KR20220143908A - 표적 전달 및 활성화의 면역 자극성 접합 복합체의 제조 및 용도 - Google Patents

표적 전달 및 활성화의 면역 자극성 접합 복합체의 제조 및 용도 Download PDF

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야페이 상하이 바이오로지 메디신 사이언스 앤드 테크놀로지 컴퍼니 리미티드
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Abstract

본 발명은 표적 전달 및 활성화의 면역 자극성 접합 복합체의 제조 및 용도를 제공한다. 구체적으로 본 발명은 링커로 사용되는 MI-S-C-A 구조의 화합물과 MI-S-C-A-D로 표시되는 약물을 연결하는 약물 화합물을 제공한다. 본 발명의 약물 화합물은 수용성을 개선하고 세포 독성을 감소시키며 약물 활성화를 향상시킨다.

Description

표적 전달 및 활성화의 면역 자극성 접합 복합체의 제조 및 용도
본 발명은 항종양 약물 화합물에 관한 것으로, 구체적으로는 표적 전달 및 활성화를 위한 면역 자극성 접합 복합체의 제조와 용도에 관련된 것이다.
Legumain은 초기에 콩과 식물 씨앗에 들어있는 아스파라긴엔도펩티다제(AEP)로 시스테인 프로테아제 C13 계열에 속하는 것으로 판정되었으며, 씨앗이 싹트는 과정에서 저장 단백질을 처리하는 것으로 알려졌다. 이후 Legumain이 기생충과 인간을 포함한 포유류에서 발견되면서 이의 프로테아제가 높은 보존성을 가지고 있음이 밝혀졌다. 1997년에는 처음으로 돼지 Legumain이 복제되고 검증되었다. Legumain은 다수의 종양에서 높게 발현된다. 정상 조직과 종양 조직에서 발현되는 Legumain의 차이는 종양을 치료하는 이상적인 표적이 된다. Legumain은 엔도펩티다제의 일종으로 약산성 조건에서 펩타이드 사슬의 아스파라긴 C 말단의 펩타이드 결합을 절단한다. CN 201210573744.3은 아스파라타아제로 표적 활성화한 폴리펩타이드 아드리아마이신 유도체가 Legumain을 통해 테트라펩타이드기(linker)를 절단하여 종양에 Leu-아드리아마이신 화합물을 방출한다고 공개했다.
본 발명은 추가적인 화합물 선별과 생물학적 시스템 연구를 통해 활성 효율을 더욱 높일 수 있는 화학적으로 변경된 링커(chemical modified linker)를 개발하였다. 본 발명의 화학적으로 변경된 활성 링커는 접합된 약물의 면역세포에 대한 선택성을 향상시켜 치료 중 면역 치료를 강화하고 PD-1 항체와 병용하여 치료 시너지 효과를 높일 수 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는 특이적으로 선택하는 고효율의 접합 링커를 생성하는 것이다. 이전의 연구를 통해 Legumain은 테트라펩타이드의 기질 펩타이드 서열을 식별하여 Asn과 기타 잔기 사이의 아미드 결합을 절단하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명에서 활성화 효율을 높이는 방법은 먼저 AAN과 같은 트리펩타이드 양 말단에서 구조가 다른 화합물을 대량으로 합성한 후, 그 화합물을 이용해 Legumain의 작동기전을 한층 더 연구하는 것이다. Legumain 결정 구조도(도 1)를 보면 Legumain의 활성 중심이 함몰된 저부에 위치하기 때문에 기질 펩타이드를 활성화하려면 저부의 효소 활성 중심에 접근해야 한다. 도면에서 Legumain의 S1 위치의 C189는 Asn 펩타이드 사슬을 공격해 절단하고 인접한 위치의 S2, S3, S4, S1은 기질과 결합하여 효소 절단 효율을 결정한다. S2, S3은 기질 펩타이드의 Ala-Ala 아미노산에 해당한다. 본 실험은 아드리아마이신 등 화합물과 MI기 연결 시 상호 작용 또는 입체 장애를 고려하여 기질 트리펩타이드의 양 말단에 화학적으로 변경된 구조를 대량으로 합성하고 선별하였다. 합성한 서로 다른 기의 화합물을 MI 및 아드리아마이신과 연결한 후 종양 조직 또는 Legumain 조건에서 활성화 효율을 선별하여 상호 구조 활성 상관관계를 갖는 새로운 화합물 접합체를 얻었으며, 그 화학식은 도 2와 같다. 여기에는 MI기, 선택성 기 S, Legumain에 의해 절단된 트리펩타이드기 C, 보결분자단 A 및 접합된 약물의 화학식을 포함한다. 본 발명에서 증가한 기는 Legumain의 접합된 약물 화합물(D)에 대한 활성화를 강화하고 약물 화합물의 물리적 성질과 생물학적 기능도 개선하였다. 본 발명에서 제공하는 약물 화합물은 친수성으로 그 세포막의 투과성이 변화하는, 약물 개발에 가장 적합한 화합물이다. 그 밖에도 본 발명은 화학식(II) 약물 화합물이 세포 선택성을 가지고 있어 특이적으로 종양 관련 대식 세포에 삼켜져 종양 관련 세포, MDSC 세포를 공격 또는 억제하여 종양 관련 대식 세포의 면역 억제 작용을 차단함으로써 면역 치료를 촉진시키는 것을 발견하였다. 본 발명은 또한 아드리아마이신 결합 시 S기의 길이가 활성화 효율에 영향을 미치며, S의 사슬이 길수록 입체 장애로 인해 화합물과 효소의 결합에 불리해져 활성화 효율이 저하됨을 발견하였다.
인혈청 알부민(HSA)은 작은 구형 단백질로 585개의 아미노산으로 이루어져 있으며(66-69kd), 전하를 띠는 많은 잔기(예: 리신, 아스파라긴산, 보결단이 없는 기 또는 탄수화합물)와 소량의 트립토판 또는 메티오닌 잔기가 있다. 본 발명의 화학식(II) 화합물은 인혈청 알부민과 결합한 34번 위치의 시스테인과 결합한 고분자 약물이며, 실험 결과 알부민 공유 결합의 본 발명 화학식(II) 화합물 또는 EMC-AANL-DOX는 독성을 감소시키고 약물 안정성을 높이며 치료 효과를 크게 향상시킨다는 것을 발견하였다.
상기 내용을 종합하면, 본 발명 화학식(I) 링커와 화학식(II) 약물 화합물은 활성화 효율, 면역세포에 대한 선택성 및 조직 선택성을 강화하며, 적절한 수용성 및 지용성, 약물 안정성을 가지고 있다.
따라서 본 발명은 본문에 기재된 화학식(I)의 화합물(링커)와 화학식(II)로 표시되는 약물 화합물(접합체) 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.
본 발명은 또한 하기 화학식 구조를 갖는 백금 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
Figure pct00001
본 발명은 또한 알부민과 공유 결합으로 연결된 본 발명의 화학식(II)로 표시되는 약물 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염과 알부민과 공유 결합으로 연결된 EMC-AANL-DOX를 제공하며, 바람직하게 알부민은 36번 위치의 시스테인 잔기를 통해 화학식(II)의 MI 또는 EMC 부분과 연결된다.
본 발명은 또한 발명의 화학식(II) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 본 발명에 기재된 백금 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 알부민과 공유 결합으로 연결된 본 발명의 화학식(II)로 표시되는 약물 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 알부민과 공유 결합으로 연결된 EMC-AANL-DOX 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약물 조합물도 제공한다.
본 발명은 또한 화학식(II) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 본 발명에 기재된 백금 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 알부민과 공유 결합으로 연결된 본 발명의 화학식(II)로 표시되는 약물 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 알부민과 공유 결합으로 연결된 EMC-AANL-DOX 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 암, 지방간(알코올성 및 비알코올성 지방간 포함), 지방성 간염, 지방성 간 질환, 간 섬유화, 간염, 간세포 손상의 지방 변성 현상을 치료하거나 예방하는 약물을 제조하는 용도로 제공되며, 바람직하게 상기 암은 고형암 또는 혈액종양이며, 바람직하게는 방광, 뇌, 유방/유선, 자궁경부, 결장, 직장, 식도, 신장, 간, 폐, 비인두, 췌장, 전립선, 피부, 위, 자궁, 난소, 고환 및 혈액 부위의 암이다.
본 발명은 또한 화학식(I)로 기재된 화합물을 화합물 약물의 수용성 증가, 약물 독성 감소, 약물의 치료 효과 증진 및/또는 약물의 면역 세포에 대한 선택성을 향상시키는 약물에 응용하거나, 수용성 개선,약물 독성 감소, 약물 치료 효과 증진 및/또는 약물의 면역 세포에 대한 선택성을 향상시키는 약물의 제조에 응용하거나, 약물을 간으로 전달하는 약물 분자의 제조에 응용할 수 있다.
본 발명은 또한 하기 화학식으로 표현되는 구조의 EMC-AANL-DOX 화합물 또는 알부민과 결합한 약물(바람직하게는 알부민 36번 위치의 시스테인 잔기를 통해 상기 EMC 부분과 공유 결합으로 연결된)을 간암 치료제 제조에 응용할 수 있고, 항PD-1 항체 및/또는 항PD-L1 항체를 병용 요법 종양 치료제의 제조에 응용할 수 있다:
Figure pct00002
본 발명은 또한 화학식(II) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 본 발명에 기재된 백금 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 알부민과 공유 결합으로 연결된 본 발명의 화학식(II)로 표시되는 약물 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 알부민과 공유 결합으로 연결된 EMC-AANL-DOX 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 면역 억제성 세포 억제, 종양 관련 대식 세포 억제, MDSC 세포 억제, 혈관 신생 억제, 항종양 면역 촉진 및/또는 T-림프구 증식을 촉진하는 약물의 제조에 응용할 수 있다.
본 발명은 또한 발명의 화학식(II) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 본 발명에 기재된 백금 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 알부민과 공유 결합으로 연결된 본 발명의 화학식(II)로 표시되는 약물 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 알부민과 공유 결합으로 연결된 EMC-AANL-DOX 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염과 항PD-1 항체를 병용 요법 종양 치료제의 제조에 응용할 수 있다.
도 1: Legumain 결정 구조 및 작용 기질도
도 2: 표적 전달 및 활성화의 면역 자극성 접합 복합체 화학식
도 3: 바람직한 화합물의 효소 절단 동역학 비교
도 4: 생쥐 골수 단핵 세포 분리 및 M2 대식 세포의 분화 유도
도 5: 화합물의 CD8+ T세포에 대한 세포 독성 실험
도 6: 화합물의 M2 대식 세포에 대한 세포 독성 실험
도 7: 화합물의 HT1080 종양에 대한 치료 효과 실험
도 8: EMC-AANL-DOX는 간과 간암 조직에 높은 분포 특징을 지닌다.
도 9: QHL-087-DOX는 간과 간암 조직에 높은 분포 특징을 지닌다.
도 10: QHL-087-DOX와 항PD-1 항체의 병용 요법으로 간 원위 암 치료
도 11: EMC-AANL-DOX와 항PD-1 항체의 병용 요법은 렌바티닙과 항PD-1 항체의 병용 요법보다 간 원위 암 치료 효과가 우수하다.
도 12: HSA-EMC-AANL-DOX, QHL-087-DOX와 항PD-1 항체의 병용 요법 효과
도 13: N-CBP의 생체외 세포 독성 실험
도 14: HSA-QHL-095-N-CBP 세포 독성 실험
도 15: HSA-QHL-095-N-CBP의 단일 요법 및 항PD-1 항체 병용 요법 효과
이하, 구체적인 실시 예를 통해 본 발명의 기술 방안을 상세하게 설명한다.
1. 링커 화합물
본 발명은 하기 화학식(I)로 표시되는 구조의 화합물을 제공하며, 이 화합물을 링커로 사용하여 관심 있는 약물(예: 항암 화합물)과 연결 시 화합물 약물의 수용성 증가, 약물 독성 감소, 약물 치료 효과 증진 및/또는 약물의 면역 세포에 대한 선택성을 향상시킬 수 있다:
MI-S-C-A （I）
화학식에서 MI는 말레이미드기이고, S는 효소 절단 효율 또는 선택성을 높이는 기이며, C는 단백질 분해 효소의 끊어질 수 있는 아미노산 링커이고, A는 보조 링커이다.
예시적인 MI는 하기 화학식으로 표시되는 말레이미드기이다:
Figure pct00003
그중 물결선은 S와의 연결 위치를 나타낸다.
일부 실시 방법에서 화학식(I)의 S는 S1-S2-S3로 표시될 수 있으며 S1은 하기 구조에서 선택된다:
Figure pct00004
.
그중 Rx는 존재하지 않거나 C1-6 알킬렌기, C1-6 알킬렌아미노기, C1-6 알킬렌카르복실기 및 C1-6알킬렌카르보닐아미노기에서 선택되고, 물결선은 인접한 부분과의 연결 위치를 나타낸다. S2는 존재하지 않거나 -[(CH2)pO]q- 이며, 그중 p는 1-4의 정수이고 바람직하게는 2이며, q는 0-15이고 바람직하게는 1-15이고 보다 바람직하게는 2-6의 정수이다. S3은 존재하지 않거나 Glu, Asp, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, Lys, Arg 및 His와 같은 극성 아미노산 잔기에서 선택되며 바람직하게는 Glu와 Asp이다.
S1, S2, S3 중 적어도 하나가 존재하는 것으로 이해되어야 한다.
바람직하게 MI, S1, S2, S3, C 및 A는 하기 방법을 통해 상호 연결된다:
Figure pct00005
그중 물결선은 인접한 부분과의 연결 위치를 나타낸다. 바람직하게 S는 하기 기에서 선택되는 기를 통해 C와 연결된다:
Figure pct00006
일부 실시 방법에서 S는 -R1-[(CH2)pO]q-R2-R3- 이고, 그중 R1은 MI와 연결되어 있으며, 존재하지 않거나 C1-6 알킬렌기 또는 C1-6 알킬렌카르보닐아미노기에서 선택된다. R2은 C1-6 알킬렌기에서 선택된다. R3은 -C(O)O-, -NH-, -O- 또는 -C(O)-R4에서 선택된다. R4는 바람직하게 Glu, Asp, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, Lys, Arg 및 His에서 선택되며, 보다 바람직하게는 Glu와 Asp의 아미노산 잔기이며, R4는 이의 아미노기를 통해 -C(O)- 와 아미드 결합을 형성한다. p는 1-4의 정수이고, q는 0-15이며 바람직하게는 1-15이고 보다 바람직하게는 2-6의 정수이다. 바람직하게, R1은 존재하지 않고, p는 2 또는 3이며, q는 1-15이고 바람직하게는 2-6이다. R2는 C1-4 알킬렌기이고, R3은 -C(O)O-, -NH-, -O- 에서 선택된다. 일부 실시 방법에서 바람직하게 R1은 존재하지 않고, q는 0이며, R2는 C1-6알킬렌이고, R3은 -C(O)-R4이며, R4은 바람직하게 Glu와 Asp이고, R4는 이의 아미노기를 통해 -C(O)- 와 아미드 결합을 형성한다. 일부 실시 방법에서 바람직하게 R1은 C1-6 알킬렌카르보닐아미노기이고, p는 2 또는 3이며, q는 1-15이고 바람직하게는 2-6이다. R2는 C1-4 알킬렌기이고, R3은 -C(O)-R4이며, R4는 바람직하게 Glu와 Asp이고, R4는 이의 아미노기를 통해 -C(O)- 와 아미노 결합을 형성한다.
예시적인 MI-S는 하기 구조에서 선택된다:
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
바람직하게 상기 MI-S와 연결된 C는 AAN이고 A는 하기 구조이다.
바람직하게는, 본 발명 화학식(I) 화합물 중 C는 종양 미세 환경에서 발현된 Legumain에 의해 절단되고 Asn 잔기가 포함된 기에서 선택된다. 일부 실시 방법에서 C는 X1X2X3이고, 그중 X1은 L 또는 D형 Ala, Thr, Val 및 Asn에서 선택되고, X2는 L 또는 D형 Ala, Thr, Val 및 Ile에서 선택되며, X3은 Asn이고 바람직하게는 D-Asn이 아니다. 예시적인 C는 하기 구조에서 선택된다: Ala-Ala-Asn, Thr-Ala-Asn, Val-Ala-Asn, Asn-Ala-Asn, Thr-Thr-Asn, Val-Thr-Asn, Asn-Thr-Asn, Ala-Val-Asn, Thr-Val-Asn, Val-Val-Asn, Asn-Val-Asn, Ala-Ile-Asn, Thr-Ile-Asn, Val-Ile-Asn, Asn-Ile-Asn, Ala-Thr-Asn, D-Thr-L-Val-L-Asn, D-Thr-L-Ala-L-Asn, D-Ala-L-Val-L-Asn, L-Thr-D-Val-L-Asn, L-Thr-D-Ala-L-Asn, L-Ala-D-Val-L-Asn, D-Thr-D-Val-L-Asn, D-Thr-D-Ala-L-Asn, D-Ala-D-Val-L-Asn. 일부 특별히 바람직한 실시 방법에서 C는 AAN이다.
본 발명의 화학식(I) 화합물 중 A는 바람직하게 Leu, PABC-OH 및 PABC-NH2에서 선택되며, 그 구조는 하기 화학식으로 표시된다:
Figure pct00012
그중 물결선은 C와의 연결 위치를 나타낸다.
일부 실시 방법에서 본 발명의 화학식(I) 화합물 중 S와 A는 하기 1-137 그룹 중에서 선택된다[화학식 중 "2peg"는 -(CH2CH2O)2- 를 나타내고, 3peg는 -(CH2CH2O)3- 을 나타내고, 4peg는 -(CH2CH2O)4- 를 나타내고, 6peg는 -(CH2CH2O)6- 를 나타내며, 순차적으로 유추된다]:
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
