KR20240040091A - 질환 치료를 위한 알파-태아단백질 생체접합체 - Google Patents

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Abstract

암을 치료하기 위한 생체접합체로서, 이황화 글루타티온-민감성 링커를 통해 세포독소와 연결된 알파-태아단백질(AFP)을 포함하는 생체접합체가 기술된다. 바람직한 구현예에서, 생체접합체는, 생체접합체가 특정 높은 비율 또는 낮은 비율의 세포독소 대 AFP를 포함하도록 글루타티온-민감성 링커를 통해 메이탄시노이드 세포독소와 연결된 AFP 변이체이다.

Description

질환 치료를 위한 알파-태아단백질 생체접합체
본 출원은 2021년 7월 23일에 출원된 미국 특허 가출원 제63/203,467호의 우선권을 주장하며, 이는 참조로서 본 출원에 통합된다.
기술분야
본 발명은 암 및 다른 질환 및 병태의 치료에 유용한 생체접합체 및 이의 제형에 관한 것이다. 본 발명은 특히 알파-태아단백질 및 세포독소를 포함하는 생체접합체에 관한 것이다.
항체 약물 접합체(ADC)는 세포독소가 표적화 제제, 예컨대 질환 세포 표적에 선택적으로 결합하는 항체 또는 다른 단백질(생체접합체)에 연결되는 광범위한 약물 부류이다. 세포 결합제(표적화제) 및 세포독소(페이로드)는 상이한 링커 구조를 통해 공유 연결될 수 있다. 일부 링커는, 생체접합체가 세포에 진입한 후 세포 내에서 분해되어 세포독소를 방출하는 절단 부위를 제공한다. 일부 링커는 불활성이지만 자가-희생성(self-immolable)이며, 세포액 또는 리소좀 내에서 단계적으로 분해되어 세포독소를 방출하게 된다. 절단성 링커는 효소 분해, pH 변경, 및 다른 세포내 조건 또는 제제에 의존하여, 보다 조절되고 직접적인 약물 방출 메커니즘을 제공한다.
생체접합체는 다수의 고도로 가변적인 성분으로 구성되며, 각각의 성분은 최적의 특성을 위해, 각각의 성분을 단독으로 그리고 다른 제제(들)와 함께 신중하게 선택할 것이 요구된다. 표적화 제제는 독성이 표적 부위로 제한되도록 질환 세포에 의해 제시된 표적에 선택적으로 결합하여야 한다. 생체접합체는 질환 세포에 치명적이거나 적어도 이를 손상시키는 독소를 포함해야 하며, 링커는 생체접합체가 세포에 진입했을 때 세포독소를 방출시킬 수 있어야 한다. 표적화제와 생체접합체 사이에 형성된 연결 또한 절단성이어야 하며, 표적화 분자당 그렇게 연결된 독소의 수는 중요한 파라미터이다. 또한, 성분이 결합되는 순서, 및 성분이 분리되는 (또는 분리되지 않는) 방법은 상업적으로 유용한 수율의 핵심일 수 있다. 따라서, 생체접합체 자체는 세포에 의해 흡수된 다음, 세포 조건 및 성분에 의해 가공되어 세포독소를 독성 형태로 제공해야 한다. 당업계에서는, 생체접합체 설계 및 생산에 있어서 주요 성분 또는 단계 중 어느 하나 이상의 변화가 상당한 변화, 예를 들어 효능의 감소 또는 생체접합체의 전신 독성 및 다른 특성의 증가를 초래할 수 있다는 것을 이해하고 이를 받아들인다.
알파-태아단백질(AFP) 수용체(AFPR)는 종양에서 높게 발현되지만, 골수 유래 억제 세포(MDSC), 및 AFP 수용체를 또한 발현하는 소정의 활성화된 림프구의 발현을 제외하고는, 건강한 조직에서는 일반적으로 낮은 발현을 나타내거나 발현을 나타내지 않는다. AFP 수용체는 모든 배아 세포에 존재하고, 정상적으로는 출생 직후에 사라지지만, 그런 다음 대부분의 성인 및 소아 암에서 다시 발현된다. 태아에서, AFP는 성인의 알부민과 유사한 셔틀 단백질로서 작용하여, 아미노산, 지방산 및 다른 필요한 분자에 가역적으로 결합한 다음 AFP 수용체를 통해 이들 분자를 세포 내로 전달함으로써 이들 분자를 배아 세포 내로 가져온다. 세포 내에 들어가면, AFP는 영양분을 세포 내로 방출한 다음 순환으로 복귀하여 추가의 분자를 세포 내로 실어 나르는 것을(shuttling) 재개한다.
종래 기술의 AFP 생체접합체는 AFP가 항암제로서 탁산과 비공유적으로 복합체화되는 제제를 포함한다(2016년 8월 4일에 공개된 WO2016/119045 참조). 링커는 사용되지 않으며, 복합체는 세포를 투과한 다음 탁산을 방출하여 치료를 수행할 것으로 예상된다. 비절단성 링커 또는 브릿지를 사용하여 연결된, 메이탄시노이드로도 알려진 약물 메이탄신(DM)을 포함하는 AFP 기반 생체접합체에 대한 언급도 있다. 메이탄시노이드는 그 자체가 세포독소이며, 리파마이신, 겔다나마이신, 및 아사트리에닌과 구조적으로 유사하다. 메이탄시노이드는 튜불린에 결합하여, “중독된(intoxicated)” 세포에서 유사분열 정지를 유도하는 미세소관의 형성을 방해할 수 있다.
다른 개시는, 접합 링커이지만 비절단성인 링커를 사용하는 AFP 생체접합체 및 독성 페이로드에 관한 것이다(2007년 4월 24일에 공개된 Merrimack의 미국 특허 제7,208,576호 참조). 이 접합체에서, 타카투주맙 AFP 항체 및 DM-1은 비절단성 링커, 즉 N-숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC) 사이에서 결합된다. DM-1 독소는 (N2’-데아세틸-N2’-(3-메르캅토-1-옥소프로필) 메이탄신이다. AFP에 유용한 다른 독소 및 링커는 본원에 참조로서 통합된 Polytherics의 WO2018/051109에 기술된 것들을 포함하며, 여기서 글루타티온 절단성인 이황화 링커는 새로운 다양한 독성제와 결합되는데, 여기에는, DM과 유사하지만 클로로기를 치환하는 페닐기를 포함하는 세포독소가 포함된다. AFP가 다우노루비신과 결합되는 접합체가 또한 Belyaev 등의 문헌[Cancer Immunol Immunother., 2017]에 기술되어 있다. 이러한 연구는 AFPR을 발현하는 것으로 나타난 면역 세포의 하위 집합인 골수 유래 억제 세포(MDSC)에 대한 AFP 기반 생체접합체에 대한 긍정적인 효과를 입증하는 데 특히 중요하다. 이 연구에서, 에를리히 암종(Ehrlich carcinoma)을 가진 마우스를 AFP-독소루비신으로 치료한 결과 비장 MDSC의 수가 감소하였고,NK 세포 수준이 정규화되었고, 종양 성장이 억제되었다. 수득된 결과는, AFP에 기초한 세포독성 생체접합체가 (또 다른 구현예에서, 종양 세포에 미치는 직접적인 효과에 추가하여) 유망한 항-MDSC 약물임을 입증한다.
정상 세포에 대해서는 독성이 미미하거나 전혀 없는 AFP 수용체(AFPR)를 표면 상에 제시하는 질환 세포에게 독소를 전달하기 위한 조성물을 제공하는 것이 바람직할 것이다. 글루타티온으로 절단함으로써 세포액에서 방출될 수 있는 세포독소에 선택적으로 반응하는 세포를 치료하기 위한 치료제 및 약학적 조성물을 제공하는 것도 바람직할 것이다.
암 줄기 세포를 포함하여, 조혈 암세포 및 고형 종양 암세포와 같은 AFPR+ 암세포를 포함하는 AFPR 양성(AFPR+) 질환 세포를 치료하는 데 유용한 생체접합체가 이제부터 제공된다. AFPR+인 비암 세포, 예컨대 골수 유래 억제 세포도 본 출원에 개시된 생체접합체로 치료될 수 있다. 이들 생체접합체에서, AFP와 같은 AFPR-결합제는 글루타티온-절단성 이황화 링커, 즉 글루타티온-민감성 이황화 링커를 사용하여 세포독소에 접합된다. 페이로드/독소, 링커, 및 AFPR 표적화제를 포함하는 성분 종을 신중하게 선택하면, 이들 생체접합체는 세포액에서 글루타티온에 의해 절단된 세포독소를 원하는 독성 형태 및 농도로 효율적으로 및 선택적으로 방출하는 것을 매우 잘 수행한다. 현재 바람직한 생체접합체는 COLO-205 마우스 모델에서 대장 종양 이종이식편의 성장을 감소시키거나 억제하는 것과 같은 많은 파라미터에 있어서 상당한 개선을 나타낸다.
본 발명에 따르면, 질환 세포의 치료에 유용한 생체접합체가 제공되며, 상기 생체접합체는:
(1) AFPR+ 세포 표면 상의 알파-태아단백질(AFP) 수용체(AFPR)에 결합하는 제제;
(2) AFPR+ 세포에 독성인 세포독소(CT); 및
(3) 글루타티온-절단성 이황화 링커를 포함하되, 링커는
(i) AFPR-결합제와 CT 사이에서 공유 결합되고,
(ii) CT를 AFPR+ 세포에 대해 세포내 방출한다.
일 양태에서, AFPR-결합제는 AFPR-결합 단편의 성숙한 야생형 AFP의 아미노산 서열 또는 성숙한 야생형 AFP의 AFPR-결합 변이체의 아미노산 서열 또는 AFP 단편의 아미노산 서열을 갖는다. 또 다른 양태에서, AFP는 재조합 인간 AFP, 또는 AFPR-결합 단편 또는 이의 변이체이고, 변이체는 1~5개의 아미노산 치환을 포함한다. 또 다른 양태에서, 제제는 당질화가 결여된 AFP이다. 또 다른 양태에서, 제제는 서열번호 3을 포함하는 재조합 [Asn233Gln] 성숙한 인간 AFP이다. 또 다른 양태에서, 제제는 서열번호 4를 포함한다. 또 다른 양태에서, 재조합 [Asn233Gln] 인간 AFP는 유전자이식 박테리아에 의해 생산된다. 또 다른 양태에서, 재조합 [Asn233Gln] 인간 AFP는 유전자이식 염소를 포함하여 유전자이식 포유동물에 의해 생산된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 세포독소(CT)는 다음 식을 갖는다:
.
본 발명의 또 다른 양태에서, AFPR-결합제와 세포독소 사이에서 결합된 링커는 다음으로부터 선택된다:
링커 1 -S-CH(CH3) -(CH2)2-CO--; 및
링커 2 -S-(CH2)3-CO-.
또 다른 양태에서, 접합체는 아래에 도시된 링커-세포독소를 포함한다:
또 다른 양태에서, 접합체는 아래에 도시된 링커-세포독소를 포함한다:
본 발명에 따르면, 다음 식의 생체접합체가 제공되며:
식 중 AFP는 알파-태아단백질의 AFP 수용체 결합 형태이다.
본 발명의 일 양태에서, n은 1 내지 11의 범위 내에 있다. 또 다른 양태에서, 평균 DPR은 2 내지 8이며, 여기서 DPR은 약물 대 단백질 비율로서 정의된다. 또 다른 양태에서, 평균 DPR은 5 내지 7이다. 또 다른 양태에서, 평균 DPR은 5.6 내지 6.1이다. 또 다른 양태에서, 평균 DPR은 약 5.9이다. 또 다른 양태에서, 평균 DPR은 3 내지 4.5이다. 또 다른 양태에서, 평균 DPR은 3.6 내지 4.1이다. 또 다른 양태에서, 평균 DPR은 약 3.9이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, AFP는 서열번호 3을 포함하는 재조합 [Asn233Gln] 성숙한 인간 AFP이다. 본 발명의 일 양태에서, n은 1 내지 11의 범위 내에 있다. 또 다른 양태에서, 평균 DPR은 2 내지 8이다. 또 다른 양태에서, 평균 DPR은 5 내지 7이다. 또 다른 양태에서, 평균 DPR은 5.6 내지 6.1이다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 평균 DPR은 약 5.9이다. 또 다른 양태에서, 평균 DPR은 3 내지 4.5이다. 또 다른 양태에서, 평균 DPR은 3.6 내지 4.1이다. 또 다른 양태에서, 평균 DPR은 약 3.9이다.
본 발명에 따르면, 다음 식의 생체접합체가 제공되며:
식 중 APF는 알파-태아단백질의 AFP 수용체 결합 형태이다.
본 발명의 일 양태에서, n은 1 내지 11의 범위 내에 있다. 또 다른 양태에서, 평균 DPR은 2 내지 8이다. 또 다른 양태에서, 평균 DPR은 5 내지 7이다. 또 다른 양태에서, 평균 DPR은 5.5 내지 6.1이다. 또 다른 양태에서, 평균 DPR은 약 5.8이다. 또 다른 양태에서, 평균 DPR은 3 내지 4.5이다. 또 다른 양태에서, 평균 DPR은 3.4 내지 4.0이다. 또 다른 양태에서, 평균 DPR은 약 3.7이다.
또 다른 양태에서, 약학적으로 허용 가능한 담체 및 위에 제시된 것과 같은 생체접합체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 또 다른 양태에서, 담체는 수성 비히클이다. 또 다른 양태에서, 수성 비히클은 5% 수크로오스가 포함된 pH 7.5의 10mM HEPES 완충액이다. 또 다른 양태에서, 약학적 조성물은 AFPR+인 암을 앓고 있는 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
또 다른 양태에서, 약학적 조성물은 AFPR+인 암을 앓고 있는 대상체에게 투여하기 위한 것이다.
