CN109456284A - 一种含取代联苯的查尔酮及其应用 - Google Patents

一种含取代联苯的查尔酮及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种含取代联苯的查尔酮，该查尔酮的化学结构如下式(I)所示，式(I)中，R1是甲氧基、N‑乙酰基乙二胺基、哌嗪基、乙酰哌嗪基、乙基哌嗪基、异丙基哌嗪基、环丙基哌嗪基、1‑叔丁氧羰基‑2‑甲基哌嗪基、环丙基甲基哌嗪基或1‑(3‑硝基苯基)哌嗪基，R2是氢、氟或甲基，R3为氢或1，4‑二氧六环基。本发明所述的一种含取代联苯的查尔酮能够抑制程序性细胞死亡受体1/程序性细胞死亡配体1(PD1/PD‑L1)的相互结合，可用于制备PD1/PD‑L1抑制剂，该抑制剂的效果显著。

Description

一种含取代联苯的查尔酮及其应用
技术领域
本发明涉及有机化合物，具体涉及查尔酮化合物，该化合物能够抑制程序性细胞死亡受体1/程序性细胞死亡配体1(PD1/PD-L1)的相互结合，可用于治疗肿瘤。
背景技术
肿瘤免疫疗法被越来越多的运用在癌症治疗领域。目前，肿瘤免疫治疗主要运用的药物是大分子生物抗体。其中PD-1/PD-L1的抑制剂(也被称为免疫检查点抑制剂)对多种肿瘤有效。因此，近年来，PD1/PD-L1成为抗肿瘤药物设计中最吸引人的一个靶标，同时也已被列为最具前景的肿瘤治疗靶点之一，因而备受关注。
PD-1在凋亡T杂交瘤细胞中被发现，由于与细胞凋亡相关，故被命名为程序性细胞死亡受体1。PD-1是一种重要的免疫抑制分子，在抑制肿瘤、病毒感染等疾病相关的抗原特异性T细胞应答中起着关键作用。体内肿瘤微环境诱导浸润的T细胞过度表达PD1，与此同时，肿瘤细胞过度表达配体PD-L1和PD-L2。PD-1与PD-L1的结合导致肿瘤患者T细胞效应功能下调，从而抑制抗肿瘤免疫应答，导致了T细胞的衰竭。PD-1/PD-L1抑制剂可以阻断PD-1和PD-L1的结合，干扰负调控信号，恢复T细胞的活性，从而增强免疫应答。PD-1/PD-L1的抑制剂(也被称为免疫检查点抑制剂)对多种肿瘤有效。到目前为止，FDA已经批准了6种免疫检查点抑制剂，它们都是单克隆抗体，包括Ipilimumab(BMS研发，anti-CTLA-4)，Nivolumab(BMS研发，anti-PD-1)，Pembrolizumab(Merck研发，anti-PD-1)、Atezolizumab(anti-PD-L1，罗氏研发)，Duvalumab(抗PD-L1，阿斯利康研发)，Avelumab(抗PD-L1，辉瑞和默克共同研发)。抗体介导的免疫检查点阻滞剂(ICB)在多种肿瘤类型如晚期转移性非小细胞肺癌、尿路上皮癌和头颈部鳞状细胞癌的临床试验中显示出很好的疗效。这些治疗方案已被采用作为相关癌症治疗的标准。然而，目前的PD-1/PD-L1单克隆抗体只对一小部分病例和肿瘤类型产生疗效。
PD-1/PD-L1抗体药物就其药效动力学而言具有靶点专属特异性和高效性等方面的优点。然而就其药代动力学而言，抗体药物的缺点也非常明显，首先，对相关组织和肿瘤细胞穿透性差，代谢半衰期长，口服生物利用度低等，其次，抗体药物具有免疫原性，因此会引起严重的不良反应，而且，抗体药物制造和分离纯化过程很复杂，导致其生产成本非常高昂。与大分子抗体药物相反，小分子化合物在药效动力学方面具有很多优势，例如，小分子化合物具有较好的口服生物利用度，对相关组织和肿瘤细胞渗透率高，半衰期合理等，而且小分子化合物具有毒性低，较高的选择性和有效性等优点，因此，小分子肿瘤免疫类药物有望克服大分子抗体药物存在的缺点。在肿瘤免疫治疗领域，小分子化合物既可以完善现有的抗体药物存在的不足，也可以与抗体药物共同使用发挥协同作用。随着科研人员在小分子肿瘤免疫药物研究中作出的巨大努力，一些高效的小分子化合物陆续被报道，其中有些小分子化合物已经进入临床研究。然而，迄今为止，没有一款小分子肿瘤免疫药物被FDA批准用于癌症相关治疗。因此，以小分子为基础的肿瘤免疫疗法仍然是肿瘤免疫治疗最值得的关注的科学领域之一。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种含取代联苯的查尔酮，该化合物能够抑制程序性细胞死亡受体1/程序性细胞死亡配体1(PD1/PD-L1)的相互结合，可用于制备PD1/PD-L1抑制剂。
本发明解决上述技术问题的方案如下：
一种含取代联苯的查尔酮，该查尔酮的化学结构如下式(I)所示，
式(I)中，R1是甲氧基、N-乙酰基乙二胺基、哌嗪基、乙酰哌嗪基、乙基哌嗪基、异丙基哌嗪基、环丙基哌嗪基、1-叔丁氧羰基-2-甲基哌嗪基、环丙基甲基哌嗪基或1-(3-硝基苯基)哌嗪基，R2是氢、氟或者甲基，R3为氢或者1，4-二氧六环基。
本发明所述的查尔酮优选为下述化合物之一：
R1是甲氧基，R2是甲基，R3为氢，所述查尔酮的化学结构为
R1是乙酰哌嗪基，R2是甲基，R3为1，4-二氧六环基，所述查尔酮的化学结构为
R1是乙酰哌嗪基，R2是氟，R3为氢，所述查尔酮的化学结构为
R1是N-乙酰基乙二胺基，R2是甲基，R3为氢，所述查尔酮的化学结构为
R1是1-叔丁氧羰基-2-甲基哌嗪基，R2是甲基，R3为氢，所述查尔酮的化学结构为
R1是异丙基哌嗪基，R2是甲基，R3为氢，所述查尔酮的化学结构为
R1是环丙基甲基哌嗪基，R2是甲基，R3为氢，所述查尔酮的化学结构为
R1是乙基哌嗪基，R2是甲基，R3为氢，所述查尔酮的化学结构为
R1是N-乙酰基乙二胺基，R2是甲基，R3为氢，所述查尔酮的化学结构为
R1是哌嗪基，R2是甲基，R3为氢，所述查尔酮的化学结构为
R1是乙酰哌嗪基，R2是甲基，R3为氢，所述查尔酮的化学结构为
R1是1-(3-硝基苯基)哌嗪基，R2是甲基，R3为1，4-二氧六环基，所述查尔酮的化学结构为
R1是环丙基哌嗪基，R2是甲基，R3为氢，所述查尔酮的化学结构为
上述取代联苯的查尔酮的制备方法包括以下步骤：
本发明的含取代联苯的查尔酮的制备方法，该方法包括以下步骤：首先将邻羟基苯乙酮和多聚甲醛，盐酸进行氯甲基化反应生成化合物II；然后将化合物II进行亲核取代反应生成化合物III；最后将化合物III和化合物IV反应生成化合物V。