바람직하게는, 본 발명의 화학식(I) 화합물 중 MI는 말레이미드기이고, S와 A는 QHL-001에서 QHL-162까지의 그룹에 속하며, C는 AAN이다.
본 발명의 특별히 바람직한 화학식(I) 화합물(링커)은 QHL-005, QHL-006, QHL-008, QHL-086, QHL-087, QHL-089, QHL-090, QHL-092, QHL-093, QHL-095, QHL-096, QHL-098, QHL-099, QHL-101, QHL-102, QHL-104, QHL-105, QHL-107, QHL-108, QHL-116, QHL-119, QHL-138, QHL-140, QHL-141, QHL-143, QHL-144, QHL-146, QHL-147, QHL-150, QHL-153, QHL-154, QHL-155, QHL-156, QHL-157, QHL-158, QHL-159, QHL-160, QHL-161 및 QHL-162에서 선택되며, 보다 바람직하게는 QHL-086, QHL-087, QHL-089 및 QHL-090이다.
2. 약물 화합물
본 발명은 하기 화학식(II)로 표시되는 화합물(접합체) 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
MI-S-C-A-D （II）
이 화학식에서 MI, S, C 및 A는 본 발명의 실시 방법에 기재된 링커 화합물을 형성하며, D는 약물이고, 바람직하게는 항암 화합물이다.
화학식II에서 A를 연결 기로 사용할 때 다음 구조에서 선택된다:
Figure pct00019
그중 물결선은 C와 D의 연결 위치를 나타낸다. 바람직하게는 -NH- 를 통해 C와 연결된다.
바람직하게 D는 레시퀴모드, 프레드니손, 트리요오드티로닌(T3), 아드리아마이신, 다우노루비신, 에피루비신, 메토트렉사트, 플루다라빈, 젬시타빈, 시토신아라비노시드, 멜팔란, 니무스틴, 미토산트론, 마이토마이신, 캠토테신, 10-하이드록시캠토테신(OPT), 토포테칸, 플록슈리딘, 독시플루리딘, 에토포시드, 카페시타빈, 빈크리스틴, 에포틸론 B, 파클리탁셀, 도세탁셀, 다브라페닙, 도비티닙, 모테사닙, 화합물 a, 화합물 b 및 하기 화학식으로 표시되는 백금 유도체에서 선택된다:
Figure pct00020
그중 상기 화합물 a와 화합물 b 구조는 다음과 같다:
Figure pct00021
보다 바람직하게 D는 다우노루비신, 도비티닙, 에피루비신, 화합물 a, 화합물 b, 마이토마이신, 다브라페닙, 모테사닙, 레시퀴모드, 프레드니손 및 T3에서 선택된다. 바람직하게 이 약물(D)들과 연결하는 데 사용되는 본 발명의 화학식(I) 화합물(링커)은 QHL-005, QHL-006, QHL-008, QHL-086, QHL-087, QHL-089, QHL-090, QHL-092, QHL-093, QHL-095, QHL-096, QHL-098, QHL-099, QHL-101, QHL-102, QHL-104, QHL-105, QHL-107, QHL-108, QHL-116, QHL-119, QHL-138, QHL-140, QHL-141, QHL-143, QHL-144, QHL-146, QHL-147, QHL-150, QHL-153, QHL-154, QHL-155, QHL-156, QHL-157, QHL-158, QHL-159, QHL-160, QHL-161 및 QHL-162에서 선택되며, 보다 바람직하게는 QHL-086, QHL-087, QHL-089 및 QHL-090이다.
바람직하게는 A와 D가 하기 방법으로 연결된다:
Figure pct00022
그중 물결선은 인접한 부분과의 연결 위치를 나타낸다.
보다 바람직하게는, A와 D가 -CO-NH- 방식으로 연결되고, 그중 카르보닐기는 A와 연결되거나 A의 일부분이고(A가 Leu인 경우), 아미노기는 D와 연결되거나 D의 일부분이다. 일반적으로 약물 화합물과 A가 연결되는 위치는 약물 화합물의 활성 중심과 멀리 떨어져 있기 때문에 약물의 생물학적 활성에 영향을 미치지 않는다.
바람직하게 본 발명에 기재된 화학식(II) 약물 화합물은 하기 화합물에서 선택된다:
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
본 발명의 일부 실시 방법에서 본 발명은 또한 하기 화학식 구조를 갖는 백금 유도체, 이의 프로드러그 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다:
Figure pct00031
본 발명의 약물 조성물은 알부민과 공유 결합하여 새로운 약물 화합물을 형성할 수 있다. 따라서 본 발명에는 알부민과 공유 결합으로 연결된 본 발명의 화학식(II) 약물 화합물도 포함된다. 일반적으로 알부민은 링커의 MI와 연결된다. 일부 실시 방법에서 본 발명은 또한 알부민과 연결된 EMC-AANL-DOX, 이의 약물 조성물 및 이의 응용도 포함한다. 본 발명에는 알부민과 공유 결합으로 연결된 본 발명의 화학식(II) 약물 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염도 포함된다.
본 발명에서 약학적으로 허용 가능한 염은 본 분야에서 널리 알려진 약학적으로 허용 가능한 다양한 염일 수 있으며, 여기에는 염산염, 브롬화수소염, 인산염, 황산염, 구연산염, 젖산염, 주석산염, 말레산염, 푸마르산염, 만델산염, 수산염과 같은 무기 및 유기산염과 수산기, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(TRIS, 트로메타몰), N-메틸글루카민과 같은 염기와 함께 형성된 무기염 및 유기염을 포함한다.
3. 제조 방법
본 발명의 화학식(I)과 (II) 화합물의 예시적 제조 방법은 다음과 같다.
1단계: 트리펩타이드-PABC 또는 테트라펩타이드 제조: 아미노산 잔기와 결합하여 형성된 트리펩타이드-PABC 또는 테트라펩타이드를 분리하여 C-A를 수득한다.
2단계: MI-S 제조: MI-S기에 적합한 화합물을 선택하여 축합 및 고리화를 통해 한쪽 끝에 카르복실기가 붙어 있는 MI-S를 수득한다.
3단계: MI-S-C-A 제조: 1단계에서 수득한 C-A와 2단계에서 수득한 MI-S를 아미노기, 카르복실기 결합을 통해 중간체(MI-S-C-A)를 수득한다.
4단계: 3단계에서 수득한 화합물 MI-S-C-A의 A 말단에 있는 카르복실기 또는 수산기 활성 산물과 선택 약물의 아미노기와 공유 결합하여 표적 전달 및 활성화를 위한 면역 자극성 아드리아마이신 접합 복합체를 형성한다.
A가 PABC-OH일 때 합성 경로는 알려진 화학, 생물학 재조합 결합 기술을 사용하여 본 발명의 아미노산 잔기와 PABC를 결합한 후 정제하여 적절한 아미노산 보호기를 포함한 C-PABC를 수득한다. 반응은 축합제, 염기, 극성 비양성자성 용매의 존재 하에 진행할 수 있다. 그런 다음 보호기를 제거하여 C-PABC를 수득한다. 그 후 축합제, 염기, 극성 비양성자성 용매의 존재 하에 C-PABC와 MI-S기를 포함하는 산 또는 에스테르 또는 염화 아실을 반응시켜 본 발명의 화학식(I)로 표시되는 MI-S-C-A를 형성한 후, 다시 축합제, 염기, 극성 비양성자성 용매의 존재 하에 관심 있는 약물 화합물 또는 이의 염과 반응시켜 본 발명의 화학식(II)로 표시되는 약물 화합물을 형성한다.
본 제조 방법에 사용되는 염기의 예로는 트리에틸아민, 피리딘, N,N-디이소프로필에틸아민, 4-디메틸아미노피리딘, 1, 2, 2, 6, 6-펜타메틸피페리딘 등의 유기 염기 또는 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산수소나트륨, 탄산수소칼륨 등의 무기 염기를 들 수 있다. 본 제조 방법에 사용되는 축합제의 예로는 HBTU, DMC, HATU, HOBT, DIC, DCC, EDCI, DEPBT 등이 있으며, 본 제조 방법에 사용되는 용매는 반응 중에 불활성이고 반응을 억제하지 않는 용매는 모두 가능하다. 이러한 용매는 디클로로메탄, 클로로포름 등의 할로겐화 탄화수소 용매, 벤젠, 톨루엔 등의 방향족 탄화수소계 용매, 아세토니트릴, N,N-디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드 등의 비양성자성 용매, 아세트산, 메틸에스테르 등의 에스테르계 용매, 테트라하이드로퓨란 등의 에테르계 용매, 또는 이러한 용매들의 혼합물일 수 있다. 본 제조 방법에서 반응은 얼음 냉각 150℃의 온도 범위 내에서 진행될 수 있다.
4. 약물 조성물
본 발명에는 약물 조성물이 포함되며, 이 약물 조성물에는 본 발명의 화학식(II)로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 본 발명에 기재된 백금 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 알부민과 공유 결합으로 연결된 본 발명의 화학식(II) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 알부민과 공유 결합으로 연결된 EMC-AANL-DOX 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.
약물 조성물에는 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제도 포함될 수 있다. 담체 또는 부형제는 본 분야에서 널리 알려진 약학적으로 허용 가능한 다양한 담체 또는 부형제일 수 있으며, 약물 제형 또는 사용 방식에 따라 다를 수 있다.
구체적인 실시 예에서 약물 조성물은 용매, 가용화제/조용매, pH 조절제, 동결 건조 부형제 및 삼투압 조절제 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명에 사용되는 동결 건조 부형제는 당류(유당, 맥아당, 덱스트란, 포도당, 과당 등), 아미노산(아르기닌, 리신, 히스티딘 등), 마니톨, 주석산, 말레산, 구연산, 염화나트륨 및 사이클로덱스트린(하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 술포부틸에테르-β-사이클로덱스트린 등) 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명에 사용되는 pH 조절제는 염산, 인산, 황산, 탄산, 질산, 아세트산, 구연산, DL-주석산, D-주석산, L-주석산, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 메글루민, 말레산, 에틸렌디아민, 트리에틸아민, 리신, 히스티딘, 인산이수소나트륨 및 인산수소이나트륨 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명에 사용되는 용매는 유기 용매가 바람직하며, 에탄올, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜300, 폴리에틸렌글리콜400, 삼차부틸알코올, 글리세린, 트윈, 대두유, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린 용액 및 술포부틸-β-사이클로덱스트린 용액 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명에 사용되는 삼투압 조절제는 포도당, 염화나트륨, 마니톨 및 젖산나트륨 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명에 사용되는 가용화제/조용제는 트윈80, 트윈60, 폴록사머, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 리튬 12-하이드록시스테아레이트, 술포부틸에테르-β-사이클로덱스트린, PVP, 글리세린 및 크레모포 중 하나 이상을 포함한다.
일반적으로 포유류에 매일 경구 투여할 수 있는 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 용량은 약 0.0025~50mg/kg이고, 바람직하게는 약 0.01~10mg/kg이다.。 알려진 항암 약물과 병용하거나 다른 치료를 병행할 경우, 투여 용량은 예기된 목적을 효과적으로 달성할 수 있도록 조절해야 한다. 알려진 항암 약물의 최적 투여 용량은 본 분야의 전문가들이 숙지하고 있는 것이다.
단위 경구 투여량에는 본 발명 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 약 0.01~50mg 포함할 수 있으며, 바람직하게는 약 0.1~10mg을 포함할 수 있다. 단위 용량은 단회 또는 다회 투여할 수 있으며, 매회 본 발명 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 약 0.1~50mg, 바람직하게는 약 0.25~10mg을 포함할 수 있다.
본 발명의 약물 조성물은 정제, 캡슐, 주사제 등 적합한 모든 제형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 약물 조성물은 경구, 정맥 주사, 근육 주사 등 통상적인 경로를 통해 투여될 수 있다.
5. 화합물 및 약물 조성물의 용도
종양에서 분비되는 사이토카인은 단핵 세포를 종양 관련 대식 세포(TAM)로 전환되도록 유도하고, 종양 관련 대식 세포는 강력한 면역 억제 기능으로 종양 세포의 침윤과 전이를 촉진시킨다. 종양 관련 대식 세포(M2형)가 단핵 세포 및 염증형 대식 세포(M1형)와 확실하게 구별되는 표지는 Legumain의 발현이다. 본 발명의 화합물은 Legumain이 존재하는 조건에서 활성화되어 방출될 수 있다. Legumain에 의해 특이적으로 활성화된 접합체의 각 부분은 최종 약물의 표적, 활성화, 안정, 독성 및 약효 등 기능에 큰 영향을 미치기 때문에 Legumain에 의해 특이적으로 활성화되는 본 발명의 접합체는 연결된 약물의 독성을 효과적으로 감소시켜 최종 약물이 새로운 표적, 활성화 및 대사 특성을 가지게 함으로써 종양의 치료 효과를 향상시키며 새로운 종양 적응증을 도출하고 종양 전이를 억제하여 완전히 새로운 구조와 기능을 생성하였다.
본 발명은 또한 본 발명의 화학식(II) 화합물이 종양 관련 대식 세포를 살상하고, 미세 환경에서 면역을 억제하는 사이토카인을 약화시키며, 독성 CD8 세포의 면역 강화 현상을 촉진시키는 것을 발견하였다. 더욱 중요하게는, 기존의 화학요법 약물이 전체 면역체계를 손상시킨 것과 달리 이러한 종양 미세 환경 방출성 화합물은 종양 국소에서만 활성화된다는 것이다. 실험에서 종양 미세 환경 방출성 화합물과 PD-1(세포 예정사1, programmed death-1) 억제 항체(항PD-L1 항체, 시판, 현재 면역 치료 효과가 있는 것으로 여겨지는 후보 약물)는 강력한 치료 시너지 효과가 있어 면역 치료제와 화학요법 약물의 병용이 어려운 문제를 해결할 수 있다.
따라서 본 발명의 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 약물 조성물은 본 분야에 알려진 레시퀴모드, 프레드니손, T3, 아드리아마이신, 다우노루비신, 에피루비신, 메토트렉사트, 플루다라빈, 젬시타빈, 시토신아라비노시드, 멜팔란, 니무스틴, 미토산트론, 마이토마이신, 캠토테신, 10-하이드록시캠토테신(OPT), 토포테칸, 플록슈리딘, 독시플루리딘, 에토포시드, 카페시타빈, 빈크리스틴, 에포틸론 B, 파클리탁셀, 도세탁셀, 다브라페닙, 도비티닙, 모테사닙, 화합물 a, 화합물 b 및 백금 화합물(카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴 등)이 치료할 수 있는 암, 안과 질환, 간 질환 등 각종 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용할 수 있다.
예를 들면, 본 분야에서 알려진 캠토테신은 악성 종양, 건선, 사마귀, 급성/만성 백혈병 및 주혈흡충병으로 인한 간비종대 등의 치료 또는 예방에 사용할 수 있고, 10-하이드록시캠토테신은 위암, 간암, 두경부암 및 백혈병 등의 치료에 사용할 수 있으며, 파클리탁셀은 주로 난소암과 유방암의 치료에 사용되며 폐암, 대장암, 흑색종, 두경부암, 림프종, 뇌종양 등에도 치료 효과가 있다. 마이토마이신은 만성 림프종, 만성 골수성 백혈병, 식도암, 위암, 결장암, 직장암, 폐암, 췌장암, 간암, 자궁경부암, 자궁체암, 난소암, 유방암, 두경부 종양, 방광 종양, 악성 강내 수증 등의 치료에 사용할 수 있다.
따라서 본 발명 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 약물 조성물은 방광, 뇌, 유방/유선, 자궁 경부, 결장-직장, 식도, 신장, 간, 폐, 비인두, 췌장, 전립선, 피부, 위, 자궁, 난소, 고환, 혈액 등 부위의 암 등의 질환을 치료하거나 예방할 수 있다. 구체적으로 이러한 암은 간암, 신장암, 갑상선암, 결장직장암, 방광암, 뇌종양, 유방암, 자궁경부암, 직장암, 식도암, 폐암(기관지 폐암, 미분화 소세포성 및 비소세포성 포함), 비인두암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 위암, 자궁암, 난소암, 고환암, 혈액암(만성 또는 급성 백혈병, 림프구성 및 과립구성 백혈병 포함), 악성 림프종, 섬유 육종, 연조직 육종, 골육종, 횡문 근육종, 유잉 육종, 콩팥 모세포종, 갑상선암 및 두경부 편평세포암이다.
구체적인 실시 예에서 본 발명의 화학식(II)로 표시되는 D는 마이토마이신의 약물 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로, 안과 질환을 치료하거나 예방하는 데 사용할 수 있으며, 이에는 상처 흉터 또는 맥락막 신생 혈관의 치료 또는 예방, 또는 대식 세포 억제가 포함된다. 구체적인 실시 예에서 화학식(II)로 표시되는 D는 마이토마이신의 약물 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염으로, 각막 이식, 녹내장, 익상편 수술 후유증 등을 치료하거나 예방하는 데 사용할 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 약물 조성물은 종양의 전이를 차단하는 데 사용할 수 있으며, 특히 종양의 폐 전이를 차단할 수 있다. 실시 예에서 본 발명의 화합물 또는 약물 조성물은 유방암의 폐 전이를 차단할 수 있다.