또 다른 양태에서, AFPR+ 세포의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 위에 제시된 것과 같은 약학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, AFPR+ 세포는 암 세포이다. 또 다른 양태에서, AFPR+ 세포는 MDSC이다. 또 다른 양태에서, AFPR+ 세포는 난소암 세포이다. 또 다른 양태에서, AFPR+ 세포는 대장암 세포이다. 또 다른 양태에서, AFPR+ 세포는 유방암 세포이다. 또 다른 양태에서, AFPR+ 세포는 림프종 세포이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, AFPR+인 암을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 병용 치료에 사용하기 위한, 위에서 제시된 것과 같은 약학적 조성물 및 제2 치료제가 제공된다. 일 양태에서, 제2 치료제는 면역 관문 억제제 또는 CAR-T 제제 또는 또 다른 면역-종양학 요법이다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 생체접합체를 생산하기 위한 프로세스가 제공되며, 상기 프로세스는 위에서 제시된 것과 같은 AFP의 AFPR-결합 형태를 위에서 제시된 것과 같은 접합체와 결합시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 생체접합체를 생산하는 프로세스로서, 세포독소 ABZ-981을 글루타티온-민감성 이황화 링커와 먼저 결합시켜 중간체를 생성하고:
그런 다음, 이를 AFP의 AFPR-결합 형태, 즉 서열번호 3을 포함하는 재조합 [Asn233Gln] 성숙한 인간 AFP와 반응시키고, 상기 중간체를 AFP 내의 리신 잔기의 엡실론 아미노기에 공유 결합시키는 프로세스가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 생체접합체를 생산하는 프로세스로서, 세포독소 ABZ-981을 글루타티온-민감성 이황화 링커와 먼저 결합시켜 중간체를 생성하는 프로세스가 제공된다:
본 발명의 이들 및 다른 양태들은 이제 첨부된 도면을 참조하여 더욱 상세히 설명되며, 도면 중:
도 1은 U-937 세포에서 생체접합체가 AFP 수용체에 대한 특이적으로 결합하는 것을 보여준다.
도 2는 COLO-205 대장암 이종이식편을 가진 마우스에서 AFP-세포독소 생체접합체가 종양 성장에 미치는 효과를 보여준다.
도 3은 COLO-205 대장암 이종이식편을 가진 마우스에서 AFP-세포독소 생체접합체가 마우스의 생존에 미치는 효과를 보여준다.
도 4는 A2780 난소암 이종이식편을 가진 마우스에서 ACT-903이 종양 성장에 미치는 효과를 보여준다.
도 5는 A2780 난소암 이종이식편을 가진 마우스에서 ACT-903이 마우스 생존에 미치는 효과를 보여준다.
본 발명은, 표적화된 세포의 표면 상의 AFPR 표적에 결합하는 임의의 제제에 세포독성 약물(세포독소(CT), 페이로드, 또는 탄두로도 알려짐)이 공유 결합되는 약학적으로 유용한 생체접합체를 제공한다. 표적화제는 알파 태아단백질(약칭: AFP)의 AFPR-결합 형태이이다. 세포독소와 표적화제 사이에서 공유 결합을 제공하는 링커는 세포내 글루타티온에 의한 절단에도 민감하여, 혈액에서 안정적으로 유지되면서, 세포독소를 전달한 AFP로부터 세포독소를 세포내 방출하기 위한 메커니즘을 제공한다. 본원에서, 링커는 글루타티온-민감성으로 기술되는데, 이는 특히 링커가 치료 대상 질환 세포의 세포액에 존재할 때 글루타티온에 의해 절단될 수 있음을 의미하도록 의도된다. 링커는 이황화 링커로서 지칭되는데, 이는 링커가 구조 내에 -S-S- 배열을 포함하기 때문이다. 이들 링커는 혈장에서도 안정한데, 페이로드의 손실은 수일의 기간에 걸쳐 단지 미미한 정도이다.
생체접합체에 사용되는 자연 상태의 AFP는 배아 간 및 난황낭에 의해 태아에서 처음 생산되는 인간 수송체 단백질이다. 이는 특정 AFP 수용체에 결합한 후 엔도시토시스에 의해 세포에 진입한다. AFPR 결합 도메인을 구성하는 펩티드를 포함하여, 이들 AFPR 결합 특성 및 수송체 특성을 갖는 다른 형태의 AFP도 본 생체접합체에서 유용한 표적화제일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은, 특히 [Asn233Gln] 성숙한 인간 AFP[1-591]를 포함하여, 야생형(UniProt KB P02771) 또는 변이체 형태, 절단된 형태, 단편화된 형태, 또는 단편 형태의 AFPR 결합 알파-태아단백질(AFP)이 AFPR-결합제로서 제공되는 생체접합체를 제공한다. 다른 구현예에서, 이러한 결합제는 언급된 2개의 이황화 링커 중 하나를 통해 세포독소에 공유 연결된다.
용어 “알파-태아단백질(alpha-fetoprotein 및 alfa-fetoprotein)” 및 “AFP”는 UniProtKB P02771로 지정된 591량체 성숙한 서열(잔기 19~609)을 갖는 분비된 인간 단백질을 지칭하여 본원에서 상호 교환적으로 사용된다. 성숙한 인간 AFP의 실제 서열은 전체가 591개의 잔기로 감소된, 성숙한 형태이고 분비 신호(잔기 1~18)가 결여된 609량체로서 아래에 도시되어 있다:
MKWVESIFLI FLLNFTESRT LHRNEYGIAS ILDSYQCTAE ISLADLATIF 50
FAQFVQEATY KEVSKMVKDA LTAIEKPTGD EQSSGCLENQ LPAFLEELCH 100
EKEILEKYGH SDCCSQSEEG RHNCFLAHKK PTPASIPLFQ VPEPVTSCEA 150
YEEDRETFMN KFIYEIARRH PFLYAPTILL WAARYDKIIP SCCKAENAVE 200
CFQTKAATVT KELRESSLLN QHACAVMKNF GTRTFQAITV TKLSQKFTKV 250
NFTEIQKLVL DVAHVHEHCC RGDVLDCLQD GEKIMSYICS QQDTLSNKIT 300
ECCKLTTLER GQCIIHAEND EKPEGLSPNL NRFLGDRDFN QFSSGEKNIF 350
LASFVHEYSR RHPQLAVSVI LRVAKGYQEL LEKCFQTENP LECQDKGEEE 400
LQKYIQESQA LAKRSCGLFQ KLGEYYLQNA FLVAYTKKAP QLTSSELMAI 450
TRKMAATAAT CCQLSEDKLL ACGEGAADII IGHLCIRHEM TPVNPGVGQC 500
CTSSYANRRP CFSSLVVDET YVPPAFSDDK FIFHKDLCQA QGVALQTMKQ 550
EFLINLVKQK PQITEEQLEA VIADFSGLLE KCCQGQEQEV CFAEEGQKLI 600
SKTRAALGV
서열번호 1; 분비 가능한 야생형 인간 AFP(1-609);
RTLHRNEYGI ASILDSYQCT AEISLADLAT IFFAQFVQEA TYKEVSKMVK 50
DALTAIEKPT GDEQSSGCLE NQLPAFLEEL CHEKEILEKY GHSDCCSQSE 100
EGRHNCFLAH KKPTPASIPL FQVPEPVTSC EAYEEDRETF MNKFIYEIAR 150
RHPFLYAPTI LLWAARYDKI IPSCCKAENA VECFQTKAAT VTKELRESSL 200
LNQHACAVMK NFGTRTFQAI TVTKLSQKFT KVNFTEIQKL VLDVAHVHEH 250
CCRGDVLDCL QDGEKIMSYI CSQQDTLSNK ITECCKLTTL ERGQCIIHAE 300
NDEKPEGLSP NLNRFLGDRD FNQFSSGEKN IFLASFVHEY SRRHPQLAVS 350
VILRVAKGYQ ELLEKCFQTE NPLECQDKGE EELQKYIQES QALAKRSCGL 400
FQKLGEYYLQ NAFLVAYTKK APQLTSSELM AITRKMAATA ATCCQLSEDK 450
LLACGEGAAD IIIGHLCIRH EMTPVNPGVG QCCTSSYANR RPCFSSLVVD 500
ETYVPPAFSD DKFIFHKDLC QAQGVALQTM KQEFLINLVK QKPQITEEQL 550
EAVIADFSGL LEKCCQGQEQ EVCFAEEGQK LISKTRAALG V 591
서열번호 2; 야생형 성숙한 인간 AFP(1-591]
RTLHRNEYGI ASILDSYQCT AEISLADLAT IFFAQFVQEA TYKEVSKMVK 50
DALTAIEKPT GDEQSSGCLE NQLPAFLEEL CHEKEILEKY GHSDCCSQSE 100
EGRHNCFLAH KKPTPASIPL FQVPEPVTSC EAYEEDRETF MNKFIYEIAR 150
RHPFLYAPTI LLWAARYDKI IPSCCKAENA VECFQTKAAT VTKELRESSL 200
LNQHACAVMK NFGTRTFQAI TVTKLSQKFT KVQFTEIQKL VLDVAHVHEH 250
CCRGDVLDCL QDGEKIMSYI CSQQDTLSNK ITECCKLTTL ERGQCIIHAE 300
NDEKPEGLSP NLNRFLGDRD FNQFSSGEKN IFLASFVHEY SRRHPQLAVS 350
VILRVAKGYQ ELLEKCFQTE NPLECQDKGE EELQKYIQES QALAKRSCGL 400
FQKLGEYYLQ NAFLVAYTKK APQLTSSELM AITRKMAATA ATCCQLSEDK 450
LLACGEGAAD IIIGHLCIRH EMTPVNPGVG QCCTSSYANR RPCFSSLVVD 500
ETYVPPAFSD DKFIFHKDLC QAQGVALQTM KQEFLINLVK QKPQITEEQL 550
EAVIADFSGL LEKCCQGQEQ EVCFAEEGQK LISKTRAALG V 591
서열번호 3, [Asn233Gln]rhAFP(1-591)
MKWVESIFLI FLLNFTESRT LHRNEYGIAS ILDSYQCTAE ISLADLATIF 50
FAQFVQEATY KEVSKMVKDA LTAIEKPTGD EQSSGCLENQ LPAFLEELCH 100
EKEILEKYGH SDCCSQSEEG RHNCFLAHKK PTPASIPLFQ VPEPVTSCEA 150
YEEDRETFMN KFIYEIARRH PFLYAPTILL WAARYDKIIP SCCKAENAVE 200
CFQTKAATVT KELRESSLLN QHACAVMKNF GTRTFQAITV TKLSQKFTKV 250
XFTEIQKLVL DVAHVHEHCC RGDVLDCLQD GEKIMSYICS QQDTLSNKIT 300
ECCKLTTLER GQCIIHAEND EKPEGLSPNL NRFLGDRDFN QFSSGEKNIF 350
LASFVHEYSR RHPQLAVSVI LRVAKGYQEL LEKCFQTENP LECQDKGEEE 400
LQKYIQESQA LAKRSCGLFQ KLGEYYLQNA FLVAYTKKAP QLTSSELMAI 450
TRKMAATAAT CCQLSEDKLL ACGEGAADII IGHLCIRHEM TPVNPGVGQC 500
CTSSYANRRP CFSSLVVDET YVPPAFSDDK FIFHKDLCQA QGVALQTMKQ 550
EFLINLVKQK PQITEEQLEA VIADFSGLLE KCCQGQEQEV CFAEEGQKLI 600
SKTRAALGV [609]
[서열번호 4] X251은 Gln, 즉 [Asn251Gln]rhAFP(1~609)이다.
AFPR 결합 활성 및 수송체 활성과 같은 AFP 활성은, 특히 보존적인 아미노산 치환을 포함하여, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실, 또는 첨가를 AFPR에 결합하는 전체 단백질 또는 단편에 포함하는 AFP 변이체에 보유되어야 한다는 것을 이해할 것이다. 이들은 AFP 또는 이의 AFPR-결합 단편의 돌연변이체 또는 변이체로서 지칭될 수 있다. 변경은 당질화 부위, 효소 취약성 등과 같은 번역 후 변형 부위를 도입하거나 제거할 수 있다.
본 발명의 방법에서 유용한 것은 AFP 수용체에 결합하고, 자연 상태로 발생하거나 Lys187Gln 변이체 및 Asn233Gln 변이체와 같은 자연 변이체로서 발생하는 AFP의 형태들이다. 또한, 본 발명은 AFPR 결합을 유지하는 AFP의 임의의 단편 및 임의의 이러한 단편의 변이체의 용도를 포함한다.
AFP의 번역 후 변형된 형태도 본원에서 유용하며, 여기에는 당질화를 포함하는 것들이 포함된다. 인간 형태에서, N-연결된 당질화는 Asn233에서 발생한다. 따라서, 인간 AFP의 천연 형태가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 고유한 인간 AFP에서 16개의 이황화 브릿지에 의해 이루어질 수 있는 적절한 3-D 접힘이 유지되는 경우, 대장균 및 스트렙토마이세스와 같은 원핵 숙주 세포에서 생산될 수 있는 것과 같이, 당질화되지 않은 형태의 인간 AFP도 유용하다. 또한, 인간 AFP의 대안적으로 당질화된 형태, 예컨대 효모, 아스페르길루스, 피키아, 곤충 세포 등을 포함하는 진핵 숙주에서 생산될 수 있는 형태들 및 CHO 및 COS 세포를 포함하는 포유류 세포 숙주에서 생산될 수 있는 형태들이 본원에서 유용하다. 또한, 본 발명에 특히 적합한 인간 AFP의 형태는 염소, 토끼, 및 일부 경우에 돼지를 포함하여, 유전자이식 동물에서 생산되는 인간 AFP 형태이다. 유전자이식 동물에서, 및 구체적으로는 염소의 우유에서 재조합 인간 AFP의 생산하는 것은 예를 들어 Merrimack의 US 7208576에 기술되어 있으며, 상기 특허 문헌에는 Asn233Gln 치환을 포함하는 성숙한 AFP의 당질화되지 않은 형태를 생산하는 것이 추가로 기술되어 있다.
