CN117916253A - 用于疾病治疗的甲胎蛋白生物缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了一种用于癌症治疗的生物缀合物，所述生物缀合物包含通过二硫化物、谷胱甘肽敏感性接头与细胞毒素连接的甲胎蛋白(AFP)。在优选的实施方案中，所述生物缀合物是通过谷胱甘肽敏感性接头与类美登素细胞毒素连接的AFP变体，以使得所述生物缀合物包含每个AFP特定的高或低比率的细胞毒素。

Description

用于疾病治疗的甲胎蛋白生物缀合物
本申请要求2021年7月23日提交的美国临时专利申请63/203,467号的优先权，该临时专利申请以引用的方式并入本申请中。
技术领域
本发明涉及可用于治疗癌症以及其他疾病和病症的生物缀合物以及它们的制剂。本发明尤其涉及包含甲胎蛋白和细胞毒素的生物缀合物。
背景技术
抗体药物缀合物(ADC)是一类广泛的药物，其中细胞毒素连接至选择性地结合至病变细胞靶标的靶向剂，诸如抗体或其他蛋白质(生物缀合物)。细胞结合剂(靶向剂)和细胞毒素(有效负载)可以通过不同的接头结构共价连接。一些接头提供切割位点，一旦生物缀合物进入细胞，该切割位点就会在细胞内被消化以释放细胞毒素。一些接头是惰性的，但是可以自毁，并且将在胞质溶胶或溶酶体中分阶段降解以释放细胞毒素。可切割的接头提供更受控制和直接的药物释放机制，该机制依赖于酶促消化、pH改变以及其他胞内条件或试剂。
生物缀合物由许多高度可变的组分组成，为了获得最佳性质，每种组分都需要仔细选择单独以及与其他一种或多种试剂组合的每种组分。靶向剂应选择性地结合至病变细胞呈递的靶标，从而将毒性限制在靶标部位。生物缀合物应包含对病变细胞致命或至少有害的毒素，并且当生物缀合物进入细胞时，接头应允许细胞毒素的释放。靶向剂和生物缀合物之间形成的连接也应该是可切割的，并且每个靶向分子如此连接的毒素的数量是一个重要的参数。同样，组分偶联的顺序以及它们分离(或不分离)的方法可能是商业上有用的产量的关键。因此，生物缀合物本身应被细胞吸收，然后被细胞条件和组分加工，以提供毒性形式的细胞毒素。在本领域中理解和接受的是，生物缀合物设计和产生中的主要组分或步骤中的任一者或多者的变化可以产生显著的变化，例如，生物缀合物的效力降低或者全身性毒性和其他性质的增加。
甲胎蛋白(AFP)受体(AFPR)在肿瘤上高表达，但是在健康组织(骨髓源性抑制细胞(MDSC)除外)和某些活化的淋巴细胞(也表达AFP受体)中通常表现出低表达或不表达。AFP受体存在于所有胚胎细胞上，通常在出生后不久消失，但是随后在大多数成人和儿童癌症中重新表达。在胎儿中，AFP充当穿梭蛋白，类似于成人中的白蛋白，通过与氨基酸、脂肪酸和其他所需分子的可逆结合将这些分子带入胚胎细胞，然后通过AFP受体将它们递送至细胞中。一旦进入细胞，AFP就会将营养物释放到细胞中，然后返回循环，继续将其他分子运送到细胞中。
现有技术中的AFP生物缀合物包含其中AFP与作为抗癌剂的紫杉烷非共价复合的制备物(参见2016年8月4日公布的WO2016/119045)。预期在不使用接头的情况下，复合物会穿透细胞，然后释放紫杉烷以实现治疗。还提到了基于AFP的生物缀合物，该生物缀合物包含使用不可切割的接头或桥来连接的药物美登素(DM)，也称为类美登素。类美登素本身是细胞毒素，它们的结构类似于利福霉素、格尔德霉素和安莎三烯。类美登素可以结合微管蛋白并且干扰微管的形成，从而诱导“中毒”细胞的有丝分裂停滞。
其他公开内容涉及使用缀合接头的AFP生物缀合物和毒性有效负载，但是该接头是不可切割的；参见2007年4月24日公布的Merrimack US 7,208,576。在该缀合物中，替组单抗(AFP抗体)和DM-1在不可切割的接头(即，N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC))之间偶联。DM-1毒素是(N2′-脱乙酰基-N2′-(3-巯基-1-氧代丙基)美登素。与AFP一起使用的其他毒素和接头包括Polytherics在WO2018/051109中描述的那些，该专利以引用的方式并入本文，其中谷胱甘肽可切割的二硫化物接头与多种新的毒性剂偶联，该毒性剂包括DM样但包含取代氯基团的苯基基团的细胞毒素。AFP与柔红霉素偶联的缀合物也在Belyaev等人，Cancer Immunol Immunother.，2017中有所描述。这项工作特别令人关注的是展示基于AFP的生物缀合物针对骨髓源性抑制细胞(MDSC)的正向作用，MDSC是已经显示出表达AFPR的免疫细胞的子集。在这项研究中，用AFP-阿霉素治疗荷载艾氏癌的小鼠的结果是脾脏MDSC数量减少、NK细胞水平归一化和肿瘤生长抑制。所获得的结果表明，在另一个实施方案中，基于AFP的细胞毒性生物缀合物除了对肿瘤细胞具有直接作用之外，还是有前途的抗MDSC药物。
发明内容
期望提供一种用于将毒素递送至病变细胞的组合物，所述病变细胞在它们的表面上呈递AFP受体(AFPR)，所述组合物对正常细胞具有最小毒性或无毒性。还期望提供一种用于治疗对细胞毒素具有选择性反应的细胞的治疗和药物组合物，所述细胞毒素可以通过用谷胱甘肽切割而在胞质溶胶中释放。
目前提供了可用于治疗AFPR阳性(AFPR+)病变细胞的生物缀合物，所述病变细胞包括AFPR+癌细胞，诸如造血癌细胞和实体瘤癌细胞，包括癌症干细胞。AFPR+非癌细胞(诸如骨髓源性抑制细胞)也可以用本申请中公开的生物缀合物来治疗。在这些生物缀合物中，AFPR结合剂(诸如AFP)被使用谷胱甘肽可切割的即谷胱甘肽敏感性二硫化物接头缀合至细胞毒素。根据需要，通过组分种类，包括有效负载/毒素、接头和AFPR靶向剂的深入选择，这些生物缀合物在将谷胱甘肽切割的细胞毒素有效地和选择性地释放至胞质溶胶中以及毒性形式和浓度方面表现得非常好。本发明优选的生物缀合物显示出在很多参数(诸如减少或抑制COLO-205小鼠模型中结直肠肿瘤异种移植物的生长)方面的显著改善。
根据本发明，提供了一种可用于治疗病变细胞的生物缀合物，所述生物缀合物包含：
(1)结合至甲胎蛋白(AFP)受体(AFPR)+细胞的表面上的AFPR的试剂；
(2)对所述AFPR+细胞有毒性的细胞毒素(CT)，以及
(3)谷胱甘肽可切割的二硫化物接头，其中所述接头
(i)在AFPR结合剂和所述CT之间共价偶联，并且
(ii)在细胞内将所述CT释放至所述AFPR+细胞。
在一个方面，AFPR结合剂具有成熟野生型AFP的氨基酸序列、成熟野生型AFP的AFPR结合片段或AFPR结合变体的氨基酸序列或AFP片段的氨基酸序列。在另一个方面，AFP是重组人AFP或者其AFPR结合片段或变体，所述变体包含1-5个氨基酸置换。在又一个方面，所述试剂是缺乏糖基化的AFP。在又另一个方面，所述试剂是包含SEQ ID No.3的重组[Asn233Gln]成熟人AFP。在另一个方面，所述试剂包含SEQ ID No.4。在另一个方面，所述重组[Asn233Gln]人AFP由转基因细菌产生。在又另一个方面，所述重组[Asn233Gln]人AFP由转基因哺乳动物产生，所述转基因哺乳动物包括转基因山羊。
在本发明的另一个方面，所述细胞毒素(CT)具有下式：
在本发明的另一个方面，在所述AFPR结合剂和所述细胞毒素之间偶联的所述接头选自：
接头1 -S-CH(CH3)-(CH2)2-CO--；和
接头2 -S-(CH2)3-CO-。
在又另一个方面，所述缀合物包含如下所示的接头-细胞毒素
在本发明的又一个方面，所述缀合物包含如下所示的接头-细胞毒素：
根据本发明，提供了一种下式的生物缀合物：
其中AFP是甲胎蛋白的AFP受体结合形式。
在本发明的一个方面，n在1至11的范围内。在另一个方面，平均DPR，其中DPR被定义为药物与蛋白质的比率，在2至8之间。在另一个方面，所述平均DPR在5至7之间。在又一个方面，所述平均DPR在5.6和6.1之间。在又另一个方面，所述平均DPR为约5.9。在又一个方面，所述平均DPR在3至4.5之间。在另一个方面，所述平均DPR在3.6和4.1之间。在又另一个方面，所述平均DPR为约3.9。
在本发明的另一个方面，所述AFP是包含SEQ ID No.3的重组[Asn233Gln]成熟人AFP。在本发明的一个方面，n在1至11的范围内。在另一个方面，所述平均DPR在2至8之间。在另一个方面，所述平均DPR在5至7之间。在又另一个方面，所述平均DPR在5.6和6.1之间。在本发明的又一个方面，所述平均DPR为约5.9。在又另一个方面，所述平均DPR在3至4.5之间。在又另一个方面，所述平均DPR在3.6和4.1之间。在又一个方面，所述平均DPR为约3.9。
根据本发明，提供了一种下式的生物缀合物：
其中APF是甲胎蛋白的AFP受体结合形式。
在本发明的一个方面，n在1至11的范围内。在另一个方面，所述平均DPR在2至8之间。在另一个方面，所述平均DPR在5至7之间。在另一个方面，所述平均DPR在5.5和6.1之间。在又另一个方面，所述平均DPR为约5.8。在又一个方面，所述平均DPR在3至4.5之间。在另一个方面，所述平均DPR在3.4和4.0之间。在又另一个方面，所述平均DPR为约3.7。
在又一个方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载剂和如上文所述的生物缀合物。在另一个方面，所述载剂是水性媒介物。在另一个方面，所述水性媒介物是含有5％蔗糖的pH 7.5的10mM HEPES缓冲液。在又另一个方面，所述药物组合物用于向患有AFPR+癌症的受试者的施用。
在另一个方面，所述药物组合物用于向患有AFPR+癌症的受试者的施用。
在另一个方面，提供了一种用于治疗有需要的受试者中的AFPR+细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如上文所述的药物组合物。在一个方面，所述AFPR+细胞是癌细胞。在另一个方面，所述AFPR+细胞是MDSC。在另一个方面，所述AFPR+细胞是卵巢癌细胞。在又另一个方面，所述AFPR+细胞是结直肠癌细胞。在又另一个方面，所述AFPR+细胞是乳腺癌细胞。在又一个方面，所述AFPR+细胞是淋巴瘤细胞。