上述方法的反应式如下所示：
上述反应式中，R1是甲氧基、N-乙酰基乙二胺基、哌嗪基、乙酰哌嗪基、乙基哌嗪基、异丙基哌嗪基、环丙基哌嗪基、1-叔丁氧羰基-2-甲基哌嗪基、环丙基甲基哌嗪基、1-(3-硝基苯基)哌嗪基，R2是氢、氟或者甲基，R3为氢或者1，4-二氧六环基。
上述的查尔酮能够抑制程序性细胞死亡受体1/程序性细胞死亡配体1(PD1/PD-L1)的相互结合，可用于制备PD1/PD-L1抑制剂。所述的PD1/PD-L1抑制剂由权利要求1所述的查尔酮和医学上可接受的辅料组成。
采用HTRF(均相时间分辨荧光)技术标准操作程序测定本发明所述的一种含取代联苯的查尔酮对PD1/PD-L1的抑制效果，结果显示该类化合物对PD1/PD-L1具有较好抑制效果。
以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。
附图说明
图1为本发明所述的一种含取代联苯的查尔酮对PD1/PD-L1的抑制曲线图，其中，A图为CET8浓度抑制率曲线图，B图为CET13浓度抑制率曲线图，C图为CET3浓度抑制率曲线图，D图为CET10浓度抑制率曲线图。
具体实施方式
实施例1(制备CET10)
结构式为化合物的制备方法由以下步骤组成：
步骤一：化合物II的制备
将20g邻羟基苯乙酮和5.2g多聚甲醛(HCOH)加入60ml浓盐酸(HCl)中，搅拌，加热至50℃，反应10小时，薄层色谱(TLC)监测，反应结束后，将反应液倾入100mL水中，用乙酸乙酯(100mL×5)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(80mL×3)、饱和食盐水(80mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得白色固体10克。
将所得到的白色固体采用核磁共振谱进行鉴定，鉴定结果为：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.32(s,1H),7.74(d,J＝2.2Hz,1H),7.50(dd,J＝8.6,2.2Hz,1H),6.98(d,J＝8.6Hz,1H),4.57(s,2H),2.65(s,3H).由上述鉴定结果可知，所得白色固体为化合物II。
步骤二：化合物III的制备
将100mg化合物II和105mg乙酰哌嗪加入5ml二氯甲烷(DCM)中，搅拌，加热至40℃，反应2小时，TLC监测，反应结束后，旋干溶剂，将反应物倾入100mL水中，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的碳酸氢钠(NaHCO3)(20mL×3)、饱和食盐水(20mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得黄色油状化合物III 100mg。
将所得到的化合物III采用核磁共振谱、质谱技术进行鉴定，鉴定结果为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.13(s,1H),7.60(s,1H),7.37(d,J＝8.4Hz,1H),6.84(d,J＝8.5Hz,1H),3.54(d,J＝4.2Hz,2H),3.40(s,4H),2.56(s,3H),2.39–2.31(m,4H),2.00(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ204.45,168.97,161.51,137.32,131.01,127.92,119.26,118.17,61.78,52.77,52.42,46.07,41.22,26.57,21.12.ESI-MS：m/z＝277.7[M+1]+.由上述鉴定结果可知，所得黄色油状产物为化合物III。
步骤三：CET10的制备
将100mg化合物III和40mg氢氧化钾加入5ml甲醇中，搅拌至溶液颜色变黄，再加入80mg化合物IV，反应24小时，TLC监测，反应结束后，用浓盐酸调节反应溶液pH＝7，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(20mL×3)、饱和食盐水(20mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯，之后进行柱层析V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝10:1得黄色固体CET10 80mg。
将所得到的CET10采用核磁共振谱、质谱技术进行鉴定，鉴定结果为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.82(s,1H),8.36(d,J＝15.3Hz,1H),7.88(s,1H),7.78–7.73(m,1H),7.63(d,J＝15.3Hz,1H),7.51(dd,J＝8.5,1.5Hz,1H),7.45(d,J＝7.4Hz,2H),7.40(d,J＝7.3Hz,1H),7.36(d,J＝1.5Hz,1H),7.35(s,1H),7.33(s,1H),7.31(s,1H),7.04(d,J＝8.5Hz,1H),3.67(s,2H),3.50(s,4H),2.48(s,4H),2.39(s,3H),2.11(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ193.43,168.73,162.91,143.77,143.31,141.37,137.34,135.66,134.46,132.14,130.03,129.16,128.15,128.10,127.05,125.90,121.90,119.59,118.46,61.97,52.89,52.59,46.15,41.29,21.23,16.98.ESI-MS：m/z＝455.6[M+1]+.由上述鉴定结果可知，所得黄色固体产物为CET10。
