CN117510828A - 一种含氨基酸残基的三臂聚乙二醇衍生物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种如式(1)所示的含氨基酸的三臂聚乙二醇衍生物，其中，ni为聚乙二醇链的聚合度，选自30‑1000的整数；R2每次出现时各自独立地为C1‑6烷基；L1A、L1B、L2各自独立地为二价连接基；Lys为赖氨酸残基；AA1、AA2各自独立地为氨基酸或氨基酸衍生物残基；p选自1‑5的整数，‑(AA1)p‑表示p个AA1结合形成的二价残基；q为0或1，表示AA2不存在或者存在一个AA2；L3为连接键或二价连接基；R01为H或能与生物相关物质反应的功能性基团或其被保护形式；m为1或2。本发明的三臂聚乙二醇衍生物能够赋予其在细胞内降解的特性，在分子量较高的情况下也能够抑制细胞空泡的形成。本发明的三臂聚乙二醇衍生物还可修饰药物或生物相关物质，实现高生物相容性、低毒性和药物活性高度保持等优势。

Description

一种含氨基酸残基的三臂聚乙二醇衍生物
技术领域
本发明涉及聚乙二醇衍生物，特别涉及一种在体循环中稳定且在细胞中可降解，用于修饰药物或生物相关物质的含氨基酸残基三臂聚乙二醇衍生物。
背景技术
聚乙二醇(PEG)被广泛用于药物或药物载体的表面修饰。在生理条件下，PEG形成的水化膜能有效保护被修饰物，避免被修饰物被快速降解或清除，有效降低被修饰物的免疫原性，降低系统毒性。此外，PEG修饰还能克服一些药物水溶性较差的问题。聚乙二醇修饰药物或生物相关物质，往往是利用官能化的聚乙二醇衍生物所含有的活性基团与药物分子(包括蛋白药物和有机小分子药物)、肽类、糖类、脂类、寡核苷酸、亲和配体、辅因子、脂质体以及生物材料等通过共价键进行偶联而得到的。
1990年Enzon开发的第一个蛋白质聚乙二醇化药物Adagen被FDA批准上市，至今已经有多种聚乙二醇化药物被批上市销售或处于临床阶段。总体而言，聚乙二醇化药物的安全性已经得到临床的检验。然而，较高分子量的PEG可能引起细胞空泡的形成，且大多数与PEG相关的空泡现象都出现在PEG分子量≥30kDa的情形(Toxicol.Pathol.2015,43,959-983)。研究数据推测PEG相关的空泡形成具有可逆性，然而大多数非临床毒理学研究中的恢复期通常太短，该可逆性难以被完全地证明。在无治疗期间，较大的空泡或多个空泡可能需要更长时间才能消失。PEG或PEG化药物造成吞噬细胞产生空泡被认为是正常的生理反应，而吞噬细胞摄取的PEG最终可能通过肝脏、肾脏或脾脏等器官从体内清除，也可能存在于其整个生命周期中，其中Kupffer细胞的寿命长达5周至14个月，意味着高分子量PEG引起的细胞空泡可能在人体中长期存在，而其长期影响并不十分清楚。尽管降低PEG分子量可有效避免细胞空泡的产生，但同时会造成PEG对所修饰药物的保护作用减弱。
近年来，多臂聚乙二醇如三臂聚乙二醇、四臂聚乙二醇、六臂聚乙二醇、八臂聚乙二醇等，因其在结构、载药量上的优势在市场上开始占据一席之地。采用传统的线性结构，不论是单官能化还是双官能化，在提升溶解性并降低毒副作用的同时，也往往由于药物分子被PEG链所包埋，而导致药物活性大大降低。相对于线性结构，多臂支化结构的聚乙二醇衍生物，可同时实现高溶解性、低毒副作用、低抗原性和药物活性高保持度。此外，多臂结构的体系粘度大大降低，还有利于获得更佳的药代动力学。带支链的聚乙二醇可以在药物的表层形成一层伞形保护层，进一步有效提高药物在体循环过程中的稳定性。然而，在多臂聚乙二醇具有较高分子量的情况下，细胞空泡的形成也会加剧。
为解决上述问题，需要开发一种在体循环中稳定的、在细胞中可降解的单官能化和双官能化的多臂聚乙二醇衍生物。
发明内容
本发明提供新型的三臂单官能化和双官能化聚乙二醇衍生物，用于药物或生物相关物质的修饰。本发明的三臂聚乙二醇衍生物同时具备体循环稳定性和细胞内降解性，能为被修饰物提供优良的保护作用、较长的体循环时间、低毒性、良好的水溶性、细胞内降解性和药物活性高度保持等优势。
本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现：
本发明的一种实施方案：
一种三臂聚乙二醇衍生物，其结构如通式(1)所示：
其中，
ni为聚乙二醇链的聚合度，i选自1、2、3中任一种，n1、n2、n3各自独立地选自30-1000的整数；R2每次出现时各自独立地为C1-6烷基；
L1A、L1B、L2各自独立地为二价连接基；
Lys为赖氨酸残基；
AA1、AA2各自独立地为氨基酸或氨基酸衍生物残基；p选自1-5的整数，-(AA1)p-表示p个AA1结合形成的二价残基；q为0或1，表示AA2不存在或者存在一个AA2；
L3为连接键或二价连接基；
R01为H或能与生物相关物质反应的功能性基团或其被保护形式；m为1或2；当m为2时，两个L3结构相同或不同，两个R01结构相同或不同；
所述聚乙二醇衍生物为单分散性或多分散性；
或其盐、互变异构体、立体异构体或溶剂化物。
本发明还提供了另外一种实施方案：
一种三臂聚乙二醇衍生物修饰的生物相关物质，其特征在于，结构如通式(5)所示，
P-L-D
(5)
其中，P为前述的任一种三臂聚乙二醇衍生物，D为生物相关物质残基，L为三臂聚乙二醇衍生物的反应性基团与生物相关物质反应后形成的二价连接基；
所述生物相关物质选自以下任一种：药物、蛋白质、多肽、寡肽、蛋白模拟物、片段、酶、抗原、抗体及其片段、受体、基因相关物质适配体、多糖、蛋白多糖、糖蛋白、脂类化合物、激素、维生素、囊泡、脂质体、染料、荧光物质、靶向因子、细胞因子、神经递质、细胞外基质物质、植物或动物提取物、病毒、疫苗、细胞、胶束；更优选以下任一种：小分子药物、核酸、类固醇、磷脂、糖脂；更优选以下任一种：小分子药物、核苷、核苷酸、寡核苷酸、反义寡核苷酸、多核苷酸、甾类化合物；进一步地，所述小分子药物优选自黄酮类、类萜、类胡萝卜素、皂草苷、类固醇、甾体、醌、蒽醌、氟醌、香豆素、生物碱、卟啉、多元酚、大环内酯物、单内酰环类、苯丙素酚类、蒽环类、氨基配醣中任一种。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供新型的三臂聚乙二醇衍生物，具有单官能化或双官能化的非对称三臂PEG结构，且同时具有碳支化和氮支化结构，为药物或生物相关物质的修饰提供更灵活的选择。本发明的三臂PEG不仅能够提高药物或生物相关物质的生物相容性和体内稳定性，与现有技术中不含氨基酸残基的氮支化V型PEG和碳支化多臂PEG相比，本发明的三臂PEG结构中含有由氨基酸残基构成的寡肽残基，能够赋予其在细胞内降解的特性，在分子量较高的情况下(30kDa及以上)也能够抑制细胞空泡的形成。本发明的三臂聚乙二醇衍生物还可修饰药物或生物相关物质，实现优良的保护作用、较长的体循环时间、高生物相容性、低毒性和药物活性高度保持等优势。
1.发明内容详述
本发明对于具体的实施方式作出了详细描述，然而，应理解的是，其仅以说明性方式而非限制性方式给出，在本发明的范围内的各种变化和修改对于所属领域的技术人员将是显而易见的。
本发明的引用文献中的描述与本发明的描述不同的，以本发明为准；这个原则针对说明书全文的所有引用文献。
1.1术语说明
在本发明中，除非另有描述，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文引用的所有专利和其他出版物的公开内容通过引用的方式整体并入本文。在本文术语的任何描述阐释与通过引用并入本文的任何文件相冲突的情况下，以下述术语的描述与阐释为准。除非另外指明，否则各术语具有以下含义。
本发明中，除非特别说明，任两个对象的“选自”/“优选”各自独立，当具有多级的选自/优选情况时，任两个对象的选自/优选可以为同级或不同级。例如，“LA、LB各自独立地选自A、B、C”，可以是LA、LB均为A，也可以是LA为A而LB为B1(B1为B的一种下级情形)。又例如，“LA优选为A(1级优选)，更优选为A1～A3(2级优选)，最优选为A11～A13(3级优选)，LB优选为B(1级优选)，更优选为B1～B3(2级优选)，最优选为B11～B13(3级优选)”，优选可以是A为A1～A3(2级优选)而B为B11～B13(3级优选)，也可以是A、B均为3级优选。
本发明中，“各自独立地为/选自/优选”不仅可以指不同类目可以各自独立地为/选自/优选定义里的任一选项，还可以在加上“每次出现时”表示同一类目在不同位置或不同时间出现时每次独立地为/选自/优选定义里的任一选项，例如，“二价连接基为-NRcC(＝O)-、-C(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)NRc-、-OC(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)O-、-SC(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)S-、-C(Rc)＝N-NRc-或-NRc-N＝C(Rc)-；其中，Rc每次出现时各自独立地为氢原子或C1-12烷基”这样的说明指出，在“-NRc-N＝C(Rc)-”中，两个Rc基团可以相同或不同(例如，一个Rc为甲基，另一个Rc为氢原子或乙基)，且“-NRcC(＝O)NRc-”的任一个Rc可以和“-NRcC(＝O)O-”中的Rc相同或不同。
本发明中，当列举了至少两项时，所列举的项的“组合”指前述列举的项中任两种或任两种以上的组合；且对项的数量不做限定，任一项的数量可以为零个、一个或大于一个，同种项的数量大于1时，可以是满足该项的相同或不同的具体形式。例如，“L为连接键或选自亚烃基、含杂原子的二价烃基、-O-、-S-、-S-S-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-NH-中任一种或任一种以上的组合”，L可以为所列举项中的任一种，也可以为任两种或任两种以上的组合，所述组合可以为-CH2-O-CH2-(即所列项中-O-和亚烃基的组合，其中亚烃基的具体形式均为2个亚甲基)，也可以为-CH2-NH-CH2CH2-(即所列项中-NH-和亚烃基的组合，其中亚烃基的具体形式为1个亚甲基和1个亚乙基)。
本发明中，除非特别说明，否则术语“包括”、“包含”和“含有”以及类似的表述应在本说明书和权利要求书中以开放性和包含性的含义解释为“包括但不限于”或“非限制性地包括”。
本发明中，“包括但不限于”某范围，指所述范围内的项可选，但不限定为所述范围的项，且并非所述范围内的所有结构都适用，尤其是本发明明确排除的项不在候选之列，以本发明顺利实施为筛选标准。
本发明中，数值区间的释义，既包括短横线标记的数值区间(如1-6)，也包括波浪线标记的数值区间(如1～6)，还包括“至/到”标记的数值区间(如，1至6、1到6)。在没有特别说明的情况下，以区间形式标记的区间均可表示该区间范围内所有整数与非整数构成的组，且该范围包括两个端点。例如，EO单元平均数选自22～100，其选择范围并不限于该区间内的整数，还可以是任意的非整数。又如，“1-3中的整数”表示1、2、3构成的组。又如，-(CH2)1-4-表示-CH2-、-(CH2)2-、-(CH2)3-、-(CH2)4-构成的组。又如，表示构成的组。
本发明中的数值范围，包括但不限于整数、非整数、百分数、分数表示的数值范围，如无特别说明，均包括两个端点。
本发明中，对于聚合物分子量而言，“约”、“左右”一般指±10％的数值范围，部分情况可放大到±15％，但不超过±20％。以预设数值为基数。例如，11kDa、12kDa与10kDa之间的偏差分别为10％、20％，“约10kDa”包括但不限于11kDa和12kDa。又如，指定通式中某个PEG组分的分子量约5kDa时，允许相应的分子量或数均分子量在5kDa±10％，也即4500～5500Da的范围内变化。
本发明中，对于百分数而言，当给出的数值(不含百分号)精确到N(包括1、0.1、0.01、0.001、0.0001等)时，“约”、“左右”一般指±0.5*N的数值范围。例如，约1％指的是1±0.5％即0.5％-1.5％的范围，约2.2％指的是2.2±0.05％即2.15％-2.25％的范围。
本发明中，聚乙二醇链的聚合度用ni表示(i选自1、2、3、…的自然数)，同一结构中取值相同的ni可互换表示，例如，n2≈n3时，可将n2用n3表示，也可将n3用n2表示。
本发明中的二价连接基，没有特别限定的情况下，其连接其它基团时可选两个连接端中的任一个，例如在GroupA和GroupB之间以酰胺键作为二价连接基时，可以为GroupA-C(＝O)NH-GroupB或GroupA-NHC(＝O)-GroupB。
本发明的结构式中，涉及相连接基团的原子归属问题时，采用来标记连接键，如以/>表示基团结构，具体地，/>表示为-CCH3(CH2CH2CH3)2；表示为-C(CH2CH2CH3)2-。而非基团形式的/>则表示为(CH3)2C(CH2CH2CH3)2。
本发明中，对于从环状结构引出的连接键或基团，当未标记于特定的成环原子，而是指向环内部时，表示该连接键可以从合适的任意成环原子引出，且当被标记的环为并环或稠环结构的一部分时，该连接键可以从所述并环或稠环结构中合适的任意成环原子引出。如中，被/>标记的连接键和基团Q都可以从除氮原子以外的八个成环碳原子中任意一个合适位置引出。
本发明中，基团中的碳原子数范围以下标形式标注在C的下标位置，表示该基团具有的碳原子数，除非特别说明，所述碳原子数不含取代基的贡献。例如，C1-12表示“具有1至12个碳原子”。又如，C1-10亚烷基表示碳原子数在下标所示范围中的任一种亚烷基，即C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10亚烷基中的任一种，包括但不限于直链的C1-10亚烷基(例如-(CH2)6-)和支化的C1-10亚烷基(例如-(CH2)3-CH(CH3)-(CH2)3-)。又如，“取代的C1-12烷基”指C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11或C12烷基的至少一个氢原子被取代基替换得到的烷基，所述取代基中的碳原子数和杂原子数无特别限制。
