DE69133324T2 - Pharmazeutische Zusammensetzungen mit kontinuierlicher Abgabe, die mit wasserlöslichen Polymeren kovalent gebundene Polypeptide enthalten - Google Patents

Pharmazeutische Zusammensetzungen mit kontinuierlicher Abgabe, die mit wasserlöslichen Polymeren kovalent gebundene Polypeptide enthalten Download PDF

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Description

  • Die folgende Erfindung betrifft pharmazeutische Zusammensetzungen physiologisch aktiver Polypeptide, die für die kontinuierliche Freisetzung des Polypeptids über einen verlängerten Zeitraum sorgen, wenn die Zusammensetzung in eine wäßrige, quasi physiologische Umgebung (wie sie im folgenden definiert wird) gebracht wird.
  • Hintergrund
  • Es besteht seit langem die Ansicht, daß die kontinuierliche Freisetzung bestimmter Arzneistoffe über einen verlängerten Zeitraum nach einer einzigen Verabreichung signifikante praktische Vorteile in der klinischen Praxis aufweisen könnte, und es wurden bereits Zusammensetzungen entwickelt, um für eine verlängerte Freisetzung einer Reihe klinisch geeigneter Arzneistoffe nach oraler Dosierung (siehe z. B. Remington's Pharmaceutical Sciences, veröffentlicht von Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, USA, 15. Auflage, 1975, Seiten 1618–1631), nach parenteraler Verabreichung (ibidem, Seiten 1631–1643) sowie nach topischer Verabreichung (siehe z. B. GB-Patent Nr. 1,351,409) zu sorgen. Ein geeignetes Verfahren zur parenteralen Verabreichung besteht in der subdermalen Injektion oder Implantation eines festen Körpers, z. B. eines Pellets oder eines Films, der den Arzneistoff enthält, und es wurden bereits verschiedene solcher implantierbaren Vorrichtungen beschrieben. Insbesondere ist bekannt, daß sich geeignete implantierbare Vorrichtungen oder injizierbare Mikropartikelsuspensionen zur Bereitstellung einer verlängerten Arzneistoffreisetzung für zahlreiche Arzneistoffe erhalten lassen, indem der Arzneistoff in ein biologisch abbaubares Polymer eingeschlossen oder in einer Matrix eines solchen Polymers dispergiert wird, so daß der Arzneistoff mit fortschreitendem Abbau der Polymermatrix freigesetzt wird.
  • Zu den allgemein bekannten, für die Verwendung in Formulierungen zur anhaltenden Freisetzung (sustained release) geeigneten biologisch abbaubaren Polymeren gehören Polyester, die durch Hydrolyse nach und nach abgebaut werden, wenn sie in eine wäßrige, quasi physiologische Umgebung gebracht werden. Besondere Polyester, die dabei zur Anwendung kamen, sind diejenigen, die sich aus Hydroxycarbonsäuren herleiten, und ein Großteil der vorhandenen Technik richtete sich auf von Alpha-Hydroxycarbonsäuren, vor allem Milchsäure sowohl in den racemischen als auch optisch aktiven Formen und Glykolsäure sowie Copolymeren davon, abgeleitete Polymere – siehe z. B., US-Patente Nr. 3,773,919 und 3,887,699; Jackanicz et al., Contraception, 1973, 8, 227–234; Anderson et al., ibidem, 1976, 11, 375–384; Wise et al., Life Sciences, 1976, 19, 867–874; Woodland et al., Journal of Medicinal Chemistry, 1973, 16, 897–901; Yolles et al., Bulletin of the Parenteral Drug Association, 1976, 30, 306–312; Wise et al., Journal of Pharmacy and Pharmacology, 1978, 30, 686–689 und 1979, 31, 201–204.
  • Es versteht sich, daß die „anhaltende" oder „verlängerte" Freisetzung eines Arzneistoffs entweder in kontinuierlicher oder diskontinuierlicher Weise erfolgen kann. So geht beispielsweise der Freisetzung eines Polypeptids aus einem Polylactidpolymer, wie sie in der GB-Patentschrift Nr. 1,325,209 beschrieben ist, häufig eine signifikante Induktionsphase voraus, während der kein Polypeptid freigesetzt wird, bzw. die Freisetzung ist zweiphasig und besteht aus einer ersten Phase, in deren Verlauf etwas Polypeptid freigesetzt wird, einer zweiten Phase, in deren Verlauf wenig oder gar kein Polypeptid freigesetzt wird, sowie einer dritten Phase, in deren Verlauf der größte Teil des verbliebenen Polypeptids freigesetzt wird. Im Gegensatz dazu besteht eine Aufgabe der folgenden Erfindung darin, Zusammensetzungen von Polypeptiden bereitzustellen, aus denen, möglicherweise mit Ausnahme eines relativ kurzen Induktionszeitraums zu Beginn, das Polypeptid kontinuierlich freigesetzt wird, wobei keine Zeiträume auftreten, in denen wenig oder gar kein Polypeptid freigesetzt wird. Die Wörter „kontinuierliche Freisetzung" werden in dieser Beschreibung lediglich dazu verwendet, einen im wesentlichen einphasigen Freisetzungsverlauf zu beschreiben, der zwar einen Wendepunkt aufweisen kann, aber mit Sicherheit keine „Plateau"-Phase besitzt, wenn man die kumulative Arzneistoffreisetzung in Abhängigkeit von der Zeit aufträgt.
  • In unserem europäischen Patent Nr. 58,481 werden pharmazeutische Zusammensetzungen mit kontinuierlicher Freisetzung beschrieben, mit denen man eine im wesentlichen einphasige Freisetzung säurestabiler Polypeptide erreichen kann. Diese Zusammensetzungen umfassen im allgemeinen ein Polylactid, bei dem es sich um ein nur aus Milchsäure aufgebautes Polymer handelt, ein Copolymer aus Milch- und Glykolsäure, ein Gemisch aus solchen Polymeren, ein Gemisch aus solchen Copolymeren oder ein Gemisch aus solchen Polymeren und Copolymeren sowie ein säurestabiles (wie nachfolgend definiert) Polypeptid, das unter den in der Zusammensetzung während des vorgesehenen Verwendungszeitraums angetroffenen Bedingungen nicht signifikant hydrolysiert wird, wobei die Zusammensetzung, wenn sie in eine wäßrige, quasi physiologische Umgebung (wie nachfolgend definiert) gebracht wird, das Polypeptid in kontinuierlicher Weise an die wäßrige, quasi physiologische Umgebung abgibt, wobei man einen über einen Zeitraum von wenigstens einer Woche im wesentlichen einphasigen Freisetzungsverlauf erhält, der zwar einen Wendepunkt aufweisen kann, doch mit Sicherheit keine „Plateau"-Phase besitzt.
  • Wie oben angegeben, betrifft die europäische Patentveröffentlichung Nr. 58,481 Formulierungen von Polypeptiden, die unter den innerhalb der beanspruchten Formulierung angetroffenen Bedingungen stabil sind. Gewisse Polypeptide, wie etwa nativer [Met–1] menschlicher G-CSF, sind jedoch von Natur aus unter solchen Bedingungen instabil und von einer Reihe von Instabilitätsproblemen, einschließlich u. a. der Tendenz zur Aggregatbildung, betroffen. Der vorliegenden Erfindung liegt die Entdeckung zugrunde, daß durch Konjugation mit einem wasserlöslichen Polymer Instabilitätsprobleme überwunden oder wenigstens gemildert werden können, die in gewissen Polypeptiden auftreten, die ansonsten unter den innerhalb des Depots angetroffenen Bedingungen nicht stabil und daher nicht zu einer ausreichenden Freisetzung in der Lage wären. Der vorliegenden Erfindung liegt ebenfalls die Entdeckung zugrunde, daß die Verwendung einer physiologisch aktiven Substanz, bei der ein physiologisch aktives Polypeptid kovalent mit einem wasserlöslichen Polymer konjugiert wird, den Freisetzungsverlauf gegenüber dem entsprechenden nichtkonjugierten Polypeptid in pharmazeutischen Zusammensetzungen mit kontinuierlicher Freisetzung verbessert.
  • Kürzlich wurde von M. S. Hora et al. in Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 16, (1989) Nr. 268, Seiten 509–510, die Entwicklung einer Interleukin-2-Mikrokügelchenformulierung mit kontrollierter Freisetzung veröffentlicht. Dabei wird von M. S. Hora et al. demonstriert, daß man ein dreiphasiges Freisetzungsmuster erhält, wenn pegyliertes Interleukin-2 (mit Polyethylenglukol (PEG) kovalent konjugiertes IL-2, im folgenden mit PEG IL-2 bezeichnet) in Gegenwart von fötalem Kälberserum aus Poly (DL-Lactid-Coglycolid)-Mikrokügelchen freigesetzt wird, und daß weiterhin eine 5- bis 15-tägige Verzögerungs- bzw. Induktionsphase angetroffen wird.
  • M. S. Hora et al. versuchen, die identifizierten Probleme mit dem Versuch zu überwinden, die Benetzung und Resolubilisierung des PEG IL-2 durch Verwendung von Humanserumalbumin (HSA) zu verbessern. Durch diesen Versuch wird jedoch ein weiteres Problem eingeführt, nämlich die Anwesenheit von solubilisierendem Protein. Die Anwesenheit eines solchen Proteins bei einer pharmazeutischen Formulierung ist nachteilig, weil dadurch u. a. die Gefahr einer negativen Nebenreaktion verstärkt und die analytische Genauigkeit eingeschränkt wird.
  • Weiterhin werden in der oben bezeichneten Veröffentlichung von M. S. Hora et al. weder die Löslichkeitseigenschaften des Poly-(D1-Lactid-Coglycolid)-Polymers (insbesondere, ob das Polymer in Benzol löslich oder unlöslich ist) noch die Polydispersität (wie nachfolgend definiert) definiert. Ohne Vorliegen dieser Fakten sowie des Herstellungsverfahrens konnten die Arbeiten nicht wiederholt werden, und die Veröffentlichung ist somit nicht hilfreich. Es wird weiterhin angemerkt, daß in der Veröffentlichung darüber hinaus weder das Molekulargewicht des Polyethylenglykols (PEG) noch das Niveau der Pegylierung angegeben werden, wobei diese beiden Faktoren notwendig sind, falls die veröffentlichten Arbeiten wiederholt werden sollen.
  • Im Hinblick auf die von M. S. Hora et al. mit pegyliertem IL-2 erhaltenen schlechten Ergebnisse für die kontinuierliche Freisetzung ist es besonders überraschend, daß gemäß der vorliegenden Erfindung durch die Verwendung von mit einem wasserlöslichen Polymer kovalent konjugierten physiologisch aktiven Polypeptiden solch ein guter Freisetzungsverlauf erzielbar sein sollte.
  • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Somit wird gemäß einem Merkmal der folgenden Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung zur kontinuierlichen Freisetzung einer säurestabilen physiologisch aktiven Substanz aus dem Material der Zusammensetzung in eine wäßrige, quasi physiologische Umgebung bereitgestellt, wobei es sich bei der Substanz um ein Polypeptid mit wenigstens einer der biologischen Eigenschaften von natürlich vorkommenden G-CSF handelt, wobei die Substanz kovalent an ein wasserlösliches Polymer konjugiert ist und das Material der Zusammensetzung
    • (a) ein aus amphipathischen Blockcopolymeren gebildetes biologisch abbaubares Hydrogel; oder
    • (b) ein Polylactid; oder
    • (c) ein Gemisch aus Polylactiden und derartigen Hydrogelen umfaßt,

    wobei keine signifikante Hydrolyse der Substanz unter den während des vorgesehenen Anwendungszeitraums innerhalb der Zusammensetzung angetroffenen Bedingungen stattfindet, wobei die Zusammensetzung
    • i) bei Plazierung in einer wäßrigen, quasi physiologischen Umgebung das Polypeptid kontinuierlich an die wäßrige, quasi physiologische Umgebung abgibt, was zu einem über einen Zeitraum von wenigstens einer Woche im wesentlichen einphasigen Freisetzungsverlauf führt;
    • ii) zwei aufeinanderfolgende Phasen der Polypeptidfreisetzung zeigt, wobei die Freisetzung in der ersten Phase durch Diffusion von der Oberfläche und in der zweiten Phase als Folge des Abbaus von Material der Zusammensetzung erfolgt, dadurch gekennzeichnet, daß die Diffusionsphase und die abbauinduzierte Phase sich zeitlich überschneiden und die Polypeptidfreisetzung über einen Zeitraum von wenigstens einer Woche stattfindet; oder
    • iii) kontinuierlich Wasser aufnimmt, was zu einem im wesentlichen einphasigen Wasseraufnahmeverlauf führt, bis über einen Zeitraum von wenigstens einer Woche das Material der Zusammensetzung abgebaut und das Polypeptid im wesentlichen vollständig an die wäßrige, quasi physiologische Umgebung abgegeben worden ist.
  • Vorzugsweise handelt es sich bei der pharmazeutischen Zusammensetzung um eine Zusammensetzung, bei der ein Molekül physiologisch aktive Substanz wenigstens ein Molekül wasserlösliches Polymer pro 3000–8000 Da Polypeptid-Molekulargewicht umfaßt.
  • Besonders bevorzugt handelt es sich bei der pharmazeutischen Zusammensetzung um eine Zusammensetzung, bei der es sich bei dem Polypeptid um ein Derivat von natürlich vorkommendem G-CSF mit wenigstens einer der biologischen Eigenschaften von natürlich vorkommendem G-CSP und einer Lösungsstabilität von mindestens 35% bei 5 mg/ml handelt, wobei in dem Derivat wenigstens Cys17 der nativen Sequenz durch einen Ser17-Rest und Asp27 der nativen Sequenz durch einen Ser27-Rest ersetzt ist.
  • Besonders bevorzugt handelt es sich bei der pharmazeutischen Zusammensetzung um eine Zusammensetzung, bei der das Polypeptid wenigstens eine weitere Modifikation, ausgewählt aus:
    • a) Glu11 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Arg11-Rest;
    • b) Leu15 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Glu15-Rest;
    • c) Lys23 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Arg33-Rest;
    • d) Gly26 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Ala26-Rest;
    • e) Gly28 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Ala28-Rest;
    • f) Ala30 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Lys30 oder Arg30-Rest;
    • g) Lys34 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Arg34-Rest;
    • h) Lys40 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Arg40-Rest;
    • i) Pro44 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Ala44-Rest;
    • j) Leu49 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Lys49-Rest;
    • k) Gly51 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Ala51-Rest;
    • l) Gly55 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Ala55-Rest;
    • m) Trp58 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Lys58-Rest;
    • n) Pro60 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Ser60-Rest;
    • o) Pro65 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Ser65-Rest;
    • p) Pro111 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Glu111-Rest;
    • q) Thr115 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Ser115-Rest;
    • r) Thr116 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Ser116-Rest; und
    • s) Tyr165 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Arg163-Rest, umfaßt.
  • Besonders bevorzugt handelt es sich bei der pharmazeutischen Zusammensetzung um eine Zusammensetzung, bei der das Polypeptid ausgewählt ist aus:
    • i) humanem [Arg11, Ser17,27,60,65]-G-CSF,
    • ii) humanem [Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Lys30]-G-CSF,
    • iii) humanem [Arg11, Glu15, Ser17,27,60,65, Ala26,28, Lys30]-G-CSF,
    • iv) humanem [Arg11,40, Ser17,27,60,65]-G-CSF,
    • v) humanem [Arg11,23, Ser17,27,60,65]-G-CSF,
    • vi) humanem [Arg11,165 Glu15, Ser17,27,60,65, Ala26,28 Lys30,58]-G-CSF,
    • vii) humanem [Arg11, Glu15,111, Ser17,27,60,65,115,116, Ala26,28, Lys30]-G-CSF,
    • viii) humanem [Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Arg30]-G-CSF, und
    • ix) humanem [Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5,11, Ser17,27,60,65]-G-CSF,
    • x) humanem [Ser17,27,60,65]-G-CSF,
    • xi) humanem [Arg11, Ser17,27,65]-G-CSF, und
    • xii) humanen [Ser17,27,65]-G-CSF.
  • Eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung ist eine Zusammensetzung, bei der es sich bei dem Polypeptid um G-CSF handelt.
  • Eine bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung ist eine Zusammensetzung, bei der das wasserlösliche Polymer ausgewählt ist aus einem Polyethylenglykol- oder Polypropylenglykol-Homopolymer, einem polyoxyethylierten Polyol oder einem Polyvinylalkohol, wobei das Homopolymer gegebenenfalls an einem Ende mit einer Alkylgruppe substituiert ist.
  • Eine besonders bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung ist eine Zusammensetzung, bei der das wasserlösliche Polymer ausgewählt ist aus unsubstituiertem Polyethylenglykol, Monomethylpolyethylenglykol und polyoxyethyliertem Glycerin.
  • Eine besonders bevorzugte pharmazeutische Zusammen setzung ist eine Zusammensetzung, bei der das wasserlösliche Polymer ein Molekulargewicht von 1000 bis 15000 besitzt.
  • Eine besonders bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzung ist eine Zusammensetzung, bei der es sich bei der physiologisch aktiven Substanz um humanen [Arg11, Ser17,27,60,65]-G-CSF, dessen Sequenz mit oder ohne vorgeschaltetes Methionin vorliegen kann und der an Monomethylpolyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 2000–5000 konjugiert ist, handelt.
  • Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt umfaßt ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wie sie hierin definiert ist, bei dem das Material der Zusammensetzung und die physiologisch aktive Substanz in einem organischen Lösungsmittel dafür gelöst oder in einem organischen oder wäßrigen Medium gleichmäßig dispergiert werden und anschließendes Trocknen und Formulieren zu einer zur Implantation oder Injektion in einen tierischen Organismus geeigneten Zusammensetzung erfolgt.
  • Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung ist ein Verfahren, bei dem das Material der Zusammensetzung Polylactid enthält, wobei in dem Verfahren die physiologisch aktive Substanz in eine Matrix, bestehend aus einem Polylactid, das wenigstens 25 Mol-% Milchsäureeinheiten und bis zu 75 Mol-% Glykolsäureeinheiten aufweist, eingebaut wird und weiterhin die physiologisch aktive Substanz und das Material der Zusammensetzung durch Schmelzverarbeitung eines innigen Feststoffgemischs aus dem Material der Zusammensetzung und der Substanz gleichmäßig miteinander vermischt werden.
  • Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt umfaßt die Verwendung einer physiologisch aktiven Substanz, die ein kovalent mit einem wasserlöslichen Polymer konjugiertes Polypeptid umfaßt, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wie sie hierin definiert ist.
  • Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt umfaßt eine säurestabile physiologisch aktive Substanz, bei der es sich um ein Derivat von G-CSF mit wenigstens einer der biologischen Eigenschaften von natürlich vorkommendem G-CSF und einer Lösungsstabilität von mindestens 35% bei 5 mg/ml handelt, wobei in dem Derivat wenigstens Cys17 der nativen Sequenz durch einen Ser17-Rest und Asp27 der nativen Sequenz durch einen Ser27-Rest ersetzt ist und das Derivat weiterhin kovalent an ein wasserlösliches Polymer konjugiert ist.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur kontinuierlichen Freisetzung einer säurestabilen physiologisch aktiven Substanz aus dem Material der Zusammensetzung in eine wäßrige, quasi physiologische Umgebung, wobei es sich bei der Substanz um ein Polypeptid mit wenigstens einer der biologischen Eigenschaften von natürlich vorkommendem G-CSF handelt, wobei die Substanz kovalent an ein wasserlösliches Polymer konjugiert ist und das Material der Zusammensetzung
    • (a) ein aus amphipathischen Blockcopolymeren gebildetes biologisch abbaubares Hydrogel; oder
    • (b) ein Polylactid,

    wobei keine signifikante Hydrolyse der Substanz unter den während des vorgesehenen Anwendungszeitraums innerhalb der Zusammensetzung angetroffenen Bedingungen stattfindet, wobei die Zusammensetzung
    • i) bei Plazierung in einer wäßrigen, quasi physiologischen Umgebung das Polypeptid kontinuierlich an die wäßrige, quasi physiologische Umgebung abgibt, was zu einem über einen Zeitraum von wenigstens einer Woche im wesentlichen einphasigen Freisetzungsverlauf führt;
    • ii) zwei aufeinanderfolgende Phasen der Polypeptidfreisetzung zeigt, wobei die Freisetzung in der ersten Phase durch Diffusion von der Oberfläche und in der zweiten Phase als Folge des Abbaus von Material der Zusammensetzung erfolgt, dadurch gekennzeichnet, daß die Diffusionsphase und die abbauinduzierte Phase sich zeitlich überschneiden und die Polypeptidfreisetzung über einen Zeitraum von wenigstens einer Woche stattfindet; oder
    • iii) kontinuierlich Wasser aufnimmt, was zu einem im wesentlichen einphasigen Wasseraufnahmeverlauf führt, bis über einen Zeitraum von wenigstens einer Woche das Material der Zusammensetzung abgebaut und das Polypeptid im wesentlichen vollständig an die wäßrige, quasi physiologische Umgebung abgegeben worden ist;

    wobei in dem Verfahren das Material der Zusammensetzung und die physiologisch aktive Substanz in einem organischen Lösungsmittel dafür gelöst oder in einem organischen oder wäßrigen Medium gleichmäßig dispergiert werden und anschließendes Trocknen und Formulieren zu einer zur Implantation oder Injektion in einen tierischen Organismus geeigneten Zusammensetzung erfolgt.
  • Vorzugsweise handelt es sich bei dem Verfahren um ein Verfahren, bei dem das Material der Zusammensetzung und die physiologisch aktive Substanz in einem wäßrigen Medium gleichmäßig dispergiert werden.
  • Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Verfahren um ein Verfahren, bei dem das Material der Zusammensetzung ein Polylactid umfaßt.
  • Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Verfahren um ein Verfahren, bei dem das Polylactid wenigstens 25 Mol-% Milchsäureeinheiten und bis zu 75 Mol-% Glykolsäureeinheiten umfaßt.
  • Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Verfahren um ein Verfahren, bei dem das Polylactid wenigstens 40 Mol-% Milchsäureeinheiten umfaßt.
  • Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Verfahren um ein Verfahren, bei dem die Milchsäureeinheiten und/oder Glykolsäureeinheiten in Form von Blöcken mit durchschnittlich wenigstens zwei identischen Monomereinheiten vorliegen.
  • Besonders bevorzugt handelt es sich bei dem Verfahren um ein Verfahren, bei dem das Polylactid entweder in Benzol löslich ist und eine inhärente Viskosität (1 g/100 ml Lösung in Benzol) von weniger als 0,3 aufweist oder nicht in Benzol löslich ist und eine inhärente Viskosität (1 g/100 ml Lösung in Chloroform oder Dioxan) von weniger als 4 aufweist.
  • Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt umfaßt ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur kontinuierlichen Freisetzung einer säurestabilen physiologisch aktiven Substanz aus dem Material der Zusammensetzung in eine wäßrige, quasi physiologische Umgebung, wobei es sich bei der Substanz um ein Polypeptid mit wenigstens einer der biologischen Eigenschaften von natürlich vorkommendem G-CSF handelt, wobei die Substanz kovalent an ein wasserlösliches Polymer konjugiert ist und das Material der Zusammensetzung
    • (a) ein aus amphipathischen Blockcopolymeren gebildetes biologisch abbaubares Hydrogel; oder
    • (b) ein Polylactid; oder
    • (c) ein Gemisch aus Polylactiden und derartigen Hydrogelen umfaßt,

    wobei keine signifikante Hydrolyse der Substanz unter den während des vorgesehenen Anwendungszeitraums innerhalb der Zusammensetzung angetroffenen Bedingungen stattfindet, wobei die Zusammensetzung
    • i) bei Plazierung in einer wäßrigen, quasi physiologischen Umgebung das Polypeptid kontinuierlich an die wäßrige, quasi physiologische Umgebung abgibt, was zu einem über einen Zeitraum von wenigstens einer Woche im wesentlichen einphasigen Freisetzungsverlauf führt;
    • ii) zwei aufeinanderfolgende Phasen der Polypeptidfreisetzung zeigt, wobei die Freisetzung in der ersten Phase durch Diffusion von der Oberfläche und in der zweiten Phase als Folge des Abbaus von Material der Zusammensetzung erfolgt, dadurch gekennzeichnet, daß die Diffusionsphase und die abbauinduzierte Phase sich zeitlich überschneiden und die Polypeptidfreisetzung über einen Zeitraum von wenigstens einer Woche stattfindet; oder
    • iii) kontinuierlich Wasser aufnimmt, was zu einem im wesentlichen einphasigen Wasseraufnahmeverlauf führt, bis über einen Zeitraum von wenigstens einer Woche das Material der Zusammensetzung abgebaut und das Polypeptid im wesentlichen vollständig an die wäßrige, quasi physiologische Umgebung abgegeben worden ist,

    wobei in dem Verfahren die physiologisch aktive Substanz in eine Matrix, bestehend aus einem Polylactid, das wenigstens 25 Mol-% Milchsäureeinheiten und bis zu 75 Mol-% Glykolsäureeinheiten aufweist, eingebaut wird und weiterhin die physiologisch aktive Substanz und das Material der Zusammensetzung durch Schmelzverarbeitung eines innigen Feststoffgemischs aus dem Material der Zusammensetzung und der Substanz gleichmäßig miteinander vermischt werden.
  • Vorzugsweise handelt es sich bei dem Verfahren um ein Verfahren, bei dem es sich bei dem Polypeptid um ein Derivat von natürlich vorkommendem G-CSP mit wenigstens einer der biologischen Eigenschaften von natürlich vorkommendem G-CSF und einer Lösungsstabilität von mindestens 35% bei 5 mg/ml handelt, wobei in dem Derivat wenigstens Cys17 der nativen Sequenz durch einen Ser17-Rest und Asp27 der nativen Sequenz durch einen Ser27-Rest ersetzt ist.
  • Vorzugsweise handelt es sich bei dem Verfahren um ein Verfahren, bei dem es sich bei dem Polypeptid um G-CSF handelt.
  • Vorzugsweise handelt es sich bei dem beanspruchten Verfahren um ein Verfahren, bei dem das wasserlösliche Polymer ausgewählt ist aus einem Polyethylenglykol- oder Polypropylenglykol-Homopolymer, einem polyoxyethylierten Polyol oder einem Polyvinylalkohol, wobei das Homopolymer gegebenenfalls an einem Ende mit einer Alkylgruppe substituiert ist.
  • Vorzugsweise handelt es sich bei dem Verfahren um ein Verfahren, bei dem es sich bei der physiologisch aktiven Substanz um humanen [Arg11, Ser17,27,60,65]-G-CSF, dessen Sequenz mit oder ohne vorgeschaltetes Methionin vorliegen kann und der an Monomethylpolyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 2000 – 5000 konjugiert ist, handelt.
  • Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt umfaßt die Verwendung einer physiologisch aktiven Substanz, die ein kovalent an ein wasserlösliches Polymer konjugiertes Polypeptid umfaßt, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wie sie hierin definiert ist.
  • Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt umfaßt eine säurestabile physiologisch aktive Substanz, bei der es sich um ein Derivat von G-CSF mit wenigstens einer der biologischen Eigenschaften von natürlich vorkommendem G-CSF und einer Lösungsstabilität von mindestens 35% bei 5 mg/ml handelt, wobei in dem Derivat wenigstens Cys17 der nativen Sequenz durch einen Ser17-Rest und Asp27 der nativen Sequenz durch einen Ser27-Rest ersetzt und das Derivat weiterhin kovalent an ein wasserlösliches Polymer konjugiert ist.
  • Gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, bei dem das Material der Zusammensetzung und die physiologisch aktive Substanz in einem organischen Lösungsmittel dafür gelöst oder in einem organischen oder wäßrigen Medium gleichmäßig dispergiert werden und anschließendes Trocknen und Formulieren zu einer zur Implantation oder Injektion in einen tierischen Organismus geeigneten Zusammensetzung erfolgt.
  • Vorteilhafterweise kann eine derartige Zusammensetzung z. B. durch Formulierung in eine zur Implantation geeignete feste Form, zweckmäßigerweise ein festes zylindrisches Depot, oder in eine zur Injektion geeignete multipartikuläre Form, beispielsweise durch Zerkleinern oder Mikronisierung, hergestellt werden. Die multipartikuläre Form kann in eine zur Injektion geeeignete Lösung oder Emulsion formuliert werden. Die Formulierung kann beispielsweise in einem wäßrigen Medium oder in einem Öl, wie z. B. Erdnußöl, oder Cremophor durchgeführt werden (siehe auch Martindale „The Extra Pharmacopoeia" 28. Auflage, Seite 694). Zu den Vehikeln für die Injektion gehört Carboxymethylzellulose (siehe auch Martindale „The Extra Pharmacopoeia" 28. Auflage, Seite 947).
  • Soll eine Dispersion gebildet werden, so wird dabei vorzugsweise ein wäßriges Medium verwendet.
  • Das Verfahren läßt sich zur Herstellung einer Arzneistoffzuführvorrichtung in Form eines Stäbchens, Kügelchens, Films oder Pellets zur Implantation einsetzen. Bei dem Material der Zusammensetzung kann es sich beispielsweise um ein Polylactid (wie nachfolgend definiert) handeln, wobei es vorteilhafterweise wenigstens 25 Mol-%, vorzugsweise 40 Mol-%, Milchsäureeinheiten und bis zu 75 Mol-% Glykolsäureeinheiten, zweckmäßigerweise in Form von Blöcken mit durchschnittlich wenigstens zwei identischen Monomereinheiten, aufweisen kann. Dabei ist das Polylactid vorzugsweise entweder in Benzol löslich und weist eine inhärente Viskosität (1 g/100 ml Lösung in Benzol) von weniger als 0,3 auf, oder es ist nicht in Benzol löslich und weist eine inhärente Viskosität (1 g/100 ml Lösung in Chloroform oder Dioxan) von weniger als 4 auf.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise unter Verwendung eines zur Gefriertrocknung geeigneten üblichen Lösungsmittels, wie z. B. Essigsäure (vorzugsweise Eisessig), mit anschließendem Frieren und darauffolgendem Gefriertrocknen durchgeführt. Dabei kann es zweckmäßig sein, eine erste. Lösung des Materials der Zusammensetzung in einem organischen Lösungsmittel dafür und eine zweite Lösung der physiologisch aktiven Substanz in einem organischen Lösungsmittel dafür herzustellen und dann die beiden Lösungen zu mischen. Bei dem dabei eingesetzten organischen Lösungsmittel handelt es sich vorzugsweise um ein für die erste und zweite Lösung übliches Lösungsmittel, das sich vorteilhafterweise zur Gefriertrocknung eignet. Dieses Verfahren ist im europäischen Patent Nr. 58,481 dargestellt. Falls gewünscht, kann die Verarbeitung jedoch über Schmelzverarbeitung eines innigen Feststoffgemischs aus dem Material der Zusammensetzung und der physiologisch aktiven Substanz durchgeführt werden.
  • Gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung bereitgestellt, wobei das Material der Zusammensetzung Polylactid (wie nachfolgend definiert), das in Form eines Hydrogels vorliegen kann, umfaßt, wobei in dem Verfahren die physiologisch aktive Substanz in eine Matrix, bestehend aus einem Polylactid, das wenigstens 25 Mol-% Milchsäureeinheiten, vorzugsweise 40 Mol-% Milchsäureeinheiten, und bis zu 75 Mol-% Glykolsäureeinheiten aufweist, eingebaut wird und weiterhin die physiologisch aktive Substanz und das Material der Zusammensetzung durch Schmelzverarbeitung eines innigen Feststoffgemischs aus dem Material der Zusammensetzung und der Substanz gleichmäßig miteinander vermischt werden.
  • Gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer physiologisch aktiven Substanz, die ein kovalent an ein wasserlösliches Polymer konjugiertes Polypeptid umfaßt, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung bereitgestellt.
  • Allgemeine Beschreibung
  • A. Physiologisch aktive Substanz
  • Im allgemeinen gilt, daß die Anzahl an mit dem Polypeptid zu konjugierenden Molekülen des wasserlöslichen Polymers um so größer sein sollte, je höher das Molekulargewicht des Polypeptids ist, um für einen optimalen Freisetzungsverlauf zu sorgen. Vorzugsweise wird wenigstens ein Molekül wasserlösliches Polymer an ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von bis zu 8000 Da konjugiert, wobei mindestens ein Molekül wasserlösliches Polymer pro 3000 –8000 Da, vor allem 4000–6500 Da, Polypeptid-Molekulargewicht eingesetzt wird. Dabei kann ein Molekül Polypeptid so viele Moleküle wasserlösliches Polymer tragen, wie sich mit der Beibehaltung des gewünschten Niveaus an biologischer Aktivität vereinbaren läßt. Tatsächlich wird vorbehaltlich dieser Einschränkung das Polypeptid vorteilhafterweise mit der maximalen Anzahl an wasserlöslichen Molekülen konjugiert. Es versteht sich, daß bei Vorhandensein mehrerer Stellen zur Konjugation wasserlöslicher Polymere auf einem gegebenen Polypeptid die maximale Konjugation zu einem heterogenen Gemisch an Produkten führen kann. So ist beispielsweise bei einem Polypeptid mit 4 Konjugationsstellen für wasserlösliche Moleküle das erzielte Maximalverhältnis von Polypeptid zu wasserlöslichem Polymer möglicherweise nicht größer als z. B. 3,9.
  • A.1. Polypeptid
  • Die in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendete physiologisch aktive Substanz kann beispielsweise ein Polypeptid mit wenigstens einer der biologischen Eigenschaften von natürlich vorkommendem G-CSF und geeigneterweise einem Teil oder der gesamten Aminosäuresequenz von natürlich vorkommendem G-CSF, das kovalent an ein wasserlösliches Polymer konjugiert ist, umfassen. Das Peptid trägt vorzugsweise keine freie Thiol-Gruppierung, womit in bezug auf Polypeptide mit wenigstens einer der biologischen Eigenschaften von natürlich vorkommendem G-CSF das Cystein an Position 17 vorzugsweise fehlt oder durch eine andere Aminosäure, wie z. B. Alanin oder vorzugsweise Serin ersetzt ist.
  • A.1.1 Polypeptide mit wenigstens einer der biologischen Eigenschaften von G-CSF
  • Falls gewünscht wird, ein Poylpeptid mit wenigstens einer der biologischen Eigenschaften von natürlich vorkommendem G-CSF zu verwenden, kann ein beliebiges Derivat mit einer solchen Eigenschaft eingesetzt werden, doch handelt es sich vorteilhafterweise bei dem verwendeten Polypeptid um ein G-CSF-Derivat unserer europäischen Patentanmeldung Nr. 91303868.3, in dem G-CSF-Derivate mit verbesserter Lösungsstabilität beschrieben werden. In unserer europäischen Patentanmeldung Nr. 91303868.3 werden Derivate von natürlich vorkommendem G-CSF beschrieben, die wenigstens eine der biologischen Eigenschaften von natürlich vorkommendem G-CSF aufweisen und eine Lösungsstabilität (wie hierin definiert) von mindestens 35% bei 5 mg/ml aufweisen, wobei in dem Derivat mindestens Cys17 der nativen Sequenz durch einen Ser17-Rest und Asp27 der nativen Sequenz durch einen Ser27-Rest ersetzt sind.
  • Vorzugsweise weisen die Derivate wenigstens eine weitere Modifikation, ausgewählt aus:
    • a) Glu11 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Arg11-Rest;
    • b) Leu15 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Glu15-Rest;
    • c) Lys23 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Arg23-Rest;
    • d) Gly26 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Ala26-Rest;
    • e) Gly28 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Ala28-Rest;
    • f) Ala30 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Lys30 oder Arg30-Rest;
    • g) Lys34 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Arg34-Rest;
    • h) Lys40 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Arg40-Rest;
    • i) Pro44 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Ala44-Rest;
    • j) Leu49 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Lys49-Rest;
    • k) Gly51 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Ala51-Rest;
    • l) Gly55 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Ala55-Rest;
    • m) Trp58 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Lys58-Rest;
    • n) Pro60 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Ser60-Rest;
    • o) Pro65 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Ser65-Rest;
    • p) Pro111 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Glu111-Rest;
    • q) Thr115 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Ser115-Rest;
    • r) Thr116 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Ser116-Rest; und
    • s) Tyr165 der nativen Sequenz, ersetzt durch einen Arg165-Rest, auf.
  • Das Vorhandensein wenigstens einer weiteren, aus (b) bis (s) ausgewählten Modifikation ist bevorzugt, wobei jedoch das Vorhandensein wenigstens einer weiteren, aus (b), (d), (e), (f), (n) und (o) ausgewählten Modifikation besonders bevorzugt ist, von denen die weitere Modifikation (o) ganz besonders bevorzugt ist.
  • Besonders bevorzugt besteht die weitere Modifikation aus wenigstens einer der folgenden Modifikationen:
    • i) Gln11, Pro60,65 der nativen Sequenz, ersetzt durch Arg11, Ser60,65
    • ii) Ala111, Thr115,116 der nativen Sequenz, ersetzt durch Glu111, Ser115,116;
    • iii) Gln11, Trp58, Tyr165 der nativen Sequenz, ersetzt durch Arg11,165, Lys58
    • iv) Leu15, Gly26,28, Ala30 der nativen Sequenz, ersetzt durch Glu15, Ala26,28, Lys30; oder
    • v) Pro44, Leu49, Gly51,55 Trp58 der nativen Sequenz, ersetzt durch Lys49,58, Ala44,51,55.
  • Die weitere Modifikation kann ebenfalls vorzugsweise aus wenigstens einer der folgenden Modifikationen bestehen:
    • vi) Leu15, Gly26,28, Ala30 der nativen Sequenz, ersetzt durch Glu15, Ala26,28, Arg30;
    • vii) Pro65 der nativen Sequenz, ersetzt durch Ser65;
    • viii) Pro60,65 der nativen Sequenz, ersetzt durch Ser60,65; oder
    • ix) Glu11, Pro65 der nativen Sequenz, ersetzt durch Arg11, Ser65.
  • Die oben erwähnten Modifikationen können daher gewünschtenfalls in ein beliebiges Polypeptid mit wenigstens einer der biologischen Eigenschaften von natürlich vorkommendem G-CSF eingeführt werden, um die Lösungsstabilität des Moleküls zu verbessern. Die oben angegebenen Modifikationen können somit auf solche Polypeptide angewendet werden, die sich in der Aminosäuresequenz von der hierin beschriebenen Sequenz für die natürlich vorkommenden G-CSFs hinsichtlich der Identität oder Lage eines oder mehrerer Reste unterscheiden (z. B. Substitutionen, terminale und interne Additionen sowie Deletionen). Zu solchen Polypeptiden könnten beispielsweise diejenigen gehören, die, z. B. durch Deletionen, verkürzt sind, oder diejenigen, die stabiler gegenüber Hydrolyse sind (und daher stärkere bzw. länger anhaltende Wirkungen haben als natürlich vorkommende), oder solche, die zur Deletion einer oder mehrerer potentieller Stellen für 0-Glykosylierung verändert worden sind (was zu höheren Aktivitäten bei von Hefe produzierten Produkten führen kann), oder solche, bei denen einer oder mehrere Cysteinreste deletiert oder, z. B. durch Alanin- oder Serinreste, ersetzt worden sind und die sich möglicherweise leichter in aktiver Form aus mikrobiellen Systemen isolieren lassen, oder solche, bei denen einer oder mehrere Tyrosinreste durch Phenylalanin ersetzt worden sind und die mehr oder weniger leicht an menschliche G-CSF-Rezeptoren auf Zielzellen binden können. Die vorgeschlagenen Modifikationen unserer oben angegebenen europäischen Patentanmeldung Nr. 91303868.3 können somit beispielsweise entweder auf nativen G-CSF, wobei Cys17 der nativen Sequenz durch Ser17 ersetzt wird, oder auf Allelvarianten und Analoge davon, von denen man weiß, daß sie wenigstens eine der biologischen Eigenschaften von natürlich vorkommendem G-CSF enthalten, wie z. B. die in der PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 87/01132, in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 243,153, in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 256,843, in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 277,603, in Biochemical und Biophysical Research Communications [1989] Bd. 159, Nr. 1, S. 103–111, Kuga T. et al. und im US-Patent Nr. 4,904,584 beschriebenen, angewendet werden.