实施例2(制备CET1)
结构式为化合物的制备方法由以下步骤组成：
步骤一：CET1的制备
将100mg化合物III和40mg氢氧化钾(KOH)加入5ml甲醇中，搅拌至溶液颜色变黄，再加入100mg化合物IV，反应24小时，TLC监测，反应结束后，用浓盐酸调节反应溶液pH＝7，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(20mL×3)、饱和食盐水(20mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯，之后进行柱层析V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝3:1得黄色固体CET1 70mg。
将所得到的CET1采用核磁共振谱技术进行鉴定，鉴定结果为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.83(s,1H),8.34(d,J＝15.2Hz,1H),7.86(s,1H),7.72(s,1H),7.61(d,J＝15.1Hz,1H),7.50(d,J＝8.5Hz,1H),7.37–7.30(m,2H),7.03(d,J＝8.5Hz,1H),6.94(d,J＝8.2Hz,1H),6.83(s,1H),6.78(d,J＝8.2Hz,1H),4.33(s,4H),3.66(s,2H),3.52(d,J＝11.4Hz,4H),2.47(s,4H),2.41(s,3H),2.11(s,3H).由上述鉴定结果可知，所得黄色固体产物为CET1。
实施例3(制备CET12)
结构式为化合物的制备方法由以下步骤组成：
步骤一：CET12的制备
将100mg化合物III和40mg氢氧化钾加入5ml甲醇中，搅拌至溶液颜色变黄，再加入74mg化合物IV，反应24小时，TLC监测，反应结束后，用浓盐酸调节反应溶液pH＝7，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(20mL×3)、饱和食盐水(20mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯，之后进行柱层析V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝3:1得黄色固体CET12 65mg。
将所得到的CET12采用核磁共振谱、质谱技术进行鉴定，鉴定结果为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.80(s,1H),8.35(d,J＝15.3Hz,1H),7.89(s,1H),7.77(d,J＝5.7Hz,1H),7.65(d,J＝15.4Hz,1H),7.51(d,J＝8.4Hz,1H),7.45(d,J＝7.3Hz,2H),7.40(d,J＝7.1Hz,1H),7.37–7.33(m,3H),7.32(s,1H),7.02(d,J＝8.5Hz,1H),3.53(s,2H),2.70(s,4H),2.50(s,4H),2.40(s,3H),2.27(s,1H),0.49–0.42(m,4H).ESI-MS：m/z＝441.7[M+1]+.由上述鉴定结果可知，所得黄色固体产物为CET12。
实施例4(制备CET8)
结构式为化合物的制备方法由以下步骤组成：
步骤一：化合物III的制备
将100mg化合物II和93mg乙基哌嗪加入5ml二氯甲烷(DCM)中，搅拌，加热至40℃，反应2小时，TLC监测，反应结束后，旋干溶剂，将反应物倾入100mL水中，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(20mL×3)、饱和食盐水(20mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得黄色油状化合物III 90mg。
将所得到的化合物III采用核磁共振谱技术进行鉴定，鉴定结果为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.27(s,1H),7.69(s,1H),7.45(d,J＝8.5Hz,1H),6.96(d,J＝8.5Hz,1H),3.58(s,2H),3.03–2.75(m,8H),2.66(s,3H),1.38(t,J＝7.2Hz,3H),0.93–0.80(m,2H).由上述鉴定结果可知，所得黄色油状产物为化合物III。
步骤二：CET8的制备
将90mg化合物III和40mg氢氧化钾加入5ml甲醇中，搅拌至溶液颜色变黄，再加入83mg化合物IV，反应24小时，TLC监测，反应结束后，用浓盐酸调节反应溶液pH＝7，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(20mL×3)、饱和食盐水(20mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯，之后进行柱层析V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝3:1得黄色固体CET8 60mg。
将所得到的CET8采用核磁共振谱、质谱技术进行鉴定，鉴定结果为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.80(s,1H),8.35(d,J＝15.3Hz,1H),7.87(s,1H),7.76(d,J＝5.7Hz,1H),7.64(d,J＝15.3Hz,1H),7.51(d,J＝8.4Hz,1H),7.46(t,J＝7.3Hz,2H),7.40(d,J＝7.1Hz,1H),7.38–7.33(m,3H),7.32(s,1H),7.02(d,J＝8.5Hz,1H),3.53(s,2H),2.78–2.42(m,10H),2.39(s,3H),1.13(t,J＝7.1Hz,3H).ESI-MS：m/z＝441.2[M+1]+.由上述鉴定结果可知，所得黄色固体产物为CET8。