本发明中，当涉及到的结构具有同分异构体时，没有特别指定的情况下，可以为其中任一种异构体。例如对于存在顺反异构体的结构，既可以为顺式结构也可以为反式结构；存在E/Z异构体的结构，既可以为E结构也可以为Z结构；有旋光性时可以为左旋或右旋。
本发明中，若本文所描述的结构与该结构的名称之间存在差异，则所描述的结构应具有更大的权重。
本发明中，聚乙二醇及其衍生物的分子量默认指平均分子量，且没有特别规定时，“平均分子量”一般指“数均分子量”Mn。对于数均分子量，既可以为多分散性嵌段或物质的分子量，也可以为单分散性嵌段或物质的分子量。没有特别写明时，分子量的计量单位为道尔顿(Da)。还可以用“聚合度”表征聚乙二醇链的分子量大小，具体指其中重复单元(氧化乙烯基单元)的数量。相应地，优选用“平均聚合度”、“数均聚合度”来表征重复单元数量的平均值、数均值。
本发明中，“任意合适的连接基”、“任意合适的反应性基团”等中的“任意合适的”是指符合化学结构的基本原则，且能够使本发明的制备方法顺利实施的结构。用此方式描述的化学结构可视为具有清楚的、确定的范围。
本发明中基团的“可稳定存在”和“可降解”是一对相对的概念。
本发明中，“可降解”指发明化学键的断裂，且断裂为彼此独立的至少两个残基。如果经化学变化后改变了结构，但整个连接基仍仅为一个完整的连接基，那么该连接基仍归到“可稳定存在”的范畴。所述可降解的条件没有特别限制，既可为体内生理条件，也可为体外模拟生理环境或其它条件，优选在体内生理条件及体外模拟生理条件。所述生理条件没有特别限制，包括但不限于血清、心、肝、脾、肺、肾、骨骼、肌、脂肪、脑、淋巴结、小肠、生殖腺等部位，可以指细胞内，也可指细胞外基质中，可以指正常生理组织，也可以指病变生理组织(如肿瘤、炎症等)。所述体外模拟环境没有特别限制，包括但不限于生理盐水、缓冲液、培养基等。所述可降解的速度没有特别限制，例如既可以为酶作用下的快速降解，也可以指生理条件下的缓慢水解等。所述的体内生理条件包括治疗时的生理条件，如紫外照射、热疗等情况。包括但不限于在光、热、低温、酶、氧化还原、酸性、碱性、生理条件、体外模拟环境等条件下可降解，优选在光、热、酶、氧化还原、酸性、碱性等条件下可降解。所述可降解指在上述任一条件下的刺激下发生降解。所述光条件包括但不限于可见光、紫外光、红外光、近红外光、中红外光等光照条件。所述热条件指高于正常生理温度，通常指高于37℃的温度条件，且通常低于45℃，优选低于42℃。所述低温条件指低于人体生理温度，优选低于25℃，更优选≤10℃，具体举例如冷藏温度、冷冻温度、液氮治疗温度、2～10℃、4～8℃、4℃、0℃、-20±5℃等。所述酶条件没有特别限制，生理条件下可生成的酶均包含在内，作为举例，如肽酶、蛋白酶、裂解酶等。所述氧化还原条件没有特别限制，如巯基与二硫键之间的氧化还原转变、氢化还原转变。所述酸性、碱性条件主要指正常组织、病变组织、处于治疗期的器官或组织等体内部位的pH条件，比如胃为酸性条件，肿瘤部位也往往偏酸性。这里的可降解指可通过体内代谢作用发生降解(如生理作用、如酶、如氧化还原等)、在体内特定部位因微环境刺激而发生降解(如酸性、碱性)、或在临床治疗刺激下发生降解(如光、如热、如低温)等。需要说明的是，有机化学中相对于生物体而言的一些极端条件，如强酸、强碱、高温(如100℃以上)等条件下的键断裂，并不包括在本发明的可降解条件的范畴。又如，虽然醚键可在如氢溴酸的强酸条件下发生断裂，但本发明中始终将其归为可稳定存在的连接基。
本发明中，“可稳定存在”指连接基能保持作为一个完整的连接基存在(一个连接基与其相邻的基团稳定地共价相连接)，则定义为“可稳定存在”，其中，允许发生能保持连接基完整性的化学变化。所述化学变化没有特别限制，包括但不限于异构化转变、氧化、还原、离子化、质子化、去质子化、取代反应等。可稳定存在的条件没有特别限制，包括但不限于光、热、低温、酶、氧化还原、中性、酸性、碱性、生理条件、体外模拟环境等条件下可稳定存在，优选在光、热、酶、氧化还原、酸性、碱性等条件下可稳定存在。这里的稳定存在指不进行特殊刺激(如特殊部位的pH条件、治疗时的光、热、低温等)的条件下，在体内代谢循环中可保持稳定的连接，不因发生链的断裂而导致分子量降低(只要仍能保持整体性)。
本发明中，对同一个连接基而言，“可稳定存在”并非绝对的概念，比如酰胺键在酸性或碱性条件下相比于酯键要稳定地多，本发明中的“可稳定存在”的连接基包含了酰胺键。但是，比如肽键，由一分子氨基酸的α-羧基和一分子氨基酸的α-氨基脱水缩合形成的一种酰胺键，当遇到特定酶作用时，则可以断裂，因此也包括在“可降解”的连接基中。同样地，氨基甲酸酯基、硫代氨基甲酸酯基等既可以为可稳定存在的连接基，也可以为可降解的连接基。更普遍地，氨基甲酸酯基、硫代氨基甲酸酯基等更倾向会发生缓慢降解，而非肽键的酰胺键则在体内循环过程中可稳定存在。又如常见的酯键可在酸、碱条件下降解，而包含在特殊结构中的酯键还可在紫外光条件下发生降解。又比如，即使某些化学键在特定酶作用下能发生降解，但如果其在临床使用时，如果循环路径不经过或者基本不经过该特定酶环境(比如定点给药的情况下)，相应的化学键仍可以视为是可稳定存在的。
本发明中，通式(1)化合物应被理解为包括通式(1)化合物的盐。所用术语“盐”选自与无机和/或有机酸形成的酸加成盐和与无机和/或有机碱形成的碱加成盐中的任一种、任二种或者任二种以上的组合。当通式(1)化合物含有碱性部分(例如但不限于吡啶或咪唑)和酸性部分(例如但不限于羧酸)，可以形成两性离子(“内盐”)并包括在所用术语“盐”中。“盐”可以是药学上可接受的(即，无毒、生理学上可接受的)盐，也可以是其他盐。通式(1)化合物的盐可通过通式(1)化合物与一定量(诸如当量)的酸或碱在诸如盐沉淀的介质中或在水性介质中反应然后冻干而形成。示例性的酸加成盐包括醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、磺酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐等；示例性碱加成盐包括铵盐、碱金属盐(诸如钠盐、锂盐和钾盐)、碱土金属盐(诸如钙盐和镁盐)、具有有机碱(例如有机胺)的盐以及具有氨基酸(诸如精氨酸或赖氨酸)的盐。碱性含氮基团可用以下试剂进行季铵化，诸如低级烷基卤化物(例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物)、二烷基硫酸盐(例如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸盐)、长链卤化物(例如，癸基、月桂基、十四烷基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物)、芳基烷基卤化物(例如，苄基和苯乙基溴化物)及其他。所述酸加成盐和碱加成盐均优选为药学上可接受的盐，并且出于本公开的目的，均被认为等同于对应的通式(1)化合物的游离形式。
本发明中的杂原子没有特别限定，包括但不限于O、S、N、P、Si、F、Cl、Br、I、B等。
本发明中，相对于化合物，失去部分原子或基团后形成的基团也称为残基。
本发明中，价态大于等于2的基团统称为“连接基”。连接基可以只含有一个原子，如醚基(-O-)、硫醚基(-S-)。特别地，当某个基团的定义包含“连接键”时，表示该基团可以不存在且仅起连接作用。
本发明中，关于基团的价态，“多价”指价态至少为3。
本发明中，除非特别说明，“连接键”指只起连接作用，不含有任何原子。
本发明中，二价连接基中的“基”可以替换为“键”，而不改变意义。例如，二价醚基也可称为醚键(-O-)，二价的酯基也可以称为酯键(-OC(＝O)-或-C(＝O)O-)，二价的氨基甲酸酯基也可称为氨基甲酸酯键(-OC(＝O)NH-或-NHC(＝O)O-)。
本发明中，当取代基所含原子数为1时，也可称为“取代原子”。
本发明中，所述化合物或基团为“取代的”时，意指所述化合物或所述基团含有一个或多个取代基。
本发明中，除非特别说明，“氨基”与“胺基”意义相同，包括一价、二价、三价、四价的中性基团或阳离子基团，取代的或未取代的。例如，CH3-NH2中的-NH2可以称为“氨基”、“胺基”或“伯胺基”。又如，CH3-NH-CH3中的-NH-可以称为“仲胺基”或“仲氨基”，其中的-NH-CH3也可以理解为甲基取代的胺基。
本发明中，“胺基”包括但不限于伯胺基、仲胺基、叔胺基和季铵离子。例如，-NRtRt和-N+RtRtRt，其中每个Rt各自独立地为氢原子或任意烃基结构。
本发明中，未指明价态时，“烃基”可以为一价烃基、二价烃基、三价烃基、…、n价烃基，其中n为所述烃基能具备的最高价态。
本发明中，“亚烃基”为二价烃基。
本发明中的仲胺键、联氨键指“-NH-”或“-NH-NH-”两端均被烃基封端，如-CH2-NH-CH2-和-CH2-NH-NH-CH2-；而如-C(＝O)-NH-则称为酰胺键，不视为含有仲胺键。
本发明中，“官能团”也即“功能性基团”，优选反应性基团、被保护的反应性基团、反应性基团的前体等等。“多元”指官能团的数量至少为3，如多元醇指至少含3个羟基的化合物，多元硫醇指至少含3个巯基的化合物，等。需要说明的是，允许还含有异质的其他类型的官能团，比如三(羟甲基)氨基甲烷为还含有一个氨基的三元醇，柠檬酸为还含有一个羟基的三元羧酸。
本发明的制备方法，除非特别说明，反应性基团还包含其被保护形式，所述被保护形式可在实际制备过程的任一合适步骤中进行脱保护得到相应的活性形式。
本发明中，成环原子为共同构成环骨架的原子。
本发明中的氨基酸的来源，在没有特别指明的情况下没有特别限制，既可以为天然来源，也可以是非天然来源，还可以为两者的混合。本发明中的氨基酸结构类型，在没有特别指明的情况下没有特别限制，既可以指L-型，也可以指D-型，还可以为两者的混合。
本发明中，参考文献CN104877127A、WO/2016/206540A、CN106967213A、CN108530637A、CN108530617A及各引用文献中有关氨基酸骨架、氨基酸衍生物骨架、环状单糖骨架的定义与举例亦作为参考纳入本发明中。除非特别说明，所述骨架也即残基。其中，氨基酸残基，包括从氨基上除去氢原子和/或从羧基上除去羟基和/或从巯基上除去氢原子和/或氨基被保护和/或羧基被保护和/或巯基被保护的氨基酸。不严密地说，氨基酸残基可以被称为氨基酸。具体举例，例如失去羧羟基(包括所有的C端羧羟基，还包括如天冬氨酸、谷氨酸中侧基上的羧羟基)、羟基上的氢原子、酚羟基上的氢原子(酪氨酸)、巯基上的氢原子(如半胱氨酸)、氮原子上的氢原子后(包括所有的N端氢原子，还包括侧基中氨基中的氢原子如赖氨酸、鸟氨酸上的ε-氨基上的氢原子、组氨酸及色氨酸的侧基环上的氨基中的氢原子等)、酰胺上的氨基(如天冬氨酰胺、谷氨酰胺等)、胍基侧基中的氨基或氨基中的氢原子形成的残基。氨基酸衍生物残基指除具有氨基酸基本特征外，还具有非氨基酸基本特征的原子或基团部分。
本发明中，“生物相关物质”包括但不限于文献CN104877127A、WO/2016/206540A、CN106967213A、CN108530637A、CN108530617A及各引用文献中所描述、列举及引用的物质。概括地，生物相关物质包括但不仅限于以下物质：药物、蛋白质、多肽、寡肽、蛋白模拟物、片段及类似物、酶、抗原、抗体及其片段、受体、小分子药物、核苷、核苷酸、寡核苷酸、反义寡核苷酸、多核苷酸、核酸、适配体、多糖、蛋白多糖、糖蛋白、类固醇、甾类化合物、脂类化合物、激素、维生素、磷脂、糖脂、染料、荧光物质、靶向因子、靶向分子、细胞因子、神经递质、细胞外基质物质、植物或动物提取物、病毒、疫苗、细胞、囊泡、脂质体、胶束等。所述生物相关物质可以为生物相关物质自身，也可以其前体、激活态、衍生物、异构体、突变体、类似物、模拟物、多晶型物、药物学上可接受的盐、融合蛋白、化学改性物质、基因重组物质等，还可以为相应的激动剂、激活剂、活化剂、抑制剂、拮抗剂、调节剂、受体、配体或配基、抗体及其片段、作用酶(如激酶、水解酶、裂解酶、氧还原酶、异构酶、转移酶、脱氨酶、脱亚胺酶、转化酶、合成酶等)、酶的底物(如凝血级联蛋白酶底物等)等。所述衍生物包括但不限于甙类、核苷类、氨基酸类、多肽类衍生物。形成新的反应性基团的化学修饰产物，即对反应性基团进行改性而改变类型、额外引入功能性基团、反应性基团、氨基酸或氨基酸衍生物、多肽等结构后生成的改性产物，均属于生物相关物质的化学改性物质。生物相关物质在与官能化聚乙二醇结合之前或之后，还允许有与其结合的目标分子、附属物或递送载体，形成改性的生物相关物质或复合的生物相关物质。其中，所述药物学上可接受的盐，既可以为无机盐，如盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐，也可以为有机盐，如草酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐等。其中，本发明中的“药物”包括在体内或体外提供生理或药理作用的任何药剂、化合物、组合物或混合物，且往往提供的是有益效果。其种类没有特别限制，包括但不限于药物、疫苗、抗体、维生素、食品、食品添加剂、营养剂、营养保健品及其它提供有益效果的药剂。所述“药物”在体内产生生理或药理作用的范围没有特别限制，可以为全身效果，也可以只在局部产生效果。所述“药物”的活性没有特别限制，主要为能够与其它物质发生相互作用的活性物质，也可以为不发生相互作用的惰性物质；但惰性的药物可通过体内作用或一定刺激转变为活性形式。其中，“小分子药物”为分子量不超过1000Da的生物相关物质，或任一生物相关物质的小分子拟态物或活性片段。
本发明中，“寡肽”指两个或两个以上氨基酸形成的肽类分子，优选构成寡肽的氨基酸残基数目为2至20个。“寡肽残基”可以为一价、二价、三价或更高价态。
本发明中，除非特别说明，“单糖基”即单糖残基，也即单糖骨架，包括开链式单糖基、也包括环状单糖基(如呋喃糖环、吡喃糖环)。