  • Es stellte sich heraus, daß solche G-CSF-Derivate, die getestet wurden, gegenüber dem entsprechenden nichtmodifizierten Polypeptid eine verbesserte Lösungsstabilität bei entweder keinem signifikanten Unterschied in der biologischen Aktivität oder einer verbesserten biologischen Aktivität besitzen.
  • Zur Messung der Lösungsstabilität wird hier der Prozentanteil an in Lösung verbleibendem G-CSF-Derivat in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung nach 14 Tagen bei 37°C bei einer gegebenen Anfangskonzentration von 1 mg/ml, 5 mg/ml und/oder 10 mg/ml bestimmt. Die Messung der Lösungsstabilität- wird nachfolgend ausführlicher im Referenzbeispiel 26 beschrieben. In den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eingesetzte G-CSF-Derivate weisen zweckmäßigerweise eine Lösungsstabilität von wenigstens 35%, vorteilhafterweise wenigstens 50% und bevorzugt wenigstens 75% bei 5 mg/ml auf. Vorzugsweise weisen die Polypeptide der vorliegenden Erfindung bei 10 mg/ml eine Lösungsstabilität von wenigstens 75%, insbesondere wenigstens 85%, auf.
  • Vorteilhafterweise werden die in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung eingesetzten G-CSF-Derivate so ausgewählt, daß sie eine der weiteren Modifikationen (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), (viii) oder (ix) wie vorstehend definiert besitzen, vorzugsweise eine der weiteren Modifikationen (i), (ii), (iv), (vi), (vii), (viii) oder (ix) und insbesondere die weitere Modifikation (ii), (iv), (vi), (vii), (viii) oder (ix).
  • Zu den besonders bevorzugten Derivaten zur Verwendung in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung gehören aufgrund ihrer guten Lösungsstabilität
    [Arg11, Ser17,27,60,65]-G-CSF;
    [Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Lys30]-G-CSF;
    [Arg11, Glu15, Ser17,27,60,65, Ala26,28, Ala26,28, Lys30]-G-CSF;
    [Arg11,23, Ser17,27,60,65]-G-CSF;
    [Arg11,34, Ser17,27,60,65]-G-CSF;
    [Arg11,40, Ser17,27,60,65]-G-CSF;
    [Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5,11, Ser17,27,60,65]-G-CSF;
    [Arg11, Glu15,111, Ser17,27,60,65,115,116, Ala26,28, Lys30]-G-CSF;
    [Arg11,165, Glu15, Ser17,27,60,65, Ala26,28, Lys30,58]-G-CSF;
    [Arg11, Glu15, Ser17,27,60,65, Ala26,28,44,51,55, Lys30,49,58]-G-CSF;
    [Arg11,165, Glu15,111, Ser17,27,60,65,115,116, Ala26,28,44,51,55, LyS30,49,58]-G-CSF;
    [Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Arg30]hu-G-CSF;
  • Zu ganz besonders bevorzugten G-CSF-Derivaten zur Verwendung in den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen gehören aufgrund ihrer außerordentlichen Lösungsstabilität sowie guten spezifischen Aktivität:
    • i) [Arg11, Ser17,27,60,65]-G-CSF,
    • ii) [Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Lys30]-G-CSF,
    • iii) [Arg11, Glu15, Ser17,27,60,65, Ala26,28, Lys30]-G-CSF,
    • iv) [Arg11,40, Ser17,27,60,65]-G-CSF,
    • v) [Arg11,23, Ser17,27,60,65]-G-CSF,
    • vi) [Arg11,165, Glu15, Ser17,27,60,65, Ala26,28, Lys30,58]-G-CSF,
    • vii) [Arg11, Glu15,111, Ser17,27,60,65,115,116, Ala26,28, Lys30]-G-CSF,
    • viii) [Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Arg30]-G-CSF, und
    • ix) [Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5,11, Ser17,27,60,65]-G-CSF,
    • x) [Ser17,27,60,65]-G-CSF,
    • xi) [Arg11, Ser17,27,65]-G-CSF, und
    • xii) [Ser17,27,65]-G-CSF,

    von denen (i), (ii), (iii), (vi), (vii), (viii), (x), (xi) und (xii) am meisten bevorzugt sind.
  • Diese letzteren menschlichen G-CSF-Derivate zeigen nicht nur außerordentliche Lösungsstabilitätseigenschaften, sondern besitzen ebenfalls eine gegenüber natürlich vorkommendem menschlichen G-CSF verbesserte spezifische Aktivität.
  • Ein Präsequenz-Methionin kann in den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung entweder vorhanden oder nicht vorhanden sein, ist jedoch zweckmäßigerweise vorhanden.
  • In bezug auf die Herstellung von G-CSF-Derivaten zur Verwendung in den pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung stellte sich der Einsatz eines auf pAT153 beruhenden Produktionsvektors als vorteilhaft heraus, wobei dieser Vektor folgendes umfaßt:
    • i) einen Promotor und gegebenenfalls einen Operator dafür, z. B. einen trp-Promotor oder einen T7A3-Promotor. Bei dem T7A3-Promotor handelt es sich um den A3-Promotor des Bakteriophagen T7 [siehe Dunn J. J. und Studier F. W. J. Mol. Biol. 166, 477–535 (1983)]. In dieser Literaturstelle sind die komplette Nukleotidsequenz des Bakteriophagen T7-DNA sowie die Orte der genetischen T7-Elemente aufgeführt;
    • ii) eine ribosomale Bindungsstellensequenz, z. B. die Sequenz einer ribosomalen trp-leader-Bindungsstelle;
    • iii) eine Klonierungsstelle für das zu exprimierende Gen;
    • iv) eine T4-Transkriptionsterminationssequenz (siehe SEQ ID Nr. 51 und 4);
    • v) eine cer-Sequenz (Sommers D. et al. MGG, 201, S. 334–338, 1985);
    • vi) ein Tetracyclin-Repressorgen (Tet R);
    • vii) ein Tetracyclin-Resistenzgen (Tet A);
    • viii) mehrere Restriktionsenzym-Erkennungssequenzen.
  • In SEQ ID Nr. 47 ist eine Sequenz aufgeführt, die eine EcoR1-Restriktionsendonukleasestelle (Nucleotide 1–6), die A3-Promotorsequenz (Nucleotide 7–52), die Sequenz der ribosomalen trp-leader-Bindungsstelle (Nucleotide 53–78) sowie das Translationsstartcodon (Nucleotide 79– 81) enthält.
  • Vorteilhafterweise kann der zur Expression eines (wie vorstehend definierten) erfindungsgemäßen G-CSF-Derivats fähige Wirt in einem Wachstumsmedium kultiviert werden, wobei während der Kultivierung ein Hefeextrakt enthaltendes Supplement zu dem Wachstumsmedium gegeben wird. Dabei wird die Zugabe des Hefeextrakt enthaltenden Supplements vorzugsweise zu einem vorbestimmten Zeitpunkt nach Beginn der Kultivierung eingeleitet. Die Zugabe des Hefeextrakt enthaltenden Supplements erfolgt vorzugsweise mit einer solchen Geschwindigkeit, daß das Wachstumsmedium nicht an Hefeextrakt verarmt. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn der Produktionsvektor mit einem T7A3-Promotor verwendet wird.
  • Es kann ebenfalls von Vorteil sein, einen Wirt zu kultivieren, der mit einem das für ein wie vorstehend definiertes G-CSF-Derivat codierende genetische Material tragenden rekombinanten Vektor in Gegenwart von Leucin und/oder Threonin in einer für eine verbesserte Akkumulierung des G-CSF-Derivats ausreichenden Menge transformiert wurde. Somit ist es besonders vorteilhaft, die Fermentation in Gegenwart von Leucin durchzuführen, wenn der Produktionsvektor mit dem trp-Promotor verwendet wird.
  • Die Reinigung des G-CSF-Derivats könnte wie in der PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 87/01132 beschrieben erfolgen, doch findet sich darin kein Hinweis auf die Entfernung von Detergenz, insbesondere N-Lauroylsarcosin in Salzform (z. B. Sarkosyl), aus den in dieser PCT-Veröffentlichung hergestellten G-CSF-Analogen. Die Entfernung von Detergenz wird vorzugsweise in Gegenwart einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung (pH 7,2–7,5) durchgeführt. Die phosphat- gepufferte Kochsalzlösung kann zweckmäßigerweise aus isotonischer Kochsalzlösung hergestellt werden und daher beispielsweise wie in Referenzbeispiel 3 beschrieben zusammengesetzt sein. Diesbezüglich wurde festgestellt, daß andere Puffer weniger bevorzugt waren, da entweder die Entfernung von Detergenz, insbesondere die Entfernung von N-Lauroylsarcosin (in Salzform), langsamer war oder dabei mehr Protein ausfiel. Bevorzugt ist weiterhin, die Entfernung von Detergenz mittels Diafiltration durchzuführen, da sich herausstellte, daß dies die Effizienz verbessert, ohne eine erhöhte Proteinpräzipitation hervorzurufen. So erwies sich beispielsweise die Diafiltration gegenüber der herkömmlichen Diffusionsdialyse als bevorzugt. Weiterhin wurde festgestellt, daß sich die Detergenzkonzentration, insbesondere die Konzentration von N-Lauroylsarcosin in Salzform (z. B. Sarkosyl), bei gleichbleibender Auflösung während der Chromatographie auf unter 1% verringern ließ. Eine Verringerung der ursprünglichen Detergenzkonzentration hilft bei der Entfernung von Detergenz, und somit ist die Verwendung der minimalen Konzentration an Detergenz, z. B. N-Lauroylsarcosin (in Salzform, z. B. Sarkosyl), in Übereinstimmung mit der Beibehaltung der Auflösung während der Chromatographie bevorzugt. Eine besondere Konzentration an Detergenz, beispielsweise N-Lauroylsarcosin (in Salzform), z. B. Sarkosyl, liegt damit im Bereich von 0,8% bis 0,2%, vorzugsweise von 0,5 bis 0,2%, insbesondere bei etwa 0,3%.
  • Zusätzlich zu dem oben Erwähnten wurde festgestellt, daß die Entfernung von Detergenz, wie z. B. N-Lauroylsarcosin (in Salzform), z. B. Sarkosyl, eine Spur an proteolytischer Aktivität aktiviert, die die Produktanalyse komplizieren könnte. Weiterhin wurde festgestellt, daß diese proteolytische Aktivität signifikant verringert und sogar beseitigt werden kann, wenn nach Entfernung des Detergenz mittels Diafiltration der pH-Wert vor einer stärkeren Proteolyse auf unterhalb 7,0 erniedrigt wird, zweckmäßigerweise mittels Diafiltration und vorzugsweise mittels Dialyse. Somit kann eine Spur an proteolytischer Aktivität bei einem pH-Wert verringert oder beseitigt wrden, der unterhalb von 7,0 liegt, aber hinreichend hoch ist, um eine signifikante Hydrolyse des Polypeptids zu vermeiden. Der ph-Wert liegt vorteilhafterweise im Bereich von 6,0 bis 4,5, vorzugsweise bei 5,8 bis 5,0, insbesondere bei etwa 5,4. Ein weiterer Vorteil dieser Ausführungsform besteht darin, daß E. coli-Verunreinigung und/oder abgebautes oder nicht korrekt gefaltetes Protein ausgefällt werden kann, indem der pH-Wert in dieser Weise erniedrigt wird. Dabei ist bevorzugt, daß die Reinigung den Schritt einer Größenausschlußchromatographie einschließt, da ansonsten das Problem eines proteolytischen Abbaus verstärkt wird und dann, obwohl durch die vorliegende Ausführungsform ein solcher Abbau verringert wird, dieser schwer zu beseitigen ist.
  • Zusätzlich zu den obigen Vorgängen ermöglicht die Einführung von Lösungsstabilität in einen G-CSF oder ein Derivat davon eine erhebliche Vereinfachung des Extraktionsvorgangs. Somit umfaßt ein Verfahren zur Extraktion eines (wie vorstehend definierten) erfindungsgemäßen aktiven Derivats aus einem Einschlußkörperchen davon 1) das Suspendieren des Einschlußkörperchens in einem Detergenz, insbesondere N-Lauroylsarcosin in Salzform (z. B. Sarkosyl), 2) Oxidation, 3) Entfernung des Detergenz, beispielsweise wie vorstehend beschrieben, und 4) Aufrechterhalten einer erhöhten Temperatur, beispielsweise 30–45°C, vorteilhafterweise 34–42°C, der nach Entfernen des Detergenz erhaltenen Lösung, um dadurch bakterielle Proteinverunreinigungen, Produktoligomere und/oder Abbauprodukte auszufällen. Die Lösung wird dabei zweckmäßigerweise 6–24 Stunden, vorteilhafterweise 8–18 Stunden, bevorzugt 10–14 Stunden und insbesondere etwa 12 Stunden bei der erhöhten Temperatur gehalten.
  • Der Extraktionsvorgang kann beispielsweise durch Lyse der Wirtszellen mit anschließendem Zentrifugieren erfolgen, um das Einschlußkörperchen beispielsweise in Form eines Pellets zu erhalten. Das Einschlußkörperchen kann dann in einem Detergenz, wie z. B. N-Lauroylsarcosin in Salzform (z. B. Sarkosyl), vorzugsweise 1–3%, insbesondere etwa 2%, N-Lauroylsarcosin in Salzform (z. B. Sarkosyl), suspendiert werden. An die Suspension in Detergenz kann sich dann eine Oxidation, beispielsweise in Gegenwart von Kupfersulfat (CuSO4), und daran wiederum ein Zentrifugieren anschließen.
  • Besteht die Möglichkeit, das Einschlußkörperchen zu waschen, so wird die Verwendung von Harnstoff gegenüber beispielsweise Deoxycholat bevorzugt.
  • Der Extraktionsvorgang ermöglicht eine Vereinfachung des Herstellungsverfahrens, beispielsweise dadurch, daß keine Größenausschlußsäulen mehr verwendet werden brauchen. Außerdem scheint die große Menge an gewonnenem Produkt nach dem Wärmebehandlungsschritt einer der Vorteile der erhöhten Lösungsstabilität der wie vorstehend definierten G-CSF-Derivate zu sein. Tatsächlich eignet sich das Protein für das neue Extraktionsverfahren um so besser, je größer die Lösungsstabilität ist. So ist beispielsweise die Anwendung dieses Extraktionsverfahrens auf die Extraktion der G-CSF-Derivate mit einer Lösungsstabilität von wenigstens 85% bei 10 mg/ml bevorzugt . Bei der Extraktion des bekannten Analogs [Met-1, Ser17]-G-CSF mit dem obigen Verfahren ergab sich durch rpHPLC, daß nur 40% des gewünschten Produkts nach Wärmebehandlung eines Retentats mit 1 mg/ml Gesamtprotein in Lösung verblieben. Bei 3 mg/ml Gesamtprotein verblieben nur 19% des Analogs in Lösung.
  • Im allgemeinen können Peptide zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung mittels rekombinanter Techniken oder durch Peptidsynthese hergestellt werden. Bei der Peptidsynthese kann es sich um eine bevorzugte präparative Technik handeln, falls dies die Größe des Peptids zuläßt und falls mehr als eine freie Aminogruppe (z. B. die N-Terminalaminogruppe und ein oder mehrere Lysinreste) für die kovalente Konjugation mit einem wasserlöslichen Polymer, wie oben beispielhaft dargestellt ist, vorhanden ist. Eine solche präparative Technik hat den – Vorteil, daß kovalent mit einem wasserlöslichen Polymer konjugierte Lysinreste an bestimmten Stellen im Molekül eingeführt werden können, um eine einzige molekulare Einheit statt des heterogenen Produktgemischs zu bilden, das durch die kovalente Konjugation eines wasserlöslichen Polymers mit einem Peptid mit mehreren freien Aminogruppen entstehen könnte.
  • Unabhängig von der verwendeten präparativen Technik kann es vorteilhaft sein, das Peptid i) durch Substitution existierender Reste durch andere Reste, wie z. B. Lysinreste, zur Anbindung wasserlöslicher Polymermoleküle, ii) durch Hinzufügen neuer solcher Reste zur Anbindung wasserlöslicher Polymermoleküle, beispielsweise am N- und/oder C-Terminus oder anderswo im Molekül, vorausgesetzt, daß die Aktivität nicht zerstört bzw. in unannehmbarer Weise reduziert wird, und/oder iii) durch Substituieren oder Entfernen eines oder mehrerer solcher Reste, z. B. Lysinreste, zur Verringerung des Ausmaßes der Anbindung wasserlöslicher Polymermoleküle, um dadurch die heterogene Beschaffenheit des Produkts zu verringern und/oder die Anbindung eines wasserlöslichen Polymers an Stellen im Molekül zu vermeiden, an denen eine solche Anbindung die Aktivität des Peptids reduzieren oder zerstören würde, zu modifizieren.
  • Die kovalente Konjugation wasserlöslicher Polymermoleküle, wie z. B. Polyethylenglykol, mit gebildetem Peptid oder mit spezifischen Aminosäuren vor der Peptidbildung kann mittels beliebiger herkömmlicher Mittel, wie z. B. mit hierin beschriebenen Verfahren, durchgeführt werden.
  • A.2 Wasserlösliches Polymer
  • Bei dem kovalent mit dem Polypeptid konjugierten wasserlöslichen Polymer kann es sich beispielsweise um ein Dextran oder Poly-N-vinylpyrrolidon handeln, doch ist es vorzugsweise ausgewählt aus Polyethylenglykol, Polypropylenglykol-Homopolymeren, polyoxyethylierten Polyolen und Polyvinylalkohol, wobei das Homopolymer gegebenenfalls an einem Ende mit einer Alkylgruppe substituiert sein kann.
  • Zu den besonderen Polymeren, an die das Polypeptid gebunden wird, gehören ein Homopolymer von Polyethylenglykol (PEG) oder ein polyoxyethyliertes Polyol, vorausgesetzt, daß das Polymer bei Raumtemperatur in Wasser löslich ist. Zu den polyoxyethylierten Polyolen gehören beispielsweise polyoxyethyliertes Glycerin, polyoxyethyliertes Sorbit oder polyoxyethylierte Glukose.
  • Bei dem Glyceringerüst von polyoxyethyliertem Glycerin handelt es sich um das gleiche Gerüst, das beispielsweise in Tieren und im Menschen natürlicherweise in Mono-, Di- und Triglyceriden vorkommt. Daher würde diese Verzweigung nicht unbedingt als eine körperfremde Substanz angesehen werden.
  • Bei dem Polymer handelt es sich vorzugsweise um unsubstituiertes Polyethylenglykol (PEG), Monomethyl-PEG (mPEG) oder polyoxyethyliertes Glycerin (POG), insbesondere um Monomethyl-PEG (mPEG), wobei das Polymer zweckmäßigerweise über eine Amid- oder Urethanverknüpfung, die beispielsweise aus dem 4-Hydroxy-3-nitrobenzolsulfonsäureester oder dem N- Hydroxysuccinimidester einer PEG-, mPEG- oder POG-Carbonsäure oder aus dem p-Nitrophenylcarbonsäureester oder 2,4,5-Trichlorphenylcarbonsäureester eines PEG, mPEG oder POG gebildet wird, an das Polypeptid gekoppelt wird. Das Polypeptid kann gewünschtenfalls mit mPEG über eine Aminosäure oder ein Peptid als Spacer-Arm verknüpft sein (siehe L. Sartore et al. in Appl. Biochem. Biotechnol. 27, 45–54 (1991).
  • Das Molekulargewicht des Polymers liegt bevorzugt zwischen etwa 300 und 100000, besonders bevorzugt zwischen 350 und 40000, z. B. je nach dem jeweils verwendeten Polypeptid. Diesbezüglich handelt es sich bei dem im Zusammenhang mit den wasserlöslichen Polymeren angegebenen Molekulargewicht um Zahlenmittel, aber da solche Polymere eine (wie unten definierte) Polydispersität von etwa 1 aufweisen sollten, entspricht das Molekulargewicht im Zahlenmittel etwa dem Molekulargewicht im Gewichtsmittel.
  • Das PEG-Homopolymer kann unsubstituiert, aber auch an einem Ende mit einer Alkylgruppe substituiert sein. Dabei handelt es sich bei der Alkylgruppe vorzugsweise um eine C1-C4-Alkylgruppe und ganz besonders bevorzugt um eine Methylgruppe. Das Polymer ist vorteilhafterweise ein unsubstituiertes Homopolymer von PEG, ein monomethylsubstituiertes Homopolymer von PEG oder polyoxyethyliertes Glycerin und weist eine untere Molekulargewichtsgrenze von vorzugsweise 1000, besonders bevorzugt 1250 und insbesondere 1500 sowie eine obere Molekulargewichtsgrenze von beispielsweise 20000 auf. Die obere Molekulargewichtsgrenze kann gewünschtenfalls bis zu 40000 hoch sein, liegt jedoch vorteilhafterweise bei 15000 und vorzugsweise bei 10000. Das Molekulargewicht liegt vorzugsweise im Bereich von 1000 bis 15000, beispielsweise 2000 bis 10000, insbesondere 2000 bis 5000.
  • Weist das Polypeptid wenigstens eine der biologischen Eigenschaften von natürlich vorkommenden G-CSF auf und wird ein unsubstituiertes Homopolymer von PEG oder ein monomethylsubstituiertes Homopolymer von PEG als wasserlösliches Polymer verwendet, so kann das untere Molekulargewicht des wasserlöslichen Polymers einen so geringen Wert wie 750 aufweisen, liegt jedoch normalerweise bei 1000, vorteilhafterweise bei 1250, vorzugsweise bei 1500 und insbesondere bei etwa 2000.
  • Das Polypeptid wird kovalent mit einem wasserlöslichen Polymer, wie z. B. Polyethylenglykol, Polypropylenglykol-Homopolymeren, polyoxyethylierten Polyolen und Polyvinylalkohol, konjugiert, wobei das Homopolymer gegebenenfalls an einem Ende mit einer Alkylgruppe substituiert ist.
  • Oben beschriebene Polypeptide können beispielsweise entweder über (1) eine freie Aminogruppe bzw. freie Aminogruppen, (2) wenigstens eine Kohlenhydratgruppierung auf dem Protein oder (3) eine freie Sulfhydrylgruppe bzw. freie Sulfhydrylgruppen, die entweder in nativem Molekül vorhanden ist bzw. sind oder in das Molekül einkonstruiert wird bzw. werden, mit dem Polymer konjugiert sein.
  • Solche Techniken sind ausführlich in der PCT-Patentveröffentlichung WO 89/06546 im Zusammenhang mit M-CSF beschrieben.
  • Insbesondere wird durch die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines (wie hierin definierten) G-CSF-Polypeptids, das mit einem Polyethylenglykol kovalent konjugiert ist, oder eines G-CSF-Polypeptids, das kovalent mit einem polyoxyethylierten Polyol konjugiert ist, bereitgestellt, wobei in dem Verfahren ein Überschuß eines aktivierten Esters oder Carbonsäureesters von Polyethylenglykol (PEG) oder polyoxyethyliertem Polyol (POP) mit einem wie hierin definierten G-CSF-Polypeptid in Kontakt gebracht wird, um dadurch ein G-CSF-Polypeptid zu bilden, das weitgehend maximal mit PEG oder POP kovalent konjugiert ist. Der aktivierte Carbonsäureester von PEG bzw. der aktivierte Carbonsäureester von POP wird vorzugsweise hergestellt, indem PEG bzw. POP, das wenigstens eine Hydroxylgruppe aufweist, mit einem Chlorameisensäureester in Kontakt gebracht wird, wodurch der aktivierte Carbonsäureester gebildet wird.
  • Das Molverhältnis des aktiven Esters oder Carbonsäureesters von PEG bzw. POP zum G-CSF-Polypeptid beträgt 200 : 1 bis 50 : 1, besonders bevorzugt 150 : 1 bis 50 : 1, insbesondere etwa 100 : 1.
  • Das eingesetzte Verfahren ähnelt dem in Applied Biochem und Biotech., 11:141–152 (1985) von Veronese et al. offenbarten Verfahren, das danach von Cetus Corporation auf IL-2 angewendet und in ihrem US-Patent Nr. 4,902,502 (eingereicht am 23. Januar 1989) beansprucht wurde.
  • Wird durch die Konjugation des wasserlöslichen Polymers mit dem Polypeptid die physiologische Aktivität des Konjugats auf unterhalb eines gewünschten Niveaus reduziert, so läßt sich dies beispielsweise dadurch überwinden, daß 1) eine spaltbare Verknüpfung zwischen dem Polypeptid und dem wasserlöslichen Polymer verwendet wird, so daß nach Freisetzung des Konjugats in vivo das wasserlösliche Polymer von dem Polypeptid unter Erhalt eines Polypeptids mit guter physiologischer Aktivität abgespalten wird, oder daß 2) das Molekül des Polypeptids (siehe z. B. in US-Patent Nr. 4,904,584 beschrieben) so zugeschnitten wird, daß die Konjugation des wasserlöslichen Polymers an Stellen auf dem Polypeptid stattfindet, die keinen signifikanten negativen Einfluß auf die physiologische Aktivität des Konjugats haben. Gewünschtenfalls kann jedoch eine Reduktion der physiologischen Aktivität des Polypeptids einfach dadurch überwunden oder wenigstens minimiert werden, daß man die in der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung vorhandene Menge an Konjugat erhöht.
  • B. Material der Zusammensetzung
  • Das Material der Zusammensetzung kann aus einer beliebigen Art von Polymer oder einem Gemisch davon, wie z. B. Polylactid (wie nachfolgend definiert) oder von amphipathischen Blockcopolymeren abgeleiteten, biologisch abbaubaren Hydrogelen (wie z. B. im europäischen Patent Nr. 92,918 beschrieben), und Gemischen aus Polylactiden und derartigen Hydrogelen bestehen. Hydrogele können von besonderem Nutzen sein, da sie sich so gestalten lassen, daß eine Komponente des linearen bzw. verzweigten Blockcopolymers eine thermodynamische Identität aufweist, die ähnlich der der an das Polypeptid gebundenen hydrophilen Einheit (wasserlösliches Polymer) ist. Daher kann es beispielsweise besonders sinnvoll sein, pegylierte Polypeptide mit polyethylenglykolhaltigen Amphipathen zu verwenden.
  • Bei dem Material der Zusammensetzung kann es sich somit beispielsweise um Polylactid (wie nachfolgend definiert), wie z. B. in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 58,481 beschrieben, handeln.
  • Die Freisetzung makromolekularer Arzneistoffe aus Polylactiden hängt von der Struktur des Polylactids (das heißt der Verteilung und Länge von Comonomereinheiten in Copolymeren von Milchsäure/Glykolsäure), dem Molekulargewicht der Homo- und Copolymere aus Milchsäure/Glykolsäure sowie der Molekulargewichtsverteilung bzw. Polydispersität dieser Homo- und Copolymere ab. Dementsprechend gehören zu den bevorzugten Polylactiden (ohne darauf beschränkt zu sein) solche, die in Benzol unlöslich sind und bei 1% w/v in Chloroform bei 25°C eine inhärente Viskosität von mehr als 0,09 dl/g, jedoch weniger als 4 dl/g aufweisen, oder solche, die in Benzol löslich sind und bei 1% w/v Chloroform eine inhärente Viskosität von mehr als 0,09 dl/g, jedoch weniger als 0,5 dl/g und besonders bevorzugt weniger als 0,3 dl/g aufweisen. Eine weitere bevorzugte Klasse von Polylactiden sind solche, die ein Molekulargewicht im Zahlenmittel von mehr als 2000 sowie kontrollierte Polydispersitäten aufweisen, so daß für Molekulargewichte im Zahlenmittel von 2000 bis 10000 die Polydispersitäten von 1,2 bis 50 und für Molekulargewichte im Zahlenmittel von 5000 bis 30000 die Polydispersitäten von 1,4 bis 15 reichen. Der bevorzugte Bereich des Molekulargewichts im Zahlenmittel liegt bei 2000 bis 20000. Die Lösungsviskositäteigenschaften sowie ihre Messung und die Messung von Molekulargewichten sind in „Preparative Methods of Polymer Chemistry", 2. Auflage, Seiten 43 bis 52, W. R. Sorenson und Tod W. Campbell, 1968, Interscience Publishers, beschrieben. Diese verschiedenen Eigenschaften des Polymers bestimmen die Abbauprofile sowohl der Polylactide allein als auch der darauf beruhenden pharmazeutischen Zusammensetzungen. Zu den Abbauprofilen gehören die Erzeugung von Mikroporosität in dem einem Abbau unterworfenen Polylactid, die Wasseraufnahme durch das dem Abbau unterworfene Polylactid sowie schließlich die Erosion bzw. der Gewichtsverlust des dem Abbau unterworfenen Polylactids. In dieser Hinsicht hängt die Diffusion einer physiologisch aktiven Substanz nur durch das Polymer ebenso von der Löslichkeit/Kompatibilität der physiologisch aktiven Substanz mit dem geschwindigkeitskontrollierenden Polymer wie von der molekularen Größe der physiologisch aktiven Substanz ab. Aus einem oder beiden dieser Gründe kann eine (wie vorstehend definierte) physiologisch aktive Substanz nicht dazu in der Lage sein, durch die Polymerphase zu diffundieren. In einer solchen Situation müßte die Freisetzung durch einen anderen Mechanismus erfolgen, wie z. B. durch wäßrige Poren in der Polymermatrix. Es kann daher wünschenswert sein, Polymere zu konstruieren, die eine im Zeitverlauf kontinuierliche Wasseraufnahme aufweisen, wobei diese kontinuierliche Wasseraufnahme mit der Erzeugung von wäßrigen Mikroporen in der dem Abbau unterworfenen Matrix im Zusammenhang steht, die dabei letzten Endes in lösliche Fragmente abgebaut wird und sich zersetzt.
  • Obschon uns nicht daran gelegen ist, durch theoretische Betrachtungen gebunden zu sein, glauben wir, daß eine kovalente Konjugation von Polypeptid mit einem wasserlöslichen Polymer, insbesondere Polyoxyethylenpolymeren, unter Bildung einer (wie vorstehend definierten) physiologisch aktiven Substanz die (vorstehend definierte) Perkolationsschwelle einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung in vorteilhafter Weise beeinflußt. Die Perkolationsschwelle hängt von dem Niveau des Einbaus in die und von der Kompatibilität der physiologisch aktiven Substanz mit der Polymermatrix in der wasserfreien Zusammensetzung ebenso wie von der Beschaffenheit und dem Ausmaß der Phasentrennung nach Hydratation der Zusammensetzung ab. Dabei stellen die Kettenlänge des Polypeptids, das Molekulargewicht des wasserlöslichen Polymers sowie das Niveau des Einbaus von wasserlöslichem Polymer allesamt Merkmale dar, die die Kompatibilität der physiologisch aktiven Substanzen beeinflussen.
  • Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen mit kontinuierlicher Freisetzung können gewünschtenfalls eine kurze Induktionsphase vor Beginn der Freisetzung der physiologisch aktiven Substanz aufweisen. Die Länge dieser Induktionsphase kann je nach Menge der freizusetzenden physiologisch aktiven Substanz und dem Zeitraum, der für ihre Freisetzung vorgesehen ist, variieren.
  • Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzun gen mit kontinuierlicher Freisetzung liegen vorzugsweise in einer von Mikrokapseln verschiedenen Form vor, beispielsweise als Mikrokügelchen, wobei die physiologisch aktive Substanz im gesamten Polymer bis zur und einschließlich der Oberfläche dispergiert ist, oder als andere mikropartikuläre Formen, in denen sich die physiologisch aktive Substanz bis zur Oberfläche erstreckt.
  • Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen mit kontinuierlicher Freisetzung können im Organismus eines Tieres (wie z. B. eines Menschen), der mit einem Polypeptid behandelt werden soll, durch z. B. intramuskuläre oder subkutane Injektion oder durch subdermale chirurgische Implantation in herkömmlicher klinischer oder tiermedizinischer Weise plaziert werden.
  • B.1 Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung
  • Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen mit kontinuierlicher Freisetzung können mit einem beliebigen herkömmlichen Verfahren hergstellt werden. So kann beispielsweise das Material der Zusammensetzung, wie z. B. oben definiert, als eine Lösung in einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. Eisessig, in dem die wie vorstehend definierte physiologisch aktive Substanz gelöst werden kann, dargestellt werden, wie z. B. im europäischen Patent Nr. 58,481 beschrieben.
  • B.2 Wäßriges Verfahren
  • Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen mit kontinuierlicher Freisetzung lassen sich ebenfalls beispielsweise durch Herstellung einer wäßrigen Dispersion aus einem Polymer oder Copolymer mit einer oder mehreren Carbonsäureendgruppen herstellen, wobei das Polymer oder Copolymer ein Molekulargewicht mit einem Gewichtsmittel von wenigstens etwa 3000 aufweist und in Form eines Ammonium- oder Alkalisalzes davon vorliegt und wobei wenigstens 80 Gew.-% des Feststoffgehalts der Dispersion ein Bakterienfilter mit einer Porengröße von 200 m–9 passieren können.
  • Die Herstellung einer solchen wäßrigen Dispersion kann so erfolgen, daß eine Lösung des Polymers oder Copolymers in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel und eine zumindest stöchiometrische Menge einer Lösung eines wasserlöslichen Ammonium- oder Alkalisalzes oder -hydroxids gemischt werden, so daß eine Dispersion des entsprechenden Ammonium- oder Alkalisalzes des Polymers oder Copolymers in einem Gemisch aus wäßrigem/organischem Lösungsmittel bei im wesentlichen neutralem pH-Wert gebildet wird, und danach das mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel unter Herstellung einer wäßrigen Dispersion des Polymer- oder Copolymersalzes, von dem wenigstens 80 Gew.-% des Feststoffgehalts ein Bakterienfilter mit einer Porengröße von 200 m–9 passieren können, verdampft wird.
  • Das in dem obigen Verfahren verwendete Polymer oder Copolymer kann beispielsweise ausgewählt werden aus den Homopolymeren Poly(D-, L- und DL-Milchsäure), Poly(D-, L- und DL-Lactid), Polyglykolsäure, Polyglykolid, Poly-E-Caprolacton und Polyhydroxybuttersäure; von zwei oder mehreren der Monomere, von denen diese Homopolymeren abgeleitet sind, abgeleiteten Copolymeren; aufgepfropften oder verzweigten Blockcopolymeren, die eines dieser Homopolymere oder Copolymere sowie ein hydrophiles Polymer, ausgewählt aus Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenoxid, Polyethylenglykol, Polyacrylamid, Polymethacrylamid, Dextran, Alginsäure, Natriumalginat, Gelatine, oder ein Copolymer aus beliebigen zwei oder mehreren Monomeren, von denen diese abgeleitet sind, enthalten.
  • Bevorzugte Polymere oder Copolymere zur Verwendung in diesem wäßrigen Verfahren sind die Homopolymere Poly (D-, L- und DL-Milchsäure) und Poly(D-, L- und DL-Lactid, sowie die Copolymeren Poly(D-, L- oder DL-Milchsäure-Coglykolsäure) und Poly(D-, L- oder DL-Lactid-Coglykolid).
  • Ein bevorzugtes mit Wasser mischbares Lösungsmittel zur Verwendung in diesem wäßrigen Verfahren ist Aceton, 2-Butanon (Methylethylketon), Dioxan, Hexafluorisopropanol, Tetrahydrofuran, Methanol oder Ethanol und besonders Aceton, und ein bevorzugtes wasserlösliches Ammonium- oder Alkalisalz oder -hydroxid ist Natrium-, Kalium- oder Ammoniumhydrogencarbonat, Natrium-, Kalium- oder Ammoniumcarbonat oder Natrium-, Kalium- oder Ammoniumhydroxid.
  • Ein alternatives Lösungsmittel zur Verwendung in diesem wäßrigen Verfahren ist ein nicht mit Wasser mischbares Lösungsmittel, wie z. B. Dichlormethan. Ein solches Lösungsmittel führt zu einer wäßrigen Dispersion von Copolymersalz mit größerer Partikelgröße.
  • Bei der Lösung des wasserlöslichen Ammonium- oder Alkalisalzes oder -hydroxids kann es sich um eine Lösung in Wasser bzw. in einem Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, beispielsweise Methanol oder Ethanol, handeln.
  • Die Verdampfung des mit Wasser mischbaren Lösungsmittels wird vorzugsweise unter vermindertem Druck sowie bei einer Temperatur, die so wenig wie möglich oberhalb der Umgebungstemperatur liegt, durchgeführt.
  • Falls die Polymer- oder Copolymerlösung in einem organischen Lösungsmittel zu der wäßrigen Phase gegeben wird und diese Zugabe vor dem Verdampfen des organischen Lösungsmittels beendet ist, erhält man hohe Ausbeuten an Partikeln, die ein 200 m–9-Filter passieren können, nur dann, wenn die Konzentration des Polymers oder Copolymers im organischen Lösungsmittel einen Wert von etwa 1,5% Gewicht zu Volumen nicht überschreitet.
  • In dem vorliegenden Verfahren erfolgt das Mischen der Lösung des Polymers oder Copolymers in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel mit der Lösung eines wasserlöslichen Ammonium- oder Alkalisalzes oder -hydroxids vorzugsweise unter Rühren mit hoher Scherung, beispielsweise mit einem Ystral-Homogenisator, mit dem eine Rührgeschwindigkeit von bis zu 25000 UpM (Umdrehungen pro Minute) erzielt werden kann, oder einem ähnlichen Gerät.
  • Vorzugsweise ist kein solubilisierendes Protein, wie z. B. fötales Kälberserum (Foetal Calf Serum, FCS) und Humanserumalbumin (HSA), in der pharmazeutischen Zusammensetzung vorhanden.
  • Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können die bevorzugten Parameter für eine gegebene Zusammensetzung durch Ausprobieren bestimmt werden, wobei die obige ausführliche Diskussion als Richtlinie zugrundegelegt wird. Im Hinblick auf bestimmte Polypeptide, wie z. B. Interleukin-2 (IL-2), menschliches Wachstumshormon (Human Growth Hormone, HGH) und Interferonα2 (IFNα2) ist die Proteinbeladung der Zusammensetzung, die im Fall von IL-2, HGH und IFNα2 normalerweise zwischen 5 und 20 Gew.-%, vorzugsweise 10 bis 18 Gew.-%, insbesondere bei etwa 12,5–16 Gew.-%, liegt, ein Parameter, der vorteilhaft verändert werden kann, um den gewünschten Freisetzungsverlauf zu erzielen.
  • Es sollte betont werden, daß man es beim Arbeiten mit wasserlöslichen Polymeren, wie z. B. Polyethylenglykol, bisher für notwendig hielt, das Ausmaß der Modifikation des gewünschten Polypeptids einzuschränken, falls eine hohe physiologische Aktivität erhalten bleiben sollte. Somit führte bislang die Konjugation eines Überschusses an wasserlöslichem Polymer mit einem physiologisch aktiven Polypeptid zu einer wesentlichen Reduktion oder dem vollständigen Verlust der physiologischen Aktivität. Die Notwendigkeit der Einschränkung des Ausmaßes der Modifikation des Polypeptids führt zu einem Anstieg der heterogenen Verteilung einer gegebenen Anzahl von wasserlöslichen Polymermolekülen um eine Anzahl, gewöhnlich eine große Anzahl, potentieller Modifikationsstellen. Ein solch hoher Grad an Heterogenität mag zwar eine geringe Auswirkung auf solche Parameter wie Löslichkeit und Halbwertzeit haben, doch kann er für die kontrollierte und vollständige Freisetzung aus einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung von Nachteil sein, da eine heterogene Population von Isomeren die Gleichmäßigkeit und Vollständigkeit der Freisetzung aus der Zusammensetzung herabsetzen kann. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß G-CSF-Derivate unserer europäischen Patentanmeldung Nr. 91303868.3 und insbesondere [Arg11, Ser17,27,60,65]-G-CSF (entweder mit oder ohne ein vorgeschaltetes Methionin, jedoch zweckmäßigerweise mit einem solchen vorgeschalteten Methionin) einer erschöpfenden Modifikation mit einem wasserlöslichen Polymer, wie z. B. oben beschrieben, insbesondere einem Polyethylenglykol (PEG), wie z. B. Monomethylpolyethylenglykol (mPEG), unterzogen werden kann und dabei wenigstens eine der biologischen Eigenschaften von natürlich vorkommendem G-CSF zu einem signifikanten Grad erhalten bleibt. So wurde beispielsweise bei pegylierten G-CSF-Derivaten, die getestet wurden, festgestellt, daß in ihnen die G-CSF-Aktivität von nativem G-CSF in vitro innerhalb eines Faktors von etwa 2 erhalten bleibt. Tatsächlich zeigen in Bezug auf in vivo-Untersuchungen mit pegyliertem [Arg11, Ser17,27,60,65]-G-CSF erhaltene Dosis-Wirkungskurven eine Aktivität, die etwa doppelt so hoch ist wie die Aktivität von nativem G-CSF. Eine solche erschöpfende Modifikation führt zu einer wesentlich geringeren heterogenen Population von Isomeren, wodurch bei einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung die Gleichmäßigkeit und Vollständigkeit der Freisetzung aus solchen Zusammensetzungen wesentlich erhöht wird.