实施例5(制备CET7)
结构式为化合物的制备方法由以下步骤组成：
步骤一：化合物III的制备
将100mg化合物II和120mg 1-环丙甲基哌嗪加入5ml二氯甲烷(DCM)中，搅拌，加热至40℃，反应2小时，TLC监测，反应结束后，旋干溶剂，将反应物倾入100mL水中，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(20mL×3)、饱和食盐水(20mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得黄色油状化合物III 80mg。
将所得到的化合物III采用质谱技术进行鉴定，鉴定结果为：ESI-MS：m/z＝289.2[M+1]+
由上述鉴定结果可知，所得黄色油状产物为化合物III。
步骤二：CET7的制备
将80mg化合物III和39mg氢氧化钾加入5ml甲醇中，搅拌至溶液颜色变黄，再加入75mg化合物IV，反应24小时，TLC监测，反应结束后，用浓盐酸调节反应溶液pH＝7，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(20mL×3)、饱和食盐水(20mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯，之后进行柱层析V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝3:1得黄色固体CET7 68mg。
将所得到的CET7采用核磁共振谱、质谱技术进行鉴定，鉴定结果为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.80(s,1H),8.35(d,J＝15.3Hz,1H),7.88(s,1H),7.76(d,J＝5.5Hz,1H),7.64(d,J＝15.3Hz,1H),7.51(d,J＝8.4Hz,1H),7.46(t,J＝7.2Hz,2H),7.40(d,J＝6.9Hz,1H),7.35(dd,J＝6.6,3.7Hz,3H),7.32(s,1H),7.02(d,J＝8.5Hz,1H),3.54(s,2H),2.59(s,8H),2.39(s,3H),2.33(d,J＝6.4Hz,2H),0.91(d,J＝4.6Hz,1H),0.54(d,J＝7.6Hz,2H),0.14(d,J＝4.7Hz,2H).ESI-MS：m/z＝467.7[M+1]+.由上述鉴定结果可知，所得黄色固体产物为CET7。
实施例6(制备CET6)
结构式为化合物的制备方法由以下步骤组成：
步骤一：化合物III的制备
将100mg化合物II和105mg异丙基哌嗪加入5ml二氯甲烷(DCM)中，搅拌，加热至40℃，反应2小时，TLC监测，反应结束后，旋干溶剂，将反应物倾入100mL水中，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(20mL×3)、饱和食盐水(20mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得黄色油状化合物III 66mg。
将所得到的化合物III采用质谱技术进行鉴定，鉴定结果为：ESI-MS：m/z＝277.1[M+1]+
由上述鉴定结果可知，所得黄色油状产物为化合物III。
步骤二：CET6的制备
将66mg化合物III和41mg氢氧化钾加入5ml甲醇中，搅拌至溶液颜色变黄，再加入78mg化合物IV，反应24小时，TLC监测，反应结束后，用浓盐酸调节反应溶液pH＝7，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(20mL×3)、饱和食盐水(20mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯，之后进行柱层析V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝3:1得黄色固体CET6 45mg。
将所得到的CET6采用核磁共振谱、质谱技术进行鉴定，鉴定结果为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.80(s,1H),8.35(d,J＝15.3Hz,1H),7.89(s,1H),7.77(d,J＝5.7Hz,1H),7.65(d,J＝15.4Hz,1H),7.51(d,J＝8.4Hz,1H),7.45(d,J＝7.3Hz,2H),7.40(d,J＝7.1Hz,1H),7.37–7.33(m,3H),7.32(s,1H),7.02(d,J＝8.5Hz,1H),3.53(s,2H),2.70(s,4H),2.50(s,4H),2.40(s,3H),2.27(s,1H),0.49–0.42(m,4H).ESI-MS：m/z＝455.8[M+1]+.由上述鉴定结果可知，所得黄色固体产物为CET6。
实施例7(制备CET11)
结构式为化合物的制备方法由以下步骤组成：
步骤一：化合物III的制备
将100mg化合物II和70mg哌嗪加入5ml二氯甲烷(DCM)中，搅拌，加热至40℃，反应2小时，TLC监测，反应结束后，旋干溶剂，将反应物倾入100mL水中，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(20mL×3)、饱和食盐水(20mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得黄色油状化合物III 56mg。
将所得到的化合物III采用核磁共振谱技术进行鉴定，鉴定结果为：
1H NMR(400MHz,MeOD)δ8.12(s,1H),7.66(d,J＝8.6Hz,1H),7.05(d,J＝8.6Hz,1H),4.40(s,2H),3.57(dd,J＝13.9,4.3Hz,8H),2.69(s,3H).