바람직한 구현예에서, AFP는 인간 알파 태아단백질의 재조합 형태이고, 이는 유전자이식 염소에서 염소 발현 시스템으로부터 생산된 인간 알파 태아단백질(hAFP)의 당질화되지 않은 성숙한 형태이다. “ACT-101”은 성숙한 서열의 아미노산 233에서 하나의 아미노산 치환(글루타민에서 아스파라긴으로의 치환)을 함유한다는 점에서 자연 발생 인간 AFP와 상이한, 유용한 AFP 종이다. 본질적으로 동일한 재조합 AFP가 당질화되지 않은 형태로 대장균에 의해 생산될 수 있으며, 여기서 발현은 예를 들어 trp 및 mal 시스템으로부터 유도된다.
AFP 결합의 표적은 알파 태아단백질 수용체(AFPR)이다. 이는 일반적으로 태아 조직과 연관이 있으며, 출생 후 2개월이 넘은 성체 세포에는 존재하지 않는다. 그러나, 많은 비율의 암세포가 기능적 AFPR을 발현한다. 이러한 수용체의 특성이 부분적으로만 분석되었지만, 이의 존재는 실험적 증거에 의해 명백하게 뒷받침되어 왔다. 마우스에서 또는 마우스에 이식된 인간 종양 이종이식편에서 자발적으로 발생하는 종양은 문헌[Cancer Biother Radiopharm 1999, 14(6):485-94]에 기술된 것과 같이, Tc-99m 형태 rhAFP를 사용하여 방사성 표지된 형태의 AFP를 흡수하는 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명의 생체접합체에 의해 표적화된 질환 세포는 AFPR 항체와의 반응성에 의해, 또는 AFP 자체에 대한 이들 질환 세포의 결합 친화도에 의해 식별된다는 것을 이해할 것이다. 이들 세포 표적은 AFPR 양성이거나, AFP 결합 친화도를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
이러한 시약을 사용함으로써, 표적 질환 세포에 세포독성 약물을 전달하는 데 유용한 상이한 형태의 AFP를, 등몰 조건에서 AFPR과의 결합으로부터 표지된 AFP를 변위시키는 이들의 능력에 의해 진단 목적으로 식별하거나, AFPR과 결합하는 이들의 능력에 의해 직접 식별할 수 있다는 것도 이해할 것이다. 세포 기반 검정 또한 이러한 목적에 유용하다. 일 예에서, AFPR-발현 U937 세포(ATCC로부터 카탈로그 번호 CRL 1593.2TM으로 입수할 수 있는 인간 남성 조직구 림프종 세포주)를 이용하여 임의의 주어진 형태의 AFP 또는 AFP 생체접합체의 AFPR 결합 친화도를 확인한다.
일 구현예에서, AFP와 세포독소를 공유 결합시킴으로써 형성된 생체접합체가 제공된다. 세포독소는 다양한 약물 접합체에 사용되는 매우 광범위한 부류의 제제로서 또는 단일 치료제로서 잘 알려져 있다. 본 발명의 생체접합체에서, 생체접합체의 AFP 성분은, DM-1, DM-3, 또는 DM-4가 아니지만 이들 세포독소와 일부 구조적 양태를 공유하는 세포독소에 결합되거나 가교된다. 본 발명에 유용한 세포독소는 다음을 포함한다:
본 발명의 생체접합체 내의 이들 메이탄시노이드 세포독소 페이로드는 절단성 글루타티온 민감성 이황화 브릿지를 함유하는 링커를 사용하여 재조합 인간 AFP(rhAFP)에 부착된다. 글루타티온은 많은 티올-이황화물 산화환원 프로세스에 그 전체가 관여하는 티올-함유 보조효소(coenzyme)이다. 환원된 (티올) 형태일 때, 글루타티온은 ‘GSH’로 약칭된다. 산화된 형태일 때, 글루타티온은 이황화기에 의해 연결된 2개의 분자로 이루어진 이량체로서 존재하며, 'GSSG'로 약칭된다. 표적 단백질 및 글루타티온 내의 이황화 결합과 유리 티올기는 이황화물 교환 반응을 통해 '전좌(trade places)'될 수 있다. 이러한 프로세스는 본질적으로 친핵체, 친전자체, 및 이탈기로서 작용하는 황 원자와의 2개의 직접 변위 이벤트의 조합이며, 링커 이황화물의 절단 및 독소의 방출을 야기한다. 세포내 글루타티온 농도는 일반적으로 0.5 내지 10 mM의 범위인 반면, 세포외 값은 실질적으로 더 낮으며, 혈장에서 약 2 uM이다. 또한, 난소암을 포함하는 종양에서 글루타티온 수준이 상승하므로, 이러한 글루타티온의 차등 농도를 통해 혈액에서 생체접합체를 안정시킬 수 있고, 종양 세포에 의해 흡수된 후 세포독소를 방출시킬 수 있다. 생체접합체의 안정성은 이황화 결합의 측면에 위치하는 R 기의 입체적 성질을 변화시킴으로써 조정될 수 있다. 다른 방출 메커니즘(예를 들어, pH 및 프로테아제-민감성 연결)이 사용될 수도 있지만, 글루타티온 방출 메커니즘이 rhAFP-독소 생체접합체에 가장 적합한데, 이는 AFP가 프로테아제-취약성 링커가 절단될 수 있는 리소솜으로 수송하지 않기 때문이다. 이는 rhAFP-접합체에 대한 연구에 의해 확인되었는데, 상기 연구에서, 디펩티드, 산-민감성 또는 비-절단성 링커를 갖는 생체접합체는 시험관 내에서 낮은 효능을 나타낸 반면(세포 내부에서 독소 방출의 결여로 인한 것이라 추정됨), 이황화 연결된 메이탄신-함유 생체접합체는 시험관 내에서 비교적 높은 (수 nM) 효능을 나타냈으며, 이는 AFP(DPR) 분자 당 로딩된 세포독소의 수에 비례하여 증가하였다.
따라서, 바람직한 구현예에서, AFP와 세포독소는 ABZ-981과 함께 아래와 같이 정의된 화학 구조를 갖는 글루타티온-민감성 이황화물을 형성하는 링커를 사용하여 가교된다:
ABZ-982 링커 -S-CH(CH 3 )-(CH 2 ) 2 -CO-;
또는
ABZ-1827 링커 -S-(CH2) 3 -CO-;
이들 링커는, 바람직한 구현예에서, 아래에 도시된 것과 같은 ABZ-1827 또는 ABZ-982의 구조를 갖는 접합체 중간체를 제공하도록 선택된 세포독소 ABZ981과 함께 형성된다.
CT ABZ-981이 본원에 교시된 것과 같은 일-메틸화된 글루타티온 절단성 이황화 링커를 통해 결합되는 경우, 합성 중간체로서 유용한 생성된 링커/페이로드 접합체는 ABZ-1827로 지정된다. 대안적으로, CT ABZ-981이 본원에 교시된 것과 같은 이-메틸화된 글루타티온 절단성 이황화 링커를 통해 결합되는 경우, 합성 중간체로서 유용한 생성된 링커/페이로드 접합체는 ABZ-982로 지정된다.
링커-페이로드는 본원의 실시예에 표시된 것과 같이 합성된다. AFP:세포독소 생체접합체를 생산하기 위해, 먼저 세포독소를 글루타티온-민감성 이황화 링커와 결합시켜 중간체, 예를 들어 전술한 것과 같은 중간체를 생산한 다음 이를 AFP와 반응시켜, 일반적으로 링커의 일 단부가 AFP 내 리신 잔기의 엡실론 아미노기에 결합되고 타 단부는 원하는 세포독소에 결합되도록 링커를 공유 결합시킨다. 그런 다음, 단리된 생체접합체를 수성 비히클, 바람직하게는 등장성이고 생리학적 pH 또는 약간 더 산성인 pH를 갖는 수성 비히클 내에서 혼합할 수 있다. 일 구현예에서, 수성 비히클은 pH가 약 6 내지 약 7.5 범위인 인산염 완충 식염수이다. 또 다른 구현예에서, 수성 비히클은 물이다. 추가의 구현예에서, 수성 비히클은 식염수(0.154M NaCl)이다. 추가의 구현예에서, 수성 비히클은 HEPES ((4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산) 완충액이다.
실온 및 표준 압력은 허용 가능한 혼합 조건이다. 혼합하는 단계는 부드러운 교반(agitation), 교반(stirring) 등을 사용하여 이루어질 수 있다. 프로세스에서, 세포독소:AFP의 원하는 평균 비율이 수득되도록 조건을 관리한다. 상기 비율은 본원에서 “평균 DPR”, 즉 평균 약물:단백질 비율로서 지칭된다. 항체 약물 접합체의 경우, 이는 “약물 항체 비율, DAR”로서 알려질 것이다. 평균 DPR은 AFP와의 반응에 이용할 수 있는 세포독소의 양을 조절함으로써 달성된다.
세포독소의 계산된 단위 투여량이 제조될 수 있는 조성물을 생산하기 위해, 생체접합체의 생산은 바람직하게는 소정량의 각각의 시약을 사용하는 것을 포함한다. 액체 크로마토그래피-질량 분광분석(LC/MS)을 사용한 실험은, 전술한 조건 하에서 혼합이 이루어질 때, AFP의 하나의 분자(분자량 = 66.5 kD)가 세포독소 접합체의 약 1~11개의 분자(분자량 = 854 kD)에 결합하고 이를 유지할 수 있다는 것을 발견하였다. DPR 비율이 높을수록 용해도가 감소하여 생체접합체가 침전될 위험이 증가한다. 따라서, DPR의 상한은, 생체접합체를 보관 도중에 침전되지 않는 용액으로 유지해야 할 필요성에 의해 결정된다. 상이한 DPR 값은 몰농도의 관점에서 각 성분의 부하와 같은 조건을 변경하거나 반응 배지의 pH를 변경함으로써 도달될 수 있다.
독소와 단백질 사이의 이황화 연결은, 예시되고 바람직한 생체접합체에 혼입된 것과 같이 메틸기의 분포를 바람직하게 혼입하는 것으로 결정되었으며, 여기서 이황화 연결은 아래 ABZ1827-AFP에 도시된 것과 같이 일메틸화되거나 아래 ABZ982-AFP에 도시된 것과 같이 이메틸화된다. ABZ1827-AFP가 ABZ982-AFP보다 바람직하다. 이러한 메틸화는 이황화 결합을 차폐할 수 있고, 생체접합체의 생체활성과 안정성 간의 바람직하고 향상된 균형을 제공한다.
이러한 생체접합체는 본원에서 ABZ1827-AFP로서 지칭된다. “n”은 AFP의 각 분자에 결합된 세포독소/링커 분자(접합체 중간체)의 수를 나타낸다. ABZ1827-AFP는 일반적으로 다양한 n의 값을 포함할 것이다. n의 값은 일반적으로 1 내지 11의 범위이지만; 미량의 더 높은 n 종이 있을 수 있다.
또 다른 구현예에서, AFP 단백질은 아래에 도시된 링커 세포독소에 공유 연결된다:
이러한 생체접합체는 본원에서 ABZ982-AFPAFP로서 지칭된다. “n”은 AFP의 각 분자에 결합된 세포독소/링커 분자(접합체 중간체)의 수를 나타낸다. ABZ982-AFP는 일반적으로 다양한 n의 값을 포함할 것이다. n의 값은 일반적으로 1 내지 11의 범위이지만; 미량의 더 높은 n 종이 있을 수 있다.
본 출원에서 논의된 생체접합체는 일반적으로 다양한 n을 갖는 생체접합체의 혼합물로 구성된다. 보다 제한된 범위의 n을 갖는 생체접합체, 또는 다른 경우에, 특정 수에 가깝게 집중된 n의 분포를 갖는 생체접합체를 제조할 수 있다. 생체접합체를 제조하고 이를 n의 평균 값에 의해 특성화할 수도 있다(전술한 바와 같이, DPR로서 식별할 수도 있음).
따라서, 본 발명은 소정의 구현예에서, 선택된 AFP를 세포독소/링커, 바람직하게는 후술하는 것과 같은 ABZ982 또는 ABZ1827과 커플링시켜 생성되는 생체접합체를 제공한다. 세포독소 성분은 일차 아민, 예컨대 AFP 리신 잔기 상의 엡실론 아미노기를 통해 AFP에 결합된다. 1개, 2개 이상, 그러나 일반적으로 11개 이하의 세포독소가 이러한 방식으로 각각의 AFP 분자에 결합될 수 있다. 각각의 AFP 단백질에 결합된 세포독소의 비율은 이러한 비율에 따라 생체접합체의 생물활성 및 용해도를 증가시키거나 감소시키도록 조작될 수도 있다.