본 발명에 기재된 간 질환은 지방간(알코올 및 비알코올성 지방간 포함), 지방성 간염, 지방성 간 질환, 간 섬유화, 간염, 간세포 손상의 지방 변성 현상 등을 포함한다.
따라서 본 발명은 필요한 대상에게 치료 또는 예방에 유효한 용량의 본 발명의 화학식(II) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 본 발명의 화학식(II) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한 약물 조성물의 투여 등, 질환(바람직하게는 본 발명의 실시 방법에 기재된 암, 안과 질환 및 간 질환)을 치료하거나 예방하는 방법을 포함한다. 일부 실시 방법에서 본 발명에 기재된 백금 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 알부민과 공유 결합으로 연결된 화학식(II) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 알부민과 공유 결합으로 연결된 EMC-AANL-DOX 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 그 각각의 약물 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 필요한 대상에게 유효한 용량의 본 발명의 화학물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한 약물 조성물의 투여 등, 종양의 전이를 차단하는 방법을 포함한다. 종양의 전이 차단은 종양의 폐 전이 및/또는 뼈 전이 차단 등을 포함한다.
종양 관련 대식 세포(TAM)는 일종의 중요한 염증 세포로 종양 관련 염증에서 매우 중요한 역할을 한다. TAM은 종양 미세 환경에서 종양 각 방면의 생물학적 특성에 영향을 미치며 종양의 발달을 촉진한다. EGF와 같은 분자를 분비하여 종양 세포의 성장과 혈관 신생을 촉진하여 암 세포의 침윤 및 전이 조건을 만들고, 동시에 획득성 면역 발동 기능을 억제한다. 따라서 본 발명은 필요한 대상에게 유효한 용량의 본 발명의 화학물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한 약물 조성물의 투여 등, 종양 관련 대식 세포를 억제하는 방법도 포함한다. 종양 관련 대식 세포를 억제함으로써 종양의 성장, 혈관 신생, 암 세포의 침윤과 전이를 억제하고 항종양 면역을 촉진하여 암을 예방하고 치료할 수 있다. 구체적인 실시 예에서 종양 관련 대식 세포는 Legumain이 발현되며 M2형이다.
본 발명의 상기 방법은 본 분야에서 알려진 방사선 요법 또는 면역 요법과 병용할 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 다양한 방법 또는 용도에 사용되는 본 발명 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 본 발명의 약물 조성물도 포함한다.
본 발명은 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 본 발명의 약물 조성물로 상기 질환(암, 암 전이 등)의 치료 또는 예방용 약물을 제조하는 용도를 포함한다. 본 발명은 또한 본 발명 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 본 발명의 약물 조성물로 종양 관련 대식 세포 억제, 종양 성장 억제, 혈관 신생 억제, 암 세포의 침윤 및 전이 억제 및/또는 항종양 면역 촉진용 약물을 제조하는 용도를 포함한다.
본 발명은 항암 화합물(특히 본문에 기재된 항암 화합물)의 독성 부작용을 감소시키는 방법을 제공하며, 그 방법에는 이러한 항암 화합물을 본 발명의 화학식(I)로 표시되는 링커 화합물과 연결하는 것을 포함한다.
본 발명의 치료 또는 예방 방법은 본 발명의 화합물 또는 약물 조성물을 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 투여 방법은 경구, 정맥 주사, 근육 주사 등을 포함한다. 대상은 포유류, 특히 사람을 포함한다.
일부 실시 방법에서 본 발명은 하기 화학식으로 표시되는 구조의 EMC-AANL-DOX 화합물 또는 알부민을 결합시킨 약물을 간암 치료제 제조에 응용할 수 있다.
Figure pct00032
본 발명에서 "함유", "포함"은 "……으로 조성", "……으로 구성"의 의미도 지니는 것으로 이해되어야 한다. 모든 중량 백분율 또는 체적 백분율의 합은 100%이 되어야 한다. 실시 예에서 사용되는 다양한 시약과 제품은 달리 설명하지 않는 한 시판 제품이고, 관련 방법은 달리 설명하지 않는 한 통상적인 기술에 따라 실시한다. 본 발명은 하기 실시 예에 의해 그 범위가 한정되지 않는다.
실시 예1: QHL-095-DOX의 합성
QHL-095-DOX의 합성 과정은 다음과 같다:
Figure pct00033
Figure pct00034
1. 중간체1의 합성
깨끗하고 건조한 2L 플라스크에 THF 500ml와 Fmoc-Asn(Trt)-OH 80g을 넣고 교반하여 용해시킨 후, DEPBT 46.6g을 넣고 실온에서 15분간 교반한 후, PABC 16g을 넣고 실온에서 30분간 반응시켰다. 그런 다음 DIPEA 45ml를 넣고 질소 기류 하 실온에서 3시간 반응시키고 TLC로 반응 완료를 확인하였다(Fmoc-Asn(Trt)-OH 반응 완료).
감압하여 반응액을 증발시키고 소량의 DMF(180ml)를 첨가하여 용해시킨 후, 교반 중인 3L 물에 적하하여 담황색의 고체를 석출하였다. 물로 2-3회 세척 후 여과하여 고체를 수집하고 진공 건조하여 백색 고체를 수득하였다(수율 90% 이상).
2. 중간체2의 합성
2L 1구 플라스크에 THF 500ml와 상기 단계에서 수득한 백색 고체를 차례로 넣고 교반하여 용해시킨 후, 얼음 염수욕조에서 0-5℃로 냉각하고, 피페리딘 100ml를 적하한 후 점차 실온으로 회복시켜 1시간 반응시키고 TLC로 반응 완료를 확인하였다. 감압하여 용매를 증발시키고 소량의 DMF를 첨가하여 용해시킨 후 교반 중인 2L 물에 적하하였다. 적하 완료 후 기계로 30분간 교반하고 여과한 후 물로 2-3회 세척하고 여과하였다. 여과된 고체 에 메틸 삼차 부틸 에테르 800ml를 첨가하고 30분간 교반한 후 여과하였다. 여과된 고체에 PE:EA=10:1를 첨가하고 2회 세척 후 여과하였다. 여과된 고체를 수집하여 진공 건조한 후 순도 70%의 백색 고체 80g을 수득하였다.
3. 중간체3의 합성
깨끗하고 건조한 250ml 1구 플라스크에 THF 50ml, Boc-Ala-Ala-OH 5.04g, DEPBT 3.89g을 차례로 넣고 실온에서 10분간 반응시킨 후 NH2H2H2-Asn(Trt)-PABC 2.6g을 첨가하고 질소 기류 하 실온에서 15분간 반응시켰다. 그런 다음 DIPEA 3.5ml를 적하하고 질소 기류 하 실온에서 3시간 반응시킨 후 감압하여 용매를 증발시키고 물을 첨가해 2-3회 교반하고 여과하여 담황색 고체 3.7g을 수득하였다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 순도 94.8%의 화합물 2.0g을 수득하였다(수율 26.6%).
4. 중간체4의 합성
1구 플라스크에 1.8g의 중간체3을 250ml 넣고 TFA 28.5ml를 첨가하고 물 1.5ml를 적하한 후 실온에서 30분간 반응시켰다. TLC로 반응 완료를 확인하고 감압하여 용매를 증발시킨 후, 메틸 삼차 부틸 에테르를 첨가하여 교반하고 여과하여 고체를 수득하였다. 그런 다음 디옥산:물=1:1 용액을 첨가하여 용해시키고, 1N 수산화나트륨을 첨가해 pH를 13으로 조절하고, 실온에서 40분간 교반한 후 감압하여 용매를 증발시키고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 화합물 450mg을 수득하였다(수율 47.5%).
5. MI-S 중간체의 합성
100ml 1구 플라스크에 MI-S1(338mg, 2mmol)과 DEPBT(717.6mg, 2.4mmol)를 넣고 DMF(15ml)를 첨가하여 용해시킨 후, 질소 기류 하 실온에서 15분간 반응시켰다. 그런 다음 R3-b(819mg, 2mmol)을 첨가하고 교반하여 용해시키고 실온에서 15분 간 반응시킨 후, DIPEA 137μl를 적하하고 질소 기류 하 실온에서 3시간 반응시켰다. TLC로 R3-a 반응 완료를 확인한 후 감압 증류 회전시켜 용매를 제거하고 미정제 생성물을 메탄올로 용해시켜 역상 HPLC로 R3-1의 중간체를 수득하였다(720 mg, 수율 64.3%).
6. MI-S의 합성
100ml 1구 플라스크에 상기 단계에서 수득한 중간체(720 mg, 1.28mmol)를 넣고 디클로로메탄 15ml를 첨가해 용해한 후, TFA 5ml를 적하하고 물 0.25ml를 적하하여 실온에서 30분간 반응시켰다. TLC로 반응 완료를 확인한 후 감압하여 용매를 증발시키고, 메틸 삼차 부틸 에테르를 첨가해 교반하고 여과하여 고체를 수득하였으며, 실리카겔 역상 크로마토그래피로 정제하여 화합물 242mg을 수득하였다. 수율은 37.5%였다.
7. 중간체5의 합성
100ml 1구 플라스크에 중간체4(150mg, 0.395mmol)와 EMC-6Peg-COOH(239mg, 0.474mmol)를 넣고 DMF(15ml)를 첨가하여 용해시킨 후, 질소 기류 하 실온에서 15분간 반응시켰다. 그런 다음 DIPEA 137μl를 적하하고 질소 기류 하 실온에서 3시간 반응시켰다. TLC로 중간체4의 반응 완료를 확인한 후 감압 증류 회전시켜 용매를 제거하고, 미정제 생성물을 메탄올로 용해시켜 역상 HPLC로 중간체5를 수득하였다(95 mg, 수율 21%).
8. 중간체6의 합성
100ml 1구 플라스크에 DMF 25ml, 중간체5(300mg, 0.346mmol), Bis-PNP(316mg, 1.04mmol)를 차례로 넣고 질소 기류 하 실온에서 15분간 반응시킨 후, DIPEA 258μl를 적하하고 질소 기류 하 실온에서 3시간 반응시켰다. HPLC로 원료 잔여량 7% 확인 후 반응을 중지시키고 감압하여 용매를 증발시킨 후, 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 150mg을 수득하였다(수율 42%).
9. 최종 화합물 QHL-095-DOX의 합성
100mL 플라스크에 염산 독소루비신 84mg(1.0 eq, 0.145mmol), 중간체6 150mg(1.0 eq, 0.145mmol)을 넣고 질소 기류 하 실온에서 15분간 반응시켰다. 그런 다음 DIPEA 75μl를 적하하고 실온에서 4시간 반응시킨 후 감압하여 용매를 증발시키고, 미정제 생성물을 메탄올에 용해시켜 역상 HPLC로 QHL-095-DOX를 수득하였다(49 mg의 적색 고체, 수율 23.8%).
실시 예2: QHL-116-DOX의 합성
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
1. 중간체1의 합성
깨끗하고 건조한 2L 플라스크에 THF 500ml와 Fmoc-Asn(Trt)-OH 80g을 넣고 교반하여 용해시킨 후, DEPBT 46.6g을 넣고 실온에서 15분간 교반한 후, PABC 16g을 넣고 실온에서 30분간 반응시켰다. 그런 다음 DIPEA 45ml를 넣고 질소 기류 하 실온에서 3시간 반응시키고 TLC로 반응 완료를 확인하였다(Fmoc-Asn(Trt)-OH 반응 완료).
감압하여 반응액을 증발시키고 소량의 DMF(180ml)를 첨가하여 용해시킨 후, 교반 중인 3L 물에 적하하여 담황색의 고체를 석출하였다. 물로 2-3회 세척 후 여과하여 고체를 수집하고 진공 건조하여 백색 고체를 수득하였다(수율 90% 이상).
2. 중간체2의 합성
2L 1구 플라스크에 THF 500ml와 상기 단계에서 수득한 백색 고체를 차례로 넣고 교반하여 용해시킨 후, 얼음 염수욕조에서 0-5℃로 냉각하고, 피페리딘 100ml를 적하한 후 점차 실온으로 회복시켜 1시간 반응시키고 TLC로 반응 완료를 확인하였다. 감압하여 용매를 증발시키고 소량의 DMF를 첨가하여 용해시킨 후 교반 중인 2L 물에 적하하였다. 적하 완료 후 기계로 30분간 교반하고 여과한 후 물로 2-3회 세척하고 여과하였다. 여과된 고체 에 메틸 삼차 부틸 에테르 800ml를 첨가하고 30분간 교반한 후 여과하였다. 여과된 고체에 PE:EA=10:1를 첨가하고 2회 세척 후 여과하였다. 여과된 고체를 수집하여 진공 건조한 후 순도 70%의 백색 고체 80g을 수득하였다.
3. 중간체3의 합성
깨끗하고 건조한 250ml 1구 플라스크에 THF 50ml, Boc-Ala-Ala-OH 5.04g, DEPBT 3.89g을 차례로 넣고 실온에서 10분간 반응시킨 후 NH2H2H2-Asn(Trt)-PABC 2.6g을 첨가하고 질소 기류 하 실온에서 15분간 반응시켰다. 그런 다음 DIPEA 3.5ml를 적하하고 질소 기류 하 실온에서 3시간 반응시킨 후 감압하여 용매를 증발시키고 물을 첨가해 2-3회 교반하고 여과하여 담황색 고체 3.7g을 수득하였다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 순도 94.8%의 화합물 2.0g을 수득하였다(수율 26.6%).
4. 중간체4의 합성
1구 플라스크에 1.8g의 중간체3을 250ml 넣고 TFA 28.5ml를 첨가하고 물 1.5ml를 적하한 후 실온에서 30분간 반응시켰다. TLC로 반응 완료를 확인하고 감압하여 용매를 증발시킨 후, 메틸 삼차 부틸 에테르를 첨가하여 교반하고 여과하여 고체를 수득하였다. 그런 다음 디옥산:물=1:1 용액을 첨가하여 용해시키고, 1N 수산화나트륨을 첨가해 pH를 13으로 조절하고, 실온에서 40분간 교반한 후 감압하여 용매를 증발시키고, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 화합물 450mg을 수득하였다(수율 47.5%).
5. 중간체5의 합성
Fmoc-Glu(OAll)-COOH(1.554g, 3.79mmol)에 DCM과 THF의 혼합 용액 10ml를 넣어 용해시키고, 교반하면서 HOtBu 2.72ml를 적하한 후, N2 기류 하 실온에서 16시간 반응시켰다. TLC로 반응 완료를 확인한 후 감압하여 용매를 증발시키고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 화합물 1.4g을 수득하였다(수율 79.5%).
6. 중간체6의 합성
깨끗하고 건조한 250ml 1구 플라스크에 THF 10ml, 상기 단계에서 수득한 중간체5(1.4g, 3mmol)를 차례로 넣고 교반하여 용해시킨 후, 얼음 염수욕조에서 0-5℃로 냉각하고, 피페리딘 3ml를 적하한 후 점차 실온으로 회복시켜 2시간 반응시켰다. TLC로 반응 완료를 확인한 후 감압하여 용매를 증발시키고, 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 화합물이 함유된 용리액을 수집하고, 진공 감압으로 항량 건조하여 화합물 583mg을 수득하였다(수율 80%).
7. 중간체7의 합성
깨끗하고 건조한 250ml 1구 플라스크에 THF 15ml, 중간체6 583mg, DEPBT 932.8mg을 차례로 넣고 실온에서 10분간 반응시킨 후, 말레이미도카프로산 506.4mg을 첨가하고 질소 기류 하 실온에서 15분간 반응시켰다. 그런 다음 DIPEA 1.3ml를 적하하고 질소 기류 하 실온에서 3시간 반응시킨 후 감압하여 용매를 증발시키고 물을 첨가해 2-3회 교반하고 여과하여 담황색 고체 800mg을 수득하였다. 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 순도 94.8%의 화합물 628mg을 수득하였다(수율 59.9%).
8. 중간체8의 합성
깨끗하고 건조한 100ml 1구 플라스크에 디클로로메탄 10ml, 중간체7 872mg을 차례로 넣고 교반한 후, TFA 3ml를 적하하여 실온에서 2시간 반응시켰다. TLC로 반응 완료를 확인한 후 진공 감압하여 용매를 증발시키고, 메틸 삼차 부틸 에테르를 첨가하여 교반 후 여과하여 고체를 수득했으며, 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 화합물이 함유된 용리액을 수집하고, 진공 감압으로 항량 건조하여 화합물 459mg을 수득하였다(수율 60.3%).
9. 중간체9의 합성
깨끗하고 건조한 250ml 1구 플라스크에 THF 15ml, 중간체8 459mg, DEPBT 434mg을 차례로 넣고 실온에서 10분간 반응시킨 후, 중간체4 457.8mg을 첨가하고 질소 기류 하 실온에서 15분간 반응시켰다. 그런 다음 DIPEA 627μl를 적하하고 질소 기류 하 실온에서 3시간 반응시킨 후 감압하여 용매를 증발시키고, 물을 첨가해 2-3회 교반하고 여과하여 담황색 고체 750mg을 수득한 후, 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 순도 63.2%의 화합물 655mg을 수득하였다(수율 63.2%).
10. 중간체10의 합성
100ml 1구 플라스크에 DMF 25ml, 중간체9(655mg, 0.88mmol), Bis-PNP(804mg, 2.64mmol)를 차례로 넣고 질소 기류 하 실온에서 15분간 반응시킨 후, DIPEA 258μl를 적하하고 질소 기류 하 실온에서 3시간 반응시켰다. HPLC로 원료 잔여량 7% 확인 후 반응을 중지시키고 감압하여 용매를 증발시킨 후, 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 335mg을 수득하였다(수율 42%).
11. 중간체11의 합성
100mL 플라스크에 염산 독소루비신 214.3mg(1.0 eq, 0.369mmol), 중간체10 335mg(1.0 eq, 0.369mmol)을 넣고 질소 기류 하 실온에서 15분간 반응시켰다. 그런 다음 DIPEA 190μl를 적하하고 실온에서 4시간 반응시킨 후 감압하여 용매를 증발시키고, 미정제 생성물을 메탄올에 용해시켜 역상 HPLC로 중간체11을 수득하였다(115mg의 적색 고체, 수율 23.8%).