在本发明的另一个方面，提供了如上文所述的药物组合物与第二治疗剂作为治疗组合用于治疗患有AFPR+癌症的受试者的用途。在一个方面，所述第二治疗剂是免疫检查点抑制剂或CAR-T剂或另一种免疫肿瘤疗法。
在本发明的另一个方面，提供了一种用于制备生物缀合物的方法，所述方法包括将如上文所述的AFP的AFPR结合形式与如上文所述的缀合物偶联。
在本发明的另一个方面，提供了一种用于制备生物缀合物的方法，由此所述细胞毒素ABZ-981首先与谷胱甘肽敏感性二硫化物接头偶联，以产生如下中间体：
然后，所述中间体与AFP的AFPR结合形式反应，所述AFP是包含SEQ ID No.3的重组[Asn233Gln]成熟人AFP，并且所述中间体与所述AFP中的赖氨酸残基的ε氨基共价偶联。
在本发明的另一个方面，提供了一种用于制备生物缀合物的方法，由此所述细胞毒素ABZ-981首先与谷胱甘肽敏感性二硫化物接头偶联，以产生如下中间体：
附图说明
现在参考附图更详细地描述本发明的这些和其他方面，其中：
图1显示了生物缀合物与U-937细胞上的AFP受体的特异性结合。
图2显示了AFP-细胞毒素生物缀合物对荷载COLO-205结直肠癌异种移植物的小鼠的肿瘤生长的作用。
图3显示了AFP-细胞毒素生物缀合物对荷载COLO-205结直肠癌异种移植物的小鼠的存活率的作用。
图4显示了ACT-903对荷载A2780卵巢癌异种移植物的小鼠的肿瘤生长的作用。
图5显示了ACT-903对荷载A2780卵巢癌异种移植物的小鼠的存活率的作用。
具体实施方式
本发明提供了药学上可用的生物缀合物，其中细胞毒性药物(也称为细胞毒素(CT)、有效负载或弹头)与结合靶细胞的表面上的AFPR靶标的任何试剂共价偶联。靶向剂是甲胎蛋白(缩写为AFP)的AFPR结合形式。提供细胞毒素和靶向剂之间的共价偶联的接头也对细胞内谷胱甘肽的切割敏感，从而提供细胞毒素从AFP中释放到细胞内的机制，同时在血液中保持稳定。在本文中，接头被描述为谷胱甘肽敏感性，这旨在表示接头可以被谷胱甘肽切割，尤其是当它存在于待治疗的病变细胞的胞质溶胶中时。接头被认为是二硫化物，因为它们在其结构中包含-S-S-排列方式。这些接头在血浆中也很稳定，几天内有效负载的损失极小。
生物缀合物中使用的AFP在自然状态下是人转运蛋白，该人转运蛋白首先在胎儿中由胚胎肝脏和卵黄囊产生。它在与特定的AFP受体结合后，通过内吞作用进入细胞。AFP的其他形式，包括构成AFPR结合结构域的肽，具有这些AFPR结合和转运蛋白性质的肽，可以是本发明的生物缀合物中可用的靶向剂。
在特定实施方案中，本发明提供了生物缀合物，其中野生型(UniProt KB P02771)或变体、截短、片段化或片段形式的AFPR结合甲胎蛋白(AFP)，尤其包括[Asn233Gln]成熟人AFP[1-591]，作为AFPR结合剂提供。在其他实施方案中，该结合剂通过所示的两个二硫化物接头中的一个共价连接至细胞毒素。
术语“甲胎蛋白”(alpha-fetoprotein、alfa-fetoprotein)和“AFP”在本文中可互换使用，涉及具有UniProtKB名称P02771中所示的591聚体成熟序列(残基19-609)的分泌人蛋白质。成熟人AFP的实际序列如下所示，为609聚体，在成熟形式中，由于缺乏分泌信号(残基1-18)，总共减少至591个残基：
SEQ ID No.1；可分泌的野生型人AFP(1-609)；
SEQ ID No.2；野生型成熟人AFP(1-591]
SEQ ID No.3，[Asn233Gln]rhAFP(1-591)
[SEQ ID No.4]X251是Gln，即，[Asn251Gln]rhAFP(1-609)
应当理解，AFP活性，诸如AFPR结合活性和转运蛋白活性，应当在包含一个或多个氨基酸置换、缺失或添加的AFP变体中得以保持，所述氨基酸置换包括在结合AFPR的整个蛋白质或片段中特别保守的氨基酸置换。这些可以称为AFP或其AFPR结合片段的突变体或变体。改变可以引入或消除翻译后修饰位点，诸如糖基化位点、酶易损性等等。
本发明的方法可使用结合至AFP受体的那些形式的AFP，并且以天然状态或作为天然变体，诸如Lys187Gln变体和Asn233Gln变体存在。同样，本发明包括使用保持AFPR结合的AFP的任何片段以及任何此类片段的变体。
本文还可使用AFP的翻译后修饰形式，包括包含糖基化的那些。在人形式中，N-连接的糖基化存在于Asn233处。因此，人AFP的天然形式适用于本发明。另外可使用诸如人AFP的非糖基化形式可以在原核宿主细胞(诸如大肠杆菌(E.coli)和链霉菌属(Streptomyces))中产生，只要维持由天然人AFP中的16个二硫化物桥实现的正确3-D折叠即可。同样，人AFP的替代性糖基化形式可用于本文，诸如可以在真核宿主(包括酵母、曲霉、毕赤酵母、昆虫细胞等)和哺乳动物细胞宿主(包括CHO细胞和COS细胞)中产生的那些形式。另外，特别适合于本发明的人AFP形式是在转基因动物(包括山羊、兔并且在一些情况下猪)中产生的人AFP形式。例如Merrimack的US 7208576中描述了通常在转基因动物中，尤其是在山羊乳中进行的重组人AFP的产生，该专利还描述了包含Asn233Gln置换的成熟AFP的非糖基化形式的产生。
在优选的实施方案中，AFP是在转基因山羊中从山羊表达系统产生的人甲胎蛋白的重组形式，即人甲胎蛋白(hAFP)的非糖基化成熟形式。“ACT-101”是有用的AFP物质，与天然存在的人AFP的不同之处在于，它在成熟序列的氨基酸233处含有一个氨基酸置换(谷氨酰胺置换天冬酰胺)。例如，基本上相同的重组AFP可以由大肠杆菌以非糖基化形式产生，其中表达由trp和mal系统驱动。
AFP结合的靶标是甲胎蛋白受体(AFPR)。这通常与胎儿组织相关，并且在出生后两个多月内不存在于成人细胞中。然而，很大一部分癌细胞表达功能性AFPR。虽然该受体仅被部分表征，但是其存在已经得到实验证据的明确支持。已经表明，使用Tc-99m形式的rhAFP，小鼠中自发产生的肿瘤或移植入小鼠中的人肿瘤异种移植物吸收放射性标记形式的AFP，如Cancer Biother Radiopharm 1999，14(6)：485-94中所述。
因此，应当理解，本发明的生物缀合物靶向的病变细胞通过它们与AFPR抗体的反应性或通过它们对AFP本身的结合亲和力来鉴定。这些细胞靶标可以被表征为AFPR阳性的，或具有AFP结合亲和力。
使用此类试剂，还应当理解，可用于将细胞毒性药物递送至靶标病变细胞的不同形式的AFP可以通过它们以等摩尔计取代标记的AFP与AFPR结合以用于诊断目的的能力，或者通过它们直接与AFPR接合的能力来鉴定。基于细胞的测定也可用于此目的。在一个实例中，利用表达AFPR的U937细胞(从ATCC获得的人类男性组织细胞淋巴瘤细胞系，目录号CRL1593.2TM)来确认任何给定形式的AFP或AFP生物缀合物的AFPR结合亲和力。
在一个实施方案中，提供了通过共价连接AFP和细胞毒素形成的生物缀合物。细胞毒素是熟知的、非常广泛的一类药剂，可用于多种药物缀合物或用作单一治疗剂。在本发明的生物缀合物中，生物缀合物的AFP组分与不是DM-1、DM-3或DM-4的细胞毒素偶联或桥联，但是与这些细胞毒素共有一些结构方面。可用于本发明的细胞毒素包括：
化学式：C43H57N3O10S
精确质量：807.38
分子量：808.00
本发明的生物缀合物中的这些类美登素细胞毒素有效负载被使用含有可切割的谷胱甘肽敏感性二硫化物桥的接头附接至重组人AFP(rhAFP)。谷胱甘肽是完整地参与很多硫醇-二硫化物氧化还原过程的含硫醇的辅酶。还原(硫醇)形式的谷胱甘肽缩写为“GSH”。氧化形式的谷胱甘肽以通过二硫化物基团连接的两个分子的二聚体形式存在，缩写为“GSSG”。靶蛋白和谷胱甘肽中的二硫键和游离的硫醇基团可以通过二硫化物交换反应来进行“交换位置”。该过程本质上是两个直接置换事件的组合，其中硫原子作为亲核试剂、亲电子试剂和离去基团，以引起接头二硫化物的切割和毒素的释放。细胞内谷胱甘肽浓度通常在0.5至10mM的范围内，而细胞外值则低得多，在血浆中为约2μM。另外，肿瘤(包括卵巢癌)中的谷胱甘肽水平升高，因此谷胱甘肽的这种差异浓度可以使血液中的生物缀合物保持稳定，并在生物缀合物被肿瘤细胞摄取后释放细胞毒素。生物缀合物的稳定性可以通过改变二硫化物侧翼的R基团的空间性质来调节。虽然还可以采用其他释放机制(例如，pH和蛋白酶敏感性连接)，但是谷胱甘肽释放机制与rhAFP-毒素生物缀合物最相关，因为AFP不会运输到溶酶体，在溶酶体中蛋白酶不稳定性接头可以被切割。这已经被rhAFP缀合物的研究所证实，其中具有二肽、酸敏感性或不可切割的接头的生物缀合物在体外显示出较差的效力，可能是由于细胞内缺乏毒素的释放，而二硫键连接的含美登素的生物缀合物在体外显示出相对较高(个位数nM)的效力，该效力随着每个AFP分子(DPR)负载的细胞毒素的数量成比例地增加。
因此，在优选的实施方案中，使用与ABZ-981形成谷胱甘肽敏感性二硫化物的接头来桥联AFP和细胞毒素，该接头具有如下定义的化学结构：
ABZ-982接头-S-CH(CH3)-(CH2)2-CO-；
或
ABZ-1827接头-S-(CH2)3-CO-；
这些接头通过选定的细胞毒素ABZ981来形成，以提供缀合物中间体，在优选的实施方案中，所述缀合物中间体具有如下所示的ABZ-1827或ABZ-982的结构。
当CT ABZ-981通过本文教导的单甲基化谷胱甘肽可切割的二硫化物接头偶联时，所得的接头/有效负载缀合物(可用作合成中间体)称为ABZ-1827。或者，当CT ABZ-981通过本文教导的二甲基化谷胱甘肽可切割的二硫化物接头偶联时，所得的接头/有效负载缀合物(可用作合成中间体)称为ABZ-982。
如本文的实施例中所示合成接头-有效负载。为了制备AFP：细胞毒素生物缀合物，首先使细胞毒素与谷胱甘肽敏感性二硫化物接头偶联，以产生中间体，例如如上文所示的中间体，然后使中间体与AFP反应，以使得接头通常与AFP中的赖氨酸残基的ε氨基基团共价偶联，在另一端，则偶联至所期望的细胞毒素。然后可以将分离的生物缀合物在水性媒介物(理想地等渗且具有生理pH值或稍呈酸性的pH的水性媒介物)中混合。在一个实施方案中，水性媒介物是pH在约6至约7.5的范围内的磷酸盐缓冲盐水。在另一个实施方案中，水性媒介物是水。在另一个实施方案中，水性媒介物是盐水(0.154M NaCl)。在另一个实施方案中，水性媒介物是HEPES((4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液。