DPR은 생체접합체의 효능, 용해도, 및 독성과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. DPR 값이 낮은 경우, 동일한 생체접합체에 대해 DPR 값이 높은 경우에 비해 비교적 낮은 효능과 연관된다. DPR 값이 높은 경우, 동일한 생체접합체에 대해 DPR 값이 낮은 경우에 비해 비교적 높은 독성과 때때로 연관되지만, 항상 그렇지는 않다. 상이한 DPR 값을 갖는 생체접합체의 제조는 AFP에 결합하도록 제공된 세포독소의 농도 및 반응 지속 시간을 조절함으로써 달성된다. AFP에 비해 세포독소의 양이 많을수록, 합성으로 인한 DPR 값이 높아지며, 최대 값은 약 11의 DPR에서 도달하지만, 일반적으로 11 미만이다.
다른 특정 구현예에서, 생체접합체는 AFP 분자 당 평균 약 2 내지 8개의 세포독소 분자의 DPR을 갖는다.
하나의 특정 구현예에서, 세포독소/링커가 ABZ-982인 경우, DPR이 평균 3 내지 4.5, 또는 보다 구체적인 구현예에서 약 3.7+/-0.3이라는 의미에서 DPR은 적당히 “낮다”.
또 다른 구현예에서, 세포독소/링커가 ABZ-982인 경우, DPR이 평균 5 내지 7, 또는 보다 구체적인 구현예에서 약 5.8+/-0.3이라는 의미에서 적당히 “높다”.
추가의 구현예에서, 독소/링커가 ABZ1827인 경우, DPR이 평균 약 5.9+/-0.3(약 6)이라는 의미에서 DPR은 적당히 “높다”. 또 다른 구현예에서, DPR은 AFP 당 5~7 DM의 범위 내에 있다.
또 다른 구현예에서, 독소/링커가 ABZ1827인 경우, 생체접합체는 약 4.5 미만의 “낮은” DPR을 갖는다. 특정 구현예에서, DPR은 평균 약 3.9+/-0.3(약 4)이다.
표 4에 나타낸 바와 같이, ABZ1827-AFP 및 ABZ982-AFP는 DPR이 “높을” 때 시험관 내에서 더 강력하지만, DPR이 “낮을” 때에도 효능을 유지한다.
생체접합체는 AFP-결합 또는 AFPR-양성인 질환 세포를 제시하는 대상체를 치료하는 데 치료적으로 유용하다. 표적 세포는 또한 “세포독소-반응성”이어야 하는데, 이는 세포내 세포독소에 반응하는 세포의 생존율이 감소되거나 0이고, 적어도 이들 세포의 수, 크기, 분포 등의 관점에서 이들 세포가 생체접합체로부터 방출된 세포독소에 의해 살해되거나, 고갈되거나, 감소됨을 단순히 의미한다. AFP와 세포독소는, 생체접합체의 제조 과정 동안 및 생체접합체의 내인성 투여 후, 메이탄시노이드가 결합된 AFP에 의해 질환 세포에 선택적으로 전달되기에 충분한 친화도로 결합하고 전신 독성은 감소된다는 것이 밝혀졌다. 메이탄시노이드 전달에 대한 이러한 접근법은 세포독소의 투여량을 감소시키고 관련 부작용을 감소시킬 수 있는데, 이는 결합된 세포독소가 독성이 덜할 뿐만 아니라 세포독소가 AFPR 양성 질환 세포에 선택적으로 전달되어 정상적인 건강한 세포를 보존하기 때문이다. 또한, AFP:세포독소 생체접합체는 식염수 또는 HEPES 완충액과 같은 양성 및 표준 약학적 비히클에서 제형화될 수 있으므로, 환자에게 전달된 후 그 자체가 독성 문제를 유발하는 담체의 사용을 피할 수 있다.
그 후, 생체접합체는 본원에서 예시된 것과 같이 치료 투여를 위해 즉시 제형화되거나, 이의 수성 비히클에 잠시 보관되거나, 바람직하게는 냉동되거나, 장기간 보관을 위해 동결건조될 수 있다. 동결-해동 사이클은 생체접합체의 응집/이량체 형성에 영향을 미치지 않는다. 생체접합체는 분해 없이 적어도 3일 동안 2~8℃의 용액으로 보관될 수 있다. 이들은 급속 냉동(-60℃) 상태로 보관될 수도 있고, 용액 중의 생체접합체는 동결/해동 사이클을 거쳐도 활성을 유지하는 것으로 나타났다. 따라서, 또 다른 구현예에서, 본 발명은 동결건조되었거나 동결된 형태의 AFP:세포독소 생체접합체 또는 HEPES 완충액 중에서 2~8℃로 냉장된 AFP:세포독소 생체접합체를 제공한다.
치료적 사용을 위해, 본 발명은 생체접합체가 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제형화되는 약학적 조성물로서 AFP:세포독소 생체접합체를 제공한다. 일 구현예에서, 제형은 예컨대 주사 또는 주입에 의해 정맥내 투여될 수 있도록 구성된다. 따라서, 담체는 주사용수, 식염수 등과 같은 수성 비히클일 수 있다.
생체 내 투여에 사용될 활성 성분은 멸균될 것이다. 이는 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 달성된다.
AFP-접합된 세포독소를 제형화하는 데 사용되는 임의의 다른 담체, 비히클, 또는 부형제는 원하는 생체접합체 안정성을 파괴하거나 AFPR에 대한 AFP의 결합 친화도를 변경시키게 될 제제 또는 조건을 피하도록 선택될 수 있다. 유기 용매는 회피될 수 있다. 생리학적 범위를 벗어나는 pH, 즉 약 6 미만 및 약 8 초과의 pH를 도입하는 제제도 이러한 이유로 회피될 수 있다. AFP:세포독소 생체접합체는 물, 또는 생리식염수 또는 특히 HEPES 완충액에서 제형화될 수 있다. 수성 완충 식염수 용액(인산염 완충 식염수 포함)이 바람직한데, 이는 이 용액이 생리학적으로 허용 가능한 pH를 갖고, 바람직한 주사 또는 주입 경로에 의해 투여하기에 적합하기 때문이다. 수크로오스와 같이 응집 또는 침전을 방지하는 화합물을 첨가하는 것이 바람직하다. 또 다른 바람직한 담체/비히클은 5% 수크로오스가 포함된 10 mM HEPES 완충액 pH 7.5이다.
AFP:세포독소 생체접합체는 치료적으로 유용하다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 AFPR 양성 또는 AFP 결합 질환 세포를 제시하는 대상체를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 AFP 결합된 세포독소를 포함하는 AFP:세포독소 생체접합체를 해당 질환 세포의 성장 및/또는 증식을 억제하는 데 효과적인 양으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
AFP 생체접합체는 유망한 항암제이며, 이는 AFP에 대한 수용체를 발현하는 종양 세포에 대한 직접적인 효과 이외에도, MDSC의 감소(또는 제거)에 기여할 수 있다. 이들은 종양 활력을 뒷받침할 수 있는 AFPR+ 세포이며, 동일한 대상체의 종양 미세환경에 존재할 때 유해하다. 이들 세포의 감소, 고갈, 또는 근절은 치료 효과를 향상시키기 위한 유망한 경로이다. 세포독성제와 접합된 벡터 분자로서의 AFP는 MDSC를 특이적으로 인식하므로, 암 환자에서 MDSC의 수를 감소시키는 데 사용될 수 있다.
AFP 수용체 양성 질환 세포는, 검출 가능하고 선택적인 AFP 수용체 결합 리간드를 사용하는 검정을 사용하여 생체 내 및 생체 외 모두에서 치료를 위해 식별될 수 있다. 본 발명의 생체접합체에 의해 표적화될 수 있는 AFPR 양성 질환 세포는 AFPR 양성 암세포를 포함하며, 여기에는 특이성으로 AFP에 결합하는 모든 암세포가 일반적으로 포함된다. 효과는 세포독소에 반응하는 AFPR 양성 질환 세포에서만 나타날 수 있을 것으로 예상되며, 원하는 성장 또는 증식의 억제는 종양 크기 감소 또는 종양 성장 속도 감소에 반영될 수 있다. 이러한 세포 및 종양은 “세포독소-반응성”이라는 특성을 가지며, 본 발명의 생체접합체를 이용한 치료의 바람직한 표적이다. 또한, 세포로부터 세포독소를 능동적으로 제거하는 막 펌프의 과발현으로 인해 세포독소에 저항성인 특정 세포독소-저항성 암세포는 본 발명의 AFP:세포독소 제형으로 효과적으로 치료될 수 있는데, 이는 생체접합체가 AFPR에 결합한 후, AFPR-생체접합체가 소포에 캡슐화되어 세포 내부로 수송되는 세포내섭취(endocytoses)라 불리는 프로세스에 의해 막을 통과하고, 따라서 막 펌프와의 상호작용을 회피하기 때문이다.
정맥내, 근육내, 피하, 두개내, 안와내, 뇌실내, 피막내, 척수내, 수포내, 병변내, 종양내, 복강내 투여를 포함하여, 비경구 투여와 같은 임의의 적절한 투여 경로가 사용될 수 있다. 주사 또는 주입에 의한 정맥내 투여가 바람직할 수 있다.
AFP에 결합하는 암세포를 제시하는 대상체를 치료하기 위한 AFP:세포독소 생체접합체의 적절한 투여량은 치료 대상 질환의 유형, 질환의 중증도 및 병기, 이전 요법, 및 환자의 임상 이력 및 제제에 대한 반응에 따라 달라질 것이다. 제제는 일련의 치료/치료 과정에 걸쳐 환자에게 적절히 투여된다. 질환의 진행은 암 요법의 진료 표준에 따라 모니터링될 수 있다. 특히, 암의 경우, 치료를 필요로 하는 대상체를 효과적으로 치료하면 수, 부피, 분포, 생존율, 및 다른 세포 파라미터(성장 및/또는 증식 또는 성숙 속도의 감소를 포함함)를 감소시킬 수 있다.
예를 들어, 질환의 유형 및 중증도에 따라, 3주마다 1회 투여되는 경우 0.5 mg/kg 내지 5 mg/kg의 AFP 생체접합체에 존재하는 약 20 μg/kg 내지 200 μg/kg의 세포독소가, 예를 들어 1회 이상 나누어서 또는 주입에 의해 환자에게 투여하기 위한 후보 투여량이다. 병태에 따라 주 1회 또는 2회, 또는 3주마다 1회 또는 2회, 또는 수주 또는 그 이상에 걸쳐 1회 또는 2회 반복 투여되는 경우, 질환 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 또는 질환 진행이 관찰될 때까지 치료가 지속된다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. AFP-세포독소 생체접합체의 중량을 기준으로 한 단위 투여량은, 예를 들어 약 500 ug 내지 500 mg의 범위, 예컨대 1 mg, 5 mg, 10 mg, 25 mg, 50 mg, 100 mg, 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 및 400 mg일 수 있다. 제형화된 생체접합체는 2, 3, 4, 5회 또는 그 이상의 단위 투여량이 각 용기(예: 바이알) 내에 포함된 다회 투여 형태로 제공될 수 있다. 생체접합된 제제 또한 키트 형태로 제공될 수 있으며, 여기에는 생체접합체를 포함하는 동결건조되거나 동결된 제제, 및 제제를 투여 가능한 투여 형태로 재구성하기 위한 별도로 포장된 비히클이 포함된다. 대안적으로, 키트는 생체접합된 제제, 및 이를 투여 가능한 투여 형태로 재구성하기 위한 지침만을 포함할 수 있다. 항암 요법의 진행은 치료 중인 특정 질환에 대해 확립된 기술 및 검정에 의해 모니터링된다.
본 발명의 생체접합체에 대한 투여 지침의 경우, 시판 중인 생체접합체인 KADCYLA™(아도-트라스투주맙 엠탄신)의 권장 투여량은 질환이 진행될 때까지 또는 허용 불가능한 독성이 나타날 때까지 3주마다(21일 주기로) 정맥내 주입되는 3.6 mg/kg이라는 것, 또는 유방암 환자의 경우 총 14주기로 투여된다는 것을 누구나 이해할 수 있어야 한다.
따라서, 생체접합체의 유효량은, 정상적인 줄기 세포와 연관된 특성, 구체적으로는 특정 암 샘플에서 발견되는 모든 세포 유형을 생성하는 능력을 갖는 암세포(종양 또는 혈액암 내에서 발견되는 암세포)인 AFPR+ 암 줄기 세포(CSC)를 포함하여, 세포독소-반응성이고 AFPR+에 대해 양성인 질환 세포 및 악성 종양의 성장 또는 증식 속도를 지연시키거나 억제하기 위한 단위 투여량으로서 또는 이를 위한 치료 요법의 일부로서 효과적인 양이다.
생체접합체는, 혈액암 및 고형 종향을 포함하여, 암세포 및 이를 포함하는 종양의 성장 또는 증식을 억제하기 위해 다양한 세포독소-반응성 암을 치료하는 데 유용하다. 대상체에게 투여되는 조성물의 특정 투여량은, 예를 들어 투여 경로, 투여 빈도, 수용자의 상태, 및 치료 중인 암의 유형에 따라 달라질 것이다. 치료에 적합한 암은 AFP 수용체를 발현하는 암이다. 유방암, 난소암, 대장암, 자궁내막암, 위암, 폐암, 림프종, 전립선암, 및 간암을 포함하여, 인간 암 또는 암 세포주에서 AFPR의 입증된 발현이 나타났다. 이들 암의 전이도 본원에 기술된 방법에 따라 치료될 수 있다.