12. 최종 화합물의 합성
100mL 플라스크에 THF 15ml, 중간체11(115mg, 0.0877mmol), 트리부틸틴 하이드라이드(76mg, 0.2631mmol)를 차례로 넣고 반응 용액을 질소로 포화시켰다. 그런 다음 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(14.2mg, 0.012mmol)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. TLC로 전환 완료를 확인하였다. 그런 다음 플라스크의 내용물을 규조토로 여과하고 잔여물은 THF로 세척하였다. 여과액은 감압하여 농축시켰다. 수득한 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목표 화합물 100mg을 수득하였다(수율 90％).
실시 예3: N-CBP의 합성
Figure pct00038
1. 중간체1의 합성
100ml 3구 플라스크에 원료 300mg을 넣고 THF/ETOH(4:1) 15ml를 첨가하여 용해시킨 후, 얼음 염수욕조에서 -5℃-0℃로 냉각하고 교반하여 온도를 조절하면서 210mg의 LiOH(5ml) 수용액을 나누어 적하한 후 자연적으로 상온으로 회복시켜 1시간 반응시켰다. HPLC로 원료의 반응 완료를 확인한 후 온도를 -5℃-0℃로 조절하고 1mol/L HCl를 사용해 반응액의 pH를 3-4로 조절한 후, 25-30℃ 온도에서 회전시켜 용매를 제거하고, 수득한 중간체1 미정제 생성물을 다음 단계에 직접 사용하였다.
2. 중간체2의 합성
중간체1에 15ml 1mol/L의 염산 디옥산 용액을 첨가한 후 실온에서 1시간 동안 교반하여 반응시켰다. HPLC로 중간체1 반응 완료를 확인한 후 25-30℃온도에서 회전시켜 용매를 제거하고, 수득한 중간체2 미정제 생성물을 다음 단계에 직접 사용하였다.
3. 중간체3의 합성
100ml 3구 플라스크에 중간체2 미정제 생성물을 넣고 디옥산 20ml를 첨가하여 용해시킨 후 얼음 염수욕조에서 -5-0℃로 냉각하고, 159mg의 탄산나트륨 용액(pH 약8)을 적하한 후, 질소 기류 하에서 -5-0℃를 유지한 상태에서 311mg Fmoc-Cl의 디옥산 용액을 적하하고 자연적으로 상온으로 회복시켜 1시간 반응시켰다. HPLC로 중간체2의 반응 완료를 확인한 후 회전시켜 용매를 제거하고, 수득한 미정제 생성물을 실리카겔 역상 크로마토그래피로 정제하여 중간체3 107mg을 수득하였다.
4. 중간체4의 합성
50ml 1구 플라스크에 중간체3 107mg을 넣고 메탄올 15ml를 첨가하여 용해시키고, 액체 질소를 사용해 -20℃로 냉각시킨 후, 302ul의 수산화테트라부틸암모늄(25% 메탄올 용액)을 적하한 후 자연적으로 상온으로 회복시켜 1시간 반응시켰다. 이 반응액은 예비 용액1이다.
50ml 1구 플라스크에 디요오드디아민 백금 140.8mg을 넣고 초순수 10ml를 첨가하여 용해시킨 후, 50℃로 가열하고 빛을 차단한 상태에서 질소 기류 하에 질산은 수용액 49.5mg을 적하하여 15분간 반응시키고, 연이어 질산은 수용액 49.5mg을 적하하여 15분간 반응시켰다. 그런 다음 반응액을 여과막으로 여과하고, 여과액을 100ml 1구 플라스크로 옮겨 실온에서 예비 용액1을 적하한 후 질소 치환을 3회 실시하였다. 이 반응액을 유욕에서 50℃로 가열하고 빛을 차단한 상태에서 밤새 반응시킨 후(일반적으로 16시간), 그 반응액을 원심 분리하여 상청액을 역상 HPLC로 정제한 제조액을 동결 건조하여 중간체4 79mg을 수득하였다(수율 45.7%).
5. N-CBP의 합성
10ml 1구 플라스크에 중간체4 10ml를 넣고 MeOH/ACN(1:1) 2ml를 첨가하고 교반하여 용해시킨 후, 실온에서 DBU 2ul를 적하하여 질소 기류 하에서 30분간 반응시켰다. HPLC로 중간체4의 반응 완료를 확인한 후 그 반응액을 6ml의 메틸 삼차 부틸 에테르에 적하하여 백색 고체를 석출하였다. 원심 분리 후 상청액을 제거하고 고체를 물/삼차 부틸 알코올로 용해시킨 후 컬럼 크로마토그래피를 통해 N-CBP 1.8mg을 수득하였다.
실시 예4: QHL-140-N-CBP의 합성
Figure pct00039
Figure pct00040
1. 중간체1의 합성
100ml 3구 플라스크에 원료 500mg을 넣고 DCM 10ml를 첨가하여 용해시킨 후, -5℃-0℃로 냉각시켜 교반하면서 TFA 5ml를 적하하고 1시간 반응시켰다. HPLC로 원료 반응 완료를 확인한 후 회전시켜 반응액에서 용매를 제거하고 남은 유상 물질이 중간체1이다.
2. 중간체2의 합성
100ml 1구 플라스크에 중간체1과 원료 Fmoc-AAN-PABC-PNP 1.15g을 넣고 DMF 20ml를 첨가하여 용해시킨 후, 질소 기류 하에서 10분간 교반하여 활성화시켰다. 그런 다음 DIPEA 0.87ml를 적하하여 30분간 반응시키고, HPLC로 원료 Fmoc-AAN-PABC-PNP의 반응 완료를 확인한 후, 회전시켜 반응액에서 DMF를 제거하고, 미정제 생성물을 물/DMF에 용해시키고, 역상 HPLC로 정제하여 중간체2 975mg을 수득하였다(수율 78.6%).
3. 중간체3의 합성
250ml 3구 플라스크에 중간체2 400mg을 넣고 THF/ETOH(4:1) 35ml를 첨가하여 용해시킨 후, 얼음 염수욕조에서 -5℃-0℃로 냉각시켰다. -5℃-0℃를 유지하면서 LiOH 수용액 202mg을 나누어 적하하고 온도를 유지한 상태에서 3시간 반응시켰다. HPLC로 중간체2 반응 완료를 확인한 후 온도를 -5℃-0℃로 유지하면서 HCL 1mol/L를 사용해 반응액의 pH를 6-7로 조절하였다. 25℃-30℃ 온도에서 회전시켜 용매를 제거하고, 수득한 미정제 생성물에 메틸 삼차 부틸 에테르를 첨가해 2회 교반한 후, 고체를 메탄올/물로 용해시켜 역상 HPLC로 정제해 중간체3 230mg을 수득하였다(수율 86.7%).
4. 중간체4의 합성
100ml 1구 플라스크에 중간체3 235mg과 EMC-OSU 222mg을 넣고 DMF 30ml를 첨가하여 용해시킨 후, 50℃로 가열하고 질소 기류 하에서 밤새 반응시켰다(일반적으로 16시간). HPLC로 중간체3의 반응 완료를 확인한 후 회전시켜 DMF를 제거하고, 수득한 미정제 생성물을 메탄올/물로 용해시켜 역상 HPLC로 정재해 중간체4 200mg을 수득하였다(수율 53.6%).
5. QHL-140-N-CBP의 합성
100ml 1구 플라스크에 중간체4 200mg을 넣고 메탄올 20ml를 첨가하여 용해시키고, 액체 질소를 사용해 -20℃로 냉각시킨 후, 279ul의 수산화테트라부틸암모늄(25% 메탄올 용액)을 적하한 후 자연적으로 상온으로 회복시켜 1시간 반응시켰다. 이 반응액은 예비 용액1이다.
100ml 1구 플라스크에 디요오드디아민 백금 130mg을 넣고 초순수 30ml를 첨가하여 용해시킨 후, 50℃로 가열하고 빛을 차단한 상태에서 질소 기류 하에 질산은 수용액 46mg을 적하하여 15분간 반응시키고, 연이어 질산은 수용액 46mg을 적하하여 15분간 반응시켰다. 그런 다음 반응액을 여과막으로 여과하고, 여과액을 250ml 1구 플라스크로 옮겨 실온에서 예비 용액1을 적하한 후 질소 치환을 3회 실시하였다. 이 반응액을 유욕에서 50℃로 가열하고 빛을 차단한 상태에서 밤새 반응시킨 후(일반적으로 16시간), 그 반응액을 원심 분리하여 상청액을 역상 HPLC로 정제한 제조액을 동결 건조하여 QHL-140-N-CBP 90mg을 수득하였다(수율 34.5%).
실시 예5: QHL-086-N-CBP의 합성
Figure pct00041
1. 중간체1의 합성
100ml 3구 플라스크에 원료 500mg을 넣고 DCM 10ml를 첨가하여 용해시킨 후, -5℃-0℃로 냉각시켜 교반하면서 TFA 5ml를 적하하고 1시간 반응시켰다. HPLC로 원료 반응 완료를 확인한 후 회전시켜 반응액에서 용매를 제거하고 남은 유상 물질이 중간체1이다.
2. 중간체2의 합성
100ml 1구 플라스크에 중간체1과 원료 Fmoc-AAN-PABC-PNP 1.15g을 넣고 DMF 20ml를 첨가하여 용해시킨 후, 질소 기류 하에서 10분간 교반하여 활성화시켰다. 그런 다음 DIPEA 0.87ml를 적하하여 30분간 반응시키고, HPLC로 원료 Fmoc-AAN-PABC-PNP의 반응 완료를 확인한 후, 회전시켜 반응액에서 DMF를 제거하고, 미정제 생성물을 물/DMF에 용해시키고, 역상 HPLC로 정제하여 중간체2 975mg을 수득하였다(수율 78.6%).
3. 중간체3의 합성
250ml 3구 플라스크에 중간체2 400mg을 넣고 THF/ETOH(4:1) 35ml를 첨가하여 용해시킨 후, 얼음 염수욕조에서 -5℃-0℃로 냉각시켰다. -5℃-0℃를 유지하면서 LiOH 수용액 202mg을 나누어 적하하고 온도를 유지한 상태에서 3시간 반응시켰다. HPLC로 중간체2 반응 완료를 확인한 후 온도를 -5℃-0℃로 유지하면서 HCL 1mol/L를 사용해 반응액의 pH를 6-7로 조절하였다. 25℃-30℃ 온도에서 회전시켜 용매를 제거하고, 수득한 미정제 생성물에 메틸 삼차 부틸 에테르를 첨가해 2회 교반한 후, 고체를 메탄올/물로 용해시켜 역상 HPLC로 정제해 중간체3 235mg을 수득하였다(수율 88.6%).
4. 중간체4의 합성
100ml 1구 플라스크에 EMC-2Peg-OH 89mg을 넣고 DMF로 용해시킨 후, DEPBT 97mg을 첨가하고 실온에서 1시간 동안 교반하여 활성화시켰다. 그런 다음 DEPBT 95ul를 적하하여 1시간 동안 교반하였다. 그런 다음 중간체3의 DMF 용액 150mg을 나누어 적하한 후 실온에서 교반하여 반응시키고, HPLC로 반응 완료를 확인하였다. 회전시켜 DMF를 제거하고, 수득한 미정제 생성물을 물/메탄올에 용해시켜 역상 HPLC로 정재해 화합물 88mg을 수득하였다(수율 37.6%).
5. QHL-086-N-CBP의 합성
50ml 1구 플라스크에 중간체4 88mg을 넣고 메탄올 10ml를 첨가하여 용해시키고, 액체 질소를 사용해 -20℃로 냉각시킨 후, 106ul의 수산화테트라부틸암모늄(25% 메탄올 용액)을 적하한 후 자연적으로 상온으로 회복시켜 1시간 반응시켰다. 이 반응액은 예비 용액1이다.
50ml 1구 플라스크에 디요오드디아민 백금 49mg을 넣고 초순수 10ml를 첨가하여 용해시킨 후, 50℃로 가열하고 빛을 차단한 상태에서 질소 기류 하에 질산은 수용액 17mg을 적하하여 15분간 반응시키고, 연이어 질산은 수용액 17mg을 적하하여 15분간 반응시켰다. 그런 다음 반응액을 여과막으로 여과하고, 여과액을 100ml 1구 플라스크로 옮겨 실온에서 예비 용액1을 적하한 후 질소 치환을 3회 실시하였다. 이 반응액을 유욕에서 50℃로 가열하고 빛을 차단한 상태에서 밤새 반응시켰다(일반적으로 16시간). HPCL로 중간체4의 약 20%가 미반응한 것을 확인한 후 반응을 중지시키고, 그 반응액을 원심 분리하여 상청액을 역상 HPLC로 정제한 제조액을 동결 건조하여 QHL-086-N-CBP 54mg을 수득하였다(수율 48.6%).
실시 예6: QHL-095-N-CBP의 합성
Figure pct00042
1. 중간체1의 합성
100ml 3구 플라스크에 원료 500mg을 넣고 DCM 10ml를 첨가하여 용해시킨 후, -5℃-0℃로 냉각시켜 교반하면서 TFA 5ml를 적하하고 1시간 반응시켰다. HPLC로 원료 반응 완료를 확인한 후 회전시켜 반응액에서 용매를 제거하고 남은 유상 물질이 중간체1이다.
2. 중간체2의 합성
100ml 1구 플라스크에 중간체1과 원료 Fmoc-AAN-PABC-PNP 1.15g을 넣고 DMF 20ml를 첨가하여 용해시킨 후, 질소 기류 하에서 10분간 교반하여 활성화시켰다. 그런 다음 DIPEA 0.87ml를 적하하여 30분간 반응시키고, HPLC로 원료 Fmoc-AAN-PABC-PNP의 반응 완료를 확인한 후, 회전시켜 반응액에서 DMF를 제거하고, 미정제 생성물을 물/DMF에 용해시키고, 역상 HPLC로 정제하여 중간체2 975mg을 수득하였다(수율 78.6%).
3. 중간체3의 합성
250ml 3구 플라스크에 중간체2 400mg을 넣고 THF/ETOH(4:1) 35ml를 첨가하여 용해시킨 후, 얼음 염수욕조에서 -5℃-0℃로 냉각시켰다. -5℃-0℃를 유지하면서 LiOH 수용액 202mg을 나누어 적하하고 온도를 유지한 상태에서 3시간 반응시켰다. HPLC로 중간체2 반응 완료를 확인한 후 온도를 -5℃-0℃로 유지하면서 HCL 1mol/L를 사용해 반응액의 pH를 6-7로 조절하였다. 25℃-30℃ 온도에서 회전시켜 용매를 제거하고, 수득한 미정제 생성물에 메틸 삼차 부틸 에테르를 첨가해 2회 교반한 후, 고체를 메탄올/물로 용해시켜 역상 HPLC로 정제해 중간체3 235mg을 수득하였다(수율 88.6%).
4. 중간체4의 합성
100ml 1구 플라스크에 중간체3 180mg과 EMC-6Peg-OSU 240mg을 넣고 DMF 20ml를 첨가하여 용해시킨 후, 50℃로 가열하고 질소 기류 하에서 밤새 반응시켰다(일반적으로 16시간). HPLC로 중간체3의 반응 완료를 확인한 후 회전시켜 DMF를 제거하고, 수득한 미정제 생성물을 메탄올/물로 용해시켜 역상 HPLC로 정재해 중간체4 234mg을 수득하였다(수율 69.2%).
5. QHL-095-N-CBP의 합성
100ml 1구 플라스크에 중간체4 234mg을 넣고 메탄올 15ml를 첨가하여 용해시키고, 액체 질소를 사용해 -20℃로 냉각시킨 후, 234ul의 수산화테트라부틸암모늄(25% 메탄올 용액)을 적하한 후 자연적으로 상온으로 회복시켜 1시간 반응시켰다. 이 반응액은 예비 용액1이다.
100ml 1구 플라스크에 디요오드디아민 백금 109mg을 넣고 초순수 20ml를 첨가하여 용해시킨 후, 50℃로 가열하고 빛을 차단한 상태에서 질소 기류 하에 질산은 수용액 38mg을 적하하여 15분간 반응시키고, 연이어 질산은 수용액 38mg을 적하하여 15분간 반응시켰다. 그런 다음 반응액을 여과막으로 여과하고, 여과액을 250ml 1구 플라스크로 옮겨 실온에서 예비 용액1을 적하한 후 질소 치환을 3회 실시하였다. 이 반응액을 유욕에서 50℃로 가열하고 빛을 차단한 상태에서 밤새 반응시킨 후(일반적으로 16시간), 그 반응액을 원심 분리하여 상청액을 역상 HPLC로 정제한 제조액을 동결 건조하여 최종 화합물 138mg을 수득하였다(수율 48%).
실시 예7: QHL-006-DOX의 합성
QHL-006에서 MI-S기의 합성 경로는 다음과 같이 표시된다:
Figure pct00043
1. QHL-006-DOX에서 MI-S 중간체-1의 합성
깨끗하고 건조한 100ml 1구 플라스크에 무수 말레산(245mg, 2.5mmol)을 넣고 디클로로메탄 10ml를 첨가한 후 교반하여 용해시켰다. 그런 다음 NH2H2H2-3Peg-COOtBu(624mg, 2.25mmol)을 첨가하고 실온에서 6시간 반응시킨 후, LC-MS로 무수 말레산의 반응 완료를 확인하였다. 그 반응액을 회전시켜 건조한 후 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 MI-S 중간체-1을 수득하였다(456mg, 수율 48.6%).
2. QHL-006-DOX에서 MI-S 중간체-2의 합성
100ml 1구 플라스크에 상기 단계에서 수득한 MI-S 중간체-1 456mg을 넣고 무수 아세트산 10ml를 첨가한 후 교반하여 용해시켰다. 여기에 NaOAC(98.7mg, 1.216mmol)를 나누어 천천히 첨가한 후, 유욕에서 110℃로 가열하여 3시간 반응시켰다. LC-MS로 MI-S 중간체-1의 반응 완료를 확인한 후 실온으로 냉각시키고, 반응액을 회전시켜 건조하고, 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 MI-S 중간체-2를 수득하였다(312, 수율 70%).
3. QHL-006-DOX에서 MI-S의 합성
100ml 1구 플라스크에 상기 단계에서 수득한 MI-S 중간체-2(312mg, 0.87mmol)를 넣고 디클로로메탄 10ml를 첨가해 용해한 후, TFA 2ml를 적하하고 물 0.15ml를 적하한 후, 실온에서 30분간 반응시켰다. TLC로 반응 완료를 확인한 후 감압하여 용매를 증발시키고, 메틸 삼차 부틸 에테르를 첨가해 교반하고 여과하여 고체를 수득하였으며, 실리카겔 역상 크로마토그래피로 정제하여 화합물 194mg을 수득하였다. 수율은 75%였다.
최종 화합물은 QHL-095-DOX 합성과 유사한 방법을 사용하고, 다른 MI-S를 연결하여(MI-S의 제조는 QHL-006-DOX에서 MI-S의 합성 과정 참조) 제조한 후 수득하였다.
실시 예8: QHL-096-DOX의 합성
Figure pct00044
Figure pct00045
1) 중간체1의 합성
N-벤질옥시카르보닐-L-알라닌(100g, 0.45mol)을 건조한 N,N-디메틸포름아미드(3L)에 용해하고, 교반하면서 1-하이드록시벤조트리아졸(72.6g, 0.54mol)과 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디아미드 하이드로클로라이드(103.3g, 0.54mol)를 첨가하고, 1시간 동안 교반하여 반응시켰다. 그런 다음 얼음 수욕조에서 0℃로 냉각시키고, L-알라닌 메틸 에스테르(46.2g, 0.45mol)와 N,N-디이소프로필에틸아민(173.8g, 1.34mol)의 N,N-디메틸포름아미드(1L) 용액을 적하한 후, 실온에서 10시간 교반하였다. 그런 다음 감압하여 용매를 증발시키고, 수득한 미정제 생성물을 디클로로메탄(2L)에 용해시킨 후 염화암모늄 포화 용액, 물과 염화나트륨 포화 용액에 차례로 세척하고, 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후 감압하여 용매를 증발시켰다. 수득한 미정제 생성물을 아세트산에틸/석유에테르로 재결정하고 정제하여 중간체1을 수득하였다(101g의 백색 고체, 수율 73.1%).
2) 중간체2의 합성
