉蛋白專一的scFv的VL 與VH 係來自巴匹珠單抗。衍生自上述抗體的scFv經過特殊設計而在C-端帶有可撓性接合物(GGGGSGGGGS)與末端的半胱胺酸殘基。半胱胺酸殘基的硫氫基可和位於各接合單元連接臂自由端的順丁烯二醯亞胺基接合。於製備對TfR1胞外域專一單抗與對β-類澱粉蛋白專一單抗的scFv時，使用編碼上述兩種抗體VL 與VH 的DNA序列並進行密碼子優化。合成編碼以下序列的的DNA序列：VL -GSTSGSGKPGSGEGSTKG-VH -(GGGGS)2 -C。本發明各實驗例中所製備的對TfR1胞外域專一單抗與對β-類澱粉蛋白專一單抗的scFv之胺基酸序列分別如序列編號：33與34所示。
於利用哺乳類動物表現系統來製備scFv蛋白時，使用以Expi293F™細胞系為基礎的過度表現系統來製備。此系統使用ExpiFectamine™ 293轉染套組(Life Technologies, Carlsbad, USA)，其包含Expi293F™細胞株、陽離子脂質系ExpiFectamine™ 293試劑、ExpiFectamine™ 293轉染強化劑1與2、以及表現系統所用的培養基(Gibco, New York, USA)。
將編碼scFv的序列置於pG1K表現匣中。將Expi293F細胞以每毫升2.0 × 106 個活細胞的密度播於Expi293F表現培養基中，並維持18至24小時後進行轉染，以確保進行轉染時細胞處於分裂狀態。進行轉染時，將帶有7.5×108 個細胞的255毫升培養基置於2-L艾氏燒瓶中，並加入ExpiFectamine™ 293轉染試劑。於轉染後，將轉染細胞在37°C下以定軌搖動器(125 rpm)培育16至18小時；之後在燒瓶中加入ExpiFectamine™ 293轉染強化劑1與強化劑2，並繼續培育5到6天。收集培養上清液，並使用蛋白L親和力層析法純化培養基中的scFv蛋白。第10A與10B圖分別是純化對TfR1胞外域專一單抗的scFv之SDS-PAGE與ELISA分析結果；第10C與10D圖分別是純化對β-類澱粉蛋白專一單抗的scFv之SDS-PAGE與ELISA分析結果。在96孔ELISA盤(Greiner Bio-one)上分別塗覆5 μg/ml的TfR1胞外域與5 μg/ml的β-類澱粉蛋白。利用HRP標記的蛋白L以1：5000的比例來偵測純化scFv。
ELISA分析結果顯示每一種純化scFv蛋白都可和其各別抗原(TfR1胞外域或β-類澱粉蛋白)專一地結合，以上分析單獨使用HRP標記的蛋白L作為陰性對照組。
實驗例 15 ：構建與選擇對人類 CD32a 胞外域專一的噬菌體 - 呈現 scFv
經雙方協議，由中央研究院基因體研究中心(臺北，臺灣)楊安綏博士研究室取得帶有對人類CD32a胞外域專一的scFv之噬菌體株。GH2 scFv抗體庫的框架序列(framework sequence)衍生自G6抗-VEGF Fab (蛋白庫編碼：2FJG)，將其選殖到噬質體載體pCANTAB5E (GE Healthcare)的限制位SfiI 與NotI 間，上述噬質體載體帶有胺苄青黴素(ampicillin)抗性基因、lacZ啟動子、有助於將scFv片段分泌至培養上清液中的pelB引導序列(leader sequence)、用於偵測的E-標籤。基於寡核苷定點突變(oligonucleotide-directed mutagenesis)技術將scFv模板的VH 與VL 域多樣化；將每一可變區域中的三個CDR同時多樣化。使用帶有超過109 個選殖株的scFv抗體庫在CD32a胞外域上進行篩選。
在Maxisorp 96孔盤(Nunc)上塗覆重組CD32a蛋白(每孔塗覆1  μg/100  μL PBS)，以淘選出抗CD32a抗體。簡言之，在孔盤上塗覆人類CD32a時，可將塗覆溶液注入孔中，並在室溫下搖晃2 小時。之後在室溫下，以阻隔緩衝液處理經CD32a塗覆的孔盤，阻隔緩衝液是以5%脫脂牛奶溶於PBST(帶有0.1% tween-20的磷酸延緩衝液)，處理時間1小時。將阻隔緩衝液中的重組噬菌體稀釋到每毫升8x1011 菌落形成單位(colony-forming unit，CFU)的濃度後，加入經塗覆CD32a的孔盤中，並溫和搖晃1小時。接著以PBST劇烈地清洗孔盤十次，再以PBS沖洗六次，以移除未專一結合的噬菌體。利用0.1 M HCl/甘胺酸緩衝液(pH 2.2)來沖提結合的噬菌體，並立刻以2 M三鹼(Tris-base)緩衝液(pH 9.0)中和沖提液。利用大腸桿菌品系ER2738 (OD600 = ~0.6)在37 °C下進行噬菌體感染，處理時間30分鐘；利用胺苄青黴素處理30分鐘，以移除未受感染的大腸桿菌。在胺苄青黴素處理後，加入帶有康黴素(kanamycin)抗性的輔助噬菌體M13KO7繼續培育1小時。從大腸桿菌培養物中選擇可被輔助噬菌體拯救的噬菌體，將其在帶有康黴素的環境中於37 °C下劇烈搖晃一晚，以擴增所選的噬菌體。在PEG/NaCl中使擴增的噬菌體析出，之後再重新懸浮於PBS中，以用於下一次的選擇-擴增循環。重複上述選擇-擴增循環，以在CD32a胞外域上連續進行三次淘選。
經噬菌體感染的ER2738菌落盤於系列稀釋後，計算其數目與噬菌體效價，以得到每一淘選回合後每毫升的輸出效價(output titer/ml；CFU/ml)。經過三回合淘選後，噬菌體輸出效價由1.6E+04 CFU/孔提升了超過1000倍而達到2.2E+07 CFU/孔。第11A圖顯示每一回合的噬菌體輸出/輸入效價比。Y軸顯示每一淘選回合的噬菌體輸出/輸入效價比。經過三回合的淘選後，陽性菌落的比例明顯提升。相較於第一回合，第三回合的輸出/輸入效價比提高了100倍，而結合的菌落也逐漸成為抗體庫中的優勢族群。
在一般的選擇程序中，於塗覆人類CD32a的ELISA孔盤上進行三回合的抗原淘選後，約有80%經結合的噬菌體粒子在ELISA分析中可專一地與所塗覆的CD32a結合。
實驗例 16 ：對人類 CD32a 胞外域專一的噬菌體 - 呈現 scFv 的單菌落 ELISA 分析
大腸桿菌品系ER2738經單一菌落噬菌體感染後，分別獲取了各別噬菌體的噬質體內的所選scFv基因；在深孔中加入2YT培養液(含16 g/L 胰化蛋白、10 g/L酵母抽出物以及5 g/L NaCl；pH 7.0)以及100 μg/ml胺苄青黴素，在37 °C下搖晃，以將這些大腸桿菌培養到中對數期(mid-log phase)。在培養液的OD600 達到1.0時，加入IPTG，使其最終濃度為1 μg/ml。在劇烈搖晃、37 °C下將孔盤培育一晚；其後，以4,000 g在4°C下將孔盤離心15分鐘。
利用ELISA來進行可溶性scFv結合試驗。簡言之，將Maxisorp 96-孔盤(Nunc)塗覆CD32a胞外域(每孔0.5  μg/100 μl PBS)或人類轉鐵蛋白-1受器(作為陰性對照組)，在4o C下搖晃18小時。在以300  μl的阻隔緩衝液處理1小時後，將100  μl含可溶性scFv的上清液和100 μl的阻隔緩衝液混合，而後將此混和物加入經塗覆的孔盤再處理1小時。將山羊抗-E-標籤抗體(與HRP複合，1：4000，型錄編號AB19400，Abcam)加入孔盤處理1小時。將TMB基質(每孔50 μl)加入孔盤，並於加入1N HCl (每孔50 μl)使反應停止後，測量在450 nm下的吸光值。
在經過三輪淘選後，共選出192株噬菌體進行本實驗例的分析。其中有12株scFv和CD32a結合後的OD450 差異(differential of OD450 )大於10，進一步定序編碼這12株scFv的基因序列，並識別出6種不同的DNA序列。第11B圖是scFv株22D1的ELISA分析結果。scFv株22D1和人類CD32a結合的OD450 為0.8，其胺基酸序列如序列編號：35所示。
實驗例 17 ：構建與選擇對人類 TfR1 胞外域專一的噬菌體 - 呈現 scFv
經雙方協議，由中央研究院基因體研究中心(臺北，臺灣)楊安綏博士研究室取得帶有對人類TfR1胞外域專一的scFv之噬菌體株。GH2 scFv抗體庫的框架序列衍生自G6抗-VEGF Fab (蛋白庫編碼：2FJG)，將其選殖到噬質體載體pCANTAB5E (GE Healthcare)的限制位SfiI 與NotI 間，上述噬質體載體帶有胺苄青黴素抗性基因、lacZ啟動子、有助於將scFv片段分泌至培養上清液中的pelB引導序列、用於偵測的E-標籤。基於寡核苷定點突變技術將scFv模板的VH 與VL 域多樣化；將每一可變區域中的三個CDR同時多樣化。使用帶有超過109 個選殖株的scFv抗體庫在TfR1胞外域上進行篩選。
在Maxisorp 96孔盤(Nunc)上塗覆重組TfR1蛋白(每孔塗覆1  μg/100  μL PBS)，以淘選出抗TfR1抗體。簡言之，在孔盤上塗覆人類TfR1時，可將塗覆溶液注入孔中，並在室溫下搖晃2 小時。之後在室溫下，以阻隔緩衝液處理經TfR1塗覆的孔盤，阻隔緩衝液是以5%脫脂牛奶溶於PBST(帶有0.1% tween-20的磷酸延緩衝液)，處理時間1小時。將阻隔緩衝液中的重組噬菌體稀釋到8x1011 CFU/mL的濃度後，加入經塗覆TfR1的孔盤中，並溫和搖晃1小時。接著以PBST劇烈地清洗孔盤十次，再以PBS沖洗六次，以移除未專一結合的噬菌體。利用0.1 M HCl/甘胺酸緩衝液(pH 2.2)來沖提結合的噬菌體，並立刻以2 M三鹼(Tris-base)緩衝液(pH 9.0)中和沖提液。利用大腸桿菌品系ER2738 (OD600 = ~0.6)在37 °C下進行噬菌體感染，處理時間30分鐘；利用胺苄青黴素處理30分鐘，以移除未受感染的大腸桿菌。在胺苄青黴素處理後，加入帶有康黴素抗性的輔助噬菌體M13KO7繼續培育1小時。從大腸桿菌培養物中選擇可被輔助噬菌體拯救的噬菌體，將其在帶有康黴素的環境中於37 °C下劇烈搖晃一晚，以擴增所選的噬菌體。在PEG/NaCl中使擴增的噬菌體析出，之後再重新懸浮於PBS中，以用於下一次的選擇-擴增循環。重複上述選擇-擴增循環，以在TfR1胞外域上連續進行三次淘選。