  • Somit handelt es sich bei der ganz besonders bevorzugten physiologisch aktiven Substanz zur Verwendung in der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung um menschlichen pegylierten [Arg11, Ser17,27,60,65]-G-CSF, in dem ein vorgeschaltetes Methionin im G-CSF-Anteil entweder vorhanden oder nicht vorhanden, jedoch zweckmäßigerweise vorhanden ist und bei dem jedes Polyethylenglykol-(PEG)-Anteil ein Molekulargewicht von 2000–5000 Da aufweist, wobei das Verhältnis des G-CSF-Anteils zu den PEG-Anteilen bei 1 : 3–1 : 4, insbesondere bei etwa 1 : 3,9 liegt.
  • B. Glossar
  • Das folgenden Glossar von in der folgenden Beschreibung verwendeten Begriffen wird als Hilfe für den Leser bereitgestellt:
  • Unter dem Begriff „eine wäßrige, quasi physiologische Umgebung" wird der Organismus, insbesondere die Muskulatur oder das subkutane Gewebe oder das Kreislaufsystem, eines Warmblüters verstanden, obwohl in Laboruntersuchungen eine solche Umgebung mit wäßrigen, gegebenenfalls auf einen physiologischen pH-Wert gepufferten Flüssigkeiten bei einer Temperatur zwischen 35 und 40°C nachgebildet werden kann.
  • Der Begriff „kontinuierliche Freisetzung" wird in dieser Beschreibung lediglich zur Definition eines Freisetzungsverlaufs verwendet, der im Wesentlichen einphasig ist und, obwohl er einen Wendepunkt aufweisen kann, mit Sicherheit keine „Plateau"-Phase besitzt, wenn die kumulative Freisetzung einer physiologisch aktiven Substanz gegen die Zeit aufgetragen wird.
  • Unter dem Begriff „einphasig", wie er hier verwendet wird, wird die kontinuierliche Freisetzung über einen Zeitraum verstanden, während dem zwar ein Wendepunkt auftreten kann, aber mit Sicherheit keine Plateauphase, wenn man die kumulative Freisetzung der physiologisch aktiven Substanz gegen die Zeit aufträgt.
  • Der Begriff „Polylactid" wird im Sinne eines Oberbegriffs verwendet, der Polymere aus Milchsäure allein, Copolymere aus Milchsäure und Glykolsäure, Gemische solcher Polymere, Gemische solcher Copolymere sowie Gemische solcher Polymere und Copolymere umfaßt, wobei die Milchsäure entweder in racemischer oder in optisch aktiver Form vorliegen kann.
  • Unter dem Begriff „säurestabil" ist zu verstehen, daß die physiologisch aktive Substanz unter den in der beanspruchten Formulierung während des für die Verwendung vorgesehenen Zeitraums angetroffenen Bedingungen stabil ist. Dabei variiert der pH-Wert innerhalb der beanspruchten Formulierung, ist jedoch im allgemeinen nicht größer als pH 8 und normalerweise nicht geringer als pH 2. Diese pH-Werte stellen im allgemeinen Extremwerte dar, wobei der pH-Wert innerhalb einer gegebenen Formulierung womöglich niemals niedriger als pH 2,5 oder pH 3 ist. Bei der entsprechenden Temperatur handelt es sich normalerweise um die Körpertemperatur eines Säugers, die im allgemeinen bis etwa 40°C reicht. Der für die Verwendung vorgesehene Zeitraum kann beispielsweise zwischen einer Woche und 6 Monaten variieren.
  • Der Begriff „Polydispersität" ist definiert als der Quotient Mw/Mn, wobei Mw für das Molekulargewicht im Gewichtsmittel und Mn für das Molekulargewicht im Zahlenmittel steht. Eine absolute Messung des Molekulargewichts im Zahlenmittel läßt sich durch Endgruppenanalyse oder durch Dampfdruckosmometrie messen. Die Messung der Molekulargewichte im Zahlen- und Gewichtsmittel kann ebenso wie die der Polydispersität durch Größenausschlußchromatographie, bezogen auf Polystyrolstandards, durchgeführt werden.
  • Der Begriff „Perkolationsschwelle" wird hier zur Definition des Zustands verwendet, der erreicht wird, wenn eine wäßrige, Arzneistoff (physiologisch aktive Substanz, wie vorstehend definiert) enthaltende Phase ein Gleichgewicht mit der äußeren Umgebung sowie mit anderen Domänen des wäßrigen Arzneistoffs (der physiologisch aktiven Substanz, wie vorstehend definiert) innerhalb der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung erreicht.
  • Der Begriff „natürlich vorkommender G-CSF", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auch auf solche G-CSFs, wie nachweislich in der Natur existieren, und umfaßt die beiden Polypeptide mit der in SEQ ID No 32 (wie nachfolgend definiert) aufgeführten Aminosäuresequenz. Diese beiden Polypeptide unterscheiden sich nur insoweit, als daß in einem Polypeptid eine Val-Ser-Glu-Tripeptidinsertion zwischen Position 35 und 36 vorhanden ist, wohingegen sie im anderen Polypeptid fehlt. Das Bezifferungssystem, das in der gesamten vorliegenden Beschreibung verwendet wird, beruht auf dem natürlich vorkommenden Polypeptid ohne die Val-Ser-Glu-Insertion, wobei der Begriff „nativ", der hier verwendet wird, sich ebenfalls auf dieses Polypeptid ohne Val-Ser-Glu-Insertion bezieht. Es versteht sich, daß die hier beschriebenen Modifikationen auf alle natürlich vorkommenden Formen von G-CSF und Analogen davon, wie oben beschrieben, anwendbar sind und daß eine daraus folgende Berichtigung der Positionsziffern des Polypeptids je nach Art des für die Modifikation ausgewählten natürlich vorkommenden G-CSF notwendig sein kann.
  • Der Begriff „mit wenigstens einer der biologischen Eigenschaften von natürlich vorkommendem G-CSF", wie er auf ein Polypeptid angewendet wird, bedeutet, daß das Polypeptid wenigstens in einem der in der PCT-Patent veröffentlichung Nr. WO 87/01132 ausführlich dargestellten biologischen Assays aktiv ist.
  • Der Begriff „Lösungsstabilität" bedeutet die verminderte Tendenz einer Substanz, unter physiologischen Bedingungen von pH, Temperatur und Ionenstärke aus einer Lösung auszufallen. Die Eigenschaft der Lösungsstabilität unterscheidet sich somit von der der Löslichkeit.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • In 1 ist die Nukleotidsequenz des 167 by großen Fragments dargestellt, auf das im Referenzbeispiel 5 verwiesen wird;
  • in 2 sind die Aminosäuresequenz und die zugehörige Nukleotidsequenz von nativem menschlichem (hu) G-CSF sowie Restriktionsstellen dargestellt;
  • in 3 sind die Aminosäuresequenz und die zugehörige Nukleotidsequenz von [Ser17,27]-hu-G-CSF und Restriktionsstellen dargestellt;
  • in 4 ist die Nukleotidsequenz des T4-Transkriptionsterminators mit (a) terminalen SalI- und HindIII-Restriktionsstellen und (b) terminalen SalI- und Styl-Restriktionsstellen dargestellt;
  • in 5 ist eine Restriktionskarte von pTB357 (hier auch mit pLB004 bezeichnet) dargestellt;
  • in 6 ist die Nukleotidsequenz des. EcoRI-SalI-Fragments, auf das in Referenzbeispiel 6(b) verwiesen wird, dargestellt, wobei jedoch die Interferon-α2-Gensequenz weggelassen worden ist;
  • in 7 ist eine Restriktionskarte von pLB015 (das hier auch mit pICI 0080 bezeichnet ist) dargestellt;
  • in 8 ist eine Restriktionskarte von pICI 1079 dargestellt;
  • in 9 ist eine Restriktionskarte von pICI 54 (hier auch mit pCG54 bezeichnet) dargestellt;
  • in 10 ist eine Restriktionskarte von pCG61 dargestellt;
  • in 11 ist eine Restriktionskarte von pICI1107 dargestellt, wobei der schattierte Bereich die für [Ser17,27]hu-G-CSF codierende Gensequenz repräsentiert;
  • in 12 ist eine Restriktionskarte von pCG300 (hier auch mit pICI 1295 bezeichnet) dargestellt.
  • In 13 ist die Freisetzung von PEG 5000[Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF aus den aus 50% d,l-Lactid/50% Glykolid-Copolymer bestehenden pharmazeutischen Zusammensetzungen A und B mit kontinuierlicher Freisetzung (siehe Beispiele 4 und 5) dargestellt, wobei beide dieser Kompositionen mittels eines Eisessig-Verfahrens hergestellt werden.
  • In 14 ist die Freisetzung von unpegyliertem [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF aus den aus 50% d,l-Lactid/50% Glykolid-Copolymer bestehenden pharmazeutischen Zusammensetzungen C und D mit kontinuierlicher Freisetzung (siehe Vergleichsbeispiel 1 und 2) dargestellt, wobei die Zusammensetzung C unpegylierten [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF allein und die Zusammensetzung D ein Gemisch aus unpegyliertem [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF und Methyl-PEG 5000 umfaßt, wobei beide Zusammensetzungen mit einem Eisessig-Verfahren hergestellt werden.
  • In 15 ist die kumulative Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF aus zwei unterschiedlichen, aus 50% d,l-Lactid/50% Glykolid-Copolymer bestehenden pharmazeutischen Zusammensetzungen G und H mit kontinuierlicher Freisetzung (siehe Beispiel 24) dargestellt, wobei beide dieser Zusammensetzungen mit einem wäßrigen Verfahren hergestellt werden.
  • In 16 ist die kumulative Freisetzung von [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF aus einer aus 50% d,l-Lactid/50% Glykolid-Copolymer bestehenden pharmazeutischen Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung, die [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF allein enthält (siehe Vergleichsbeispiel 3), und aus einer aus 50% d,l-Lactid/50% Glykolid-Copolymer bestehenden pharmazeutischen Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung, die ein Gemisch aus [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF und Methyl-PEG 5000 enthält (siehe Vergleichsbeispiel 4), dargestellt, wobei beide Zusammensetzungen mit einem wäßrigen Verfahren hergestellt wurden.
  • In 17 ist die kumulative Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Lys30]hu-G-CSF aus den aus 50% d,l-Lactid/50% Glykolid-Copolymer bestehenden pharmazeutischen Zusammensetzungen mit kontinuierlicher Freisetzung E (siehe Beispiel 3), K (siehe Beispiel 25) und M (siehe Vergleichsbeispiel 5) dargestellt, wobei die Zusammensetzung E mit dem Eisessig-Verfahren hergestellt wird und die Zusammensetzungen K und M jeweils mit einem wäßrigen Verfahren hergestellt werden.
  • In 18 ist die kumulative Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF aus den aus 50% d, 1-Lactid/50% Glykolid-Copolymer bestehenden pharmazeutischen Zusammensetzungen mit kontinuierlicher Freisetzung F (siehe Beispiel 4), L (siehe Beispiel 26) und N (Vergleichsbeispiel 6) dargestellt, wobei die Zusammensetzung F mit dem Eisessig-Verfahren hergestellt wird und die Zusammensetzungen L und N jeweils mit einem wäßrigen Verfahren hergestellt werden.
  • Auf die folgenden Materialien wird nachfolgend in den Referenzbeispielen und Beispielen Bezug genommen, und ihre Zusammensetzung ist wie folgt:
  • PUFFER FÜR RESTRIKTIONSENZYME
    Figure 00500001
  • Die obigen Puffer sind von Boehringer Mannheim erhältlich.
  • Im stellengerichteten Mutageneseverfahren – Referenzbeispiel 4
    Figure 00500002
  • Figure 00510001
  • Nukleotidmix 1: jeweils 250 μM dATP, dGTP, dCTP=S (Phosphorthioat-Derivat von dCTP) dTTP und 1 mM ATP
  • Nukleotidmix 2: jeweils 250 μM dATP, dGTP, dCTP, dTTP und 350 μM ATP
  • Geneclean (TM)
  • Der Kit enthält 1) 6 M Natriumiodid, 2) eine konzentrierte Lösung aus Natriumchlorid, Tris und EDTA zur Herstellung einer Natriumchlorid/Ethanol/Wasser-Waschlösung; 3) Glassmilk (TM) – ein 1,5-ml-Fläschchen mit 1,25 ml einer Suspension aus Siliziumdioxidmatrix in Wasser.
  • Dies ist eine DNA-Reinigungstechnik, die auf dem Verfahren von Vogelstein und Gillespie, veröffentlicht in Proceedings of the National Academy of Sciences USA (1979) Bd. 76, S. 615, beruht.
  • Alternativ läßt sich eines der in „Molecular Cloning – a laboratory manual" zweite Auflage, Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) beschriebenen Verfahren verwenden.
  • Random Label Kit, Pharmacia-Produkt Nr. 27-9250
  • Die Vorgehensweise ist in „Molecular Cloning – a Laboratory Manual" zweite Auflage, Sambrook, Fritsch und Maniatis, S. 10.13–10.17 (veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory 1989) beschrieben.
  • Sequenase (TM)
  • Chemisch modifizierte T7-DNA-Polymerase, basierend auf dem Verfahren von Tabor und Richardson, veröffentlicht in „Proceedings of the National Academy of Sciences USA (1987) Bd. 84, S. 4767–4771.
  • Ultrogel-AcA-Gele
  • Ein Matrixgemisch aus Polyacrylamid und Agarose, das die hohe Auflösung von Polyacrylamid und die Festigkeit von Agarose in einer synergistischen Zusammenlagerung der beiden Komponenten liefert. Ultrogel AcA 54 enthält 5% Polyacrylamid und 4% Agarose.
  • M9-Minimalmedien
    Figure 00520001
  • Zusätze/75 ml
    Figure 00520002
  • Spurenelementlösung (Trace Element Solution, TES)
  • TES weist die folgende Zusammensetzung auf:
    Figure 00520003
    Figure 00530001
    und wird dem Wachstumsmedium mit 0,5 ml/l zugesetzt.
  • T4-DNA-Ligase
  • Beschrieben in „Molecular Cloning – a Laboratory Manual" zweite Auflage, Sambrook, Fritsch und Maniatis, 5.60–5.64 (veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory 1989) und auch von Weiss B. et al. J. Biol. Chem., Bd. 243, S. 4543 (1968).
  • Phosphatgepufferte Kochsalzlösung OXOID
  • Die Phosphatgepufferte Kochsalzlösung OXOID, wie sie hierin verwendet wird, wird mittels Dulbecco 'A'-Tabletten mit der Formel:
    Figure 00530002
    bereitgestellt. Dabei werden 10 Tabletten in 1 Liter destilliertem Wasser gelöst und 10 Minuten bei 115°C unter Erhalt einer von unlöslichem. Material freien Lösung autoklaviert. Die obige Lösung entspricht der Orginalformulierung von Dulbecco und Vogt (1954) J. Exp. Med. 99(2), 167–82, außer daß Calcium und Magnesium weggelassen werden.
  • Alle Nukleotidsequenzen, auf die hier verwiesen wird, sind in der herkömmlichen 5'-3'-Weise beschrieben.
  • Die Derivate der vorliegenden Erfindung beruhen auf menschlichem G-CSF, der auch mit hu-G-CSF bezeichnet wird.
  • Da alle der in den Beispielen hergestellten Derivate unter Verwendung von E. coli hergestellt werden, ist im allgemeinen ein vorgeschaltetes Methionin vorhanden.
  • Der Begriff „N-Lauroylsarcosin", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf die Verwendung dieser Substanz in Salzform. Somit wird in den Beispielen N-Lauroylsarcosin in Form des Natriumsalzes verwendet.
  • Monomethylpolyethylenglykol 5000 wird hier auch mit Methylpolyethylenglykol 5000 und in gewissen Katalogen für Forschungschemikalien mit Methoxy-Polyethylenglykol 5000 bezeichnet.
  • Die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele sind nur zur Veranschaulichung angegeben.
  • Beispiel 1
  • PEG-5000-[Met–1, Ser17,27] hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung
  • Eisessig-Verfahren
  • Formulierung A (Protein mit 20% Beladung)
  • 27,7 mg Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 7673, Polydispersität 2,59) wurden in 1,0 ml Eisessig gelöst. 1 ml einer wäßrigen Lösung von PEG-5000-[Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF (9 mg/ml) (aus Referenzbeispiel 3) wurde gefriergetrocknet und danach in einem weiteren 1-ml-Aliquot Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 2 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 85°C erhitzten Platten gründlich vermischt und dann bei dieser Temperatur zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde dann in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 10 mg geschnitten. Die Depots wurden danach in Plastikfläschchen mit jeweils 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID und 0,02% Natriumazid gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Zeitabständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met-1, Ser17,27]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe 13).
  • Beispiel 2
  • PEG-5000-[Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung – Eisessig-Verfahren
  • Formulierung B (15,36% Proteinbeladung)
  • 155,43 mg Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 7791,2, Polydispersität 2,65) wurden in 2,0 ml Eisessig gelöst. 3,79 ml einer wäßrigen Lösung von PEG-5000-[Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF (10,56 mg/ml) (aus Referenzbeispiel 3) wurden gefriergetrocknet (Gewicht nach Gefriertrocknen: 104,94 mg) und danach in einem weiteren 2,0-ml-Aliquot Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 70°C erhitzten Platten gründlich vermischt und dann bei dieser Temperatur zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde dann in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 70 mg geschnitten. Die Depots wurden danach in Plastikfläschchen mit jeweils 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID und 0,02% Natriumazid gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Zeitabständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Ser17,17]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe 13).
  • Vergleichsbeispiel 1
  • PEG-5000-[Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF allein enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung
  • Eisessig-Verfahren
  • Formulierung C (20% Proteinbeladung)
  • 160,73 mg Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 7673, Polydispersität 2,59) wurden in 2,0 ml Eisessig gelöst. 4,088 ml einer wäßrigen Lösung von [Met–1, Ser17,27] hu-G-CSF (10,0 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in einem weiteren 2,0-ml-Aliquot Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 2 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 95°C erhitzten Platten gründlich vermischt und dann bei dieser Temperatur zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde dann in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 74 mg geschnitten. Die Depots wurden danach in Plastikfläschchen mit jeweils 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID und 0,02 Natriumazid gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Zeitabständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe 14).
  • Vergleichsbeispiel 2
  • [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF und Methyl-PEG 5000 enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung
  • Eisessig-Verfahren
  • Formulierung D (20% Proteinbeladung)
  • 120,66 mg Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 7673, Polydispersität 2,59) wurden in 2,0 ml Eisessig gelöst. 3,935 ml einer wäßrigen Lösung von [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF (10,0 m/ml) wurden g gefriergetrocknet und danach in 2,0 ml einer Lösung mit 40,82 mg Methyl-PEG 5000 in Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 2 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet.
  • Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 95°C erhitzten Platten gründlich vermischt und dann bei dieser Temperatur zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde dann in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 74 mg geschnitten. Die Depots wurden danach in Plastikfläschchen mit jeweils 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID und 0,02% Natriumazid gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Zeitabständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe 14).
  • Beispiel 3
  • PEG-5000-[Met–1, Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Lys30]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung
  • Eisessig-Verfahren
  • Formulierung E (20% Proteinbeladung)
  • 120,34 mg Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 7673, Polydispersität 2,59) wurden in 2,0 ml Eisessig gelöst. 3,738 ml einer wäßrigen Lösung von PEG-5000-[Met–1, Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Lys30]hu-G-CSF (10,7 mg/ml) (aus Referenzbeispiel 8) wurden gefriergetrocknet und danach in einem weiteren 2,0-ml-Aliquot Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 2 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 85°C erhitzten Platten gründlich vermischt und dann bei dieser Temperatur zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde dann in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 70 mg geschnitten. Die Depots wurden danach in Plastikfläschchen mit jeweils 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID und 0,02 Natriumazid gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Zeitabständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Lys30]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe 17).
  • Beispiel 4
  • PEG-5000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung
  • Eisessig-Verfahren
  • Formulierung F (Polypeptid mit 20% Proteinbeladung)
  • 120,40 mg Polylactid (50 Gew.-% d,l-lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 7673, Polydispersität 2,59) wurden in 2,0 ml Eisessig gelöst. 3,478 ml einer wäßrigen Lösung von PEG-5000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF (11,5 mg/ml) (aus Referenzbeispiel 7) wurden gefriergetrocknet und danach in einem weiteren 2,0-ml-Aliquot Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 2 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 85°C erhitzten Platten gründlich vermischt und dann bei dieser Temperatur zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde dann in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 72 mg geschnitten. Die Depots wurden danach in Plastikfläschchen mit jeweils 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID und 0,02 Natriumazid gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Zeitabständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe 18).
  • Beispiel 5
  • PEG-5000-[Met–1]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung
  • A. Eisessig-Verfahren
  • 120,11 mg Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 9429, Polydispersität 2,02) wurden in 20 ml anhydridfreiem Eisessig gelöst. 3,738 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-5000-[Met–1]-G-CSF (10,7 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 65°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 70 mg geschnitten. Die Depots wurden danach in Plastikfläschchen mit jeweils 2,0 ml 0,02 w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1]-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • B. Wäßriges Verfahren
  • 4,0 g Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew. X Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 9429, Polydispersität 2,02) wurden in 16,0 ml Dichlormethan gelöst und hohen Scherkräften ausgesetzt (Ystral-1500-Homogenisator). Dazu wurden 4 ml einer wäßrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung (20 mg/ml) zugetropft. Nach Zugabe weiterer 40 ml destillierten Wassers wurde eine feine weiße Dispersion erhalten. Das Dichlormethan wurde dann in einem Rotationsverdampfer abgezogen. Die Dispersion wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Dieses Natriumsalz des Polymers wurde anschließend unter Vakuum bei Raumtemperatur vor Gebrauch gelagert.
  • 120,87 mg des Natriumsalzes des Polymers wurden in 2,0 ml destilliertem Wasser dispergiert. 3,738 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-5000-[Met–1]hu-G-CSF (10,7 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde zu der Suspension gegeben und gemischt. Weitere 4 x 0,5-ml-Aliquots destilliertes Wasser wurden zum Spülen des Glasgeräts verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 65°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 80 mg geschnitten. Die Depots wurden dann in Plastikfläschchen mit 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In" regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • Beispiel 6
  • PEG-5000-[Met–1, Ser17]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung
  • A. Eisessig-Verfahren
  • 119,75 mg Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 9429, Polydispersität 2,02) wurden in 20 ml anhydridfreiem Eisessig gelöst. 4,95 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-5000-[Met–1, Ser17]hu-G-CSF (siehe Referenzbeispiel 13) (8,08 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 65°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 70 mg geschnitten. Die Depots wurden danach in Plastikfläschchen mit jeweils 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Ser17]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • B. Wäßriges Verfahren
  • 4,0 g Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 9429, Polydispersität 2,02) wurden in 16,0 ml Dichlormethan gelöst und hohen Scherkräften ausgesetzt (Ystral-1500-Homogenisator). Dazu wurden 4 ml einer wäßrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung (20 mg/ml) zugetropft. Nach Zugabe weiterer 40 ml destillierten Wassers wurde eine feine weiße Dispersion erhalten. Das Dichlormethan wurde dann in einem Rotationsverdampfer abgezogen. Die Dispersion wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Dieses Natriumsalz des Polymers wurde anschließend unter Vakuum bei Raumtemperatur vor Gebrauch gelagert.
  • 120,80 mg des Natriumsalzes des Polymers wurden in 2,0 ml destilliertem Wasser dispergiert. 4,95 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-5000-[Met–1, Ser17]hu-G-CSF (8,08 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde zu der Suspension gegeben und gemischt. Weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots destilliertes Wasser wurden zum Spülen des Glasgeräts verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 65°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 80 mg geschnitten. Die Depots wurden dann in Plastikfläschchen mit 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Ser17]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • Beispiel 7
  • PEG-5000-[Met–1, g11,16 Ser17,27,60,65]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung
  • A. Eisessig-Verfahren
  • 120,72 mg Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 9429, Polydispersität 2,02) wurden in 2,0 ml anhydridfreiem Eisessig gelöst. 3,47 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-5000-[Met–1, Arg11,16, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF (siehe Referenzbeispiel 19) (11,53 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 65°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 65 mg geschnitten. Die Depots wurden danach in Plastikfläschchen mit jeweils 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Arg11,16, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • B. Wäßriges Verfahren
  • 4,0 g Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 9429, Polydispersität 2,02) wurden in 16,0 ml Dichlormethan gelöst und hohen Scherkräften ausgesetzt (Ystral-1500-Homogenisator). Dazu wurden 4 ml einer wäßrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung (20 mg/ml) zugetropft. Nach Zugabe weiterer 40 ml destillierten Wassers wurde eine feine weiße Dispersion erhalten. Das Dichlormethan wurde dann in einem Rotationsverdampfer abgezogen. Die Dispersion wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet.
  • Dieses Natriumsalz des Polymers wurde anschließend unter Vakuum bei Raumtemperatur vor Gebrauch gelagert.
  • 119,71 mg des Natriumsalzes des Polymers wurden in 2,0 ml destilliertem Wasser dispergiert. 3,47 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-5000-[Met–1, Arg11,16, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF (11, 53 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde zu der Suspension gegeben und gemischt. Weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots destilliertes Wasser wurden zum Spülen des Glasgeräts verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 65°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 70 mg geschnitten. Die Depots wurden dann in Plastikfläschchen mit 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Arg11,16, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • Beispiel 8
  • PEG-5000-[Met–1, Arg11,23, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung
  • A. Eisessig-Verfahren
  • 120,11 mg Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 9429, Polydispersität 2,02) wurden in 2,0 ml anhydridfreiem Eisessig gelöst. 3,66 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-5000-[Met–1, Arg11,23, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF (siehe Referenzbeispiel 14) (10,93 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 65°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 80 mg geschnitten. Die Depots wurden danach in Plastikfläschchen mit jeweils 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Arg11,23, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • B. Wäßriges Verfahren
  • 4,0 g Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 9429 Polydispersität 2,02) wurden in 16,0 ml Dichlormethan gelöst und hohen Scherkräften ausgesetzt (Ystral-1500-Homogenisator). Dazu wurden 4 ml einer wäßrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung (20 mg/ml) zugetropft. Nach Zugabe weiterer 40 ml destillierten Wassers wurde eine feine weiße Dispersion erhalten. Das Dichlormethan wurde dann in einem Rotationsverdampfer abgezogen. Die Dispersion wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Dieses Natriumsalz des Polymers wurde anschließend unter Vakuum bei Raumtemperatur vor Gebrauch gelagert.
  • 120,71 mg des Natriumsalzes des Polymers wurden in 2,0 ml destilliertem Wasser dispergiert. 3,66 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-5000-[Met–1, Arg11,23, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF (10,93 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde zu der Suspension gegeben und gemischt. Weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots destilliertes Wasser wurden zum Spülen des Glasgeräts verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 65°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 70 mg geschnitten. Die Depots wurden dann in Plastikfläschchen mit 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Arg11,23, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • Beispiel 9
  • PEG-5000-[Met–1, Arg11,34, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung
  • A. Eisessig-Verfahren
  • 120,65 mg Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 10691, Polydispersität 1,75) wurden in 2,0 ml anhydridfreiem Eisessig gelöst. 3,810 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-5000-[Met–1, Arg11,34, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF (siehe Referenzbeispiel 20) (10,5 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 90°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt . Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 70 mg geschnitten. Die Depots wurden danach in Plastikfläschchen mit jeweils 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Arg11,34, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • B. Wäßriges Verfahren
  • 5,0 g Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 10691 Polydispersität 1,75) wurden in 20 ml Dichlormethan gelöst und hohen Scherkräften ausgesetzt (Ystral-1500-Homogenisator). Dazu wurden 5 ml einer wäßrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung (20 mg/ml) zugetropft. Nach Zugabe weiterer 50 ml destillierten Wassers wurde eine feine weiße Dispersion erhalten. Das Dichlormethan wurde dann in einem Rotationsverdampfer abgezogen. Die Dispersion wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Dieses Natriumsalz des Polymers wurde anschließend unter Vakuum bei Raumtemperatur vor Gebrauch gelagert.
  • 120,15 mg des Natriumsalzes des Polymers wurden in 2,0 ml destilliertem Wasser dispergiert. 3,810 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-5000-[Met–1, Arg11,34, Ser17,27,60,65] hu-G-CSF (10,5 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde zu der Suspension gegeben und gemischt. Weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots destilliertes Wasser wurden zum Spülen des Glasgeräts verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 90°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 75 mg geschnitten. Die Depots wurden dann in Plastikfläschchen mit 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Arg11,34, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • Beispiel 10
  • PEG-5000-[Met–1, Arg11,40, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung
  • A. Eisessig-Verfahren
  • 120,74 mg Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 10691, Polydispersität 1,75) wurden in 2,0 ml anhydridfreiem Eisessig gelöst. 3,77 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-5000-[Met–1, Arg11,40, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF (siehe Referenzbeispiel 21) (10,6 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 95°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 85 mg geschnitten. Die Depots wurden danach in Plastikfläschchen mit jeweils 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Arg11,40, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • B. Wäßriges Verfahren
  • 5,0 g Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 10691, Polydispersität 1,75) wurden in 20 ml Dichlormethan gelöst und hohen Scherkräften ausgesetzt (Ystral-1500-Homogenisator). Dazu wurden 5 ml einer wäßrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung (20 mg/ml) zugetropft. Nach Zugabe weiterer 50 ml destillierten Wassers wurde eine feine weiße Dispersion erhalten. Das Dichlormethan wurde dann in einem Rotationsverdampfer abgezogen. Die Dispersion wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Dieses Natriumsalz des Polymers wurde anschließend unter Vakuum bei Raumtemperatur vor Gebrauch gelagert.
  • 120,20 mg des Natriumsalzes des Polymers wurden in 2,0 ml destilliertem Wasser dispergiert. 3,77 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-5000-[Met–1, Arg11,40, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF (10,6 mg/ml) wurden gefrier-getrocknet und danach in weiteren 2,0 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde zu der Suspension gegeben und gemischt. Weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots destilliertes Wasser wurden zum Spülen des Glasgeräts verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 95°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 72 mg geschnitten. Die Depots wurden dann in Plastikfläschchen mit 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Arg11,40, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • Beispiel 11
  • PEG-5000-[Met–1, Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5,11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung
  • A. Eisessig-Verfahren
  • 119,79 mg Polylactid (60 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 10691, Polydispersität 1,75) wurden in 2,0 ml anhydridfreiem Eisessig gelöst. 3,175 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-5000-[Met–1, Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5,11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF(siehe Referenzbeispiel 22) (12,6 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 95°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 80 mg geschnitten. Die Depots wurden danach in Plastikfläschchen mit jeweils 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5,11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • B. Wäßriges Verfahren
  • 5,0 g Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 10691, Polydispersität 1,75) wurden in 20 ml Dichlormethan gelöst und hohen Scherkräften ausgesetzt (Ystral-1500-Homogenisator). Dazu wurden 5 ml einer wäßrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung (20 mg/ml) zugetropft. Nach Zugabe weiterer 50 ml destillierten Wassers wurde eine feine weiße Dispersion erhalten. Das Dichlormethan wurde dann in einem Rotationsverdampfer abgezogen. Die Dispersion wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Dieses Natriumsalz des Polymers wurde anschließend unter Vakuum bei Raumtemperatur vor Gebrauch gelagert.
  • 119,67 mg des Natriumsalzes des Polymers wurden in 2,0 ml destilliertem Wasser dispergiert. 3,175 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-5000-[Met–1, Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5,11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF (12,6 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde zu der Suspension gegeben und gemischt. Weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots destilliertes Wasser wurden zum Spülen des Glasgeräts verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 95°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 90 mg geschnitten. Die Depots wurden dann in Plastikfläschchen mit 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG 5000-[Met–1, Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5,11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • Beispiel 12
  • PEG-5000-[Met–1, Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Arg30]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung
  • A. Eisessig-Verfahren
  • 120,25 mg Polylactid (60 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 10691, Polydispersität 1,75) wurden in 2,0 ml anhydridfreiem Eisessig gelöst. 2,899 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-5000-[Met–1, Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Arg30] hu-G-CSF (siehe Referenzbeispiel 15) (13,8 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 90°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 100 mg geschnitten. Die Depots wurden danach in Plastikfläschchen mit jeweils 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000- [Met–1, Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Arg30]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • B. Wäßriges Verfahren
  • 5,0 g Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 10691, Polydispersität 1,75) wurden in 20 ml Dichlormethan gelöst und hohen Scherkräften ausgesetzt (Ystral-1500-Homogenisator). Dazu wurden 5 ml einer wäßrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung (20 mg/ml) zugetropft. Nach Zugabe weiterer 50 ml destillierten Wassers wurde eine feine weiße Dispersion erhalten. Das Dichlormethan wurde dann in einem Rotationsverdampfer abgezogen. Die Dispersion wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Dieses Natriumsalz oder das Polymer wurde anschließend unter Vakuum bei Raumtemperatur vor Gebrauch gelagert.
  • 120,37 mg des Natriumsalzes des Polymers wurden in 2,0 ml destilliertem Wasser dispergiert. 2,899 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-5000-[Met–1, Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Arg30]hu-G-CSF (13,8 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde zu der Suspension gegeben und gemischt. Weitere 4 × 0,5-ml-destilliertes Wasser wurden zum Spülen des Glasgeräts verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 95°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 100 mg geschnitten. Die Depots wurden dann in Plastikfläschchen mit 2,0 ml 0,02 w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Arg30]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • Beispiel 13
  • PEG-5000-[Met–1, Ser17,27,115,116, Glu111]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung
  • A. Eisessig-Verfahren
  • 120,80 mg Polylactid (60 Gew.-% d, L-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 10691, Polydispersität 1,75) wurden in 2,0 ml anhydridfreiem Eisessig gelöst. 3,333 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-5000-[Met–1, Ser17,27,115,116, Glu111]hu-G-CSF (siehe Referenzbeispiel 16) (12,0 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 90°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 95 mg geschnitten. Die Depots wurden danach in Plastikfläschchen mit jeweils 2,0 ml 0,02 w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Ser17,27,115,116, Glu111]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • B. Wäßriges Verfahren
  • 5,0 g Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 10691, Polydispersität 1,75) wurden in 20 ml Dichlormethan gelöst und hohen Scherkräften ausgesetzt (Ystral-1500-Homogenisator). Dazu wurden 5,0 ml einer wäßrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung (20 mg/ml) zugetropft. Nach Zugabe weiterer 50 ml destillierten Wassers wurde eine feine weiße Dispersion erhalten. Das Dichlormethan wurde dann in einem Rotationsverdampfer abgezogen. Die Dispersion wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Dieses Natriumsalz des Polymers wurde anschließend unter Vakuum bei Raumtemperatur vor Gebrauch gelagert.
  • 119,83 mg des Natriumsalzes des Polymers wurden in 2,0 ml destilliertem Wasser dispergiert. 3,333 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-5000-[Met–1, Ser17,27,115,116, Glu111]hu-G-CSF (12,0 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde zu der Suspension gegeben und gemischt. Weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots destilliertes Wasser wurden zum Spülen des Glasgeräts verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 95°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 95 mg geschnitten. Die Depots wurden dann in Plastikfläschchen mit 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Ser17,27,115,116, Glu111]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • Beispiel 14
  • PEG-5000-[Met–1, Arg11,165, Ser17,27, Lys58]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung
  • A. Eisessig-Verfahren
  • 119,28 mg Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 10691, Polydispersität 1,75) wurden in 2,0 ml anhydridfreiem Eisessig gelöst. 2,224 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-5000-[Met–1, Arg11,165, Ser17,27, Lys58]hu-G-CSF (17,907 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 90°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt . Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 100 mg geschnitten. Die Depots wurden danach in Plastikfläschchen mit jeweils 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000- [Met–1, Arg11,165, Ser17,27, Lys58]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • B. Wäßriges Verfahren
  • 5,0 g Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 10691, Polydispersität 1,75) wurden in 20 ml Dichlormethan gelöst und hohen Scherkräften ausgesetzt (Ystral-1500-Homogenisator). Dazu wurden 5,0 ml einer wäßrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung (20 mg/ml) zugetropft. Nach Zugabe weiterer 50 ml destillierten Wassers wurde eine feine weiße Dispersion erhalten. Das Dichlormethan wurde dann in einem Rotationsverdampfer abgezogen. Die Dispersion wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Dieses Natriumsalz des Polymers wurde anschließend unter Vakuum bei Raumtemperatur vor Gebrauch gelagert.
  • 119,82 mg des Natriumsalzes des Polymers wurden in 2,0 ml destilliertem Wasser dispergiert. 2,224 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-5000-[Met–1, Arg11,165, Ser17,27, Lys58]hu-G-CSF (17,985 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde zu der Suspension gegeben und gemischt. Weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots destilliertes Wasser wurden zum Spülen des Glasgeräts verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 95°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 90 mg geschnitten. Die Depots wurden dann in Plastikfläschchen mit 2,0 ml 0,02 w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Arg11,165, Ser17,27, Lys58]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • Beispiel 15
  • PEG-5000-[Met–1, Ser17,27, Lys49,58, Ala44,51,55]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung
  • A. Eisessig-Verfahren
  • 119,83 mg Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 10691, Polydispersität 1,75) wurden in 2,0 ml anhydridfreiem Eisessig gelöst. 2,317 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-5000-[Met–1, Ser17,27, Lys49,58, Ala44,51,55]hu-G-CSF (siehe Referenzbeispiel 18) (17,262 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 90°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 100 mg geschnitten. Die Depots wurden danach in Plastikfläschchen mit jeweils 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Ser17,27, Lys49,58 Ala44,51,55 HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • B. Wäßriges Verfahren
  • 5,0 g Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 10691, Polydispersität 1,75) wurden in 20 ml Dichlormethan gelöst und hohen Scherkräften ausgesetzt (Ystral-1500-Homogenisator). Dazu wurden 5,0 ml einer wäßrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung (20 mg/ml) zugetropft. Nach Zugabe weiterer 50 ml destillierten Wassers wurde eine feine weiße Dispersion erhalten. Das Dichlormethan wurde dann in einem Rotationsverdampfer abgezogen. Die Dispersion wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Dieses Natriumsalz des Polymers wurde anschließend unter Vakuum bei Raumtemperatur vor Gebrauch gelagert.