室温和标准压力是可接受的混合条件。可以使用温和的搅动、搅拌等等来促进混合。在此过程中，对条件进行管理，以获得所期望的平均细胞毒素：AFP比率。该比率在本文中称为“平均DPR”，即平均药物：蛋白质比率。对于抗体药物缀合物，这称为“药物抗体比率，DAR”。平均DPR是通过控制可与AFP反应的细胞毒素的量来实现的。
为了制备可以得出细胞毒素的计算单位剂量的组合物，生物缀合物的制备理想地涉及预定量的每种试剂的使用。据使用液相色谱法-质谱法(LC/MS)的实验发现，当在上述条件下进行混合时，一分子的AFP(分子量＝66.5kD)能够结合并保持约1-11个分子的细胞毒素缀合物(分子量＝854kD)。由于溶解度较低，较高的DPR比率会增加生物缀合物沉淀的风险。因此，DPR的上限取决于在储存期间使生物缀合物维持在溶液中而不发生沉淀的需要。通过改变条件(诸如以体积摩尔浓度计每种组分的负载)或通过改变反应介质的pH，可以达到不同的DPR值。
已经确定，毒素和蛋白质之间的二硫键理想地掺有如示例性和优选的生物缀合物中所掺入的甲基基团的分布，其中二硫键是单甲基化的，如下文ABZ1827-AFP中所示，或二硫键是二甲基化的，如下文ABZ982-AFP中所示。ABZ1827-AFP优于ABZ982-AFP。这种甲基化可以屏蔽二硫键，并且提供所期望的且增强的生物缀合物的生物活性和稳定性之间的平衡。
该生物缀合物在本文中称为ABZ1827-AFP。“n”代表与每个分子的AFP结合的细胞毒素/接头分子(缀合物中间体)的数量。ABZ1827-AFP通常含有一系列n值。n的值通常在1-11的范围内；但是可以存在痕量的具有更大的n的物质。
在另一个实施方案中，AFP蛋白与如下所示的接头细胞毒素共价连接：
该生物缀合物在本文中称为ABZ982-AFP。“n”代表与每个分子的AFP结合的细胞毒素/接头分子(缀合物中间体)的数量。ABZ982-AFP通常含有一系列n值。n的值通常在1-11的范围内；但是可以存在痕量的具有更大的n的物质。
本申请中讨论的生物缀合物通常由具有不同的n的生物缀合物的混合物组成。可以制备n的范围更有限，或者在其他情况下在特定数值附近的n的分布的生物缀合物。还可以制备生物缀合物并通过n的平均值(也称为DPR，如上文所定义)来表征生物缀合物。
因此，在某些实施方案中，本发明提供了生物缀合物，所述生物缀合物是选定的AFP与细胞毒素/接头(优选地ABZ982或ABZ1827)偶联的结果，如下文所述。细胞毒素组分通过伯胺(诸如AFP赖氨酸残基上的ε氨基基团)偶联至AFP。一种、两种或更多种，但通常不超过11种细胞毒素可以以这种方式偶联至每个AFP分子。还可以操纵与每个AFP蛋白偶联的细胞毒素的比率，以根据该比率升高或降低生物缀合物的生物活性和溶解度。
已知DPR与生物缀合物的效力、溶解度和毒性有关。对于同一生物缀合物，相对于高DPR值，低DPR值与相对较低的效力相关。对于同一生物缀合物，相对于低DPR值，高DPR值有时与相当高的毒性相关，但并非总是如此。通过控制用于与AFP偶联的细胞毒素的浓度和反应的持续时间来实现具有不同DPR值的生物缀合物的制备。细胞毒素相对于AFP的量越大，合成产生的DPR值就越高，DPR达到的最大值为约11，通常小于11。
在其他特定实施方案中，生物缀合物具有平均每个AFP分子约2至8个细胞毒素分子的DPR。
在一个特定实施方案中，当细胞毒素/接头是ABZ-982时，DPR适当地“低”，意思是DPR平均在3和4.5之间，或者在更特定实施方案中为约3.7+/-0.3。
在另一个实施方案中，细胞毒素/接头是ABZ-982，DPR适当地“高”，意思是DPR平均在5和7之间，或者在更特定实施方案中为约5.8+/-0.3。
在另一个实施方案中，当毒素/接头是ABZ1827时，DPR适当地“高”，意思是DPR平均为约5.9+/-0.3(约6)。在另一个实施方案中，DPR在每个AFP 5-7DM的范围内。
在另一个实施方案中，当毒素/接头是ABZ1827时，生物缀合物具有低于约4.5的“低”DPR。在一个具体实施方案中，DPR平均为约3.9+/-0.3(约4)。
如表4所示，当DPR“高”时，ABZ1827-AFP和ABZ982-AFP在体外更有效，但是当DPR“低”时，也保持效力。
生物缀合物在治疗上可用于治疗具有AFP结合性或AFPR阳性病变细胞的受试者。靶细胞也应该是“细胞毒素响应性的”，简单而言，对胞内细胞毒素具有反应性的细胞显示出降低的活力或缺乏活力，并且至少在数量、大小、分布等方面是被从生物缀合物释放的细胞毒素杀死、剔除或减少的。已经发现，在生物缀合物制备期间和在内源性施用后，AFP和细胞毒素以足够的亲和力结合，以使得类美登素通过相关的AFP选择性地递送至病变细胞，并且具有降低的全身毒性。这种类美登素递送方法可以减少细胞毒素的剂量，从而减少相关不良事件，不仅因为结合的细胞毒素毒性较小，而且还因为细胞毒素被选择性地递送至AFPR阳性病变细胞，从而不伤害正常健康细胞。此外，AFP：细胞毒素生物缀合物可以在良性和标准药物媒介物(诸如盐水或HEPES缓冲液)中配制，从而避免使用本身在递送至患者时产生毒性问题的载剂。
其后可以立即配制用于治疗施用的生物缀合物，将生物缀合物短暂储存于水性媒介物中，优选地冷冻、或冻干以延长储存，如本文所示例。冻融循环不会影响生物缀合物的聚集/二聚体形成。生物缀合物可以在2-8℃的溶液中储存至少3天而不会降解。它们也可以深度冷冻储存(≤-60℃)，并且溶液中的生物缀合物已经显示出在冷冻/解冻循环期间保持活性。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了冻干或冷冻形式或在HEPES缓冲液中冷藏于2-8℃的AFP：细胞毒素生物缀合物。
对于治疗用途，本发明提供了作为药物组合物的AFP：细胞毒素生物缀合物，其中生物缀合物与药学上可接受的载剂一起配制。在一个实施方案中，制剂适合于静脉内施用，诸如通过注射或通过输注静脉内施用。因此，载剂可以是水性媒介物，诸如注射用水、盐水等等。
用于体内施用的活性成分将是无菌的。这通过无菌过滤膜过滤来实现。
可以选择用于配制AFP缀合的细胞毒素的任何其他载剂、媒介物或赋形剂，以避免会破坏所期望的生物缀合物稳定性或会改变AFP对AFPR的结合亲和力的试剂或条件。可以避免使用有机溶剂。由于这个原因，也可以避免引入生理范围之外的pH(即，小于约pH 6和大于约pH 8)的试剂。AFP：细胞毒素生物缀合物可以在水、或生理盐水或特别是HEPES缓冲液中配制。水性缓冲盐水溶液(包括磷酸盐缓冲盐水)是优选的，因为它们具有生理上可耐受的pH，并且适合于通过优选的注射或输注途径施用。添加防止聚集或沉淀的化合物(诸如蔗糖)是所期望的。另一种优选的载剂/媒介物是含有5％蔗糖的pH 7.5的10mM HEPES缓冲液。
AFP：细胞毒素生物缀合物是在治疗上有用的。因此，在一个方面，本发明提供了一种用于治疗具有AFPR阳性或AFP结合性病变细胞的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用包含AFP结合的细胞毒素的AFP：细胞毒素生物缀合物，所述AFP：细胞毒素生物缀合物的量可有效抑制病变细胞的生长和/或增殖。
AFP生物缀合物是有前景的抗癌药物，除了对表达AFP受体的肿瘤细胞产生直接影响之外，还可以有助于减少(或消除)MDSC。这些是可以支持肿瘤活力的AFPR+细胞，并且当存在于同一受试者的肿瘤微环境中时是有害的。减少、剔除或根除这些细胞是增强治疗效果的有前景的途径。AFP作为与细胞毒性剂缀合的载体分子，特异性识别MDSC，因此可以用于癌症患者以减少MDSC的数量。
使用采用可检测的和选择性AFP受体结合配体的测定，可以鉴定AFP受体阳性病变细胞以用于体内和离体治疗。可以被本发明的生物缀合物靶向的AFPR阳性病变细胞包括AFPR阳性癌细胞，所述AFPR阳性癌细胞通常包括特异性结合AFP的所有癌细胞。预期效果仅在那些对细胞毒素作出反应并且具有期望的生长或增殖抑制的AFPR阳性病变细胞中可见，如减小的肿瘤大小或降低的肿瘤生长速率所反映。此类细胞和肿瘤具有“细胞毒素响应性”性质，并且是用本发明的生物缀合物治疗的优选靶标。此外，某些细胞毒素耐受性癌细胞(其中对细胞毒素的耐受性是由于主动从细胞中除去细胞毒素的膜泵的过表达)可以用本发明的AFP：细胞毒素制剂来有效地治疗，因为生物缀合物在与AFPR结合后，通过称为胞吞作用的过程跨过膜，其中AFPR-生物缀合物被包封于囊泡中并运输至细胞的内部，从而避免与膜泵的相互作用。
可以采用任何适当的施用途径，例如肠胃外施用，包括静脉内、肌肉内、皮下、颅内、眶内、心室内、囊内、脊柱内、脑池内、病灶内、瘤内腹膜内施用。通过注射或输注进行的静脉内施用可以是优选的。
对于呈现出结合AFP的癌细胞的受试者的治疗，AFP：细胞毒素生物缀合物的适当剂量将取决于待治疗的疾病类型、疾病的严重度和病程、既往疗法以及患者的临床病史和对药剂的反应。药剂适合于在一系列/疗程的治疗中施用于患者。可以根据癌症疗法的实践标准来监测疾病的进展。尤其是在癌症的情况下，对有需要的受试者的有效治疗可以使数量、体积、分布、活力和其他细胞参数减少，包括它们的生长和/或增殖或成熟速率的降低。
例如，根据疾病的类型和严重度，如果每3周施用一次，则0.5mg/kg至5mg/kg的AFP生物缀合物中存在约20μg/kg至200μg/kg的细胞毒素是向患者施用的候选剂量，无论是例如通过一次或多次单独施用，还是通过输注。对于每周、或每3周、或超过数周或更长时间一次或两次的重复施用，取决于病症，治疗持续直到出现所期望的疾病症状的抑制或直到观察到疾病的进展。然而，可以使用其他剂量方案。基于AFP-细胞毒素生物缀合物的重量计的单位剂量可以在例如约500μg至500mg，诸如1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg和400mg的范围内。配制的生物缀合物可以以多剂量形式提供，包括在每个容器(例如，小瓶)内的2、3、4、5或更多个单位剂量。生物缀合的制备物还可以以试剂盒形式提供，所述试剂盒包括包含生物缀合物的冻干或冷冻制备物和用于将制备物复原为可施用剂型的单独包装的媒介物。在替代方案中，试剂盒可以简单地包括生物缀合的制备物，以及将该制备物重构为可施用剂型的说明。抗癌疗法的进展通过针对正在治疗的特定疾病建立的技术和测定来监测。