經噬菌體感染的ER2738菌落盤於系列稀釋後，計算其數目與噬菌體效價，以得到每一淘選回合後每毫升的輸出效價(output titer/ml；CFU/ml)。經過三回合淘選後，噬菌體輸出效價由3.74E+03 CFU/孔提升了超過1萬倍而達到1.5E+08 CFU/孔。第12A圖顯示每一回合的噬菌體輸出/輸入效價比。Y軸顯示每一淘選回合的噬菌體輸出/輸入效價比。經過三回合的淘選後，陽性菌落的比例明顯提升。相較於第一回合，第三回合的輸出/輸入效價比提高了1萬倍，而結合的菌落也逐漸成為抗體庫中的優勢族群。
在一般的選擇程序中，於塗覆人類TfR1的ELISA孔盤上進行三回合的抗原淘選後，約有80%與TfR1結合的噬菌體粒子在ELISA分析中可專一地與所塗覆的TfR1結合。
實驗例 18 ：對人類 TfR1 胞外域專一的噬菌體 - 呈現 scFv 的單菌落 ELISA 分析
大腸桿菌品系ER2738經單一菌落噬菌體感染後，分別獲取了各別噬菌體的噬質體內的所選scFv基因；在深孔中加入2YT培養液(含16 g/L 胰化蛋白、10 g/L酵母抽出物以及5 g/L NaCl；pH 7.0)以及100 μg/ml胺苄青黴素，在37 °C下搖晃，以將這些大腸桿菌培養到中對數期(mid-log phase)。在培養液的OD600 達到1.0時，加入IPTG，使其最終濃度為1 μg/ml。在劇烈搖晃、37 °C下將孔盤培育一晚；其後，以4,000 g在4°C下將孔盤離心15分鐘。
利用ELISA來進行可溶性scFv結合試驗。簡言之，將Maxisorp 96-孔盤(Nunc)塗覆TfR1胞外域(每孔0.5  μg/100 μl PBS)或CD16b (作為陰性對照組)，在4o C下搖晃18小時。在以300  μl的阻隔緩衝液處理1小時後，將100  μl含可溶性scFv的上清液和100 μl的阻隔緩衝液混合，而後將此混和物加入經塗覆的孔盤再處理1小時。將山羊抗-E-標籤抗體(與HRP複合，1：4000，型錄編號AB19400，Abcam)加入孔盤處理1小時。將TMB基質(每孔50 μl)加入孔盤，並於加入1N HCl (每孔50 μl)使反應停止後，測量在450 nm下的吸光值。
在經過三輪淘選後，共選出192株噬菌體進行本實驗例的分析。其中有23株scFv和TfR1結合後的OD450 差異大於10，進一步定序編碼這23株scFv的基因序列，並識別出16種不同的DNA序列。第12B圖是scFv株12A1的ELISA分析結果。scFv株12A1和人類TfR1結合的OD450 為1.7，其胺基酸序列如序列編號：36所示。
實驗例 19 ：製備 TCO- 對 CD32a 胞外域專一的 scFv 複合物
如上文實驗例所示，合成編碼序列編號：32蛋白質的DNA序列並使其表現。將抗-CD32a單抗的純化scFv和5 mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)在室溫下以溫和搖晃培育4小時，以使位於C-端的半胱胺酸殘基還原，以利與Mal-PEG3 -TCO (Conju-probe, Inc.)複合。利用NAP-10 Sephadex G-25管柱，將還原scFv蛋白的緩衝液置換為磷酸鈉緩衝液(100 mM磷酸鈉(pH7.0)、50 mM NaCl與5 mM EDTA)。在還原反應與緩衝液交換後，使莫耳比10：1 ([Mal-PEG3 -TCO]：[scFv])的反應物於室溫下反應一晚以進行複合。利用去鹽管柱移除過量的交聯物，並分析TCO-scFv複合產物。
MALDI-TOF質譜分析結果指出TCO-對CD32a專一的scFv複合物的分子量為27,337道耳頓。用12% SDS-PAGE以考瑪斯(Coomassie)染色來分析TCO-對CD32a專一的scFv複合物的純度。第13A圖與第13B圖分別是TCO-對CD32a專一的scFv複合物的ELISA與質譜分析結果，並以未修飾的對CD32a專一的scFv作為陽性對照組。ELISA結果顯示，TCO-對CD32a專一的scFv複合物可結合至重組人類CD32a胞外域。
實驗例 20 ：製備四嗪 - 對 TfR1 胞外域專一的 scFv 複合物
如上文實驗例所示，合成編碼序列編號：33蛋白質的DNA序列並使其表現。將抗-TfR1單的純化scFv和5 mM二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)在室溫下以溫和搖晃培育4小時，以使位於C-端的半胱胺酸殘基還原，以利與Mal-PEG4 -四嗪 (Conju-probe, Inc.)複合。利用NAP-10 Sephadex G-25管柱，將還原scFv蛋白的緩衝液置換為磷酸鈉緩衝液(100 mM磷酸鈉(pH7.0)、50 mM NaCl與5 mM EDTA)。在還原反應與緩衝液交換後，使莫耳比10：1 ([Mal-PEG4 -四嗪]：[scFv])的反應物於室溫下反應一晚以進行複合。利用去鹽管柱移除過量的交聯物，並分析四嗪-scFv複合產物。
MALDI-TOF質譜分析結果指出四嗪-對TfR1專一的scFv複合物的分子量為27,086道耳頓。用12% SDS-PAGE以考瑪斯(Coomassie)染色來分析四嗪-對TfR1專一的scFv複合物的純度。第14A圖與第14B圖分別是四嗪-對TfR1專一的scFv複合物的ELISA與質譜分析結果，並以未修飾的對TfR1專一的scFv作為陽性對照組。ELISA結果顯示，四嗪-對TfR1專一的scFv複合物可結合至重組人類TfR1胞外域。
實驗例 21 ：將 三個對內毒素專一的 scFv 複合至四嗪 - 多肽 1 核的三個順丁烯二醯亞胺 -PEG12 連接臂
本實驗例揭示可將三個scFv複合至四嗪-多肽1核上的三個PEG12 -順丁烯二醯亞胺連接臂。在與帶有三條PEG12 -順丁烯二醯亞胺連接臂的四嗪-多肽1核複合之前，將對內毒素專一的scFv和DTT以莫耳比2：1 ([DTT]：[scFv])的比例在25°C下以溫和搖晃培育4小時，以使位於C-端的半胱胺酸殘基還原。接著，利用NAP-10 Sephadex G-25管柱(GE Healthcare)，將經還原的對內毒素專一的scFv的緩衝液置換為順丁烯二醯亞胺-SH耦合反應緩衝液(100 mM磷酸鈉(pH7.0)、50 mM NaCl與5 mM EDTA)。在還原反應與緩衝液交換後，使莫耳比1：4 ([接合物]：[蛋白])的反應物於4°C下反應一晚以使其與帶有三條順丁烯二醯亞胺-PEG12 連接臂的四嗪-多肽1核複合。
利用粒徑篩析管柱S75，將與三個對內毒素專一的scFv複合的PEG12 -順丁烯二醯亞胺-四嗪-多肽1複合物和游離的scFv、游離的PEG12 -順丁烯二醯亞胺-四嗪-多肽1複合物以及與一個或兩個對內毒素專一的scFv複合的PEG12 -順丁烯二醯亞胺-四嗪-多肽1複合物互相分離。
第15A圖是所合成的標的接合單元的FPLC溶析曲線圖；滯留體積(retention volume)為9.5毫升；所述合成的標的接合單元是由帶有一個自由四嗪官能基和一組三個對內毒素專一的scFv (作為標的元件)的接合單元所組成。產物(即，帶有一個自由四嗪官能基和一組三個對內毒素專一的scFv的PEG12 -順丁烯二醯亞胺-四嗪-多肽1複合物)純化於溶析份(elution fraction)中，以10% SDS-PAGE分離後，此產物為第15B圖電泳條4箭頭所指處。
實驗例 22 ：標的接合單元的 MALDI-TOF 分析；此標的接合單元帶有連接於四嗪 - 多肽 1 核上三條 順丁烯二醯亞胺 -PEG12 連接臂的三個對內毒素專一的 scFv
將帶有連接於四嗪-多肽1核上三條順丁烯二醯亞胺-PEG12 連接臂的三個對內毒素專一的scFv的標的接合單元樣本進行MALDI-TOF分析。實驗所得的中位數分子量和三個對內毒素專一的scFv與帶有三條順丁烯二醯亞胺-PEG12 連接臂的四嗪-多肽1核耦合產物的理論中位數分子量相符。根據第15C圖所示的質譜分析結果，此一標的接合單元的中位數分子量為81,727道耳頓。
如下圖所示，此處合成的標的接合單元帶有一個自由四嗪官能基和一組三個對內毒素專一的scFv作為標的元件。
Figure TWI614023BD00023
實驗例 23 ：製備由四嗪 - 多肽 1 核和帶有三個對 RSV F 蛋白專一的 scFv 組成的標的接合單元
利用上文實驗例所述的方法，將scFv與接合單元複合並於純化後進一步分析。
第16圖為所述合成標的接合單元的質譜分析結果，此接合單元包含一個自由四嗪官能基和一組三個scFv對RSV F蛋白專一的scFv (如下圖所示)。如第16圖所示，此一標的接合單元的分子量為81,978道耳頓。
Figure TWI614023BD00024
實驗例 24 ：將 三個對 β- 類澱粉蛋白專一的 scFv 耦合至帶有 三條順丁烯二醯亞胺 -PEG12 連接臂的 TCO- 多肽 1 核