  • 120,82 mg des Natriumsalzes des Polymers wurden in 2,0 ml destilliertem Wasser dispergiert. 2,317 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-5000-[Met–1, Ser17,27, Lys49,58, Ala44,51,55]hu-G-CSF (17,2 62 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde zu der Suspension gegeben und gemischt. Weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots destilliertes Wasser wurden zum Spülen des Glasgeräts verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 95°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 100 mg geschnitten. Die Depots wurden dann in Plastikfläschchen mit 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Ser17,27, Lys49,58, Ala44,51,55]-hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • Beispiel 16
  • PEG-750-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung
  • Eisessig-Verfahren
  • 150,11 mg Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 10691, Polydispersität 1,75) wurden in 2,0 ml anhydridfreiem Eisessig gelöst. 4,678 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-750-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF (siehe Referenzbeispiel 24) (8,55 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 90°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 75 mg geschnitten. Die Depots wurden danach in Plastikfläschchen mit jeweils 2,0 ml 0,02 w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-750-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • Beispiel 17
  • PEG-2000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung
  • A. Eisessig-Verfahren
  • 140,32 mg Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 10691, Polydispersität 1,75) wurden in 2,0 ml anhydridfreiem Eisessig gelöst. 4,695 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-2000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF (siehe Referenzbeispiel 23) (8,52 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 90°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 70 mg geschnitten. Die Depots wurden danach in Plastikfläschchen mit jeweils 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-2000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • B. Wäßriges Verfahren
  • 5,0 g Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 10691, Polydispersität 1,75) wurden in 20 ml Dichlormethan gelöst und hohen Scherkräften ausgesetzt (Ystral-1500-Homogenisator). Dazu wurden 5,0 ml einer wäßrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung (20 mg/ml) zugetropft. Nach Zugabe weiterer 50 ml destillierten Wassers wurde eine feine weiße Dispersion erhalten. Das Dichlormethan wurde dann in einem Rotationsverdampfer abgezogen. Die Dispersion wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Dieses Natriumsalz des Polymers wurde anschließend unter Vakuum bei Raumtemperatur vor Gebrauch gelagert.
  • 140,85 mg des Natriumsalzes des Polymers wurden in 2,0 ml destilliertem Wasser dispergiert. 4,695 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-2000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65] hu-G-CSF (8,25 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde zu der Suspension gegeben und gemischt. Weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots destilliertes Wasser wurden zum Spülen des Glasgeräts verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 90°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 70 mg geschnitten. Die Depots wurden dann in Plastikfläschchen mit 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-2000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 1 unten).
  • TABELLE 1A
    Figure 00850001
  • Die oben verwendeten Begriffe „GAA" und „Aq" beziehen sich auf das Eisessig-Verfahren bzw. das wäßrige Verfahren für die Formulierung.
  • TABELLE 1B
    Figure 00860001
  • Figure 00870001
  • TABELLE 1B (Fortsetzung)
    Figure 00870002
  • Beispiel 18
  • PEG-5000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung (Lactid; Glykolid 80 : 20)
  • A. Eisessig-Verfahren (5,52% Proteinbeladung)
  • 158,91 mg Polylactid (80 Gew.-% d,l-Lactid/20 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 7952, Polydispersität 2,01) wurden in 2,0 ml anhydridfreiem Eisessig gelöst. 41,90 mg einer gefriergetrockneten Präparation von PEG-5000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurden in weiteren 2,0 ml Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt und zum Spülen des Glasgeräts weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach durch Eintropfen in flüssigen Stickstoff gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 75°C erhitzten Platten gründlich vermischt und zu Depots mit einem Gewicht von etwa 80 mg geformt. Die Depots wurden dann in Plastikfläschchen mit 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet.
  • Figure 00880001
  • Beispiel 19
  • PEG-5000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung [80% (Lactid : Glykolid 50 : 50)/20% Methylpolyethylenglykol 2000]
  • A. Eisessig-Verfahren (5,23% Proteinbeladung)
  • 159,87 mg eines Hydrogels (80,7 Gew.-% d,l-Lactid/Glykolid-Copolymer, 19,3 Gew.-% 2000 MePEG) wurden in 2,0 ml anhydridfreiem Eisessig gelöst. 40,26 mg einer gefriergetrockneten Präparation von PEG-5000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF (26,46 Gew.-% Protein) wurden in weiteren 2,0 ml Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach durch Eintropfen in flüssigen Stickstoff gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 60°C erhitzten Platten gründlich vermischt und zu Depots mit einem Gewicht von etwa 80 mg geformt. Die Depots wurden dann in Plastikfläschchen mit 2,0 ml 0,02 w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet.
  • Figure 00890001
  • Beispiel 20
  • PEG-5000- [Met–1, Arg11 Ser17,27,60,65]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung [80% (Lactid : Glykolid 100 : 0)/20% Methylpolyethylenglykol 2000]
  • A. Eisessig-Verfahren (5,23 Proteinbeladung)
  • 159,70 mg eines Hydrogels (82,5 Gew.-% Poly d,l-Lactid, 17,5 Gew.-% 2000 MePEG) wurden in 2,0 ml anhydridfreiem Eisessig gelöst. 39,50 mg einer gefriergetrockneten Präparation von PEG-5000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF (26,46 Gew.-% Protein) wurden in weiteren 2,0 ml Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach durch Eintropfen in flüssigen Stickstoff gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 60°C erhitzten Platten gründlich vermischt und zu Depots mit einem Gewicht von etwa 70 mg geformt. Die Depots wurden dann in Plastikfläschchen mit 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet.
  • Figure 00900001
  • Beispiel 21
  • PEG-5000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung (Lactid : Glykolid 50 : 50)
  • A. Eisessig-Verfahren (4,14% Proteinbeladung)
  • 160,34 mg Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 9827, Polydispersität 2,18) wurden in 2,0 ml anhydridfreiem Eisessig gelöst. 40,73 mg einer gefriergetrockneten Präparation von PEG-5000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurden in weiteren 2,0 ml Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach durch Eintropfen in flüssigen Stickstoff gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 60°C erhitzten Platten gründlich vermischt und zu Depots mit einem Gewicht von etwa 60 mg geformt. Die Depots wurden dann in Plastikfläschchen mit 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet.
  • Figure 00910001
  • Beispiel 22
  • PEG-5000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung (Lactid : Glykolid 75 : 25)
  • Eisessig-Verfahren
  • 161,46 mg Polylactid (75 Gew.-% d,l-Lactid/25 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 12938, Polydispersität 1,81) wurden in 2,0 ml anhydridfreiem Eisessig gelöst. 39,03 mg einer gefriergetrockneten Präparation von PEG TG50 wurden in weiteren 2,0 ml Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach durch Eintropfen in flüssigen Stickstoff gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 75°C erhitzten Platten gründlich vermischt und zu Depots mit einem Gewicht von etwa 80 mg geformt. Die Depots wurden dann in Plastikfläschchen mit 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet.
  • Figure 00920001
  • Beispiel 23
  • PEG-5000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung (Lactid : Glykolid 100 : 0)
  • B. Eisessig-Verfahren (5,37% Proteinbeladung)
  • 158,67 mg Polylactid (100 Gew.-% d,l-Lactid/0 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 9042, Polydispersität 1,96) wurden in 2,0 ml anhydridfreiem Eisessig gelöst. 40,42 mg einer gefriergetrockneten Präparation von PEG-5000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurden in weiteren 2,0 ml Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach durch Eintropfen in flüssigen Stickstoff gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 75°C erhitzten Platten gründlich vermischt und zu Depots mit einem Gewicht von etwa 70 mg geformt. Die Depots wurden dann in Plastikfläschchen mit 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. In regelmäßigen Abständen wurde das wäßrige Medium entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet.
  • Figure 00930001
  • Beispiel 24
  • PEG-5000-[Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung – wäßriges Verfahren
  • i) Formulierung G (20% Proteinbeladung)
  • 4,0 g Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid, 50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 7673, Polydispersität 2,59) wurden in 12 ml Dichlormethan gelöst und hohen Scherkräften ausgesetzt (Ystral-1500-Homogenisator). Dazu wurden 4 ml wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung (20 mg/ml) zugetropft. Nach Zugabe von weiteren 60 ml destilliertem Wasser wurde eine feine weiße Dispersion erhalten. Das Dichlormethan wurde in einem Rotationsverdampfer abgedampft. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Dieses Natriumsalz des Polymers wurde anschließend unter Vakuum bei Raumtemperatur gelagert. 160,31 mg des Natriumsalzes des Polymers wurden in 2 ml destilliertem Wasser dispergiert. 4,396 ml einer wäßrigen Lösung von PEG-5000-[Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF (9, 1 mg/ml) wurden mit destilliertem Wasser auf 5 mg/ml verdünnt und zu der Polymersalzsuspension gegeben. Zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots destilliertes Wasser verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 90°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach bei dieser Temperatur zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 105 mg geschnitten. Danach wurden die Depots in Plastikfläschchen mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID, 0,02 Natriumazid gegeben und bei 37°C gelagert. Das wäßrige Medium wurde in regelmäßigen Abständen entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet.
  • ii) Formulierung H (20% Proteinbeladung)
  • 4,0 g Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid, 50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 7791,2, Polydispersität 2,65) wurden in 16 ml Dichlormethan gelöst und hohen Scherkräften ausgesetzt (Ystral-1500-Homogenisator). Dazu wurden 4 ml wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung (20 mg/ml) zugetropft. Nach Zugabe von weiteren 40 ml destilliertem Wasser wurde eine feine weiße Dispersion erhalten. Das Dichlormethan wurde in einem Rotationsverdampfer abgedampft. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Dieses Natriumsalz des Polymers wurde anschließend unter Vakuum bei Raumtemperatur gelagert.
  • 89,84 mg des Natriumsalzes des Polymers wurden in 2 ml destilliertem Wasser dispergiert. 3,33 ml einer wäßrigen Lösung von PEG-5000-[Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF (9 mg/ml) wurden zu der Polymersalzsuspension gegeben. Zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots destilliertes Wasser verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 95°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach bei dieser Temperatur zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 63 mg geschnitten. Danach wurden die Depots in Plastikfläschchen mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID, 0,02% Natriumazid gegeben und bei 37°C gelagert. Das wäßrige Medium wurde in regelmäßigen Abständen entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet. Ein Vergleich der kumulativen Freisetzung für die Formulierungen G und H ist in 15 dargestellt.
  • Vergleichsbeispiel 3
  • [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF allein enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung – wäßriges Verfahren
  • Formulierung I (20% Proteinbeladung)
  • 4,0 g Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid, 50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 7791,2, Polydispersität 2,65) wurden in 16 ml Dichlormethan gelöst und hohen Scherkräften ausgesetzt (Ystral-1500-Homogenisator). Dazu wurden 4 ml wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung (20 mg/ml) zugetropft. Nach Zugabe von weiteren 40 ml destilliertem Wasser wurde eine feine weiße Dispersion erhalten. Das Dichlormethan wurde in einem Rotationsverdampfer abgedampft. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Dieses Natriumsalz des Polymers wurde anschließend unter Vakuum bei Raumtemperatur gelagert.
  • 160,20 mg des Natriumsalzes des Polymers wurden in 2 ml destilliertem Wasser dispergiert. 4,000 ml einer wäßrigen Lösung von [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF (10, 0 mg/ml) wurden mit destilliertem Wasser auf 5 mg/ml verdünnt und zu der Polymersalzsuspension gegeben. Zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots destilliertes Wasser verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 95°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach bei dieser Temperatur zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 81 mg geschnitten. Danach wurden die Depots in Plastikfläschchen mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID, 0,02% Natriumazid gegeben und bei 37°C gelagert. Das wäßrige Medium wurde in regelmäßigen Abständen entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet. Die kumulative Proteinfreisetzung für die Formulierung I ist in 16 dargestellt.
  • Vergleichsbeispiel 4
  • [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF und Methyl-PEG-5000 enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung – wäßriges Verfahren
  • Formulierung J (20% Proteinbeladung)
  • 4,0 g Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid, 50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 7791,2, Polydispersität 2,65) wurden in 16 ml Dichlormethan gelöst und hohen Scherkräften ausgesetzt (Ystral-1500-Homogenisator). Dazu wurden 4 ml wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung (20 mg/ml) zugetropft. Nach Zugabe von weiteren 40 ml destilliertem Wasser wurde eine feine weiße Dispersion erhalten. Das Dichlormethan wurde in einem Rotationsverdampfer abgedampft. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Dieses Natriumsalz des Polymers wurde anschließend unter Vakuum bei Raumtemperatur gelagert.
  • 119,77 mg des Natriumsalzes des Polymers wurden in 2 ml destilliertem Wasser dispergiert. 4,000 ml einer wäßrigen Lösung von [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF (10,0 mg/ml) wurden mit einer 40,43 mg Methyl-PEG-5000 enthaltenden wäßrigen Lösung auf 5 mg/ml verdünnt und zu der Polymersalzsuspersion gegeben. Zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots destilliertes Wasser verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 95°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach bei dieser Temperatur zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 83 mg geschnitten. Danach wurden die Depots in Plastikfläschchen mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID, 0,02% Natriumazid gegeben und bei 37°C gelagert. Das wäßrige Medium wurde in regelmäßigen Abständen entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet. Die kumulative Proteinfreisetzung für die Formulierung J ist in 16 dargestellt.
  • Beispiel 25
  • PEG-5000-[Met–1, Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Lys30]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung – wäßriges Verfahren
  • Formulierung K (20% Proteinbeladung)
  • 4,0 g Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid, 50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 7791,2, Polydispersität 2,65) wurden in 16 ml Dichlormethan gelöst und hohen Scherkräften ausgesetzt (Ystral-1500-Homogenisator). Dazu wurden 4 ml wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung (20 mg/ml) zugetropft. Nach Zugabe von weiteren 40 ml destilliertem Wasser wurde eine feine weiße Dispersion erhalten. Das Dichlormethan wurde in einem Rotationsverdampfer abgedampft. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Dieses Natriumsalz des Polymers wurde anschließend unter Vakuum bei Raumtemperatur gelagert.
  • 120,8 mg des Natriumsalzes des Polymers wurden in 2 ml destilliertem Wasser dispergiert. 3,738 ml einer wäßrigen Lösung von PEG-5000-[Met–1, Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Lys30]hu-G-CSF (10,7 mg/ml) wurden zu der Polymersalzsuspension gegeben. Zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots destilliertes Wasser verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 80°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach bei dieser Temperatur zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 95 mg geschnitten. Danach wurden die Depots in Plastikfläschchen mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID, 0,02% Natriumazid gegeben und bei 37°C gelagert. Das wäßrige Medium wurde in regelmäßigen Abständen entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Lys30]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet. Die kumulative Proteinfreisetzung für die Formulierung K ist in 17 dargestellt.
  • Beispiel 26
  • PEG-5000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung – wäßriges Verfahren
  • A. Wäßriges Verfahren
  • i) Formulierung L (20% Proteinbeladung)
  • 4,0 g Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid, 50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 7791,2, Polydispersität 2,65) wurden in 16 ml Dichlormethan gelöst und hohen Scherkräften ausgesetzt (Ystral-1500-Homogenisator). Dazu wurden 4 ml wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung (20 mg/ml) zugetropft. Nach Zugabe von weiteren 40 ml destilliertem Wasser wurde eine feine weiße Dispersion erhalten. Das Dichlormethan wurde in einem Rotationsverdampfer abgedampft. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Dieses Natriumsalz des Polymers wurde anschließend unter Vakuum bei Raumtemperatur gelagert.
  • 120,5 mg des Natriumsalzes des Polymers wurden in 2 ml destilliertem Wasser dispergiert. 3,478 ml einer wäßrigen Lösung von PEG-5000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF (11,5 mg/ml) wurden zu der Polymersalzsuspension gegeben. Zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots destilliertes Wasser verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 90°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach bei dieser Temperatur zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 84 mg geschnitten. Danach wurden die Depots in Plastikfläschchen mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID, 0,02% Natriumazid gegeben und bei 37°C gelagert. Das wäßrige Medium wurde in regelmäßigen Abständen entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-[Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet. Die kumulative Proteinfreisetzung für die Formulierung L ist in 18 dargestellt.
  • Vergleichsbeispiel 5
  • [Met–1, Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Lys30]hu-G-CSF allein enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung – wäßriges Verfahren
  • Formulierung M (20% Proteinbeladung)
  • 4,0 g Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid, 50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 7673, Polydispersität 2,59) wurden in 12 ml Dichlormethan gelöst und hohen Scherkräften ausgesetzt (Ystral-1500-Homogenisator). Dazu wurden 4 ml wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung (20 mg/ml) zugetropft. Nach Zugabe von weiteren 60 ml destilliertem Wasser wurde eine feine weiße Dispersion erhalten. Das Dichlormethan wurde in einem Rotationsverdampfer abgedampft. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Dieses Natriumsalz des Polymers wurde anschließend unter Vakuum bei Raumtemperatur gelagert.
  • 160,98 mg des Natriumsalzes des Polymers wurden in 2 ml destilliertem Wasser dispergiert. 4,124 ml einer wäßrigen Lösung von [Met–1, Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Lys30]hu-G-CSF (9,7 mg/ml) wurden mit destilliertem Wasser auf 5,0 mg/ml verdünnt und zu der Polymersalzsuspension gegeben. Zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots destilliertes Wasser verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 75°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach bei dieser Temperatur zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 81 mg geschnitten. Danach wurden die Depots in Plastikfläschchen mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID, 0,02 Natriumazid gegeben und bei 37°C gelagert. Das wäßrige Medium wurde in regelmäßigen Abständen entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von [Met–1, Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Lys30]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet. Die kumulative Proteinfreisetzung für die Formulierung M ist in 17 dargestellt.
  • Vergleichsbeispiel 6
  • [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung
  • Formulierung N (20% Proteinbeladung)
  • 2,0 g Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid, 50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 7673, Polydispersität 2,59) wurden in 8 ml Dichlormethan gelöst und hohen Scherkräften ausgesetzt (Ystral-1500-Homogenisator). Dazu wurden 2 ml wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung (20 mg/ml) zugetropft. Nach Zugabe von weiteren 30 ml destilliertem Wasser wurde eine feine weiße Dispersion erhalten. Das Dichlormethan wurde in einem Rotationsverdampfer abgedampft. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Dieses Natriumsalz des Polymers wurde anschließend unter Vakuum bei Raumtemperatur gelagert.
  • 159,99 mg des Natriumsalzes des Polymers wurden in 2 ml destilliertem Wasser dispergiert. 3,988 ml einer wäßrigen Lösung von [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF (10,03 mg/ml) wurden mit destilliertem Wasser auf 5,0 mg/ml verdünnt und zu der Polymersalzsuspension gegeben. Zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots destilliertes Wasser verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 95°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach bei dieser Temperatur zu einer 1 mm dicken Tafel geformt. Die Tafel wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 81 mg geschnitten. Danach wurden die Depots in Plastikfläschchen mit 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID, 0,02 Natriumazid gegeben und bei 37°C gelagert. Das wäßrige Medium wurde in regelmäßigen Abständen entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet. Die kumulative Proteinfreisetzung für die Formulierung N ist in 18 dargestellt.
  • Beispiel 27
  • PEG-5000-menschliches Calcitonin pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung
  • A. Eisessig-Verfahren (5,0% w/w Proteinbeladung)
  • 396,23 mg Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 10691, Polydispersität 1,75) wurden in 4,0 ml anhydridfreiem Eisessig gelöst. 2,955 ml einer wäßrigen Lösung von PEG-5000-menschliches Calcitonin (8,46 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und dann in weiteren 2,0 ml Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 1,0 ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach durch Eintragen in flüssigen Stickstoff gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 75°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach über eine 16-Gauge-Öffnung extrudiert. Das Extrudat wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 10 mg geschnitten. Die Depots wurde dann in Plastikfläschchen mit 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. Das wäßrige Medium wurde in regelmäßigen Abständen entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-menschliches Calcitonin wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 2 unten).
  • B. Wäßriges Verfahren
  • 5,0 g Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 10691, Polydispersität 1,75) wurden in 20,0 ml Dichlormethan gelöst und hohen Scherkräften ausgesetzt (Ystral-1500-Homogenisator). Dazu wurden 5,00 ml einer wäßrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung (20 mg/ml) zugetropft. Nach Zugabe weiterer 50 ml destillierten Wassers wurde eine feine weiße Dispersion erhalten. Das Dichlormethan wurde dann in einem Rotationsverdampfer abgezogen. Die Dispersion wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Dieses Natriumsalz des Polymers wurde anschließend unter Vakuum bei Raumtemperatur vor Gebrauch gelagert.
  • 392,62 mg des Natriumsalzes des Polymers wurden in 4,0 ml destilliertem Wasser dispergiert. 2,955 ml einer wäßrigen Lösung aus PEG-5000-menschliches Calcitonin (8,46 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 2,0 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde zu der Suspension gegeben und gemischt. Weitere 4 x 1,0-ml-Aliquots destilliertes Wasser wurden zum Spülen des Glasgeräts verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach durch Eintragen in flüssigen Stickstoff gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 60°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach über eine 16-Gauge-Öffnung extrudiert. Das Extrudat wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 10 mg geschnitten. Die Depots wurden dann in Plastikfläschchen mit 2,0 ml 0,02 w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. Das wäßrige Medium wurde in regelmäßigen Abständen entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-menschliches Calcitonin wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 2 unten).
  • TABELLE 2
    Figure 01050001
  • Figure 01060001
  • Beispiel 28
  • Unpegyliertes menschliches Calcitonin enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung
  • A. Eisessig-Verfahren (5% w/w Proteinbeladung)
  • 473,50 mg Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 10691, Polydispersität 1,75) wurden in 4,0 ml anhydridfreiem Eisessig gelöst. 25,56 mg einer gefriergetrockneten Präparation von menschlichem Calcitonin wurden ebenfalls in weiteren 2,0 ml Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 1,0-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach durch Eintragen in flüssigen Stickstoff gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 75°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach über eine 16-Gauge-Öffnung extrudiert. Das Extrudat wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 10 mg geschnitten. Die Depots wurden dann in Plastikfläschchen mit 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. Das wäßrige Medium wurde in regelmäßigen Abständen entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-menschliches Calcitonin wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet. Analysen wurden an Tag 1, 2, 7, 8 und 16 durchgeführt, wobei kein Hinweis auf eine signifikante Freisetzung über diesen Zeitraum gefunden wurde.
  • B. Wäßriges Verfahren (5% w/w Proteinbeladung)
  • 5,0 g Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 10691, Polydispersität 1,75) wurden in 20,0 ml Dichlormethan gelöst und hohen Scherkräften ausgesetzt (Ystral-1500-Homogenisator). Dazu wurden 5,00 ml einer wäßrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung (20 mg/ml) zugetropft. Nach Zugabe weiterer 50 ml destillierten Wassers wurde eine feine weiße Dispersion erhalten. Das Dichlormethan wurde dann in einem Rotationsverdampfer abgezogen. Die Dispersion wurde unmittelbar danach in einem Bad aus Dichlormethan/Drikold gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Dieses Natriumsalz des Polymers wurde anschließend unter Vakuum bei Raumtemperatur vor Gebrauch gelagert. 474,84 mg des Natriumsalzes des Polymers wurden in 4,0 ml destilliertem Wasser dispergiert. 25,65 mg einer gefriergetrockneten Präparation von menschlichem Calcitonin wurden ebenfalls in 2,0 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wurde zu der Suspension gegeben und gemischt. Weitere 4 × 1,0-ml-Aliquots destilliertes Wasser wurden zum Spülen des Glasgeräts verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach durch Eintragen in flüssigen Stickstoff gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 55°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach über eine 16-Gauge-Öffnung extrudiert. Das Extrudat wurde in Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 10 mg geschnitten. Die Depots wurden dann in Plastikfläschchen mit 2,0 ml 0,02 w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. Das wäßrige Medium wurde in regelmäßigen Abständen entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-menschliches Calcitonin wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet. Analysen wurden an Tag 1, 2, 7, 8 und 16 durchgeführt, wobei kein Hinweis auf eine signifikante Freisetzung über diesen Zeitraum gefunden wurde.
  • Beispiel 29
  • PEG-5000-Interleukin-2 (PEG-5000-IL-2) enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung
  • Eisessig-Verfahren (20% w/w Proteinbeladung)
  • 113,42 mg Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 10691, Polydispersität 1,75) wurden in 2,0 ml anhydridfreiem Eisessig gelöst. 4,88 ml einer wäßrigen Lösung von PEG-5000-IL-2 (7,35 mg/ml) wurden gefriergetrocknet und danach in weiteren 1,0 ml Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach durch Eintragen in flüssigen Stickstoff gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 75°C erhitzten Platten gründlich vermischt und zu Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 30 mg geformt. Die Depots wurden danach in Plastikfläschchen mit 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. Das wäßrige Medium wurde in regelmäßigen Abständen entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von PEG-5000-IL-2 wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet (siehe Tabelle 3 unten).
  • TABELLE 3
    Figure 01090001
  • Beispiel 30
  • Unpegyliertes Interleukin-2 (IL-2) enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung mit kontinuierlicher Freisetzung
  • Eisessig-Verfahren (20% w/w Proteinbeladung)
  • 54,90 mg Polylactid (50 Gew.-% d,l-Lactid/50 Gew.-% Glykolid-Copolymer, Molekulargewicht im Gewichtsmittel 10691, Polydispersität 1,75) wurden in 4,0 ml anhydridfreiem Eisessig gelöst. 45,0 mg einer gefriergetrockneten Präparation von IL-2 wurden ebenfalls in weiteren 1,0 ml Eisessig gelöst. Die beiden Lösungen wurden gemischt, und zum Spülen des Glasgeräts wurden weitere 4 × 0,5-ml-Aliquots Eisessig verwendet. Die Lösung wurde unmittelbar danach durch Eintragen in flüssigen Stickstoff gefroren und über Nacht gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wurde unter Verwendung einer hydraulischen Presse mit auf 80°C erhitzten Platten gründlich vermischt und danach zu Depots mit einem Gewicht von jeweils etwa 30 mg geformt. Die Depots wurden dann in Plastikfläschchen mit 2,0 ml 0,02% w/v Natriumazidlösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung OXOID gegeben und bei 37°C gelagert. Das wäßrige Medium wurde in regelmäßigen Abständen entfernt und durch frischen Puffer ersetzt. Die Freisetzung von IL-2 wurde mittels HPLC-Analyse des Mediums bestimmt und die kumulative Proteinfreisetzung berechnet.
  • Analysen wurden an Tag 1, 2, 4, 8 und 16 durchgeführt, wobei kein Hinweis auf eine signifikante Freisetzung über diesen Zeitraum gefunden wurde.
  • Referenzbeispiel 1
  • Herstellung von mit Methyl-Polyethylenglykol 5000 modifiziertem menschlichem [Met–1]-G-CSF
  • A. Herstellung von menschlichem [Met–1]-G-CSF
  • a) Herstellung eines synthetischen Gens für menschlichen [Met–1]-G-CSF
  • Eine DNA-Sequenz (2 und SEQ ID No 45), die die Aminosäuresequenz des Polypeptids aus 2 (menschlicher G-CSF) codiert, wurde gemäß folgenden Gesichtspunkten konstruiert:
    • 1) Einzelsträngige kohäsive Termini, um die Ligation an geeigneten Stelle in einem Plasmid zu gestatten.
    • 2) Eine Reihe von Restriktionsendonucleasesequenzen über das gesamte Gen hinweg, um die nachfolgende genetische Manipulation zu erleichtern.
    • 3) Translationsterminationscodon.
    • 4) Als Codons am 5'-Ende des codierenden Bereichs wurden normalerweise A/T-reiche Codons gewählt. Andere Codons wurden normalerweise entsprechend den für Expression in E. coli bevorzugten Codons gewählt.
  • Das Gen wurde aus den im folgenden dargestellten 18 Oligonukleotiden (SEQ ID No. 1 – SEQ ID No. 18) zusammengesetzt.
  • Herstellung der Oligonukleotide
  • Die im folgenden dargestellten Oliconucleotidsequenzen wurden in einem DNA-Syntheseautomaten 380A von Applied Biosystems aus 5'-Dimethoxytrityl-basengeschützten Nucleosid-2-cyanoethyl-N,N-diisopropylphosphoramiditen und an „Controlled-Pore-Glass"-Träger gebundenen geschützten Nucleosiden in einem 0,2-Mikromol-Maßstab gemäß den von Applied Biosystems Inc. mitgelieferten Vorschriften hergestellt.
  • Als Alternative können die Oligonukleotidsequenzen mit manuellen Verfahren, wie sie von Atkinson und Smith in „Oligonukleotid Synthesis, a Practical Approach" (M. T. Gait, Herausgeber, IRL Press, Oxford, Washington DC, Seiten 35–81) beschrieben sind, hergestellt werden.
  • Im einzelnen wurde die Herstellung der Oligonukleotidsequenzen unter Verwendung des DNA- Syntheseautomaten 380A von Applied Biosystems wie folgt durchgeführt:
  • Die Oligonukleotide wurden nach Abspaltung vom festen Träger und Entfernung aller Schutzgruppen jeweils in Wasser (1 ml) gelöst. Zu den Oligonukleotidlösungen (400 μl) wurde jeweils eine Lösung aus 3 M Natriumacetat (pH 5,6; 40 μl) und Ethanol (1 ml) gegeben, und die Gemische wurden 20 Stunden bei –70°C gelagert. Die erhaltenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren (10 Minuten bei 13000 UpM) gesammelt und die Pellets mit Ethanol : Wasser (7 : 3) (200 μl) gewaschen, danach kurz im Vakuum getrocknet und in Wasser (15 μl) und 10 μl eines Formamid/Farbstoff-Gemischs (10 mM NaOH, 0,5 mM EDTA, 0,01% Bromphenolblau, 0,01% Xylencyanol, 80% Formamid gelöst.
  • Die Oligonukleotide wurden auf einem 10%igen Polyacrylamidgel in 50 mM Tris-Borat (pH 8,3) mit 8,3 M Harnstoff gereinigt. Oligonukleotide mit der korrekten Länge wurden mittels „UV Shadowing" (Narang et al., 1979 in Methods in Enzymology, Bd. 68, 90–98) identifiziert – normalerweise die stärkste Bande -, aus dem Gel ausgeschnitten und in 5 mM Tris-Borat (pH 8,3) 3–4 Stunden bei 300 mV elektroeluiert. Die wäßrigen Lösungen wurden auf etwa 200 μl durch Behandlung mit n-Butanol (Mischen, Zentrifugieren und Entfernen der oberen organischen Schicht) eingeengt. Die gereinigten Oligonukleotide wurden 20 Stunden bei –70°C aus einer 0,3 M Natriumacetatlösung durch Zugabe von Ethanol (2,5 Volumen) gefällt.
  • Konstruktion des Gens
  • Die Oligonukleotide SEQ ID No 2 – SEQ ID No 17 (jeweils 400 pM) [nachfolgend dargestellt] wurden mit T4-Polynucleotidkinase (3,6 Einheiten) 2 Stunden bei 37°C in 25 μl einer Lösung mit ATP (800 pM mit 25 pM Gamma-32p ATP), 100 μM Spermidin, 20 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl (pH 9,0) und 0,1 mM EDTA phosphoryliert. Die Lösungen wurden zur Beendigung der Reaktionen 5 Minuten bei 100°C erhitzt, danach paarweise, wie in Tabelle 1 gezeigt, unter Erhalt der Duplexe A bis I gemischt (Oligonukleotide SEQ ID No. 1 und SEQ ID No. 18 (400 mM in 25 μl) wurden jeweils unphosphoryliert eingesetzt). Nach Zugabe von 0,3 M Natriumacetat (pH 5,6, 200 μl) und Ethanol (850 μl) wurden die Duplexe 20 Stunden bei – 20°C gefällt. Die erhaltenen Niederschläge wurden durch Zentrifugieren gesammelt und mit Ethanol : Wasser (7 : 3) gewaschen und danach in Wasser (50 μl) gelöst. Die Oligonukleotidpaare wurden in einer Annealing-Reaktion aneinandergelagert, indem die Lösungen zunächst 2 Minuten bei 100°C im kochenden Wasserbad erhitzt wurden. Man ließ danach das Bad langsam auf 40°C abkühlen (in etwa 4 Stunden). Die Lösungen von 3 Paar Duplexen wurden unter Erhalt der Gruppen I bis III wie gezeigt kombiniert (siehe Tabelle 1), dann lyophilisiert und in 30 μl einer Lösung mit T4-DNA-Ligase (1 Einheit, BRL), 50 mM Tris (pH 7,6), 10 mM Magnesiumchlorid, 5% (w/v) PEG 8000, 1 mm ATP, 1 mm DTT (BRL, Focus Bd. 8 Nr. 1 Winter 1986) gelöst, und die DNA wurde 5 Minuten bei 30°C und anschließend 20 Stunden bei 16°C ligiert. Danach wurden 3 M Natriumacetat (20 μl) und Wasser (150 μl) zugegeben, und das Produkt wurde durch Zugabe von Ethanol (750 μl) und Abkühlen für 20 Stunden auf –20°C gefällt. Der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren gesammelt und mit Ethanol (1 ml) gewaschen, danach in Wasser (15 μl) und Formamid/Farbstoff-Gemisch (10 μl) gelöst und auf einem 10%igen Polyacrylamidgel in 50 mM Tris-Borat (pH 8,3), 1 mM EDTA und 8,3 M Harnstoff gereinigt. Banden der Stränge mit den entsprechenden Längen (173–186 Basen) wurden mittels Autoradiographie identifiziert und zusammen durch Elektroelution aus einem einzigen Gelstück isoliert, wie oben für einzelne Oligonukleotidesequenzen beschrieben. Die DNA-Stränge wurden einem Annealing unterzogen, indem zunächst eine wäßrige Lösung (50 μl) 2 Minuten bei 100°C erhitzt wurde und man diese dann über 4 Stunden auf 40°C abkühlen ließ. Die Gruppen I, II und III wurden im wesentlichen wie für die Gruppenherstellung beschrieben zusammenligiert, wobei als Produkt die in 8 gezeigte Gensequenz erhalten wurde. Nach Fällung wurde das Gen mit T4-Polynucleotidkinase, wie zuvor für einzelne Oligonukleotide beschrieben, phosphoryliert und danach in Wasser (20 μl) gelöst.
  • TABELLE 1
    Figure 01140001
  • b) Klonierung des synthetischen Gens für menschlichen [Met–1]-G-CSF
  • Das oben beschriebene synthetische Gen wurde in den Plasmidvektor pSTP1 (Windass et al., Nucleic Acids Research (1983) Bd. 10, S. 6639) kloniert.
  • Für die Vektorherstellung wurden 10 μg STP1 in Wasser (37,5 μl) und 10 × Restriktionspuffer B (4,5 μl) (BCL) gelöst. Danach wurde die Restriktionsendonuclease SalI (3 μl) (BCL, 8 Einheiten/μl) zugegeben und das Gemisch 1 Stunde bei 37°C inkubiert, bis das linearisierte Plasmid gegenüber den superhelikalen Formen und den Formen mit Einzelstrangbrüchen („Nicked"-Formen) überwiegt. Die DNA wurde 30 Minuten bei 4°C mit Ethanol gefällt, mit Ethanol : Wasser (7 : 3) gewaschen und danach in Wasser (39,5 μl), 10 × Puffer H (4,5 ml) (BCL) gelöst. Danach wurde die Restriktionsendonuclease EcoRI (1 μl) (BCL, 90 Einheiten/μl) zugegeben und das Gemisch 1 Stunde bei 37°C inkubiert, bis das große EcoRI-SalI-Fragment überwog. Die DNA wurde 20 Stunden bei –20°C gefällt, mit Ethanol : Wasser (7 : 3) gewaschen und danach in Wasser (20 μl) gelöst.
  • Das große EcoRI-SalI-Fragment wurde auf einem 1%igen präparativen Agarosegel gereinigt und wie zuvor beschrieben elektroeluiert und gefällt und danach in Wasser (20 μl) gelöst. Zur Ligation des synthetischen Gens wurde ein Gemisch aus Vektor-DNA (2 μl der EcoRI-SalI-Fragment-Lösung), synthetischem Gen (5 μl der zuvor beschriebenen wäßrigen Lösung, 5 × Ligasepuffer (6 μl –250 mM Tris pH 7,6 50 mM MgCl2, 25% w/v PEG 8000, 5 MM ATP, 5 mM DTT exBRL), Wasser (15 μl) und T4-DNA-Ligase (2 μl, 1 U/μl) 4 Stunden bei 16°C inkubiert. Das DNA-Reaktionsgemisch wurde direkt zur Transformation des E. coli-Stamms HB101 eingesetzt (entweder 1 μl des reinen Ligationsgemischs oder 2 μl Ligationsgemisch, 5 x verdünnt mit Wasser). Das DNA-Gemisch (1 bzw. 2 μl) wurde zu kompetenten E. coli-HB101-Zellen (20 μl, BRL) auf Eis gegeben und das Gemisch auf Eis 45 min inkubiert und danach 45 Sekunden einem Hitzeschock bei 42°C unterzogen. Nach 2 min auf Eis wurden 100 μl SOC-Puffer (Bactotrypton 2%; Hefeextrakt 0, 5 o; NaCl 10 mm; KCl 2,5 MM; MgCl2, MgSO4 20 mm (jeweils 10 mm); Glucose 20 mm) zugegeben, und das Gemisch wurde 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Aliquots der Suspensionen wurden auf jeweils 1 Platten mit 50 μl/ml Ampicillin ausplattiert. Die Transformanten wurden einem Screening auf das Vorhandensein des klonierten synthetischen Gens mittels Koloniehybridisierungsanalyse unter Verwendung von in „Molecular Cloning: A Laboratory Manual" von Maniatis et al. (Cold Spring Harbor) und in der GB-Patentanmeldung Nr. 8502605 beschriebenen Standardverfahren unterworfen. Insgesamt 100 Kolonien wurden auf Filter (Schleicher und Schuell) ausgestrichen, 20 Stunden bei 37°C wachsen gelassen, lysiert und gebacken. Der Filter wurde 20 Stunden bei 65°C mit einer aus der Oligonukleotidsequenz SEQ ID No. 1 (siehe unten) unter Verwendung eines Kits zur Zufallsmarkierung (Pharmacia) hergestellten radioaktiven Sonde hybridisiert. Fünf Kolonien 1–5, die ein positives Hybridisierungssignal ergaben, wurden in L-Brühe im kleinen Maßstab (100 ml) 20 Stunden bei 37°C kultiviert, und Plasmid-DNA wurde durch Zentrifugieren in einem Cäsiumchloridgradienten, im wesentlichen wie in „Molecular Cloning; A Laboratory Manual" von Maniatas et al. (Cold Spring Harbor) beschrieben, präpariert.
  • Die DNA wurde mit dem Standard-Didesoxy-Kettenabbruchverfahren, wie von Sanger et al. in Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74, 5463–5467 (1977) beschrieben, unter Verwendung eines SequenaseTM-Kits (United States Biochemical Corporation) sequenziert. Die Oligonukleotide SEQ 1D No. 19 bis SEQ 1D No. 23 (siehe unten) wurden als Sequenzierprimer verwendet.
  • TABELLE 2
    Figure 01160001
  • Figure 01170001
  • Die Plasmid-DNA aus Klon 5 enthielt die in 6 gezeigte DNA-Sequenz. Das Plasmid (pAG88) wurde zur Transformation kompetenter Zellen der folgenden E. coli-Stämme mittels Standardverfahren verwendet:
    HB101
    CGSC 6300 (im folgenden auch mit MSD 522 bezeichnet)
  • Die E. coli-Stämme HB 101 und MSD 522 (CGSC 6300) sind überall erhältlich. Sie können somit beispielsweise vom E. coli Genetic Stock Centre, Yale University, USA, bezogen werden. Außerdem kann E. coli HB 101 auch beispielsweise von BRC, Vertrieb durch GIBCO Limited (Unit 4, Cowley Mill Trading Estate, Longbridge Way, Uxbridge UB8 2YG, Middlesex, England), oder von GIBCO Laboratories, Life Technologies Inc., 3175 Staley Road, Grand Island, NY 14072, USA, bezogen werden. Der Genotyp des Stamms HB101 ist in dem oben erwähnten „Molecular Cloning – A Laboratory Manual" mit Sup E44 hsd S20 (rB –mB –)rec A 13 ara-14 F–leu 6 thi-1 proA2 lac Y1 gal K2 rps L20 xyl–5 mtl–1 beschrieben. Der Genotyp von MSD 522 (CGSC 6300) ist in Referenzbeispiel 12 dargestellt.