용어 “대상체”, “환자”, 및 “수용자” 모두는 특히 인간을 포함하는 포유동물을 지칭하지만, 다른 영장류, 가축, 애완동물, 말 등을 또한 지칭한다. 본 발명의 생체접합체로 치료한 대상체는 내인성 AFP 수용체가 대상체의 건강한 세포 및 조직에 만연하지 않도록 적어도 약 3개월령이어야 한다는 것을 이해할 것이다. 또한, 비인간을 치료하는 데 사용되는 생체접합체는 바람직하게는 해당 종에 특이적인 AFP의 형태를 포함한다.
표적화된 세포독성제를 다른 요법과 병용 투여하는 것이 일반적이므로, 당업자는 생체접합체가 면역 요법을 포함하는 다른 암 요법과 병용으로 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
생체접합체는 유용한 다른 치료제와 병용으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 하나 이상의 추가 치료제와 “병용으로” 투여하는 것은 동시에 (공동으로) 투여하는 것 및 임의의 순서로 연속 투여하는 것을 포함한다. 다른 치료 요법이 본 발명의 항암제의 투여와 조합될 수 있다. 예를 들어, 이러한 항암제로 치료받을 환자는 외부 빔 조사와 같은 방사선 요법을 받을 수도 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 화학요법제 또는 생물학적 제제가 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 화학요법제 또는 생물학적 제제에 대한 제조 및 투여 일정은 제조사의 지침에 따라 사용되거나 숙련된 실무자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 화학요법제는 생체접합체를 투여하기 전에 투여되거나, 그 다음에 투여되거나, 동시에 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 생체접합체는 관문 억제제 또는 CAR-T 제제와 같은 면역 자극제와 병용으로 사용될 수 있는데, 이는 이러한 면역-종양학 약물의 효능이 MDSC가 존재할 때 감소되기 때문이다. AFP 생체접합체에 의한 MDSC의 감소(또는 제거)는 면역 종양학 제제의 효능을 크게 향상시킬 것이다.
본 발명의 생체접합체 및 약학적 조성물은 원하는 경우 추가 치료제, 예를 들어 추가 항암제, 예를 들어 CAR-T 제제, 면역 관문 억제제, 알킬화제, 알킬 설포네이트, 아지리딘, 에틸렌이민 및 메틸아멜아민, 아세토게닌, 아우리스타틴, 캄프토테신, 브리오스타틴, 칼리스타틴, CC-1065, 크립토피신, 돌라스타틴, 듀오카마이신, 엘레유테로빈, 판크라티스타틴, 사르코딕티인, 스폰지스타틴, 질소 머스타드, 항생제, 에네디엔 항생제, 디네마이신, 비스포스포네이트, 에스페라마이신, 발색단백질 에네디인 항생제 발색단, 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 아자시티딘, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 켈라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 유베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물, 엘로티닙, 베무라페닙, 크리조티닙, 소라페닙, 이브루티닙, 엔잘루타미드, 엽산 유사체, 퓨린 유사체, 안드로겐, 항-부신제, 프롤린산과 같은 엽산 보충제, 아세글라톤, 알도포스파미드 글리코시드, 아미노레불린산, 에닐루라실, 암사크린, 베스트라부실, 비산트렌, 에다트렉세이트, 데포파민, 데메콜신, 디아지쿠온, 에플로르니틴, 아세트산엘립티늄, 에포틸론, 에토글루시드, 질산갈륨, 하이드록시우레아, 렌티난, 로니다이닌, 메이탄시노이드, 미토구아존, 미톡산트론, 모피다몰, 니트라에린, 펜토스타틴, 페나메트, 피라루비신, 로속산트론, 포도필린산 2-에틸하이드라지드, 프로카르바진, PS® 다당류 복합체(JHS Natural Products, Eugene, OR), 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2’,2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A, 및 안기딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드(“Ara-C”), 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸(Camptosar, CPT-1 1), 국소이성화효소 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴; 레티노이드; 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린; 옥살리플라틴; 세포 증식을 감소시키는 PKC-알파, Raf, H-Ras, EGFR, 및 VEGF-A의 억제제(예컨대 항체); 및 이들의 약학적으로 허용 가능한 염, 산, 또는 유도체; 또는 이들의 조합과 병용으로 사용될 수 있다.
본 발명의 생체접합체 및 약학적 조성물은 항암 항체 또는 폴리펩티드, 예를 들어 아바고보맙, 아데카투무맙, 아푸투주맙, 알렘투주맙, 알투모맙, 아마툭시맙, 아나투모맙, 아르시투모맙, 바비툭시맙, 벡투모맙, 베바시주맙, 비바투주맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙, 칸투주맙, 카투막소맙, 세툭시맙, 시타투주맙, 식수투무맙, 클리바투주맙, 코나투무맙, 다라투무맙, 드로지투맙, 둘리고투맙, 두시지투맙, 데투모맙, 다세투주맙, 달로투주맙, 에크로멕시맙, 엘로투주맙, 엑시툭시맙, 에르투막소맙, 에타라시주맙, 파를레투주맙, 피클라투주맙, 피지투무맙, 플란보투맙, 푸툭시맙, 가니투맙, 겜투주맙, 지렌툭시맙, 글렘바투무맙, 이브리투모맙, 이고보맙, 임가투주맙, 인다툭시맙, 이노투주맙, 인테투무맙, 이필리무맙, 이라투무맙, 라베투주맙, 렉사투무맙, 린투주맙, 로르보투주맙, 루카투무맙, 마파투무맙, 마투주맙, 밀라투주맙, 민레투모맙, 미투모맙, 목세투모맙, 나르나투맙, 납투모맙, 네시투무맙, 니모투주맙, 노페투모맙, 오카라투주맙, 오파투무맙, 올라투맙, 오나르투주맙, 오포르투주맙, 오레고보맙, 파니투무맙, 파르사투주맙, 파트리투맙, 펨투모맙, 퍼투주맙, 핀투모맙, 프리투무맙, 라코투모맙, 라무시루맙, 라드레투맙, 릴로투무맙, 리툭시맙, 로바투무맙, 사투모맙, 시브로투주맙, 실툭시맙, 심투주맙, 솔리토맙, 타카투주맙, 타플리투모맙, 테나투모맙, 테프로투무맙, 티가투주맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, 튜코투주맙, 유블리툭시맙, 벨투주맙, 보르세투주맙, 보투무맙, 잘루투무맙, CC49, 3F8, 또는 이들의 임의의 조합과 병용으로 사용될 수도 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 본원에 기술된 장애의 치료에 유용한 AFP:세포독소 생체접합체(들)를 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 본 발명은 생체접합체를 용액의 형태로 또는 동결건조되거나 동결된 형태로, 적절한 표지가 부착된 용기에 포함한다. 적절한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기, 및 시험관을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성될 수 있다. 용기는 병태를 치료하는 데 효과적인 조성물을 보유하며, 멸균 액세스 포트를 가질 수 있다(예를 들어 용기는 정맥주사 용액 백이거나, 피하 주사용 바늘로 천공할 수 있는 마개가 구비된 바이알일 수 있음). 용기 상의 표지 또는 용기와 연관된 표지는 조성물이 암 병태를 치료하는 데 사용된다는 것을 나타낸다. 제조 물품은 식염수, HEPES-완충액, 인산염-완충 식염수, 주사용수 등을 포함하여, 약학적으로 허용 가능한 완충액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는, 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 주사기, 및 본 발명에 따라 사용하기 위한 지침이 포함된 패키지 삽입물를 포함하여, 상업적 관점에서 및 사용 관점에서 바람직한 다른 물품을 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법에 유용한 AFP 제조 표준 물질과 같은 대조군 제제 또는 표준 물질 및 교정자(calibrator)가 키트에 포함될 수도 있다.
따라서, 알파 태아단백질(AFP) 수용체는 종양 태아 항원이고 암 치료제의 신규한 표적이라는 것을 이해할 것이다. 이러한 수용체는 많은 흔한 암의 표면에서 고도로 발현되지만, 일반적으로 정상적인 성체 세포에서는 발현되지 않는다. 신규한 메이탄시노이드 독소를 AFP의 재조합 인간 형태에 공유 접합시킴으로써, 독소 페이로드는 정상 세포를 보존하면서 암세포에 선택적으로 전달될 수 있다. AFP는 인간 단백질이기 때문에, AFP 생체접합체에 대한 유해한 면역 반응의 위험이 감소된다.
합성의 실시예
링커 구조(일메틸 대 이메틸)만이 상이한 2가지 형태의 생체접합체를 제조하고, 일부 경우에 메이탄시노이드 DM1 및/또는 DM3 및/또는 DM4에 기초한 생체접합체와 비교하였다. 이들의 합성에 대한 일반적인 접근법이 아래에 나타나 있으며, 여기서 R은 시약 세포독소이고 P는 단백질인 AFP이다.
1) AFP의 제조
2007년 4월 24일에 공개되고 그 전체가 참조로서 본원에 통합된 Merrimack의 US 7208576에 기술된 방식으로, 당질화가 결여된 성숙한 [Asn233Gln]rhAFP(1~591)를 유전자이식 염소에서 생산하고, 염소 우유로부터 회수하였다. 이러한 형태의 AFP를 ACT-101로 지정하였는데, 상기 형태는 성숙한 AFP에 Asn233Gln 치환이 포함된 서열번호 3을 갖는다.
2) 세포독소:링커 생체접합체의 제조
ABZ981로 지정된 메이탄시노이드 유사 세포독서를 WO2018/051109에 기술된 방식으로 먼저 생산한 다음, 다음의 방식으로 이황화 글루타티온-민감성 링커와 공유 결합시켰다:
일반 분석 방법: 링커-페이로드를 아래에 표시된 바와 같이 합성하였다. 사용된 모든 용매를 그대로 사용하였는데, 이들은 Sigma Aldrich 또는 Fisher Scientific으로부터 구입하였다. Varian Inova 500 MHz NMR 기기를 이용해 1H-NMR 스펙트럼을 기록하였다. 화학적 이동(δ)은 분석에 사용된 NMR 용매와 관련하여 ppm 단위로 보고하였다. 커플링 상수(J)를 헤르츠(Hz) 단위로 보고하였다. 크로마토그래피 순도는 Kinetex® 1.7 μm C18 100 Å 컬럼(50 x 2.1 mm)을 사용하는 Waters UPLC/MS-5SQD 시스템으로 이용해 다음의 분석 UPLC 방법을 사용해 결정하였다; 주입 부피 2~5 μL; 유속 0.6 mL/분; 2.5 내지 5분에 걸쳐 물 중 10~90% 아세토니트릴; 254 nm에서 ACQUITY UPLC 광다이오드 어레이(PDA) 검출기; 실온. 크로마토그래피 순도는 Chromolith® FastGradient RP-18e 분석 컬럼(50 × 2 mm, Merck KGaA, P/N 1.52007.0001)을 사용하는 Agilent 6130, 1260 Infinity, LC/MS 시스템을 이용해 결정하였다.
표적 화합물의 합성
합성 반응식:
실험 절차
화합물 A 및 ABZ-947의 합성
화합물 A:
실온에서 아르곤 하에, 26 mL의 무수 THF 중 메이탄시놀(2.6 g, 4.60 mmol) 및 DMAP(0.56 g, 4.60 mmol)의 혼합물 용액에 ZnHMDS(4.6 mL, 11.50 mmol)를 적가하였다. 혼합물을 30분 동안 교반하여 갈색 현탁 용액을 수득하였다. 이 용액에 이소부티르 무수물을 적가하였다. 생성된 용액을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. LC/MS에 의한 분취액은 반응이 완료되어 원하는 생성물이 수득되었음을 나타냈다. 미정제물을 포화 NH4Cl 용액(100 mL)으로 퀀칭시키고, 100 mL의 아세트산에틸로 희석하고, 유기층을 분리하였다. 수성층을 아세트산에틸(120 mL x 2)로 추출하였다. 합쳐진 유기물을 물(50 mL), 염수 용액(50 mL)으로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 농축시킨 후 미정제 갈색 고형분을 수득하고, 이를 HP 120 g Gold 컬럼 ISCO 시스템을 사용하여 DCM 중 5% MeOH로 정제하여 1.48 g(51%)의 화합물 A를 수득하였다. MS (ESI, pos.): C32H43ClN2O9에 대해 계산된 값 634.27; 확인된 값 635.3 (M+H), 1293.4 (2M+Na). 또 다른 배치를 완료하고 다음 단계를 위해 합쳤다.
ABZ-947:
사용에 앞서, 물과 THF의 혼합물을 아르곤으로 완전히 탈기시켰다. 100 mL의 둥근 바닥 플라스크에 담긴 화합물 A(3.10 g, 4.88 mmol), 4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)아닐린(1.60 g, 7.32 mmol), 및 K3PO4(4.14 g, 19.52 mmol)의 혼합물에 THF(50 mL) 및 H2O(7 mL)를 채웠다. 교반 혼합물을 진공에 의해 탈기하고 아르곤으로 재충진하였다. 이를 3회 반복하고 아르곤으로 추가로 탈기하였다. 그런 다음, SphosPd-G3(0.38 g, 0.488 mmol, 0.1당량)을 첨가하고 격막으로 캡핑하였다. 혼합물을 아르곤 하에 추가로 탈기하고 실온에서 밤새 교반하였다. 반응이 완료될 때까지 반응의 진행을 LC/MS에 의해 모니터링하였다. 수성 NH4Cl 용액(30 mL)을 첨가하여 반응을 퀀칭시켰다. 미정제물을 셀라이트 패드로 여과하여 맑은 용액을 수득하였다. 수성층을 아세트산에틸(120 mL x 2)로 추출하였다. 아세트산에틸 층을 물, 염수로 세척하고, Na2SO4로 건조시켰다. 농축시킨 후 미정제 진황색 고형분을 수득하고, 이를 HP 120 g Gold 컬럼 ISCO 시스템을 사용하여 DCM 중 5% MeOH로 정제하여 3.37 g(89%)의 ABZ-947을 수득하였다. MS (ESI, pos.): C38H49N3O9에 대해 계산된 값 691.35; 확인된 값 692.3 (M+H), 1383.8 (2M+H).