对于本发明的生物缀合物的剂量指导，应当理解，商购获得的生物缀合物KADCYLATM(恩美曲妥珠单抗(ado-trastuzumab emtansine))的推荐剂量为每3周(21天周期)给予静脉内输注3.6mg/kg，直到疾病进展或不可接受的毒性，或者对于乳腺癌患者给予总共14个周期。
因此，应当理解，生物缀合物的有效量是作为单位剂量或作为治疗方案的一部分，可有效延迟或抑制对细胞毒素具有反应且呈AFPR+阳性的病变细胞和恶性肿瘤(包括AFPR+癌症干细胞(CSC))的生长或增殖速率的量，所述病变细胞和恶性肿瘤是具有与正常干细胞相关的特征，尤其是产生特定癌症样品中存在的所有细胞类型的能力的癌细胞(存在于肿瘤或血液癌症内)。
该生物缀合物可用于治疗各种细胞毒素响应性癌症，以抑制癌细胞和包含它们的肿瘤(包括血液癌症和实体瘤)的生长或增殖。向受试者施用的组合物的具体剂量将取决于例如施用途径、施用的频率、接受者的状态和所治疗的癌症的类型。适合治疗的癌症是那些表达AFP受体的癌症。AFPR在人类癌症或癌细胞系(包括乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、子宫内膜癌、胃癌、肺癌、淋巴瘤、前列腺癌和肝癌)中的表达已得到证实。这些癌症的转移也可以根据本文所述的方法治疗。
术语“受试者”、“患者”和“接受者”均指哺乳动物，尤其包括人，但也包括其他灵长类动物、家畜、宠物、马等等。应当理解，用本发明的生物缀合物治疗的受试者应当为至少约3个月龄，以使得内源性AFP受体在受试者的健康细胞和组织上不普遍。另外，用于治疗非人类的生物缀合物理想地包括对该物种具有特异性的AFP形式。
通常将靶向细胞毒剂与其他疗法组合施用，因此本领域的技术人员将理解生物缀合物可以与其他癌症疗法(包括免疫疗法)组合使用。
生物缀合物可以与有用的其他治疗剂组合施用于有需要的受试者。与一种或多种另外的治疗剂“组合”的施用包括以任何顺序同时(同时)和连续施用。其他治疗方案可以与本发明的抗癌剂的施用组合。例如，待用此类抗癌剂治疗的患者还可以接受放射疗法，诸如外束辐射。或者或另外，可以向患者施用化疗剂或生物制剂。此类化学治疗剂或生物制剂的制备和给药排程可以根据制造商的说明或由技术人员凭经验确定来使用。化疗剂可以在施用或生物缀合物之前或之后，或者可以与施用或生物缀合物同时给予。在特定实施方案中，生物缀合物可以与免疫刺激剂，诸如检查点抑制剂或CAR-T制备物组合使用。因为在存在MDSC的情况下，此类免疫肿瘤药物的功效会降低。通过AFP生物缀合物进行的MDSC的减少(或消除)将大大增强免疫肿瘤药物的功效。
如果需要，本发明的生物缀合物和药物组合物可以与另一种治疗剂组合使用，所述另一种治疗剂例如另一种抗癌剂，例如，CAR-T剂、免疫检查点抑制剂、烷基化剂、烷基磺酸盐、氮丙啶、乙烯亚胺和甲基蜜胺、番荔枝内酯(acetogenins)、澳瑞他汀(auristatin)、喜树碱(camptothecin)、苔藓抑素(bryostatin)、凯利他汀(callystatin)、CC-1065、念珠藻素(cryptophycins)、多拉司他汀(dolastatin)、倍癌霉素(duocarmycin)、五加素(eleutherobin)、水鬼蕉碱(pancratistatin)、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、海绵抑素(spongistatin)、氮芥、抗生素、烯二炔抗生素、达内霉素(dynemicin)、双膦酸盐、埃斯波霉素(esperamicin)、色蛋白烯二炔抗生素发色团、阿克拉霉素(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、氨曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、阿扎胞苷(azacitidine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、马塞罗霉素(marcel lomycin)、丝裂霉素(mitomycins)、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycins)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链脲佐菌素(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物、厄洛替尼(erlotinib)、威罗非尼(vemurafenib)、克唑替尼(crizotinib)、索拉非尼(sorafenib)、依鲁替尼(ibrutinib)、恩杂鲁胺(enzalutamide)、叶酸类似物、嘌呤类似物、雄激素、抗肾上腺剂、叶酸补充剂(诸如亚叶酸)、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶(eniluracil)、安吖啶(amsacrine)、贝斯布西(bestrabucil)、比生群(bisantrene)、依达曲沙(edatrexate)、地磷酰胺(defofamine)、地美可辛(demecolcine)、地吖醌(diaziquone)、依洛尼塞(eflornithine)、依利醋铵(elliptinium acetate)、埃博霉素(epothilone)、依托格鲁(etoglucid)、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖(lentinan)、氯尼达明(lonidainine)、类美登素、米托胍腙(mitoguazone)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫哌达醇(mopidamol)、尼曲吖啶(nitraerine)、喷司他汀(pentostatin)、蛋氨氮芥(phenamet)、吡柔比星(pirarubicin)、洛索蒽醌(losoxantrone)、鬼臼酸2-乙基酰肼、丙卡巴肼(procarbazine)、多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)、雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A(roridin A)和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加胞嘧啶(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌(thiotepa)；紫杉烷、苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物、长春花碱(vinblastine)；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐；伊立替康(irinotecan)(Camptosar，CPT-11)、拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸；类视黄醇；卡培他滨(capecitabine)；康布瑞汀(combretastatin)；甲酰四氢叶酸(leucovorin)；奥沙利铂(oxaliplatin)；减少细胞增殖的PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR和VEGF-A的抑制剂(诸如抗体)；以及它们的药学上可接受的盐、酸或衍生物；或者它们的组合。
本发明的生物缀合物和药物组合物还可以与抗癌抗体或多肽组合使用，所述抗癌抗体或多肽例如阿巴戈沃单抗(abagovomab)、阿德卡木单抗(adecatumumab)、阿夫妥珠单抗(afutuzumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、阿妥莫单抗(altumomab)、阿马妥昔单抗(amatuximab)、阿纳图莫单抗(anatumomab)、阿西莫单抗(arcitumomab)、巴维妥昔单抗(bavituximab)、贝克莫单抗(bectumomab)、贝伐单抗(bevacizumab)、比伐珠单抗(bivatuzumab)、博纳吐单抗(blinatumomab)、布伦妥昔单抗(brentuximab)、坎妥珠单抗(cantuzumab)、卡妥索单抗(catumaxomab)、西妥昔单抗(cetuximab)、西妥珠单抗(citatuzumab)、西妥木单抗(cixutumumab)、克利伐珠单抗(clivatuzumab)、康那木单抗(conatumumab)、达雷妥尤单抗(daratumumab)、德罗齐单抗(drozitumab)、杜利戈单抗(duligotumab)、度西吉单抗(dusigitumab)、地莫单抗(detumomab)、达塞珠单抗(dacetuzumab)、达洛珠单抗(dalotuzumab)、埃克罗昔单抗(ecromeximab)、埃洛妥珠单抗(elotuzumab)、恩妥昔单抗(ensituximab)、艾妥索单抗(ertumaxomab)、依塔拉珠单抗(etaracizumab)、法雷妥珠单抗(farletuzumab)、非卡妥珠单抗(ficlatuzumab)、无花果木单抗(figitumumab)、弗兰沃单抗(fianvotumab)、夫妥昔单抗(futuximab)、加尼单抗(ganitumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、吉伦妥昔单抗(girentuximab)、格伦巴妥尤单抗(glembatumumab)、伊布莫单抗(ibritumomab)、伊戈沃单抗(igovomab)、伊加妥珠单抗