本實驗例揭示可將三個scFv複合至TCO-多肽1核上的三個順丁烯二醯亞胺-PEG12 連接臂。在與帶有三條順丁烯二醯亞胺-PEG12 連接臂的TCO-多肽1核複合之前，將對β-類澱粉蛋白專一的scFv和DTT以莫耳比2：1 ([DTT]：[scFv])的比例在室溫下以溫和搖晃培育4小時，以使位於C-端的半胱胺酸殘基還原。接著，利用NAP-10 Sephadex G-25管柱(GE Healthcare)，將經還原的對β-類澱粉蛋白專一的scFv的緩衝液置換為順丁烯二醯亞胺-SH耦合反應緩衝液(100 mM磷酸鈉(pH7.0)、50 mM NaCl與5 mM EDTA)。在還原反應與緩衝液交換後，使莫耳比1：4 ([接合物]：[蛋白])的反應物於4°C下反應一晚以使其與帶有三條順丁烯二醯亞胺-PEG12 連接臂的TCO-多肽1核複合。
將前述實驗例的反應混合物調整至pH 5.0，之後加入至以(5 mM EDTA與50 mM醋酸鈉(pH 5.0)預平衡的(pre-equilibrated)陽離子交換管柱SP Sepharose FF (GE Healthcare)。利用0至500 mM的氯化鈉線性梯度在每分鐘0.5毫升的流率、100分鐘的條件下，使和三個對β-類澱粉蛋白專一的scFv複合的順丁烯二醯亞胺-PEG12 -TCO-多肽1複合物析出。利用陽離子交換管柱SP Sepharose FF，將與三個對β-類澱粉蛋白專一的scFv複合的順丁烯二醯亞胺-PEG12 -TCO-多肽1複合物和游離的scFv、游離的順丁烯二醯亞胺-PEG12 -TCO-多肽1複合物以及與一個或兩個對β-類澱粉蛋白專一的scFv複合的順丁烯二醯亞胺-PEG12 -TCO-多肽1複合物互相分離。濃縮純化產物，即與三個對β-類澱粉蛋白專一的scFv複合的順丁烯二醯亞胺-PEG12 -TCO-多肽1複合物，並將其緩衝液置換為鏈接反應緩衝液(100 mM磷酸鉀，pH 7.0)。
第17A圖是在陽離子交換管柱SP Sepharose FF上進行FPLC後，所合成的效應接合單元的溶析曲線圖；所述合成的效應接合單元是由帶有一個自由TCO官能基和一組三個對β-類澱粉蛋白專一的scFv (作為效應元件)的接合單元所組成。第17A圖所示的#1與#2分別代表與兩個和三個對β-類澱粉蛋白專一的scFv複合的順丁烯二醯亞胺-PEG12 -TCO-多肽1複合物的析出峰。純化產物(即，帶有一個自由TCO官能基和一組三個對β-類澱粉蛋白專一的scFv的順丁烯二醯亞胺-PEG12 -TCO-多肽1複合物)，以8% SDS-PAGE分離後，此產物為第17B圖電泳條所示。
實驗例 25 ：效應接合單元的 MALDI-TOF 分析；此效應接合單元帶有連接於 TCO- 多肽 1 核上三條 順丁烯二醯亞胺 -PEG12 連接臂的三個對 β- 類澱粉蛋白專一的 scFv
將帶有連接於TCO-多肽1核上三條順丁烯二醯亞胺-PEG12 連接臂的三個對β-類澱粉蛋白專一的scFv的效應接合單元樣本進行MALDI-TOF分析。實驗所得的中位數分子量和三個對β-類澱粉蛋白專一的scFv與帶有三條順丁烯二醯亞胺-PEG12 連接臂的TCO-多肽1核耦合產物的理論中位數分子量相符。根據第17C圖所示的質譜分析結果，此一效應接合單元的中位數分子量為87,160道耳頓。
如下圖所示，此處合成的效應接合單元帶有一個自由TCO官能基和一組三個對人類β-類澱粉蛋白專一的scFv作為標的元件。
Figure TWI614023BD00025
實驗例 26 ：製備分子構建體；此分子構建體帶有作為標的元件的三個對 RSV F 蛋白專一的 scFv 以及作為效應元件的一個對 CD32a 胞外域專一的 scFv
於本實驗例中，使上述實驗例所製得之標的接合單元的四嗪基和TCO-對CD32a胞外域專一的scFv複合物的TCO基進行iEDDA反應，而將兩者接合。具體來說，所述標的接合單元帶有三個對RSV F蛋白專一的scFv以及一個自由四嗪基。
根據製造商(Jena Bioscience GmbH, Jena, Germany)的說明進行四嗪-TCO接合。簡言之，將100 μl的標的接合單元(0.3 mg/ml)加入含有效應元件的溶液中，兩者的莫耳比為1：1.2 ([四嗪]：[TCO])。在室溫下將反應混合物培育1小時。對產物進行質譜分析，結果顯示產物的分子量為113,036道耳頓(第18A圖)。
此一產物(如下所示)是一種單一接合單元分子構建體，其具有三個對RSV F蛋白專一的scFv (作為標的元件)以及一個對CD32a胞外域專一的scFv (作為效應元件)。
Figure TWI614023BD00026
實驗例 27 ：製備分子構建體；此分子構建體帶有作為標的元件的三個對內毒素專一的 scFv 以及作為效應元件的一個對 CD32a 胞外域專一的 scFv
使上述實驗例所製得之標的接合單元的四嗪基和TCO-對CD32a胞外域專一的scFv複合物的TCO基進行iEDDA反應，而將兩者接合。
根據上述實驗例所述的方式進行四嗪-TCO接合。所得產物(如下所示)是一種單一接合單元分子構建體，其具有三個對內毒素專一的scFv (作為標的元件)以及一個對CD32a胞外域專一的scFv (作為效應元件)。第18B圖所示的質譜分析結果顯示此一分子構建體的分子量為113,761道耳頓。
Figure TWI614023BD00027
實驗例 28 ：製備分子構建體；此分子構建體帶有作為標的元件的一個對 TfR1 胞外域專一的 scFv 以及作為效應元件的三個對 β- 類澱粉蛋白專一的 scFv
使上述實驗例所製得之標的接合單元的TCO和四嗪-對TfR1胞外域專一的scFv複合物的四嗪基進行iEDDA反應，而將兩者接合。
根據製造商(Jena Bioscience GmbH, Jena, Germany)的說明進行四嗪-TCO接合。簡言之，將12.6 μl的標的元件(5.65 mg/ml)加入含有帶有效應元件的接合單元溶液中，兩者的莫耳比為10：1 ([四嗪]：[TCO])。在室溫下將反應混合物培育3小時。對產物進行質譜分析，結果顯示產物的分子量為114,248道耳頓(第18C圖)。
此一產物(如下所示)是一種單一接合單元分子構建體，其具有一個對TfR1胞外域專一的scFv (作為標的元件)以及三個對β-類澱粉蛋白專一的scFv (作為效應元件)。
Figure TWI614023BD00028
當可理解，上文實施方式的說明僅為例示，且本發明所屬技術領域具有通常知識者可對其進行各種修飾。上文的說明、實驗例與資料完整地說明了本發明例示性實施方式的結構與用途。雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。
主要元件符號如下：
10A‧‧‧接合單元
11a‧‧‧中心核
20a-20d‧‧‧連接臂
為讓本發明的上述與其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，茲將所附圖式簡單說明如下。
第1A圖至第1N圖為根據本揭示內容某些實施方式的接合單元的示意圖。
第2圖為一多肽核接合單元的基質輔助雷射脫附飛行時間質譜分析(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)結果，此多肽核接合單元帶有一個含四嗪基的連接臂以及三個含順丁烯二醯亞胺基的PEG連接臂。
第3圖為NHS-PEG5 -芬戈莫德複合物的MALDI-TOF MS分析結果。
第4圖為一載藥束的MALDI-TOF MS分析結果，此載藥束由帶有自由TCO官能基與一組五個芬戈莫德分子的接合單元所組成。
第5圖為一載藥束的MALDI-TOF MS分析結果，此載藥束由帶有自由TCO官能基與一組十個芬戈莫德分子的接合單元所組成。
第6圖為一載藥束的MALDI-TOF MS分析結果，此載藥束由帶有自由TCO官能基與一組五個芬戈莫德磷酸鹽分子的接合單元所組成。
第7圖為純化人類CD32a胞外域(ectodomain)的SDS-PAGE分析結果。
第8圖為純化人類TfR1胞外域的SDS-PAGE分析結果。
第9A圖為純化對RSV蛋白F專一的scFv的SDS-PAGE分析結果；第9B圖為純化對RSV蛋白F專一的scFv的ELISA分析結果；第9C圖為純化對內毒素專一的scFv的SDS-PAGE分析結果；第9D圖為純化對內毒素專一的scFv的ELISA分析結果；第9E圖為純化對CD32a胞外域專一的scFv的SDS-PAGE分析結果；以及第9F圖為純化對CD32a胞外域專一的scFv的ELISA分析結果。
第10A圖為純化對大鼠TfR1胞外域專一的scFv的SDS-PAGE分析結果；第10B圖為純化對大鼠TfR1胞外域專一的scFv的ELISA分析結果；第10C圖為純化對β-類澱粉蛋白專一的scFv的SDS-PAGE分析結果；以及第10D圖為純化對β-類澱粉蛋白專一的scFv的ELISA分析結果。
第11A圖為帶有對人類CD32a胞外域專一的scFv之噬菌體的病毒效價資料；以及第11B圖為對人類CD32a胞外域專一的噬菌體-呈現scFv的單菌落ELISA分析結果。
第12A圖為帶有對人類TfR1胞外域專一的scFv之噬菌體的病毒效價資料；以及第12B圖為對人類TfR1胞外域專一的噬菌體-呈現scFv的單菌落ELISA分析結果。
第13A圖與第13B圖分別是TCO-對CD32a專一的scFv複合物的ELISA分析結果與質譜分析結果。
第14A圖與第14B圖分別是四嗪-對TfR1專一的scFv複合物的ELISA分析結果與質譜分析結果。
第15A圖是所合成的標的接合單元以粒徑篩析(size exclusion)管柱S75進行FPLC所得的溶析曲線圖，所述合成的標的接合單元是由帶有一自由四嗪官能基和一組三個對內毒素專一的scFv (作為標的元件)的接合單元所組成；第15B圖與第15C圖分別是第15A圖所述合成的標的接合單元的SDS-PAGE分析結果與質譜分析結果。
第16圖是所合成的標的接合單元的質譜分析結果；所述標的接合單元是由帶有一自由四嗪官能基和一組三個對RSV蛋白F專一的scFv(作為標的元件)的接合單元所組成。