중간체1(100g, 0.34mol)을 테트라하이드로퓨란(2L)과 물(1L)의 혼합 용액에 용해시키고 0℃로 냉각시킨 후, 수산화 리튬 1 mol/L 용액(400mL)을 적하하고 10시간 동안 교반하여 반응시켰다. 그런 다음 농염산을 pH<6으로 중화시켜 적하하고 감압하여 테트라하이드로퓨란을 증발시켰으며, 잔여 수상을 디클로로메탄(1L x 3)으로 추출하고, 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후 감압하고 증발시켜 중간체2를 수득하였다(88g의 백색 고체, 수율 92.2%).
3) 중간체3의 합성
3구 플라스크에서 L-류신 t-부틸 에스테르(22.4g, 0.1mol), N-Fmoc-N'-트리틸 아스파라긴(59.6g, 0.1mol)을 N,N-디메틸포름아미드(1000mL)로 용해하고, 교반하면서 1-하이드록시벤조트리아졸(14.85g, 0.11mol)과 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디아미드 하이드로클로라이드(23g, 0..12mol)를 첨가한 후 얼음 수욕조에서 0℃로 냉각시켰다. 그런 다음 N,N-디이소프로필에틸아민(25.8g, 0.2mol)을 첨가하고 10시간 교반한 후 감압하여 용매를 증발시켰다. 수득한 미정제 생성물을 클로로포름(1000ml)에 용해시키고, 염화암모늄 포화 용액, 염화나트륨 포화 용액 및 물에 차례로 세척하고, 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조하고 여과한 후 감압하여 용매를 증발시켰다. 수득한 미정제 생성물을 재결정하고(체적 비율에 따라 디클로로메탄:아세트산에틸=1:1) 정제하여 중간체3을 수득하였다(42.4g의 백색 고체, 수율 55.4%).
4) 중간체4의 합성
중간체3(7.65g, 0.01mol)을 디클로로메탄(100mL)과 N,N-디메틸포름아미드(100mL)의 혼합 용액에 용해하고, 피페리딘(40ml)을 첨가하여 실온에서 5시간 교반한 후 감압하여 용매를 증발시켰다. 그런 다음 진공 건조기에서 고진공으로 건조시켜 소량의 피페리딘을 제거하여 담황색의 고체인 중간체4를 수득하였으며, 정제하지 않은 상태로 다음 단계에 사용하였다.
5) 중간체5의 합성
상기 단계에서 수득한 중간체4 미정제 생성물을 N,N-디메틸포름아미드(200mL)에 용해하고, 중간체2(2.94g, 0.012mol), O-벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸 유로니움 헥사플루오로 포스페이트(HBTU)(6.07g, 0.016mol)를 첨가한 후, 얼음 수욕조에서 0℃로 냉각하였다. 그런 다음 N,N-디이소프로필에틸아민(2.6g, 0.02mol)을 첨가하고 실온에서 밤새 교반한 후 감압하여 용매를 증발시켰다. 잔여물은 클로로포름(100ml)에 용해하고, 염화암모늄 포화 용액, 염화나트륨 포화 용액에 차례로 세척한 후, 무수 황산나트륨으로 건조하고 여과하여 용매를 증발시켰다. 수득한 미정제 생성물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 중간체5를 수득하였다(3.1g의 백색 고체, 2단계 총 수율 37.8%).
6) 중간체6의 합성
Cbz-AAN(trt)-L-Otbu(3.00g, 3.65mmol)을 메탄올(100mL)에 용해하고,10%의 탄소 상 팔라듐(0.3g)과 수소를 첨가한 후, 상온 상압에서 4시간 교반하여 반응시켰다. 그런 다음 탄소 상 팔라듐을 여과하고 메탄올로 세척한 후, 여과액과 세척액을 합하여 감압을 통해 용매를 증발시켜 중간체6을 수득하였다(2.38g의 백색 고체, 수율 95.2%).
7) 중간체7의 합성
250ml 1구 플라스크에 중간체6(2.38g,3.4mmol)과 EMC-6Peg-OSu(2.4g,4.08mmol)를 넣고 DMF(30ml)를 첨가하여 용해한 후 50℃로 가열하여 6시간 반응시켰다. 그런 다음 감압 증류 회전시켜 용매를 제거하고 수득한 미정제 생성물을 메탄올에 용해시킨 후, 역상 HPLC로 정제해 중간체7을 수득하였다(2.5g, 수율 63.2%).
8) 중간체8의 합성
중간체7(1.00g, 0.852 mmol)을 DCM(20 mL)에 용해하고 실온에서 트리플루오로아세트산(10ml)을 적하한 후 2시간 동안 교반하여 반응시켰다. 그런 다음 HPLC로 반응액에서 중간체1의 반응이 완료된 것을 확인한 후, 감압 증류 회전시켜 용매를 제거하고, 수득한 미정제 생성물을 메틸 삼차 부틸 에테르에 2회 세척한 후, 고체를 메틴올에 용해시키고 역상 HPLC로 정제해 중간체8을 수득하였다(721mg의 백색 고체, 수율 96.8%).
9) 최종 화합물 QHL-096-DOX의 합성
100mL 플라스크에 염산 독소루비신 63mg(1.0 eq), 중간체8 95mg(1 eq), DEPBT 39mg(1.2 eq), DMF 10mL를 넣고 질소 기류 하에서 반응 혼합물에 DIPEA 60ul(3eq)를 첨가한 후, 실온에서 4시간 반응시켰다. 그런 다음 감압하여 용매를 증발시키고, 미정제 생성물을 메탄올에 용해시켜 역상 HPLC로 QHL-096-DOX를 수득하였다(52mg의 적색 고체, 수율 34.2%). 7) 중간체7의 합성
중간체6(1.00g, 1.46 mmol)을 DCM(20 mL)에 용해하고 실온에서 트리플루오로아세트산(10ml)을 적하한 후 2시간 동안 교반하여 반응시켰다. 그런 다음 HPLC로 반응액에서 중간체1의 반응이 완료된 것을 확인한 후, 감압 증류 회전시켜 용매를 제거하고, 수득한 미정제 생성물을 메틸 삼차 부틸 에테르에 2회 세척한 후, 고체를 메틴올에 용해시키고 역상 HPLC로 정제해 중간체7을 수득하였다(546mg의 백색 고체, 수율 96.8%).
실시 예9: QHL-117-DOX의 합성
QHL-117의 합성 경로는 다음과 같다:
Figure pct00046
Figure pct00047
1) 중간체1의 합성
N-벤질옥시카르보닐-L-알라닌(100g, 0.45mol)을 건조한 N,N-디메틸포름아미드(3L)에 용해하고, 교반하면서 1-하이드록시벤조트리아졸(72.6g, 0.54mol)과 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디아미드 하이드로클로라이드(103.3g, 0.54mol)를 첨가하고, 1시간 동안 교반하여 반응시켰다. 그런 다음 얼음 수욕조에서 0℃로 냉각시키고, L-알라닌 메틸 에스테르(46.2g, 0.45mol)와 N,N-디이소프로필에틸아민(173.8g, 1.34mol)의 N,N-디메틸포름아미드(1L) 용액을 적하한 후, 실온에서 10시간 교반하였다. 그런 다음 감압하여 용매를 증발시키고, 수득한 미정제 생성물을 디클로로메탄(2L)에 용해시킨 후 염화암모늄 포화 용액, 물과 염화나트륨 포화 용액에 차례로 세척하고, 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후 감압하여 용매를 증발시켰다. 수득한 미정제 생성물을 아세트산에틸/석유에테르로 재결정하고 정제하여 중간체1을 수득하였다(101g의 백색 고체, 수율 73.1%).
2) 중간체2의 합성
중간체1(100g, 0.34mol)을 테트라하이드로퓨란(2L)과 물(1L)의 혼합 용액에 용해시키고 0℃로 냉각시킨 후, 수산화 리튬 1 mol/L 용액(400mL)을 적하하고 10시간 동안 교반하여 반응시켰다. 그런 다음 농염산을 pH<6으로 중화시켜 적하하고 감압하여 테트라하이드로퓨란을 증발시켰으며, 잔여 수상을 디클로로메탄(1L x 3)으로 추출하고, 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조시킨 후 감압하고 증발시켜 중간체2를 수득하였다(88g의 백색 고체, 수율 92.2%).
3) 중간체3의 합성
3구 플라스크에서 L-류신 t-부틸 에스테르(22.4g, 0.1mol), N-Fmoc-N'-트리틸 아스파라긴(59.6g, 0.1mol)을 N,N-디메틸포름아미드(1000mL)로 용해하고, 교반하면서 1-하이드록시벤조트리아졸(14.85g, 0.11mol)과 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디아미드 하이드로클로라이드(23g, 0..12mol)를 첨가한 후 얼음 수욕조에서 0℃로 냉각시켰다. 그런 다음 N,N-디이소프로필에틸아민(25.8g, 0.2mol)을 첨가하고 10시간 교반한 후 감압하여 용매를 증발시켰다. 수득한 미정제 생성물을 클로로포름(1000ml)에 용해시키고, 염화암모늄 포화 용액, 염화나트륨 포화 용액 및 물에 차례로 세척하고, 유기상을 무수 황산나트륨으로 건조하고 여과한 후 감압하여 용매를 증발시켰다. 수득한 미정제 생성물을 재결정하고(체적 비율에 따라 디클로로메탄:아세트산에틸=1:1) 정제하여 중간체3을 수득하였다(42.4g의 백색 고체, 수율 55.4%).
4) 중간체4의 합성
중간체3(7.65g, 0.01mol)을 디클로로메탄(100mL)과 N,N-디메틸포름아미드(100mL)의 혼합 용액에 용해하고, 피페리딘(40ml)을 첨가하여 실온에서 5시간 교반한 후 감압하여 용매를 증발시켰다. 그런 다음 진공 건조기에서 고진공으로 건조시켜 소량의 피페리딘을 제거하여 담황색의 고체인 중간체4를 수득하였으며, 정제하지 않은 상태로 다음 단계에 사용하였다.
5) 중간체5의 합성
상기 단계에서 수득한 중간체4 미정제 생성물을 N,N-디메틸포름아미드(200mL)에 용해하고, 중간체2(2.94g, 0.012mol), O-벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸 유로니움 헥사플루오로 포스페이트(HBTU)(6.07g, 0.016mol)를 첨가한 후, 얼음 수욕조에서 0℃로 냉각하였다. 그런 다음 N,N-디이소프로필에틸아민(2.6g, 0.02mol)을 첨가하고 실온에서 밤새 교반한 후 감압하여 용매를 증발시켰다. 잔여물은 클로로포름(100ml)에 용해하고, 염화암모늄 포화 용액, 염화나트륨 포화 용액에 차례로 세척한 후, 무수 황산나트륨으로 건조하고 여과하여 용매를 증발시켰다. 수득한 미정제 생성물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하여 중간체5를 수득하였다(3.1g의 백색 고체, 2단계 총 수율 37.8%).
6) 중간체6의 합성
Cbz-AAN(trt)-L-Otbu(3.00g, 3.65mmol)을 메탄올(100mL)에 용해하고,10%의 탄소 상 팔라듐(0.3g)과 수소를 첨가한 후, 상온 상압에서 4시간 교반하여 반응시켰다. 그런 다음 탄소 상 팔라듐을 여과하고 메탄올로 세척한 후, 여과액과 세척액을 합하여 감압을 통해 용매를 증발시켜 중간체6을 수득하였다(2.38g의 백색 고체, 수율 95.2%).
7) 중간체7의 합성
깨끗하고 건조한 250ml 1구 플라스크에 THF 15ml, (2.387g, 3.4mmol) 중간체6, DEPBT 1.35g을 차례로 넣고 실온에서 10분간 반응시킨 후, (1.3g, 3.4mmol) EMC-Glu(OAll)-COOH를 첨가하고 질소 기류 하 실온에서 15분간 반응시켰다. 그런 다음 DIPEA 1.8ml를 적하하고 질소 기류 하 실온에서 3시간 반응시킨 후 감압하여 용매를 증발시키고, 물을 첨가해 2-3회 교반하고 여과하여 담황색 고체 700mg을 수득한 후, 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 순도 63.2%의 화합물 2.2g을 수득하였다(수율 63.2%).
8) 중간체8의 합성
중간체7(1.53g, 1.46 mmol)을 DCM(20 mL)에 용해하고 실온에서 트리플루오로아세트산(10ml)을 적하한 후 2시간 동안 교반하여 반응시켰다. 그런 다음 HPLC로 반응액에서 중간체1의 반응이 완료된 것을 확인한 후, 감압 증류 회전시켜 용매를 제거하고, 수득한 미정제 생성물을 메틸 삼차 부틸 에테르에 2회 세척한 후, 고체를 메틴올에 용해시키고 역상 HPLC로 정제해 중간체8을 수득하였다(928mg의 백색 고체, 수율 84.8%).
9) 중간체9의 합성
100mL 플라스크에 염산 독소루비신 510.4mg(1.0 eq, 0.88mmol), 중간체8 659mg(1.0 eq, 0.88mmol)을 넣고 질소 기류 하 실온에서 15분간 반응시켰다. 그런 다음 DIPEA 78μl를 적하하고 실온에서 4시간 반응시킨 후 감압하여 용매를 증발시키고, 미정제 생성물을 메탄올에 용해시켜 역상 HPLC로 중간체9를 수득하였다(258mg의 적색 고체, 수율 23.8%). 10) 최종 화합물의 합성
100mL 플라스크에 THF 15ml, 중간체9(258mg, 0.202mmol), 트리부틸틴 하이드라이드(175.7mg, 0.606mmol)를 차례로 넣고 반응 용액을 질소로 포화시켰다. 그런 다음 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(32.7mg, 0.028mmol)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. TLC로 전환 완료를 확인하였다. 그런 다음 플라스크의 내용물을 규조토로 여과하고 잔여물은 THF로 세척하였다. 여과액은 감압하여 농축시켰다. 수득한 미정제 생성물을 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 목표 화합물 224mg을 수득하였다(수율 90％).
하기 표1의 기타 화합물은 실시 예 1-2, 4-9와 유사한 방법을 사용하고 다른 MI, S, C, A 및 D 부분을 사용하여 제조한 후 수득하였다.
질량 분석법(MS)으로 이 화합물들을 검증하였으며 그 분자량을 표1에 기재하였다. 이 분자량은 구조에 기반해 계산한 분자량과 일치하였다.
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
Figure pct00055
Figure pct00056
본 발명은 하기 대조 화합물도 제공하며 그 구조식은 다음과 같다:
화합물 C1: Doxorubicin
Figure pct00057
화합물 C2: AANL-DOX
Figure pct00058
화합물 C3: EMC-AANL-DOX
Figure pct00059
화합물 C4: Peg-AANL-DOX
Figure pct00060
실시 예 10: 인혈청 알부민과 결합한 HSA-EMC-AANL-DOX, HSA-QHL-087- DOX 및 HSA-QHL-087-N-CBP 약물의 제조
EMC-AANL-DOX, QHL-087-DOX 및 QHL-087-N-CBP의 제조에서 EMC-AANL-DOX는 DMSO로 용해하고, QHL-087-DOX와 QHL-087-N-CBP는 무균수로 용해하였다. HSA는 무균수로 용해하였다. 화합물과 HSA를 3:1(4.8 umol/mL, 1.6 umol/mL)로 결합한 후 37℃ 수욕조에서 3시간 반응시켜 반응액을 추출하고, 가압 한외 여과막을 이용해 결합하지 않은 화합물을 걸러내고, 생리 식염수로 희석한 후 3회 여과시켜 반제품을 수득하였다. DEAE 이온 교환, 겔 여과 및 수산화인회석 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 방법을 사용하여 인혈청 알부민과 결합한 아드리아마이신 항종양 약물을 분리하였다. 반제품은 즉시 분주, 냉동, 동결 건조하였다. 제품의 동결 건조 공정은 기계의 성능 특성에 따라 정할 수 있지만 제품의 제조 품질과 보존 품질이 요구에 부합해야 한다. 실험에서 다양한 비율, 다양한 시간을 적용해 레구비신과 HSA 결합 상태를 비교한 결과 EMC-AANL-DOX, QHL-087-DOX 및 QHL-087-N-CBP를 HSA와 3:1로 결합하고 37℃ 수욕조에서 3시간 결합시켰을 때 HSA 결합률은 각각 62%, 99.6% 및 99.7%로 나타났다.
실시 예 11: 화학적으로 변경된 링커를 선택해 최적화된 활성화 효율 획득
Legumain을 통해 분해되는 천연 펩타이드 서열 링커와 비교해 S-C-A는 화학적으로 변경된 링커로 높은 활성화 효율을 보였다. C가 AAN을 선택할 때의 활성화는 다양한 S-C-A 링커와 대조 링커의 활성화를 평가하여 측정하였다. S-C-A 접합체로 용해하고 10배로 희석해 0.1mM/ml의 농도가 되게 하였다. 37℃에서 1mg/ml 농도의 화합물 시료를 산성화된 인간 유방암(MDA-MB435) 종양 조직 균질액(pH6.0) 100μg에 첨가하였다. 종양 조직 균질액에서 방출된 효소를 HPLC로 측정하여 종양 조직의 링커에 대한 활성화 효율을 비교하였다. 그 결과를 표2-1, 2-2, 2-3 및 2-4에 기재하였다.
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Legumain을 통해 분해되는 천연 펩타이드 서열 링커와 비교해 D형 트리펩타이드의 활성화 효율에 대한 영향을 측정하였다. MI-S의 S1는 -CH2CH2-CONH-, S2: 2peg이다. 그 결과를 표2-4에 기재하였다.
Figure pct00065
표 데이터를 통해, S와 A는 높은 활성화 조건으로 설계되었고, 변수가 다른 트리펩타이드에서 아미노산 선택 및 원자 배열이 활성화 효율에 영향을 미쳤으며, 특히 D-Asn은 활성화 능력을 상실하게 했지만 기타 두 위치의 아미노산은 D-형으로 조정된 경우에도 활성화 능력을 지니는 것을 알 수 있었다.
실시 예 12: 바람직한 화합물의 효소 절단 동역학 속도 비교
C3, QHL-087-DOX, QHL-090-DOX, QHL-093-DOX, QHL-094-DOX, QHL-093-DOX 및 QHL-096-DOX의 시료 각 10mg에 적정량의 물을 첨가하여 4umol/mL의 시료 저장액을 준비하고, 물로 점차 희석하여 하기 표3의 시료 용액 농도를 만들고 다른 농도의 시료 용액 20ul를 선택해 Legumain 80ul를 첨가하였다. 37℃ 수욕조에서 2시간 동안 반응시킨 후, 10ul를 시료에 첨가하고 HPLC로 각 대응 산출물의 면적을 측정하고, 산출물의 선형 방정식에 따라 산출물의 농도를 계산하고 공식에 대입하면 대응하는 V를 얻을 수 있다:
V（umoL/mL/min）=C(umoL/mL)/120min
V-[C] 작도를 통해 절편 Km/Vmax와 직선 및 x축의 교점을 구할 수 있다. [C]는 각 기질의 농도, 즉 시료 용액 농도이며 단위는 umoL/mL이다.
Figure pct00066