本发明中的单糖基，可以选自包括但不限于单糖、糖醇、脱氧糖、氨基糖、氨基糖衍生物(如酰胺衍生物)、糖酸、糖苷中任一种化合物的残基，可以为开链结构或环状结构。如氨基糖脱除一个氨基氢原子后形成的氨基残基，又如糖酸脱除羧羟基后形成的酰基等。所述单糖可以包括但不限于醛糖(多羟基醛)、酮糖(多羟基酮)。如烷基醚衍生物，甲基醚衍生物，举例如白雀木醇。本发明中单糖基的碳原子数无特别限制，包括但不限于丁糖、戊糖、己糖、庚糖。优选戊糖、己糖。其中，丁糖、戊糖、己糖、庚糖、糖醇、脱氧糖、氨基糖、氨基糖的酰胺衍生物、糖酸、糖苷等的举例包括但不限于CN106967213A中公开的结构。
本发明的聚乙二醇衍生物可以用于将生物活性成分传递至患者中的以下一或多种：肝脏或肝脏细胞(例如肝细胞)、肾脏或肾脏细胞、肿瘤或肿瘤细胞、CNS或CNS细胞(中枢神经系统，例如脑和/或脊髓)、PNS或PNS细胞(外周神经系统)、肺或肺细胞、血管或血管细胞、皮肤或皮肤细胞(例如真皮细胞和/或滤泡细胞)、眼或眼细胞(例如黄斑、中央凹、角膜、视网膜)、耳或耳细胞(例如内耳、中耳和/或外耳细胞)。
本发明中的“微修饰”，指经过简单的化学反应过程即可完成的化学修饰过程。所述简单的化学反应过程主要指保护、脱保护、盐络合、解络合、离子化、质子化、去质子化或改变离去基团等化学反应过程。
本发明中，“微变化形式”与“微修饰”相对应，指经历保护、脱保护、盐络合、解络合、离子化、质子化、去质子化或改变离去基团等简单的化学反应过程后能形成目标反应性基团的结构形式。所述改变离去基团，即离去基团的转变，例如但不限于酯形式向酰氯形式的转变。
本发明中的一些具体实施方案中，反应过程中还涉及相关基团的“保护”和“脱保护”过程。为防止某反应性基团对反应产生影响，通常对该反应性基团进行保护。本发明中的一些具体实施方案中，反应性基团为2个以上时，选择性地仅使目标反应性基团进行反应，因此对其他反应性基团进行保护。保护基不仅在目标反应进行过程中保持稳定，根据需要，可以通过本领域常规技术手段去除。
本发明中，反应性基团的“保护”，意指通过特定试剂将所要保护的反应性基团可逆地转化为惰性基团(非反应性基团)的策略。被保护的基团中，区别于未保护形式的部分称为“保护基”。例如，-OTBS是羟基(-OH)的一种被保护形式，其中-TBS基团为羟基的保护基。
本发明中，“脱保护”和“去保护”意义相同，皆指将被保护的基团从被保护形式转变为未保护形式的过程。
本发明中，“羟基保护基”包含可作为通常的羟基的保护基而使用的所有的基团。羟基保护基，优选为烷酰基(例如乙酰基、叔丁酰基)、芳烷酰基(例如苄酰基)、苄基、三苯甲基、三甲基硅基、叔丁基二甲硅基、烯丙基、缩醛基或缩酮基。乙酰基的脱去一般在碱性条件下进行，最常用的是NH3/MeOH的氨解和甲醇阴离子催化的甲醇解；苄基在中性溶液中室温下钯催化氢解很容易除去苄基，也可用金属纳在乙醇或液氨中还原裂去；三苯甲基一般是通过催化氢解除去；三甲基硅基通常使用含氟离子的试剂(如四丁基氟化胺/无水THF等)除去；叔丁基二甲硅醚较为稳定，能够承受醇性氢氧化钾的酯水解条件以及温和的还原条件(如Zn/CH3OH等)，可用氟离子(如Bu4N+F-)在四氢呋喃溶液中脱去，也可用含水乙酸于室温下脱去。二醇的保护，优选形成二氧戊环、二氧六环、环状碳酸酯或环状硼酸酯。
本发明中，“巯基保护基”包含可作为通常的巯基的保护基而使用的所有的基团。与羟基类似，巯基可以硫醚和硫酯的形式来保护。巯基保护基，优选为叔丁基、苄基、取代的苄基、二苯甲基、取代的二苯甲基、三苯甲基、乙酰基、苯甲酰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基、硫代缩醛基或硫代缩酮基。硫醚的去保护可在酸催化下用Na/NH3还原或用重金属离子如Ag+、Hg+反应，再用硫化氢处理即可。有些基团包括S-二苯基甲基、S-三苯基甲基硫醚、S-2-四氢吡喃基、S-异丁氧甲基的半琉基缩醛，可用(SCN)2、碘或亚硫酰氯氧化成二硫醚，接着再还原成硫醇。硫酯的形成及去保护方法与羧酸酯相同。
本发明中，“羧基保护基”是指能通过水解、羧基保护基的去保护反应而转化为羧基的保护基。羧基保护基，优选为烷基(例如甲基、乙基、叔丁基)或芳烷基(例如苄基)，更优选为叔丁基(tBu)、甲基(Me)或乙基(Et)。本发明中，“被保护的羧基”是指羧基被适合的羧基保护基保护后所形成的基团，优选为甲氧羰基、乙氧羰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基。所述羧基保护基可以在酸或碱的催化下水解除去，偶尔也可用热解反应消去，例如叔丁基可以在温和的酸性条件下除去，苄基可以通过氢解脱去。脱除羧基保护基的试剂选自TFA、H2O、LiOH、NaOH、KOH、MeOH、EtOH及其组合，优选为TFA和H2O的组合、LiOH和MeOH的组合、或LiOH和EtOH的组合。被保护的羧基脱保护，从而产生相应的游离酸，所述脱保护在碱存在下进行，所述碱和由所述脱保护形成的所述游离酸形成药学可接受的盐。
本发明中，“氨基保护基”等同于“胺基保护基”，包含可作为通常的氨基/胺基的保护基而使用的所有的基，例如芳基C1-6烷基、C1-6烷氧基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基、芳基氧基羰基、C1-6烷基磺酰基、芳基磺酰基或甲硅烷基等。氨基保护基优选为Boc(叔丁氧羰基)、Moz(对甲氧基苄氧羰基)及Fmoc(9-芴亚甲氧羰基)。脱除氨基保护基的试剂选自TFA、H2O、LiOH、MeOH、EtOH及其组合，优选为TFA和H2O的组合、LiOH和MeOH的组合、或LiOH和EtOH的组合。脱除Boc保护的试剂为TFA或HCl/EA；优选TFA。脱除Fmoc保护所用的脱保护剂为含20％哌啶的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液。
本发明中，“炔基保护基”包含可作为通常的炔基的保护基而使用的所有的基，优选为三甲基硅基(TMS)、三乙基硅基、叔丁基二甲基硅基(TBS)或联苯基二甲基硅基。TMS保护的炔基在碱性条件下容易完成脱保护，如K2CO3/MeOH或KOH/MeOH。TBS保护的炔基在四正丁基氟化铵的四氢呋喃溶液中(TBAF/THF)可脱除保护基。
本发明中，被羟基保护基保护的羟基没有特别限制，例如可以为醇羟基、酚羟基等的羟基；被氨基保护基保护的氨基/胺基没有特别限制，例如可以来自伯胺、仲胺、联胺、酰胺等。本发明中胺基没有特别限制，包括但不限于伯胺基、仲胺基、叔胺基、季铵离子。
本发明中，被保护羟基的脱保护与羟基保护基的类型有关。所述羟基保护基的类型没有特别限制，以苄基、硅醚、缩醛、叔丁基对末端羟基进行保护为例，相应的脱保护方法包括但不限于：
A：苄基的脱保护
苄基脱保护可以利用氢化还原剂和氢供体的氢化作用来实现，在这个反应体系中的含水量应小于1％，反应才能顺利进行。
氢化还原催化剂没有限制，优选为钯和镍，但是并不限制载体，但优选氧化铝或碳，更优选碳。钯的用量为含被保护羟基化合物的1至100wt％，优选为含被保护羟基化合物的1至20％wt％。
反应溶剂没有特别的限制，只要原料和产物均可以溶剂即可，但优选甲醇、乙醇、乙酸乙酯、四氢呋喃，乙酸；更优选甲醇。并不特别限制氢供体，但优选氢气、环己烯、2-丙醇、甲酸铵等。反应温度优选为25至40℃。反应时间没有特别限制，反应时间与催化剂的用量成负相关，优选为1至5个小时。
B：缩醛、缩酮的脱保护
用于这类羟基保护的缩醛或缩酮化合物优选乙基乙烯基醚、四氢吡喃、丙酮、2,2-二甲氧基丙烷、苯甲醛等。而这类缩醛、缩酮的脱保护通过在酸性条件下实现，溶液pH优选0至4。酸没有特别限制，但优选乙酸、磷酸、硫酸、盐酸、硝酸，更优选盐酸。反应溶剂没有特别的限制，只要能够溶解反应物和产物即可，优选水。反应温度优选0至30℃。
C：硅醚的脱保护
用于这类羟基保护的化合物包括三甲基硅醚、三乙基硅醚、二甲基叔丁基硅醚、叔丁基二苯基硅醚等。而这类硅醚的脱保护通过含氟离子的化合物，优选四丁基氟化铵、四乙基氟化铵、氢氟酸、氟化钾，更优选四丁基氟化铵、氟化钾。含氟试剂的用量在被保护羟基的摩尔当量的5至20倍，优选8至15倍引发剂，如果含氟的用量小于5倍被保护羟基的摩尔当量，会导致脱保护不完全；当脱保护试剂的用量大于20倍被保护羟基的摩尔当量，过量的试剂或化合物给纯化带来麻烦，可能混入后续步骤，从而引起副反应。反应溶剂没有特别的限制，只要能够溶解反应物和产物即可，优选非质子性溶剂，更优选四氢呋喃、二氯甲烷。反应温度优选0至30℃，当温度低于0℃，反应速度较慢，不能完全脱除保护基。
D：叔丁基的脱保护
叔丁基的脱保护在酸性条件下进行，溶液pH优选0至4。酸没有特别限制，但优选乙酸、磷酸、硫酸、盐酸、硝酸，更优选盐酸。反应溶剂没有特别的限制，只要能够溶解反应物和产物即可，优选水。反应温度优选0至30℃。
本发明中，“羧基活化”是指用羧基活化剂对羧基进行活化处理，羧基活化后能够促进缩合反应更好的进行，如：抑制缩合反应中消旋杂质的产生、催化加快反应速度等。“羧基活化基”是羧基活化剂的残基。所述羧基活化剂为N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺(HONb)和N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)中一种或多种的组合，优选为NHS/EDCI、NHS/DCC、HONb/DCC的组合，最优选为NHS/EDCI的组合。
本发明中，反应用到的缩合剂并不限制，但优选N,N’-二环己基羰二亚胺(DCC)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)，苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，最优选为DCC。而一般缩合剂的用量为羧酸摩尔当量的1至20倍，优选为5-10倍，这个反应可以加入适当的催化剂(如4-二甲基氨基吡啶)。
本发明中，得到的产物可通过萃取、重结晶、吸附处理、沉淀、反沉淀、薄膜透析或超临界提取等纯化方法加以纯化。
本发明中，反应的溶剂可以是无溶剂或非质子性溶剂，非质子性溶剂包括甲苯、苯、二甲苯、乙腈、乙酸乙酯、乙醚、甲基叔丁基醚、四氢呋喃、氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺，优选四氢呋喃、二氯甲烷、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺。
本发明中，反应用到的碱可以为有机碱(如三乙胺、吡啶、4-二甲基氨基吡啶、咪唑或二异丙基乙基胺，优选三乙胺、吡啶)，也可以为无机碱(例如K2CO3)。
本发明中，聚乙二醇组分的重复单元为氧化乙烯基单元，即-CH2CH2O-或-OCH2CH2-，也记为EO单元，重复单元的数量也记为EO单元数，重复单元的平均数也记为EO单元平均数，且优选数均平均数。
本发明中，对于多分散性情况，化合物单个分子的分子量/聚合度、宏观物质中化合物组分的数均分子量/数均聚合度的“相等”或“相同”或“等于”(包括其他形式的等价表达)，在没有特别指定的情况下，并不限定在数值上严格相等，而是指数值相接近或近似相等，所述相接近或近似相等优选偏差不超过±10％，通常以预设数值为基数。
本发明中，对于单分散性情况，单个化合物分子及通式中氧化乙烯基单元数相同或相等是指在数值上严格相等；例如设定某个PEG组分的EO单元数为11，则等于12的设定值不落在设定范畴；但对于为了获得含设定EO单元数的化合物组分，而采用一定制备方法获得的宏观产物，由于制备方法、纯化方法的限制，可能导致该宏观产物中还含有除目标EO单元数组分之外的其他EO单元数组分，此时当EO单元平均数偏离预设的EO单元数不超过±5％(基数≥10)或者不超过±0.5(基数<10)时，视为获得了含目标组分的单分散性宏观产物；此外，当符合EO单元数或EO单元平均数范围的组分含量达到一定百分比时(优选≥90％，更优选>95％，更优选大于96％，更优选大于98％，更优选99％～100％)，也视为获得了含目标组分的单分散性宏观产物；即使未达到上述的含量比例，只要采用了本发明的制备方法或采用基本相同的制备思路的类似方法，因故获得的含量不足的产品、以主产品、联产品或副产品形式出现的组分，不论是否进行分离纯化，均在本发明的范围内。
本发明中，当用Da、kDa、重复单元数、EO单元数描述多分散组分的化合物通式的分子量时，对于单个化合物分子，分子量数值允许落在给定数值的一定范围内(包括端点，优选±10％范围内)；用氧化乙烯基单元数描述单分散组分的化合物通式的预设分子量时，则无范围波动，为离散点，但其制备产物可能因分子量不均一而使EO单元平均数在一定范围范围内波动(不超过±10％或±1，优选不超过±5％或±0.5)。例如mPEG(甲氧基聚乙二醇单元)的分子量为5kDa，指通式中单个分子的分子量数值在4500～5500Da之间，对应的制备产物相应组分的平均分子量为5kDa，也即平均分子量的数值在4500～5500Da之间时的产物为目标产物，且分子量落在该范围的组分才对目标组分的含量有贡献；又如设计mPEG具有22个氧化乙烯基单元，则通式中所有化合物分子的EO单元数均应当严格为22，但制备产物可能是20、21、22、23、24个EO单元的化合物的混合物，此时EO单元的平均数落在22±2.2范围内(优选在22±1.1范围内)时则视为获得目标组分，而分子量落在该数值范围内的组分均可视为目标组分用以计算纯度。
本发明中，除非特别说明，“mPEG”为甲氧基封端的聚乙二醇链段，其结构式为其中，ni为聚乙二醇链的聚合度，选自1～1000的整数。
本发明中，产物PDI<1.005即可视为单分散性，可记为PDI＝1。
本发明中，“单链组分”中的重复单元个数至少为2。
本发明的聚乙二醇化药物可以系统地作用和/或局部地作用。为此目的，它们可以适合的途径给药，例如通过注射(如静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌内注射，包括滴注)或经皮给药；或通过口服、含服、经鼻、透粘膜、局部、以眼用制剂的形式或通过吸入给药。对于这些给药途径，可以适合的剂型给药本发明的药物组合物。所述剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、锭剂、硬糖剂、散剂、喷雾剂、乳膏剂、软膏剂、栓剂、凝胶剂、糊剂、洗剂、软膏剂、水性混悬剂、可注射溶液剂、酏剂、糖浆剂。