第17A圖是所合成的標的接合單元以陽離子交換管柱進行FPLC所得的溶析曲線圖，所述合成的標的接合單元是由帶有一個自由TCO官能基和一組三個對β-類澱粉蛋白專一的scFv (作為標的元件)的接合單元所組成；第17B圖與第17C圖分別是第17A圖所述合成的標的接合單元的SDS-PAGE分析結果與ELISA分析結果。
第18A圖為一單一接合單元分子構建體質譜分析結果，此單一接合單元分子構建體是以三個對內毒素專一的scFv作為標的元件以及一個對CD32a胞外域專一的scFv作為效應元件；第18B圖為另一單一接合單元分子構建體的的質譜分析結果，此單一接合單元分子構建體是以三個對內毒素專一的scFv作為標的元件以及一個對CD32a胞外域專一的scFv作為效應元件；以及第18C圖為又一單一接合單元分子構建體的質譜分析結果，此單一接合單元分子構建體是以一個對TfR1胞外域專一的scFv作為標的元件以及三個對β-類澱粉蛋白專一的scFv作為效應元件。
根據慣常的作業方式，圖中各種特徵與元件並未依比例繪製，其繪製方式是為了以最佳的方式呈現與本發明相關的具體特徵與元件。此外，在不同圖式間，儘可能以相同或相似的元件符號來指稱相似的元件/部件。
＜110＞ 免疫功坊股份有限公司 ＜120＞ 具有標的部分及效應部分的胜肽核多臂接合物 ＜130＞ P2951-TW ＜150＞ US 62/164,400 ＜151＞ 2015-05-20 ＜150＞ US/62/213,012 ＜151＞ 2015-09-01 ＜150＞ US 62/308,349 ＜151＞ 2016-03-15 ＜160＞ 36 ＜170＞ BiSSAP 1.3 ＜210＞ 1 ＜211＞ 4 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ filler sequence-1 ＜400＞ 1 Gly Gly Gly Ser 1 ＜210＞ 2 ＜211＞ 4 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ filler sequence-2 ＜400＞ 2 Gly Ser Gly Ser 1 ＜210＞ 3 ＜211＞ 4 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ filler sequence-3 ＜400＞ 3 Gly Gly Ser Gly 1 ＜210＞ 4 ＜211＞ 5 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ filler sequence-4 ＜400＞ 4 Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 ＜210＞ 5 ＜211＞ 5 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ filler sequence-5 ＜400＞ 5 Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 ＜210＞ 6 ＜211＞ 5 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ filler sequence-6 ＜400＞ 6 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 ＜210＞ 7 ＜211＞ 6 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ filler sequence-7 ＜400＞ 7 Gly Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 ＜210＞ 8 ＜211＞ 7 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ filler sequence-8 ＜400＞ 8 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly 1 5 ＜210＞ 9 ＜211＞ 8 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ filler sequence-9 ＜400＞ 9 Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser 1 5 ＜210＞ 10 ＜211＞ 9 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ filler sequence-10 ＜400＞ 10 Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser 1 5 ＜210＞ 11 ＜211＞ 10 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ filler sequence-11 ＜400＞ 11 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 ＜210＞ 12 ＜211＞ 11 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ filler sequence-12 ＜400＞ 12 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser 1 5 10 ＜210＞ 13 ＜211＞ 12 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ filler sequence-13 ＜400＞ 13 Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser 1 5 10 ＜210＞ 14 ＜211＞ 13 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ filler sequence-14 ＜400＞ 14 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 ＜210＞ 15 ＜211＞ 14 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ filler sequence-15 ＜400＞ 15 Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Gly Gly Ser 1 5 10 ＜210＞ 16 ＜211＞ 15 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ filler sequence-16 ＜400＞ 16 Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 ＜210＞ 17 ＜211＞ 16 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ ACETYLATION ＜220＞ ＜223＞ polypeptide core-1 ＜400＞ 17 Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys 1 5 10 15 ＜210＞ 18 ＜211＞ 19 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ ACETYLATION ＜220＞ ＜223＞ polypeptitde core-2 ＜400＞ 18 Cys Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys 1 5 10 15 Gly Ser Lys ＜210＞ 19 ＜211＞ 31 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ ACETYLATION ＜220＞ ＜223＞ polypeptide-3 ＜400＞ 19 Cys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys 1 5 10 15 Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys 20 25 30 ＜210＞ 20 ＜211＞ 8 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ hapten ＜400＞ 20 Trp Ala Asp Trp Pro Gly Pro Pro 1 5 ＜210＞ 21 ＜211＞ 16 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ Xaa is homopropargylglycine ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ ACETYLATION ＜220＞ ＜223＞ polypeptide core-4 ＜400＞ 21 Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys 1 