실험 결과는 도3과 같이 다른 구조가 일치하는 조건에서 QHL-087의 2PEG기가 활성화 효율을 크게 높였으며, PEG 수량이 증가함에 따라 오히려 효율이 저하되었다. 6PEG기가 연결된 동일 조건을 비교하면, H2PABC-NH2H2가 leu보다 활성화 효율이 훨씬 높았다.
실시 예 13:
생쥐의 비장 및 CD8+ T세포의 분리 및 배양, 생쥐 골수 단핵 세포의 분리 및 M2 대식 세포의 분화 유도
1. 생쥐의 비장 세포 분리
1) C57BL/6 생쥐의 비장을 40uM 여과망을 배치한 배양 접시(얼음 수욕조)에 놓고 약 10mL의 생리 식염수를 넣어준 후 무균 주사기 코어로 가볍게 연마하였다.
2) 연마 후의 세포 현탁액을 50mL 원심분리관에 담고 약 5mL의 생리 식염수로 배양 접시를 세척한 후 50mL 원심분리관에 넣어 병합하였다.
3) 세포 현탁액을 1000r/mi로 10분간 원심 분리한 후 상청액을 버리고 적당량의 생리 식염수로 재현탁한 후 3배 체적의 염화암모늄 적혈구 분해액을 넣은 후 골고루 두드렸다. 얼음 위에서 약 10분간 분해한 후 약 10mL의 생리 식염수를 넣어 분해를 중지시키고 1000r/min로 5분간 원심 분리하였다.
4) 원심 분리 후 상청액을 버리고 10mL의 생리 식염수를 넣어 피펫팅한 후 1000 r/min로 5분간 원심 분리하였으며, 이 작업을 1회 반복한 다음, 세포를 10% RMPI 1640 배지에 재현탁하여 후속 배양에 사용하거나 0.5%BSA에서 후속 T세포 선별을 진행하였다.
2. CD8+ T세포 선별
상기 분리에서 얻은 생쥐 비장 세포를 1E8/mL에 재현탁하고, 1E8 세포마다 100ul Miltenyi biotec CD8a(Ly-2) microBeads를 넣고 고르게 혼합하여 4도 차광 상태에서 15분간 배양하였다. 그런 다음 5-10배 체적의 PBS를 첨가하고 충분히 섞어 세척한 후 300g을 5분간 원심 분리한 후 상청액을 제거하고 세척 작업을 1회 중복하였다. 세포를 2E8/mL 재현탁하고 세포 현탁액을 자석판 위의 LS 컬럼(LS 컬럼은 먼저 완충액(pH7.2 PBS + 0.5%BSA + 2mM EDTA)으로 세척하여 평형시킴)에 배치한 후 세포 현탁액이 LS 컬럼을 천천히 흐르게 하고 CD8+ T세포가 LS 컬럼의 자석 입자에 결합하면 3배 체적의 세포 현탁액 세척 완충액으로 LS 컬럼을 세척하고, 세척 완료 후 LS 컬럼을 자석판에서 떼어내 15mL 원심 분리관에 넣고, LS 컬럼에 5mL 세척 완충액을 첨가한 후 LS 컬럼 코어로 LS에 결합된 세포를 신속하게 압출하여 원심 분리관에 넣어, 컬럼을 통과한 모든 세포를 수집하고 세포를 원심 분리하였다. 상청액을 제거하고 세척 완충액으로 한 번 더 세척한 후 적당한 체적의 10% RMPI1640 배지에 재현탁하여 세포 수를 세어 준비하였다.
3. CD8+ T 양성 세포의 활성화 및 증폭
A. CD3/CD28 자석 컬럼의 세척: a. 작은 관 안의 면역 자성 비즈를 흔들어 부유시켰다(30초 이상 와류 또는 5분간 비스듬히 회전). b. 필요한 양의 면역 자성 비즈를 1.5ml 시험관에 넣고 혈청이 포함된 1640 1ml를 첨가하고 30초 이상 와류 또는 5분 이상 회전시켜 현탁시켰다.
B. T세포의 활성화: a. 적합한 개수의 세포를 배양판에 분주하였다(6웰 배양판의 경우 1E6/ml, 배양액 2ml, T세포 밀도 2E6/ml 유지, 2E6/ml를 초과할 수 없음). b. 선택한 자성 비즈를 자성 비즈:세포(수량비)=1:1로 첨가하였다. c. 배양기에서 3일간 배양하였다.
C. 증폭: 3일 이내에는 배양액을 교체할 필요가 없으며, 3일 차에 30U/mlIL-2(실제 상황에 맞게 적당량 증가 가능)을 추가하고 배지를 교체하였다(48시간 후 세포 수량이 약 1배 증식하였으며, 세포 크기와 형태를 실시간 모니터링하였다). b. 4-5일 자극 후 자성 비즈를 제거하고(과도한 활성화 방지) 세포를 상하로 5-10회 이동하고 기포가 생기지 않도록 천천히 조작하여 세포와 자성 비즈를 분리하였다. 세포를 1.5ml 시험관에 수집하여 자성체 위에 1분간 놓아두어 자성 비즈가 시험관벽에 흡착하면 세포를 다른 시험관으로 옮겨 최대한 자성 비즈를 제거하였다. 자성 비즈를 제거한 세포는 30U/mlIL-2(실제 상황에 맞게 적당량 증가 가능)의 배지에서 계속 배양하고 상태, 증식 및 활력을 모니터링하였다.
4. 생쥐 골수 단핵 세포 분리 및 M2 대식 세포의 분화 유도
무균 조건에서 C57BL/6 생쥐 2마리의 양측 대퇴골과 경골을 채취하고 클린 벤치에서 골간단을 잘라낸 후, 5 mL 무균 주사기로 추출한 무혈청 MEM 배양액으로 골수강을 4회 반복해서 가볍게 세척하였다. 수집한 모든 세포 현탁액을 1000 r/min로 10분간 원심 분리한 후 상청액을 버리고 침전된 세포를 적당 체적의 무혈청 MEM 배양액으로 재현탁시킨 후, 피펫팅으로 고르게 분산시키고 40uM 여과망으로 여과하였다. 여기에 3배 체적의 적혈구 분해액을 넣고 얼음 위에서 10분간 분해시킨 후, 1000 r/min로 5분간 원심 분리하여 상청액을 버리고 침전된 세포를 무혈청 MEM 배지로 2회 세척하여 침전된 세포를 수집하였다. 10%의 FBS, 1% PS가 포함된 MEM 완전 배양액으로 세포를 재현탁시켜 세포 수를 계산하고 후속 분화시켰다. 100uL, 세포 20000개/웰을 96 웰 세포 배양판에 분주하고 배양액에 100ng M-CSF을 첨가하여 M2 대식 세포분화에 사용하였다. 37℃의 5% CO2 배양기에서 정치 배양하여 7일간 분화를 유도하며 세포 형태를 관찰하였다. 유도된 세포 형태는 도4와 같으며, M2 대식 세포와 단핵 세포, DC 및 GM-대식 세포의 차이를 통해 M2 대식 세포를 확인하였다.
실시 예 14: MTT법으로 약물의 세포 성장에 대한 억제 작용 측정
실시 예 13의 세포 수 계산 후 배지로 세포 농도를 조절하고 96웰 배양판에 분주하였다. 각 웰에는 세포 현탁액 100μl를 분주했으며, CD8+ T세포의 분주 농도는 세포 100000개/웰, M2 대식 세포의 분주 농도는 세포 20000개/웰이었다. 96웰 배양판을 37℃의 이산화탄소(5%) 배양기에 넣고 24시간 배양하였다. 24시간 후 96웰 배양판에 다른 농도의 약물이 포함된 세포 배양액 100ul를 분주한 그룹, 약물을 첨가하지 않고 해당 약물의 용매만 분주한 대조 그룹(0.1%DMSO), 세포 없이 배지만 분주한 블랭크(Blank) 그룹을 배치하였다. 각 그룹을 3개의 평행 웰에 배치한 후 배양판을 37℃의 이산화탄소(5%) 배양기에 넣고 48시간 배양하였다. 48시간 후 각 웰에 MTT 20μl(농도 5 mg/ml)를 첨가한 후 4시간 배양하였다. 그런 다음 배양액을 뽑아내고 용해 용매로 DMSO 150μl를 첨가하여 용해한 후 효소 면역 측정기로 490nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포의 생존율과 약물이 세포를 절반으로 억제하는 농도를 계산하였다. 세포 생존율% = (OD 시험 - OD 블랭크 대조) / (OD 시험 대조 - OD 블랭크 대조) * 100%. 생존율(%)은 Excel 프로그램으로 계산하고, Prism 5 프로그램으로 세포에 대한 약물 용량-반응 곡선을 그렸다. 각 지표는 평균값을 나타내며 변이 계수(CV)는 데이터의 일관성을 평가한다.
상기 실험 방법의 시험 개략도 및 세포에 대한 약물 농도 설정에 따라 측정 대상 약물의 최대 시작 농도를 14uM로 설정하고 1:3의 비율로 점진적으로 희석하여 9개의 용량군(각 군 3개 중복)을 만들고 약물을 포함한 웰의 약물 용매(DMSO) 농도는 모두 0.1%로 제어하였다. 약물 용매(0.1%DMSO)만 첨가한 그룹을 시험 대조군(Control), 세포를 포함하지 않고 배지만 첨가한 그룹은 블랭크군(Blank)으로 하여, 하기 방법으로 각 용량군의 대조군(Control) 대비 종양 세포 생존율(%)을 계산하였다.
각 용량군의 세포 생존율(%) = (OD 용량군 - OD 블랭크군) / (OD 0.1% DMSO - OD 블랭크군) * 100%
실험 결과는 도5, 도6과 같다. 다른 구조가 일치하는 조건에서 C3(즉, EMC-AANL-DOX) 대비 QHL-087-DOX는 M2 대식 세포에 대한 세포 독성이 매우 높고 CD8+ T세포에 대한 독성은 약하여 면역 억제 세포에 대한 선택성을 보여주었다.
실시 예 15: 본 발명 약물들의 M2 대식 세포에 대한 세포 독성 선별
실시 예 14의 방법에 따라 M2 대식 세포 억제에 대해 일부 화합물의 세포 독성 선별 실험을 실시하였다. 각 약물은 3웰을 검측했으며 각 웰에는 하기 약물 10uM를 첨가하여 약물을 포함하지 않은 웰 대비 억제율을 측정하였다. 실험 결과는 표4와 같다.
실시 예 16: 본 발명의 실시 예에서 제조한 수용성 고효율 표적 활성화 아드리아마이신 유도체 등과 대조 화합물의 수용성 비교
본 발명의 실시 예에 따라 제조한 상기 화합물과 참조 화합물 C1, C2, C3, C4를 동결 건조한다(-70℃). 화합물을 다양한 농도의 물에 용해하고 관찰 및 HPLC 측정(> 95％)을 통해 그 수용성을 검사하였다. 그 결과는 표4와 같다.
표4: 약물의 수용성 시험 데이터 및 M2 대식 세포 억제율 선별
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
Figure pct00071
Figure pct00072
Figure pct00073
Figure pct00074
Figure pct00075
시험 결과 다른 구조가 일치하는 조건에서 2peg기는 수용성을 크게 높여 물에 용해되지 않는 것을 수용성으로 변화시켰으며 PEG 수가 증가함에 따라 용해성도 높아졌다. PEG 연결이 동일한 조건에서 Glu와 Asp를 증가시켰을 때 수용성이 높아졌다. 기의 변화로 접합 약물의 수용성이 변했으며 이는 약물의 혈관막 및 종양 세포막에 대한 투과성에 거대한 영향을 미쳐 치료 약효에 영향을 미친다. 화합물의 수용성 증가는 약물의 개발 가능성과 접합 약물의 생산에 필수적인 조건이다.
실시 예 17: C3, QHL-085-DOX, QHL-087-DOX, QHL-091-DOX, QHL-094-DOX 주사제의 누드 마우스 HT1080 모델에서의 약효 연구
실험 목적: 생쥐 모델을 통해 종양 치료 과정에서 C3, QHL-085-DOX, QHL-087-DOX, QHL-091-DOX 및 QHL-94-DOX의 항종양 약효를 조사한다.
시험 약물: C3, QHL-085-DOX, QHL-087-DOX, QHL-091-DOX 및 QHL-094-DOX의 주사제. 실험 시 생리 식염수를 사용해 해당 농도로 희석하였다.
방법 및 결과:
1. 동물: 6-8주령의 누드 마우스 수컷.
2. 종양 모델의 제조
1) ATCC에서 HT1080 세포를 구매하여 ATCC에서 제공한 설명서에 따라 감정하였다. 세포는 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM을 배지로 하여 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 3일 간격으로 계대 배양하고 15회 이내의 계대 배양 세포를 사용하였다.
2) 종양의 생성: 5×106의 HT1080 세포를 누드 마우스의 등에 피하주사하였다. 종양 크기가 100mm3가 되었을 때 무작위로 치료군을 나누었다. 그런 다음 치료를 시작하였으며, 치료를 시작한 날을 1일 차로 기록하였다.
3) 치료 과정
C3, QHL-085-DOX, QHL-087-DOX, QHL-091-DOX 및 QHL-094-DOX의 임상 응용에 근거하여 약물 (IV)를 정맥 주사하였다. C3, QHL-085-DOX, QHL-087-DOX, QHL-091-DOX 및 QHL-094-DOX를 저용량과 동일 용량 18umol/kg로 각각 투여하였다. 대조군에는 생리 식염수를 투여하였다. 3주간 매주 1회 투약하였다.
4) 결과 및 검토: 각 군별 실험 결과는 도 7과 같다. 저용량 치료군 대비 4peg와 2peg군의 종양 억제 효과는 순차적으로 증가하였다.
실시 예 18: C1, C2, C3, QHL-086-DOX, QHL-092-DOX, QHL-095-DOX, QHL-087-DOX, QHL-010-DOX, QHL-117-DOX 주사제의 누드 마우스 HT1080 모델에서의 약효 연구
실험 목적: 생쥐 모델을 통해 종양 치료 과정에서 상기 화합물의 항종양 약효를 조사한다.
시험 약물: C1, C2, C3 및 해당 화합물의 주사제. 실험 시 생리 식염수를 사용해 해당 농도로 희석하였다.
방법 및 결과:
1. 동물: 6-8주령의 누드 마우스 수컷.
2. 종양 모델의 제조
1) ATCC에서 HT1080 세포를 구매하여 ATCC에서 제공한 설명서에 따라 감정하였다. 세포는 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM을 배지로 하여 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 3일 간격으로 계대 배양하고 15회 이내의 계대 배양 세포를 사용하였다.
2) 종양의 생성: 5×106의 HT1080 세포를 누드 마우스의 등에 피하주사하였다. 종양 크기가 100mm3가 되었을 때 무작위로 치료군을 나누었다. 그런 다음 치료를 시작하였으며, 치료를 시작한 날을 1일 차로 기록하였다.
3) 치료 과정
해당 화합물의 임상 응용에 근거하여 약물 (IV)를 정맥 주사하였다. 표에 기재된 화합물을 저용량과 동일 용량 36umol/kg로 투여하였다. 대조군에는 생리 식염수를 투여하였다. 3주간 매주 1회 투약하였다.
5) 각 군별 실험 결과는 표5와 같다.
표5: C1, C2, C3 및 본 발명의 일부 화합물과 마이토마이신의 누드 마우스 치료 효과
Figure pct00076
5) 결과 및 검토: 표5와 같이 AANL-DOX 치료군 대비 QHL-086-DOX, QHL-092-DOX, QHL-095-DOX, QHL-087-DOX, QHL-010-DOX, QHL-117-DOX의 고용량 치료군은 종양의 성장을 효과적으로 억제하여 종양이 소실되는 완치 효과를 달성하였다.
실시 예 19: QHL-087-DOX 및 EMC-AANL-DOX의 간 원위 이식 CT26 종양에서의 조직 분포 연구
실험 목적: 간 종양 활성 약물의 조직분포를 연구한다.
실험 동물: 6-8주령의 BALB/c 생쥐 암컷.
종양 모델 제조:
1） ATCC에서 CT26 세포를 구매하여 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM을 배지로 하여 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 3일 간격으로 계대 배양하고 15회 이내의 계대 배양 세포를 사용하였다.
2） 종양의 생성: 5×106의 CT26 세포를 누드 마우스의 등에 피하주사하였다. 종양 크기가 800-1000mm3가 되었을 때 무작위로 치료군을 나누었다. 그런 다음 종양 조직을 추출하고 100mm3의 종양 조직을 잘라 BALB/c 생쥐 간에 이식하였다.
3） 투약 과정: 14일 후 이식한 간 종양이 커졌을 때 간 종양을 이식한 생쥐 36마리의 치료군에 약물 치료를 진행하였다. 그런 다음 1, 6, 12, 24, 36, 72시간 후 각기 다른 조직을 추출해 각 조직에 방출된 아드리아마이신의 농도를 검출하였다. 산출된 AUClast h * nmol/g, 평균값과 SEM은 도8, 도9와 같다.
4) 결과 및 검토: 도8, 도9에 나타난 것과 같이 QHL-087-DOX와 EMC-AANL-DOX의 활성 아드리아마이신은 간과 간 종양에 주로 분포하였다. 앞서 EMC-AANL-DOX는 유방암 치료용으로 발표된 바 있으며, 추가 연구를 통해 QHL-087-DOX는 더 많은 약물을 간으로 전달하는 특성이 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서 간 종양의 활성화로 인해 아드리아마이신의 노출량이 훨씬 높게 나타났다. EMC-AANL-DOX에 비해 QHL-087-DOX는 간암에 대한 약물 전달 및 활성화, 아드리아마이신의 노출량이 높았다.
실시 예 20: 원위 간 이식 CT26 종양에서 QHL-087-DOX의 약효 연구
실험 목적: QHL-087-DOX, PD-1 및 그 조합의 간 이식 CT26 종양에서의 치료 효과를 연구한다.
시험 약물: QHL-087-DOX 18μmol/kg, 생쥐 PD-1 5mg/kg.
동물: 6-8주령의 BALB/c 생쥐 암컷.
1） 종양 모델의 제조: ATCC에서 구매한 CT26 종양 세포를 10％ 우태아 혈청이 포함된 DMEM을 배지로 하여 37°C, 5％CO2에서 배양하였다. 3일 간격으로 세포를 계대 배양하고 15회 이내의 계대 배양 세포를 사용하였다. 5×105 CT26 암 세포를 누드 마우스의 등에 피하주사하였다. 종양 크기가 800-1000mm3이 되면 무작위로 치료군을 나누었다. 그런 다음 종양 조직을 추출하고 100mm3의 종양 조직을 잘라 BALB/c 생쥐 간에 이식하였다. 1주 후 이식한 간 종양이 커졌을 때 간 종양을 이식한 생쥐를 무작위로 치료군을 나누었다.
2） 치료 과정: 각 치료군의 생쥐 6마리를 약물 치료하였다. 치료를 시작한 날이 1일 차이다. QHL-087-DOX의 임상 응용에 근거하여 3주간 매주 1회 (IV) 약물을 정맥 주사하였다. 3주간 매주 2회 (IV) 생쥐 PD-1 항체를 정맥 주사하였다. 각 군별 실험 결과는 도10과 같다.
3) 결과 및 검토: QHL-087-DOX와 PD-1의 병용 치료가 간 원위 종양에 대한 면역 시너지 효과가 있다는 것을 처음으로 발견하였으며, QHL-087-DOX와 PD-1의 병용 치료가 QHL-087-DOX 단일 요법보다 치료 효과가 뛰어나고 면역 치료의 특성을 지닌다는 것도 발견하였다.
실시 예 21: EMC-AANL-DOX(레구비신, legubicin), 렌바티닙 및 PD-1의 원위 간암에 대한 병용 치료 효과
실험 목적: 원위 간암에 대한 EMC-AANL-DOX, 렌바티닙 및 PD-1의 병용 치료 효과.
시험 약물: EMC-AANL-DOX 18μmol/kg, 생쥐 PD-1 5mg/kg.
동물: 6-8주령의 BALB/c 생쥐 암컷.