由上述鉴定结果可知，所得黄色油状产物为化合物III。
步骤二：CET11的制备
将56mg化合物III和27mg氢氧化钾加入5ml甲醇中，搅拌至溶液颜色变黄，再加入52mg化合物IV，反应24小时，TLC监测，反应结束后，用浓盐酸调节反应溶液pH＝7，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(20mL×3)、饱和食盐水(20mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯，之后进行柱层析V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝3:1得黄色固体CET11 44mg。
将所得到的CET11采用核磁共振谱技术进行鉴定，鉴定结果为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.84(s,1H),8.37(d,J＝15.2Hz,1H),7.84(s,1H),7.77(dd,J＝6.9,2.0Hz,1H),7.61(d,J＝15.3Hz,1H),7.48(s,1H),7.46(s,1H),7.44(s,1H),7.42(d,J＝5.0Hz,1H),7.40–7.37(m,1H),7.36(s,1H),7.33(d,J＝1.5Hz,1H),7.32(s,1H),7.04(d,J＝8.5Hz,1H),3.57(s,2H),3.18(s,4H),2.73(s,4H),2.39(s,3H).由上述鉴定结果可知，所得黄色固体产物为CET11。
实施例8(制备CET2)
结构式为化合物的制备方法由以下步骤组成：
步骤一：CET2的制备
将100mg化合物III和41mg氢氧化钾加入5ml甲醇中，搅拌至溶液颜色变黄，再加入80mg化合物IV，反应24小时，TLC监测，反应结束后，用浓盐酸调节反应溶液pH＝7，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(20mL×3)、饱和食盐水(20mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯，之后进行柱层析V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝3:1得黄色固体CET2 70mg。
将所得到的CET2采用核磁共振谱、质谱技术进行鉴定，鉴定结果为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.77(s,1H),8.08(d,J＝15.6Hz,1H),7.82(d,J＝15.0Hz,2H),7.67(d,J＝6.8Hz,1H),7.57(d,J＝7.2Hz,2H),7.50(dd,J＝15.5,7.8Hz,4H),7.43(d,J＝7.5Hz,1H),7.29(d,J＝7.6Hz,1H),7.01(d,J＝8.5Hz,1H),3.65(s,2H),3.49(d,J＝18.3Hz,4H),2.46(s,4H),2.08(s,3H).ESI-MS：m/z＝459.7[M+1]+.由上述鉴定结果可知，所得黄色固体产物为CET2。
实施例9(制备CET3)
结构式为化合物的制备方法由以下步骤组成：
步骤一：化合物III的制备
将300mg化合物II加入20ml二氯甲烷(DCM)中，搅拌至完全溶解，249mg N-乙酰基乙二胺分批次少量加入，0℃反应2小时，TLC监测，反应结束后，旋干溶剂，将反应物倾入100mL水中，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(20mL×3)、饱和食盐水(20mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得黄色油状化合物III 310mg。
将所得到的化合物III采用核磁共振谱技术进行鉴定，鉴定结果为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.22(s,1H),7.72(s,1H),7.47(dd,J＝8.6,1.9Hz,1H),6.98(d,J＝8.5Hz,1H),6.01(s,1H),3.79(s,2H),3.51(s,1H),3.40(dd,J＝11.5,5.7Hz,2H),2.82(t,J＝5.8Hz,2H),2.66(d,J＝14.9Hz,3H),2.01(s,3H).
由上述鉴定结果可知，所得黄色油状产物为化合物III。
步骤二：CET3的制备
将310mg化合物III和140mg氢氧化钾加入5ml甲醇中，搅拌至溶液颜色变黄，再加入270mg化合物IV，反应24小时，TLC监测，反应结束后，用浓盐酸调节反应溶液pH＝7，用乙酸乙酯(80mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(40mL×3)、饱和食盐水(40mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯，之后进行柱层析V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝2:1得黄色固体CET3 170mg。
将所得到的CET3采用核磁共振谱技术进行鉴定，鉴定结果为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.30(d,J＝18.5Hz,2H),7.90(d,J＝7.3Hz,1H),7.81(d,J＝15.3Hz,1H),7.54(d,J＝8.4Hz,1H),7.42(d,J＝7.0Hz,3H),7.38(d,J＝7.0Hz,1H),7.27–7.13(m,3H),6.97(d,J＝8.5Hz,1H),4.01(s,2H),3.52(d,J＝4.1Hz,2H),3.01(s,2H),2.34(s,3H),1.96(s,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ193.47,171.76,163.72,144.25,143.38,141.45,137.44,136.03,134.11,132.38,131.62,129.19,128.15,127.05,126.18,125.84,123.38,121.45,119.97,118.91,51.35,47.19,36.91,23.07,16.94.