  • c) Klonierung des Gens für menschlichen [Met–1]-G-CSF in einem Expressionsvektor
  • Das oben beschriebene Gen wurde, wie in Referenzbeispiel 3(c) beschrieben, in das Plasmid pICI 0020 kloniert, so daß das Expressionsplasmid pICI 1056 erhalten wurde.
  • d) Fermentation
  • Das Plasmid pICI 1056 wurde transformiert, und zur Expression von menschlichem [Met–1]-G-CSF wurde eine Fermentation durchgeführt, wie in Referenzbeispiel 3(e) beschrieben.
  • e) Reinigung
  • Die Reinigung wurde wie in der zur Gewinnung größerer Mengen an [Met–1]hu-G-CSF entwickelten und auf den Seiten 48 und 49 der PCT-Patentveröffentlichung Nr. WO 87/01132 dargestellten zweiten Reinigungsvorschrift beschrieben durchgeführt, wobei die abschließende Dialyse gegen phosphatgepufferte Kochsalzlösung durchgeführt wurde.
  • B. Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem [Met–1]hu-G-CSF
  • Eine wie oben unter A beschrieben hergestellte Lösung aus [Met–1]hu-G-CSF (300 g) wurde auf 8 mg/ml in 20 mM Natriumacetat, 37 mM Natriumchlorid pH 5,4 mittels Ultrafiltration auf einer Amicon-YM10-Membran (Molekulargewicht-[MW]-Ausschlußgrenze 10 kDa) konzentriert. Zu dieser Lösung wurde ein gleiches Volumen an 0,8 M Natriumborat pH 8,8 und anschließend Methylpolyethylenglykol-p-nitrophenylcarbonat mit einem MW von ca. 5000 (Sigma Chemical Co Ltd) (100 Äquivalente pro Mol [Met–1]hu-G-CSF), gelöst in Wasser, zugegeben. Man ließ die Reaktion 3 Stunden bei 20°C unter leichtem Rühren ablaufen, und die Reaktion wurde dann durch Zugabe von 1 M Ethanolamin-hydrochlorid pH 8,0 (10 Äquivalente pro Mol aktiviertem Methylpolyethylenglykol) gequencht. Das Reaktionsgemisch wurde unmittelbar danach durch Titration mit 1 M Essigsäure auf pH 5,4, eingestellt und mit 20 mM Natriumacetat, 100 mM NaCl, pH 5,4, auf 500 ml verdünnt. Das Gemisch wurde einer Diafiltration gegen 10 Liter desselben Puffers unter Verwendung eines mit einer SIY30-Membran (MW-Ausschlußgrenze 30 kDa) ausgestatteten „Spiral-Cartridge"-Systems CH2A-1S von Amicon unterzogen, bis das gelbe p-Nitrophenol im Retentat nicht mehr zu sehen war. Das Retentat wurde auf etwa 300 ml eingeengt und in eine mit einer YM30-Membran (Ausschlußgrenze 30 kDa) ausgestattete Rührzelle 8400 von Amicon gegeben. Das Retentat wurde auf 50 ml eingeengt und mit 20 mM Natriumacetat, 100 mM NaCl, pH 5,4, wieder auf 300 ml verdünnt. Dieser Vorgang wurde viermal wiederholt und das Produkt schließlich auf etwa 25 ml eingeengt. Dieses Konzentrat wurde auf einer Säule (5 × 90 cm) aus mit 20 mM Natriumacetat equilibriertem Ultrogel AcA54 chromatographiert. Das modifizierte Protein enthaltende Fraktionen wurde durch Verfolgen des Proteins bei 280 nm und des Methylpolyethylenglykols mittels Iod/Kaliumiodid-Titration (CR Acad. Sci. Paris, 274 1617 1972) identifiziert, vereinigt und ausgiebig gegen Wasser dialysiert. Das Endprodukt wurde mittels Ultrafiltration an einer Amicon-YM30-Membran an mehr als 11,5 mg/ml konzentriert, durch ein 0,22-μm-Filter unter sterilen Bedingungen filtriert und für weitere Untersuchungen bei 4°C gelagert.
  • SDS-PAGE des modifizierten Endprodukts zeigte, daß kein nicht umgesetzter [Met–1]hu-G-CSF mehr vorhanden war, d. h. das gesamte Produkt lief als verschmierte Bande mit hohem MW. Titrationen der Filtrate und Retentate mit Iod/Kaliumiodid zeigten, daß durch wiederholte Diafiltration bei pH 5,4 an einer YM30-Membran (MW-Ausschlußgrenze 30 kDa) praktisch das gesamte nicht proteingebundene Methylpolyethylenglykol entfernt worden war. Das Endprodukt enthielt etwa 4 Mol kovalent gebundenes Methylpolyethylenglykol pro Mol Protein. Die spezifische Aktivität des nichtmodifizierten Derivats sank von 0,8 × 109 U/mg auf 0,2 × 109 U/mg (25%) im modifizierten Produkt. Das Produkt war vollkommen stabil und zeigte keine Änderung der spezifischen Aktivität in Lösung bis zu 10 mg/ml (an Protein) bei 37°C über 14 Tage.
  • In diesem Referenzbeispiel wird der pH-Wert der [Met–1]hu-G-CSF-Lösung vor der Pegylierung sorgfältig geprüft, um eine Dimerisierung zu vermeiden oder wenigstens zu minimieren.
  • Referenzbeispiel 2
  • Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem menschlichem [Met–1]-G-CSF
  • Das Referenzbeispiel 1 wurde wiederholt, mit Ausnahme, daß die Reinigung von [Met–1]hu-G-CSF wie folgt durchgeführt wurde:
  • Gefrorene Zellpaste (500 g) wurde lysiert und die Pellet-Rohfraktion abgetrennt, gewaschen und wie in Referenzbeispiel 4 (siehe unten) solubilisiert. Der mit Sarkosyl lösliche Extrakt wurde durch Zentrifugation über 30 Minuten bei 30000 × g geklärt.
  • Zu 1 Liter Überstand wurde 1 Liter Aceton unter Rühren bei 4°C zugetropft. Das ausgefallene Protein wurde nach 10 Minuten durch Zentrifugation für 30 Minuten bei 15000 × g gesammelt und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 40 mM Natriumacetat, 6 M Guanidin-Hydrochlorid pH 4,0 (500 ml) unter Verwendung eines mit einer PTA-20-Sonde ausgestatteten Polytron-PT10-35-Homogenisators resolubilisiert und dann 1 Stunde bei 4°C Rühren gelassen, bevor eine ausgiebige Dialyse in Collodionschläuchen (Spectrapor, MW-Ausschlußgrenze 6–8 kDa) gegen 20 mM Natriumacetat, pH 5,4 erfolgte. Das ausgefallene Protein wurde durch 30 Min. Zentrifugieren bei 15000 × g entfernt und der Überstand auf eine mit 20 mM Natriumacetat pH 5,4 equilibrierte 50-ml-Säule aus CM-Zellulose (Whatman CM52) aufgetragen. Die Säule wurde mit demselben Puffer gewaschen, bis der E280-Wert des Elutionsmittels auf die Basislinie absank, danach mit vier Säulenvolumen 20 mM Natriumacetat pH 5,4 mit 20 mM NaCl gewaschen. Die [Met–1]hu-G-CSF enthaltende Produktfraktion wurde mit 37 mM NaCl in 20 mM Natriumacetat, pH 5,4 eluiert, die Fraktionen wurden vereinigt und entweder sofort mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziert oder bei –20°C gelagert, bis sie für weitere Untersuchungen benötigt wurden.
  • Referenzbeispiel 3
  • Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem menschlichem [Met–1, Ser17,27]-G-CSF
  • A. Herstellung von menschlichem [Met–1, Ser17,27]-G-CSF
  • Die Vorgehensweise für die Schritte A a) und A b) in Referenzbeispiel 1 wurde mit den folgenden Modifikationen wiederholt:
  • Die SEQ ID Nr. 1, 2, 3 und 4 wurden durch die Oligonukleotide SEQ ID Nr. 24, 25, 26 bzw. 27 (wie unten ausführlich dargestellt) ersetzt.
  • c) Klonierung des Gens für menschlichen [Met–1, Ser17,27]-G-CSF in einem Expressionsvektor
  • Das oben beschriebene Gen (siehe 3) wurde in den Plasmidvektor pICI0020 kloniert. Bei diesem Vektor handelt es sich um ein auf pAT153 beruhendes Plasmid, bei dem der 651 by große EcoR1-Acc1-Bereich durch ein 167 by großes EcoR1-Cla1-Fragment ersetzt ist, das aus:
    • (1) einem synthetischen E. coli-trp-Promotor und einer trp-leader-Ribosomenbindungsstelle
    • (2) einem Translationsinitiationscodon
    • (3) einer von M13mp18 abgeleiteten Mehrfach-Restriktionsenzymerkennungssequenz, da die Stellen für KpnI, BamHI, XbaI, SalI, PstI, SphI und HindIII enthält
    • (4) einer synthetischen Transkriptionsterminationssequenz besteht.
  • Die DNA-Sequenz dieses Bereichs ist in 1 gezeigt (siehe auch SEQ ID No 44).
  • Der pICI0020 Expressionsvektor wurde vollständig mit Kpn1 (BCL) in 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM Magnesiumchlorid verdaut. Die DNA wurde mit Ethanol bei –20°C aus einer Lösung mit 0,3 M Natriumacetat gefällt, wonach die klebrigen 3'-Enden durch Behandlung mit T4-DNA-Polymerase über 10 Minuten bei 37°C wie folgt entfernt wurden:
    DNA (1 μg) in Wasser (16 μl)
    10X T4-Polymerasepuffer (2 μl)
    0,33 M Tris-Acetat pH 7,9
    0,1 M Magnesiumacetat
    0,66 M Kaliumacetat
    5 mM Dithiothreitol
    1 mg/ml Rinderserumalbumin (BSA PENTAX Fraktion V)
    2 mM dNTP-Gemisch (1 μl)
    T4-DNA-Polymerase (1 μl; 2,5 Einheiten/μl BCL)
  • Nach Zugabe von Wasser (80 μl) wurde das Gemisch mit Phenol/Chloroform (100 μl) und danach mit Chloroform (100 μl) extrahiert. Die DNA wurde mit Ethanol (250 μl) nach Zugabe von 3 M Natriumacetat (10 μl) bei –20°C gefällt und danach mit SaiI (BCL) in 150 mM NaCl, 10 mM MgCl2 und 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) vollständig verdaut. Der Vektor mit stumpfem Kpn-Ende sowie SalI-Ende wurde aus einem 0,7%igen Agarosegel gereinigt und unter Verwendung von Geneclean (Handelsname) nach der vom Hersteller (Bio101, USA) empfohlenen Vorgehensweise isoliert.
  • Das synthetische Gen wurde aus den pSTP1-Vektoren wie folgt isoliert. Die Vektoren wurden mit ScaI und SaiI (beide von BCL) in 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 und 10 mM Tris-HCl (pH 7,5) verdaut. Das 530 by große Fragment wurde aus einem 0,7%igen Agarosegel gereinigt und unter Verwendung von Geneclean (Handelsname) nach der vom Hersteller (Bio101, USA) empfohlenen Vorgehensweise isoliert.
  • Zur Ligation wurde ein Gemisch aus dem ScaI-SaiI-Genfragment (50 mg) und dem pICI0020-Vektorfragment (100 ng) in 20 μl einer Lösung mit 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTT, 5 o w/v PEG 8000 und T4-DNA-Ligase (2 Einheiten; BRL) 20 Stunden bei 16°C inkubiert. Das erhaltene Gemisch wurde zur Transformation kompetenter E. coli-HB101-Zellen (wie von BRL geliefert) wie hierin beschrieben verwendet. Die Transformanten wurden auf L-Agarplatten mit 50 μg/ml Ampicillin auf Wachstum selektioniert und einem Screening auf das Vorhandensein des Gens mittels Koloniehybridisierung mit einer mit 32Pmarkierten Sonde (SEQ ID No 24), wie hier beschrieben, unterzogen. Von 6 positiv hybridisierenden Kolonien wurde Plasmid-DNA präpariert, durch Zentrifugieren in einem Cäsiumchloridgradienten gereinigt, und die Sequenz wurde durch Didesoxysequenzierung, wie hier beschrieben, bestätigt.
  • Das Plasmid mit diesem Gen wurde mit pICI 1080 bezeichnet.
  • d) Subklonierung einer Expressionskassette mit einem Gen für [Met–1, Ser17,27] G-CSF in M13mp18
  • Die folgende Subklonierung wurde durchgeführt, um einen Startpunkt für die Herstellung der in den Referenzbeispielen 7 und 8 ausführlich dargestellten G-CSF-Derivate zu schaffen.
  • Plasmid-DNA aus pICI1080 (gereinigt über Cäsiumchlorid- Dichtezentrifugation) wurde gemäß den Angaben des Herstellers mit EcoRI und SalI (BCL) vollständig verdaut. Das kleine, den trp-Promotor und das [Met–1, Ser17,27]G-CSF-Gen enthaltende EcoRI-SalI-Fragment wurde aus einem 0,7%igen Agarosegel unter Verwendung von Geneclean (Handelsname) isoliert. Dieses Fragment wurde in einen mit EcoRI-SalI geschnittenen M13mp18-Vektor (DNA von Amersham International; Enzyme von BCL) kloniert. Die Fragmente wurden in 5 × BRL-Ligationspuffer mit BRL-T4-DNA-Ligase (zuvor beschrieben) zusammenligiert. Der Ligationsansatz wurde zur Transfektion kompetenter E. coli-TGl-Zellen (die gemäß dem Calciumchloridverfahren von Mandel und Higa, beschrieben in Molecular Cloning – A Laboratory Manual – Maniatis et al. Cold Spring Harbor, kompetent gemacht worden waren) verwendet. Die transfizierten Zellen wurden in TY-Topagar mit 2% X-GaI in DMF und 200 μl log-Phase E. coli-TGl-Zellen suspendiert und auf 2 × TY-Agarplatten (TY-Topagar – 8 g Bactotrypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 3,75 g Bactoagar in 500 μl sterilem H2O; TY-Platten – 8 g Bactotrypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 7,5 g Bactoagar in 500 ml sterilem H2O) ausplattiert.
  • Vier weiße Plaques wurden in 4 × 2-ml-Aliquots von 1% E. coli-TGl-Zellen in TY-Brühe (8 g Bactotrypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl in 500 ml sterilem H2O) überführt und 6 Stunden bei 37°C kultiviert. Die 2-ml-Kulturen wurden jeweils in 0,5-ml- und 1,5-ml-Aliquots geteilt. Die Bakterien wurden aus der Lösung durch Zentrifugieren in einer EppendorfTM-Mikrozentrifuge abgetrennt und die Überstände in sterile EppendorfTM-Röhrchen überführt. Die 0,5-ml-Aliquots wurden als Phagen-Stammlösungen bei –20°C gelagert. Die 1,5-ml-Aliquots wurden zur Herstellung einzelsträngiger DNA nach dem Verfahren im M13-Sequenzierhandbuch von Amersham International (siehe unten) verwendet. Diese DNA-Proben wurden dann unter Verwendung der Oligonukleotide SEQ 1D No 22, SEQ 1D No 23 und des M13- Universal-Sequenzierprimers sequenziert. Die Reaktionen wurden mit dem Sequenase-Kit (Handelsname) gemäß den Angaben des Herstellers durchgeführt. Alle 4 Clone besaßen die korrekte DNA-Sequenz für [Ser17,27]G-CSF.
  • Einzelstrang-DNA-Präparation im Großmaßstab
  • Für Einzelstrang-DNA-Präparationen zwischen 200–500 μg DNA/ml wurde das Verfahren in „Oligonukleotide Directed Mutagenesis" von Amersham International verwendet. Eine ausführliche Vorschrift wird wie folgt ausgeführt:
  • EINZELSTRANG-DNA-PRÄP. IM GROSSMASSSTAB:
  • A. Herstellung einer 1-ml-Phagen-Stammlösung
    • 1. E. coli-TGl-Einzelkolonie von einer Glucose/Minimalmedium-Platte picken. Über Nacht in 10 ml 2 × TY-Medium unter Schütteln bei 37°C wachsen lassen. 10 μl bis 20 ml frisches Medium zugeben und 3 Stunden bei 37°C schütteln.
    • 2. 1 ml 2 × TY-Medium in einem sterilen 10-m1-Kulturröhrchen mit 100 μl der 3-Stunden-Kultur aus Schritt 1 animpfen.
    • 3. Die 1-ml-Kultur mit einem rekombinanten Plaque animpfen.
    • 4. 4 Stunden unter Schütteln bei 37°C inkubieren. Überführung in ein Mikrozentrifugenröhrchen.
    • 5. 5 Minuten bei Umgebungstemperatur zentrifugieren. Überstand in ein frisches Röhrchen giessen.
  • Über Nacht bei 4°C lagern. E. coli-TGl-Übernachtkultur für die nächste Stufe ansetzen.
  • B. Anzucht der 100-ml-Phagenkultur
    • 1. 100 ml 2 × TY-Medium mit 1 ml TG1-Übernachtkultur animpfen und unter Schütteln bei 37°C bis zu einer O.D. 500 von 0,3 inkubieren.
    • 2. Den 1-ml-Phagenüberstand aus A5 (oben) in die 100-ml-Kultur geben.
    • 3. 5 Stunden unter Schütteln bei 37°C inkubieren. Überführung in Zentrifugenröhrchen.
    • 4. 30 Minuten bei 4°C und 5000 × g zentrifugieren.
    • 5. Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen überführen. Darauf achten, daß dabei keine Zellen mitgeschleppt werden (Bakterienpellet für die RF-DNA-Präparation aufgewahren).
    • 6. 0,2 Volumen 20% w/v PEG 6000 in 2,5 M NaCl zum Überstand geben. Gut mischen und danach 1 Stunde bei 4°C stehenlassen.
    • 7. 20 Minuten bei 5000 × g und 4°C zentrifugieren, Überstand verwerfen.
    • 8. 5 Minuten bei 5000 × g zentrifugieren und verbliebenes PEG/NaCl mit einer ausgezogenen Pasteurpipette vollständig entfernen.
    • 9. Viruspellet in 500 μl Wasser (doppelt destilliert) resuspendieren und in ein Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml) überführen.
    • 10. 5 Minuten in einer Mikrozentrifuge zur Abtrennung aller verbliebenen Zellen zentrifugieren. Den Überstand in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
    • 11. 200 μl 20% PEG 12,5 M NaCl zum Überstand geben, gut mischen und danach 15 Minuten bei Umgebungstemperatur stehenlassen.
    • 12. 5 Minuten zentrifugieren, Überstand verwerfen. 13. 2 Minuten zentrifugieren. Sorgfältig alle Spuren von PEG/NaCl mit einer ausgezogenen Pasteurpipette entfernen.
    • 14. Das Viruspellet in 500 μl doppelt destilliertem Wasser resuspendieren.
    • 15. 200 μl mit 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA gesättigtes Phenol zugeben, kurz am Vortex mischen.
    • 16. Röhrchen 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen.
    • 17. 3 Minuten zentrifugieren.
    • 18. Überstand in frisches Röhrchen überführen. 19. Schritte 15–18 wiederholen.
    • 20. 500 μl Chloroform zugeben und wäßrige Phase zweimal extrahieren.
    • 21. 50 μl 3 M Natriumacetat und 1 ml absolutes Ethanol zugeben. Mischen.
    • 22. 20 Minuten in ein Bad aus Trockeneis und Ethanol stellen.
    • 23. 15 Minuten zentrifugieren.
    • 24. Pellets jeweils mit 1 ml –20°C kaltem Ethanol waschen. Abgießen.
    • 25. Pellet unter Vakuum trocknen und in 50 μl doppelt destilliertem Wasser aufnehmen.
  • Durch diese Verfahrensweise erhält man 100–200 μg Einzelstrang-DNA.
  • e) Fermentation
  • pICI 1080 wurde in den E. coli-Stamm MSD 522 (CGSC 6300) (erwähnt im Referenzbeispiel 1A (b)) transformiert, und die erhaltenen Rekombinanten wurden gereinigt und als Glycerinkulturen bei –80°C aufbewahrt.
  • Ein Aliquot der Kultur wurde der Stammkultur entnommen und auf L-Ampicillin-Agarplatten zur Trennung von Einzelkolonien nach Übernachtwachstum bei 37°C ausgestrichen. Eine gewünschte Einzelkolonie wurde entfernt und in 10 ml L-Ampicillin-Brühe resuspendiert, und 10 250-ml-Erlenmeyerkolben mit 75 ml L-Ampicillin-Brühe wurden unmittelbar danach mit jeweils 100 μl angeimpft. Nach 16 h Wachstum bei 37°C auf einem Reziprokschüttler wurden die Kolbeninhalte vereinigt und zur Animpfung eines Fermenters mit 20 1 LCM50-Wachstumsmedium verwendet.
  • Figure 01280001
  • Die Fermentationen wurden dann bei einer Temperatur von 37°C und einem durch automatische Zugabe von 6 M Natriumhydroxidlösung gesteuerten pH-Wert von pH 6,7 durchgeführt. Der Spannungssollwert für gelösten Sauerstoff (dOT-Wert) lag bei 50% Luftsättigung und wurde zunächst durch automatische Anpassung der Fermenterrührergeschwindigkeit gesteuert. Die Luftzufuhr zum Fermenter von anfänglich 20 l/min, was 1 Volumen pro Volumen pro Minute (VVM) entspricht, wurde auf 50 l/min (2,5 VVM) erhöht, als die Fermenterrührergeschwindigkeit 80–90% ihres Maximums erreichte. Da die Sauerstoffübertragungsgeschwindigkeit (Oxygen Transfer Rate, OTR) der Fermenter bei einer höheren Zelldichte als der einer OD550 von 50 unter den beschriebenen Bedingungen entsprechenden Zelldichte nicht mit der Sauerstoffaufnahmegeschwindigkeit (Oxygen Uptake Rate, OUR) der Bakterien Schritt halten konnte, wurde der dOT-Wert im Fermenter bei höheren Zelldichten als der angegebenen bei 50% Luftsättigung gehalten, indem die Sauerstoffaufnahmegeschwindigkeit der Bakterien eingeschränkt wurde. Dies wurde dadurch erreicht, daß das Medium so formuliert wurde, daß es bei einer OD550 von 50 zu einem Kohlenstoffmangelmedium wurde, und dann die limitierende Kohlenstoff quelle zusammen mit Ammoniumsulfat und Hefeextrakt mit einer die Bakterienwachstumsrate limitierenden Geschwindigkeit zugefüttert wurde.
  • Die Fermentationen wurden über 16 h durchgeführt, wobei zur Messung der optischen Dichte (OD550), des Zelltrockengewichts und der Anreicherung von G-CSF in den Zellen Proben entnommen wurden. Die G-CSF-Anreicherung wurde mittels Scanning von mit Coomassie-Blau gefärbten SDS-PAGE-Gelen von Ganzzelllysaten der Bakterienproben gemessen, wie im Fachgebiet allgemein bekannt ist.
  • Nach Erreichen einer OD550 von 25 wurde Caseinhydrolysat-Lösung (100 g/l Oxzoid L41) mit einer Geschwindigkeit von 1,5 g/l/h in die Fermenter gepumpt.
  • Nach Erreichen einer OD550 von etwa 50 war der Vorrat der Kohlenstoff quelle im Fermentationsansatz erschöpft, was zu einem rapiden Anstieg des dOT-Werts von 50% Luftsättigung führte. An diesem Punkt wurde eine Nährlösung mit Glycerin (470 g/l), Hefeextrakt (118 g/l) und Ammoniumsulfat (118 g/l) mit einer solchen Geschwindigkeit in die Fermenter gepumpt, daß dadurch der dOT-Wert auf 50% Luftsättigung zurückkehrte und darauf gehalten wurde, wobei der Fermenter mit ca. 80% seines Maximums gerührt wurde. Nach ca. 13–14 h wurde diese „fed-batch"-Nährlösung durch eine zweite Nährlösung mit lediglich Glycerin (715 g/l) und Ammoniumsulfat (143 g/l) ersetzt. Die Caseinhydrolysat-Zufütterung wurde dabei durchgehend bei 1,5 g/l/h gehalten. Nach ungefähr 16 Stunden, als eine mikroskopische Untersuchung der Kultur das Vorhandensein großer Einschlußkörperchen (inclusion bodies) in einer Mehrzahl der Zellen zeigte, wurden die Bakterien in einer Sorval-RC3B-Zentrifuge (7000 g, 30 min, 4°C) geerntet und eingefroren bei minus 80°C gelagert.
  • f) Reinigung
  • Gefrorene Zellpaste (500 g) wurde bei 4°C in 50 mM Tris-HCl, 25 mM EDTA, pH 8,0 (5 Liter) unter Verwendung eines Silverson-Homogenisators, Modell AXR, resuspendiert. Die Suspension wurde durch dreimaliges Passieren durch einen Manton-Gaulin-Homogenisator bei 6000 psi lysiert und 30 Minuten in einer Sorvall-RC3C-Zentrifuge mit einem H6000A-Rotor bei 5000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Pelletfraktion vor der weiteren Reinigung bei –20°C gelagert. Die Pelletfraktion (60–100 g) wurde aufgetaut und in 1% w/v Desoxycholinsäure (Natriumsalz) in 5 mM EDTA, 5 mM Dithiothreitol, 50 mM Tris-HCl, pH 9,0 (1200 ml) mit 1 mg/ml Natriumazid unter Verwendung eines Polytron-Homogenisators mit einer PTA-20-Sonde bei Geschwindigkeitsstufe 5 resuspendiert. Die Suspension wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gemischt und dann 30 Minuten in einer Sorvall-RC5C-Zentrifuge mit einem GSA-Rotor bei 6500 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet noch zweimal in der gleichen Weise behandelt. Danach wurde das Pellet zweimal in Wasser (1 Liter) resuspendiert und 20 Minuten bei 15000 × g zentrifugiert. Das die gewaschenen Einschlußkörperchen enthaltende letzte Pellet wurde in 2% (w/v) N-Lauroylsarcosin, Natriumsalz, (Sarkosyl) in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 (150 ml) mit 1 mg/ml Natriumazid solubilisiert. Nach Zugabe von 20 μM Kupfersulfat wurde das Gemisch 16 Stunden bei 20°C gerührt und anschließend 30 Minuten in einer Sorvall-RC5C-Zentrifuge mit einem SS34-Rotor bei 30000 × g zentrifugiert. Der das Derivat enthaltende Überstand wurde bei –20°C in 50-ml-Aliquots vor der weiteren Reinigung aufbewahrt.
  • Das solubilisierte Derivat (20 ml) wurde aufgetaut und zur Entfernung jeglichen partikulären Materials durch ein 5-μm-Filter geleitet. Das Filtrat wurde auf eine Säule (5 × 90 cm) aus mit 0,3% w/v N-Lauroylsarcosin (Natriumsalz) in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, mit 1 mg/ml Natriumazid bei 4°C equilibriertem Ultrogel AcA54 aufgetragen. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer bei einer Fließgeschwindigkeit von 2,5 ml/Minute eluiert, wobei Fraktionen von jeweils 10 ml gesammelt wurden. Die das Proteinderivat enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt (ungefähr 100 ml) und bei 4°C gelagert.
  • Die vereinigten Derivatfraktionen von mehreren Säulen wurden zusammengegeben (300–500 ml) und gegen 10 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid pH 7,4 (3–5 Liter) mit 1 mg/ml Natriumazid unter Verwendung einer mit einer S1Y10-Membran (Ausschlußgrenze 10 kDa) ausgestatteten CH2A-1S-Spiral-Cartridge-Diafiltrationsvorrichtung von Amicon dialysiert. Das Retentat wurde 30 Minuten in einer Sovall-RC5C-Zentrifuge mit einem SS34-Rotor bei 30000 × g zentrifugiert und der Überstand in einem Spectrapor-Dialyseschlauch mit einer Ausschlußgrenze von 6–8 kDa 40 Stunden gegen eine dreimal gewechselte Lösung (8 Liter/300 ml Überstand) von 20 mM Natriumacetat, 100 mM Natriumchlorid, pH 5,4 mit 1 mg/ml Natriumazid, dialysiert. Der dabei gebildete Niederschlag wurde durch 30minütige Zentrifugation bei 30000 × g abgetrennt und der Überstand 24 Stunden gegen Wasser mit 1 mg/ml Natriumazid und anschließend 72 Stunden gegen sechsmal gewechseltes Wasser dialysiert. Das letzte Retentat wurde durch 30minütige Zentrifugation bei 30000 × g geklärt und entweder eingefroren bei –20°C (Proteinkonzentration etwa 1 mg/ml oder nach Gefriertrocknen bei 4°C gelagert.
  • Die Konzentration an N-Lauroylsarcosin (Natriumsalz) war nach der Diafiltration auf einen Wert unterhalb 0,001% w/v gesunken und lag unterhalb der Nachweisgrenze (etwa 0,0001%) des nach der Dialyse gegen Wasser verwendeten rpHPLC-Verfahrens.
  • B. Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF
  • Dies wurde wie in Referenzbeispiel 7 beschrieben hergestellt. Das Endprodukt enthielt etwa 4,1 Mol kovalent gebundenes Methylpolyethylenglykol pro Mol Protein. Die spezifische biologische Aktivität von [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF, (1,4 × 109 U/mg) ging nach der Modifikation nur auf 2,4 × 108 U/mg (17%) zurück. Das Produkt war vollkommen stabil und zeigte keine Änderung der spezifischen Aktivität in Lösung bei bis zu 10 mg/ml (an Protein) in PBS über 14 Tage bei 37°C. Diese Ergebnisse zeigen eine auffallende Ähnlichkeit mit den in Referenzbeispiel 7 gefundenen Ergebnissen und deuten auf die Stetigkeit der mit einer gegebenen Anordnung von Aminosäuren erzielten Ergebnisse hin.
  • Referenzbeispiel 4
  • Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem menschlichem [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65-G-CSF
  • Die in Referenzbeispiel 7 beschriebene Vorgehensweise wurde mit Ausnahme des folgenden wiederholt:
  • Gefrorene Zellpaste (500 g) wurde bei 4°C in 50 mM Tris-HCl, 25 mM EDTA pH 8,0 (5 Liter) unter Verwendung eines Polytron-PT6000-Homogenisators resuspendiert. Die Suspension wurde lysiert, indem sie dreimal bei 6000 psi durch einen Manton-Gaulin-Homogenisator geführt wurde, und dann 30 Minuten bei 4°C und 5000 × g in einer mit einem H6000A-Rotor ausgestatteten Sorvall- RC3C-Zentrifuge zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Pelletfraktion vor der weiteren Reinigung bei –20°C gelagert.
  • Die Pelletfraktion (200–250 g) wurde aufgetaut und in 1% w/v Deoxycholinsäure (Natriumsalz) in 5 mM EDTA, 5 mM Dithiothreitol, 50 mM Tris-HCl pH 9,0 mit 1 mg/ml Natriumazid (3 Liter) unter Verwendung eines mit einer PTA20-Sonde ausgestatteten Polytron-PT10-35-Homogenisators resuspendiert. Die Suspension wurde 30 Minuten bei 20°C gemischt und dann 30 Minuten bei 5000 × g in einer Sorvall-RC3C-Zentrifuge mit einem H6000A-Rotor zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet noch zweimal in der gleichen Weise behandelt. Das Pellet wurde danach zweimal in Wasser (3 Liter) resuspendiert und 30 Minuten bei 5000 × g zentrifugiert. Das die gewaschenen Einschlußkörperchen enthaltende letzte Pellet wurde in 2% w/v N-Lauroylsarcosin, Natriumsalz, (Sarkosyl) in 50 mM Tris-HCl pH 8,0 (300 ml) mit 1 mg/ml Natriumazid solubilisiert. Nach Zugabe von 20 μM Kupfersulfat wurde das Gemisch unter Rühren bei 20°C 16 Stunden inkubiert und danach in einer Sorvall-RC5C-Zentrifuge mit einem SS34-Rotor bei 30000 × g zentrifugiert. Der das Derivat enthaltende Überstand wurde unmittelbar danach weiter gereinigt oder bei –20°C gelagert, bis er benötigt wurde.
  • Das solubilisierte Derivat wurde in 2% w/v Sarkosyl in 50 mM Tris-HCl pH 8,0 mit 1 mg/ml Natriumazid auf 15 mg/ml Gesamtprotein (abgeschätzt mittels E280) eingestellt und zur Entfernung eventuell vorhandenen partikulären Materials durch ein 5-μM-Filter gegeben. Das Filtrat wurde in Aliquots von 80 ml auf eine Säule (10 × 90 cm) aus mit 0,3% w/v Sarkosyl (Natriumsalz) in 50 mM Tris-HCl pH 8,0 mit 1 mg/ml Natriumazid bei 4°C equilibriertem Sephacryl S200 HR aufgetragen. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 ml/Minute eluiert, wobei Fraktionen von jeweils 40 ml gesammelt wurden. Die das Proteinderivat enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und bei 4°C gelagert.
  • Die vereinigten Derivatfraktionen aus mehreren Säulenläufen wurden zusammengegeben (etwa 1000 ml) und gegen 10 Liter 10 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid pH 7,4 mit 1 mg/ml Natriumazid unter Verwendung einer mit einer SIY10-Membrankartusche (Ausschlußgrenze 10 kDa) ausgestatteten CH2A-IS-Diafiltrationsvorrichtung von Amicon dialysiert. Das Retentat wurde, falls notwendig, 30 Minuten bei 15000 × g in einer Sorvall-RC5C-Zentrifuge mit einem GSA-Rotor zentrifugiert und das geklärte Retentat 24 Stunden in einem Spectrapor-Dialyseschlauch mit einer Ausschlußgrenze von 6–8 kDa gegen drei Wechsel (jeweils 8 Liter/300 ml Retentat) von 20 mM Natriumacetat, 100 mM Natriumchlorid, pH 5,4, bei 4°C dialysiert. Der dabei gebildete Niederschlag wurde durch 30minütige Zentrifugation bei 15000 × g abgetrennt und der Überstand 48 Stunden gegen viermal gewechseltes Wasser (jeweils 8 Liter/300 ml Überstand) dialysiert. Das letzte Retentat wurde durch 30minütige Zentrifugation bei 15000 × g geklärt und auf 0, 1 M Natriumborat pH 8, 0 gebracht. Das gereinigte Derivat wurde entweder unmittelbar mit Methylpolyethylenglykol modifiziert oder bei –20°C gelagert, bis es benötigt wurde.
  • Referenzbeispiel 5
  • Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem menschlichem [Met–1, Ser17,27]-G-CSF
  • Die in Teil A des Referenzbeispiels 3 beschriebene Vorgehensweise wurde mit Ausnahme des folgenden wiederholt:
  • Der Duplex I wurde mit T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert und 2 Stunden bei 37°C in 1 × H-Puffer (BCL; 30 μl) mit MstII (10 Einheiten) verdaut.
  • Nach der Fällung mit Ethanol wurde das 143 by große EcoRI-MstII-Fragment auf einem 10%igen Polyacrylamidgel mit 7 M Harnstoff gereinigt, durch Elektroelution aus einem Gelstückchen isoliert, wonach die DNA-Stränge einem Annealing unterzogen wurden, wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben.
  • Das oben beschriebene synthetische EcoRI-MstII-Fragment wurde in den im Referenzbeispiel 1 beschriebenen Plasmidvektor pAG88 kloniert. Zur Herstellung des Vektors wurde pAG88 (10 μg) mit MstII (20 Einheiten; BCL) in 1 × H-Puffer (BCL; 100 μl) 2 Stunden bei 37°C verdaut. Die DNA wurde mit Ethanol aus 0,3 M Natriumacetat bei –20°C gefällt und danach mit EcoRI (20 Einheiten; BCL) in 1 × H-Puffer (BCL; 100 μl) 2 Stunden bei 37°C verdaut. Nach der Ethanolfällung wurde das große EcoRI-MstII-Fragment auf einem 1%igen Agarosegel und unter Verwendung von Geneclean (Handelsname) wie vom Hersteller (Bio 101, USA) beschrieben gereinigt. Die Ligation des 143 by großen Genfragments in das große EcoRI-MstII-Fragment erfolgte wie im Referenzbeispiel 1 (b) beschrieben. Das synthetische Fragment enthaltende Kolonien wurden durch Screening mit einer vom Oligonukleotid (SEQ ID No 24) hergestellten radioaktiven Sonde bestätigt, und die korrekte Sequenz wurde mittels DNA-Sequenzierung wie im Referenzbeispiel 1 beschrieben bestätigt. Das das Gen für [Met–1, Ser17,27]-G-CSF enthaltende Plasmid wurde mit pICI1107 bezeichnet. Das Gen wurde in den Expressionsvektor pICI0020 kloniert und die Reinigung wie im Referenzbeispiel 3 beschrieben durchgeführt.
  • Referenzbeispiel 6
  • Herstellung von Genen für Derivate des menschlichen G-CSF mittels stellengerichteter Mutagenese
  • Es wurde das Phosphorothioatverfahren von Eckstein und Mitarbeitern verwendet:
    Taylor, J. W. et al. Nucleic Acids Research (1985) Vol pp 8749–8764
    Taylor, J. W. et al. Nucleic Acids Research (1985) Vol pp 8765–8785
    Nakamaye, K. et al. Nucleic Acids Research (1986) Vol pp 9679–9698
    Sayers, J. R. et al. Nucleic Acids Research (1988) Vol pp 791–802
  • Das Verfahren läßt sich unter Verwendung eines von Amersham International vertriebenen Kits durchführen. Das Verfahren ist im folgenden in groben Zügen dargestellt, wobei es hinsichtlich der Verwendung von mehr als einem mutagenen Oligonukleotid und der Inkubationstemperatur für Oligonukleotide mit einer Länge von mehr als 30 Basen Änderungen gegenüber dem ursprünglichen Verfahren enthält.
  • 1. Annealing der Oligonukleotidmutante an einzelsträngige DNA-Matrize:
    Figure 01360001
  • (Bei gleichzeitiger Verwendung von zwei mutagenen Oligonukleotiden wurden jeweils 2,5 μl (1,6 pmol/l μl) phosphoryliertes Oligonukleotid zu 5 μl Einzelstrang-DNA-Matrize (1 μg/μl) in 3,5 μl Puffer 1 und 3,5 μl Wasser gegeben. Bei Verwendung von drei mutagenen Oligonukleotiden wurden jeweils 2,5 μl (1,6 pmol/μl) phosphorylisiertes Oligonukleotid zu 5 μl Einzelstrang-DNA (1 μg/μl in 3,5 μl Puffer 1 und 1 μl Wasser) gegeben. Die obigen Komponenten wurden in einem verdeckelten Röhrchen 3 Minuten in ein 70°C warmes Wasserbad, wenn das Oligonukleotid eine Länge von < 30 Basen aufwies, bzw. 3 Minuten in einem kochenden Wasserbad, falls das Oligonukleotid eine Länge von > 30 Basen aufwies, gegeben. Das Röhrchen wurde danach 30 Minuten in ein 37°C warmes Wasserbad gestellt.
  • 2. Synthese und Ligation des mutierten DNA-Strangs:
  • Zum Annealing-Ansatz gab man
  • Figure 01370001
  • Die obigen Komponenten wurden in ein 16°C warmes Wasserbad gegeben und über Nacht stehen gelassen.
  • 3. Entfernung der (nichtmutierten) Einzelstrang-DNA unter Verwendung von Einweg-Zentrifugationsfiltereinheiten
  • Die folgenden Komponenten wurden zu dem Ansatz aus Schritt 2 gegeben:
  • Figure 01370002
  • Die 250-μl-Probe wurde in die obere Hälfte der Filtereinheit gegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur in einer SORVALL-RT6000B-Tischzentrifuge mit einem SORVALL-H1000B-Auschwingrotor bei 1500 rpm zentrifugiert. Dabei passiert die Probe zwei Nitrozellulosemembranen, die die Einzelstrang-DNA binden, wobei die Doppelstrang-DNA durch das Filter hindurch in das Sammelröhrchen unterhalb läuft.