(imgatuzumab)、茚达妥昔单抗(indatuximab)、伊诺珠单抗(inotuzumab)、因特图尤单抗(intetumumab)、伊匹单抗(ipilimumab)、伊拉木单抗(iratumumab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、莱克沙木单抗(lexatumumab)、林妥珠单抗(lintuzumab)、洛伏妥珠单抗(lorvotuzumab)、卢卡木单抗(lucatumumab)、马帕木单抗(mapatumumab)、马图珠单抗(matuzumab)、米拉妥珠单抗(milatuzumab)、明瑞妥莫单抗(minretumomab)、米妥莫单抗(mitumomab)、莫西妥单抗(moxetumomab)、纳那单抗(namatumab)、纳妥单抗(naptumomab)、耐昔妥珠单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、诺非图莫单抗(nofetumomabn)、奥卡妥珠单抗(ocaratuzumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥拉单抗(olaratumab)、奥那妥珠单抗(onartuzumab)、奥朴珠单抗(oportuzumab)、奥瑞戈单抗(oregovomab)、帕尼单抗(panitumumab)、帕沙珠单抗(parsatuzumab)、帕特里单抗(patritumab)、培妥莫单抗(pemtumomab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、品妥莫单抗(pintumomab)、普立木单抗(pritumumab)、雷可图莫单抗(racotumomab)、雷莫芦单抗(ramucimmab)、拉德雷单抗(radretumab)、利妥木单抗(rilotumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、罗巴木单抗(robatumumab)、萨图莫单抗(satumomab)、西布珠单抗(sibrotuzumab)、塞妥昔单抗(siltuximab)、辛妥珠单抗(simtuzumab)、索利托单抗(solitomab)、替组单抗(tacatuzumab)、塔普利莫单抗(taplitumomab)、特纳妥单抗(tenatumomab)、替普妥木单抗(teprotumumab)、替加妥珠单抗(tigatuzumab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、妥考珠单抗(tucotuzumab)、乌布妥昔单抗(ublituximab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、沃塞珠单抗(vorsetuzumab)、沃图木单抗(votumumab)、扎鲁木单抗(zalutumumab)、CC49、3F8或者它们的任何组合。
在本发明的另一个实施方案中，提供了含有可用于治疗本文所述的障碍的AFP：细胞毒素生物缀合物的制品。制品包含本发明的生物缀合物，该生物缀合物呈溶液或冻干或冷冻形式，该制品在容器中并适当地贴有标签。合适的容器包括例如瓶、小瓶、注射器和试管。容器可以由多种材料(诸如玻璃或塑料)形成。容器装有对治疗病症有效的组合物，并且可以具有无菌入口(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉注射液袋或小瓶)。容器上或与容器相关的标签标明该组合物用于治疗癌症病症。制品还可以包括第二容器，该第二容器包含药学上可接受的缓冲液，包括盐水、HEPES缓冲液、磷酸盐缓冲盐水、注射用水等等。它还可以包括从商业和使用角度来看所期望的其他物质，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有根据本发明的使用说明的包装插页。可用于该方法的对照试剂或标准品和校准品(诸如AFP制备标准品)也可以包括在试剂盒中。
因此，应当理解，甲胎蛋白(AFP)受体是癌胚抗原和癌症治疗的新靶标。该受体在很多常见癌症的表面上高表达，但是通常在正常成人细胞中不表达。通过将新型类美登素毒素与AFP的重组人形式共价缀合，毒素有效负载可以选择性地递送至癌细胞，同时不伤害正常细胞。由于AFP是人蛋白质，因此对AFP生物缀合物产生任何有害免疫反应的风险得以降低。
合成的实例
制备了两种形式的生物缀合物，不同之处仅在于它们的接头结构(单甲基与二甲基)，并且在一些情况下将该生物缀合物与基于类美登素DMl和/或DM3和/或DM4的生物缀合物进行了比较。它们的一般合成方法如下所示，其中R是试剂细胞毒素，P是蛋白质AFP。
1)AFP的制备
缺乏糖基化的成熟[Asn233Gln]rhAFP(1-591)以Merrimack在2007年4月24日公布的US 7208576中描述的方式在转基因山羊中产生并且从山羊乳中回收，该专利全文以引用的方式并入本文。这种形式的AFP称为ACT-101并且具有SEQ ID No.3，该序列在成熟AFP中掺有Asn233Gln置换。
2)细胞毒素：接头生物缀合物的制备
首先以WO2018/051109中描述的方式产生称为ABZ981的类美登素样细胞毒素，然后将该类美登素样细胞毒素以如下方式与二硫化物谷胱甘肽敏感性接头共价偶联：
一般分析方法：如下文所示合成接头-有效负载。所用的所有溶剂均按原样使用，且购自Sigma Aldrich或Fisher Scientific。1H-NMR谱在Varian Inova 500MHz NMR仪器上记录。相对于用于分析的NMR溶剂，化学位移(δ)以ppm为单位报告。耦合常数(J)以赫兹(Hz)为单位报告。在Waters UPLC/MS-5SQD系统上使用1.7μm C18/>色谱柱(50×2.1mm)和以下分析性UPLC方法来测定色谱纯度：进样体积2-5μL；流速0.6mL/min；10％-90％乙腈/水2.5至5分钟；ACQUITY UPLC光电二极管阵列(PDA)检测器，在254nm；室温处。在Agilent 6130，1260Infinity，LC/MS系统上使用/>FastGradient RP-18e分析柱(50×2mm，Merck KGaA，P/N 1.52007.0001)来测定色谱纯度
靶标化合物的合成
合成方案：
实验程序
化合物A和ABZ-947的合成
化合物A：
在室温处，在氩气下，向美登醇(2.6g，4.60mmol)和DMAP(0.56g，4.60mmol)在26mL无水THF中的混合溶液中滴加ZnHMDS(4.6mL，11.50mmol)。将混合物搅拌30分钟，得到棕色悬浮液。向该溶液中滴加异丁酸酐。将所得的溶液在室温处搅拌1.5小时。通过LC/MS对等分试样进行分析表明反应完全进行，得到所期望的产物。将粗产物用饱和NH4Cl溶液(100mL)淬灭，用100mL乙酸乙酯稀释，并分离有机层。水层用乙酸乙酯萃取(120mL×2)。合并的有机物用水(50mL)、盐水溶液(50mL)洗涤，并用Na2SO4干燥。在浓缩后，得到粗棕色固体，使用HP120g金色谱柱ISCO系统用5％MeOH/DCM纯化固体，得到1.48g(51％)化合物A。MS(ESI，正)：C32H43ClN2O9的计算值634.27；测定值635.3(M+H)，1293.4(2M+Na)。完成另一批纯化并合并所得的产物用于下一步。
化学式：C32H43CIN2O9
精确质量：634.27
分子量：635.15
ABZ-947：
在使用前用氩气使水和THF的混合物充分脱气。向100mL圆底烧瓶中的化合物A(3.10g，4.88mmol)、4-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧杂环戊硼烷-2-基)苯胺(1.60g，7.32mmol)和K3PO4(4.14g，19.52mmol)的混合物中添加THF(50mL)和H2O(7mL)。使搅拌的混合物通过真空脱气并重新填充氩气。重复3次，并用氩气进一步脱气。然后，添加SphosPd-G3(0.38g，0.488mmol，0.1当量)并用隔膜加盖。使混合物在氩气下进一步脱气，并在室温处搅拌过夜。通过LC/MS监控反应进程，显示反应完全进行。添加NH4Cl水溶液(30mL)以淬灭反应。粗产物通过硅藻土垫过滤，得到清洁的溶液。水层用乙酸乙酯萃取(120mL×2)。乙酸乙酯层用水、盐水洗涤，并在Na2SO4上干燥。在浓缩后，得到粗深黄色固体，使用120g金色谱柱ISCO系统用5％MeOH/DCM纯化固体，得到3.37g(89％)ABZ-947。MS(ESI，正)：C38H49N3O9的计算值691.35；测定值692.3(M+H)，1383.8(2M+H)。
化学式：Ca8H49N3O9
精确质量：691.35
分子量：691.82
化合物B和ABZ-981的合成：
化合物B：
将ABZ-947(237mg，0.0342mmol)、4-((5-硝基吡啶-2-基)二硫烷基)戊酸(101mg，0.753mmol)和HATU(390mg，1.03mmol)在8mL无水DMF中的搅拌溶液冷却至0℃，随后缓慢添加DIEA(0.24mL，1.37mmol)。将所得的溶液温热至室温并搅拌过夜。通过使用UPLC对等分试样进行分析的过程，显示反应完全进行。反应混合物用水(20mL)和盐水(20mL)稀释。混合物用乙酸乙酯萃取(50mL×2)。使有机层真空浓缩得到粗产物。粗产物用DMSO(5mL)稀释，然后用C18 aq.150g ISCO色谱柱(5％ACN至95％ACN/水，0.05％AcOH作为改性剂)纯化。对纯级分进行收集、冷冻并冻干，得到253mg(77％)化合物B浅棕色固体。MS(ESI，正)：C48H59N5O12S2的计算值961.36；测定值962.42(M+H)。
化学式：C48H59N5O12S2
精确质量：961.36
分子量：962.14
ABZ-981：