종양 모델의 제조: ATCC에서 구매한 CT26 종양 세포를 10％ 우태아 혈청이 포함된 DMEM을 배지로 하여 37°C, 5％CO2에서 배양하였다. 3일 간격으로 세포를 계대 배양하고 15회 이내의 계대 배양 세포를 사용하였다. 5×105 CT26 암 세포를 누드 마우스의 등에 피하주사하였다. 종양 크기가 800-1000mm3이 되면 무작위로 치료군을 나누었다. 그런 다음 종양 조직을 추출하고 100mm3의 종양 조직을 잘라 BALB/c 생쥐 간에 이식하였다. 1주 후 이식한 간 종양이 커졌을 때 간 종양을 이식한 생쥐를 무작위로 치료군을 나누었다.
치료 과정: 각 치료군의 생쥐 6마리를 약물 치료하였다. 치료를 시작한 날이 1일 차이다. EMC-AANL-DOX의 임상 응용에 근거하여 3주간 매주 1회 (IV) 약물을 정맥 주사하였다. 3주간 매주 2회 (IV) 생쥐 PD-1 항체를 정맥 주사하였다. 각 군별 실험 결과는 도11과 같다.
결과 및 검토: 간 원위 종양에 대한 EMC-AANL-DOX와 PD-1의 병용 치료가 렌바티닙과 PD-1의 병용 치료보다 효과가 뛰어나다는 것을 처음으로 발견하였으며, EMC-AANL-DOX와 렌바티닙의 병용 치료가 각기 단약을 사용한 단일 요법보다 치료 효과가 뛰어나다는 것도 발견하였다.
실시 예 22: 누드 마우스 간암 HepG2 세포에 대한 본 발명 일부 화합물 주사액의 치료 효과 연구
실험 목적: 생쥐 종양 치료 모델에서 본 발명 일부 화합물의 항종양 효과를 연구한다.
시험 약물: 표에 기재된 해당 화합물의 주사제와 대조군의 주사제. 실험 시 생리 식염수를 사용해 해당 농도로 희석하였다.
방법 및 결과:
1. 실험 동물: 6-8주령의 누드 마우스 수컷.
2. 종양 모델의 제조
1) ATCC에서 인간 간암 HepG2 세포를 구매하여 ATCC에서 제공한 설명서에 따라 감정하였다. 세포는 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM을 배지로 하여 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 3일 간격으로 계대 배양하고 15회 이내의 계대 배양 세포를 사용하였다.
2) 종양의 생성: 5×106의 HepG2 세포를 누드 마우스의 등에 피하주사하였다. 종양 크기가 100mm3가 되었을 때 무작위로 치료군을 나누었다. 그런 다음 치료를 시작하였으며, 치료를 시작한 날을 1일 차로 기록하였다.
3) 치료 과정
해당 화합물의 임상 응용에 근거하여 약물 (IV)를 정맥 주사하였다. 화합물과 대조군 약물을 54umol/kg의 용량으로 투여하고, DOX는 독성 제한으로 인해 18umol/kg의 용량만 사용할 수 있다. 대조군에는 생리 식염수를 투여하였다. 4주간 매주 1회 투약하였다.
6） 각 군별 실험 결과는 표6와 같다.
표6: 본 발명의 일부 화합물과 대조군의 누드 마우스 종양 치료에 대한 영향
Figure pct00077
5） 결과 및 검토: 표6에 나타난 것과 같이 EMC-AANL-DOX는 간암에 좋은 작용을 하며, 본 발명의 바람직한 화합물을 EMC-AANL-DOX와 동일한 용량을 사용했을 때 종양 성장에 대한 치료 작용이 증가하였다.
실시 예 23: CT26 종양 면역 모델 치료에 대한 QHL-096-DOX, QHL-087-DOX, QHL-090-DOX, QHL-093-DOX, QHL-117-DOX의 약효 연구
실험 목적: CT26 종양 모델의 면역 치료에서 상기 화합물의 항종양 약효를 연구한다.
시험 약물: QHL-096-DOX, QHL-087-DOX, QHL-090-DOX, QHL-093-DOX, QHL-117-DOX 및 대조군, 용량 36umol/k, 생쥐 PD-1 항체, 5 mg/kg.
실험 동물: 6-8주령의 BALB/c 생쥐 암컷.
종양 모델 제조:
1) ATCC에서 CT26 세포를 구매하여 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM을 배지로 하여 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 3일 간격으로 계대 배양하고 15회 이내의 계대 배양 세포를 사용하였다.
2) 종양의 생성 5×106 해당 세포를 누드 마우스의 등에 피하주사하였다. 종양 크기가 100mm3 이상이 되면 무작위로 치료군을 나누었다. 그런 다음 치료를 시작하였으며, 치료를 시작한 날을 1일 차로 기록하였다.
3) 치료 과정 36umol/kg 용량의 약물을 투여하였다. 대조군에는 생리 식염수를 투여하였다. 3주간 매주 1회 투여하였다.
4) 종양 CD8+ T세포 분석. 종양 조직 균질액에서 종양의 각 세포를 여과하여 분리하고 완충액으로 2회 세척한 후, 실온에서 백혈구 공통 항원 CD45-PE와 CD8-FITC 표지의 항체를 1시간 배양하였다. 1％ 우태아 혈청을 포함한 인산염 완충액으로 세포를 2회 세척한 후 유세포 분석법으로 백혈구 공통 항원(CD45) 양성 세포 중 T-림프구 항원(CD8) 양성 세포의 비율을 분석하였다. 비율의 증가는 T-림프구의 증가를 나타내므로 동물의 종양에 대한 면역력이 개선되었음을 나타낸다.
4) 각 군별 실험 결과는 표7와 같다.
표7: 해당 화합물과 대조군의 종양 억제 및 면역 활성화에 대한 영향
Figure pct00078
5) 결과 및 검토: C3, QHL-096-DOX, QHL-087-DOX, QHL-090-DOX, QHL-093-DOX, QHL-117-DOX와 PD-1의 병용 요법은 단일 요법보다 치료 효과가 높으며 종양을 완치할 수 있었다. QHL-090-다브라페닙, QHL-090-다브라페닙과 PD-1 병용 요법도 치료 시너지 효과가 있었다.
실시 예 24: 다양한 종양 모델에서 QHL-087-DOX 주사액의 치료 효과 연구
실험 목적: 생쥐의 다양한 종양 모델에서 QHL-087의 항종양 스펙트럼을 연구한다.
시험 약물: QHL-087-DOX 주사제. 실험 시 생리 식염수를 사용해 해당 농도로 희석하였다.
방법 및 결과:
1. 동물: 6-8주령의 누드 마우스 수컷.
2. 종양 모델의 제조
1) ATCC(American Type Culture Collection)에서 해당 종양 세포를 구매하여 ATCC에서 제공한 지침에 따라 감정하였다. 10％ 우태아 혈청이 포함된 DMEM을 배지로 하여 37℃, 5％CO2에서 배양하였다. 3일 간격으로 세포를 계대 배양하고 15회 이내의 계대 배양 세포를 사용하였다.
2) 종양의 생성 5×106 해당 세포를 누드 마우스의 등에 피하주사하였다. 종양 크기가 100mm3 이상이 되면 무작위로 치료군을 나누었다. 그런 다음 치료를 시작하였으며, 치료를 시작한 날을 1일 차로 기록하였다.
3) 치료 과정 QHL-087-DOX의 임상 응용에 근거하여 QHL-087-DOX를 36umol/kg로 투여하였다. 대조군에는 생리 식염수를 투여하였다. 3주간 매주 1회 투여하였다.
4) 각 군별 실험 결과는 표8과 같다.
표8: 다양한 종양 모델에서 QHL-087-DOX의 치료 효과
Figure pct00079
5) 결과 및 검토: QHL-087-DOX은 다양한 종양 모델에서 뛰어난 치료 효과를 보이며 광범위한 항종양 스펙트럼을 지니고 있음을 보여주었다.
실시 예 25:HSA-EMC-AANL-DOX, HSA-QHL-087-DOX 및 HSA-QHL-087-N-CBP와 대조 화합물의 용해성 비교
본 발명의 실시 예에서 제조된 동결 건조품 EMC-AANL-DOX, HSA-EMC-AANL-DOX, HSA-QHL-087-DOX 및 HSA-QHL-087-N-CBP를 무균실에서 분주하고 주사용수로 재용해하였다. HSA-EMC-AANL-DOX, HSA-QHL-087-DOX 및 HSA-QHL-087-N-CBP는 표9와 같이 완전 용해될 수 있다.
Figure pct00080
표9에 나타난 것과 같이 인혈청 알부민이 화합물과 결합하면 용해성이 더욱 향상되어 HSA-EMC-AANL-DOX, HSA-QHL-087-DOX 및 HSA-QHL-087-N-CBP 등 고분자 단백질계 약물을 EMC-AANL-DOX 용해에 필요한 자극성 유기 용매를 사용하지 않고 주사용수 또는 생리 식염수를 사용해 고농도로 직접 용해할 수 있다. 물에 용해되지 않는EMC-AANL-DOX 소분자 화합물 약물과 달리 용해 특성의 변화는 약물의 분포 대사와 약물 작용 방식에 큰 영향을 미친다.
실시 예 26: 본 발명의 실시 예에서 제조한 수용성 고효율 표적 활성화 아드리아마이신 유도체와 대조 화합물의 용액 안정성 비교
화합물 EMC-AANL-DOX, HSA-EMC-AANL-DOX, QHL-087-DOX, HSA-QHL-087-DOX, QHL-087-N-CBP 및 HSA-QHL-087-N-CBP의 무게를 정확하게 재어 무균실에서 각 5.0mg의 시료에 0.5ml 멸균 주사용수를 첨가해 제조한 10mg/ml의 모액을 분주하였다. EMC-AANL-DOX의 용해에는 50%의 에틸알코올이 필요하다. 모액 30ul에 pH값 5.5의 다른 완충액 570ul를 추가하여 0.5mg/ml 시료 용액을 제조하였다. 시료가 침전되면 25℃/37℃의 수욕조에 넣고 8시간 정치시킨 후 HPLC와 전기 영동법으로 0시간 대비 함량을 측정하면 서로 다른 화합물의 용액 안정성 데이터를 얻을 수 있다. 그 결과는 표10와 같다.
Figure pct00081
상기 표의 데이터에서 알 수 있듯이, 25℃, pH=5.5 조건에서 알부민 결합 화합물은 안정성이 증가했으며, QHL-087-N-CBP와 HSA-QHL-087-N-CBP에서 더욱 두드러졌다.
실시 예 27: HSA-EMC-AANL-DOX, HSA-QHL-087-DOX 및 HSA-QHL-087-N-CBP 의 활성화 효율 실험
EMC-AANL-DOX는 용매(50% 주사용수+50%에틸알코올)로 용해하고, HSA-EMC-AANL-DOX, HSA-QHL-087-DOX 및 HSA-QHL-087-N-CBP는 주사용수로 용해하고 물로 10배 희석하여 1mg/ml의 농도가 되게 하였다. 본 발명의 실험에서는 37도 온도에서 산성화된 종양 조직의 균질액(pH6.0) 100μg에 1mg/ml의 화합물 시료를 첨가하여 종양 조직 균질액 중의 효소가 아드리아마이신을 방출하게 한 후, HPLC로 화합물의 감소와 아드리아마이신의 증가를 측정하여 종양 조직에서 약물의 활성화 효율을 비교하였으며, 선별을 통해 본 발명의 화합물 EMC-AANL-DOX, HSA-EMC-AANL-DOX, HSA-QHL-087-DOX 및 HSA-QHL-087-N-CBP의 연결이 선별된 화합물 중 활성화 효율이 가장 높은 것을 발견하였다. 그 결과는 표11와 같다.
표11: 다양한 종양 조직 균질액에서 EMC-AANL-DOX, HSA-EMC-AANL-DOX, HSA-QHL-087-DOX 및 HSA-QHL-087-N-CBP 화합물의 활성화 비율(%)
Figure pct00082
실시 예 28: EMC-AANL-DOX, HSA-EMC-AANL-DOX, QHL-087-DOX, HSA-QHL-087-DOX, QHL-087-N-CBP 및 HSA-QHL-087-N-CBP의 독성 측정
실험 목적: 생쥐에 대한 정맥 투여 MTD 측정 실험을 통해 본 발명 약물의 생물학적 급성 독성에 대해 이해한다.
시험 약물: EMC-AANL-DOX는 용매(50% 주사용수+50%에틸알코올)로 용해하고, HSA-EMC-AANL-DOX, QHL-087-DOX, HSA-QHL-087-DOX, QHL-087-N-CBP 및 HSA-QHL-087-N-CB는 주사용수로 용해하였으며, 실험 시 생리 식염수를 사용해 해당 농도로 희석하였다.
동물: BALB/C 생쥐(Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.,Ltd에서 구매), 체중 19-21g, 암컷.
방법 및 결과: 체중 19-21g의 BALB/C 생쥐 암컷 36마리를 체중에 따라 6마리씩 무작위로 7군으로 나누었다. 표12에 기재된 용량의 EMC-AANL-DOX, HSA-EMC-AANL-DOX, QHL-087-DOX, HSA-QHL-087-DOX, QHL-087-N-CBP 및 HSA-QHL-087-N-CBP을 해당 군에 1회 정맥 주사하였다. 생리 식염수군, 파클리탁셀군 주사액(시판, Youcare Pharmaceutical Group(北京惇康))의 대조 시험도 실시하여 각 생쥐에 0.2ml의 약을 투여하였다. 17일 동안 매일 동물의 털이 곤두서 있는지, 어수선하고 윤기가 없는지, 혼수상태인지, 등이 굽었는지, 과격한 반응을 보이는지 등을 관찰하고 체중과 사망을 기록하였다. 3, 5, 14일 차에 채혈하여 전혈구의 수를 세고, 14일 차에는 동물을 해부하여 심장, 간, 신장, 폐, 비장, 췌장의 HE 염색을 관찰하였다.
표12: 다른 용량의 화합물 주사액, 생리 식염수, 파클리탁셀 주사액을 투여받은 피험 생쥐의 사망률 결과 대조
Figure pct00083
결과 및 검토: 본 발명의 HSA-EMC-AANL-DOX, HSA-QHL-087-DOX 및 HSA-QHL-087-N-CBP를 주사했을 때 동물의 털이 곤두서거나, 어수선하고 윤기가 없거나, 혼수상태이거나, 등이 굽었거나, 과격한 반응을 보이거나 사망한 사례가 없었으며, 이는 알부민 결합 약물의 독성이 비결합 약물보다 현저하게 낮음을 나타낸다.
실시 예 29: HSA-EMC-AANL-DOX, HSA-QHL-087-DOX와 항PD-1 항체의 병용 치료 효과
실험 목적: EMC-AANL-DOX, HSA-QHL-087-DOX와 항PD-1 항체의 병용 치료 효과를 비교 연구한다.
시험 약물: HSA-EMC-AANL-DOX와 HSA-QHL-087-DOX, 각 용량 18μmol/kg, 생쥐 PD-1 항체 5mg/kg.
실험 동물: 6-8주령의 BALB/c 생쥐 암컷.
종양 모델 제조: ATCC에서 CT26 세포를 구매하여 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM을 배지로 하여 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 3일 간격으로 계대 배양하고 15회 이내의 계대 배양 세포를 사용하였다. 5×106 CT26 암 세포를 생쥐에게 피하주사하였다. 매주 1회 생쥐에게 약물을 3회 주사하고, 항PD-1 항체를 매주 2회 투여하여, 총 8회 투여하였다.
결과 및 검토: 실험 결과는 도12에 나타난 것과 같이 HSA-QHL-087-DOX와 항PD-1 항체의 병용 치료 효과가 HSA-EMC-AANL-DOX 단약 치료 효과보다 높았으며 완치율이 훨씬 높았다.
실시 예 30: MTT법으로 N-CBP 및 HSA-QHL-095-N-CBP의 종양 세포 성장에 대한 억제 작용 측정
분리하고 배양한 세포의 수를 계산하고 배지로 세포 농도를 조절한 후, 세포를 96웰 배양판에 분주하였다. 각 웰에는 세포 현탁액 100μl, CD8+ T세포 100000개/웰, CT26 대식 세포 20000개/웰을 분주하였다. 96웰 배양판을 37℃의 이산화탄소(5%) 배양기에 넣고 24시간 배양하였다. 24시간 후 96웰 배양판에 다른 농도의 약물이 포함된 세포 배양액 100ul를 분주한 그룹, 약물을 첨가하지 않고 해당 약물의 용매만 분주한 대조 그룹(0.1%DMSO), 세포 없이 배지만 분주한 블랭크(Blank) 그룹을 배치하였다. 각 그룹을 3개의 평행 웰에 배치한 후 배양판을 37℃의 이산화탄소(5%) 배양기에 넣고 48시간 배양하였다. 48시간 후 각 웰에 MTT 20μl(농도 5 mg/ml)를 첨가한 후 4시간 배양하였다. 그런 다음 배양액을 뽑아내고 용해 용매로 DMSO 150μl를 첨가하여 용해한 후 효소 면역 측정기로 490nm에서 흡광도를 측정하였다.
결과 및 검토: 실험 결과는 도13, 도14와 같다. N-CBP의 체외 세포 독성은 카보플라틴과 옥살리플라틴보다 강했으며 시스플라틴보다는 약했다(도13). HSA-QHL-095-N-CBP는 N-CBP에 비해 카보플라틴의 생체외 세포 독성이 낮았다(도14).
실시 예 31: HSA-QHL-095-N-CBP의 단일 요법 및 항PD-1 항체 병용 요법 효과
실험 목적: 카보플라틴, HSA-QHL-095-N-CBP 및 항PD-1 항체와의 병용 치료 효과를 비교 연구한다.
시험 약물: 카보플라틴, HSA-QHL-095-N-CBP, 용량 18μmol/kg, 생쥐 PD-1 항체, 5 mg/kg.
실험 동물: 6-8주령의 BALB/c 생쥐 암컷.
종양 모델 제조: ATCC에서 CT26 세포를 구매하여 10% 우태아 혈청이 포함된 DMEM을 배지로 하여 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 3일 간격으로 계대 배양하고 15회 이내의 계대 배양 세포를 사용하였다. 5×106 CT26 암 세포를 생쥐에게 피하주사하였다.
치료 과정: 해당 약물을 3주간 매주 1회 주사하였다. 항PD-1 항체는 4주간 매주 1회 투여하였다.
결과 및 검토: 실험 결과는 도15에 나타난 것과 같이 HSA-QHL-095-N-CBP의 치료 효과가 카보플라틴보다 훨씬 높았으며, HSA-QHL-095-N-CBP와 항PD-1 항체의 병용 요법은 단일 요법보다 치료 효과가 높았으며 완치 효과가 있었다.
실시 예 32: 비알코올성 지방간(NAFLD) 모델 생쥐의 염증 반응에 대한 영향
실험 방법: C57 생쥐를 6마리씩 무작위로 정상군(표준 사료), 모델군(고지방 사료), 심바스타틴군(양성 대조, 3mg/kg) 및 약물 용량군(50mg/kg)으로 나누었다. 정상군의 생쥐에게는 표준 사료를 먹이고 나머지 군에는 고지방 사료를 먹여 NAFLD 모델을 유도하였다. 모델링과 동시에 각군의 생쥐에게 IV 해당 용량 48umol/kg의 약물을 8주간 매주 2회 투여하였다. 마지막 약물을 투여하고 12시간 후 전자동 생화학 분석기로 혈청 생화학작 지표인 고밀도 지단백콜레스테롤(HDL-C), 저밀도 지단백콜레스테롤(LDL-C)을 측정하였다. 그 결과는 표13와 같다.
Figure pct00084
결과: 정상군과 비교하여 모델군의 혈청 중 HDL-C 함량이 66.2%로 현저하게 감소하였으며, LDL-C ?t량은 135.6%(P<0.05)로 현저하게 증가하였다. QHL-158-T3과 QHL-159-T3 치료군의 HDL-C와 LDL-C의 정상 회복 수준은 비교적 양호하였다.