  • 100 μl 500 mM NaCl wurden zugegeben und danach nochmals 10 Minuten zentrifugiert, um eventuell noch vorhandene RF-DNA auszuwaschen.
  • Die folgenden Komponenten wurden zu dem Filtrat gegeben:
  • Figure 01380001
  • Das Gemisch wurde 20 Minuten in ein Bad aus Trockeneis und Ethanol gestellt und danach 15 Minuten in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Danach wurde das Pellet in 10 μl Puffer 2 resuspendiert.
  • 4. „Nicking" des nichtmutierten Strangs mit Nci I.
  • Zu dem Reaktionsgemisch aus Schritt 3 wurden 65 μl Puffer 3 sowie 8 Einheiten Nci I (1 μl) gegeben. Das Gemisch wurde 90 Minuten in ein 37°C warmes Wasserbad gestellt.
  • 5. Verdauung des nichtmutierten Strangs mit Exonuclease III
  • Zu dem Reaktionsansatz aus Schritt 4 gab man
  • Figure 01380002
  • Das Gemisch wurde in ein 37°C warmes Wasserbad gestellt und 30 Minuten bei 37°C inkubiert, wobei 50 Einheiten Exonuclease III ungefähr 3000 Basen in 30 Minuten verdauen. Das Gemisch wurde danach zur Inaktivierung der Enzyme 15 Minuten in 70°C heißes Wasserbad gestellt.
  • 6. Repolymerisierung und Ligation der „gapped"-DNA.
  • Zu dem Reaktionsansatz aus Schritt 5 gab man
  • Figure 01390001
  • Das Gemisch wurde 3 Stunden in ein 16°C warmes Bad gestellt.
  • 7. Transformation kompetenter E. coli-TG1-Wirtszellen mit der DNA:
  • 300 μl frisch hergestellter kompetenter E. coli-TG1-Zellen (hergestellt nach dem Verfahren von Mandel und Higa) wurden mit 20 μl des Reaktionsansatzes aus Schritt 6 transformiert (Doppelansatz).
  • Die Transformanten wurden auf einen Rasen aus TG1-Zellen aus Log-Phase in TY-Top-Agar auf TY-Platten ausplaziert und über Nacht bei 37°C inkubiert.
  • Der E. coli-Stamm TG1 kann leicht beispielsweise von E. coli Genetic Stock Centre, Yale University, USA und von Amersham International plc, Amersham Place, Little Chalfont, Amersham, Buckinghamshire, England HP7 9NA als Teil ihres „in vitro mutagenesis system, Oligonukleotide directed" Kits bezogen werden (Produkt-Nr. RPN 1523).
  • Referenzbeispiel 7
  • Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem menschlichem [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]-G-CSF
  • A. Herstellung von menschlichem [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]-G-CSF
  • Die im Referenzbeispiel 6 beschriebene Vorgehensweise wurde unter Verwendung der mutagenen Matrize M13mp18 mit dem in Referenzbeispiel 3 bzw. 5 beschriebenen Gen für [Met–1, Ser17,27]-G-CSF wiederholt. Die verwendeten mutagenen Oligonukleotide sind mit SEQ 1D No 28 und SEQ ID No 29 bezeichnet und werden im folgenden definiert.
  • Das Triplet ACG in SEQ 1D No 28 dient zur Umwandlung von Gln in Position 11 in Arg, und das erste bzw. letzte AGA-Triplet im SEQ ID No 29 dient jeweils zur Umwandlung von Pro in Positionen 65 bzw. 60 zu Ser. Die Mutagenese wurde wie im Referenzbeispiel 6 unter Verwendung von SEQ ID No 29 in einer Einzelprimermutagenese durchgeführt. Dabei wurde ein einzelner Plaque erhalten, der die Pro 60 Ser- bzw. Pro 65 Ser-Austausche enthält. Aus diesem Plaque wurde wie in Referenzbeispiel 6 beschrieben Einzelstrang-DNA hergestellt. Diese DNA wurde als mutagene Matrize in einer Einzelprimer-Mutagenese unter Verwendung von SEQ ID No 28 als mutagenen Primer verwendet. Dabei ergaben sich > 100 Plaques, von denen 3 einem Screening mittels DNA-Sequenzierung wie zuvor beschrieben unterzogen wurden. Bei allen 3 war der gesamte Satz an Austauschen vorhanden. Auf einem der Plaques wurde doppelsträngige RF-DNA hergestellt, indem der Vorschrift für die Präparation einzelsträngiger DNA im Großmaßstab (Schritt d im Referenzbeispiel 3) bis Schritt B5 gefolgt wurde. Die RF-DNA wurde aus dem Bakterienpellet nach der Vorschrift für die alkalische Lyse von Birnboim und Doly (Nucleic Acids Research (1979) 7, 1513–1523) extrahiert und durch Caesiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt, wie in „Molecular Cloning – a Laboratory Manual" von Sambrook, Fritsch und Maniatis (Gold Spring Harbor Publication) beschrieben. Die gereinigte RF-DNA wurde mit EcoRI und SalI in Puffer H wie zuvor beschrieben verdaut und das den trp-Promotor, die Ribosombindungsstelle, das Translationsstartcodon und das Gen für [Met–1, Ser17,27]-G-CSF enthaltende, 619 by lange Fragment aus einem 0,7%igen Agarosegel unter Verwendung von Geneclean (TM) isoliert. Das Fragment wurde mit T4-DNA-Ligase (BRL) sowie Ligasepuffer im wesentlichen wie zuvor beschrieben in einen mit EcoRI/SalI verdauten pICI0020-Vektor ligiert, wobei ein 2 : 1 molarer Überschuß an Insert gegenüber Vektor verwendet wurde. Der Ligationsansatz wurde zur Transformation des E. coli-Stamms HB101 verwendet. Die Selektion von Transformanten erfolgte durch Wachstum auf L-Agar-Platten mit 50 μg/ml Ampicillin. Die Kolonien wurden einem Screening auf das Vorhandensein der inserierten DNA mittels Restriktionsanalyse von nach dem Verfahren von Birnboim und Doly, wie es im „Molecular Cloning – a Laboratory Manual" Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Publication) beschrieben ist, präparierten Plasmid-DNA unterzogen. Die Plasmid-DNA aus einer die erwartete, 619 by lange EcoRI-SalI-Insertion enthaltenden Kolonie wurde zur Transformation des E. coli-Stamms MSD522 verwendet und mit pICI1239 bezeichnet. Die Reinigung wurde wie im Referenzbeispiel 3 beschrieben durchgeführt.
  • B. Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF
  • Eine Lösung aus [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF (418 mg) in Wasser (400 ml) wurde durch Zugabe von 0,8 M Natriumborat, pH 8,8, auf pH 8,0 gebracht und mittels Ultrafiltration auf einer YM10-Membran (MG-Ausschlußgrenze: 10 kDa) von Amicon auf 50 ml (8 mg/ml) eingeengt. Zu dieser Lösung gab man ein gleiches Volumen 0,8 M Natriumborat, pH 8,8 und anschließend in Wasser (100 ml) gelöstes Methylpolyethylenglykol-p-Nitrophenylcarbonat, MG ca. 5000, Sigma Chemical Co. Ltd. (11,3 g, 100 Äquivalente, 20 Äquivalente pro Aminogruppe auf [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF). Man ließ die Reaktion bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln 3 Stunden ablaufen und stoppte sie dann durch Zugabe von Ethanolamin-Hydrochlorid, pH 8,0 (10 Äquivalente pro Mol aktiviertes Methyl-Polyethylenglykol). Das Reaktionsgemisch wurde auf einer YM30-Membran (MG-Ausschlußgrenze 30 kDa) von Amicon bei 4°C auf ein Retentatendvolumen von 50 ml eingeengt. Das Retentat wurde mit 0,1 M Ammoniumhydrogencarbonat pH 8,0 (200 ml) verdünnt und nochmals wie zuvor auf 50 ml durch Ultrafiltration eingeengt. Dieser Vorgang wurde viermal wiederholt und das Produkt schließlich auf 25 ml eingeengt. Die konzentrierte Produktlösung wurde auf einer mit 10 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid, pH 7,4 mit 1 mg/ml Natriumazid (PBS-Azid) equilibriertem Ultrogel AcA54-Säule (5 × 90 cm) chromatographiert. Die modifizierten proteinenthaltenden Fraktionen wurden durch Verfolgen des Proteins bei 280 nm und von Polyethylenglykol mittels Iod/Kaliumiodid-Titration (C. R. Acad. Sci. Paris 274 1617, 1972) identifiziert, vereinigt und ausgiebig gegen Wasser dialysiert. Das Endprodukt wurde mittels Ultrafiltration auf einer YM30-Membran von Amicon auf mehr als 11,5 mg/ml konzentriert, durch ein 0,22-Mikron-Filter unter sterilen Bedingungen filtriert und für weitere Untersuchungen bei 4°C gelagert.
  • Proteinabschätzungen über Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse zeigten eine Rückgewinnung von insgesamt 51% [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF im modifizierten Endprodukt. Durch PAGE-SDS des Reaktionsgemischs konnte gezeigt werden, daß kein nicht umgesetzter [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65] hu-G-CSF mehr vorhanden war, wobei das gesamte Produkt als verschmierte Bande bei hohem MG lief. Die Titration der Filtrate und Retentate mit Iod/Kaliumiodid zeigte, daß durch die wiederholte Ultrafiltration bei pH 8,0 auf einer YM30-Membran praktisch alle nichtproteingebundenen Methylpolyethylenglykolderivate abgetrennt worden waren. Dies wurde durch Größenausschlußchromatographie auf einer anschließend mit Ethanolamin-gequenchtem aktiviertem Methylpolyethylenglykol als Nullwert kalibrierten Ultrogel AcA54-Säule bestätigt. Iod/Kaliumiodid-Titration des an Methylpolyethylenglykol kovalent gebundenen [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF zeigte zusammen mit den Proteinabschätzungen über Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse etwa 3,9 Mole Methylpolyethylenglykol pro Mol Protein an. Die spezifische biologische Aktivität des [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF, (1,2 × 109 U/mg), sank auf 2,2 × 108 U/mg (19%) nach Modifikation mit dem Methylpolyethylenglykol. Das Produkt war vollkommen stabil und zeigte keine Änderung der spezifischen Aktivität in Lösung bis zu 10 mg/ml (auf Protein bezogen) in PBS über 14 Tage bei 37°C.
  • Referenzbeispiel 8
  • Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem menschlichem [Met–1, Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Lys30]-G-CSF
  • A. Herstellung von menschlichem [Met–1, Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Lys30]G-CSF
    • a) Die im Referenzbeispiel 7 beschriebene Vorgehensweise wurde unter Verwendung der mutagenen Matrize M13mp18, die das Gen für [Met–1, Ser17,27]-G-CSF, beschrieben in Referenzbeispiel 3 bzw. 5, enthielt, wiederholt. Die verwendeten mutagenen Oligonukleotide sind mit SEQ ID No 33 und SEQ ID No 34 bezeichnet und werden im folgenden definiert.
  • Das Triplet TTC in SEQ ID No 33 dient zur Umwandlung von Leu in Position 15 zu Glu. In SEQ ID No 34 dient das erste TTT-Triplet zur Umwandlung von Ala in Position 30 zu Lys, wobei die Triplets AGC zur Umwandlung von Gly in Position 28 bzw. 26 zu Ala dienen.
  • Das mutagenese Verfahren wurde im wesentlichen wie in Referenzbeispiel 6 beschrieben als Doppelprimer-Experiment durchgeführt, wobei die Expressionskassette in das Expressionsplasmid unter Erhalt von pICI 1266 überführt wurde.
  • b) Reinigung
  • Gefrorene Zellpaste wurde lysiert und die Pellet-Rohfraktion wie in Referenzbeispiel 3 abgetrennt. Die dieses Protein enthaltenden Einschlußkörperchen im Pellet wurden mit dem Desoxycholinsäure-(Natriumsalz)-Puffer, beschrieben in Referenzbeispiel 3, solubilisiert. Für das vorliegende Protein wurde die folgende modifizierte Vorschrift verwendet.
  • Die Pellet-Rohfraktion (60–100 g) wurde aufgetaut und in 25 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 (1200 ml) unter Verwendung eines Polytron-Homogenisators mit einer PTA-20-Sonde und Geschwindigkeitsstufe 5 resuspendiert. Die Suspension wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gemischt und dann 30 Minuten in einer Sorvall RC5C-Zentrifuge mit einem GSA-Rotor bei 6500 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet noch zweimal in derselben Weise behandelt. Das Pellet wurde danach zweimal in Wasser (1 Liter) resuspendiert und wie im Referenzbeispiel 3 zentrifugiert. Danach erfolgte der Reinigungsvorgang wie in Referenzbeispiel 3 beschrieben.
  • B. Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem [Met–1, Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Lys30]hu-G-CSF
  • Dieser wurde wie im Referenzbeispiel 7 beschrieben hergestellt, wobei wiederum 100 Moläquivalente Reagenz verwendet wurden, obwohl dieses Derivat in Position 30 einen zusätzlichen Lysinrest enthält. Das Endprodukt enthielt etwa 4,7 Mole kovalent gebundenes Methylpolyethylenglykol pro Mol Protein. Dieses erhöhte Einbauniveau stimmt mit dem Vorhandensein einer zusätzlichen potentiellen Modifikationsstelle überein und äußert sich in einer leichten Erhöhung des MG in der PAGE-SDS. Die spezifische biologische Aktivität des nichtmodifizierten Derivats, 1,2 × 109 U/mg, sank auf 4,4 × 107 U/mg (3%) beim modifizierten Produkt. Das Produkt war vollkommen stabil und zeigte keine Änderung der spezifischen Aktivität in Lösung bis zu 10 mg/ml (bezogen auf Protein) in PBS über 14 Tage bei 37°C.
  • Referenzbeispiel 9
  • Die Vorgehensweise aus Referenzbeispielen 1, 3 und 5 wurde wiederholt, wobei anstelle des E. coli-Stamms MSD 522 im Fermentationsschritt (siehe z. B. Referenzbeispiel 3 (e)) E. coli TG1 verwendet wurde.
  • Referenzbeispiel 10
  • Alternatives Extraktionsverfahren für menschlichen [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]-G-CSF
  • Das Verfahren aus Referenzbeispiel 7 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß das Extraktionsverfahren folgendermaßen durchgeführt wurde:
  • Gefrorene Zellpaste (640 g) wurde bei 4°C in 50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 5 mM Dithiothreitol, 2 M Harnstoff, pH 8,0 mit 1 mg/ml Natriumazid (5 Liter) unter Verwendung eines Polytron-Homogenisators mit einer PTA-20-Sonde und Geschwindigkeitsstufe 7/8 resuspendiert. Die Suspension wurde lysiert, indem sie dreimal bei 6000 psi durch einen Manton-Gaulin-Homogenisator Lab 60/60 geleitet und mit einem weiteren Liter Puffer durchgespült wurde. Die Kühlung erfolgte mittels eines Conair-Kühlers mit einfachem Durchgang bei –20°C. Das Lysat wurde 30 Minuten bei 5000 × g in einer Sorvall RC3C-Zentrifuge mit einem H6000A-Rotor zentrifugiert.
  • Der Überstand wurde verworfen und das Pellet (etwa 450 g) im gleichen Puffer (10 Liter) resuspendiert. Die Suspension wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gemischt und 30 Minuten in zwei Sorvall RC3C-Zentrifugen mit H6000A-Rotoren bei 5000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet noch zweimal in der gleichen Weise behandelt. Das Pellet wurde danach zweimal im Wasser (10 Liter) resuspendiert und 30 Minuten bei 5000 UpM zentrifugiert. Die letzten Pellets, die die gewaschenen Einschlußkörperchen enthielten, wurden in 2% w/v N-Lauroylsarcosin, Natriumsalz, in 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 (1 Liter) mit 1 mg/ml Natriumazid unter Verwendung eines Polytron-Homogenisators auf Geschwindigkeitsstufe 7 resuspendiert. Danach wurden 20 mM Kupfer-II-sulfat in Wasser (1,5 ml) zugegeben und das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, bevor 30 Minuten in einer Sorvall RC5C-Zentrifuge mit einem GSA-Rotor bei 10000 UpM zentrifugiert wurde.
  • Der das Derivat enthaltende Überstand wurde durch ein 5-μm-Filter zur Entfernung eventuell vorhandener partikulärer Substanz filtriert, sechsfach mit 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 mit 1 mg/ml Natriumazid bei 4°C verdünnt und unter maximalem Druck in einer mit einer S10Y10-Kartusche (Ausschlußgrenze: 10 kDa) ausgestatteten DC20-Ultrafiltrationsvorrichtung von Amicon gegen 10 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid pH 7,4 (90 Liter) mit 1 mg/ml Natriumazid ultrafiltriert. Dabei bildete sich gegen Ende der Ultrafiltration ein Niederschlag.
  • Das Retentat (2,1 mg/ml Gesamtprotein, 1,7 mg/ml Produkt) wurde in 4-Liter-Polypropylenbehältern mit Schraubverschluß gesammelt und über Nacht bei 37°C inkubiert. Der dabei gebildete Niederschlag wurde durch 45 minütige Zentrifugation bei 5000 UpM in einer Sorvall-RC3C abgetrennt und der Überstand bei 4°C gelagert.
  • Die Überprüfung mittels SDS-PAGE und rpHPLC zeigte, daß während der abschließenden Hitzebehandlung E. coli-Proteinverunreinigungen, Produktoligomere sowie Abbauprodukte selektiv gefällt wurden, wobei ungefähr 85% des gewünschten Produkts in Lösung verblieben. Die hoch angereicherte geklärte, hitzebehandelte Produktlösung war biologisch voll aktiv und über 2 Wochen bei 37°C und 20 mg/ml stabil, ohne Anzeichen eines proteolytischen Abbaus und mit weniger als 20% Präzipitation. Damit wurde ein ausgezeichnetes Zwischenprodukt für die weitere chromatographische Reinigung bereitgestellt.
  • Referenzbeispiel 11
  • Herstellung von menschlichem [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]-G-CSF unter Verwendung eines Produktionsvektors mit trp-Promotor
    • a) Das Plasmid pICI1239 (beschrieben in Referenzbeispiel 7) wurde mit EcoRI und SalI in Puffer H wie zuvor beschrieben verdaut. Das kleine, den trp-Promotor, die Ribosombindungsstelle sowie das Gen für [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF enthaltende EcoRI-SalI-Fragment wurde aus einem 0,7%igen Agarosegel unter Verwendung von Geneclean (TM) isoliert. Aus pICI 0080 (siehe Referenzbeispiel 6) wurde durch Verdauung mit EcoRI und XhoI in Puffer H ein Vektorfragment hergestellt und das große EcoRI-XhoI-Fragment aus einem 0,7%igen Agarosegel unter Verwendung von Geneclean (TM) isoliert. Das kleine EcoRI-SalI-Fragment wurde in das EcoRI-XhoI-Vektorfragment ligiert, wobei ein 2 : 1 molarer Überschuß an Insert zu Vektor, wie zuvor beschrieben, verwendet wurde, und der Ligationsansatz dann zur Transformation des E. coli-Stamms MSD 522 eingesetzt. Die Transformanten wurden auf das Wachstum auf L-Agarplatten mit Tetracyclin (15 μg/ml) selektioniert. Drei Kolonien wurden ausgewählt und in M9-Minimalmedium (75 ml) mit Supplementen und Tetracyclin (15 μg/ml) 20 Stunden auf einem Reziprokschüttler bei 37°C angezogen. Die Anhäufung von Protein wurde mittels Scanning mit Coomassie Blue angefärbten SDS-PAGE-Gelen ganze Zelllysate gemessen. Alle drei Klone exprimierten [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF . Plasmid DNA aus einer der Kolonien wurde mit pICI1327 bezeichnet und die Sequenz des Promotors und Gens durch Didesoxy-Standardsequenzierverfahren wie zuvor beschrieben bestätigt.
  • b) Fermentation
  • pICI 1327 wurde in dem E. coli-Stamm MSD 522 transformiert, und die erhaltenen Rekombinanten wurden gereinigt und in Form von Glycerin-Stammkulturen bei –80°C gehalten.
  • Der Stammkultur wurde ein Aliquot entnommen und auf Tetracyclin-Agarplatten zur Trennung von Einzelkolonien nach Wachstum über Nacht bei 37°C ausgestrichen. Eine gewünschte Einzelkolonie wurde entnommen und in 10 ml Tetracyclin-Brühe resuspendiert, und unmittelbar danach wurden 3 jeweils 75 ml Tetracyclin-Brühe enthaltende 250-ml-Erlenmeyerkolben mit jeweils 100 μl angeimpft. Nach 16 h Wachstum bei 37°C auf einem Reziprokschüttler wurden die Inhalte der Kolben vereinigt und zur Animpfung eines Fermenters mit 20 L Wachstumsmedium verwendet.
  • Figure 01490001
  • Die Fermentationen erfolgten danach bei einer Temperatur von 37°C und einem durch automatische Zugabe einer 6 M Natriumhydroxidlösung kontrollierten pH-Wert von 6,7. Der eingestellte Wert für die gelöste Sauerstoffspannung (dissolved oxygen tension, dOT) lag bei 50% Luftsättigung und wurde zunächst über die automatische Einstellung der Rührergeschwindigkeit des Fermenters kontrolliert. Die anfangs 20 L/Min., entsprechend einem Volumen pro Volumen pro Minute (VVM), betragende Luftzufuhr in den Fermenter wurde auf 50 L/Min. (2,5 VVM) erhöht, sobald die Fermenter-Rührergeschwindigkeit 80–90% ihres Maximums erreicht hatte. Da die Sauerstoffübertragungsgeschwindigkeit (oxygen transfer rate (OTR) der Fermenter nicht in der Lage war, mit der Sauerstoffaufnahmegeschwindigkeit (oxygen uptake rate, OUR) der Bakterien bei einer Zelldichte oberhalb der einer OD550 von 50 unter den beschriebenen Bedingungen entsprechenden Zelldichte Schritt zu halten, wurde bei Zelldichten oberhalb dieses Werts die dOT im Fermenter bei 50% Luftsättigung gehalten, indem die Sauerstoffaufnahmegeschwindigkeit der Bakterien beschränkt wurde. Dies wurde dadurch erreicht, daß das Medium so formuliert wurde, daß es bei einer OD550 von 50 zu einem Kohlenstoff-limitierten Medium wurde, und danach die limitierende Grundstoffquelle zusammen mit Ammoniumsulfat und Hefeextrakt mit einer Geschwindigkeit, durch die die bakterielle Wachstumsgeschwindigkeit beschränkt wurde, zugefüttert wurde.
  • Die Fermentationen wurden über 18 h durchgeführt, wobei während dieser Zeit Proben zur Messung der optischen Dichte (OD550), des Zelltrockengewichts und der Anhäufung von menschlichem [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]-G-CSF in den Zellen entnommen wurden. Die Anhäufung von menschlichem [Met–1, Ar11, Ser17,27,60,65]-G-CSF wurde durch Scanning von mit Coomassie blue angefärbten SDS-PAGE-Gelen ganzer Zelllysate der Bakterienproben gemessen, wie es im Fachgebiet allgemein bekannt ist.
  • Sobald die OD550 einen Wert von 35 erreicht hatte (8,5 h), wurde eine Lösung aus Casein-Hydrolysat (100 g/l Oxzoid L41) mit einer Geschwindigkeit von 0,75 g/l/h in die Fermenter gepumpt.
  • Sobald die OD550 einen Wert von ungefähr 50 erreicht hatte, war die zugeführte Kohlenstoffquelle im Fermentationsansatz erschöpft, was zu einem raschen Anstieg der dOT von 50% Luftsättigung führte. An diesem Punkt wurde eine Nährlösung mit Glycerin (470 g/l), Hefeextrakt (118 g/l) und Ammoniumsulfat (118 g/l) in die Fermenter mit einer Geschwindigkeit, durch die die dOT auf einen Wert von 50% Luftsättigung zurückgeführt und dann darauf gehalten wurde, wobei der Fermenterrührer bei ca. 70–80% seines Maximums arbeitete, gepumpt. Die Zufütterung von Casein-Hydrolysat wurde während der gesamten Zeit bei 0,75 g/l/h gehalten. Sobald nach ungefähr 18 Stunden die mikroskopische Untersuchung der Kultur zeigte, daß in einer Mehrzahl der Zellen große Einschlußkörperchen vorlagen, wurden die Bakterien in einer Sorval-RC3B-Zentrifuge (7000 g, 30 Min., 4°C) geerntet und bei –80°C eingefroren gelagert.
  • c) Reinigung
  • Die Reinigung wurde wie in Referenzbeispiel 3 (f) durchgeführt.
  • Referenzbeispiel 12
  • Herstellung von menschlichem [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]-G-CSF mit einem den T7A3-Promotor enthaltenden Produktionsvektor
    • a) Ein einen T7A3-Promoter, eine trp-Leader-Ribosombindungsstellensequenz sowie ein Gen für [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF enthaltendes EcoRI-SalI-Fragment wurde in M13 mp18 subkloniert, wie in Teil d) des Referenzbeispiels 3 beschrieben. Die Sequenz des EcoRI-SalI-Fragments ist in SEQ ID No 47 und 3 aufgeführt, wobei SEQ ID No 47 aus der EcoRI-Restriktionsstelle (Nukleotide 1–6), der A3-Promotorsequenz des bakteriophagen T7 (Nukleotid 7–52), der trp-Leader-Ribosombindungsstellensequenz (Nukleotide 53–78) sowie dem Translationsstartcodon (Nukleotide 79– 81) besteht. In 3 ist die in der SalI-Restriktionsstelle endende Nukleotidsequenz von menschlichem [Met–1, Ser17,27]-G-CSF aufgeführt. Dabei ist ersichtlich, daß das 3'-terminale ATG-Codon der SEQ ID No 47 unmittelbar vor dem ACT-Codon, das für Threonin (Aminosäure 1) in 3 codiert, liegt. Die 5'-Nukleotidsequenz AATTCAGT fehlt somit im EcoRI-SalI-Fragment. Das EcoRI- SalI-Fragment läßt sich auch durch Ausschneiden aus pICI1295 (siehe Referenzbeispiel 31) herstellen. Eine stellengerichtete Mutagenese wurde an Einzelstrang-DNA, wie in Referenzbeispiel 6 beschrieben, durchgeführt, indem zur Umwandlung des Codons für Gln in Position 11 zu Arg das Oligonukleotid SEQ ID No 28 verwendet wurde. Doppelsträngige RF-DNA wurde aus einem Plaque mit dem Gln11 → Arg11-Austausch wie im Referenzbeispiel 7 beschrieben präpariert, mit der Ausnahme, daß die Inkubation im Schritt B3 3 Stunden statt 5 Stunden dauerte, und mit EcoRI (wie zuvor beschrieben) und SnaBI (wie in Referenzbeispiel 13 beschrieben) verdaut. Das erhaltene, 144 by lange, den T7A3-Promotor, die trp-Leader-Ribosombindungsstellensequenz und das Genfragment mit dem Arg11-Codon enthaltende EcoRI-SnaBI-Fragment wurde isoliert und mit einem mit EcoRI/SnaBI geschnittenen Vektor aus pICI1327 (der die Codons für Ser60 und Ser65 enthält und in Referenzbeispiel 11 beschrieben ist) ligiert. Der Ligationsansatz wurde zur Transformation des E. coli-Stamms MSD522 verwendet, und Transformanten wurden auf Wachstum auf L-Agarplatten mit Tetracyclin (15 μg/mg) selektioniert. Die Plasmid-DNA aus einer Kolonie mit der erwarteten T7A3-Promotor- sowie der [Met–1, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF-Gensequenz wurde durch Sequenzieren der DNA aus dem isolierten Plasmid identifiziert und mit pICI1386 bezeichnet. Die Fermentation wurde nach zwei unten angegebenen alternativen Verfahren (b) und (c) durchgeführt. Dabei wurde das Verfahren (b) bei 37°C durchgeführt, wobei nach 16 Stunden Fermentation, wie beschrieben, eine mikrobielle Biomasse von 35 g/l vorlag und die geschätzte Anhäufung von menschlichem [Met–1, Ser17,27,60,65]-G-CSF 7 g/l Fermentationsbrühe betrug. Das Verfahren (c) wurde bei 30°C durchgeführt, wobei die Fermentation aufgrund der niedrigeren Fermentationstemperatur entsprechend langsamer erfolgte. Im Hinblick auf Verfahren (c) betrug die mikrobielle Biomasse nach 35 Stunden 55 g/l und die geschätzte Anhäufung des menschlichen [Met–1, Ser17,27,60,65]-G-CSF 15 g/l Fermentationsbrühe.
    • b) Der vom E. coli Genetic Stock Centre erhaltene E. coli-Stamm CGSC6300 (Genotyp F–, λ–, lac+) wurde mit dem Plasmid pICI1386 transformiert. Der erhaltene Stamm CGSC6300 (pICI1386) wurde gereinigt und in Form von Glycerin-Stammkulturen bei –80°C aufbewahrt. Der Stammkultur wurde ein Aliquot entnommen und auf L-Tetracyclin-Agarplatten zur Trennung von Einzelkolonien nach Wachstum über Nacht (16 h) bei 37°C ausgestrichen. Eine Einzelkolonie von CGSC6300 (pICI1386) wurde aufgenommen und in 10 ml L-Tetracyclinbrühe resuspendiert, und unmittelbar danach wurden 20 jeweils 75 ml L-Tetracyclin-Brühe enthaltende 250-ml-Erlenmeyerkolben mit jeweils 100 μl angeimpft. Nach 16 h Wachstum bei 37°C auf einem Reziprokschüttler. wurden die Inhalte der Kolben vereinigt und zur Animpfung eines Fermenters mit 20 Litern modifiziertem LCM50-Wachstumsmedium eingesetzt. Die Zusammensetzung des Wachstumsmediums ist in Tabelle 1 dargestellt.
  • TABELLE 1
    Figure 01530001
  • Figure 01540001
  • Die Fermentation erfolgte danach bei einer Temperatur von 37°C und einem durch automatische Zugabe einer 6 M Natriumhydroxidlösung kontrollierten pH-Wert von 6,7. Der eingestellte Wert für die gelöste Sauerstoffspannung (dissolved oxygen tension, dOT) lag bei 50% Luftsättigung und wurde zunächst über die automatische Einstellung der Rührergeschwindigkeit des Fermenters kontrolliert. Die Luftzufuhr in dem Fermenter betrug zu Anfang 20 L/Min., entsprechend 1,0 Volumen Volumen pro Minute (VVM), und wurde manuell auf 45 L/Min. erhöht, sobald die Rührergeschwindigkeit des Fermenters ihr Maximum erreicht hatte (1000 UpM). Die Fermentation wurde über 16 h durchgeführt, wobei während dieser Zeit Proben zur Messung der optischen Dichte der Kultur (OD550), der Biomassenkonzentration, der Gesamtkonzentration von mikrobiellem Protein und der Anhäufung von menschlichem [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]-G-CSF in den Bakterienzellen entnommen wurden. Die Anhäufung wurde mittels Scanning von mit Coomassie Blue angefärbten SDS-PAGE-Gelen ganzer Zelllysate der Bakterienproben gemessen, wie es im Fachgebiet allgemein bekannt ist. Die Gesamtmenge an mikrobiellem Protein wurde nach dem Verfahren von Lowry abgeschätzt. 4,5 h nach Einimpfen wurde eine Hefeextraktlösung (225 g/L) mit 1,7 g/L/h in den Fermenter gepumpt.
  • Sobald die zugeführte Kohlenstoffquelle (Glycerin) im Wachstumsmedium erschöpft war, stieg die dOT von 50% Luftsättigung rasch an. An diesem Punkt wurde eine Nährlösung mit Glycerin (714 g/l) und Ammoniumsulfat (143 g/L) zugepumpt. Da die bakterielle Sauerstoff-Sulfat-Geschwindigkeit (Oxygen Sulphate Rate, OUR) die miximale Sauerstoffübertragungsgeschwindigkeit des Fermenters (Oxygen Transfer Rate, OTR) unmittelbar vor Erschöpfung der Kohlenstoffquelle im Wachstumsmediumansatz erreichte, wurde die Nährlösung in den Fermenter mit einer Geschwindigkeit gepumpt, durch die die bakterielle OUR auf ungefähr 80–90% der maximalen OTR der Fermenter beschränkt wurde. Die Fütterungsgeschwindigkeit wurde manuell so eingestellt, daß die dOT unter den beschriebenen Bedingungen auf einen Wert von 50% Luftsättigung zurückgeführt und dann darauf gehalten wurde.
    • c) Der in (b) beschriebene Fermentationsprozeß wurde wiederholt, jedoch für 35 Stunden bei einer Temperatur von 30°C. Mit Ausnahme der Fermentationstemperatur von 30°C waren die Medium- und Fermentationsbedingungen zu den in (b) beschriebenen identisch.
    • d) Die Reinigung wurde wie in Referenzbeispiel 3 (f) durchgeführt.
  • Referenzbeispiel 13
  • A. Herstellung von [Met–1, Ser17]hu-G-CSF
  • Die in Referenzbeispiel 5 beschriebene Vorgehensweise für die Herstellung von [Met–1, Ser17,27]-hu-G-CSF wurde mit den folgenden Ausnahmen wiederholt:
    • 1) Der Duplex für die Phosphorylierung wurde aus den Oligonukleotidsequenzen SEQ ID Nr. 24, 25, 3 und 4 hergestellt, wobei die Sequenzen SEQ ID Nr. 3 bzw. 4 die in den Referenzbeispielen 3, 4 und 5 eingesetzten SEQ ID Nr. 26 bzw. 27 ersetzen.
    • 2) Der Duplex, auf dem in (1) Bezug genommen wird, wurde mit T4-Polynucleotidkinase phosphoryliert, jedoch mit SnaBI (10 Einheiten) in 1 × M-Puffer (BC; 30 μl) 2 Stunden bei 37°C verdaut.
    • 3) Nach Reinigung mit Ethanol wurde im Gegensatz zum 143 by großen EcoRI-MstII-Fragment das 72 by große EcoRI-SnaBI-Fragment gereinigt.
    • 4) Das synthetische EcoRI-SnaBI-Fragment wurde in den Plasmidvektor pAG88, wie in Referenzbeispiel 1 beschrieben, kloniert, wobei pAG88 zur Herstellung des Vektors mit SnaBI (20 Einheiten; BCL) in 1 × M-Puffer (BCL: 100 μl) statt mit MstII in 1 × H-Puffer 2 Stunden bei 37°C verdaut wurde.
    • 5) Nach der Fällung mit Ethanol wurde statt des großen EcoRI-MstII-Fragments das große EcoRI-SnaBI-Fragment auf einem 1%igen Agarosegel gereinigt.
    • 6) Das das Gen für [Met–1, Ser17]hu-G-CSF enthaltende Plasmid wurde mit pICI1105 bezeichnet.
  • B. Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem [Met–1, Ser17hu-G-CSF
  • Eine Lösung aus [Met–1, Ser17]hu-G-CSF (300 mg, 6,25 mg/ml) in Wasser wurde mit 1,1 M Natriumborat pH 8,9 auf 75 ml verdünnt, so daß eine Proteinlösung (4 mg/ml) in 0,4 M Borat, pH 8,7 erhalten wurde. Zu dieser Lösung wurde unter Rühren eine Wasserlösung (75 ml) von Methylpolyethylenglykol-p-nitrophenylcarbonat, MG ca. 5000, (Sigma Chemical Co Ltd) (100 Äquivalente pro Mol Protein, 20 Äquivalente pro Aminogruppe) zugetropft. Die Reaktion wurde bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt und durch Zutropfen von Ethanolamin-Hydrochlorid pH 8 (10 Äquivalente pro Mol aktiviertem Methylpolyethylenglykol) abgestoppt. Das Reaktionsgemisch wurde mit 0,1 M Ammoniumhydrogencarbonat pH 8 auf 350 ml verdünnt und nacheinander in einer mit einer YM30-Membran (MG Ausschlußgrenze 30 kDa) ausgestatteten Amicon-Rührzelle und mit diesem Lösungsmittel verdünnt, bis keine gelbe Farbe mehr vorhanden war. Das letzte Konzentrat (25 ml) wurde auf einer mit PBS-Azid equilibrierten und eluierten Ultrogel-AcA54-Säule (5 × 90 cm) chromatographiert. Das modifizierte Protein enthaltende Fraktionen wurden durch Verfolgen des Proteins bei 280 nm und von Methylpolyethylenglykol mittels Iod/Kaliumiodid-Titration identifiziert, vereinigt und ausgiebig gegen Wasser dialysiert. Dieses Produkt wurde auf einer Amicon-YM30-Membran (MG-Ausschlußgrenze 30 kDa) auf 5 mg/ml konzentriert, unter sterilen Bedingungen durch ein 0,22 μ-Filter filtriert und für weitere Untersuchungen bei 4°C gelagert.
  • Mit einer SDS-PAGE des modifizierten Endprodukts wurde gezeigt, daß kein nichtumgesetzter [Met–1, Ser17]hu-G-CSF mehr vorhanden war, wobei das gesamte Produkt als hochmolekulare verschmierte Bande lief. Die Titration der Retentate und Filtrate mit Iod/Kaliumiodid zeigte, daß durch die wiederholte Ultrafiltration auf einer YM30-Membran bei pH 8,0 praktisch das gesamte nichtproteingebundene Methylpolyethylenglykol abgetrennt worden war. Das Endprodukt enthielt etwa 3,5 Mole kovalent gebundenes Methylpolyethylenglykol pro Mol Protein. Die spezifische Aktivität des nichtmodifizierten Derivats, 0,8 × 109 U/mg, sank beim modifizierten Produkt auf 0,8 × 108 U/mg (10%). Das Produkt war vollkommen stabil und zeigte keine Änderung der spezifischen Aktivität in Lösung bis zu 10 mg/ml (bezogen auf Protein) über 14 Tage bei 37°C.
  • Referenzbeispiel 14
  • Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem menschlichem [Met–1, Arg11,23, Ser17,27,60,65]-G-CSF
  • A. Herstellung von [Met–1, Arg11,23, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF
  • Als mutagene Matrize wurde das Gen für [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF enthaltendes M13mp18 wie im Teil (d) des Referenzbeispiels 3 beschrieben hergestellt, wobei pICI1080 durch das Plasmid pICI1239 ersetzt wurde. Die in Referenzbeispiel 7 beschriebene Vorgehensweise wurde wiederholt, wobei die obige Matrize mit dem mit SEQ ID No 38 bezeichneten mutagenen Oligonukleotid verwendet wurde. Diese dient zur Umwandlung des Codons für Lys in Position 23 zu Arg. Doppelsträngige RF-DNA wurde aus einem Phagen, der den gewünschten Austausch enthielt, präpariert und die Expressionskassette wie im Referenzbeispiel 15 (siehe unten) unter Erhalt von pICI1388 isoliert und kloniert.
  • Das weitere Vorgehen bezüglich Erhalt der Titelverbindung erfolgte wie in den Referenzbeispielen 3 und 4 beschrieben.