向化合物B(22mg，0.0207mmol)和TCEP HCl(59mg，0.207mmol)在ACN(1mL)和水(0.8mL)的混合物中的溶液中缓慢添加饱NaHCO3溶液(1.2mL)直到pH达到7-8。将所得的溶液在室温处搅拌2小时。取一份等分试样进行LC/MS分析，结果显示反应完全进行。使反应混合物减压浓缩。残留物用50mL乙酸乙酯稀释，然后添加盐水(20mL)。使有机物分离并真空浓缩，产物用C18 aq.50g ISCO色谱柱(5％ACN至95％ACN/水，0.05％AcOH作为改性剂)纯化。对纯馏分进行收集、冷冻并冻干，得到14mg(83％)ABZ-981白色固体。MS(ESI，正)：C43H57N3O10S的计算值807.38；测定值808.92(M+H)。
化学式：C43H57N3O10S
精确质量：807.38
分子量：808.00
化合物C和ABZ-982的合成：
/>
化合物C：
向装有化合物B(420mg，0.436mmol)的40mL透明小瓶中添加DMF(6mL)并搅拌以得到澄清溶液。在室温处添加PBS pH＝7.4缓冲液(2.0mL)，然后添加4-巯基戊酸(234mg，1.746mmol)。搅拌30分钟，并在LC-MS上监测反应进程(如果反应未完成，则搅拌直到反应完成)。在反应完成后，使反应混合物真空浓缩，用1mL DMSO稀释，并转移至预先平衡的C18aq.100g色谱柱。使用洗脱剂(10％ACN至95％ACN/水，0.05％AcOH作为改性剂)进行纯化。对纯馏分进行收集、冷冻并冻干，得到317mg(77％)化合物C白色固体。MS(ESI，正)：C48H65N3O12S2的计算值939.40；测定值940.54(M+H)。
化学式：C48H65N3O12S2
精确质量：939.40
分子量：940.18
ABZ-982：
向装有化合物C(300mg，0.319mmol)的40mL透明小瓶中添加DCM(10mL)并搅拌以得到澄清溶液。在氩气下的冰浴中添加EDCI(110mg，0.574mmol)，然后添加NHS(55mg，0.479mmol)。将所得的溶液搅拌16-24小时，并通过LC-MS监测反应进程。在反应完成后，使粗产物减压浓缩。将粗产物用1mL DMSO溶解，并装入预先平衡的C18aq.150g色谱柱。使用洗脱剂(10％ACN至95％ACN/水，0.05％AcOH作为改性剂)进行纯化。对纯馏分进行收集、冷冻并冻干，得到280mg(85％)ABZ-982白色固体。MS(ESI，正)：C52H68N4O14S2的计算值1036.42；测定值1037.71(M+H)。
化学式：C52H68N4O14S2
精确质量：1036.42
分子量：1037.25
化合物D和ABZ-1827的合成：
化合物D：
向装有化合物B(500mg，0.519mmo1)的40mL透明小瓶中添加DMF(7mL)并搅拌以得到澄清溶液。在室温处添加PBS pH＝7.4缓冲液(2.5mL)，然后添加4-巯基丁酸(250mg，2.08mmol)。将深色反应混合物搅拌30分钟，并在LC-MS上监测反应进程(如果反应未完成，则搅拌直到反应完成)。在反应完成后，使反应混合物真空浓缩，用1mL DMSO稀释，并转移至预先平衡的C18 aq.150g色谱柱。使用洗脱剂(10％ACN至95％ACN/水，0.05％AcOH作为改性剂)进行纯化。对纯馏分进行收集、冷冻并冻干，得到351mg(73％)化合物D白色固体。MS(ESI，正)：C47H63N3O12S2的计算值925.39；测定值926.73(M+H)。
化学式：C47H63N3O12S2
精确质量：925.39
分子量：926.15
ABZ-1827：
向装有化合物D(350mg，0.377mmol)的40mL透明小瓶中添加DCM(10mL)并搅拌以得到澄清溶液。在氩气下的冰浴中添加EDCI(130mg，0.680mmol)，然后添加NHS(65mg，0.565mmol)。将所得的溶液搅拌16-24小时，并通过LC-MS监测反应进程。在反应完成后，使粗产物减压浓缩。将粗产物用1.5mL DMSO溶解，并装入预先平衡的C18aq.150g色谱柱。使用洗脱剂(10％ACN至95％ACN/水，0.05％AcOH作为改性剂)完成纯化。对纯馏分进行收集、冷冻并冻干，得到270mg(70％)ABZ-1827白色固体。MS(ESI，正)：C51H66N4o14S2的计算值1022.40；测定值1023.75(M+H)。
化学式：C51H66N4O14S2
精确质量：1022.40
分子量：1023.22
为了制备具有不同的DPR值的AFP生物缀合物，使用30kDa MWCO过滤器将AFP蛋白进行缓冲液交换至10mM HEPES pH 7.5缓冲液。在缓冲液交换后，将蛋白质浓度调节至5mg/mL。对于缀合反应，将少量DMSO添加至反应，随后添加ABZ982或ABZ1827接头-有效负载(新鲜制备为含有DMSO的10mM储液)。反应混合物中存在的DMSO的总量为10％(v/v)，(7当量DPR3-4生物缀合物的接头-有效负载，10当量DPR 5-6生物缀合物的接头-有效负载)。将反应混合物在室温(22℃)处在旋转管上以10rpm/min混合16-20小时。通过以下方式来纯化生物缀合物：使用30kDa MWCO过滤器将粗生物缀合物进行缓冲液交换至10mM HEPES、5％蔗糖pH7.5。将纯化的生物缀合物无菌过滤并储存于-80℃处。
对于具有确定DPR的产物，将每种缀合反应溶液与等体积的50mM磷酸钠、2M NaClpH 7混合。将每种生物缀合物用50mM磷酸钠pH 7、20％异丙醇的梯度从色谱柱洗脱。将粗溶液与等体积的50mM磷酸钠、4M NaCl pH 7混合，并将所得的溶液上样至用50mM磷酸钠、2MNaCl pH 7平衡的ToyoPearl Phenyl-650S HIC色谱柱。将含有不同DPR值的馏分进行合并并浓缩。将浓缩的样品进行缓冲液交换至PBS pH 7.1-7.5，并进行无菌过滤(0.22μm PVDF膜)。DPR分配基于A248/A280吸收比率。在280nm处进行HIC分析后，从单个DPR物种的相对峰面积计算平均DPR。
生物缀合物测试
在体外测试先导化合物之前，在U937细胞系以及其他细胞系中建立AFP受体的表达以及细胞结合和吸收荧光标记的rhAFP的能力，如下表1中汇总的研究中所示。在这项研究中，使用商购获得的Alexa Fluor-647(AF-647)蛋白质标记试剂盒的产品方案中所述的程序来标记rhAFP。在96孔板中进行结合实验，并使用读板器来测量荧光。肿瘤细胞在细胞培养基中悬浮培养或铺板培养。将每个肿瘤细胞系与AF-647标记的rhAFP在37℃处温育0.5、2和5小时(n＝3次重复)。通过在冰上冷却来停止温育。对于悬浮液中的细胞，通过离心分别收集细胞和培养基，并对细胞和培养基进行重复洗涤步骤。对于铺板的细胞，使用胰蛋白酶/EDTA进行细胞脱壁。除了MOLT-4之外，大多数细胞系都显示出高结合，MCF7(乳腺癌)在所有测试的细胞系中显示出最高结合，其次是U937(淋巴瘤)和COLO-205(结直肠癌)。
在其他AFP受体结合研究中，使用FluoroTagTM FITC缀合试剂盒，用Alexa Fluor-488或FITC来标记rhAFP，并获得类似的结果。
表1
ACT-101与人肿瘤细胞系的结合
在不同的反应条件下合成一系列含有DM1、DM3、DM4或ABZ981的生物缀合物，产生不同的平均DPR。这些生物缀合物的细胞毒性在一组肿瘤细胞系(白血病、乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌和肺癌)中进行体外评估。结果汇总于下表2中。
在系列1生物缀合物中，ABZ981缀合物具有最高的DPR(7.5)，但是在U937细胞系中具有与以较低的DPR(4.4-5.1)合成的其他缀合物相似的效力。DM4缀合物(DPR 4.4)在MCF-7细胞系中也具有与ABZ981缀合物相似的效力。然而，DM1和DM3缀合物在该细胞系中的效力低大约3倍。
在以相似的DPR(3.5-4)合成的系列2缀合物中，DM4缀合物在所研究的细胞系中是最有效的，而ABZ981缀合物(DPR 3.5)的效力低3至15倍。
这些结果表明，体外效力不一定与DPR有关。
表2
不同的DPR的生物缀合物在各种人肿瘤细胞系中的效力
进行温育系列2AFP生物缀合物的离体研究，该生物缀合物分别在小鼠和人血清中在37℃处温育3天和7天。将生物缀合物捕获于填充有抗AFP抗体的Innova磁性珠粒上。通过LC-ESI-MS对捕获的样品进行分析，以确认DPR谱和蛋白质的完整性。所有生物缀合物均显示出良好的稳定性，在3天后小鼠血清中的DPR平均减少为-5.9％至-13.5％，在7天后人血清中的DPR平均减少为-8.1％至15.8％。
荷瘤小鼠中的生物分布/药代动力学
在DPR为大约4的条件下重新合成含有DM4、DM1或ABZ981的生物缀合物(表3)，用于在皮下移植有COLO-205肿瘤异种移植物的小鼠的药代动力学/生物分布(PK/BD)研究中进行比较测试。
表3
PK/BD研究中测试的生物缀合物的描述
调整施用体积，从而以单次尾静脉IV注射将相同量的生物缀合物(25mg/kg)递送至每组动物。在注射后0.25和1小时采集血液样品，在4、8和24小时采集血液和组织样本，以评估生物缀合物的药代动力学和生物分布(每个时间点n＝3)。使用商购获得的ELISA试剂盒来测量AFP水平，并通过LC/MS来测量游离的美登素及其代谢物的水平。在此期间，血液中检测到的游离的毒素量可忽略不计(≤总注射剂量的0.001％)，这与生物缀合物在小鼠血清中的离体稳定性一致。
肿瘤对生物缀合物以及毒素释放和代谢的摄取
当以ng/mg组织或总施用剂量的百分比表示时，在所有时间点，与其他组相比，AFP-ABZ981缀合物相对于基于DM的缀合物，毒素向肿瘤的递送(游离的美登素加上代谢物)最高。AFP-ABZ981缀合物实现的水平分别比DM1和DM4缀合物高大约3倍和22倍。这是出乎意料的，因为与DM4缀合物相比，AFP-ABZ981缀合物在体外并不更有效。当归一化为AFP时，AFP-ABZ981缀合物组中的游离的毒素的峰值水平为肿瘤中的AFP水平的18％，这表明相当多的毒素仍与AFP结合。然而，对于AFP-ABZ981缀合物，肿瘤中的毒素释放比AFP-DM4和AFP-DM1缀合物更高(分别为大约1％和9％)。用AFP-ABZ981缀合物实现的较高水平的毒素可能是由于空间位阻较小，因为对于该缀合物，二硫键的任一侧上只有单个甲基基团。