5 10 15 ＜210＞ 22 ＜211＞ 19 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ Xaa is homopropargylglycine ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ ACETYLATION ＜220＞ ＜223＞ polypeptide core-5 ＜400＞ 22 Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys 1 5 10 15 Gly Ser Lys ＜210＞ 23 ＜211＞ 19 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ Xaa is L-azidohomoalanine ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ ACETYLATION ＜220＞ ＜223＞ polypeptide core-6 ＜400＞ 23 Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys 1 5 10 15 Gly Ser Lys ＜210＞ 24 ＜211＞ 21 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ Xaa is homopropargylglycine ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ ACETYLATION ＜220＞ ＜223＞ polypeptide core-7 ＜400＞ 24 Xaa Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Lys Gly Ser Gly Ser Lys 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ser Cys 20 ＜210＞ 25 ＜211＞ 7 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ ACETYLATION ＜220＞ ＜223＞ polypeptide core-8 ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 2,4,6 ＜223＞ Xaa is PEGylated amino acid with two EG units ＜400＞ 25 Cys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys 1 5 ＜210＞ 26 ＜211＞ 11 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 1 ＜223＞ ACETYLATION ＜220＞ ＜223＞ polypeptide core-9 ＜220＞ ＜221＞ MOD_RES ＜222＞ 2,4,6,8,10 ＜223＞ Xaa is PEGylated amino acid with six EG units ＜400＞ 26 Cys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys Xaa Lys 1 5 10 ＜210＞ 27 ＜211＞ 16 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ 5xdrug ＜400＞ 27 Cys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys Gly Ser Lys 1 5 10 15 ＜210＞ 28 ＜211＞ 666 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ human transferrin-1 receptor ＜400＞ 28 Leu Ala Gly Thr Glu Ser Pro Val Arg Glu Glu Pro Gly Glu Asp Phe 1 5 10 15 Pro Ala Ala Arg Arg Leu Tyr Trp Asp Asp Leu Lys Arg Lys Leu Ser 20 25 30 Glu Lys Leu Asp Ser Thr Asp Phe Thr Ser Thr Ile Lys Leu Leu Asn 35 40 45 Glu Asn Ser Tyr Val Pro Arg Glu Ala Gly Ser Gln Lys Asp Glu Asn 50 55 60 Leu Ala Leu Tyr Val Glu Asn Gln Phe Arg Glu Phe Lys Leu Ser Lys 65 70 75 80 Val Trp Arg Asp Gln His Phe Val Lys Ile Gln Val Lys Asp Ser Ala 85 90 95 Gln Asn Ser Val Ile Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg Leu Val Tyr Leu 100 105 110 Val Glu Asn Pro Gly Gly Tyr Val Ala Tyr Ser Lys Ala Ala Thr Val 115 120 125 Thr Gly Lys Leu Val His Ala Asn Phe Gly Thr Lys Lys Asp Phe Glu 130 135 140 Asp Leu Tyr Thr Pro Val Asn Gly Ser Ile Val Ile Val Arg Ala Gly 145 150 155 160 Lys Ile Thr Phe Ala Glu Lys Val Ala Asn Ala Glu Ser Leu Asn Ala 165 170 175 Ile Gly Val Leu Ile Tyr Met Asp Gln Thr Lys Phe Pro Ile Val Asn 180 185 190 Ala Glu Leu Ser Phe Phe Gly His Ala His Leu Gly Thr Gly Asp Pro 195 200 205 Tyr Thr Pro Gly Phe Pro Ser Phe Asn His Thr Gln Phe Pro Pro Ser 210 215 220 Arg Ser Ser Gly Leu Pro Asn Ile Pro Val Gln Thr Ile Ser Arg Ala 225 230 235 240 Ala Ala Glu Lys Leu Phe Gly Asn Met Glu Gly Asp Cys Pro Ser Asp 245 250 255 Trp Lys Thr Asp Ser Thr Cys Arg Met Val Thr Ser Glu Ser Lys Asn 260 265 270 Val Lys Leu Thr Val Ser Asn Val Leu Lys Glu Ile Lys Ile Leu Asn 275 280 285 Ile Phe Gly Val Ile Lys Gly Phe Val Glu Pro Asp His Tyr Val Val 290 295 300 Val Gly Ala Gln Arg Asp Ala Trp Gly Pro Gly Ala Ala Lys Ser Gly 305 310 315 320 Val Gly Thr Ala Leu Leu Leu Lys Leu Ala Gln Met Phe Ser Asp Met 325 330 335 Val Leu Lys Asp Gly Phe Gln Pro Ser Arg Ser Ile Ile Phe Ala Ser 340 345 350 Trp Ser Ala Gly Asp Phe Gly Ser Val Gly Ala Thr Glu Trp Leu Glu 355 360 365 Gly Tyr Leu Ser Ser Leu His Leu Lys Ala Phe Thr Tyr Ile Asn Leu 370 375 380 Asp Lys Ala Val Leu Gly Thr Ser Asn Phe Lys Val Ser Ala Ser Pro 385 390 395 400 Leu Leu Tyr Thr Leu Ile Glu Lys Thr Met Gln Asn Val Lys His Pro 405 410 415 Val Thr Gly Gln Phe Leu Tyr Gln Asp Ser Asn Trp Ala Ser Lys Val 420 425 430 Glu Lys Leu Thr Leu Asp Asn Ala Ala Phe Pro Phe Leu Ala Tyr Ser 435 440 445 Gly Ile Pro Ala Val Ser Phe Cys Phe Cys Glu Asp Thr Asp Tyr Pro 450 455 460 Tyr Leu Gly Thr Thr Met Asp Thr Tyr Lys Glu Leu Ile Glu Arg Ile 465 470 475 480 Pro Glu Leu Asn Lys Val Ala Arg Ala Ala