화합물 B 및 ABZ-981의 합성
화합물 B:
8 mL의 무수 DMF 중 ABZ-947(237 mg, 0.0342 mmol), 4-((5-니트로피리딘-2-일)디설파닐)펜탄산(101 mg, 0.753 mmol), 및 HATU(390 mg, 1.03 mmol)의 교반 용액을 0℃로 냉각시킨 다음, DIEA(0.24 mL, 1.37 mmol)를 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 실온으로 가온시키고 밤새 교반하였다. UPLC를 사용하여 분취액을 처리하자, UPLC는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 물(20 mL) 및 염수(20 mL)로 희석하였다. 혼합물을 아세트산에틸(50 mL x 2)로 추출하였다. 유기층을 진공에서 농축시켜 미정제 생성물을 수득하였다. 미정제물을 DMSO(5 mL)로 희석한 다음, C18 수성 150 g ISCO 컬럼(개질제로서 0.05% AcOH가 포함된 물 중 5% ACN 내지 95% ACN)으로 정제하였다. 순수 분획을 수집하고, 동결시키고, 동결건조시켜 253 mg(77%)의 화합물 B를 담갈색 고형분으로서 수득하였다. MS (ESI, pos.): C48H59N5O12S2에 대해 계산된 값 961.36; 확인된 값 962.42 (M+H).
ABZ-981:
ACN(1 mL)과 물(0.8 mL)의 혼합물 중 화합물 B(22 mg, 0.0207 mmol) 및 TCEP·HCl(59 mg, 0.207 mmol)의 용액에 포화 NaHCO3 용액(1.2 mL)을 pH가 7~8에 도달할 때까지 서서히 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 분취액으로 수행한 LC/MS 결과는 반응이 완료되었음을 나타냈다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 50 mL의 아세트산에틸로 희석한 다음 염수(20 mL)를 첨가하였다. 유기물을 분리하고 진공에서 농축시키고, 이를 C18 수성 50 g의 ISCO 컬럼(개질제로서 0.05% AcOH가 포함된 물 중 5% ACN 내지 95% ACN)으로 정제하였다. 순수 분획을 수집하고, 동결시키고, 동결건조시켜 14 mg(83%)의 ABZ-981을 백색 고형분으로서 수득하였다. MS (ESI, pos.): C43H57N3O10S에 대해 계산된 값 807.38; 확인된 값 808.92 (M+H).
화합물 C 및 ABZ-982의 합성:
화합물 C:
화합물 B(420 mg, 0.436 mmol)가 담긴 40 mL 투명 바이알에 DMF(6 mL)를 첨가하고 교반하여 맑은 용액을 수득하였다. PBS pH = 7.4 완충액(2.0 mL)에 이어서 4-메르캅토펜탄산(234 mg, 1.746 mmol)을 실온에서 첨가하였다. 30분 동안 교반하고 LC-MS 상에서 반응 진행을 모니터링하였다(반응이 완료되지 않은 경우, 반응이 완료될 때까지 교반함). 반응 완료 후, 반응 혼합물을 진공에서 농축시키고, 1 mL의 DMSO로 희석하고, 사전 평형화된 C18 수성 100 g 컬럼으로 옮겼다. 용리액(개질제로서 0.05% AcOH가 포함된 물 중 10% ACN 내지 95% ACN)을 사용하여 정제를 수행하였다. 순수 분획을 수집하고, 동결시키고, 동결건조시켜 317 mg(77%)의 화합물 C를 백색 고형분으로서 수득하였다. MS (ESI, pos.): C48H65N3O12S2에 대해 계산된 값 939.40; 확인된 값 940.54 (M+H).
ABZ-982:
화합물 C(300 mg, 0.319 mmol)가 담긴 40 mL 투명 바이알에 DCM(10 mL)을 첨가하고 교반하여 맑은 용액을 수득하였다. EDCI(110 mg, 0.574 mmol)에 이어서 NHS(55 mg, 0.479 mmol)를 아르곤 하에 얼음조에서 첨가하였다. 생성된 용액을 16~24시간 동안 교반하고, LC-MS에 의해 반응 진행을 모니터링하였다. 반응 완료 후, 미정제물을 감압 하에 농축시켰다. 미정제물을 1 mL의 DMSO로 용해시키고, 사전 평형화된 C18 수성 150 g 컬럼에 채웠다. 용리액(개질제로서 0.05% AcOH가 포함된 물 중 10% ACN 내지 95% ACN)을 사용하여 정제를 수행하였다. 순수 분획을 수집하고, 동결시키고, 동결건조시켜 280 mg(85%)의 ABZ-982를 백색 고형분으로서 수득하였다. MS (ESI, pos.): C52H68N4O14S2에 대해 계산된 값 1036.42; 확인된 값 1037.71 (M+H).
화합물 D 및 ABZ-1827의 합성:
화합물 D:
화합물 B(500 mg, 0.519 mmol)가 담긴 40 mL 투명 바이알에 DMF(7 mL)를 첨가하고 교반하여 맑은 용액을 수득하였다. PBS pH = 7.4 완충액(2.5 mL)에 이어서 4-메르캅토펜탄산(250 mg, 2.08 mmol)을 실온에서 첨가하였다. 짙은 색의 반응 혼합물을 30분 동안 교반하고 LC-MS 상에서 반응 진행을 모니터링하였다(반응이 완료되지 않은 경우, 반응이 완료될 때까지 교반함). 반응 완료 후, 반응 혼합물을 진공에서 농축시키고, 1 mL의 DMSO로 희석하고, 사전 평형화된 C18 수성 150 g 컬럼으로 옮겼다. 용리액(개질제로서 0.05% AcOH가 포함된 물 중 10% ACN 내지 95% ACN)을 사용하여 정제를 수행하였다. 순수 분획을 수집하고, 동결시키고, 동결건조시켜 351 mg(73%)의 화합물 D를 백색 고형분으로서 수득하였다. MS (ESI, pos.): C47H63N3O12S2에 대해 계산된 값 925.39; 확인된 값 926.73 (M+H).
ABZ-1827:
화합물 D(350 mg, 0.377 mmol)가 담긴 40 mL 투명 바이알에 DCM(10 mL)을 첨가하고 교반하여 맑은 용액을 수득하였다. EDCI(130 mg, 0.680 mmol)에 이어서 NHS(65 mg, 0.565 mmol)를 아르곤 하에 얼음조에서 첨가하였다. 생성된 용액을 16~24시간 동안 교반하고, LC-MS에 의해 반응 진행을 모니터링하였다. 반응 완료 후, 미정제물을 감압 하에 농축시켰다. 미정제물을 1.5 mL의 DMSO로 용해시키고, 사전 평형화된 C18 수성 150 g 컬럼에 채웠다. 용리액(개질제로서 0.05% AcOH가 포함된 물 중 10% ACN 내지 95% ACN)을 사용하여 정제를 완료하였다. 순수 분획을 수집하고, 동결시키고, 동결건조시켜 270 mg(70%)의 ABZ-1827을 백색 고형분으로서 수득하였다. MS (ESI, pos.): C51H66N4O14S2에 대해 계산된 값 1022.40; 확인된 값 1023.75 (M+H).
DPR 값이 상이한 AFP 생체접합체를 제조하기 위해, AFP 단백질을 30 kDa MWCO 필터를 이용해 10 mM HEPES pH 7.5 완충액으로 완충액 교환하였다. 완충액 교환 후, 단백질 농도가 5 mg/mL로 조정되었다. 접합 반응을 위해, 소량의 DMSO를 반응에 첨가한 다음, ABZ982 또는 ABZ1827 링커-페이로드(DMSO가 포함된 10 mM 스톡 용액으로서 새롭게 제조함)를 첨가하였다. 반응 혼합물에 존재하는 DMSO의 총량은 10%(v/v)였다 (DPR 3-4 생체접합체의 경우 7당량의 링커-페이로드, DPR 5-6 생체접합체의 경우 10당량의 링커-페이로드). 반응 혼합물을 실온(22℃)에서 튜브 리볼버(tube revolver)를 이용해 10 rpm/분의 속도로 16~20시간 동안 혼합하였다. 30 kDa MWCO 필터를 사용하여 미정제 생체접합체를 10 mM HEPES, 5% 수크로오스, pH 7.5로 완충액 교환하여 생체접합체를 정제하였다. 정제된 생체접합체를 멸균 여과하고 -80℃에서 보관하였다.
DPR이 정의된 생성물의 경우, 각각의 접합 반응 용액을 동일한 부피의 50 mM 인산나트륨, 2 M NaCl, pH 7과 혼합하였다. 각각의 생체접합체를 50 mM 인산나트륨, pH 7, 20% 이소프로판올의 구배를 사용해 컬럼에서 용리하였다. 미정제 용액을 동일한 부피의 50 mM 인산나트륨, 4 M NaCl, pH 7과 혼합하고, 생성된 용액을 50 mM 인산나트륨, 2M NaCl, pH 7로 평형화된 ToyoPearl Phenyl-650S HIC 컬럼 상에 로딩하였다. 상이한 값의 DPR을 함유하는 분획을 모아서 농축시켰다. 농축된 샘플을 pH 7.1~7.5의 PBS로 완충액 교환하고, 멸균 여과하였다(0.22 um PVDF 막). DPR 할당은 A248/A280 흡수 비율에 기초하였다. 평균 DPR은 280 nm에서의 HIC 분석 후 개별 DPR 종의 상대 피크 면적으로부터 계산하였다.
생체접합체 시험
리드 화합물을 시험관 내에서 시험하기 전에, AFP 수용체의 발현 및 형광 표지된 rhAFP에 결합하여 이를 흡수하는 세포의 능력을 아래 표 1에 요약된 연구에서와 같이 U937 세포주뿐만 아니라 다른 세포주에서도 확립하였다. 본 연구에서, 상업적으로 이용 가능한 Alexa Fluor-647(AF-647) 단백질 표지 키트의 제품 프로토콜에 기술된 절차를 사용하여 rhAFP를 표지하였다. 결합 실험을 96-웰 플레이트에서 수행하고, 플레이트 판독기를 사용하여 형광을 측정하였다. 종양 세포를 현탁액에서 배양하거나 세포 배양 배지에 도말하였다. 각각의 종양 세포주를 AF-647로 표지된 rhAFP와 함께 37℃에서 0.5, 2, 및 5시간 동안 인큐베이션하였다(n=3 반복). 얼음을 이용해 냉각시켜 인큐베이션을 중단시켰다. 현탁액 중 세포의 경우, 원심분리에 의해 세포 및 배양 배지를 별도로 수집하고, 반복 세척 단계를 수행하였다. 도말된 세포의 경우, 트립신/EDTA를 사용해 세포를 분리하였다. MOLT-4를 제외한 대부분의 세포주는 높은 결합을 나타냈으며, MCF7(유방암)은 시험된 모든 세포주에 대해 가장 높은 결합을 나타냈고, 그 다음으로 U937(림프종) 및 COLO-205(대장암)가 높았다.
다른 AFP 수용체 결합 연구에서, rhAFP는 FluoroTag™ FITC 접합 키트를 사용하여 Alexa Fluor-488 또는 FITC로 표지하였고, 유사한 결과를 달성하였다.
DM1, DM3, DM4, 또는 ABZ981을 함유하는 일련의 생체접합체를 다양한 반응 조건 하에서 합성하여, 상이한 평균 DPR을 생성하였다. 이들 생체접합체의 세포독성을 종양 세포주 패널(백혈병, 유방암, 대장암, 난소암, 및 폐암)에서 시험관 내에서 평가하였다. 결과는 아래 표 2에 요약되어 있다.
시리즈 1 생체접합체 중, ABZ981 접합체의 DPR이 가장 높았지만(7.5), U937 세포주에서의 효능은 DPR이 더 낮은(4.4~5.1) 합성된 다른 접합체와 유사하였다. DM4 접합체(DPR 4.4) 또한 MCF-7 세포주에서 ABZ981 접합체와 유사한 효능을 가졌다. 그러나, DM1 및 DM3 접합체의 효능은 이 세포주에서 약 3배 더 낮았다.
유사한 DPR(3.5~4)로 합성한 시리즈 2 접합체에서, DM4 접합체는 조사한 세포주 가운데 가장 강력했지만, ABZ981 접합체(DPR 3.5)는 3~15배 덜 강력했다.
이들 결과는 시험관 내 효능이 반드시 DPR과 관련되는 것은 아님을 나타냈다.
마우스 및 인간 혈청에서 37℃에서 각각 3일 및 7일 동안 인큐베이션한 시리즈 2 AFP 생체접합체를 인큐베이션하는 생체 외 연구를 수행하였다. 생체접합체를 항-AFP 항체로 충진된 Innova 자성 비드 상에 포획하였다. 포획된 샘플을 LC-ESI-MS에 의해 분석하여 단백질의 DPR 프로파일 및 무결성을 확인하였다. 모든 생체접합체는 양호한 안정성을 나타냈으며, 3일 후 마우스 혈청에서 DPR은 평균 -5.9% 내지 -13.5% 감소하였고, 7일 후 인간 혈청에서 DPR은 평균 -8.1% 내지 15.8% 감소하였다.