随后在2.5至6.3的DPR处制备含有具有两种不同的释放功能的ABZ981的生物缀合物(AFP-ABZ982和AFP-ABZ1827)。U937和SKOV3细胞系的体外测试结果如表4所示。在存在8分浓度范围的化合物的情况下温育细胞4天，每个浓度以一式三份进行测试。使用新鲜解冻的U937细胞进行的两个实验给出与在培养中维持的U937细胞相似的结果。
表4
AFP-ABZ982和AFP-ABZ1827生物缀合物的细胞毒性
使用荧光标记的rhAFP在U937细胞系中进行的竞争实验证实了这些生物缀合物与AFP受体的特异性结合(图1)。简而言之，将培养的U-937细胞转移至无血清培养基中，在37℃处放置2小时，与AlexaFluor488标记的rhAFP和未标记的rhAFP或生物缀合物的滴定一起在4℃处共温育1小时。通过流式细胞术来洗涤、固定和分析细胞。
转到表5，在大约4(“低DPR”)和6(“高DPR”)的DPR处制备AFP-ABZ982和AFP-ABZ1827中的每者的两种生物缀合物(总共4种)，用于在COLO-205人肿瘤异种移植物模型中进行体内功效测试。评估移植前COLO-205细胞系中的效力。简而言之，用COLO-205细胞接种96孔板，每孔接种5,000或2,500个细胞，总体积达每孔50μL。将平板温育过夜，然后用生物缀合物在37℃处°理72小时，然后进行CellTiter-Glo测定以测量细胞活力。样品一式三份运行。高DPR生物缀合物比低DPR生物缀合物更有效，并且在体外显示出类似的针对COLO-205的效力，但是AFP-ABZ982高DPR生物缀合物是最有效的，IC50甚至低于未缀合的毒素-接头。
表5
在体外生物缀合物对COLO-205细胞的效力
在荷瘤小鼠中的疗效
在本实验中，研究了具有不同的药物-蛋白质比率(AFP-ABZ982高DPR/低DPR和AFP-1827高DPR/低DPR)和略微不同的接头结构的四种新型AFP-类美登素生物缀合物的功效。上述四种含有ABZ981的生物缀合物被重新合成并在10mM HEPES缓冲液、5％蔗糖pH 7.5中进行配制(表6)。在对荷瘤小鼠进行功效测试之前，采用与功效研究所用相同的给药方案(Q1D×5，持续2周)，在0、5、10、20和40mg/kg的剂量下，测定健康小鼠中的每种生物缀合物的最大耐受剂量(MTD)。MTD基于给药期间每天进行的临床观察和治疗结束时测定的肝酶(AST/ALT)的升高。出乎意料的是，AFP-ABZ1827高DPR的MTD高于低DPR的MTD。一般而言，预期具有较高DPR、携带较大量毒素的生物缀合物具有较低的MTD。
表6
MTD和功效研究中测试的生物缀合物的描述
在结肠癌异种移植物模型中，在7周龄的无胸腺雄性小鼠的右侧皮下移植1×107个COLO-205细胞。肿瘤为大约100mm3至200mm3的小鼠随机接受对照(载剂)或4种生物缀合物中的一种(10只动物/组)。动物每天治疗一次，持续2周，在5次给药后休息2天；在移植后60天内，每周评估肿瘤体积两次。图2和图3显示了本发明的生物缀合物在结肠癌的COLO 205人异种移植物模型中的有价值的性质，如该研究所示。
如图2所示，AFP生物缀合物AFP-ABZ982，尤其是AFP-ABZ1827对COLO-205肿瘤的生长具有显著的抑制作用，尤其是当AFP-ABZ982以低DPR下使用时以及当AFP-ABZ1827以高DPR使用时。从第17天开始，与对照相比，在所有治疗组中观察到肿瘤重量的统计学显著性(p＜0.05)降低，并且持续到所有对照组动物被实施安乐死。在高DPR AFP-ABZ1827组中，肿瘤消退发生得更早(第14天)，并且在治疗停止后继续，10只动物中有9只的肿瘤体积低于检测限。
如图3所示，与媒介物对照相比，所有测试的生物缀合物均改善了荷瘤小鼠的总体存活率。在AFP-ABZ1827高DPR组中，所有小鼠在60天观察期结束时都是存活的，而对照组中的所有动物在第38天因不受控制的肿瘤生长而死亡。在治疗的小鼠中未观察到毒性迹象。
在这项研究中，在减轻肿瘤重量和改善荷瘤小鼠的总体存活率方面，高DPR AFP-ABZ1827优于低DPR当量和所有其他测试的生物缀合物。
对不同剂量水平的高DPR AFP-ABZ1827(ACT-903)的进一步研究显示，在COLO-205异种移植物模型中显示，以30mg/kg、40mg/kg或50mg/kg的剂量进行单次静脉内注射后第14天肿瘤生长显著减少(p＜0.05)。在本研究中，对于这两个剂量组，在第24天施用第二剂。与媒介物对照组相比，该方案与40mg/kg组(p＜0.001)和50mg/kg组(p＝0.0037)的显著延长的存活期相关。
在来源于两个患者的卵巢癌类器官中进行高DPR AFP-ABZ1827(ACT-903)的进一步研究。使用荧光标记的ACT-101的研究证实了AFP受体的存在，因为该化合物与卵巢类器官结合并被其迅速吸收。ACT-903在两种类器官中以浓度依赖性和时间依赖性方式有效诱导细胞死亡。使用膜联蛋白V染色，即使在低浓度的ACT-903(类似于实验中使用的阳性对照，已知的细胞毒素，即毒胡萝卜素和星形孢菌素)处72小时仍观察到大量细胞凋亡，而未缀合的蛋白质(ACT-101)对细胞无害。
在卵巢癌异种移植物模型中进行高ACT-903的进一步研究。在五至7周龄的无胸腺雌性小鼠的右侧皮下移植A2780卵巢肿瘤细胞。小鼠随机接受对照(媒介物)或ACT-903(5只动物/组)。动物每天接受治疗，持续10天，在5个剂量后休息2天。治疗前的基线处肿瘤体积的范围为108mm3至288mm3。在移植后60天内，每周评估肿瘤体积两次。图4和图5显示了本发明的生物缀合物在卵巢癌的A2780人异种移植物模型中的有价值的性质，如该研究所示。
如图4所示，ACT-903对A2780肿瘤的生长具有显著的抑制作用。肿瘤生长曲线表明，ACT-903治疗组的肿瘤负荷显著减少(p＜0.0001)，在治疗后所有小鼠的肿瘤完全消退(肿瘤不可见或不可触及)。此外，在60天观察期期间，在治疗结束后未发生肿瘤再生长。
如图5所示，与媒介物对照相比，ACT-903显著改善了存活率(p＜0.0001)，ACT-903治疗组中的所有小鼠均存活至60天观察期结束，而对照组中无存活的小鼠。
因此，应当理解，AFP受体是癌症治疗的有高度吸引力的新型靶标，因为其表达在除MDSC之外的正常组织中通常非常低或不存在，但是在很多常见癌症中大量存在。此外，由于AFP是天然存在的人类蛋白质，每个人类胎儿在子宫内都会接触到AFP，因此减少了对rhAFP-细胞毒素生物缀合物的任何有害免疫反应的风险。
本文所述的生物缀合物含有可以被谷胱甘肽还原的二硫化物接头，谷胱甘肽在肿瘤细胞内以高浓度存在，但是在血流中以低浓度存在。因此，本发明的生物缀合物将提供双重肿瘤靶向机制，该双重肿瘤靶向机制基于AFP受体在肿瘤上的差异表达和谷胱甘肽在肿瘤中的浓度增加。
包括本文要求保护的那些的缀合物可以推广到其他动物模型，包括AFP-ABZ982低DPR和高DPR，以及优选的AFP-ABZ1827低DPR和特别高的DPR。它们代表不同的释放功能和DPR加载。体外效力处于低nM的范围内，与U937细胞系中游离的细胞毒素一样高。在所用的缀合条件下，二聚体形成不是问题，并且当在10mM HEPES或含有5％蔗糖的Tris-HCl缓冲液中配制时，生物缀合物在20℃处稳定至少96小时，并且在小鼠/人血清中在37℃处7天内表现出高血清稳定性。
本文引用的所有参考文献，包括公布、专利申请和专利，均据此以引用的方式并入。

Claims (100)

1.一种可用于治疗病变细胞的生物缀合物，所述生物缀合物包含
(1)结合至甲胎蛋白(AFP)受体(AFPR)+细胞的表面上的AFPR的试剂；
(2)对所述AFPR+细胞有毒性的细胞毒素(CT)，以及
(3)谷胱甘肽可切割的二硫化物接头，其中所述接头
(i)在AFPR结合剂和所述CT之间共价偶联，并且
(ii)在细胞内将所述CT释放至所述AFPR+细胞。
2.根据权利要求1所述的生物缀合物，其中所述AFPR结合剂具有成熟野生型AFP的氨基酸序列、所述成熟野生型AFP的AFPR结合片段或AFPR结合变体的氨基酸序列或AFP片段的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的生物缀合物，其中所述AFP是重组人AFP或者其AFPR结合片段或变体，所述变体包含1-5个氨基酸置换。
4.根据权利要求3所述的生物缀合物，其中所述试剂是缺乏糖基化的AFP。
5.根据权利要求1所述的生物缀合物，其中所述试剂是包含SEQ ID No.3的重组[Asn233Gln]成熟人AFP。
6.根据权利要求1所述的生物缀合物，其中所述试剂包含SEQ ID No.4。
7.根据权利要求5所述的生物缀合物，其中所述重组[Asn233Gln]人AFP由转基因细菌产生。
8.根据权利要求5所述的生物缀合物，其中所述重组[Asn233Gln]人AFP由包括转基因山羊在内的转基因哺乳动物产生。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的生物缀合物，其中所述细胞毒素(CT)具有下式：
10.根据权利要求1至8中任一项所述的生物缀合物，其中在所述AFPR结合剂和所述细胞毒素之间偶联的所述接头选自：
接头1-S-CH(CH3)-(CH2)2-CO--；和
接头2-S-(CH2)3-CO-。
11.根据权利要求9所述的生物缀合物，其中在所述AFPR结合剂和所述细胞毒素之间偶联的所述接头选自：
接头1-S-CH(CH3)-(CH2)2-CO--；和
接头2-S-(CH2)3-CO-。
12.一种用于制备根据权利要求1所述的生物缀合物的缀合物，其中所述缀合物包含如下所示的接头-细胞毒素
13.一种用于制备根据权利要求1所述的生物缀合物的缀合物，其中所述缀合物包含如下所示的接头-细胞毒素：
14.一种下式的生物缀合物：
其中AFP是甲胎蛋白的AFP受体结合形式。
15.一种制备物，所述制备物包含根据权利要求14所述的生物缀合物，其中n在1至11的范围内。
16.根据权利要求15所述的制备物，其中平均DPR在2至8之间。