本发明，治疗，是指为了抵御疾病、障碍或病症而对患者进行的处理和护理，意在包括延迟疾病、障碍或病症的进展，减轻或缓和症状和并发症，和/或治愈或消除疾病、障碍或病症。待治疗的患者优选哺乳动物，尤其是人。
1.2三臂聚乙二醇衍生物
本发明的一种实施方案：
一种三臂聚乙二醇衍生物，其结构如通式(1)所示：
其中，
ni为聚乙二醇链的聚合度，i选自1、2、3中任一种，n1、n2、n3各自独立地选自30-1000的整数；R2每次出现时各自独立地为C1-6烷基；
L1A、L1B、L2各自独立地为二价连接基；
Lys为赖氨酸残基；
AA1、AA2各自独立地为氨基酸或氨基酸衍生物残基；p选自1-5的整数，-(AA1)p-表示p个AA1结合形成的二价残基；q为0或1，表示AA2不存在或者存在一个AA2；
L3为连接键或二价连接基；
R01为H或能与生物相关物质反应的功能性基团或其被保护形式；m为1或2；当m为2时，两个L3结构相同或不同，两个R01结构相同或不同。
本发明中，通式(1)化合物能够以非溶剂化或溶剂化形式存在，包括水合形式。一般来讲，出于本公开的目的，具有药学上可接受的溶剂(诸如水、乙醇等)的溶剂化形式等同于非溶剂化形式。
本发明中，通式(1)化合物及其盐、溶剂化物可以它们的互变异构形式存在，包括酮-烯醇互变、酰胺-亚胺酸互变、内酰胺-内酰亚胺互变、烯胺-亚胺互变、质子转移互变和价互变。
本发明中，通式(1)化合物应理解为包含其盐、互变异构体、立体异构体或溶剂化物。
本发明的一种具体实施方案中，每条PEG链对应的数均分子量为1000、1500、2000、2500、3000、3350、3500、4000、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000或20000Da。
本发明的一种具体实施方案中，PEG链均为多分散性，且PEG链的聚合度选自约30至约1000，更优选约20至约500；更优选100至约500。
1.2.1.其他通式
本发明的一种具体实施方案：
一种三臂聚乙二醇衍生物，p为1，AA1为甘氨酸残基，结构如通式(2)所示：
其中，
L1A、L1B各自独立地选自C1-6亚烷基或-(CH2)1-6C(＝O)-，其中，连接基的左端与PEG链相连接；更优选各自独立地选自-CH2CH2-、-CH2-、-CH2C(＝O)-、-CH2CH2C(＝O)-中任一种；进一步优选L1A、L1B为以下情形中任一种：
情形(1)：L1A、L1B各自独立地为-CH2CH2-或-CH2-；
情形(2)：L1A、L1B中的一个为-CH2CH2-或-CH2-，另一个为-CH2C(＝O)-或-CH2CH2C(＝O)-；
其余参数定义与通式(1)相同。
本发明一种具体实施方案：
一种三臂聚乙二醇衍生物，对应通式(2)中的q为0，AA2不存在，且结构为通式(3)所示：
其中，L3优选为连接键、-O-、-O(CH2)tpOC(＝O)O-、-NH(CH2)tp-、-NH(CH2)tpC(＝O)NH(CH2)tp-、-NH(CH2)tpNHC(＝O)(CH2)tp-中任一种，且右端与R01相连接；tp为1-4的整数，优选为1或2；
R01优选为-OH、-CHO、-COOH、-NH2、
所述三臂聚乙二醇衍生物的结构更优选为以下任一种：
/>
/>
其余参数定义与通式(2)相同。
本发明的一种具体实施方案：
一种三臂聚乙二醇衍生物，对应通式(2)中的q为1，存在一个AA2，且结构为通式(4)所示：
其中，
R01优选为-OH或-CHO；
L3优选为连接键或-NH(CH2)tp-，且右端与R01相连接；tp为1-4的整数，优选为1或2；
AA2优选为三价的氨基酸残基或氨基酸衍生物残基，更优选为三价谷氨酸残基或者三价天冬氨酸残基；
所述三臂聚乙二醇衍生物的结构更优选为以下任一种：
其余参数定义与通式(2)相同。
1.2.2.二价连接基
本发明中，L1A、L1B、L2各自独立地为二价连接基；L3为连接键或二价连接基。
本发明的一种具体实施方案中，优选L2为-(CH2)tq-、-(CH2)tqC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)tqC(＝O)-、-(CH2)tqNHC(＝O)(CH2)tqC(＝O)-、-(CH2)tqC(＝O)NH(CH2)tqC(＝O)-中任一种，其中，tq每次出现时各自独立地为0-4的整数，连接基的右端与式(1)中的赖氨酸残基相连接；L2更优选为-C(＝O)-、-CH2C(＝O)-、-CH2CH2C(＝O)-、-CH2CH2CH2C(＝O)-、-C(＝O)CH2CH2C(＝O)-、-C(＝O)CH2CH2CH2C(＝O)-、-CH2CH2NHC(＝O)CH2CH2C(＝O)-、-CH2CH2CH2NHC(＝O)CH2CH2C(＝O)-、-CH2CH2NHC(＝O)CH2CH2CH2C(＝O)-、-CH2CH2CH2NHC(＝O)CH2CH2CH2C(＝O)-、-CH2C(＝O)NHCH2C(＝O)-、-CH2CH2C(＝O)NHCH2C(＝O)-、-CH2CH2CH2C(＝O)NHCH2C(＝O)-中任一种。
本发明的一种具体实施方案中，更优选L2为-(CH2)tq-或-(CH2)tqC(＝O)-，tq为0-4的整数；L2优选为-C(＝O)-、-CH2CH2C(＝O)-或-CH2CH2CH2C(＝O)-。
本发明的一种具体实施方案中，优选L3为连接键、亚烷基、-C(＝O)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-O-、-S-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRc-、-NRcC(＝O)-、-C(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)NRc-、-OC(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)O-、-SC(＝O)NRc-和-NRcC(＝O)S-中任一种、任两种或者任两种以上的组合；
Rc为H、C1-6烷基、碳环基、杂环基中任一种；优选Rc为H；
所述亚烷基优选为-(CRaRb)t-，其中，t每次出现时各自独立地为1-12的整数，Ra、Rb各自独立地为H、C1-6烷基、碳环基、杂环基中任一种，t个Ra和t个Rb选自相同结构、两种不同结构的组合或两种以上不同结构的组合；优选Ra、Rb每次出现时各自独立地为-CH3或-H，更优选Ra、Rb都为H；优选t为1-4的整数，更优选t为1或2。
本发明的一种具体实施方案中，优选L1A、L1B各自独立地选自C1-6亚烷基，优选为-CH2CH2-或-CH2-。
本发明的一种具体实施方案中，上述的二价连接基L1A、L1B、L3的稳定性没有特别限制，当中任一个二价连接基或任一个与相邻杂原子基团组成的二价连接基各自独立地为连接键、可稳定存在的连接基或可降解的连接基；所述可稳定存在的连接基在体内生理条件及体外模拟生理条件可稳定存在，优选为连接键、亚烷基、酰胺键、醚键、氨基甲酸酯键、仲氨基、羰基中任一种，或酰胺键、醚键、氨基甲酸酯键、仲氨基、羰基中任一种或一种以上与一个或多个亚烷基的组合。
1.2.3.氨基酸/寡肽
本发明中，AA1、AA2各自独立地为氨基酸或氨基酸衍生物残基。
本发明的一种具体实施方案中，p个AA1和q个AA2各自独立地选自甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、组氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、鸟氨酸和瓜氨酸中任一种的残基或衍生物残基；
当p＝1时，-AA1-优选为甘氨酸残基；
当p≥2时，-(AA1)p-为寡肽残基或寡肽衍生物残基；所述寡肽为二肽、三肽、四肽或五肽，优选为甘氨酸-苯丙氨酸、组氨酸-β-丙氨酸、甘氨酸-甘氨酸、赖氨酸-甘氨酸、赖氨酸-谷氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-赖氨酸-甘氨酸、甘氨酸-组氨酸-赖氨酸、甘氨酸-半胱氨酸-谷氨酸、甘氨酸-亮氨酸-甘氨酸、缬氨酸-瓜氨酸-甘氨酸、缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸、甘氨酸-组氨酸-脯氨酸、甘氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-赖氨酸-甘氨酸-赖氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、精氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-酪氨酸中任一种，更优选为甘氨酸-苯丙氨酸、组氨酸-β-丙氨酸、甘氨酸-甘氨酸、赖氨酸-甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-半胱氨酸-谷氨酸、甘氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸中任一种；
当q为1时，AA2优选为谷氨酸残基或者天冬氨酸残基。
1.2.4.R01
本发明中，R01为H或能与生物相关物质反应的功能性基团或其被保护形式。
本发明的一种具体实施方案中，优选R01为环氧基、醇羟基、硫醇基、羧基、氨基、醛基、活性酯基、活性碳酸酯基、氨基甲酸酯基、异氰酸酯基、异硫代氰酸酯基、琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基、烯基、炔基、烯酸酯基、叠氮基、氰基、二硫代吡啶基、α-卤代乙酰基炔基、叶酸基、罗丹明基、生物素基、单糖基和多糖基中任一种或任一种的被保护形式；优选为以下结构中任一种：
1.2.6.制备方法
本发明的一种具体实施方案中，三臂聚乙二醇衍生物通过含有偶合反应和/或聚合反应的制备过程获得；
所述偶合反应，供选择范围没有特别限制，只要两个相同或不同的反应性基团经该反应能够形成共价连接基即可；同一制备过程中可含有单步或分步的偶合反应，优选每一步偶合反应各自独立地为烷基化反应、缩合反应、酰胺化反应、酯化反应、硫酯化反应、开环反应、关环缩合反应、加成反应、环加成反应、α,β-不饱和键加成反应、炔基加成反应、席夫碱反应联合还原反应、click反应、叠氮-炔加成反应、1,3-偶极环加成反应、Diels-Alder加成反应、thiol-yne反应、thiol-ene反应、thiol-vinyl反应和缩合反应中任一种；所述偶合反应的反应条件与反应生成的共价连接基类型有关，可采用现有公开技术；经所述偶合反应生成的共价连接基的价态可以为二价或三价，优选为二价；经所述偶合反应可生成稳定的基团，也可生成可降解的基团；
所述聚合反应，至少经历以下两个步骤：小分子引发剂去质子化、环氧乙烷的聚合；所述小分子引发剂可以是直接获得的原料，也可以是制备过程中的中间体；
所述制备过程中，当偶合反应和聚合反应同时存在时，偶合反应、聚合反应的先后顺序没有限制。
本发明中，各制备方法中用到的原料可以购买获得或者自行合成获得。
本发明中，单分散性聚乙二醇衍生物的制备方法中，可以将含聚乙二醇组分的单分散性原料替换为相同组分的多分散性原料，获得相应的多分散性产物；同样地，多分散性聚乙二醇衍生物的制备方法中，可以将含聚乙二醇组分的多分散性原料替换为相同组分的单分散性原料，获得相应的单分散性产物。本发明中所提供的结构，其对应的单分散和多分散聚乙二醇衍生物均在本发明的范围内。
本发明中的一些具体方案中，聚乙二醇衍生物原料，包括但不限于线性聚乙二醇衍生物和非线性聚乙二醇衍生物，可以参考CN108530637B、CN110591079A、CN108659227A、CN108530617B或CN1243779C中的方法制备得到。
本发明中制备的中间体、终产物都可通过包括但不限于萃取、重结晶、吸附处理、沉淀、反沉淀、薄膜透析或超临界提取等的纯化方法加以纯化。对终产物的结构、分子量的表征确认，可采用包括但不限于核磁、电泳、紫外-可见分光光度计、FTIR、AFM、GPC、HPLC、MALDI-TOF、圆二色谱法等表征方法。
1.2.6.1.三臂聚乙二醇衍生物的制备
本发明中，制备方法所描述的反应路线并不代表实际的完整制备过程，本领域技术人员熟悉在实际操作中还可进行任何必要的微修饰(例如，保护或脱保护)、中间体制备、后处理或纯化等过程，以此获得本发明的聚乙二醇衍生物的制备方法仍在本发明的公开范围内。
本发明中，通式(1)所示的三臂聚乙二醇衍生物的制备方法可以采用以下流程中的一种或多种，且各流程的实施顺序在能够顺利实施的前提下没有特别限制；其中，RPEG为所述流程包含：
-(AA1)P-的引入：以二臂聚乙二醇衍生物2arm-PEG为原料，偶联一个氨基酸或寡肽小分子H2N-(AA1)k-COO-PG1，其中k选自1-5的整数，当k小于p时，需要继续偶联两个或两个以上的氨基酸或寡肽小分子，直至所有k之和等于p，得到中间体IM-1。
其中，PG1为羧基保护基，优选为tBu(叔丁基)。
具体例子如实施例1.1中S1-3的制备：
赖氨酸支化结构的引入：通过IM-1与含有Lys残基的小分子N-1的偶联，获得中间体IM-2。其中，T为不含聚乙二醇组分的线性或非线性结构，其末端含有反应性基团或其微变化形式(例如，-COOH或-COOtBu，醛基或缩醛基)，T每次出现时为相同或不同的结构。
具体例子如实施例1.2中S1-9的制备：
PEG单链组分的引入：分为两种情形，(1)采用了二臂PEG为原料的情况下，引入第三条PEG单链组分；(2)仅采用含单链组分的聚乙二醇衍生物作为PEG来源。