종양 보유 마우스에서의 생체분포/약동학
COLO-205 종양 이종이식편을 피하 이식한 마우스를 대상으로 한 약동학/생체분포(PK/BD) 연구에서의 비교 시험을 위해, DM4, DM1, 또는 ABZ981을 함유하는 생체접합체를 약 4의 DPR로 재합성하였다(표 3).
투여 부피를 조정하여 동일한 양의 생체접합체(25 mg/kg)를 꼬리 정맥 내로 1회 IV 주사하여 각 동물 군에 전달하였다. 주사 후 0.25시간 및 1시간차에 혈액 샘플을 채취하고, 4, 8, 및 24시간차에 혈액 및 조직 샘플을 채취하여 생체접합체의 약동학 및 생체분포를 평가하였다(시점 당 n=3). 상업적으로 이용 가능한 ELISA 키트를 사용하여 AFP 수준을 측정하고, 유리 메이탄신 및 이의 대사산물의 수준은 LC/MS에 의해 측정하였다. 이 기간에 걸쳐 혈액에서 무시할 만한 양의 유리 독소가 검출되었는데(주입된 총 투여량의 0.001% 이하), 이는 마우스 혈청을 대상으로 한 생체 접합체의 생체 외 안정성과 일치한다.
생체접합체의 종양 흡수 및 독소 방출 및 대사
종양으로의 독소 전달(유리 메이탄신 + 대사산물)은, ng/mg(조직)으로서 표현했을 때 또는 투여된 총 투여량의 백분율로서 표현했을 때, 다른 군과 비교하여 모든 시점에 DM 기반 접합체에 비해 AFP-ABZ981 접합체가 가장 높았다. AFP-ABZ981 접합체로 달성된 수준은 DM1 및 DM4 접합체보다 각각 약 3배 및 22배 더 높았다. AFP-ABZ981 접합체가 DM4 접합체에 비해 시험관 내에서 더 강력하지 않았기 때문에, 이는 예상 밖이었다. AFP에 대해 정규화했을 때, AFP-ABZ981 접합체 군에서의 피크 유리 독소 수준은 종양에서의 AFP 수준의 18%였는데, 이는 독소의 상당한 백분율이 AFP에 결합된 상태로 남아 있음을 시사한다. 그러나, 종양에서의 독소 방출은 AFP-ABZ981 접합체의 경우 AFP-DM4 및 AFP-DM1 접합체보다 높았다(각각 약 1 및 9%). AFP-ABZ981 접합체로 더 높은 수준의 독소를 달성한 것은 입체 장애가 더 적었기 때문일 수 있는데, 이는 이 접합체와의 이황화 결합의 일 측에는 단일 메틸기만이 있기 때문이다.
이어서, 2개의 상이한 방출 기능(AFP-ABZ9812 및 AFP-ABZ1827)을 갖는 ABZ981을 함유하는 생체접합체를 2.5 내지 6.3의 DPR로 제조하였다. U937 및 SKOV3 세포주를 대상으로 한 시험관 내 시험 결과는 표 4에 나타나 있다. 8점 농도 범위에 걸쳐 화합물이 존재하는 가운데 세포를 4일 동안 인큐베이션하였으며, 각 농도를 3회 시험하였다. 새롭게 해동시킨 U937 세포를 사용하여 수행한 2가지 실험은 배양물에서 유지시킨 U937 세포와 유사한 결과를 나타냈다.
AFP 수용체에 대한 이들 생체접합체의 특이적 결합은 형광 표지된 rhAFP를 사용하여 U937 세포주에서의 경쟁 실험에 의해 확인하였다(도 1). 간략하게, 배양된 U-937 세포를 37℃에서 2시간 동안 무혈청 배지로 옮기고, AlexaFluor488-표지된 rhAFP와 함께 공동 인큐베이션하고, 표지되지 않은 rhAFP 또는 생체접합체를 4℃에서 1시간 동안 적정하였다. 세포를 세척하고, 고정시키고, 유세포 분석법으로 분석하였다.
표 5로 돌아가서, COLO-205 인간 종양 이종이식 모델에서 생체 내 효능 시험을 위해 AFP-ABZ982 및 AFP-ABZ1827 각각의 2개의 생체접합체(총 4개)를 약 4(“낮은 DPR”) 및 6(“높은 DPR”)의 DPR로 제조하였다. 이식 전에, COLO-205 세포주에서의 효능을 평가하였다. 간략하게, 96 웰 플레이트에 COLO-205 세포를 웰 당 5,000개 또는 2,500개씩, 웰 당 50 νL의 총 부피로 시딩하였다. 플레이트를 밤새 인큐베이션한 다음, 37℃에서 72시간 동안 생체접합체로 처리한 다음, CellTiter-Glo 검정을 수행하여 세포 생존력을 측정하였다. 샘플별로 3회 실행하였다. DPR이 높은 생체접합체는 DPR이 낮은 생체접합체보다 더 강력했으며, 시험관 내에서 COLO-205에 대해 유사한 효능을 나타냈지만, DPR이 높은 AFP-ABZ982 생체접합체가 가장 강력하였으며, 접합되지 않은 독소 링커보다도 IC50이 낮았다.
종양 보유 마우스에서의 효능
본 실험에서, 약물-단백질 비율이 상이하고(AFP-ABZ982 높은 DPR/낮은 DPR; 및 AFP-1827 높은 DPR/낮은 DPR) 링커 구조가 약간 상이한 4개의 신규한 AFP-메이탄시노이드 생체접합체의 효능. 상기 4개의 ABZ981-함유 생체접합체를 재합성하고 pH 7.5의 10 mM HEPES 완충액, 5% 수크로오스에서 제형화하였다(표 6). 종양 보유 마우스에서 효능을 시험하기 전에, 효능 연구에 사용된 것과 동일한 0, 5, 10, 20, 및 40 mg/kg의 투여량의 투여 요법(2주 동안 Q1Dx5)을 사용하여, 건강한 마우스에서 각각의 생체접합체에 대한 최대 내약 투여량(MTD)을 결정하였다. MTD는 투여 기간 동안 매일 이루어진 임상 관찰 및 치료 종료 후 결정된 간 효소(AST/ALT)의 상승에 기초하였다. 놀랍게도, DPR이 높은 AFP-ABZ1827의 MTD는 DPR이 낮은 경우의 MTD보다 높았다. 일반적으로, 더 많은 양의 독소를 운반하는 DPR이 더 높은 생체접합체는 더 낮은 MTD를 가질 것으로 예상된다.
대장암 이종이식 모델에서, 7주령 무흉선 수컷 마우스에게 1 x 107개의 COLO-205 세포를 우측 옆구리에 피하 이식하였다. 약 100 mm3 내지 200 mm3의 종양을 가진 마우스를 대조군(비히클) 또는 4개의 생체접합체 중 하나(10마리/군)를 투여 받도록 무작위 배정하였다. 동물을 2주 동안 매일 치료하되, 5회 투여 후 2일 동안 휴약기를 두었고; 이식 후 60일 동안 종양 부피를 주 2회 평가하였다. 도 2 및 도 3은 본 연구에 의해 나타난 것과 같이, 대장암의 COLO 205 인간 이종이식 모델에서 본 발명의 생체접합체의 가치 있는 특성을 나타낸다.
도 2에 도시된 바와 같이, AFP 생체접합체 AFP-ABZ982 및 특히 AFP-ABZ1827은, 특히 AFP-ABZ982가 낮은 DPR로 사용될 때 및 AFP-ABZ1827이 높은 DPR로 사용될 때, COLO-205 종양의 성장에 극적인 억제 효과를 갖는다. 17일차에 시작하여 모든 대조군 동물을 안락사시킬 때까지, 대조군과 비교하여 모든 치료군에서 통계적으로 유의한(p<0.05) 종양 중량 감소가 지속적으로 관찰되었다. DPR이 높은 AFP-ABZ1827 군에서, 종양 퇴행은 더 일찍 발생하였고(14일차) 치료를 중단한 후에도 계속되었으며, 10마리 중 9마리에서 종양 부피가 검출 한계 미만으로 떨어졌다.
도 3에 도시된 바와 같이, 모든 생체접합체는 비히클 대조군과 비교했을 때 종양 보유 마우스의 전체 생존을 개선하였다. DPR이 높은 AFP-ABZ1827 군에서, 모든 마우스는 60일 관찰 기간 종료 후에도 생존한 반면, 대조군의 동물은 조절되지 않은 종양 성장으로 인해 38일차에 이르러 모두 사망하였다. 치료한 마우스에서 독성의 징후는 관찰되지 않았다.
본 연구에서, DPR이 높은 AFP-ABZ1827은, 종양 중량을 감소시키고 종양 보유 마우스의 전체 생존을 개선하는 맥락에서, DPR이 낮은 동등한 생체접합체 및 시험된 모든 다른 생체접합체보다 우월하였다.
상이한 투여량 수준에서 DPR이 높은 AFP-ABZ1827(ACT-903)에 대한 추가 연구는 COLO-205 이종이식 모델에서, 30 mg/kg, 40 mg/kg, 또는 50 mg/kg의 투여량으로 1회 IV 주사 후 14일차까지 종양 성장의 유의한 감소를 나타냈다(p<0.05). 이 연구에서, 이들 2가지 투여량 군에 대해 2차 투여량을 24일차에 투여하였다. 이 요법은 비히클 대조군과 비교하여 40 mg/kg 군(p<0.001) 및 50 mg/kg 군(p=0.0037)에서 유의하게 연장된 생존 기간과 관련이 있었다.
2명의 환자에서 유래된 난소암 오르가노이드(organoids)를 대상으로 DPR이 높은 AFP-ABZ1827(ACT-903)에 대한 추가 연구를 수행하였다. 형광 표지된 ACT-101을 사용한 연구를 통해, 난소 오르가노이드에 결합하고 이에 의해 신속하게 흡수되는 화합물로서 AFP 수용체의 존재를 확인하였다. ACT-903은 두 오르가노이드 모두에서 농도 및 시간 의존적 방식으로 세포 사멸을 효과적으로 유도하였다. 아넥신 V(AnnexinV) 염색을 사용하여, 실험에 사용된 양성 대조군(알려진 세포독소인 타프시가진(thapsigargin) 및 스타우로스포린(staurosporine))과 유사한, 낮은 농도의 ACT-903에서도 72시간차까지 대규모 세포자멸사가 관찰된 반면, 접합되지 않은 단백질(ACT-101)은 세포에 무해하였다.
난소 암종 이종이식 모델을 대상으로 높은 ACT-903에 대한 추가 연구를 수행하였다. 5 내지 7주령 무흉선 암컷 마우스에게 A2780 난소 종양 세포를 우측 옆구리에 피하 이식하였다. 마우스를 대조군(비히클) 또는 ACT-903(5마리/군)을 투여 받도록 무작위 배정하였다. 동물을 10일 동안 치료하되, 5회 투여 후 2일 동안 휴약기를 두었다. 치료 전 베이스라인 시점의 종양 부피는 108 mm3 내지 288 mm3의 범위였다. 이식 후 60일 동안 주 2회 종양 부피를 평가하였다. 도 4 및 도 5는 본 연구에 의해 나타난 것과 같이, 난소암의 A2780 인간 이종이식 모델에서 본 발명의 생체접합체의 가치 있는 특성을 나타낸다.
도 4에 도시된 바와 같이, ACT-903은 A2780 종양의 성장에 극적인 억제 효과를 갖는다. 종양 성장 곡선은 ACT-903 치료군에서 종양 부담의 유의한 감소를 나타내며(p<0.0001), 치료 후 모든 마우스에서 완전한 종양 퇴행(종양이 보이지 않거나 촉진되지 않음)이 나타났다. 또한, 치료가 종료된 후 60일의 관찰 기간 동안에도 종양 재성장은 나타나지 않았다.
도 5에 도시된 바와 같이, ACT-903은 비히클 대조군에 비해 생존을 유의하게 개선하며(p<0.0001), 대조군에서는 생존한 마우스가 없는 것과 비교해, ACT-903 치료군의 모든 마우스는 60일 관찰 기간의 종료 후에도 생존하였다.
따라서, AFP 수용체의 발현이, MDSC를 제외하고는 일반적으로 정상 조직에서 매우 낮거나 존재하지 않지만, 많은 흔한 암에 대량으로 존재하기 때문에, AFP 수용체는 암 치료제의 매우 매력적인 신규 표적이라는 것을 이해할 것이다. 또한, AFP는 모든 인간 태아가 자궁 내에서 노출되는 자연 발생 인간 단백질이기 때문에, rhAFP-세포독소 생체접합체에 대한 임의의 유해한 면역 반응의 위험이 감소된다.
본원에 기술된 생체접합체는 글루타티온에 의해 감소될 수 있는 이황화 링커를 함유하며, 이는 종양 세포 내부에 높은 농도로 존재하지만 혈류에서는 낮은 농도로 존재한다. 따라서, 본 발명의 생체접합체는, 종양 상에서 AFP 수용체의 차등 발현 및 종양 내에서 글루타티온 농도의 증가 둘 다에 기초하여 이중 종양-표적화 메커니즘을 제공할 것이다.
향후, 본원에서 청구된 것들을 포함하여, DPR이 낮은 AFP-ABZ982 및 DPR이 높은 AFP-ABZ982뿐만 아니라, 바람직하게는 DPR이 낮은 AFP-ABZ1827 및 DPR이 특히 높은 AFP-ABZ1827을 포함하는 접합체를 추가의 동물 모델에게 투여할 수 있다. 이들은 상이한 방출 기능 및 DPR 로딩을 대표한다. 시험관 내 효능은, 높게는 U937 세포주에서의 유리 세포독소만큼 낮은 nM 범위에 있다. 사용된 접합 조건 하에서 이량체 형성은 문제가 되지 않으며, 5% 수크로오스가 포함된 10 mM HEPES 또는 트리스-HCl 완충액 중 어느 하나에서 제형화했을 때의 생체접합체는 20℃에서 적어도 96시간 동안 안정하며, 마우스/인간 혈청에서 7일에 걸쳐 37℃에서 높은 혈청 안정성을 나타낸다.