由上述鉴定结果可知，所得黄色固体产物为CET3。
实施例10(制备CET4)
结构式为化合物的制备方法由以下步骤组成：
步骤一：CET4的制备
将100mg化合物II和60mg氢氧化钾加入5ml甲醇中，搅拌至溶液颜色变黄，再加入117mg化合物IV，反应24小时，TLC监测，反应结束后，用浓盐酸调节反应溶液pH＝7，用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(30mL×3)、饱和食盐水(30mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯，之后进行柱层析V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝2:1得黄色固体CET4 90mg。
将所得到的CET4采用核磁共振谱技术进行鉴定，鉴定结果为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.86(s,1H),8.36(d,J＝15.3Hz,1H),7.94(s,1H),7.78–7.74(m,1H),7.65(d,J＝15.3Hz,1H),7.51(dd,J＝8.5,1.6Hz,1H),7.46(d,J＝7.5Hz,2H),7.41(d,J＝7.2Hz,1H),7.37–7.33(m,3H),7.32(s,1H),7.06(d,J＝8.5Hz,1H),4.47(s,2H),3.44(d,J＝7.0Hz,3H),2.40(s,3H).
由上述鉴定结果可知，所得黄色固体产物为CET4。
实施例11(制备CET5)
结构式为化合物的制备方法由以下步骤组成：
步骤一：化合物IV的制备
将100mg化合物II，120mg化合物III加入5ml二氯甲烷(DCM)中，搅拌，40℃反应2小时，TLC监测，反应结束后，旋干溶剂，将反应物倾入100mL水中，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(20mL×3)、饱和食盐水(20mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得黄色油状化合物IV 90mg。
将所得到的化合物IV采用质谱技术进行鉴定，鉴定结果为：
ESI-MS：m/z＝349.2[M+1]+由上述鉴定结果可知，所得黄色油状产物为化合物IV。
步骤二：CET5的制备
将90mg化合物III和29mg氢氧化钾加入5ml甲醇中，搅拌至溶液颜色变黄，再加入56mg化合物V，反应24小时，TLC监测，反应结束后，用浓盐酸调节反应溶液pH＝7，用乙酸乙酯(80mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(40mL×3)、饱和食盐水(40mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯，之后进行柱层析V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝2:1得黄色固体CET5 10mg。
将所得到的CET5采用核磁共振谱、质谱技术进行鉴定，鉴定结果为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.78(s,1H),8.35(d,J＝15.3Hz,1H),7.90(s,1H),7.73(s,1H),7.63(d,J＝15.4Hz,1H),7.52(d,J＝8.5Hz,1H),7.45(d,J＝7.3Hz,2H),7.40(d,J＝6.9Hz,1H),7.35–7.31(m,4H),7.03(d,J＝8.5Hz,1H),4.23(s,1H),3.87(d,J＝13.2Hz,1H),3.58(d,J＝13.1Hz,1H),3.39(d,J＝13.2Hz,1H),3.15(d,J＝11.4Hz,1H),2.82(d,J＝10.9Hz,1H),2.64(d,J＝12.7Hz,1H),2.40(s,3H),2.27(s,1H),2.16(d,J＝8.9Hz,1H),1.49(s,9H),1.28(s,3H).ESI-MS：m/z＝527.7[M+1]+.由上述鉴定结果可知，所得黄色固体产物为CET5。
实施例12(制备CET13)
结构式为化合物的制备方法由以下步骤组成：
步骤一：化合物IV的制备
将100mg化合物II，124mg化合物III加入5ml二氯甲烷(DCM)中，搅拌，40℃反应2小时，TLC监测，反应结束后，旋干溶剂，将反应物倾入100mL水中，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(20mL×3)、饱和食盐水(20mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得黄色油状化合物IV 65mg。
将所得到的化合物IV采用核磁共振谱技术进行鉴定，鉴定结果为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.24(s,1H),7.78–7.69(m,2H),7.65(dd,J＝7.9,1.7Hz,1H),7.49(dd,J＝8.5,2.1Hz,1H),7.37(t,J＝8.2Hz,1H),7.18(dd,J＝8.2,2.4Hz,1H),6.97(d,J＝8.5Hz,1H),3.55(s,2H),3.40–3.22(m,4H),2.66(s,3H),2.65(d,J＝4.3Hz,4H).由上述鉴定结果可知，所得黄色油状产物为化合物IV。
步骤二：CET13的制备
将65mg化合物IV和21mg氢氧化钾加入5ml甲醇中，搅拌至溶液颜色变黄，再加入52mg化合物V，反应24小时，TLC监测，反应结束后，用浓盐酸调节反应溶液pH＝7，用乙酸乙酯(80mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(40mL×3)、饱和食盐水(40mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯，之后进行柱层析V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝2:1得黄色固体CET5 3mg。