Ala Glu Val Ala Gly Gln 485 490 495 Phe Val Ile Lys Leu Thr His Asp Val Glu Leu Asn Leu Asp Tyr Glu 500 505 510 Arg Tyr Asn Ser Gln Leu Leu Ser Phe Val Arg Asp Leu Asn Gln Tyr 515 520 525 Arg Ala Asp Ile Lys Glu Met Gly Leu Ser Leu Gln Trp Leu Tyr Ser 530 535 540 Ala Arg Gly Asp Phe Phe Arg Ala Thr Ser Arg Leu Thr Thr Asp Phe 545 550 555 560 Gly Asn Ala Glu Lys Thr Asp Arg Phe Val Met Lys Lys Leu Asn Asp 565 570 575 Arg Val Met Arg Val Glu Tyr His Phe Leu Ser Pro Tyr Val Ser Pro 580 585 590 Lys Glu Ser Pro Phe Arg His Val Phe Trp Gly Ser Gly Ser His Thr 595 600 605 Leu Pro Ala Leu Leu Glu Asn Leu Lys Leu Arg Lys Gln Asn Asn Gly 610 615 620 Ala Phe Asn Glu Thr Leu Phe Arg Asn Gln Leu Ala Leu Ala Thr Trp 625 630 635 640 Thr Ile Gln Gly Ala Ala Asn Ala Leu Ser Gly Asp Val Trp Asp Ile 645 650 655 Asp Asn Glu Phe His His His His His His 660 665 ＜210＞ 29 ＜211＞ 192 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ human CD32 ＜400＞ 29 Gln Ala Ala Ala Pro Pro Lys Ala Val Leu Lys Leu Glu Pro Pro Trp 1 5 10 15 Ile Asn Val Leu Gln Glu Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Gln Gly Ala 20 25 30 Arg Ser Pro Glu Ser Asp Ser Ile Gln Trp Phe His Asn Gly Asn Leu 35 40 45 Ile Pro Thr His Thr Gln Pro Ser Tyr Arg Phe Lys Ala Asn Asn Asn 50 55 60 Asp Ser Gly Glu Tyr Thr Cys Gln Thr Gly Gln Thr Ser Leu Ser Asp 65 70 75 80 Pro Val His Leu Thr Val Leu Ser Glu Trp Leu Val Leu Gln Thr Pro 85 90 95 His Leu Glu Phe Gln Glu Gly Glu Thr Ile Met Leu Arg Cys His Ser 100 105 110 Trp Lys Asp Lys Pro Leu Val Lys Val Thr Phe Phe Gln Asn Gly Lys 115 120 125 Ser Gln Lys Phe Ser Arg Leu Asp Pro Thr Phe Ser Ile Pro Gln Ala 130 135 140 Asn His Ser His Ser Gly Asp Tyr His Cys Thr Gly Asn Ile Gly Tyr 145 150 155 160 Thr Leu Phe Ser Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Val Pro Ser 165 170 175 Met Gly Ser Ser Ser Pro Met Gly Ile Ile His His His His His His 180 185 190 ＜210＞ 30 ＜211＞ 256 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ scFv of anti-RSV mAb ＜400＞ 30 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Cys Gln Leu Ser Val Gly Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser Gly 100 105 110 Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Thr 115 120 125 Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr 130 135 140 Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Ser 145 150 155 160 Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala 165 170 175 Asp Ile Trp Trp Asp Asp Lys Lys Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 180 185 190 Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Lys 195 200 205 Val Thr Asn Met Asp Pro Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg 210 215 220 Ser Met Ile Thr Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr 225 230 235 240 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys 245 250 255 ＜210＞ 31 ＜211＞ 257 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ scFv of anti-endotoxin mAb ＜400＞ 31 Asp Ile Gln Met Asn Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Thr Ile Ser Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Ile Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val 115 120 125 Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 130 135 140 Ser Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr Met 145 150 155 160 Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Ala Pro Glu Trp Leu Ala Leu 165 170 175 Ile Arg Asn Lys Arg Asn Gly Asp Thr Ala Glu Tyr Ser Ala Ser Val 180 185 190 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Tyr Ser Arg Ser Ile Leu His 195 200 205 Leu Gln Met Asn Ala Leu Arg Thr Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys 210 215 220 Val Arg Gln Gly Arg Gly Tyr Thr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 225 230 235 240 Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Cys ＜210＞ 32 ＜211＞ 255 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ scFv of anti-CD32a mAb ＜400＞ 32 Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Ser Ala 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro His 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val 115 120 125 His Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu 130 135 140 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met 145 150 155 160 His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val 165 170 175 Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Tyr Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly 180 185 190 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 195 200 205 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 210 215 220 Asp Leu Gly Ala Ala Ala Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 225 230 235 240 Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys 245 250 255 ＜210＞ 33 ＜211＞ 251 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ scFv of anti-transferrin-1 receptor mAb ＜400＞ 33 Asp Ile Val Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Thr Ile Leu Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asn Val Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Ser Tyr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser 100 105 110 Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val 115 120 125 Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Ala Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Met 130 135 140 Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr Trp Met 145 150 155 160 Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Leu Ile Gly Met 165 170 175 Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Val Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys Asp 180 185 190 Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln 195 200 205 Leu Asn Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 210 215 220 Phe Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 225 230 235 240 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys 245 250 ＜210＞ 34 ＜211＞ 262 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ scFv of anti-beta-amyloid Bapineuzumab mAb ＜400＞ 34 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser 115 120 125 Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 130 135 140 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 145 150 155 160 Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 165 170 175 Glu Trp Val Ala Ser Ile Arg Ser Gly Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser 180 185 190 Asp Asn Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 195 200 205 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Val Arg Tyr Asp His Tyr Ser Gly Ser Ser Asp Tyr Trp 225 230 235 240 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser 245 250 255 Gly Gly Gly Gly Ser Cys 260 ＜210＞ 35 ＜211＞ 239 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ B6 scFv of anti-human TfR derived from phage display ＜400＞ 35 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asp Ser Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Ser Tyr Ser Gly Tyr Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Gly Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Ile Glu Gly Arg Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val 115 120 125 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 130 135 140 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Gly Asn Ser Ser Ile His Trp Val 145 150 155 160 Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Trp Pro 165 170 175 Phe Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr 180 185 190 Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser 195 200 205 Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ser Tyr 210 215 220 Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 ＜210＞ 36 ＜211＞ 243 ＜212＞ PRT ＜213＞ 人工序列 ＜220＞ ＜223＞ scFv of anti-human CD32 derived from phage display ＜400＞ 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Asn Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Gly Thr Ser Gly Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Gly Gly Pro Met 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Ser Ser 100 105 110 Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Val 115 120 125 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 130 135 140 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Ile Asn Asn Gly Gly Ile 145 150 155 160 His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Gly 165 170 175 Ile Trp Pro Phe Gly Gly Phe Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 180 185 190 Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln 195 200 205 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 210 215 220 Ser Trp Phe Ser Trp Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser
10A‧‧‧接合單元
11a‧‧‧中心核
20a-20d‧‧‧連接臂

Claims (25)

  1. 一種接合單元，包含： 一中心核，包含：(1)一第一多肽，包含複數個離胺酸(lysine，K)殘基，其中每一個K殘基和其下一個K殘基間是由一填充序列所隔開，該填充序列包含甘胺酸(glycine，G)以及絲胺酸(serine，S)殘基，且該K殘基的數目為2至15；或(2)一第二多肽，包含(Xaa -K)n 序列，其中Xaa 為一聚乙二醇化胺基酸(PEGylated amino acid)其具有2至12個乙二醇(ethylene glycol，EG)重複單元，且n為2至15的整數，其中該中心核N-或C-端至少一者的胺基酸殘基有疊氮基或炔基、或為半胱胺酸殘基，其中當該中心核N-或C-端的胺基酸殘基為半胱胺酸殘基時，該接合單元更包含，視需要地，一耦合臂，該耦合臂透過該半胱胺酸殘基的硫氫基而與其連接，且該耦合臂的自由端有疊氮基、炔基、四嗪基、環辛烯基或環辛炔基； 複數個連接臂，分別連接於該中心核的該K殘基； 視需要的複數個銜接臂，分別透過CuAAC反應、SPAAC反應或iEDDA反應而連接於該些連接臂；以及 複數個第一元件，分別透過以下方式而連接於該些連接臂：於其間形成一醯胺鍵、或透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應、CuAAC反應、SPAAC反應或iEDDA反應；或分別透過以下方式而連接於該些銜接臂：於其間形成一醯胺鍵、或透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應，其中 每一該些第一元件為芬戈莫德、芬戈莫德磷酸鹽、干擾素-β或對整合素-α4、β-類澱粉蛋白、病毒蛋白或細菌蛋白專一的scFv；以及 當該些連接臂是透過CuAAC反應或SPAAC反應而連接於該些銜接臂或該些第一元件時，該位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基為半胱胺酸殘基，且該耦合臂的自由端為四嗪基或環辛烯基；或 當該些連接臂是透過iEDDA反應而連接於該些銜接臂或該些第一元件時，該位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基有疊氮基或炔基、或該位於中心核N-或C-端的胺基酸殘基為半胱胺酸殘基，且該耦合臂的自由端為該疊氮基、炔基或環辛炔基。
  2. 如請求項1所述的接合單元，其中該填充序列的序列為GS、GGS、GSG、或如序列編號：1-16所示任一序列。
  3. 如請求項1所述的接合單元，其中該第一多肽包含2-15單元的G1-5 SK序列。
  4. 如請求項3所述的接合單元，其中該第一多肽包含(GSK)2-15 序列。
  5. 如請求項1所述的接合單元，其中每一該些連接臂為一PEG鏈，其具有2至20個EG重複單元。
  6. 如請求項1所述的接合單元，其中該些連接臂的每一者為一PEG鏈，，其具有2至20個EG重複單元，且其自由端帶有一雙硫鍵。
  7. 如請求項1所述的接合單元，其中該耦合臂為一PEG鏈，其具有2至12個EG重複單元。
  8. 如請求項1所述的接合單元，其中具有疊氮基的該胺基酸殘基為L-疊氮高丙胺酸(azidohomoalanine、AHA)、4-疊氮-L-苯丙胺酸(4-azido-L-phenyl- alanine)、4-疊氮-D-苯丙胺酸(4-azido-D-phenylalanine)、3-疊氮-L-丙胺酸(3-azido-L-alanine)、3-疊氮-D-丙胺酸(3-azido-D-alanine)、4-疊氮-L-高丙胺酸(4-azido-L-homoalanine)、4-疊氮-D-高丙胺酸(4-azido-D-homoalanine)、5-疊氮-L-烏胺酸(5-azido-L-ornithine)、5-疊氮-D-烏胺酸(5-azido-D-ornithine)、6-疊氮-L-離胺酸(6-azido-L-lysine)或6-疊氮-D-離胺酸(6-azido-D-lysine)。
  9. 如請求項33所述的接合單元，其中具有炔基的該胺基酸殘基為L-高炔丙基甘胺酸(L-homopropargylglycine，L-HPG)、D-高炔丙基甘胺酸(D-homopropargylglycine，D-HPG)或β-高炔丙基甘胺酸(beta-homopropargyl- glycine、β-HPG)。
  10. 如請求項1所述的接合單元，其中該環辛烯基為反式-環辛烯(trans-cyclooctene，TCO)；且該環辛炔基為二苯并環辛炔(dibenzocyclooctyne，DBCO)、二氟化環辛炔(difluorinated cyclooctyne，DIFO)、二環壬炔(bicyclononyne，BCN)或二苯并環辛炔(dibenzocyclooctyne，DICO)。
  11. 如請求項1所述的接合單元，其中該四嗪基為1,2,3,4-四嗪、1,2,3,5-四嗪或1,2,4,5-四嗪基、或其衍生物。
  12. 如請求項1所述的接合單元，其中該病毒蛋白為呼吸道融合病毒(respiratory syncytia virus，RSV)的F蛋白、人類免疫缺陷病毒第I型(human immunodeficiency virus type 1，HIV-1)的gp120蛋白、A型流感病毒的血球凝集素A (hemagglutinin A，HA)蛋白或巨細胞病毒的醣蛋白。
  13. 如請求項1所述的接合單元，其中該細菌蛋白是革蘭氏陰性菌(Gram(-) bacteria)的內毒素(endotoxin)、困難梭狀芽孢桿菌(Clostridium difficile )的表面抗原、金黃葡萄球菌(Staphylococcus aureus )的壁脂酸(lipoteichoic acid)、炭疽桿菌(Bacillus anthracis )的炭疽毒素(anthrax toxin)或大腸桿菌(Escherichia coli )的第I型或第II型類志賀毒素(Shiga-like toxin type I or II)。
  14. 如請求項1所述的接合單元，更包含一第二元件，其透過任一種以下方式而連接於該中心核： 發生於該疊氮基或炔基與該第二元件間的CuAAC反應； 發生於該疊氮基或環辛炔基與該第二元件間的SPAAC反應；以及 發生於該環辛烯基或四嗪基與該第二元件間的iEDDA反應。
  15. 如請求項14所述的接合單元，其中：當該第一元件為該芬戈莫德、芬戈莫德磷酸鹽、干擾素-β或對整合素-α4或β-類澱粉蛋白專一的該scFv時，該第二元件為一對運鐵蛋白受器專一的scFv。
  16. 如請求項14所述的接合單元，其中：當該第一元件為對病毒蛋白或細菌蛋白專一的該scFv時，該第二元件為一對CD32或CD16b專一的scFv。
  17. 如請求項15或16所述的接合單元，其中： 該些第一元件分別透過以下方式而連接於該些連接臂：於其間形成一醯胺鍵、或透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應；以及 該第二元件是透過CuAAC反應而連接於該中心核N-或C-端胺基酸殘基的疊氮基或炔基。
  18. 如請求項16所述的接合單元，更包含一第三元件，透過iEDDA反應而連接於該耦合臂。
  19. 如請求項15或16所述的接合單元，其中： 該些第一元件分別透過以下方式而連接於該些連接臂：於其間形成一醯胺鍵、或透過硫氫-順丁烯二醯亞胺反應；以及 該第二元件是透過SPAAC反應而連接於該中心核N-或C-端胺基酸殘基的疊氮基或環辛炔基。
  20. 如請求項19所述的接合單元，更包含一第三元件，透過iEDDA反應而連接於該耦合臂。
  21. 一接合單元於製備用以治療一有需要個體的中樞神經系統(central nervous system，CNS)疾病的藥物的用途，其中該接合單元如請求項15所述。
  22. 如請求項21所述的用途，其中： 該CNS疾病為多發性硬化症，且該第一元件為該芬戈莫德、芬戈莫德磷酸鹽、干擾素-β或對整合素-α4專一的該scFv；或 該CNS疾病為阿滋海默症，且該第一元件為對β-類澱粉蛋白專一的該scFv。
  23. 一接合單元於製備用以治療一有需要個體的感染性疾病的藥物的用途，其中該接合單元如請求項16所述。
  24. 如請求項23所述的方法，其中該病毒蛋白是呼吸道融合病毒(RSV)的F蛋白、人類免疫缺陷病毒第I型(HIV-1)的gp120蛋白、A型流感病毒的血球凝集素A (HA)蛋白或巨細胞病毒的醣蛋白。
  25. 如請求項23所述的方法，其中該細菌蛋白是革蘭氏陰性菌的內毒素、困難梭狀芽孢桿菌的表面抗原、金黃葡萄球菌的壁脂酸、炭疽桿菌的炭疽毒素或大腸桿菌的第I型或第II型類志賀毒素。
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