본원에 인용된 간행물, 특허 출원, 및 특허를 포함하여 모든 참조 문헌은 참조로서 본원에 통합된다.

Claims (101)

  1. 질환 세포의 치료에 유용한 생체접합체로서,
    (1) AFPR+ 세포 표면 상의 알파-태아단백질(AFP) 수용체(AFPR)에 결합하는 제제;
    (2) AFPR+ 세포에 독성인 세포독소(CT); 및
    (3) 글루타티온-절단성 이황화 링커를 포함하되, 링커는
    (i) AFPR-결합제와 CT 사이에서 공유 결합되고,
    (ii) CT를 AFPR+ 세포에 대해 세포내 방출하는, 생체접합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 AFPR-결합제는 AFPR-결합 단편의 성숙한 야생형 AFP의 아미노산 서열 또는 상기 성숙한 야생형 AFP의 AFPR-결합 변이체의 아미노산 서열 또는 상기 AFP 단편의 아미노산 서열을 갖는, 생체접합체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 AFP는 재조합 인간 AFP, 또는 AFPR-결합 단편 또는 이의 변이체이고, 상기 변이체는 1~5개의 아미노산 치환을 포함하는, 생체접합체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 제제는 당질화가 결여된 AFP인, 생체접합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제제는 서열번호 3을 포함하는 재조합 [Asn233Gln] 성숙한 인간 AFP인, 생체접합체.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제제는 서열번호 4를 포함하는, 생체접합체.
  7. 제5항에 있어서, 상기 재조합 [Asn233Gln] 인간 AFP는 유전자이식 박테리아에 의해 생산되는, 생체접합체.
  8. 제5항에 있어서, 상기 재조합 [Asn233Gln] 인간 AFP는 유전자이식 염소를 포함하여, 유전자이식 포유동물에 의해 생산되는, 생체접합체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독소(CT)는 다음 식을 갖는, 생체접합체:
    .
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AFPR-결합제와 상기 세포독소 사이에서 결합된 링커는 다음으로부터 선택되는, 생체접합체:
    링커 1 -S-CH(CH3) -(CH2)2-CO--; 및
    링커 2 -S-(CH2)3-CO-.
  11. 제9항에 있어서, 상기 AFPR-결합제와 상기 세포독소 사이에서 결합된 링커는 다음으로부터 선택되는, 생체접합체:
    링커 1 -S-CH(CH3) -(CH2)2-CO--; 및
    링커 2 -S-(CH2)3-CO-.
  12. 제1항의 생체접합체를 생산하는 데 유용한 접합체로서, 아래에 도시된 링커-세포독소를 포함하는, 접합체:
    .
  13. 제1항에 따른 생체접합체를 생산하는 데 유용한 접합체로서, 아래에 도시된 링커-세포독소를 포함하는, 접합체:
    .
  14. 다음 식의 생체접합체로서:

    식 중 AFP는 알파-태아단백질의 AFP 수용체 결합 형태인, 생체접합체.
  15. 제14항에 따른 생체접합체를 포함하는 제제로서, n은 1 내지 11의 범위 내에 있는, 제제.
  16. 제15항에 있어서, 평균 DPR은 2 내지 8인, 제제.
  17. 제16항에 있어서, 평균 DPR은 5 내지 7인, 제제.
  18. 제17항에 있어서, 평균 DPR은 5.6 내지 6.1인, 제제.
  19. 제17항에 있어서, 평균 DPR은 5.9인, 제제.
  20. 제16항에 있어서, 평균 DPR은 3 내지 4.5인, 제제.
  21. 제20항에 있어서, 평균 DPR은 3.6 내지 4.1인, 제제.
  22. 제20항에 있어서, 평균 DPR은 3.9인, 제제.
  23. 제14항에 있어서, 상기 AFP는 서열번호 3을 포함하는 재조합 [Asn233Gln] 성숙한 인간 AFP인, 생체접합체.
  24. 제23항에 따른 생체접합체를 포함하는 제제로서, n은 1 내지 11의 범위 내에 있는, 제제.
  25. 제24항에 있어서, 평균 DPR은 2 내지 8인, 제제.
  26. 제25항에 있어서, 평균 DPR은 5 내지 7인, 제제.
  27. 제26항에 있어서, 평균 DPR은 5.6 내지 6.1인, 제제.
  28. 제26항에 있어서, 평균 DPR은 5.9인, 제제.
  29. 제24항에 있어서, 평균 DPR은 3 내지 4.5인, 제제.
  30. 제24항에 있어서, 평균 DPR은 3.6 내지 4.1인, 제제.
  31. 제24항에 있어서, 평균 DPR은 3.9인, 제제.
  32. 다음 식의 생체접합체로서:

    식 중 APF는 알파-태아단백질의 AFP 수용체 결합 형태인, 생체접합체.
  33. 제32항에 따른 생체접합체를 포함하는 제제로서, n은 1 내지 11의 범위 내에 있는, 제제.
  34. 제33항에 있어서, 평균 DPR은 2 내지 8인, 제제.
  35. 제34항에 있어서, 평균 DPR은 5 내지 7인, 제제.
  36. 제35항에 있어서, 평균 DPR은 5.5 내지 6.1인, 제제.
  37. 제35항에 있어서, 평균 DPR은 5.8인, 제제.
  38. 제34항에 있어서, 평균 DPR은 3 내지 4.5인, 제제.
  39. 제38항에 있어서, 평균 DPR은 3.4 내지 4.0인, 제제.
  40. 제38항에 있어서, 평균 DPR은 3.7인, 제제.
  41. 약학적으로 허용 가능한 담체 및 제17항에 따른 생체접합체를 포함하는 약학적 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 상기 담체는 수성 비히클인, 약학적 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 상기 수성 비히클은 5% 수크로오스가 포함된 pH 7.5의 10mM HEPES 완충액인, 약학적 조성물.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 AFPR+인 암을 앓고 있는 대상체에게 투여하기 위한, 약학적 조성물.
  45. 약학적으로 허용 가능한 담체 및 제1항 내지 제8항, 제14항, 및 제26항 중 어느 한 항에 따른 생체접합체를 포함하는 약학적 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 상기 담체는 수성 비히클인, 약학적 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 상기 수성 비히클은 5% 수크로오스가 포함된 pH 7.5의 10mM HEPES 완충액인, 약학적 조성물.
  48. 약학적으로 허용 가능한 담체 및 제1항 내지 제8항, 제14항, 및 제26항 중 어느 한 항에 따른 생체접합체를 포함하는 약학적 조성물로서, 상기 약학적 조성물은 AFPR+인 암을 앓고 있는 대상체에게 투여하기 위한, 약학적 조성물.
  49. 약학적으로 허용 가능한 담체 및 제9항에 따른 생체접합체를 포함하는 약학적 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 상기 담체는 수성 비히클인, 약학적 조성물.
  51. 　
  52. 제50항에 있어서, 상기 수성 비히클은 5% 수크로오스가 포함된 pH 7.5의 10mM HEPES 완충액인, 약학적 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 AFPR+인 암을 앓고 있는 대상체에게 투여하기 위한, 약학적 조성물.
  54. 약학적으로 허용 가능한 담체 및 제10항에 따른 생체접합체를 포함하는 약학적 조성물.
  55. 제54항에 있어서, 상기 담체는 수성 비히클인, 약학적 조성물.
  56. 제55항에 있어서, 상기 수성 비히클은 5% 수크로오스가 포함된 pH 7.5의 10mM HEPES 완충액인, 약학적 조성물.
  57. 제56항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 AFPR+인 암을 앓고 있는 대상체에게 투여하기 위한, 약학적 조성물.
  58. 약학적으로 허용 가능한 담체 및 제11항에 따른 생체접합체를 포함하는 약학적 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 상기 담체는 수성 비히클인, 약학적 조성물.
  60. 제59항에 있어서, 상기 수성 비히클은 5% 수크로오스가 포함된 pH 7.5의 10mM HEPES 완충액인, 약학적 조성물.
  61. 제60항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 AFPR+인 암을 앓고 있는 대상체에게 투여하기 위한, 약학적 조성물.
  62. AFPR+ 세포의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제31항에 따른 약학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 AFPR+ 세포는 암 세포인, 방법.
  64. 제62항에 있어서, 상기 AFPR+ 세포는 MDSC인, 방법.
  65. 제63항에 있어서, 상기 AFPR+ 세포는 난소암 세포인, 방법.
  66. 제63항에 있어서, 상기 AFPR+ 세포는 대장암 세포인, 방법.
  67. 제63항에 있어서, 상기 AFPR+ 세포는 유방암 세포인, 방법.
  68. 제63항에 있어서, 상기 AFPR+ 세포는 림프종 세포인, 방법.
  69. AFPR+ 세포의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제35항에 따른 약학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 AFPR+ 세포는 암 세포인, 방법.
  71. 제69항에 있어서, 상기 AFPR+ 세포는 MDSC인, 방법.
  72. 제70항에 있어서, 상기 AFPR+ 세포는 난소암 세포인, 방법.
  73. 제70항에 있어서, 상기 AFPR+ 세포는 대장암 세포인, 방법.
  74. 제70항에 있어서, 상기 AFPR+ 세포는 유방암 세포인, 방법.
  75. 제70항에 있어서, 상기 AFPR+ 세포는 림프종 세포인, 방법.
  76. AFPR+ 세포의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제49항에 따른 약학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  77. 제76항에 있어서, 상기 AFPR+ 세포는 암 세포인, 방법.
  78. 제76항에 있어서, 상기 AFPR+ 세포는 MDSC인, 방법.
  79. 제77항에 있어서, 상기 AFPR+ 세포는 난소암 세포인, 방법.
  80. 제77항에 있어서, 상기 AFPR+ 세포는 대장암 세포인, 방법.
  81. 제77항에 있어서, 상기 AFPR+ 세포는 유방암 세포인, 방법.
  82. 제77항에 있어서, 상기 AFPR+ 세포는 림프종 세포인, 방법.
  83. AFPR+ 세포의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제56항에 따른 약학적 조성물의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 AFPR+ 세포는 암 세포인, 방법.
  85. 제83항에 있어서, 상기 AFPR+ 세포는 MDSC인, 방법.
  86. 제84항에 있어서, 상기 AFPR+ 세포는 난소암 세포인, 방법.
  87. 제84항에 있어서, 상기 AFPR+ 세포는 대장암 세포인, 방법.
  88. 제84항에 있어서, 상기 AFPR+ 세포는 유방암 세포인, 방법.
  89. 제84항에 있어서, 상기 AFPR+ 세포는 림프종 세포인, 방법.
  90. AFPR+인 암을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 병용 치료에 있어서 제31항에서 정의된 것과 같은 약학적 조성물 및 제2 치료제의 용도.
  91. 제90항에 있어서, 제2 치료제는 면역 관문 억제제 또는 CAR-T 제제 또는 또 다른 면역-종양학 요법인, 용도.
  92. AFPR+인 암을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 병용 치료에 있어서 제35항에서 정의된 것과 같은 약학적 조성물 및 제2 치료제의 용도.
  93. 제92항에 있어서, 제2 치료제는 면역 관문 억제제 또는 CAR-T 제제 또는 또 다른 면역-종양학 요법인, 용도.
  94. AFPR+인 암을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 병용 치료에 있어서 제49항에서 정의된 것과 같은 약학적 조성물 및 제2 치료제의 용도.
  95. 제94항에 있어서, 제2 치료제는 면역 관문 억제제 또는 CAR-T 제제 또는 또 다른 면역-종양학 요법인, 용도.
  96. AFPR+인 암을 앓고 있는 대상체를 치료하기 위한 병용 치료에 있어서 제56항에서 정의된 것과 같은 약학적 조성물 및 제2 치료제의 용도.
  97. 제96항에 있어서, 제2 치료제는 면역 관문 억제제 또는 CAR-T 제제 또는 또 다른 면역-종양학 요법인, 용도.
  98. 생체접합체를 생산하는 프로세스로서, 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 AFP의 AFPR-결합 형태를 제12항에 따른 접합체와 결합시키는 단계를 포함하는, 프로세스.
  99. 생체접합체를 생산하는 프로세스로서, 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 AFP의 AFPR-결합 형태를 제13항에 따른 접합체와 결합시키는 단계를 포함하는, 프로세스.
  100. 생체접합체를 생산하는 프로세스로서, 세포독소 ABZ-981을 글루타티온-민감성 이황화 링커와 먼저 결합시켜 중간체를 생성하고:

    그런 다음, 이를 AFP의 AFPR-결합 형태, 즉 서열번호 3을 포함하는 재조합 [Asn233Gln] 성숙한 인간 AFP와 반응시키고, 상기 중간체를 AFP 내의 리신 잔기의 엡실론 아미노기에 공유 결합시키는, 프로세스.
  101. 생체접합체를 생산하는 프로세스로서, 세포독소 ABZ-981을 글루타티온-민감성 이황화 링커와 먼저 결합시켜 중간체를 생성하고:

    그런 다음, 이를 AFP의 AFPR-결합 형태, 즉 서열번호 3을 포함하는 재조합 [Asn233Gln] 성숙한 인간 AFP와 반응시키고, 상기 중간체를 AFP 내의 리신 잔기의 엡실론 아미노기에 공유 결합시키는, 프로세스.
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