将所得到的CET13采用核磁共振谱、质谱技术进行鉴定，鉴定结果为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.84(s,1H),8.35(d,J＝15.3Hz,1H),7.93(s,1H),7.73(d,J＝2.1Hz,2H),7.67(d,J＝8.2Hz,2H),7.56–7.53(m,1H),7.38(d,J＝8.2Hz,1H),7.32(d,J＝4.0Hz,2H),7.20(dd,J＝8.2,1.8Hz,1H),7.05(d,J＝8.5Hz,1H),6.94(d,J＝8.2Hz,1H),6.83(d,J＝1.9Hz,1H),6.78(dd,J＝8.2,2.0Hz,1H),4.33(s,4H),3.61(s,2H),3.34(d,J＝10.6Hz,4H),2.69(s,4H),2.41(s,3H).ESI-MS：m/z＝592.4[M+1]+.由上述鉴定结果可知，所得黄色固体产物为CET13。
实施例13(制备CET9)
结构式为化合物的制备方法由以下步骤组成：
步骤一：化合物IV的制备
将100mg化合物II，75mg化合物III加入5ml二氯甲烷(DCM)中，搅拌，40℃反应2小时，TLC监测，反应结束后，旋干溶剂，将反应物倾入100mL水中，用乙酸乙酯(20mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(20mL×3)、饱和食盐水(20mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯得黄色油状化合物IV 83mg。
将所得到的化合物IV采用质谱技术进行鉴定，鉴定结果为：
ESI-MS：m/z＝275.2[M+1]+由上述鉴定结果可知，所得黄色油状产物为化合物IV。
步骤二：CET9的制备
将83mg化合物III和34mg氢氧化钾加入5ml甲醇中，搅拌至溶液颜色变黄，再加入65mg化合物V，反应24小时，TLC监测，反应结束后，用浓盐酸调节反应溶液pH＝7，用乙酸乙酯(80mL×3)萃取，静置分液，有机相分别用5％的NaHCO3(40mL×3)、饱和食盐水(40mL×3)洗涤，然后用无水硫酸镁干燥，抽滤，减压除去乙酸乙酯，之后进行柱层析V(石油醚)：V(乙酸乙酯)＝2:1得黄色固体CET9 6mg。
将所得到的CET9采用核磁共振谱技术进行鉴定，鉴定结果为：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.80(s,1H),8.35(d,J＝15.3Hz,1H),7.89(s,1H),7.77(d,J＝5.7Hz,1H),7.65(d,J＝15.4Hz,1H),7.51(d,J＝8.4Hz,1H),7.45(d,J＝7.3Hz,2H),7.40(d,J＝7.1Hz,1H),7.36(s,1H),7.34(d,J＝4.6Hz,2H),7.32(s,1H),7.02(d,J＝8.5Hz,1H),3.53(s,2H),2.70(s,4H),2.50(s,4H),2.40(s,3H),2.27(s,1H),0.48–0.41(m,4H).ESI-MS：m/z＝453.7[M+1]+.由上述鉴定结果可知，所得黄色固体产物为CET9。
实施例14、含取代联苯的查尔酮的化合物对PD1/PD-L1的抑制效果研究
本发明化合物的对PD1/PD-L1的抑制效果采用如下方法测试所证明。
这些效果表明本发明化合物对PD1/PD-L1的抑制效果明显，其可用于治疗癌症，特别是治疗转移性非小细胞肺癌、尿路上皮癌和头颈部鳞状细胞癌。具体测试方法如下：
一、实验目的及原理
参考公开号为CN108593615A专利申请说明书第[0016]、[0017]和[0034]段所述方法，采用HTRF方法快速高效检测实施例1～13所制备的化合物(编号依次为CET1～CET13)对PD1/PD-L1的抑制效果。HTRF检测技术是基于时间分辨荧光(TRF)和荧光共振能量转移(FRET)两大技术原理。时间分辨荧光(TRF)利用稀土元素中镧系元素半衰期长，荧光比普通荧光持续时间长的特性，通过延迟50-100微秒排除背景，从而反映样品实际情况。荧光共振能量转移(FRET)是指在两个不同的荧光基团中，如果一个荧光基团(供体Donor)的发射光谱与另一个基团(受体Acceptor)的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时(一般小于)，就可观察到荧光能量由供体向受体转移的现象，即以前一种基团的激发波长激发时，可观察到后一个基团发射的荧光。简单地说，就是在供体基团的激发状态下由一对偶极子介导的能量从供体向受体转移的过程。能量供给体－接受体(D–A)对之间发生有效能量转移的条件是苛刻的，主要包括：(1)能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱必须重叠；(2)能量供体与能量受体的荧光生色团必须以适当的方式排列；(3)能量供体、能量受体之间必须足够接近，这样发生能量转移的几率才会高。HTRF是利用了具有穴状结构的铕(Eu)元素的螯和标记物作为一个能量供体(Donor)和XL665(改良过的别藻蓝蛋白)作为一个能量受体(Acceptor)，是基于Eu穴状化合物的供体与XL665受体(第二荧光标记物)之间的时间分辨荧光(TRF)和荧光共振能量转移(FRET)特性开通的高通量药物筛选技术。在荧光共振能量转移中，受体发射荧光的寿命等同与供体的发射荧光的寿命。因为Eu的荧光衰减周期较长，所以含Eu的供体会诱导XL665受体长时间地发射荧光，受体激发后产生的荧光便能持续较长时间，这样通过时间分辨就可以区分短寿命的自身散射荧光，这样从短寿命荧光背景中就很容易区分出FRET信号。当由于生物分子相互作用导致两个荧光基团接近时，在激发时被Eu穴状化合物捕获的部分能量释放，发射波长为620nm；另一部分能量转移到受体(Acceptor)上，发射波长为665nm。665nm的发射光仅由供体(Donor)引起的FRET产生。在HTRF检测试剂盒中，Eu穴状化合物的能量供体能够特异性的结合PD-L1蛋白，XL665能量受体能够特异性的结合PD-1蛋白，从而形成四个物质聚合的复合物。拉近Donor和Acceptor的距离，能量能够从Donor上转移到Acceptor上，使Acceptor产生荧光；若测试化合物能够阻断二者结合，则随着测试化合物浓度的增加，665nm/620nm的比值降低；待检测体系稳定后测定荧光值的变化便可量化阻断剂的效价IC50；检测的为HTRF两个荧光665nm和620nm，即时间分辨荧光(TRF)，当665nm/620nm的比值降低，阻断剂的效应越高。HTRF检测试剂盒，就是综合利用抗原抗体的特异性结合反应，受体供体间能量共振转移而开发的，高灵敏度，快速免洗，低背景的高通量检测技术。
二、试剂基本信息
三、实验试剂准备
四、实验过程
(1)向96孔板中每孔加入2μl的化合物稀释液，1000rpm离心1min.