情形(1)：中间体IM-2与含一个单链组分的聚乙二醇衍生物RPEG-LF-FG进行偶联，获得中间体IM-3，其中LF为二价连接基，优选为连接键、-OCH2CH2-或-OCH2CH2CH2；FG为反应性基团，选自包括但不限于-COOH、-F、-Cl、-Br、-OMs、-OTs、-CHO、-COCl、-CONHS、活性酯基中任一种，优选为-COOH或其中，T的定义与前述相同。
具体例子如实施例1.1中E1-1的制备(脱除tBu保护之前)：
情形(2)：小分子N-2的一个氨基与含PEG单链组分的聚乙二醇衍生物RPEG-LF-W的反应性基团W进行单步或分步反应，获得两臂聚乙二醇中间体IM-4。其中，W优选为离去基团，更优选为-Cl、-Br、-OMs或-OTs。其中，RPEG、LF与情形(1)相同；PG2为氨基保护基。脱除PG2后，参考情形(1)继续引入第三条PEG单链组分。
具体例子如实施例9中E9-1的制备，其中S9-5对应IM-4：
末端官能化：通过末端微修饰和/或进一步偶联小分子获得结构，此过程与T的转变相对应。其中，末端微修饰选自以下化学反应过程中的任一种或一种以上：保护、脱保护、盐络合、解络合、离子化、质子化、去质子化、改变离去基团。一个完整的制备例中可以包含多次连续或不连续的T的转变。当q为1即存在AA2时，T的转变包含偶联一个含AA2残基的小分子，优选所述小分子为谷氨酸残基。具体例子如实施例1.1中，T经历由-COOtBu向-COOH的转变；又如实施例1.4中，T经历由-COOH向-C(＝O)O(CH2)2OH、的转变；又如实施例7中，T经历由-COOH向/>的转变。
以上参数未特别说明的，其定义与通式(1)相同。
基于R01的末端官能化：对满足通式(1)的聚乙二醇衍生物进行基于R01的末端功能化，所得末端功能化后的结构仍满足通式(1)。所述末端功能化的方法没有特别限制，与最终的功能性基团或其被保护形式的类型相关，主要包括末端羟基的功能化和基于反应性基团的向目标功能性基团或其被保护形式的转变。本发明中，末端羟基的功能化的具体制备方法包括但不限于如文献CN104530417A中段落[0960]段到[1205]段记载的。本发明中，基于反应性基团向目标功能性基团或其被保护形式的转变，可以通过以下任一种方式实现：
方式一：直接修饰，基于反应性基团的直接修饰，得到目标功能性基团或其被保护形式。作为举例，如羧基向酰卤、酰肼、酯、硫酯、二硫代酯的转变，如羟基、巯基、炔基、氨基、羧基等向相应的被保护结构的转变等等。又如酸酐对羟基、氨基等的修饰等。
方式二：两个反应性基团之间的偶联反应，以含有1种反应性基团及目标功能性基团或其被保护形式的异官能化试剂为原料，通过所述反应性基团与聚乙二醇衍生物末端反应性基团之间的反应，引入目标功能性基团或其被保护形式。两个反应性基团之间的反应方式、方法没有特别限制，其反应条件与反应生成的二价连接基类型有关，可采用现有公开技术。如烷基化、烯基加成反应、炔基加成反应、席夫碱反应联合还原反应、缩合反应等。其中，烷基化反应优选为基于巯基或氨基的烷基化的反应，依次对应于硫醚键、仲氨基或叔氨基的形成。其中缩合反应包括但不限于生成酯基、硫酯基、酰胺基、亚胺键、腙键、氨基甲酸酯基等的缩合反应。又如以含叠氮、炔基、烯基、三硫酯基、巯基、二烯基、呋喃基、1,2,4,5-四嗪基、氰酸根等基团与目标功能性基团或其被保护形式的异官能化试剂为原料，通过click反应引入目标功能性基团或其被保护形式。两个反应性基团之间的反应伴随新键的生成，新生成的二价连接基的典型代表为酰胺键、尿烷键、酯基、仲胺键、硫醚键、三氮唑基团等。
方式三：通过直接修饰与偶联反应的组合，获得目标功能性基团或其被保护形式。
1.2.7.结构举例
本发明的一种具体方案中，三臂聚乙二醇衍生物，其结构选自以下结构式中任一种：
/>
/>
1.2.8.三臂聚乙二醇衍生物修饰的生物相关物质
本发明的一种实施方案：
一种三臂聚乙二醇衍生物修饰的生物相关物质，其特征在于，结构如通式(5)所示，
P-L-D
(5)
其中，P为前文所述的任一种三臂聚乙二醇衍生物，D为生物相关物质残基，L为三臂聚乙二醇衍生物的反应性基团与生物相关物质反应后形成的二价连接基；
所述生物相关物质选自以下任一种：药物、蛋白质、多肽、寡肽、蛋白模拟物、片段、酶、抗原、抗体及其片段、受体、基因相关物质适配体、多糖、蛋白多糖、糖蛋白、脂类化合物、激素、维生素、囊泡、脂质体、染料、荧光物质、靶向因子、细胞因子、神经递质、细胞外基质物质、植物或动物提取物、病毒、疫苗、细胞、胶束；更优选以下任一种：小分子药物、核酸、类固醇、磷脂、糖脂；更优选以下任一种：小分子药物、核苷、核苷酸、寡核苷酸、反义寡核苷酸、多核苷酸、甾类化合物；进一步地，所述小分子药物优选自黄酮类、类萜、类胡萝卜素、皂草苷、类固醇、甾体、醌、蒽醌、氟醌、香豆素、生物碱、卟啉、多元酚、大环内酯物、单内酰环类、苯丙素酚类、蒽环类、氨基配醣中任一种。
本发明的一种具体方案中，优选生物相关物质为基因工程药物，选自抗体、抗体片段、白介素、溶菌酶、干扰素、生长素、EPO和GCSF中任一种，所述干扰素优选α-、β-或γ-干扰素。
2.具体实施方式
下面结合一些具体实施例对三臂聚乙二醇衍生物的制备、三臂聚乙二醇衍生物修饰药物的制备以及生物活性测试做进一步描述。具体实施例为进一步详细说明本发明，非限定本发明的保护范围。
实施例1：三臂单官能化聚乙二醇衍生物(E1-1、E1-2)
实施例1.1：三臂单官能化聚乙二醇羧酸衍生物E1-1的制备
对应通式(3-2)，E1-1中，L3为连接键，R01为-OH。设计的总分子量约为40.2kDa，n1≈226，n2≈226，n3≈450。
制备方法如下：
步骤a：将二臂聚乙二醇乙酸衍生物S1-1(30.15g,1.5mmol,Mn≈20.1kDa,n1≈n2≈226,PDI＝1.04)溶于150mL无水二氯甲烷中，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS,0.26g,2.3mmol)，再加入二环己基碳二亚胺(DCC,0.46g,2.3mmol)。将4-(二甲基氨基)吡啶(DMAP,0.04g,0.3mmol)加入含tBu保护羧基的甘氨酸(S1-2,1.97g,15.0mmol)的30mL二氯甲烷溶液中。将所述两份溶液混合后，室温下搅拌反应24小时。反应结束后，过滤除去不溶物，减压浓缩。用TFA/DCM混合溶液(1:1v/v)脱除tBu保护，再用纯化水洗涤，二氯甲烷萃取，萃取液用无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩，通过柱层析进行纯化得到S1-3(18.27g)。
步骤b：将S1-3(16.16g,0.8mmol,Mn≈20.2kDa,n1≈n2≈226,PDI＝1.04)溶于100mL无水二氯甲烷中，加入NHS(0.14g,1.2mmol)，再加入DCC(0.25g,1.2mmol)。将DMAP(0.02g,0.2mmol)加入含Fmoc保护氨基的赖氨酸(S1-4,3.40g,8.0mmol)的40mL二氯甲烷溶液中。将所述两份溶液混合后，室温下搅拌反应24小时。反应结束后，过滤除去不溶物，减压浓缩。用20％哌啶/DMF溶液脱除Fmoc保护基，旋蒸除去溶剂，通过柱层析进行纯化得到S1-5(8.43g)。
步骤c：将甲氧基聚乙二醇丙酸衍生物S1-6(7.96g,0.4mmol,Mn≈19.9kDa,n3≈450,PDI＝1.04)溶于50mL无水二氯甲烷中，加入NHS(0.07g,0.6mmol)，再加入DCC(0.12g,0.6mmol)。将DMAP(0.01g,0.1mmol)加入S1-5(8.12g,0.4mmol,Mn≈20.3kDa,n1≈n2≈226,PDI＝1.04)的50mL二氯甲烷溶液中。将所述两份溶液混合后，室温下搅拌反应24小时。反应结束后，过滤除去不溶物，减压浓缩。用TFA/DCM混合溶液(1:1v/v)脱除tBu保护，再用纯化水洗涤，二氯甲烷萃取，萃取液用无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩，通过柱层析进行纯化得到E1-1(5.44g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.27-4.21(m,1H,Lys-α-CH<),4.12(s,2H,-OCH2C(＝O)N<),3.74-3.43(m,PEG；2H,Gly-CH2-；4H,-O(CH2)2N<；2H,>NCH2C(＝O)NH-；2H,-OCH2CH2C(＝O)NH-),3.37(s,9H,-OCH3),3.23-3.16(m,2H,Lys-ε-CH2-),2.52-2.47(t,2H,-OCH2CH2C(＝O)NH-),1.87-1.34(m,6H,Lys-β-CH2-,Lys-γ-CH2-,Lys-σ-CH2-)。GPC测试分子量约为40.2kDa，PDI＝1.05。
实施例1.2：三臂单官能化聚乙二醇醛衍生物E1-2的制备
对应通式(3-2)，E1-2中，L3为-NH(CH2)2-，R01为-CHO。设计的总分子量约为40.3kDa，n1≈226，n2≈226，n3≈450。
步骤a：将含Fmoc和Cbz保护氨基的赖氨酸S1-7(5.03g,10.0mmol)溶于80mL无水二氯甲烷中，加入NHS(1.27g,11.0mmol)，再加入DCC(2.27g,11.0mmol)。将DMAP(0.24g,2.0mmol)加入3-氨基丙醛二乙缩醛S1-8(1.76g,12.0mmol)的30mL二氯甲烷溶液中。将所述两份溶液混合后，室温下搅拌反应24小时。反应结束后，过滤除去不溶物，减压浓缩。用20％哌啶/DMF溶液脱除Fmoc保护基，旋蒸除去溶剂，通过柱层析进行纯化得到M-1(3.73g)。
步骤b：将S1-3(16.16g,0.8mmol,Mn≈20.2kDa,n1≈n2≈226,PDI＝1.04)溶于100mL无水二氯甲烷中，加入NHS(0.14g,1.2mmol)，再加入DCC(0.25g,1.2mmol)。将DMAP(0.02g,0.2mmol)加入M-1(3.28g,8.0mmol)的50mL二氯甲烷溶液中。将所述两份溶液混合后，室温下搅拌反应24小时。反应结束后，过滤除去不溶物，减压浓缩。将粗产物溶于甲醇中，用Pd/C进行还原，反应完成后纯化得到含有裸露氨基的S1-9(8.70g)。
步骤c：将S1-6(7.96g,0.4mmol,Mn≈19.9kDa,n3≈450,PDI＝1.04)溶于50mL无水二氯甲烷中，加入NHS(0.07g,0.6mmol)，再加入DCC(0.12g,0.6mmol)。将DMAP(0.01g,0.1mmol)加入S1-9(8.16g,0.4mmol,Mn≈20.4kDa,n1≈n2≈226,PDI＝1.04)的50mL二氯甲烷溶液中。将所述两份溶液混合后，室温下搅拌反应24小时。反应结束后，过滤除去不溶物，浓缩，将粗产物溶于水中，用盐酸调节溶液pH至2.0，搅拌反应16小时。反应完毕后加入10％氯化钠，用碳酸氢钠调节溶液pH为6.4±0.2，用二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，无水异丙醇重结晶，得到E1-2(5.96g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.26-4.19(m,1H,Lys-α-CH<),4.12(s,2H,-OCH2C(＝O)N<),3.75-3.38(m,PEG；2H,Gly-CH2-；4H,-O(CH2)2N<；2H,>NCH2C(＝O)NH-；2H,-OCH2CH2C(＝O)NH-；2H,-CH2CH2CHO),3.36(s,9H,-OCH3),3.22-3.13(m,2H,Lys-ε-CH2-),2.74-2.64(m,2H,-CH2CH2CHO),2.52-2.47(t,2H,-OCH2CH2C(＝O)NH-),1.80-1.35(m,6H,Lys-β-CH2-,Lys-γ-CH2-,Lys-σ-CH2-)。GPC测试分子量约为40.3kDa，PDI＝1.06。
实施例1.3：三臂单官能化聚乙二醇琥珀酰亚胺活性酯衍生物E1-3的制备
对应通式(3-2)，E1-3中，L3为-O-，R01为琥珀酰亚胺基。设计的总分子量约为40.3kDa，n1≈226，n2≈226，n3≈450。
制备方法如下：
将E1-1(8.04g,0.2mmol,Mn≈40.2kDa,n1≈n2≈226，n3≈450,PDI＝1.05)溶于100mL二氯甲烷，加入NHS(0.12g,1.0mmol)和DCC(0.21g,1.0mmol)，室温下搅拌反应24小时。反应结束后，过滤除去不溶物，减压浓缩，通过柱层析进行纯化得到E1-3(7.70g)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:4.47-4.40(m,1H,Lys-α-CH<),4.12(s,2H,-OCH2C(＝O)N<),3.75-3.43(m,PEG；2H,Gly-CH2-；4H,-O(CH2)2N<；2H,>NCH2C(＝O)NH-；2H,-OCH2CH2C(＝O)NH-),3.37(s,9H,-OCH3),3.19-3.13(m,2H,Lys-ε-CH2-),2.77(s,4H,NHS-CH2-),2.52-2.47(t,2H,-OCH2CH2C(＝O)NH-),1.92-1.31(m,6H,Lys-β-CH2-,Lys-γ-CH2-,Lys-σ-CH2-)。GPC测试分子量约为40.3kDa，PDI＝1.05。
实施例1.4：三臂单官能化聚乙二醇对硝基苯活性酯衍生物E1-4的制备
对应通式(3-2)，E1-4中，L3为-O(CH2)2OC(＝O)O-，R01为对硝基苯基。设计的总分子量约为40.4kDa，n1≈226，n2≈226，n3≈450。
制备方法如下：
步骤a：在氩气气氛下，将E1-1(20.10g,0.5mmol,Mn≈40.2kDa,n1≈n2≈226，n3≈450,PDI＝1.05)、乙二醇(S1-10,0.31g,5.0mmol)和DMAP(0.01g,0.1mmol)依次溶于二氯甲烷(200mL)，冰浴下滴加DCC(0.12g,0.6mmol)的二氯甲烷溶液(3mL)。滴加完毕后，反应温度升至室温，搅拌反应24h。反应结束后，通过过滤将沉淀去除。浓缩，通过柱层析进行纯化得到S1-11(10.42g)。