Claims (20)

  1. 하기 화학식(I)로 표시되는 구조를 갖는 화합물:
    MI-S-C-A （I）

    상기 화학식에서
    MI는 말레이미드기이고,
    S는 효소 절단 효율 또는 선택성을 높이는 기이고,
    C는 단백질 분해 효소의 끊어질 수 있는 아미노산 링커이고,
    A는 보조 링커이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 MI는 하기 화학식으로 표시되는 말레이미드기이다:
    Figure pct00085

    그중 물결선은 S와의 연결 위치를 나타낸다.
  3. 제1항에 있어서, 상기 S는 S1-S2-S3으로 표시되며, S1은 하기 구조에서 선택된다:
    Figure pct00086

    그중 Rx는 존재하지 않거나 C1-6 알킬렌기, C1-6 알킬렌아미노기, C1-6 알킬렌카르복실기 및 C1-6알킬렌카르보닐아미노기에서 선택되고, 물결선은 인접한 부분과의 연결 위치를 나타낸다. S2는 존재하지 않거나 -[(CH2)pO]q- 이며, 그중 p는 1-4의 정수이고 바람직하게는 2이며, q는 0-15이고 바람직하게는 1-15이고 보다 바람직하게는 2-6의 정수이다. S3은 존재하지 않거나 Glu, Asp, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, Lys, Arg 및 His와 같은 극성 아미노산 잔기에서 선택되며 바람직하게는 Glu와 Asp이다.
    그중 S는 하기 기에서 선택되는 기를 통해 C와 연결된다:
    Figure pct00087

    그중 물결선은 인접한 부분과의 연결 위치를 나타낸다.
    그리고 S1, S2, S3 중 적어도 하나가 존재하는 것으로 이해되어야 한다.
  4. 제1항에 있어서, 상기 S는 -R1-[(CH2)pO]q-R2-R3- 이고, 그중 R1은 MI와 연결되어 있으며, 존재하지 않거나 C1-6 알킬렌기 또는 C1-6 알킬렌카르보닐아미노기에서 선택된다. R2은 C1-6 알킬렌기에서 선택된다. R3은 -C(O)O-, -NH-, -O- 또는 -C(O)-R4에서 선택된다. R4는 바람직하게 Glu, Asp, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Trp, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gln, Lys, Arg 및 His에서 선택되며, 보다 바람직하게는 Glu와 Asp의 아미노산 잔기이며, R4는 이의 아미노기를 통해 -C(O)- 와 아미드 결합을 형성한다. p는 1-4의 정수이고, q는 0-15이며 바람직하게는 1-15이고 보다 바람직하게는 2-6의 정수이다.
  5. 제1항 내지 4항에 있어서, 상기 MI, S1, S2, S3, C 및 A는 하기 방법을 통해 상호 연결된다:
    Figure pct00088

    그중 물결선은 인접한 부분과의 연결 위치를 나타낸다.
  6. 제1항에 있어서, 상기 MI-S는 하기 구조에서 선택된다:
    Figure pct00089

    Figure pct00090

    Figure pct00091

    Figure pct00092

    Figure pct00093

    Figure pct00094
  7. 제1항에 있어서, 상기 C는 종양 미세 환경에서 발현된 Legumain에 의해 절단되고 Asn 잔기가 포함된 기에서 선택된다.
  8. 제7항에 있어서, 상기 C는 X1X2X3이고, 그중 X1은 L 또는 D형 Ala, Thr, Val 및 Asn에서 선택되고, X2는 L 또는 D형 Ala, Thr, Val 및 Ile에서 선택되며, X3은 Asn이고 바람직하게는 D-Asn이 아니다.
    바람직하게 C는 하기 구조에서 선택된다: Ala-Ala-Asn, Thr-Ala-Asn, Val-Ala-Asn, Asn-Ala-Asn, Thr-Thr-Asn, Val-Thr-Asn, Asn-Thr-Asn, Ala-Val-Asn, Thr-Val-Asn, Val-Val-Asn, Asn-Val-Asn, Ala-Ile-Asn, Thr-Ile-Asn, Val-Ile-Asn, Asn-Ile-Asn, Ala-Thr-Asn, D-Thr-L-Val-L-Asn, D-Thr-L-Ala-L-Asn, D-Ala-L-Val-L-Asn, L-Thr-D-Val-L-Asn, L-Thr-D-Ala-L-Asn, L-Ala-D-Val-L-Asn, D-Thr-D-Val-L-Asn, D-Thr-D-Ala-L-Asn, D-Ala-D-Val-L-Asn.
  9. 제1항에 있어서, 상기 A는 하기 구조에서 선택된다:
    Figure pct00095

    그중 물결선은 C와의 연결 위치를 나타낸다.
  10. 제1항에 있어서, 상기 S와 A는 하기 QHL-001내지 QHL-162 그룹 중에서 선택된다:
    Figure pct00096

    Figure pct00097

    Figure pct00098

    Figure pct00099

    Figure pct00100

    Figure pct00101

    바람직하게 C는 AAN이다.
  11. 하기 화학식(II)로 표시되는 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    MI-S-C-A-D （II）

    상기 화학식에서 MI, S, C 및 A는 제1항 내지 10항에 기재된 설명과 같으며, D는 약물, 바람직하게는 항암 화합물이다.
    보다 바람직하게 D는 아드리아마이신, 다우노루비신, 에피루비신, 메토트렉사트, 플루다라빈, 젬시타빈, 시토신아라비노시드, 멜팔란, 니무스틴, 미토산트론, 마이토마이신, 캠토테신, 10-하이드록시캠토테신(OPT), 토포테칸, 플록슈리딘, 독시플루리딘, 에토포시드, 카페시타빈, 빈크리스틴, 에포틸론 B, 파클리탁셀, 도세탁셀, 다브라페닙, 도비티닙, 모테사닙, 프레드니손, 트리요오드티로닌, 레시퀴모드, 하기 화학식으로 표시되는 백금 유도체:
    Figure pct00102

    및 하기 화합물 a와 화합물 b에서 선택된다:
    Figure pct00103

    바람직하게는 A와 D가 하기 방법으로 연결된다:
    Figure pct00104

    그중 물결선은 인접한 부분과의 연결 위치를 나타낸다.
  12. 제11항에 있어서, 상기 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 하기 화합물에서 선택된다:
    Figure pct00105

    Figure pct00106

    Figure pct00107

    Figure pct00108

    Figure pct00109

    Figure pct00110

    Figure pct00111

    Figure pct00112

    Figure pct00113

    Figure pct00114

    Figure pct00115
  13. 하기 화학식 구조를 갖는 백금 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염:
    Figure pct00116
  14. 제11항 또는 12항에서 있어서, 상기 접합체, 알부민과 공유 결합으로 연결된 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  15. 제11항 또는 12항에 있어서 상기 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 제13항에 있어서 상기 백금 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 제 14항에 있어서 상기 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약물 조합물.
  16. 제11항 또는 12항에 있어서 상기 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 제13항에 있어서 상기 백금 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 제14항에 있어서 상기 접합체 또는 약학적으로 허용 가능한 염은 암, 지방간(알코올성 및 비알코올성 지방간 포함), 지방성 간염, 지방성 간 질환, 간 섬유화, 간염, 간세포 손상의 지방 변성 현상을 치료하거나 예방하는 약물을 제조하는 용도이며, 바람직하게 상기 암은 고형암 또는 혈액종양이며, 바람직하게는 방광, 뇌, 유방/유선, 자궁경부, 결장, 직장, 식도, 신장, 간, 폐, 비인두, 췌장, 전립선, 피부, 위, 자궁, 난소, 고환 및 혈액 부위의 암이다.
  17. 제1항 내지 10항에 있어서, 상기 화합물은 화합물 약물의 수용성 증가, 약물 독성 감소, 약물의 치료 효과 향상 및/또는 약물의 면역 세포에 대한 선택성을 향상시키는 약물에 응용되거나, 수용성 개선,약물 독성 감소, 약물 치료 효과 증진 및/또는 약물의 면역 세포에 대한 선택성을 향상시키는 약물의 제조에 응용되거나, 약물을 간으로 전달하는 약물 분자의 제조에 응용될 수 있다.
  18. 하기 화학식으로 표시되는 구조를 갖는 EMC-AANL-DOX 화합물 또는 이의 알부민과 결합한 약물을 간암 치료제 제조에 응용하거나, 항PD-1 항체와 함께 병용 요법 종양 치료제의 제조에 응용할 수 있다:
    Figure pct00117
  19. 제11항 또는 12항에 있어서 상기 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 제13항에 있어서 상기 백금 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 제14항에 있어서 상기 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 면역 억제성 세포 억제, 종양 관련 대식 세포 억제, MDSC 세포 억제, 혈관 신생 억제, 항종양 면역 촉진 및/또는 T-림프구 증식을 촉진하는 약물의 제조에 응용할 수 있다.
  20. 제11항 또는 12항에 있어서 상기 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 제13항에 있어서 상기 백금 유도체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 제14항에 있어서 상기 접합체 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염과 항PD-1 항체를 병용 요법 종양 치료제의 제조에 응용할 수 있다.
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