(2)向每孔加入4μl(2.5X)PD-1混合液，1000rpm离心1min.
(3)向每孔加入4ul(2.5X)PD-L1混合液，1000rpm离心1min，室温孵育15min.(4)每孔加入10μl(2X)测试混合液,1000rpm离心1min.
(5)室温孵育120min,使用Tecan酶标仪读取荧光值(Ex:320nM；Em:620and665nM).
(6)按下列公式计算抑制率，抑制率(Inibition)％＝(1-(各孔665nm/620nm信号值-低对照组平均值)/(高对照组平均值-低对照组平均值))*100。其中高对照组为没有加化合物处理，仅用等量浓度DMSO溶液加入反应体系组；低对照组为没有PD-1混合液，只加入等量detection检测混合液。该检测体系中，DMSO终浓度为0.5％。用GraphPad Prism5软件计算半数抑制量IC50。
测活性结果如表1-2所示：
表1化合物CET1～CET13在1μM对PD1/PD-L1的抑制效果
表2部分化合物对PD1/PD-L1的抑制效果IC50
根据上述体外实验结果，我们可以得出专利所述的一种含取代联苯的查尔酮，该类化合物能够抑制程序性细胞死亡受体1/程序性细胞死亡配体1(PD1/PD-L1)的相互结合，其中CET3，CET8，CET10，CET13对PD1/PD-L1的抑制效果显著。

Claims (4)

1.一种含取代联苯的查尔酮，该查尔酮的化学结构如下式(I)所示，
式(I)中，R1是甲氧基、N-乙酰基乙二胺基、哌嗪基、乙酰哌嗪基、乙基哌嗪基、异丙基哌嗪基、环丙基哌嗪基、1-叔丁氧羰基-2-甲基哌嗪基、环丙基甲基哌嗪基或1-(3-硝基苯基)哌嗪基，R2是氢、氟或甲基，R3为氢或1，4-二氧六环基。
2.根据权利要求1所述的一种含取代联苯的查尔酮，其特征在于所述的查尔酮为下述化合物中的一种：
R1是甲氧基，R2是甲基，R3为氢，所述查尔酮的化学结构为
R1是乙酰哌嗪基，R2是甲基，R3为1，4-二氧六环基，所述查尔酮的化学结构为
R1是乙酰哌嗪基，R2是氟，R3为氢，所述查尔酮的化学结构为
R1是N-乙酰基乙二胺基，R2是甲基，R3为氢，所述查尔酮的化学结构为
R1是1-叔丁氧羰基-2-甲基哌嗪基，R2是甲基，R3为氢，所述查尔酮的化学结构为
R1是异丙基哌嗪基，R2是甲基，R3为氢，其结构为
R1是环丙基甲基哌嗪基，R2是甲基，R3为氢，所述查尔酮的化学结构为
R1是乙基哌嗪基，R2是甲基，R3为氢，所述查尔酮的化学结构为
R1是乙酰哌嗪基，R2是甲基，R3为氢，所述查尔酮的化学结构为
R1是哌嗪基，R2是甲基，R3为氢，所述查尔酮的化学结构为
R1是乙酰哌嗪基，R2是氢，R3为氢，所述查尔酮的化学结构为
R1是1-(3-硝基苯基)哌嗪基，R2是甲基，R3为1，4-二氧六环基，所述查尔酮的化学结构为
R1是环丙基哌嗪基，R2是甲基，R3为氢，所述查尔酮的化学结构为
3.权利要求1或者2所述的查尔酮在制备抑制PD1/PD-L1抑制剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的PD1/PD-L1抑制剂由权利要求1所述的查尔酮和医学上可接受的辅料组成。
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