步骤b：冰浴下，将对硝基苯基氯甲酸酯(S1-12,0.05g,0.2mmol)的二氯甲烷溶液1mL缓慢滴加到含有S1-11(8.06g,0.2mmol,Mn≈40.2kDa,n1≈n2≈226，n3≈450,PDI＝1.05)和三乙胺(TEA,0.04g,0.4mmol)的二氯甲烷溶液(80mL)中，搅拌一小时后升至室温，继续反应24小时。反应结束后，萃取，浓缩，通过柱层析进行纯化得到E1-4(6.71g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.28(d,4H,Ar),7.38(d,4H,Ar),4.48-4.40(m,4H,-C(＝O)O(CH2)2OC(＝O)O-),4.26-4.17(m,1H,Lys-α-CH<),4.13(s,2H,-OCH2C(＝O)N<),3.75-3.41(m,PEG；2H,Gly-CH2-；4H,-O(CH2)2N<；2H,>NCH2C(＝O)NH-；2H,-OCH2CH2C(＝O)NH-),3.37(s,9H,-OCH3),3.22-3.15(m,2H,Lys-ε-CH2-),2.52-2.48(t,2H,-OCH2CH2C(＝O)NH-),1.89-1.35(m,6H,Lys-β-CH2-,Lys-γ-CH2-,Lys-σ-CH2-)。GPC测试分子量约为40.4kDa，PDI＝1.05。
实施例2：三臂单官能化聚乙二醇衍生物(E2-1、E2-2)
实施例2.1：三臂单官能化聚乙二醇羧酸衍生物E2-1的制备
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对应通式(3-3)，E2-1中，L3为连接键，R01为-OH。设计的总分子量约为30.4kDa，n1≈n2≈n3≈226。
制备方法如下：
将甲氧基聚乙二醇丁酸衍生物S2-1(10.10g,1.0mmol,Mn≈10.1kDa,n3≈226,PDI＝1.03)溶于50mL无水二氯甲烷中，加入NHS(0.17g,1.5mmol)，再加入DCC(0.31g,1.5mmol)。将DMAP(0.02g,0.2mmol)加入S1-5(20.3g,1.0mmol,Mn≈20.3kDa,n1≈n2≈226,PDI＝1.04)的100mL二氯甲烷溶液中。将所述两份溶液混合后，室温下搅拌反应24小时。反应结束后，过滤除去不溶物，减压浓缩。用TFA/DCM混合溶液(1:1v/v)脱除tBu保护，再用纯化水洗涤，二氯甲烷萃取，萃取液用无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩，通过柱层析进行纯化得到E2-1(9.36g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.27-4.21(m,1H,Lys-α-CH<),4.12(s,2H,-OCH2C(＝O)N<),3.72-3.40(m,PEG；2H,Gly-CH2-；4H,-O(CH2)2N<；2H,>NCH2C(＝O)NH-；2H,-OCH2CH2CH2C(＝O)NH-),3.36(s,9H,-OCH3),3.23-3.14(m,2H,Lys-ε-CH2-),2.35-2.21(m,2H,-OCH2CH2CH2C(＝O)NH-),1.89-1.32(m,6H,Lys-β-CH2-,Lys-γ-CH2-,Lys-σ-CH2-；2H,-OCH2CH2CH2C(＝O)NH-)。GPC测试分子量约为30.4kDa，PDI＝1.06。
实施例2.2：三臂单官能化聚乙二醇醛衍生物E2-2的制备
对应通式(3-3)，E2-2中，L3为-NH(CH2)2-，R01为-CHO。设计的总分子量约为30.4kDa，n1≈n2≈n3≈226。
制备方法如下：
将S2-1(10.10g,1.0mmol,Mn≈10.1kDa,n3≈226,PDI＝1.03)溶于50mL无水二氯甲烷中，加入NHS(0.17g,1.5mmol)，再加入DCC(0.31g,1.5mmol)。将DMAP(0.02g,0.2mmol)加入S1-9(20.40g,1.0mmol,Mn≈20.4kDa,n1≈n2≈226,PDI＝1.04)的100mL二氯甲烷溶液中。将所述两份溶液混合后，室温下搅拌反应24小时。反应结束后，过滤除去不溶物，浓缩，将粗产物溶于水中，用盐酸调节溶液pH至2.0，搅拌反应16小时。反应完毕后加入10％氯化钠，用碳酸氢钠调节溶液pH为6.4±0.2，用二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，无水异丙醇重结晶，得到E2-2(9.70g)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ:4.26-4.19(m,1H,Lys-α-CH<),4.12(s,2H,-OCH2C(＝O)N<),3.74-3.39(m,PEG；2H,Gly-CH2-；4H,-O(CH2)2N<；2H,>NCH2C(＝O)NH-；2H,-OCH2CH2CH2C(＝O)NH-；2H,-C(＝O)NHCH2CH2CHO；9H,-OCH3),3.19-3.11(m,2H,Lys-ε-CH2-),2.73-2.66(m,2H,-C(＝O)NHCH2CH2CHO),2.34-2.22(m,2H,-OCH2CH2CH2C(＝O)NH-),1.82-1.34(m,6H,Lys-β-CH2-,Lys-γ-CH2-,Lys-σ-CH2-；2H,-OCH2CH2CH2C(＝O)NH-)。GPC测试分子量约为30.4kDa，PDI＝1.05。
实施例3：三臂单官能化聚乙二醇衍生物(E3-1、E3-2)
实施例3.1：三臂单官能化聚乙二醇羧酸衍生物E3-1的制备
对应通式(3-1)，E3-1中，L3为连接键，R01为-OH。设计的总分子量约为40.2kDa，n1≈n2≈226，n3≈450。
制备方法如下：
将甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺碳酸酯S3-1(20.00g,1.0mmol,Mn≈20.0kDa,n3≈450,PDI＝1.04)溶于100mL无水二氯甲烷中，加入NHS(0.17g,1.5mmol)，再加入DCC(0.31g,1.5mmol)。将DMAP(0.02g,0.2mmol)加入S1-5(20.3g,1.0mmol,Mn≈20.3kDa,n1≈n2≈226,PDI＝1.04)的100mL二氯甲烷溶液中。将所述两份溶液混合后，室温下搅拌反应24小时。反应结束后，过滤除去不溶物，减压浓缩。用TFA/DCM混合溶液(1:1v/v)脱除tBu保护，再用纯化水洗涤，二氯甲烷萃取，萃取液用无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩，通过柱层析进行纯化得到E3-1(10.65g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.30-4.17(m,1H,Lys-α-CH<；2H,-OCH2CH2OC(＝O)NH-),4.12(s,2H,-OCH2C(＝O)N<),3.75-3.44(m,PEG；2H,Gly-CH2-；4H,-O(CH2)2N<；2H,>NCH2C(＝O)NH-；2H,-OCH2CH2OC(＝O)NH-),3.37(s,9H,-OCH3),3.23-3.12(m,2H,Lys-ε-CH2-),1.88-1.32(m,6H,Lys-β-CH2-,Lys-γ-CH2-,Lys-σ-CH2-)。GPC测试分子量约为40.2kDa，PDI＝1.06。
实施例3.2：三臂单官能化聚乙二醇醛衍生物E3-2的制备
对应通式(3-1)，E3-2中，L3为-NH(CH2)2-，R01为-CHO。设计的总分子量约为40.2kDa，n1≈n2≈226，n3≈450。
制备方法如下：
将S3-1(20.00g,1.0mmol,Mn≈20.0kDa,n3≈450,PDI＝1.04)溶于100mL无水二氯甲烷中，加入NHS(0.17g,1.5mmol)，再加入DCC(0.31g,1.5mmol)。将DMAP(0.02g,0.2mmol)加入S1-9(20.40g,1.0mmol,Mn≈20.4kDa,n1≈n2≈226,PDI＝1.04)的100mL二氯甲烷溶液中。将所述两份溶液混合后，室温下搅拌反应24小时。反应结束后，过滤除去不溶物，浓缩，将粗产物溶于水中，用盐酸调节溶液pH至2.0，搅拌反应16小时。反应完毕后加入10％氯化钠，用碳酸氢钠调节溶液pH为6.4±0.2，用二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，无水异丙醇重结晶，得到E3-2(11.66g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.28-4.16(m,1H,Lys-α-CH<；2H,-OCH2CH2OC(＝O)NH-),4.12(s,2H,-OCH2C(＝O)N<),3.75-3.38(m,PEG；2H,Gly-CH2-；4H,-O(CH2)2N<；2H,>NCH2C(＝O)NH-；2H,-OCH2CH2OC(＝O)NH-；2H,-C(＝O)NHCH2CH2CHO),3.36(s,9H,-OCH3),3.21-3.11(m,2H,Lys-ε-CH2-),2.73-2.62(m,2H,-C(＝O)NHCH2CH2CHO),1.78-1.34(m,6H,Lys-β-CH2-,Lys-γ-CH2-,Lys-σ-CH2-)。GPC测试分子量约为40.2kDa，PDI＝1.06。
实施例4：三臂单官能化聚乙二醇胺衍生物(E4-1)
对应通式(3-1)，E4-1中，L3为-NH(CH2)2-，R01为-NH2。设计的总分子量约为40.2kDa，n1≈n2≈226，n3≈450。
制备方法如下：
将E3-1(20.10g,0.5mmol,Mn≈40.2kDa,n1≈n2≈226，n3≈450,PDI＝1.06)溶于200mL无水二氯甲烷中，加入NHS(0.09g,0.8mmol)，再加入DCC(0.15g,0.8mmol)。将DMAP(0.01g,0.1mmol)加入乙二胺(S4-1,0.30g,5.0mmol)的5mL二氯甲烷溶液中。将所述两份溶液混合后，室温下搅拌反应24小时。反应结束后，过滤除去不溶物，减压浓缩，通过柱层析进行纯化得到E4-1(7.04g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.30-4.17(m,1H,Lys-α-CH<；2H,-OCH2CH2OC(＝O)NH-),4.12(s,2H,-OCH2C(＝O)N<),3.77-3.43(m,PEG；2H,Gly-CH2-；4H,-O(CH2)2N<；2H,>NCH2C(＝O)NH-；2H,-OCH2CH2OC(＝O)NH-),3.36(s,9H,-OCH3),3.33-3.25(m,2H,-C(＝O)NHCH2CH2NH2),3.19-3.10(m,2H,Lys-ε-CH2-),2.84(m,2H,-C(＝O)NHCH2CH2NH2),1.77-1.32(m,6H,Lys-β-CH2-,Lys-γ-CH2-,Lys-σ-CH2-)。GPC测试分子量约为40.2kDa，PDI＝1.06。
实施例5：三臂单官能化聚乙二醇马来酰亚胺衍生物(E5-1)
对应通式(3-1)，E5-1中，L3为-NH(CH2)2NHC(＝O)(CH2)2-，R01为马来酰亚胺基。设计的总分子量约为40.4kDa，n1≈n2≈226，n3≈450。
制备方法如下：
将E4-1(20.10g,0.5mmol,Mn≈40.2kDa,n1≈n2≈226，n3≈450,PDI＝1.06)溶于200mL无水二氯甲烷中，加入NHS(0.09g,0.8mmol)，再加入DCC(0.15g,0.8mmol)。将DMAP(0.01g,0.1mmol)加入含呋喃保护基的3-马来酰亚胺基丙酸(S5-1,1.19g,5.0mmol)的15mL二氯甲烷溶液中。将所述两份溶液混合后，室温下搅拌反应24小时。反应结束后，过滤除去不溶物，减压浓缩，加入50mL甲苯(Tol)，再加入0.50g的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)，加热至125℃，搅拌反应5小时，脱除呋喃保护基。浓缩，无水异丙醇重结晶，得到E5-1(5.60g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:6.72(s,2H,MAL),4.28-4.17(m,1H,Lys-α-CH<；2H,-OCH2CH2OC(＝O)NH-),4.13(s,2H,-OCH2C(＝O)N<),3.85(t,2H,-CH2CH2-MAL),3.78-3.43(m,PEG；2H,Gly-CH2-；4H,-O(CH2)2N<；2H,>NCH2C(＝O)NH-；2H,-OCH2CH2OC(＝O)NH-),3.37(s,9H,-OCH3),3.30-3.23(m,4H,-C(＝O)NH(CH2)2NHC(＝O)-),3.19-3.11(m,2H,Lys-ε-CH2-),2.57(t,2H,-CH2CH2-MAL),1.78-1.34(m,6H,Lys-β-CH2-,Lys-γ-CH2-,Lys-σ-CH2-)。GPC测试分子量约为40.4kDa，PDI＝1.06。
实施例6：三臂单官能化聚乙二醇衍生物(E6-1、E6-2)
实施例6.1：三臂单官能化聚乙二醇羧酸衍生物E6-1的制备
对应通式(3-2)，E6-1中，L3为-NHCH2-，R01为-COOH。设计的总分子量约为40.3kDa，n1≈n2≈226，n3≈450。
制备方法如下：