17.根据权利要求16所述的制备物，其中所述平均DPR在5至7之间。
18.根据权利要求17所述的制备物，其中所述平均DPR在5.6和6.1之间。
19.根据权利要求17所述的制备物，其中所述平均DPR为约5.9。
20.根据权利要求16所述的制备物，其中所述平均DPR在3至4.5之间。
21.根据权利要求20所述的制备物，其中所述平均DPR在3.6和4.1之间。
22.根据权利要求20所述的制备物，其中所述平均DPR为约3.9。
23.根据权利要求14所述的生物缀合物，其中所述AFP是包含SEQ ID No.3的重组[Asn233Gln]成熟人AFP。
24.一种制备物，所述制备物包含根据权利要求23所述的生物缀合物，其中n在1至11的范围内。
25.根据权利要求24所述的制备物，其中平均DPR在2至8之间。
26.根据权利要求25所述的制备物，其中所述平均DPR在5至7之间。
27.根据权利要求26所述的制备物，其中所述平均DPR在5.6和6.1之间。
28.根据权利要求26所述的制备物，其中所述平均DPR为约5.9。
29.根据权利要求24所述的制备物，其中所述平均DPR在3至4.5之间。
30.根据权利要求24所述的制备物，其中所述平均DPR在3.6和4.1之间。
31.根据权利要求24所述的制备物，其中所述平均DPR为约3.9。
32.一种下式的生物缀合物：
其中APF是甲胎蛋白的AFP受体结合形式。
33.一种制备物，所述制备物包含根据权利要求32所述的生物缀合物，其中n在1至11的范围内。
34.根据权利要求33所述的制备物，其中平均DPR在2至8之间。
35.根据权利要求34所述的制备物，其中所述平均DPR在5至7之间。
36.根据权利要求35所述的制备物，其中所述平均DPR在5.5和6.1之间。
37.根据权利要求35所述的制备物，其中所述平均DPR为约5.8。
38.根据权利要求34所述的制备物，其中所述平均DPR在3至4.5之间。
39.根据权利要求38所述的制备物，其中所述平均DPR在3.4和4.0之间。
40.根据权利要求38所述的制备物，其中所述平均DPR为约3.7。
41.一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载剂和根据权利要求17所述的生物缀合物。
42.根据权利要求41所述的药物组合物，其中所述载剂是水性媒介物。
43.根据权利要求42所述的药物组合物，其中所述水性媒介物是含有5％蔗糖的pH 7.5的10mM HEPES缓冲液。
44.根据权利要求41至43中任一项所述的药物组合物，用于向患有AFPR+癌症的受试者施用。
45.一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载剂和根据权利要求1至8、14和26中任一项所述的生物缀合物。
46.根据权利要求45所述的药物组合物，其中所述载剂是水性媒介物。
47.根据权利要求46所述的药物组合物，其中所述水性媒介物是含有5％蔗糖的pH 7.5的10mM HEPES缓冲液。
48.包含药学上可接受的载剂和根据权利要求1至8、14和26中任一项所述的生物缀合物的药物组合物，用于向患有AFPR+癌症的受试者施用。
49.一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载剂和根据权利要求9所述的生物缀合物。
50.根据权利要求49所述的药物组合物，其中所述载剂是水性媒介物。
51.根据权利要求50所述的药物组合物，其中所述水性媒介物是含有5％蔗糖的pH 7.5的10mM HEPES缓冲液。
52.根据权利要求52所述的药物组合物，用于向患有AFPR+癌症的受试者施用。
53.一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载剂和根据权利要求10所述的生物缀合物。
54.根据权利要求54所述的药物组合物，其中所述载剂是水性媒介物。
55.根据权利要求55所述的药物组合物，其中所述水性媒介物是含有5％蔗糖的pH 7.5的10mM HEPES缓冲液。
56.根据权利要求56所述的药物组合物，用于向患有AFPR+癌症的受试者施用。
57.一种药物组合物，所述药物组合物包含药学上可接受的载剂和根据权利要求11所述的生物缀合物。
58.根据权利要求58所述的药物组合物，其中所述载剂是水性媒介物。
59.根据权利要求59所述的药物组合物，其中所述水性媒介物是含有5％蔗糖的pH 7.5的10mM HEPES缓冲液。
60.根据权利要求60所述的药物组合物，用于向患有AFPR+癌症的受试者施用。
61.一种用于治疗有需要的受试者中的AFPR+细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求31所述的药物组合物。
62.根据权利要求62所述的方法，其中所述AFPR+细胞是癌细胞。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述AFPR+细胞是MDSC。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述AFPR+细胞是卵巢癌细胞。
65.根据权利要求63所述的方法，其中所述AFPR+细胞是结直肠癌细胞。
66.根据权利要求63所述的方法，其中所述AFPR+细胞是乳腺癌细胞。
67.根据权利要求63所述的方法，其中所述AFPR+细胞是淋巴瘤细胞。
68.一种用于治疗有需要的受试者中的AFPR+细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求35所述的药物组合物。
69.根据权利要求69所述的方法，其中所述AFPR+细胞是癌细胞。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述AFPR+细胞是MDSC。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述AFPR+细胞是卵巢癌细胞。
72.根据权利要求70所述的方法，其中所述AFPR+细胞是结直肠癌细胞。
73.根据权利要求70所述的方法，其中所述AFPR+细胞是乳腺癌细胞。
74.根据权利要求70所述的方法，其中所述AFPR+细胞是淋巴瘤细胞。
75.一种用于治疗有需要的受试者中的AFPR+细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求49所述的药物组合物。
76.根据权利要求76所述的方法，其中所述AFPR+细胞是癌细胞。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述AFPR+细胞是MDSC。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述AFPR+细胞是卵巢癌细胞。
79.根据权利要求77所述的方法，其中所述AFPR+细胞是结直肠癌细胞。
80.根据权利要求77所述的方法，其中所述AFPR+细胞是乳腺癌细胞。
81.根据权利要求77所述的方法，其中所述AFPR+细胞是淋巴瘤细胞。
82.一种用于治疗有需要的受试者中的AFPR+细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求56所述的药物组合物。
83.根据权利要求83所述的方法，其中所述AFPR+细胞是癌细胞。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述AFPR+细胞是MDSC。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述AFPR+细胞是卵巢癌细胞。
86.根据权利要求84所述的方法，其中所述AFPR+细胞是结直肠癌细胞。
87.根据权利要求84所述的方法，其中所述AFPR+细胞是乳腺癌细胞。
88.根据权利要求84所述的方法，其中所述AFPR+细胞是淋巴瘤细胞。
89.根据权利要求31所述的药物组合物与第二治疗剂作为治疗组合用于治疗患有AFPR+癌症的受试者的用途。
90.根据权利要求90所述的用途，其中所述第二治疗剂是免疫检查点抑制剂或CAR-T剂或另一种免疫肿瘤疗法。
91.根据权利要求35所述的药物组合物与第二治疗剂作为治疗组合用于治疗患有AFPR+癌症的受试者的用途。
92.根据权利要求92所述的用途，其中所述第二治疗剂是免疫检查点抑制剂或CAR-T剂或另一种免疫肿瘤疗法。
93.根据权利要求49所述的药物组合物与第二治疗剂作为治疗组合用于治疗患有AFPR+癌症的受试者的用途。
94.根据权利要求94所述的用途，其中所述第二治疗剂是免疫检查点抑制剂或CAR-T剂或另一种免疫肿瘤疗法。
95.根据权利要求56所述的药物组合物与第二治疗剂作为治疗组合用于治疗患有AFPR+癌症的受试者的用途。
96.根据权利要求96所述的用途，其中所述第二治疗剂是免疫检查点抑制剂或CAR-T剂或另一种免疫肿瘤疗法。
97.一种用于制备生物缀合物的方法，所述方法包括将根据权利要求2至8中任一项所述的AFP的AFPR结合形式与根据权利要求12所述的缀合物偶联。
98.一种用于制备生物缀合物的方法，所述方法包括将根据权利要求2至8中任一项所述的AFP的AFPR结合形式与根据权利要求13所述的缀合物偶联。
99.一种用于制备生物缀合物的方法，由此所述细胞毒素ABZ-981首先与谷胱甘肽敏感性二硫化物接头偶联，以产生如下中间体：
然后，所述中间体与AFP的AFPR结合形式反应，所述AFP是包含SEQ ID No.3的重组[Asn233Gln]成熟人AFP，并且所述中间体与所述AFP中的赖氨酸残基的ε氨基共价偶联。
100.一种用于制备生物缀合物的方法，由此所述细胞毒素ABZ-981首先与谷胱甘肽敏感性二硫化物接头偶联，以产生如下中间体：
然后，所述中间体与AFP的AFPR结合形式反应，所述AFP是包含SEQ ID No.3的重组[Asn233Gln]成熟人AFP，并且所述中间体与所述AFP中的赖氨酸残基的ε氨基共价偶联。
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