  • B. Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem [Met–1, Arg11,23, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF
  • Eine Lösung aus [Met–1, Arg11,23, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF (300 mg) in 0,1 M Natriumborat, pH 8,0 wurde mittels Ultrafiltration auf einer Amicon-YM10-Membran (MG- Ausschlußgrenze 10 kDa) auf 37,5 ml eingeengt. Zu dieser Lösung gab man ein gleiches Volumen 0,8 M Natriumborat pH 8,8 und anschließend in Wasser (75 ml) gelöstes Methylpolyethylenglykol-p-Nitrophenylcarbonat (MG ca. 5000) (Sigma Chemical Company Ltd) (100 Äquivalente pro Mol [Met–1, Arg11,23, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF). Man ließ die Reaktion unter leichtem Rühren 3 Stunden bei 20°C ablaufen und stoppte durch Zugabe von 1 M Ethanolamin-Hydrochlorid pH 8,0 (15 ml, 10 Äquivalente pro Mol aktiviertes Methylpolyethylenglykol) ab. Das Reaktionsgemisch wurde mit 0,1 M Ammoniumhydrogencarbonat pH 8,0 auf 500 ml verdünnt und gegen 10 Liter des gleichen Puffers unter Verwendung eines mit einer S1Y30 Membran (MG-Ausschlußgrenze 30 kDa) ausgestatteten CH2A-IS Spiral Cartridge System von Amicon diafiltriert, bis kein gelbes p-Nitrophenol mehr im Retentat sichtbar war. Das Retentat wurde auf 300 ml eingeengt und in eine mit einer YM30-Membran (Ausschlußgrenze 30 kDa) ausgestatteten Rührzelle 8400 von Amicon gegeben. Das Retentat wurde auf 50 ml eingeengt und mit 0,1 M Ammoniumhydrogencarbonat, pH 8,0 wieder auf 300 ml verdünnt. Dieser Vorgang wurde viermal wiederholt und das Produkt schließlich auf etwa 25 ml eingeengt. Die konzentrierte Produktlösung wurde auf einer mit 10 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid pH 7,1 mit 1 mg/ml Natriumazid (PBS-Azid) equilibrierten Ultrogel-AcA54-Säule (5 × 90 cm) chromatographiert. Das modifizierte Protein enthaltende Fraktionen wurden durch Verfolgen des Proteins bei 280 nm und von Methylpolyethylenglykol mittels Iod/Kaliumiodid-Titration (CR Acad Sci Paris 274, 1617, 1972) identifiziert, vereinigt und ausgiebig gegen Wasser dialysiert. Das Endprodukt wurde mittels Ultrafiltration auf einer Amicon-Y30-Membran auf mehr als 11,5 mg/ml aufkonzentriert, durch ein 0,22 μm-Filter sterilfiltriert und für weitere Untersuchungen bei 4°C gelagert.
  • Eine SDS-PAGE des modifizierten Endprodukts zeigte an, daß kein nichtumgesetzter [Met–1, Arg11,23, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF mehr vorhanden war, wobei das gesamte Produkt in Form einer verschmierten Bande mit hohem MG lief. Die Titration der Filtrate und Retentate mit Iod/Kaliumiodid zeigte, daß durch die wiederholte Diafiltration auf einer YM30-Membran bei pH 8,0 praktisch das gesamte nichtproteingebundene Methylpolyethylenglykol abgetrennt worden war. Das Endprodukt enthielt etwa 3,5 Mole kovalent gebundenes Methylpolyethylenglykol pro Mol Protein. Die spezifische Aktivität des nichtmodifizierten Derivats, 2,5 × 109 U/mg, sank beim modifizierten Produkt auf 3,5 x 108 U/mg (14%). Das Produkt war vollkommen stabil und zeigte keine Änderung der spezifischen Aktivität in Lösung bis zu 10 mg/ml (bezogen auf Protein) über 14 Tage bei 37°C.
  • Referenzbeispiel 15
  • Herstellung von mit Methyl-Polyethylen-Glykol 5000 modifiziertem menschlichem [Met–1, Ala26,28, Ser17,27, Arg30]-G-CSF
  • A) Herstellung von [Met–1, Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Arg30]hu-G-CSF
  • Als mutagene Matrize wurde das Gen für [Met–1, Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Lys30]hu-G-CSF enthaltendes M13mp18 wie im Teil (d) des Referenzbeispiels 3 beschrieben hergestellt, wobei pICI1080 durch das Plasmid pICI1266 ersetzt wurde. Die in Referenzbeispiel 7 beschriebene Vorgehensweise wurde wiederholt, wobei die obige Matrize mit dem mit SEQ ID No 37 bezeichneten mutagenen Oligonukleotid verwendet wurde. Dieses dient zur Umwandlung des Codons für Lys in Position 30 zu Arg. Doppelsträngige RF DNA wurde aus einem den gewünschten Austausch enthaltenden Phagen präpariert. Eine EcoRI-SalI-Expressionskassette wurde isoliert und in pICI0080, wie im Referenzbeispiel 11 beschrieben, kloniert, so daß pICI1343 erhalten wurde.
  • Das weitere Vorgehen bezüglich des Erhalts der Titelverbindung erfolgte wie in Referenzbeispiel 7 beschrieben, und die Reinigung erfolgte wie in Referenzbeispiel 8 beschrieben.
  • B) Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem [Met–1, Glu15, Ala26,28, Ser17,27, Arg30]hu-G-CSF
  • Dieser wurde wie in Referenzbeispiel 14 hergestellt. Das Endprodukt enthielt etwa 4 Mol kovalent gebundenes Methylpolyethylenglykol pro Mol Protein. Die spezifische Aktivität des nichtmodifizierten Derivats, 0,9 × 109 U/mg, sank beim modifizierten Produkt auf 0,6 × 108 U/mg (7%) ab. Das Produkt war vollkommen stabil und zeigte keine Änderung der spezifischen Aktivität in Lösung bis zu 10 mg/ml (bezogen auf Protein) über 14 Tage bei 37°C.
  • Referenzbeispiel 16
  • Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem menschlichem [Met–1, Ser17,27,115,116, Glu111]hu-G-CSF
  • A) Herstellung von menschlichem [Met–1, Ser17,27,115,116, Glu111]-G-CSF
  • Die in Referenzbeispiel 7 beschriebene Vorgehensweise wurde wiederholt, wobei als mutagene Matrize das Gen für [Met–1, Ser17,27]-G-CSF, beschrieben im Referenzbeispiel 3 bzw. 5, enthaltendes M13mp18 verwendet wurde. Als mutagenes Oligonukleotid wurde das mit SEQ ID No 30 bezeichnete (wie unten definiert) verwendet.
  • Das Triplet GCT dient zur Umwandlung von Thr in Position 116 zu Ser, das Triplet AGA dient zur Umwandlung von Thr in Position 115 zu Ser und das Triplet TTC dient zur Umwandlung von Ala in Position 111 zu Glu. Das mutagene Verfahren entsprach im wesentlichen dem für Referenzbeispiel 7 beschriebenen, wobei die Expressionskassette unter Erhalt von pICI 1243 in das Expressionsplasmid übertragen wurde. Die Fermentation und Reinigung erfolgte wie in Referenzbeispiel 3 und 4 beschrieben.
  • B) Herstellung von Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem [Met–1, Ser17,27,115,116]hu-G-CSF
  • Dieser wurde wie in Referenzbeispiel 14 hergestellt. Das Endprodukt enthielt etwa 4 Mol kovalent gebundenes Methylpolyethylenglykol pro Mol Protein. Die spezifische Aktivität des nichtmodifizierten Derivats, 0,7 × 109 U/mg, sank beim modifizierten Produkt auf 0,8 × 108 U/mg (11%) ab. Das Produkt war vollkommen stabil und zeigte keine Änderung der spezifischen Aktivität in Lösung bis zu 10 mg/ml (bezogen auf Protein) über 14 Tage bei 37°C.
  • Referenzbeispiel 17
  • Herstellung von Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem [Met–1, Arg11,165, Ser17,27, Lys58]hu-G-CSF
  • A) Herstellung von menschlichem [Met–1, Arg11, Ser17,27, Lys58, Arg165]-G-CSF
  • Die in Referenzbeispiel 7 beschriebene Vorgehensweise wurde wiederholt, wobei als mutagene Matrize das Gen für [Met–1, Ser17,27]-G-CSF, beschrieben in Referenzbeispiel 3 und 5, enthaltendes M13mp18 verwendet wurde. Als mutagene Oligonukleotide wurden die mit SEQ ID No 28, SEQ ID No 31 und SEQ ID No 32 bezeichneten (wie unten definiert) verwendet.
  • Das Triplet TTT in SEQ ID No 31 dient zur Umwandlung von Trp in Position 58 zu Lys, und das zweite GCG-Triplet in SEQ ID No 32 dient zur Umwandlung von Tyr in Position 165 zu Arg.
  • Das mutagenese Verfahren wurde zunächst als Doppelprimer-Experiment durchgeführt, wobei SEQ ID No 31 und SEQ ID No 32 als mutagene Oligonukleotide verwendet wurden, wie für Referenzbeispiel 6 beschrieben. Dadurch wurden zwei Plaques erhalten, die beide den SEQ ID No 32-Austausch (Tyr 165 Arg), jedoch nicht den SEQ ID No 31-Austausch aufwiesen. Aus einem dieser Plaques wurde wie in Referenzbeispiel 3 beschrieben Einzelstrang-DNA präpariert. Diese DNA wurde als mutagene Matrize in einer Doppelprimer-Mutagenese unter Verwendung von SEQ ID No 28 und SEQ ID No 31 des mutagenen Primers eingesetzt. Dadurch wurden 2 Plaques erhalten, von denen bei einem der vollständige Satz an Austauschen eingebaut war, und die Expressionskassette wurde unter Erhalt von pICI1246 in das Expressionsplasmid überführt. Die Fermentation und Reinigung erfolgte wie in Referenzbeispiel 3 und 4 beschrieben.
  • B) Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem [Met–1, Arg11,165, Ser17,27, Lys58]hu-G-CSP
  • Dieser wurde wie in Referenzbeispiel 14 hergestellt. Das Endprodukt enthielt etwa 4,5 Mol kovalent gebundenes Methylpolyethylenglykol pro Mol Protein. Die spezifische Aktivität des nichtmodifizierten Derivats, 0,8 × 109 U/mg, sank beim modifizierten Produkt auf 0,1 x 109 U/mg (13%) ab. Das Produkt war vollkommen stabil und zeigte keine Änderung der spezifischen Aktivität in Lösung bis zu 10 mg/ml (bezogen auf Protein) über 14 Tage bei 37°C.
  • Referenzbeispiel 18
  • Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem menschlichem [Met–1, Ser17,27, Ala44,51,55, Lys49,58]-G-CSF
  • A) Herstellung von menschlichem [Met–1, Ser17,27, Ala44,51,55, Lys49,58]-G-CSF
  • Die in Referenzbeispiel 7 beschriebene Vorgehensweise wurde wiederholt, wobei als mutagene Matrize das in Referenzbeispiel 3 bzw. 5 beschriebene Gen für [Met–1, Ser17,27]-G-CSF enthaltendes M13mp18 verwendet wurde. Als mutagene Oligonukleotide wurden die mit SEQ ID No 35 und SEQ ID No 36 (wie unten definiert) verwendet. In SEQ ID No 35 dienen die Triplets AGC zur Umwandlung von Gly zu Ala in Position 51 bzw. Pro zu Ala in Position 44, und das Triplet TTT dient zur Umwandlung von Leu zu Lys in Position 49. In SEQ ID No 36 dient das Triplet TTT zur Umwandlung von Trp zu Lys in Position 58 und das zweite AGC-Triplet zur Umwandlung von Gly zu Aln in Position 55.
  • Die Mutagenese wurde als Doppelprimer-Experiment wie in Referenzbeispiel 6 beschrieben durchgeführt, wodurch 16 Plaques erhalten wurden. 8 Plaques wurden einem Screening mittels DNA-Sequenzierung, wie in Referenzbeispiel 7 beschrieben, unterzogen. Alle Plaques wiesen die SEQ ID No 36-Austausche (Gly55Ala, Trp58Lys) auf, doch hatte keiner von ihnen die SEQ ID No 35-Austausche. Aus einem dieser Plaques wurde wie in Referenzbeispiel 3 (d) beschrieben Einzelstrang-DNA präpariert und als mutagene Matrize in einer Einzelprimer-Mutagenese mit SEQ ID No 35 als mutagenem Primer eingesetzt. Dies ergab 50 Plaques, von denen 3 einem Screening mittels DNA-Sequenzierung unterzogen wurden, wobei 2 den kompletten Satz an Austauschen aufwiesen. Die Expressionskassette wurde unter Erhalt von pICI1297 in das Expressionsplasmid übertragen. Die Fermentation und Reinigung erfolgte wie in den Referenzbeispielen 3 und 4 beschrieben.
  • B) Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem [Met–1, Ser17,27, Ala44,51,55, Lys49,58]hu-G-CSF
  • Dieser wurde wie in Referenzbeispiel 14 hergestellt. Das Endprodukt enthielt etwa 3,5 Mol kovalent gebundenes Methylpolyethylenglykol pro Mol Protein. Die spezifische Aktivität des nichtmodifizierten Derivats, 0,75 × 109 U/mg, sank beim modifizierten Produkt auf 0,32 × 109 U/mg (47%) ab. Das Produkt war vollkommen stabil und zeigte keine Änderung der spezifischen Aktivität in Lösung bis zu 10 mg/ml (bezogen auf Protein) über 14 Tage bei 37°C.
  • Referenzbeispiel 19
  • Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem menschlichem [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]-G-CSF
  • A) Herstellung von [Met–1, Arg17,27,60,65]hu-G-CSF
  • Die in Referenzbeispiel 14 beschriebene Vorgehensweise wurde wiederholt, wobei das Oligonukleotid mit der Bezeichnung SEQ ID No 38 durch SEQ ID No 42 (diese dient zur Umwandlung des Codons für Lys in Position 16 zu Arg) unter Erhalt von pICI1387 ersetzt wurde.
  • Das weitere Vorgehen bezüglich des Erhalts von [Met–1, Arg11,16, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF sowie die Reinigung dieser Verbindung erfolgten wie in den Referenzbeispielen 3 und 4 beschrieben.
  • B) Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem [Met–1, Arg11,16, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF
  • Dieses Protein fiel bei ausgiebiger Dialyse gegen Wasser im letzten Schritt des in Referenzbeispiel 4 beschriebenen Reinigungsverfahrens aus. Der Niederschlag wurde in 0,1 M Natriumborat pH 8,0 wieder aufgelöst und mit Methylpolyethylenglykol 5000 wie in Referenzbeispiel 14 modifiziert. Das Endprodukt enthielt etwa 3,5 Mole kovalent gebundenes Methylpolyethylenglykol pro Mol Protein. Die spezifische Aktivität des nichtmodifizierten Derivats, 2,3 × 109 U/mg, sank beim modifizierten Produkt auf 3,6 x 108 U/mg (16%) ab. Das Produkt war vollkommen stabil und zeigte keine Änderung der spezifischen Aktivität in Lösung bis zu 10 mg/ml (bezogen auf Protein) über 14 Tage bei 37°C.
  • Referenzbeispiel 20
  • Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem menschlichem [Met–1, Arg11,34, Ser17,27,60,65]-G-CSF
  • A) Herstellung von [Met–1, Arg11, Arg11,34, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF
  • Die in Referenzbeispiel 14 beschriebene Vorgehensweise wurde wiederholt, wobei das mit SEQ ID No 38 bezeichnete Oligonukleotid durch die SEQ ID No 39 (diese dient zur Umwandlung des Codons für Lys in Position 34 zu Arg) unter Erhalt von pICI1389 ersetzt wurde.
  • Das weitere Vorgehen bezüglich Erhalts der Titelverbindung und die Reinigung der Titelverbindung erfolgten wie in Referenzbeispielen 3 und 4 beschrieben.
  • B) Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem [Met–1, Arg11,34, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF
  • Dieser wurde wie in Referenzbeispiel 14 hergestellt. Das Endprodukt enthielt etwa 4 Mol kovalent gebundenes Methylpolyethylenglykol pro Mol Protein. Die spezifische Aktivität des nichtmodifizierten Derivats, 1,4 × 109 U/mg, sank beim modifizierten Produkt auf 2,0 × 108 U/mg (14%) ab. Das Produkt war vollkommen stabil und zeigte keine Änderung der spezifischen Aktivität in Lösung bis zu 10 mg/ml (bezogen auf Protein) über 14 Tage bei 37°C.
  • Referenzbeispiel 21
  • Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem menschlichem [Met–1, Arg11,40, Ser17,27,60,65]-G-CSF
  • A) Herstellung von [Met–1, Arg11,40, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF
  • Die in Referenzbeispiel 14 beschriebene Vorgehensweise wurde wiederholt, wobei das mit SEQ ID No 38 bezeichnete Oligonukleotid durch die SEQ ID No 40 (diese dient zur Umwandlung des Codons für Lys in Position 40 zu Arg) unter Erhalt von pICI1390 ersetzt wurde.
  • Das weitere Vorgehen bezüglich Erhalts der Titelverbindung und die Reinigung der Titelverbindung erfolgten wie in Referenzbeispielen 3 und 4 beschrieben.
  • B) Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem [Met–1, Arg11,40, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF
  • Dieser wurde wie in Referenzbeispiel 14 hergestellt. Das Endprodukt enthielt etwa 4 Mol kovalent gebundenes Methylpolyethylenglykol pro Mol Protein. Die spezifische Aktivität des nichtmodifizierten Derivats, 1,3 × 109 U/mg, sank beim modifizierten Produkt auf 3,0 × 108 U/mg (23%) ab. Das Produkt war vollkommen stabil und zeigte keine Änderung der spezifischen Aktivität in Lösung bis zu 10 mg/ml (bezogen auf Protein) über 14 Tage bei 37°C.
  • Referenzbeispiel 22
  • Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem menschlichem [Met–1, Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5,11, Ser17,27,60,65]-G-CSF
  • A) Herstellung von [Met–1, Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5,11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF
  • Die in Referenzbeispiel 14 beschriebene Vorgehensweise wurde wiederholt, wobei das Oligonukleotid SEQ ID No 38 durch SEQ ID No 41 ersetzt wurde (dies dient zur Umwandlung der Codons für Thr, Leu, Gly und Pro in den Positionen 1, 3, 4 und 5 zu Ala, Thr, Tyr bzw. Arg unter Erhalt von pICI1391). Das Polypeptid dieses Beispiels verdeutlicht, daß die vorliegende Erfindung auf ein Polypeptid, das bekanntermaßen G-CSF-Aktivität besitzt, angewandt werden kann, um die Lösungsstabilität des Polypeptids zu verbessern. Bei dem bekannten Polypeptid handelt es sich um [Met–1, Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5, Ser17]hu-G-CSF, das in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 272,703 von Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd. beschrieben ist.
  • Das weitere Vorgehen bezüglich Erhalts der Titelverbindung sowie die Reinigung der Titelverbindung erfolgten wie in den Referenzbeispielen 3 und 4 beschrieben.
  • B) Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem [Met–1, Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF
  • Dieser wurde wie in Referenzbeispiel 14 hergestellt. Das Endprodukt enthielt etwa 4 Mol kovalent gebundenes Methylpolyethylenglykol pro Mol Protein. Die spezi fische Aktivität des nichtmodifizierten Derivats, 1,5 × 109 U/mg, sank beim modifizierten Produkt auf 2,0 × 108 U/mg (14%) ab. Das Produkt war vollkommen stabil und zeigte keine Änderung der spezifischen Aktivität in Lösung bis zu 10 mg/ml (bezogen auf Protein) über 14 Tage bei 37°C.
  • Referenzbeispiel 23
  • Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 2000 modifiziertem menschlichem [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65-G-CSF
  • a) Herstellung von Methylpolyethylenglykol-p-Nitrophenylcarbonat, MG ca. 2000
  • Zu einer Lösung aus p-Nitrophenylchlorformiat (2,32 g, 11,5 mMol) in Acetonitril (250 ml) wurde bei 0–5° unter Rühren Methylpolyethylenglykol, mittleres MG 2000 (Sigma Chemical Co Ltd) (20 g, 10 mMol) gegeben und anschließend Triethylamin (1,11 g, 1,53 ml, 11 mMol) zugetropft. Man ließ das Gemisch auf Raumtemperatur erwärmen und rührte 24 Std. bei 20°C. Das ausgefallene Triethylammonium-Hydrochlorid wurde durch Filtration abgetrennt (0,46 g von 1,375 g der Theorie) und das Filtrat nach Verdünnung mit 11 Diethylether (wasserfrei) 24 Std. bei 0–5°C gelagert. Ein weißer Niederschlag wurde durch Filtration gesammelt und nochmals gefällt, indem er in einem minimalen Volumen an Ethanol bei 35– 40°C gelöst und die Lösung dann auf 0°C abgekühlt wurde. Das Produkt wurde nochmals aus Acetonitril/Diethylether (1 : 5 v/v) unter Erhalt des Endprodukts ausgefällt, das mit Ether gewaschen und unter Erhalt von 15,5 g eines weißen Feststoffs im Vakuum getrocknet wurde. Die Mikroanalyse ergab C, 53,5, H, 9,1, N 0,4, Cl 0, was die Abwesenheit von Chlorformiat im Produkt zeigte.
  • b) Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 2000 modifiziertem [Met–1, Ar11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF
  • Eine Lösung aus [Met–1, Arg11, Ser17,22,60,65]hu-G-CSF (1,5 g) in PBS-Azid (300 ml, 5 mg/ml) wurde gegen 0,4 M Natriumborat pH 8,8 (7 × 71) auf ein Endvolumen von 375 ml (4 mg/ml) dialysiert. Zu dieser Lösung wurde unter Rühren eine Wasserlösung (375 ml) von Methylpolyethylenglykol-p-Nitrophenylcarbonat, MG ca. 2000 (10,0 g, 60 Äquivalente, 12 Äquivalente pro Aminogruppe auf [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF) zugetropft. Man ließ die Reaktion unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur 3 Std. ablaufen und stoppte sie dann durch Zutropfen von Ethanolamin-Hydrochlorid, pH 8,0 (10 Äquivalente pro Mol aktiviertes Methylpolyethylenglykol) ab. Das Reaktionsgemisch wurde auf einer YM10-Membran in einer Amicon-Rührzelle (MG-Ausschlußgrenze 10 kDa) bei 4°C auf ein Retentatendvolumen von 50 ml eingeengt. Das Retentat wurde mit 0,1 M Ammoniumhydrogencarbonat pH 8,0 (450 ml) verdünnt und nochmals auf 50 ml wie zuvor konzentriert. Dieser Vorgang wurde siebenmal wiederholt. Das letzte Konzentrat wurde in eine zweite, mit einer YM30-Membran (MG-Ausschlußgrenze 30 kDa) ausgestatteten Amicon-Rührzelle überführt, auf 500 ml verdünnt und nochmals auf 50 ml eingeengt. Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt und das Produkt auf ein Endvolumen von 50 ml eingeengt. Die konzentrierte Produktlösung wurde zu zwei gleichen Teilen auf einer mit PBS-Azid equilibrierten Ultrogel AcA54-Säule (5 × 90 cm) chromatographiert. Das modifizierte Protein enthaltende Fraktionen wurden durch Verfolgen des Proteins bei 280 nm und von Methylpolyethylenglykol mittels Iod/Kaliumiodid-Titration (C R Acad Sci Paris 274, 1617, 1972) identifiziert, vereinigt und ausgiebig gegen Wasser dialysiert. Die letzte Wasserlösung wurde in einer mit einer YM30-Membran ausgestatteten Amicon-Rührzelle auf ein Volumen von 50 ml eingeengt. Das Konzentrat wurde mit Wasser auf ein Volumen von 500 ml verdünnt, nochmals eingeengt und dieser Vorgang noch fünfmal wiederholt. Das letzte Konzentrat wurde durch ein 0,22-Mikron-Filter sterilfiltriert und für weitere Untersuchungen bei 4°C gelagert.
  • Proteinschätzungen mittels Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse deuteten auf eine Wiedergewinnung von insgesamt 47% [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF im modifizierten Endprodukt hin. Mittels einer PAGE-SDS des Reaktionsgemischs nach 3 Std. sowie der letzten Wasserlösung des Produkts wurde angedeutet, daß kein nicht umgesetztes Protein mehr vorhanden war, wobei das gesamte Produkt in Form einer verschmierten Bande mit hohem MG lief. Die Titration der Filtrate und Retentate mit Iod/Kaliumiodid zeigte, daß durch die wiederholte Ultrafiltration auf einer YM30-Membran im wesentlichen alle nichtproteingebundenen Methylpolyethylenglykolderivate abgetrennt worden waren. Dies wurde durch chromatographische Analyse mittels HPLC auf rpC4 (Dynamax 300A 12u) bestätigt, wobei mit einem Gradienten von 40 bis 90% Acetonitril – 0,1% TFA in Wasser – 0,1% TFA eluiert und die UV-Absorption bei 280 mm, die einen einzigen Spitzenwert ergab, verfolgt wurde. Die Fraktionen wurden gefriergetrocknet, in Wasser rekonstruiert und bezüglich Protein bei 280 nm und bezüglich Methylpolyethylenglykol mittels Titration mit Iod/Kaliumiodid verfolgt und zeigten dabei jeweils einen an gleicher Stelle auftretenden Spitzenwert. Eventuell noch vorhandenes nicht proteingebundenes Methylpolyethylenglykol wäre als deutlicher, früheluierender Iod/Kaliumiodid-positiver Spitzenwert nachgewiesen worden.
  • Die Iod/Kaliumiodid-Titration des kovalent an Methylpolyethylenglykol 2000 gebundenen [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF ergab unberechenbare Ergebnisse und ließ keine Abschätzung der PEG : Protein-Verhältnisse zu. Die spezifische biologische Aktivität des nichtmodifizierten modifizierten Derivats, 1,2 × 109 U/mg, sank beim modifizierten Produkt auf 1,5 × 108 U/mg (13%) ab. Das Produkt war vollkommen stabil und zeigte keine Änderung der spezifischen Aktivität in PBS-Lösung bis zu 10 mg/ml (bezogen auf Protein) über 14 Tage bei 37°C.
  • Referenzbeispiel 24
  • Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 750 modifiziertem menschlichem [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65-G-CSF
  • a) Herstellung von Methylpolyethylenglykol-p-Nitrophenylcarbonat, MG ca. 750.
  • Zu einer Lösung aus p-Nitrophenylchlorformiat (5, 1 g, 25, 3 mmol) in Acetonitril (50 ml) wurde bei 0–5°C unter Rühren Methylpolyethylenglykol, mittleres MG 750 (Sigma Chemical Co Ltd) (20 g, 26,67 mmol) gegeben und anschließend Triethylamin (2,69 g, 3,71 ml, 26,63 mmol) über 30 Min. zugetropft. Man ließ das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen und dann 8 Std. rühren. Das ausgefallene Triethylammonium-Hydrochlorid wurde durch Filtration aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt und das Filtrat mit Diethylether (wasserfrei) (11) verdünnt, vier Stunden auf 0°C abgekühlt und nochmals filtriert. Insgesamt wurden so 3,4 g Triethylammonium-Hydrochlorid gesammelt. Das Filtrat wurde unter vermindertem Druck eingedampft und in vacuo unter Erhalt von 23,5 g eines gelben wachsartigen Feststoffs getrocknet.
  • Die Mikroanalyse ergab Cl 0% was die Abwesenheit von Chorformiat im Produkt zeigte. Eine Lösung aus [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G- CSF (250 mg) in PBS-Azid (50 ml) wurde gegen Wasser und danach gegen 0,4 M Natriumborat pH 8,8 dialysiert. Zur letzten Lösung (50 ml) wurde bei Raumtemperatur eine Wasserlösung (50 ml) von Methylpolyethylenglykol-p-Nitrophenylcarbonat, MG ca. 750 (100 Äquivalente, 20 Äquivalente pro Aminogruppe auf [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF) unter Rühren zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Std. bei Raumtemperatur gerührt und dann durch Zutropfen von Ethanolamin-Hydrochlorid pH 8 (10 Äquivalente pro Mol aktiviertes Methylpolyethylenglykol) abgestoppt.
  • Das Reaktionsgemisch wurde in eine mit einer YM10-Membran (MG-Ausschlußgrenze 10 kDa) ausgestattete Amicon-Rührzelle überführt und konzentriert. Das Konzentrat (25 ml) wurde mit 0,1 M Ammoniumhydrogencarbonat pH 8 auf 350 ml verdünnt und auf ca. 25 ml eingeengt. Dieser Vorgang wurde fünfmal wiederholt. Das letzte Konzentrat (27 ml) wurde auf einer mit PBS-Azid equilibrierten und eluierten Ultrogel AcA54-Säule (5 × 90 cm) chromatographiert. Fraktionen mit dem modifizierten Protein wurden durch Verfolgen des Proteins bei 280 nm und von Methylpolyethylenglykol mittels Iod/Kaliumiodid-Titration identifiziert, vereinigt und ausgiebig gegen Wasser dialysiert. Das Endprodukt wurde in einer mit einer YM10-Membran filtrierten Amicon-Rührzelle konzentriert. Das letzte Konzentrat wurde durch ein 0,2-μ-Filter steril filtriert und für weitere Untersuchungen bei 4°C gelagert.
  • Proteinschätzungen mittels Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse deuteten auf eine Wiedergewinnung von insgesamt ungefähr 80% [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF im modifizierten Endprodukt hin. Die PAGE-SDS des Produkt ergab eine scharfe Bande und zeigte an, daß kein nicht umgesetzter [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF mehr vorhanden war.
  • Die Titration der Filtrate und Retentate mit Iod/Kaliumiodid zeigte, daß durch die wiederholte Ultrafiltration bei pH 8,0 auf einer YM10-Membran im wesentlichen alle nichtproteingebundenen Methylpolyethylenglykolderivate abgetrennt worden waren. Die Iod/Kaliumiodid-Titration des an Methylpolyethylenglykol gebundenen [Met–1, Arg11, Ser17,27,60,65]hu-G-CSF ergab sehr variable Ergebnisse und ließ eine Abschätzung der PEG : Protein-Verhältnisse nicht zu. Die spezifische biologische Aktivität des nichtmodifizierten Derivats, 1,2 × 109 U/mg, sank beim modifizierten Produkt auf 4 × 108 U/mg (33%) ab. Das Produkt war vollständig löslich und zeigte keine Änderung der spezifischen Aktivität in PBS-Lösung bis zu 10 mg/ml (bezogen auf Protein) über 14 Tage bei 37°C.
  • Referenzbeispiel 25
  • Charakterisierung der G-CSF-Derivate vor Modifizierung mit Methylpolyethylenglykol
  • Eine Wasserlösung der Derivate der Referenzbeispiele 1, 3, 7, 8 sowie 13–24 (Proteinkonzentration etwa 1 mg/ml) wurden auf einer Amicon-YM10-Membran bei 4°C auf mindestens 11 mg/ml Protein konzentriert. Um jegliche Präzipitation während der Konzentration zu vermeiden, wurde die Ausgangslösung mit pH 5,5 zunächst durch Zugabe von Ammoniumhydroxid bis zu einer Endkonzentration von etwa 0,25 mM auf pH 8,5 eingestellt. Nach der Konzentrierung war der pH-Wert der Lösung auf etwa 8,0 gesunken.
  • Die konzentrierte Proteinlösung wurde auf 10 mg/ml Protein (abgeschätzt nach einer einen A280-Wert von 1,0 ergebenden Lösung von 1 mg/ml) durch Zugabe von 20-fach konzentrierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung eingestellt. Die Lösung von 10 mg/ml Derivat in 10 mM. Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid, pH 7,4 (PBS) stellte eine allgemeine Stammlösung dar, von der aus die Homogenität, Identität, biologische Aktivität und Lösungsstabilität des Proteins ermittelt werden konnte.
  • Für jedes Derivat wurde gezeigt, daß es zu wenigstens 95% aus einer Komponente besteht, indem eine PAGE-SDS unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen gefahren wurde sowie mittels Reverse-Phase-HPLC. Durch wiederholte Analyse der Aminosäurezusammensetzung nach saurer Hydrolyse in 6 NHCl bei 110°C wurden die Aminosäureverhältnisse für jedes Derivat sowie eine genaue Messung der Proteinkonzentration in der Stammlösung erhalten. Diese Proteinkonzentration wurde zusammen mit dem Mittelwert der an mindestens 6 unterschiedlichen Tagen gewonnenen Bioassay-Titer zur Bestimmung der spezifischen Aktivität des Derivats verwendet. Die N-terminale Sequenzanalyse sowie die Analyse mittels Elektrospray-Massenspektrometrie ausgewählter Derivate ergaben die erwarteten Sequenzen und Molekulargewichte.
  • Stammlösungen von mit Methylpolyethylenglykol modifizierten G-CSF-Derivaten (Referenzbeispiel 1, 3, 7, 8 sowie 13–24) wurden auf ähnliche Weise hergestellt, so daß dadurch die in diesen Referenzbeispielen aufgestellten Daten bereitgestellt wurden.
  • Referenzbeispiel 26
  • Lösungsstabilität von G-CSF und seinen Derivaten
  • Ungefähre Verdünnungen der Stammlösung von G-CSF, dessen Derivaten sowie derjenigen G-CSF-Derivate, die mit Methylpolyethylenglykol modifiziert waren, in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (Phosphat Buffered Saline, PBS) bei 4°C, wie in Referenzbeispiel 25 beschrieben, wurden auf die Lösungsstabilität hin untersucht. Dabei wurden Lösungen von 1 mg/ml, 5 mg/ml und gelegentlich 10 mg/ml Protein in PBS 14 Tage bei 37°C inkubiert. Die Lösungen wurden in regelmäßigen Zeitabständen auf Zeichen für Präzipitation hin beobachtet. Nach 14 Tagen wurde jede Lösung 20 Minuten bei 140000 UpM zentrifugiert, der Überstand durch Dekantieren abgetrennt und ein eventuell vorhandenes Pellet wieder in PBS mit 1% (w/v) N-Lauroylsarcosin gelöst. Der Gesamtproteingehalt in jedem Überstand sowie dem wiedergelösten Niederschlag wurde über A280-Messungen abgeschätzt, und der Monomergehalt in nichtmodifizierten G-CSF sowie dessen Derivaten wurde über Reverse-Phase-HPLC abgeschätzt. Diese Schätzungen wurden als Prozentanteil der entsprechenden, von Lösungen zu Beginn der Inkubation sowie einer 14 Tage bei 4°C inkubierten 1-mg/ml-Lösung erhaltenen Daten ausgedrückt. Dabei wurden Variationen zwischen Gesamtprotein und Monomerschätzungen nur bei einigen der wiedergelösten Pellets beobachtet. Somit läßt sich der Prozentanteil des in Lösung verbleibenden Proteins in den Überständen aus der jeweiligen Ausgangskonzentration bestimmen.
  • Nach Modifikation mit Methylpolyethylenglykol zeigten G-CSF sowie alle Derivate vollkommende Lösungsstabilität bis zu 10 mg/ml, wie in den Referenzbeispielen 1, 3, 7, 8 sowie 13–24 angegeben.
  • Es konnte gezeigt werden, daß die spezifische Aktivität des Produkts in allen Überständen jeweils die gleiche wie in der Ausgangslösung ist, wobei in der PAGE-SDS unter reduzierenden bzw. nicht reduzierenden Bedingungen keine Unterschiede beobachtet wurden.
  • Referenzbeispiel 27
  • Bioassays
  • 1) G-CSF-Bioassay
  • Eine faktor-abhängige Zelllinie, Paterson – G-CSF (FDCP-G), erhalten vom Paterson Institute, Manchester, England, wurde mittels limitierender Verdünnung in Gegenwart von G-CSF kloniert. Ein auf G-CSF reagierender Clon mit der Bezeichnung Clon E7 wurde zur Bestimmung der menschlichen rekombinanten G-CSF-Aktivität verwendet. Dabei wurden 2,5 × 103 PDCP-G-Clon-E7-Zellen in 100 μl RPMI 1640 + 10% FCS zu einem gleichen Volumen RPMI 1640 + 10% FCS mit G-CSF gegeben. Jede G-CSF-Probe wurde über 10 jeweils sich verdoppelnde Verdünnungen gemessen. Das Endvolumen von RPMI 1640 (siehe Moore GE et al (1967) JAMA, 199, 519) + 10% FCS (foetal calf serum [fötales Kälberserum]) in jeder Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen betrug jeweils 200 μl. Die Mikrotiterplatte wurde bei 37°C in 5% CO2 in einem luftbefeuchteten Brutschrank 4 Tage inkubiert. Pro Vertiefung wurde 1,0 μCi titriertes Thymidin zugegeben und während der letzten 6 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden auf Glasfaser-Filterpapieren geerntet und das Niveau der Radioaktivität mittels Flüssigszintillationszählung bestimmt. Es stellte sich heraus, daß das Niveau des tritylierten Thymidineinbaus zur vorhandenen Menge an G-CSF direkt proportional ist. Der FDCP-G-Clon-E7-Assay wurde unter Verwendung eines von Amersham International bezogenen rekombinanten menschlichen G-CSF mit einer angegebenen spezifischen Aktivität von 108 Einheiten/mg Protein kalibriert.
  • Die Wirkungen der G-CSF-Proben wurden durch Vergleich mit einem Standard bekannter Aktivität bestimmt.
  • Die Einheiten der G-CSF-Aktivität pro ml wurden entsprechend der folgenden Formel berechnet:
  • Figure 01780001
  • Interleukin-2 (IL-2)-Bioassay
  • Interleukin-2 wurde auf biologische Aktivität getestet, indem das Wachstum einer IL-2-abhängigen Mäuse-Zellinie, CTL, wie von Robb et al, J Exp Med 160 1126 1986 beschrieben, verfolgt wurde, mit der Ausnahme, daß die Zellen 48 h mit IL-2 inkubiert und 6–8 Stunden mit 3H-Thymidin gepulst wurden.
  • Calcitonin-Bioassay mit T47D-Zellen
  • Der Bioassay für Calcitonin beruht auf dem Prinzip, daß die menschliche Brustkrebs-Zelllinie T47D mit Adenylatcyclase in Verbindung stehende Rezeptoren für Calcitonin trägt (Martin et al (1980) Biochem Biophys Res Commun 98: 150–156). Die Stimulierung von T47D-Zellen durch Calcitonin führt zu Produktion erhöhter interzellulärer Niveaus an cyclischen AMP, die mittels Radioimmunassay quantifiziert werden können. Die Menge an Calcitonin bzw. PEGyliertem Calcitonin in unbekannten Proben läßt sich durch Vergleich mit einer unter Verwendung bekannter Standardproben von Calcitonin oder PEGyliertem Calcitonin angefertigten Eichkurve quantifizieren.
  • Im Bioassay wurden T47D-Zellen als Suspension in serumfreiem Medium oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung präpariert. Die Zellen wurden in Teströhrchen aliquotiert und mit Standard-Calcitonin bzw. PEGyliertem Calcitonin, oder mit Calcitonin bzw. PEGyliertes Calcitonin enthaltenden Proben in Gegenwart von 10–4 M Isobutylmethylxanthin 20 Minuten stimuliert. Die Inkubation wurde gestoppt, indem die Zellsuspensionen 5 Minuten in ein kochendes Wasserbad gestellt wurden. Die Zellen wurden durch zwei Cyclen von Einfrieren/Auftauen in Gegenwart von 0,01% Triton X-100 lysiert und die Zelltrümmer dann durch 5 minütige Zentrifugation bei 10000 × g sedimentiert.
  • Cyclisches AMP im Lysat-Überstand wurde mittels Radioimmunassay unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Kits (Amersham International TRK432) quantifiziert. Eine Eichkurve wurde angefertigt, indem die Menge an Standard-Calcitonin bzw. PEGyliertem Calcitonin gegen die Niveaus an cyclischem AMP aufgetragen wurden. Die Menge an Calcitonin bzw. PEGyliertem Calcitonin in den unbekannten Proben wurde durch Interpolation aus der entsprechenden Eichkurve bestimmt.