将E1-1(20.10g,0.5mmol,Mn≈40.2kDa,n1≈n2≈226，n3≈450,PDI＝1.05)溶于200mL无水二氯甲烷中，加入NHS(0.09g,0.8mmol)，再加入DCC(0.15g,0.8mmol)。将DMAP(0.01g,0.1mmol)加入S1-2(0.66g,5.0mmol)的10mL二氯甲烷溶液中。将所述两份溶液混合后，室温下搅拌反应24小时。反应结束后，过滤除去不溶物，减压浓缩。用TFA/DCM混合溶液(1:1v/v)脱除tBu保护，再用纯化水洗涤，二氯甲烷萃取，萃取液用无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩，通过柱层析进行纯化得到E6-1(8.28g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.29-4.18(m,1H,Lys-α-CH<),4.12(s,2H,-OCH2C(＝O)N<),3.74-3.43(m,PEG；2H,Gly-CH2-；4H,-O(CH2)2N<；2H,>NCH2C(＝O)NH-；2H,-OCH2CH2C(＝O)NH-；2H,-C(＝O)NHCH2COOH),3.36(s,9H,-OCH3),3.19-3.10(m,2H,Lys-ε-CH2-),2.53-2.45(t,2H,-OCH2CH2C(＝O)NH-),1.79-1.35(m,6H,Lys-β-CH2-,Lys-γ-CH2-,Lys-σ-CH2-)。GPC测试分子量约为40.3kDa，PDI＝1.05。
实施例6.2：三臂单官能化聚乙二醇醛衍生物E6-2的制备
对应通式(3-2)，E6-2中，L3为-NHCH2C(＝O)NH(CH2)2-，R01为-CHO。设计的总分子量约为40.3kDa，n1≈n2≈226，n3≈450。
制备方法如下：
将E6-1(20.15g,0.5mmol,Mn≈40.3kDa,n1≈n2≈226，n3≈450,PDI＝1.05)溶于200mL无水二氯甲烷中，加入NHS(0.09g,0.8mmol)，再加入DCC(0.15g,0.8mmol)。将DMAP(0.01g,0.1mmol)加入S1-8(0.74g,5.0mmol)的10mL二氯甲烷溶液中。将所述两份溶液混合后，室温下搅拌反应24小时。反应结束后，过滤除去不溶物，浓缩，将粗产物溶于水中，用盐酸调节溶液pH至2.0，搅拌反应16小时。反应完毕后加入10％氯化钠，用碳酸氢钠调节溶液pH为6.4±0.2，用二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，无水异丙醇重结晶，得到E6-2(7.31g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.31-4.20(m,1H,Lys-α-CH<),4.12(s,2H,-OCH2C(＝O)N<),3.74-3.45(m,PEG；4H,Gly-CH2-；4H,-O(CH2)2N<；2H,>NCH2C(＝O)NH-；2H,-OCH2CH2C(＝O)NH-),3.42-3.38(m,2H,-C(＝O)NHCH2CH2CHO),3.36(s,9H,-OCH3),3.18-3.10(m,2H,Lys-ε-CH2-),2.71-2.63(m,2H,-C(＝O)NHCH2CH2CHO),2.53-2.45(t,2H,-OCH2CH2C(＝O)NH-),1.79-1.32(m,6H,Lys-β-CH2-,Lys-γ-CH2-,Lys-σ-CH2-)。GPC测试分子量约为40.3kDa，PDI＝1.05。
实施例7：三臂单官能化聚乙二醇二羧酸衍生物(E7-1)
三臂单官能化聚乙二醇羧酸衍生物E1-1、E2-1、E3-1可与谷氨酸进一步偶联，得到含两个羧基的三臂单官能化聚乙二醇二羧酸衍生物。以下以E1-1与含tBu保护羧基的谷氨酸反应制备E7-1为例：
对应通式(4)，E7-1中，L2为-CH2CH2C(＝O)-，AA2为谷氨酸三价残基m为2，两个L3均为连接键，两个R01均为-OH。设计的总分子量约为40.3kDa，n1≈n2≈226，n3≈450。
制备方法如下：
将E1-1(20.10g,0.5mmol,Mn≈40.2kDa,n1≈n2≈226，n3≈450,PDI＝1.05)溶于200mL无水二氯甲烷中，加入NHS(0.09g,0.8mmol)，再加入DCC(0.15g,0.8mmol)。将DMAP(0.01g,0.1mmol)加入含两个tBu保护羧基的谷氨酸(S7-1,1.30g,5.0mmol)的20mL二氯甲烷溶液中。将所述两份溶液混合后，室温下搅拌反应24小时。反应结束后，过滤除去不溶物，减压浓缩。用TFA/DCM混合溶液(1:1v/v)脱除tBu保护，再用纯化水洗涤，二氯甲烷萃取，萃取液用无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩，通过柱层析进行纯化得到E7-1(10.46g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.49-4.40(m,1H,Glu-α-CH),4.27-4.19(m,1H,Lys-α-CH<),4.12(s,2H,-OCH2C(＝O)N<),3.76-3.42(m,PEG；2H,Gly-CH2-；4H,-O(CH2)2N<；2H,>NCH2C(＝O)NH-；2H,-OCH2CH2C(＝O)NH-),3.36(s,9H,-OCH3),3.22-3.15(m,2H,Lys-ε-CH2-),2.54-2.47(t,2H,-OCH2CH2C(＝O)NH-),2.42(t,2H,Glu-γ-CH2-),2.19-1.94(m,2H,Glu-β-CH2-),1.78-1.34(m,6H,Lys-β-CH2-,Lys-γ-CH2-,Lys-σ-CH2-)。GPC测试分子量约为40.3kDa，PDI＝1.05。
实施例8：三臂单官能化聚乙二醇二醛衍生物(E8-1)
根据实施例7制备的基于E1-1、E2-1、E3-1的二羧酸衍生物可进一步作为原料制备相应的二醛衍生物。以二羧酸衍生物E7-1为例，制备三臂单官能化聚乙二醇二醛衍生物E8-1：
对应通式(4)，E8-1中，L2为-CH2CH2C(＝O)-，AA2为谷氨酸三价残基m为2，两个L3均为-NH(CH2)2-，两个R01均为-CHO。设计的总分子量约为40.4kDa，n1≈n2≈226，n3≈450。
制备方法如下：
将E7-1(20.15g,0.5mmol,Mn≈40.3kDa,n1≈n2≈226，n3≈450,PDI＝1.05)溶于200mL无水二氯甲烷中，加入NHS(0.09g,0.8mmol)，再加入DCC(0.15g,0.8mmol)。将DMAP(0.01g,0.1mmol)加入S8-1(2.03g,5.0mmol,S8-1以S1-8和Cbz保护氨基的谷氨酸为原料合成)的30mL二氯甲烷溶液中。将所述两份溶液混合后，室温下搅拌反应24小时。反应结束后，过滤除去不溶物，浓缩，将粗产物溶于水中，用盐酸调节溶液pH至2.0，搅拌反应16小时。反应完毕后加入10％氯化钠，用碳酸氢钠调节溶液pH为6.4±0.2，用二氯甲烷萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，无水异丙醇重结晶，得到E8-1(8.04g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.47-4.40(m,1H,Glu-α-CH),4.29-4.20(m,1H,Lys-α-CH<),4.14(s,2H,-OCH2C(＝O)N<),3.75-3.44(m,PEG；2H,Gly-CH2-；4H,-O(CH2)2N<；2H,>NCH2C(＝O)NH-；2H,-OCH2CH2C(＝O)NH-),3.42-3.38(m,4H,-CH2CH2CHO),3.36(s,9H,-OCH3),3.23-3.17(m,2H,Lys-ε-CH2-),2.74-2.63(m,4H,-CH2CH2CHO),2.55-2.46(t,2H,-OCH2CH2C(＝O)NH-),2.41(t,2H,Glu-γ-CH2-),2.20-1.96(m,2H,Glu-β-CH2-),1.77-1.32(m,6H,Lys-β-CH2-,Lys-γ-CH2-,Lys-σ-CH2-)。GPC测试分子量约为40.4kDa，PDI＝1.05。
实施例9：三臂单官能化聚乙二醇羧酸衍生物(E8-1)
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对应通式(3-4)，E9-1中，L3为连接键，R01为-OH。设计的总分子量约为40.2kDa，n1≈226，n2≈226，n3≈450。
制备方法如下：
步骤a：第一次烷基化反应：将甲氧基聚乙二醇磺酸酯衍生物S9-3(12.12g,1.2mmol,Mn≈10.1kDa,n1≈226,PDI＝1.03)溶于60mL二氯甲烷中，加入小分子原料S9-2(5.78g,12.0mmol,以Boc保护氨基的甘氨酸和S1-4为原料制得)，室温下反应24小时，反应完毕后将反应液浓缩，于乙醚中沉淀两次除去杂质，得到中间体S9-4(10.84g)。
步骤b：第二次烷基化反应：将S9-4(8.40g,0.8mmol,Mn≈10.5kDa,n1≈226,PDI＝1.03)与S9-3(12.12g,1.2mmol)溶于100mL二氯甲烷中，室温下反应24小时，反应完毕后浓缩反应液，加入pH＝7.0的磷酸盐缓冲液搅拌16h，柱层析后得到含对称氮支化二臂聚乙二醇结构的中间体S9-5(8.61g)。
步骤c：将S1-6(7.96g,0.4mmol,Mn≈19.9kDa,n3≈450,PDI＝1.04)溶于50mL无水二氯甲烷中，加入NHS(0.07g,0.6mmol)，再加入DCC(0.12g,0.6mmol)。将DMAP(0.01g,0.1mmol)加入S9-5(8.12g,0.4mmol,Mn≈20.3kDa,n1≈n2≈226,PDI＝1.04)的50mL二氯甲烷溶液中。将所述两份溶液混合后，室温下搅拌反应24小时。反应结束后，过滤除去不溶物，减压浓缩。用TFA/DCM混合溶液(1:1v/v)脱除tBu保护，再用纯化水洗涤，二氯甲烷萃取，萃取液用无水硫酸钠干燥，过滤、浓缩，通过柱层析进行纯化得到E9-1(5.50g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.26-4.18(m,1H,Lys-α-CH<),3.72-3.43(m,PEG；2H,Gly-CH2-；2H,-OCH2CH2C(＝O)NH-；4H,-OCH2CH2N<),3.37(s,9H,-OCH3),3.27(s,2H,>NCH2C(＝O)NH-),3.21-3.11(m,2H,Lys-ε-CH2-),2.80(t,2H,-OCH2CH2N<),2.52-2.44(t,2H,-OCH2CH2C(＝O)NH-),1.90-1.34(m,6H,Lys-β-CH2-,Lys-γ-CH2-,Lys-σ-CH2-)。GPC测试分子量约为40.2kDa，PDI＝1.07。
实施例10：三臂单官能化聚乙二醇修饰的伊利替康衍生物(E10-1)
制备方法如下：
将E4-1(20.10g,0.5mmol,Mn≈40.2kDa,n1≈n2≈226，n3≈450,PDI＝1.06)溶于200mL无水二氯甲烷中，加入NHS(0.09g,0.8mmol)，再加入DCC(0.15g,0.8mmol)。将DMAP(0.01g,0.1mmol)加入伊利替康丙酸衍生物(S10-1,3.44g,5.0mmol)的50mL二氯甲烷溶液中。将所述两份溶液混合后，室温下搅拌反应24小时。反应结束后，通过过滤将沉淀去除。浓缩，通过柱层析进行纯化得到E10-1(6.93g)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:8.19-8.17(d,1H),7.84(s,1H),7.59(dd,1H),7.17(s,1H),5.70-5.39(m,2H),5.24(s,2H),4.50-4.39(m,2H),4.26-4.23(m,3H),4.13(s,2H),3.76-3.43(m,PEG+10H),3.36(s,9H),3.30-3.24(m,4H),3.18-3.06(m,6H),2.95-2.88(m,1H),2.82-2.74(m,4H),2.72-2.56(m,4H),2.52-2.43(m,2H),2.08-1.32(m,19H),0.97(t,3H)。GPC测试分子量约为40.9kDa，PDI＝1.06。
实施例11：生物学活性测试
(1)血清稳定性评价
往18个1.3mL微型离心管中各加入小鼠血清1mL，其中15个分别加入本发明的聚乙二醇衍生物，1个加入不含降解性基团的聚乙二醇衍生物对比例C-1(30.2kDa)，1个加入含赖氨酸-赖氨酸二肽残基的三臂聚乙二醇衍生物对比例C-2(40.4kDa)，1个加入含甘氨酸-赖氨酸-赖氨酸三肽残基的三臂聚乙二醇衍生物对比例C-3(40.5kDa)，每管聚乙二醇衍生物浓度均设置为5.0mg/mL。在37℃下孵育96小时后，取样200μL。除去血清中的蛋白质：添加乙腈，涡旋器搅拌1分钟，使血清中的蛋白质析出，离心分离，回收上清液。除去脂肪酸等疏水性物质：往回收液中加入己烷，涡旋器搅拌1分钟，离心分离。回收下层，真空条件下进行浓缩，回收聚乙二醇衍生物，GPC测定分子量，按下式计算分解率：
分解率＝(试验前Mn的峰面积％-试验后Mn的峰面积％)/(试验前Mn的峰面积％)×100％
其中，Mn为聚乙二醇衍生物的平均分子量，例如，E1-1的平均分子量Mn为40.2kDa。对比例C-1、C-2、C-3分别参考CN1243779C、CN1995094A、CN101168594A合成，结构如下：
小鼠血清中的分解率测定结果如表1所示。结果显示，本发明的含氮支化结构的三臂单官能化聚乙二醇衍生物在血清中的分解率均不超过5％，且略低于支化结构均为碳核的三臂聚乙二醇衍生物对比例(C-2、C-3在血清中分解率分别为9％、7％)，说明本发明的三臂单官能化聚乙二醇衍生物具有较好的血清稳定性。
表1、聚乙二醇衍生物在小鼠血清中的分解率
(2)细胞内降解性评价
实验组：使用培养基RPMI-1640(10％FBS Pn/St)10mL，在100mm培养皿中接种10×106cell的RAW264.7，在37℃下培养24小时后，更换到溶有10.0mg/mL本发明聚乙二醇衍生物或对比例聚乙二醇衍生物的培养基，继续在37℃下培养96小时后，将细胞溶于1％的SDS溶液中，用PBS稀释。除去蛋白质：添加乙腈，涡旋器搅拌1分钟，使蛋白质析出，离心分离，回收上清液。除去脂肪酸等疏水性物质：往回收液中加入己烷，涡旋器搅拌1分钟，离心分离。回收下层，真空条件下进行浓缩，回收聚乙二醇衍生物。
对照组：溶有10.0mg/mL本发明聚乙二醇衍生物或对比例聚乙二醇衍生物的培养基在不接种细胞的情况下，在37℃下等待96小时后，参考实验组方式完成聚乙二醇衍生物的回收。
对所回收的聚乙二醇衍生物进行GPC测试，按照前述公式计算分解率，结果总结于表2。结果显示，含氮支化结构的三臂单官能化聚乙二醇衍生物在细胞中具有高分解率，其中E3-1、E3-2的分解率在98％以上，显著高于对比例。
表2、聚乙二醇衍生物在细胞/培养基中的分解率
(3)细胞空泡形成评价
使用本发明的含甘氨酸-甘氨酸-赖氨酸三肽残基的三臂聚乙二醇衍生物E3-2(40.4kDa)、不含降解性基团的对比例C-1(30.2kDa)、含赖氨酸-赖氨酸二肽残基的三臂聚乙二醇衍生物对比例C-2(40.4kDa)和含甘氨酸-赖氨酸-赖氨酸三肽残基的三臂聚乙二醇衍生物对比例C-3(40.5kDa)进行细胞空泡形成评价。将Balb/c小鼠(8周龄，雄性)分为空白组、3个对照组(C-1、C-2、C-3)和实验组(E3-2)，每组各四只。空白组小鼠经尾静脉注射20μL生理盐水，对照组小鼠经尾静脉注射20μL的对比例聚乙二醇衍生物的生理盐水溶液(200mg/mL)，实验组经尾静脉注射20μL的E3-2的生理盐水溶液(200mg/mL)，每3天1次，连续10次给药。给药完成后，用4％多聚甲醛水溶液对小鼠进行灌注固定，制作石蜡切片。进行HE染色以及经由抗PEG抗体的免疫染色，评估脑的脉络丛上皮细胞中的空泡形成。结果显示，注射C-0、C-1的对照组小鼠体内均产生了明显的细胞空泡，而空白组、注射C-2的对照组和注射E3-2的实验组并未观测到空泡的产生，参考细胞内降解性试验结果，说明本发明的三臂聚乙二醇衍生物能够显著抑制细胞空泡形成。
(4)聚乙二醇化伊利替康的生物学测试
细胞毒性试验：
采用MTT染色法进行聚乙二醇化伊立替康E10-1(其中聚乙二醇组分来自E4-1)的细胞毒性测试，分别设置不加任何药物只加培养基的空白对照组、添加伊立替康的阳性对照组、添加聚乙二醇化伊立替康(E10-1)的实验组。阳性对照组和实验组的药物浓度均设置有1nM、10nM、100nM三个梯度，每个浓度6个复孔，重复三次试验。选用COLO205人结肠癌细胞、人结肠腺癌细胞HT29细胞、人肺腺癌细胞A549细胞、胰腺癌细胞MiaPaCa-2细胞、人卵巢癌细胞A2780细胞和人卵巢腺癌细胞OVCAR-3六种癌细胞为体外癌细胞模型。
以接种密度1×104细胞/孔，将细胞悬浮液100μL/孔接种到96孔板中。接种之后，在37℃、4％CO2的细胞培养箱中孵育培养24h。吸弃旧培养基，三个实验组分别加入含有1nM、10nM、100nM的E10-1的培养基100μL，三个阳性对照组分别加入含对应浓度伊立替康的培养基100μL，空白对照组加入新鲜培养基100μL。继续孵育48h后，每个孔加入5mg/mL的MTT的PBS缓冲液20μL。MTT与癌细胞孵育4h后，吸弃培养基和MTT缓冲液的混合液，加入DMSO(150μL/孔)溶解活细胞的蓝紫色结晶物甲瓒，轻轻振荡摇匀96孔板至充分溶解后，用酶标仪测试490nm处的吸光度。
细胞存活率＝(药物组吸光度值/空白组吸光度值)×l00％。
结果显示，阳性对照组(伊利替康)和实验组(E10-1)对前述六种癌细胞均有显著的抑制癌细胞增殖作用，且实验组细胞存活率与阳性对照组基本相当，本发明的聚乙二醇衍生物E4-1用于伊利替康药物的修饰保留了药物活性。
抗肿瘤效果：
采用动物移植性肿瘤实验法，用H22小鼠肝癌细胞接种于小鼠右侧腋皮下形成实体瘤，分别在接种2天、7天后，进行尾静脉注射给药，给药方式为单次给药。给药2周后，将小鼠颈椎脱臼处死，剥离肿瘤，并称重。结果表明，相比于空白对照，伊立替康和两臂聚乙二醇修饰的伊利替康衍生物(E10-1)均有明显的抑瘤效果，且E10-1的抑瘤率高于单独的伊立替康。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，对此应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (13)

1.一种三臂聚乙二醇衍生物，其结构如通式(1)所示：
其中，
ni为聚乙二醇链的聚合度，i选自1、2、3中任一种，n1、n2、n3各自独立地选自30-1000的整数；R2每次出现时各自独立地为C1-6烷基；
L1A、L1B、L2各自独立地为二价连接基；
Lys为赖氨酸残基；
AA1、AA2各自独立地为氨基酸或氨基酸衍生物残基；p选自1-5的整数，-(AA1)p-表示p个AA1结合形成的二价残基；q为0或1，表示AA2不存在或者存在一个AA2；
L3为连接键或二价连接基；
R01为H或能与生物相关物质反应的功能性基团或其被保护形式；m为1或2；当m为2时，两个L3结构相同或不同，两个R01结构相同或不同。
2.根据权利要求1所述的三臂聚乙二醇衍生物，其特征在于，每条PEG链对应的数均分子量为1000、1500、2000、2500、3000、3350、3500、4000、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、19000或20000Da。
3.根据权利要求1所述的三臂聚乙二醇衍生物，其特征在于，所述n1、n2、n3对应的PEG链均为多分散性，且n1、n2、n3每次出现时各自独立地选自约30至约1000，更优选约30至约500；更优选100至约500。
4.根据权利要求1所述的三臂聚乙二醇衍生物，其特征在于，R01为环氧基、醇羟基、硫醇基、羧基、氨基、醛基、活性酯基、活性碳酸酯基、氨基甲酸酯基、异氰酸酯基、异硫代氰酸酯基、琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基、烯基、炔基、烯酸酯基、叠氮基、氰基、二硫代吡啶基、α-卤代乙酰基炔基、叶酸基、罗丹明基、生物素基、单糖基和多糖基中任一种或任一种的被保护形式；优选为以下结构中任一种：
5.根据权利要求1所述的三臂聚乙二醇衍生物，其特征在于，L2为-(CH2)tq-、-(CH2)tqC(＝O)-、-C(＝O)(CH2)tqC(＝O)-、-(CH2)tqNHC(＝O)(CH2)tqC(＝O)-、-(CH2)tqC(＝O)NH(CH2)tqC(＝O)-中任一种，其中，tq每次出现时各自独立地为0-4的整数，连接基的右端与式(1)中的赖氨酸残基相连接；L2优选为-C(＝O)-、-CH2C(＝O)-、-CH2CH2C(＝O)-、-CH2CH2CH2C(＝O)-、-C(＝O)CH2CH2C(＝O)-、-C(＝O)CH2CH2CH2C(＝O)-、-CH2CH2NHC(＝O)CH2CH2C(＝O)-、-CH2CH2CH2NHC(＝O)CH2CH2C(＝O)-、-CH2CH2NHC(＝O)CH2CH2CH2C(＝O)-、-CH2CH2CH2NHC(＝O)CH2CH2CH2C(＝O)-、-CH2C(＝O)NHCH2C(＝O)-、-CH2CH2C(＝O)NHCH2C(＝O)-、-CH2CH2CH2C(＝O)NHCH2C(＝O)-中任一种。
6.根据权利要求1所述的三臂聚乙二醇衍生物，其特征在于，L3为连接键、亚烷基、-C(＝O)-、-OC(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)O-、-O-、-S-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRc-、-NRcC(＝O)-、-C(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)NRc-、-OC(＝O)NRc-、-NRcC(＝O)O-、-SC(＝O)NRc-和-NRcC(＝O)S-中任一种、任两种或者任两种以上的组合；
Rc为H、C1-6烷基、碳环基、杂环基中任一种；优选Rc为H；
所述亚烷基优选为-(CRaRb)t-，其中，t每次出现时各自独立地为1-12的整数，Ra、Rb各自独立地为H、C1-6烷基、碳环基、杂环基中任一种，t个Ra和t个Rb选自相同结构、两种不同结构的组合或两种以上不同结构的组合；优选Ra、Rb每次出现时各自独立地为-CH3或-H，更优选Ra、Rb都为H；优选t为1-4的整数，更优选t为1或2。
7.根据权利要求1所述的三臂聚乙二醇衍生物，其特征在于，p个AA1和q个AA2各自独立地选自甘氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、组氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、鸟氨酸和瓜氨酸中任一种的残基或衍生物残基；
当p＝1时，-AA1-优选为甘氨酸残基；
当p≥2时，-(AA1)p-为寡肽残基或寡肽衍生物残基；所述寡肽为二肽、三肽、四肽或五肽，优选为甘氨酸-苯丙氨酸、组氨酸-β-丙氨酸、甘氨酸-甘氨酸、赖氨酸-甘氨酸、赖氨酸-谷氨酸、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-赖氨酸-甘氨酸、甘氨酸-组氨酸-赖氨酸、甘氨酸-半胱氨酸-谷氨酸、甘氨酸-亮氨酸-甘氨酸、缬氨酸-瓜氨酸-甘氨酸、缬氨酸-丙氨酸-甘氨酸、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸、甘氨酸-组氨酸-脯氨酸、甘氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、甘氨酸-赖氨酸-甘氨酸-赖氨酸、甘氨酸-苯丙氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸、精氨酸-赖氨酸-天冬氨酸-缬氨酸-酪氨酸中任一种，更优选为甘氨酸-苯丙氨酸、组氨酸-β-丙氨酸、甘氨酸-甘氨酸、赖氨酸-甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸、甘氨酸-半胱氨酸-谷氨酸、甘氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸中任一种；
当q为1时，AA2优选为谷氨酸残基或者天冬氨酸残基。
8.根据权利要求7所述的三臂聚乙二醇衍生物，其特征在于，p为1，AA1为甘氨酸残基；所述三臂聚乙二醇衍生物结构如通式(2)所示：
其中，
L1A、L1B各自独立地选自C1-6亚烷基或-(CH2)1-6C(＝O)-，其中，连接基的左端与PEG链相连接；更优选各自独立地选自-CH2CH2-、-CH2-、-CH2C(＝O)-、-CH2CH2C(＝O)-中任一种；进一步优选L1A、L1B为以下情形中任一种：
情形(1)：L1A、L1B各自独立地为-CH2CH2-或-CH2-；
情形(2)：L1A、L1B中的一个为-CH2CH2-或-CH2-，另一个为-CH2C(＝O)-或-CH2CH2C(＝O)-。
9.根据权利要求8所述的三臂聚乙二醇衍生物，其特征在于，q为0，AA2不存在，且结构为通式(3)所示：
其中，L3优选为连接键、-O-、-O(CH2)tpOC(＝O)O-、-NH(CH2)tp-、-NH(CH2)tpC(＝O)NH(CH2)tp-、-NH(CH2)tpNHC(＝O)(CH2)tp-中任一种，且右端与R01相连接；tp为1-4的整数，优选为1或2；
R01优选为-OH、-CHO、-COOH、-NH2、
所述三臂聚乙二醇衍生物的结构更优选为以下结构式中任一种：
10.根据权利要求8所述的三臂聚乙二醇衍生物，其特征在于，q为1，存在一个AA2，且结构为通式(4)所示：
其中，
R01优选为-OH或-CHO；
L3优选为连接键或-NH(CH2)tp-，且右端与R01相连接；tp为1-4的整数，优选为1或2；
AA2优选为三价的氨基酸残基或氨基酸衍生物残基，更优选为三价谷氨酸残基或者三价天冬氨酸残基；
所述三臂聚乙二醇衍生物的结构更优选为以下任一种：
11.根据权利要求1所述的三臂聚乙二醇衍生物，其结构选自以下结构式中任一种：
12.一种三臂聚乙二醇衍生物修饰的生物相关物质，其特征在于，结构如通式(5)所示，
P-L-D
(5)
其中，P为权利要求1-11中任一项所述的三臂聚乙二醇衍生物，D为生物相关物质残基，L为三臂聚乙二醇衍生物的反应性基团与生物相关物质反应后形成的二价连接基；
所述生物相关物质选自以下任一种：药物、蛋白质、多肽、寡肽、蛋白模拟物、片段、酶、抗原、抗体及其片段、受体、基因相关物质适配体、多糖、蛋白多糖、糖蛋白、脂类化合物、激素、维生素、囊泡、脂质体、染料、荧光物质、靶向因子、细胞因子、神经递质、细胞外基质物质、植物或动物提取物、病毒、疫苗、细胞、胶束；更优选以下任一种：小分子药物、核酸、类固醇、磷脂、糖脂；更优选以下任一种：小分子药物、核苷、核苷酸、寡核苷酸、反义寡核苷酸、多核苷酸、甾类化合物；进一步地，所述小分子药物优选自黄酮类、类萜、类胡萝卜素、皂草苷、类固醇、甾体、醌、蒽醌、氟醌、香豆素、生物碱、卟啉、多元酚、大环内酯物、单内酰环类、苯丙素酚类、蒽环类、氨基配醣中任一种。
13.根据权利要求12所述的三臂聚乙二醇衍生物修饰的生物相关物质，其特征在于，所述生物相关物质为基因工程药物，选自抗体、抗体片段、白介素、溶菌酶、干扰素、生长素、EPO和GCSF中任一种，所述干扰素优选α-、β-或γ-干扰素。
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