  • Referenzbeispiel 28
  • Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem humanen Calcitonin (hCT)
  • Lyophilisiertes chemisch synthetisiertes hCT wurde von Cambridge Research Biochemicals, Gadbrook Park, Rudheath, Northwich, Cheshire, England bezogen. Die Reverse-Phase- und Ionenaustausch-HPLC zeigte einen einzigen Spitzenwert. 300 mg wurden in 75 ml H2O mit Methylpolyethylenglykol wie in Referenzbeispiel 3 beschrieben modifiziert, mit der Ausnahme, daß pro Aminogruppe am hCT 5 Äquivalente Reagenz verwendet wurden. Das Reaktionsgemisch wurde auf einer Amicon-YM10-Membran (Molekulargewichtausschlußgrenze 10 kDa) bei 4°C gegen 0,1 M Ammoniumhydrogencarbonat pH 8,0 zur Abtrennung von nichtumgesetztem hCT diafiltriert. Das Retentat wurde auf 36 ml eingeengt und das Volumen mit 50 mM Natriumphosphat pH 7,0 mit 1,7 M Ammoniumsulfat auf 60 ml aufgefüllt. Diese Lösung wurde in 5 × 12 ml Ansätzen auf einer in 50 mM Natriumphosphat pH 7,0 mit 0,68 M Ammoniumsulfat äquilibrierten 8 ml-Phenyl-Superose-Säule (Pharmacia/LKB) chromatographiert. Freies Methylpolyethylenglykol wurde unter diesen Bedingungen nicht an die Säule gebunden und durch Waschen abgetrennt. Das mit Methylpolyethylenglykol modifizierte hCT wurde mit 50 mM Natriumphosphat pH 7,0 eluiert. Das eluierte Peptid wurde unter Verwendung einer Spectrapor-Dialysemembran (MG-Ausschlußgrenze 6–8 kDa) nach Wasser dialysiert und unter Verwendung einer Amicon-YM10-Membran bei 4°C auf eine Endkonzentration von 11 mg/ml, wie sie mittels Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse bestimmt wurde, konzentriert. Dieses Produkt, das 1,5 Mole kovalent gebundenes Methylpolyethylenglykol pro Mol hCT enthielt, besaß noch biologische Aktivität und war frei von nichtmodifiziertem Ausgangsmaterial.
  • Referenzbeispiel 29
  • Herstellung von mit Methylpolyethylenglykol 5000 modifiziertem menschlichem Interleukin-2 (IL-2)
  • Im E. coli produziertes lyophilisiertes, rekombinantes menschliches IL-2 wurde von Biosource International, California bezogen. Es besaß eine Reinheit von mehr als 98%, wie durch SDS-PAGE bestimmt wurde. Verfahren zur Produktion von IL-2 E. coli sowie seine anschließende Reinigung sind beschrieben (Kato et al, Biochem, Biophys. Res. Commun. 130, 692 (1988); Liang et al, Biochem J. 229 429 (1985), Koths et al US-Patent 4569790 (1986)). Eine Lösung aus 211 mg in 30 ml H2O wurde mit Methylpolyethylenglykol, MG ca. 5000, modifiziert und wie in Referenzbeispiel 3 beschrieben gereinigt, wobei 20 Äquivalente pro Aminogruppe auf IL-2 eingesetzt wurden. Das Endprodukt enthielt 3,4 Mole Methylpolyethylenglykol pro Mol Protein, war frei von nichtmodifiziertem Ausgangsmaterial und besaß noch biologische Aktivität.
  • Referenzbeispiel 30
  • Konstruktion von pICI 0080
  • a) Konstruktion von pTB357 (hierin auch mit pLB 004 bezeichnet)
  • Im Plasmid pTB357 kommt eine reprimierte Tetracyclinresistenz-Determinante, wie sie auf dem natürlich vorkommenden Plasmid RP4 angetroffen wird, zur Anwendung. Dieses reprimierte System schaltet die Expression des tetA-Gens in Abwesenheit von Tetracyclin ab, wohingegen die meisten Arzneistoffresistenzmechanismen konstitutive Expression aufweisen.
  • Der tet-Locus wurde zuerst von Barth und Grinter (J. Mol. Biol. 113: 455–474, 1977) auf RP4 kartiert. Es konnte gezeigt werden, daß dieser Locus aus nebeneinanderliegenden Genen besteht: tetA, dem Resistenz-Strukturgen und tetR, dem Repressorgen, wobei dieser Bereich sequenziert wurde (Klock et al, J. Bacteriol: 161: 326–332, 1985). Diese Gene sind auf nebeneinanderliegenden BglII-SmaI- und SmaI-SmaI-Fragmenten lokalisiert. Die BglII-Stelle tritt in RP4 nur einmal auf doch sind darin fünf SmaI-Stellen vorhanden (Lanka, Lurz und Furste, Plasmid 10: 303–307, 1983).
  • i) Klonierung der tetA + tetR-Gene
  • Das Plasmid RP4 ist gut beschrieben (Datta et al, J. Bacteriol 108: 1244, 1971) und frei erhältlich. Weiterhin wurde das Plasmid RP4 unter den Zugangsnummern 50078 und 50437 bei der National Collection of Type Cultures, 61 Colindale Avenue, London, NW9 5HT, Großbritannien hinterlegt. Die dieses Plasmid enthaltenden E. coli-Stämme wurden in Selektionsbrühekulturen angezogen und die Plasmid-DNA mit einer Version in größerem Maßstab des Verfahrens nach Holmes und Quigley (Holmes und Quigley, Anal. Biochem 114: 193-197, 1981) isoliert. Sie wurde danach durch Behandlung mit 2,5 M Ammomiumacetat deproteiniert und wiederum mit Isopropanol ausgefällt. Diese Plasmid-DNA wurde dann nach den vom Zulieferer empfohlenen Bedingungen mit dem Restriktionsenzym BglII behandelt und vollständig geschnitten. Danach wurde sie mit XmaI unter Verwendung von verdünnten Enzym und kurzen Inkubationszeiten teilweise geschnitten. Bei XmaI handelt es sich um ein Isoschizomer von SmaI, das jedoch an seinen geschnittenen Stellen kohesive Enden aus 4 Nukleotiden produziert.
  • Das Vektorplasmid pUC8 (Yanisch-Perron, Vieira und Messing, Gene 33: 103–119, 1985) wurde in ähnlicher Weise präpariert und mit BamHI und XmaI vollständig geschnitten. Die RP4-Fragmente wurden durch 16stündige Ligation mit T4-Ligase bei 12°C in diesem Vektor kloniert. Dieses Konstrukt wurde zur Transformation von E. coli C600 verwendet, die mittels des Calciumchloridverfahrens kompetent gemacht worden war (Maniatis et al, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Die Kulturen wurden danach auf ein Medium ausplattiert, mit dem auf Tetracyclinresistenz selektioniert wurde.
  • E. coli C600 ist aus zahlreichen Quellen, einschließlich vieler Kultursammlungen, wie z. B. dem E. coli Genetic Stock Centre, Yale University, USA unter Zugangs-Nr. GCSC 3004, leicht erhältlich. Der Genotyp von E. coli C600 ist K12 thr-1 leuB6 thi-1 hsdSI lacY1 tonA21 λ-supE44.
  • Mehrere Kolonien mit dieser Resistenz wurden auf den erwarteten Phenotyp (Ampicillin- und Tetracyclinresistenz, jedoch keine auf RP4 selbst hinweisende Kanamycinresistenz) überprüft. Kolonien mit den korrekten Resistenzen wurden danach einer Clonanalyse unterzogen, indem Plasmid-DNA isoliert wurde (Verfahren nach Holmes und Quigley). Diese Präparationen wurden mit EcoRI und HindIII geschnitten und über Gelelektrophorese analysiert. Dadurch wurde die Größe der klonierten Insertion festgelegt, für die sich ein Wert von 2,45 kb ergab, der für das BglII – XmaI – XmaI-Fragment aus RP4 vorhergesagt worden war. Ein dieses Fragment mit den tetA- und tetR-Genen tragender Clon wurde mit pTB344 bezeichnet.
  • ii) Entfernung des tet-Gens aus pAT153
  • Es war notwendig, daß tet-Gen aus dem Vektorplasmid pAT153 zu entfernen, bevor die tetA + tetR-Kassette aus RP4 inseriert wurde, um eine Genverdopplung zu vermeiden, die eine Quelle für genetische Instabilität darstellen kann. Ebenso kann das tet-Gen durch das nichtentsprechende tetR nicht effektiv suppremiert werden. Die Entfernung wurde durchgeführt, indem die pAT153-Plasmid-DNA isoliert und mit EcoRI und AvaI geschnitten wurde. Zwischen diese Stellen wurden synthetische Oligonukleotide mit der Sequenz SEQ ID No 56:
    Figure 01830001
    kloniert. Diese passen in die EcoRI- und AvaI-kohesiven Enden und enthalten zusätzlich SphI-, BamHI- und ClaI-Stellen. Nach der Transformation und Selektion wurden Kolonien auf den Verlust der Tetracyclin-Resistenzdeterminante getestet. Die Plasmid-DNA aus einem Klon wurde sequenziert, um zu bestätigen, daß die vorhergesagte Sequenz korrekt war. Dieses Plasmid wurde mit pCH19 bezeichnet.
  • iii) Insertion der tetA- + tetR-Gene
  • Das tetA- und das tetR-Gen wurden aus pTB344 auf einem Fragment von EcoRI bis PstI isoliert. Der pUC8-Vektor wurde durch Schneiden mit SspI zerstört, da es die gleiche Selektionsdeterminante (Ampicillinresistenz) wie pCH19 trägt. Die pCH19-Plasmid-DNA wurde mit EcoRI und PstI geschnitten und danach mit dem die tet-Gene tragenden 2,45 kb großen Fragment ligiert. Dieses Konstrukt wurde zur Transformation von E. coli C600 transformiert, wobei die Kultur unter Selektion auf Tetracyclin-resistente Kolonien ausplattiert wurde. Die Insertion der tet-Gene war so vorgesehen, daß dadurch die bla-Gene in pCH19 größtenteils ersetzt werden, womit dieses seine Ampicillinresistenz-Determinante verlieren sollte. Der Verlust der Ampicillinresistenz der Transformanten wurde bestätigt. Einige wenige Clone wurden dann zur Isolierung von Plasmid-DNA verwendet, die dann einer Restriktionsanalyse unterzogen wurde. Dadurch wurde die vorgesehene Struktur des konstruierten Plasmids bestätigt. Dieses wurde mit pTB351 bezeichnet.
  • iv) Insertion der cer-Sequenz
  • Das natürlich vorkommende Plasmid ColEI wird im Gegensatz zu seinen Derivaten pBR322 und pAT153 mit hoher Stabilität in E. coli beibehalten. Sommers und Sherratt (Cell, 36: 1097–1103, 1984) zeigten, daß dies daran lag, daß den Derivaten eine kurze (283 by große), cer genannte Sequenz, die im Ausgangsplasmid vorliegt, fehlt. Diese Sequenz enthält ein stellenspezifisches System zur Auflösung von Plasmid-Multimeren, durch das die Anhäufung von durch die homologe Rekombination gebildeten Plasmidmultimeren verhindert wird. Solche Multimere besitzen eine negative Wirkung auf den Teilungsvorgang, der normalerweise eine stabile Weitergabe der Tochterplasmide während der Bakterienzellteilung wieder herstellt.
  • Die cer-Sequenz (Sommers, D et al MGG, 201, S. 334– 338, 1985) wurde aus dem Plasmid pKS492 (zur Verfügung gestellt von D. Sherratt) durch Schneiden mit BamHI und TagI als ein 289 by großes Fragment isoliert. Das Plasmid pTB351 wurde als DNA aus einem E. coli-dam-Stamm isoliert, um zu verhindern, daß seine ClaI-Stelle durch das dam (+)-Methylierungssystem blockiert wird. Diese DNA wurde mit BamHI und ClaI geschnitten (wobei beide Stellen auf dem synthetischen Oligonukleotid für diese Klonierung eingeführt wurden). Das cer-Fragment wurde mit dem geschnittenen Vektor ligiert und danach zur Transformation von E. coli C600 verwendet, wobei auf Tetracyclinresistenz selektioniert wurde. Transformantenkolonien wurden dann einer Clonanalyse mittels AvaI-Restriktion und Gelelektrophorese unterzogen. Die Anwesenheit einer zusätzlichen DNA-Bande von etwa 300 by deutete auf den Einbau des cer-Fragments hin. Weitere Restriktionsanalysen wurden dazu verwendet, die korrekte Struktur der erhaltenen Plasmide zu bestätigen. Eines von diesen wurde mit pTB357 (5) und auch mit pLB004 bezeichnet.
  • b) Plasmid pCH101
  • Das Plasmid pCH101 entspricht pICI 0020 (siehe Beispiel 1c), mit der Ausnahme, daß das EcoRI-SalI-Fragment (siehe 1) durch ein aus der SEQ ID No 50 (siehe auch 6) und der Sequenz des Interferon α2-Gens, wie sie von Edge M. D. et al, Nucleic Acids Research 1983, Bd. 11, S. 6419–6435 beschrieben ist, bestehendes Fragment ersetzt ist. Diesbezüglich liegt das 3'-terminale ATG-Codon der SEQ ID No 50 unmittelbar vor dem TGT-Codon, das für Cystein (Aminosäure 1) in der Interferon α2-Frequenz aus der oben erwähnten Literaturangabe Edge M. D. et al Nucleic Acids Research codiert. Die 5'-Nukleotidsequenz GATCCATG sowie die komplimentäre 3'-Nukleotidsequenz GTAC werden somit bei der Nukleotidsequenz der oben erwähnten Literaturangabe weggelassen.
  • c) Insertion einer Expressionskassette in pTB357
  • Einen aus dem trp-Promotor, einer ribosomen Bindungsstelle und dem Interferon-α2-Gen bestehende Expressionskassette wurde aus dem Plasmid pCH101 (siehe b oben) auf einem Restriktionsfragment von EcoRI bis SphI isoliert. Dieses wurde in dem in ähnlicher Weise mit EcoRI und SphI geschnittenen Produktionsvektor (pTB357) (siehe (a) oben) ligiert. Diese DNA wurde zur Transformation einer kompetenten Kultur von E. coli C600 verwendet, wobei tetracyclin-resistente Kolonien isoliert wurden. Einige von diesen wurden mittels DNA-Clonanalyse auf den Erhalt der auf der Expressionskassette liegenden SstI-Restriktionsstelle getestet. In dieser Hinsicht positive Clone wurden durch Restriktionskartierung weiter getestet, um zu überprüfen, ob das erwartete Konstrukt korrekt war. Sie wurden ebenfalls auf die übertragene Fähigkeit zur Produktion von Interferon-α2-Protein, wie sie auf einem mit Coomassie Blue angefärbten Polyacrylamid-SDS-Gel analysiert wurde, überprüft. Einer der auf diese Weise bestätigten Clone wurde mit pLB005 bezeichnet.
  • d) Insertion des T4-Transkriptionsterminators im pTB244
  • Die T4-Transkriptionsterminatorsequenz wurde in Form des Fragments von SaiI bis HindIII (Länge 67 Basenpaare) (siehe SEQ ID No 48 und 4a) in die Mehrfachklonierungsstelle eines Zwischenvektors pTB244 (beschrieben in der europäischen Patentanmeldung Nr. 237,269) zwischen dessen SaiI- und HindIII-Stellen inseriert. Eine Clonanalyse wurde zur Bestätigung der Struktur dieses Konstrukts (pTB244.T4ter) verwendet. Aus diesem Vektor wurde dann ein Fragment von SstI bis SphI, das den größten Teil der Mehrfachklonierungsstelle sowie den T4-Terminator enthielt, isoliert. Dieses Fragment wurde in das in ähnlicher Weise mit SstI und SphI geschnittene pLB005 inseriert, wodurch das Interferon-α2-Gen substituiert wurde, eine Kassette bestehend aus dem trp-Promotor, der Mehrfachklonierungsstelle und dem T4-Terminator jedoch übrig blieb. Diese Konstrukt wurde mittels Clonanalyse bestätigt und das Plasmid mit pLB013 bezeichnet.
  • e) Substitution der Mehrfachklonierungsstelle
  • Die Mehrfachklonierungsstelle in pLB013 ist für diesen Vektor in mehrfacher Hinsicht nicht ideal: die SalI-, BamHI- und SmaI-Stellen sind nicht einzigartig, sondern kommen an anderer Stelle auf dem Plasmid vor. Dieses Fragment wurde daher durch Schneiden mit SstI und XbaI (beide einzigartig) ausgeschnitten, und synthetische Oligonukleotide mit der SEQ ID No 51:
    Figure 01870001
    an seiner Stelle inseriert. Clone wurden auf den Erhalt der neuen Restriktionsstellen hin analysiert und dann durch Sequenzion bestätigt. Ein solches Plasmid wurde mit pLB014 bezeichnet. Die auf diese Weise inserierten neuen Klonierungsstellen sind: Nde1, Kpn1, BglII, Xho1 und ScaI, wobei sich daran die zuvor vorhandenen XbaI- bzw. SalI-Stellen anschließen.
  • f) Weitere Modifikationen
  • Es wurde festgestellt, daß die unmittelbar nebeneinanderliegenden SstI- und NdeI-Stellen in pLB014 von diesen beiden Restriktionsenzymen weder gleichzeitig noch nacheinander geschnitten werden konnten, vermutlich aufgrund ihrer engen Nachbarschaft. Daher wurde eine zusätzliche Sequenz dazwischen inseriert. Dies erfolgte durch Schneiden von pLB014 mit SstI und KpnI und nachfolgender Insertion des synthetischen Oligonukleotids der SEQ ID No. 52.
  • Figure 01870002
  • Die Clone wurden auf den Erhalt einer zusätzlichen PvuII- bzw. PstI-Stelle analysiert und danach durch Sequenzieren bestätigt. Ein solches Plasmid wurde mit pLB015 (= pICI0080) (siehe 7) bezeichnet. Dieses Plasmid wird im Gegensatz zu pLB014 vom SstI und NdeI effizient geschnitten. Dies dient dazu, einen Ort für die Insertion verschiedener Ribosombindungsstellensequenzen mit der korrekten Positionierung hinsichtlich des stromaufwärts befindlichen trp-Promotors zur Verfügung zu stellen, wobei NdeI zur Bereitstellung des ATG-Startcodons des zu expremierenden Gens vorgesehen ist.
  • Referenzbeispiel 31
  • Konstruktion des Plasmids pICI1295 (auch mit pCG300 bezeichnet)
  • a) Herstellung von pCG54 aus pICI1079
  • Bei pICI1079 handelt es sich um ein ampicillin-resistentes, von pAT153 abgeleitetes Plasmid, das die folgenden Elemente zwischen den EcoRI- und StyII-Restriktionsstellen enthält:
    • (i) ein CI857 aus dem Phagen λ;
    • (ii) einen λPL-Promotor;
    • (iii) eine synthetische Ribosomenbindungsstelle;
    • (iv) eine synthetische Interferon-α2-Gensequenz;
    • (v) eine aus dem Phagen T4 abgeleitete synthetische Transkriptionsterminatorsequenz zwischen den SalI- und Styl-Restriktionsstellen. Die DNA-Sequenz dieses Transkriptionsterminators ist in 4 und SEQ ID No. 53 gezeigt.
  • PICI1079 ist in 8 dargestellt.
  • PICI1079 wurde gemäß dem Budapester Vertrag bei den National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB2 1RY, Scotland, UK, hinterlegt (NCIMB Nr. 40370, Hinterlegungsdatum 19. Februar 1991).
  • PCG54 wurde konstruiert, um einen Expressionsvektor zur Verfügung zu stellen, der die gleichen Promotor-, Ribosomenbindungsstellen- und Transkriptionsterminatorsequenzen wie oben, d. h.: λPL, RBS7 und T4, enthält, dem jedoch die für die Herstellung eines spezifischen Proteins codierende Gensequenz fehlt. Durch ein solches Konstrukt wäre die Möglichkeit eines Expressionsbasisvektors gegeben, der die wesentlichen Elemente enthält, um die Transkription und Translation zur Herstellung eines beliebigen interessierenden Proteins gestatten und die in diesem Vektor durch nachfolgende Klonierungsereignisse eingeführt werden könnten.
  • Die Konstruktion des Vektors wurde durch Restriktionsendonucleasespaltung von pICI1079 an seinen jeweiligen EcoRI- und SalI-Stellen gestartet. Durch diesen Spaltungsschritt wurde ein Vektorfragment, das das pICI1079-Rückgrat zusammen mit den Genen für die Plasmidreplikation und die antibiotischen Resistenzfunktionen und zusätzlich die T4-Transkriptionsterminatorsequenz enthielt, freigesetzt. Das Fragment wurde durch Agarosegelreinigungsschritte isoliert, wobei für die abschließende Reinigung des DNA-Fragments Geneclean eingesetzt wurde.
  • In dieses Vektorfragment wurde dann ein zweites kleineres DNA-Fragment mit einer Größe von ungefähr 1,2 Kb eingeführt. Dieses zweite Fragment läßt sich beispielsweise durch DNA-Synthese oder durch stellengerichtete bzw. PCR-Mutagenese des kleinen, aus pICI1079 wie oben beschrieben erhaltenen EcoRI-SalI-Restriktionsfragments erhalten. Dieses zweite Fragment enthielt genau die gleichen Promotor- und Ribosomenbindungsstellensequenzen, wie sie ursprünglich im pICI1079 vorlagen, und hatte darüberhinaus EcoRI- und SalI-Stellen an seinen 5'- bzw. 3'-Enden zur Verfügung, so daß dadurch kompatible Enden für die Ligation mit dem pICI1079-Fragment bereitgestellt wurden. Eine Ligationsreaktion in Gegenwart des Gibco-BRL-Enzyms T4-DNA-Ligase und ihres entsprechenden Puffers führte zur Bildung des Konstrukts pCG54.
  • Diese Konstrukt enthaltende Clone von ursprünglich nach der Transformation eines Aliquots des Ligationsansatzes in kompetente E. coli-Zellen des Stamms HB101 isoliert. Das dabei erhaltende Konstrukt pCG54 hatte eine Größe von 3,682 Kb und enthielt wesentliche Merkmale, wie sie auf der in 9 dargestellten Karte umrissen sind.
  • b) Herstellung von pCG61 aus pCG54 (auch mit pICI54 bezeichnet)
  • Synthetische Oligonukleotidsequenzen wurden so gestaltet, daß sie sowohl die natürliche Sequenz für den T7A3-Promotor als auch eine Sequenz, die einen wirksamen Translationsinitiationsbereich, um die korrekte Prozessierung einer beliebigen, unmittelbar daneben klonierten Polypeptidgensequenz zu ermöglichen, bereitstellen würde, umfaßten. Eine geeignete Kandidatensequenz für diesen letzteren Bereich wurde als RBS1, die trp-Ribosomenbindungssequenz, identifiziert. Daher wurden zwei als SEQ ID No. 54 und SEQ ID No. 55 identifizierte komplimentäre Oligonukleotide zur Erzeugung eines doppelsträngigen DNA-Linkers, der den T7A3-Promotor und RBS1-Sequenzen umfaßte, synthetisiert.
  • Die Oligonukleotide wurden als 84-Mere nach der Standardvorschrift unter Verwendung eines ABI-Gensyntheseautomaten hergestellt. Dabei wurden sie so konstruiert, daß die synthetischen Fragmente in der Doppelstrangform Restriktionsendonucleasestellen EcoRI und KpnI an den 5'- bzw. 3'-Enden aufweisen würden. Aufgrund ihrer Länge konnten die Oligomere nicht mittels HPLC gereinigt werden, und die Reinigung wurde daher mittels einer Acrylamidgelelektrophorese mit einem 10% Acrylamid/7 M Harnstoff-Gel ausgeführt.
  • Vor der Reinigung wurden die Oligomere zunächst auf einem Gel zur Größenbestimmung überprüft, um sicherzustellen, daß sie nicht nur die korrekte Größe aufwiesen, sondern daß die hergestellten Proben auch die benötigten Oligomere als ihren größten Anteil enthielten und nicht etwa einen hohen Anteil an Verunreinigung mit kleinen sekundären Oligonukleotiden, die als Nebenprodukte der Synthese entstehen.
  • Die Acrylamidgele wurden nach Standardverfahren hergestellt, wobei als Katalysatoren für die Gelpolymerisation Ammoniumpersulfat und N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin verwendet wurden.
  • Die Größenüberprüfung der Oligonukleotide erforderte, daß sie nach der Elektrophorese sichtbar gemacht werden konnten. Es war daher notwendig, die Proben mit 32P radioaktiv zu markieren. Dadurch war es möglich, die Probenqualität nach der Elektrophorese in Form einer Autoradiographie zu beurteilen.
  • Die Oligonukleotidproben wurden in Rohform unphosphoryliert geliefert. Diese Tatsache wurde für Radioaktivitätsmarkierungszwecke dahingehend ausgenutzt, daß die Proben unter Verwendung des Enzyms T4-Polynucleotidkinase durch Phosphorylieren an den 5'-Enden „heiß" markiert werden konnten.
  • Die Oligomeren wurden nach der Synthese in unphosphorylierter Form bereitgestellt, so daß nach der Reinigung jedes Oligomer jeweils einzeln einer Phosphorylierungsreaktion unterzogen wurde, bei der ATP zur Phosphorylierung jeweils des 5'-Endes des Moleküls in Gegenwart von T4-Polynucleotidkinase verwendet wurde (siehe Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Sambrook, Fritsch und Maniatis, S. 5,68–5,71). Nachdem die beiden komplimentären Oligonukleotide phosphoryliert worden waren, wurde sie in einer Annealing-Reaktion unter Ausbildung des doppelsträngigen DNA-Duplex, der den T7A3-Promotor und die RBS1-Sequenz enthielt, zusammengelagert.
  • Das Vektormolekül pCG54 wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und KpnI gespalten. Bei dem Restriktionsverdau werden ein 2,3 kb großes Vektorfragment sowie ein den λPL-Promotor und die RBS1-Sequenz enthaltendes 1,1 kb großes Fragment erzeugt. Dieser Klonierungsschritt ist dafür vorgesehen, die λpL-RBS1-Sequenz durch das synthetische Fragment von EcoRI bis KpnI, das die T7A3-RBS1-Sequenz umfaßt, zu ersetzen. Das aus dem Verdau von pCG54 erhaltene 2,3 kb große Vektorfragment wurde nach der üblichen Vorschrift unter Verwendung der Agarosegelelektrophorese und der Geneclean-Methodik zur Entfernung von DNA aus Agarosefragmenten gereinigt.
  • Das 84bp große, synthetische EcoRI-KpnI-Fragment wurde in das oben hergestellte Vektormolekül ligiert und die ligierte DNA zur Transformation von E. coli-HB101-Zellen verwendet. Die Selektion positiver rekombinanter Clone erfolgte über Ampicillinresistenz. Nach der Transformation wurden einige das rekombinante Plasmid enthaltende Kolonien zu Screeningzwecken ausgewählt.
  • Das in den Vektor während der Klonierung eingebaute synthetische Fragment besaß eine solche Größe (84-Mer), die die Restriktionsanalyse rekombinanter Plasmid-DNA-Proben als einfaches Screeningverfahren ungeeignet machte. Insertionen von so geringer Größe sind nicht leicht in der Agarosegelelektrophorese zu erkennen. Das Fragment selbst enthält keine interne Restriktionsendonuclease-Spaltstelle, die zur Feststellung seines Vorhandenseins verwendet werden könnte. Ein erstes Screening von rekombinanten Clonen wurde daher mit dem Verfahren der Koloniehybridisierung durchgeführt (siehe Grunstein und Hogness Proc. Nat. Acad. Sci 72, 3961 (1975)). Immobilisierte Plasmid-DNA aus den rekombinanten Clonen enthaltende Nitrozellulosefilter wurden gegen eine durch radioaktive Zufallsmarkierung der in der Annealing-Reaktion zusammengelagerten synthetischen Oligonukleotide SEQ ID No 54 und SEQ ID No 55 hergestellte Sonde hybridisiert. Die DNA wurde mit α32P-dCTP und 2stündige Inkubation mit Klenow-Polymerase bei 37°C markiert. In allen Fällen wurde Plasmid-DNA jeweils mit einem Verfahren im größeren Maßstab, das eine CsCl-Gradientendichtezentrifugation einschloß, um die Reinheit zu gewährleisten, siehe „Molecular Cloning – A laboratory manual" zweite Auflage, Sambrook, Fritsch und Maniatis (Gold Spring Harbor Laboratory, 1989) S. 1,42–1,52, präpariert. Die DNA-Präparation mit einem solchen Verfahren gewährleistet ein Material von hoher Qualität, das zur Verwendung in nachfolgenden Klonierungsmanipulationen und der Sequenzanalyse geeignet ist.
  • Die gesamte aus dem rekombinanten Clon isolierte Plasmid-DNA wurde einem sekundären Screening mittels Sequenzanalyse unterzogen, um sicherzustellen, daß die Oligonukleotidsequenz an den Klonierungsverbindungsstellen sowie die Sequenz des T7A3-RBS1-Fragments selbst absolut korrekt war. Bei der verwendeten Sequenziervorschrift handelte es sich um die der Sequenase und bei dem zur Verwendung ausgewählten Sequenzierprimer beispielsweise um pBR322 UP (pBR322 Universal Primer). Die Sequenzierung erfolgte unter Verwendung der Didesoxy-Kettenabbruch-Sequenziertechnik nach Sanger.
  • Clone mit der korrekten Sequenz wurden als neues Expressionskonstrukt pCG61 bezeichnet und enthielten den T7A3-Promotor, die RBS1-Sequenz und die T4-Terminatorsequenz (siehe 10).
  • c) Herstellung von pCG300 (auch mit pICI 1295 bezeichnet) aus pCG61
  • Die Sequenz des G-CSF-Analogons [Ser17,27]hu-G-CSF sowie die an seiner Konstruktion beteiligten Syntheseschritte sind wie in Referenzbeispiel 3 beschrieben (siehe 3). Diese G-CSF-Analogonsequenz wurde aus einem Konstrukt isoliert, bei dem das Gen in das Plasmid pSTP1 unter Erhalt von pICI1107 eingebaut worden war (siehe Beispiel 2). PICI1107 wurde mit ScaI verdaut und das große Fragment nach Agarosegelelektrophorese und Geneclean-Reinigung isoliert. Dieses Fragment wurde dann mit der Restriktionsendonuclease SalI verdaut, so daß ein auf einem Restriktionsfragment von ScaI bis Sal1, das zur Klonierung in pCG61 geeignet ist, liegendes [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF-Gen erzeugt wurde (siehe 10).
  • Nach Restriktion mit SaiI wurde das benötigte Fragment wiederum mit Agarosegel-Reinigungstechniken isoliert.
  • Das Vektormolekül pCG61 wurde mit dem Restriktionsenzym Kpn1 verdaut. Spaltung mit diesem Enzym führt zu einem 3'-Überhang, der dann unter Verwendung des Enzyms T4-Polymerase stumpfendig gemacht wurde, siehe „Molecular Cloning – a Laboratory Manual", zweite Auflage, Sambrook, Fritsch und Maniatis, S. 5.44–5.47. Die T4-Polymeraseaktivität wurde durch 30minütige Inkubation bei 70°C hitzeinaktiviert und die DNA mittels Ethanolfällung gewonnen. Das Pellet wurde in sterilem destilliertem Wasser gelöst und die solubilisierte DNA mit SalI gespalten. Das Vektorfragment von KpnI (nun stumpfendig) bis SalI wurde mittels Ethanolfällung und anschließender Agarosegelelektrophorese und Reinigungstechniken gewonnen.
  • Das [Met–1, Ser17,27]hu-C-CSF-Fragment von ScaI bis SalI wurde dann in dem Vektor von stumpfendigem KpnI bis SalI ligiert. Die ligierte DNA wurde in den E. coli-Stamm HB101 transformiert. Die Selektion rekombinanter Clone folgte auf Ampicillinresistenz.
  • Ein erstes Screening potentieller rekombinanter Clone wurde mittels Hybridisierung durchgeführt. Eine radioaktiv markierte Sonde wurde durch Zufallsmarkierung eines Fragments von EcoRI bis SalI (mit der [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF-Gensequenz), das aus dem Plasmid pICI1107 hergestellt worden war, präpariert. Diese wurde zur Hybridisierung gegen Kolonien eingesetzt, deren DNA auf der Oberfläche von Nitrocellosefiltern immobilisiert worden war. Anschließend wurde Plasmid-DNA aus 24 Clonen präpariert, die in diesem Screening hybridisiert worden waren. Alle DNA-Präparationen erfolgten nach dem schnellen Miniprep-Verfahren, siehe Birnboim und Doly, Nucleic Acids Research, 7, 1513, 1979. Diese rekombinanten DNA-Präparationen wurden dann einem sekundären Screening in Form einer Restriktionsanalyse unterzogen. Die Linearisierung der DNA mit BamHI, deren Stelle nur einmal innerhalb der Expressionskassette vorkam, deutete auf das Vorhandensein der [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF-Sequenz hin.
  • Zur Bestätigung des Vorhandenseins des [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF-Gens sowie zur Verifizierung der korrekten Basensequenz an den Klonierungsverbindungsstellen sowie über das gesamte [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF-Gen wurde eine Sequenzanalyse durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden Plasmid-DNA-Proben in Großmaßstab aus 16 rekombinanten Clonen präpariert, wobei zur Gewährleistung der Reinheit die CsCl-Gradientendichtezentrifugationstechnik eingesetzt wurde. Die Sequenzierschritte wurden gemäß dem Sequenzprotokoll durchgeführt, wobei es sich bei dem ausgewählten Sequenzierprimer um den pBR322-Universalprimer (EcoRI) handelte. Zwei der rekombinanten Clone enthielten die korrekte Sequenz am ScaI-Ende des [Met–1, Ser17,27]hu-G-CSF-Fragments sowie über die gesamte G-CSF-Peptidsequenz selbst. Die Clone wurden als Expressionskonstrukt pCG300 identifiziert (siehe 12).
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Claims (14)

  1. Pharmazeutische Zusammensetzung zur kontinuierlichen Freisetzung einer säurestabilen physiologisch aktiven Substanz aus dem Material der Zusammensetzung in eine wäßrige, quasi physiologische Umgebung, wobei es sich bei der Substanz um ein Polypeptid mit wenigstens einer der biologischen Eigenschaften von natürlich vorkommendem G-CSF handelt, wobei die Substanz kovalent an ein wasserlösliches Polymer konjugiert ist und das Material der Zusammensetzung (a) ein aus amphipathischen Blockcopolymeren gebildetes biologisch abbaubares Hydrogel; oder (b) ein Polylactid; oder (c) ein Gemisch aus Polylactiden und derartigen Hydrogelen umfaßt, wobei keine signifikante Hydrolyse der Substanz unter den während des vorgesehenen Anwendungszeitraums innerhalb der Zusammensetzung angetroffenen Bedingungen stattfindet, wobei die Zusammensetzung i) bei Plazierung in einer wäßrigen, quasi physiologischen Umgebung das Polypeptid kontinuierlich an die wäßrige, quasi physiologische Umgebung abgibt, was zu einem über einen Zeitraum von wenigstens einer Woche im wesentlichen einphasigen Freisetzungsverlauf führt; ii) zwei aufeinanderfolgende Phasen der Polypeptidfreisetzung zeigt, wobei die Freisetzung in der ersten Phase durch Diffusion von der Oberfläche und in der zweiten Phase als Folge des Abbaus von Material der Zusammensetzung erfolgt, dadurch gekennzeichnet, daß die Diffusionsphase und die abbauinduzierte Phase sich zeitlich überschneiden, und die Polypeptidfreisetzung über einen Zeitraum von wenigstens einer Woche stattfindet; oder iii) kontinuierlich Wasser aufnimmt, was zu einem im wesentlichen einphasigen Wasseraufnahmeverlauf führt, bis über einen Zeitraum von wenigstens einer Woche das Material der Zusammensetzung abgebaut und das Polypeptid im wesentlichen vollständig an die wäßrige, quasi physiologische Umgebung abgegeben worden ist.
  2. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei ein Molekül physiologisch aktive Substanz wenigstens ein Molekül wasserlösliches Polymer pro 3000–8000 Da Polypeptid-Molekulargewicht umfaßt.
  3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei es sich bei dem Polypeptid um ein Derivat von natürlich vorkommendem G-CSF mit wenigstens einer der biologischen Eigenschaften von natürlich vorkommendem G-CSF und einer Lösungsstabilität von mindestens 35% bei 5 mg/ml handelt, wobei in dem Derivat wenigstens Cys17 der nativen Sequenz durch einen Ser17-Rest und Asp27 der nativen Sequenz durch einen Ser27-Rest ersetzt ist.
  4. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei das Polypeptid wenigstens eine weitere Modifikation, ausgewählt aus: a) Glu11 der nativen Sequenz ersetzt durch einen Arg11-Rest; b) Leu15 der nativen Sequenz ersetzt durch einen Glu15-Rest; c) Lys23 der nativen Sequenz ersetzt durch einen Arg23-Rest; d) Gly26 der nativen Sequenz ersetzt durch einen Ala26-Rest; e) Gly28 der nativen Sequenz ersetzt durch einen Ala28-Rest; f) Ala30 der nativen Sequenz ersetzt durch einen Lys30 oder Arg30-Rest; g) Lys34 der nativen Sequenz ersetzt durch einen Arg34-Rest; h) Lys40 der nativen Sequenz ersetzt durch einen Arg40-Rest; i) Pro44 der nativen Sequenz ersetzt durch einen Ala44-Rest; j) Leu49 der nativen Sequenz ersetzt durch einen Lys49-Rest; k) Gly51 der nativen Sequenz ersetzt durch einen Ala51-Rest; l) Gly55 der nativen Sequenz ersetzt durch einen Ala55-Rest; m) Trp58 der nativen Sequenz ersetzt durch einen Lys58-Rest; n) Pro60 der nativen Sequenz ersetzt durch einen Ser60-Rest; o) Pro65 der nativen Sequenz ersetzt durch einen Ser65-Rest; p) Pro111 der nativen Sequenz ersetzt durch einen Glu111-Rest; q) Thr115 der nativen Sequenz ersetzt durch einen Ser115-Rest; r) Thr116 der nativen Sequenz ersetzt durch einen Ser116-Rest; und s) Tyr165 der nativen Sequenz ersetzt durch einen Arg165-Rest, umfaßt.
  5. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus: i) [Arg11, Ser17,27,60,65]-humanem G-CSF, ii) [Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Lys30]-humanem G-CSF, iii) [Arg11, Glu15, Ser17,27,60,65, Ala26,28, Lys30]-humanem G-CSF, iv) [Arg11,40, Ser17,27,60,65]-humanem G-CSF, v) [Arg11,23, Ser17,27,60,65]-humanem G-CSF, vi) [Arg11,165, Glu15, Ser17,27,60,65, Ala26,28, Lys30,58]-humanem G-CSF, vii) [Arg11, Glu15,111, Ser17,27,60,115,116, Ala26,28, Lys30]-humanem G-CSF, viii) [Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Arg30]-humanem G-CSF, ix) [Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5,11, Ser17,27,60,65]-humanem G-CSF, x) [Ser17,27,60,65]-humanem G-CSF, xi) [Arg11, Ser17,27,65]-humanem G-CSF, und xii) [Ser17,27,65]-humanem G-CSF.
  6. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei es sich bei dem Polypeptid um G-CSF handelt.
  7. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das wasserlösliche Polymer ausgewählt ist aus einem Polyethylenglykol- oder Polypropylenglykol-Homopolymer, einem polyoxyethylierten Polyol oder einem Polyvinylalkohol, wobei das Homopolymer gegebenenfalls an einem Ende mit einer Alkylgruppe substituiert ist.
  8. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das wasserlösliche Polymer ausgewählt ist aus unsubstituiertem Polyethylenglykol, Monomethylpolyethylenglykol und polyoxyethyliertem Glycerin.
  9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, wobei das wasserlösliche Polymer ein Molekulargewicht von 1000 bis 15000 besitzt.
  10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 sowie 7 bis 9, wobei es sich bei der physiologisch aktiven Substanz um [Arg11, Ser17,27,60,65]-humanen G-CSF, dessen Sequenz mit oder ohne vorgeschaltetes Methionin vorliegen kann und der an Monomethylpolyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 2000–5000 konjugiert ist, handelt.
  11. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Material der Zusammensetzung und die physiologisch aktive Substanz in einem organischen Lösungsmittel dafür gelöst oder in einem organischen oder wäßrigen Medium gleichmäßig dispergiert werden und anschließendes Trocknen und Formulieren zu einer zur Implantation oder Injektion in einen tierischen Organismus geeigneten Zusammensetzung erfolgt.
  12. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–10, wobei das Material der Zusammensetzung Polylactid enthält, wobei in dem Verfahren die physiologisch aktive Substanz in eine Matrix bestehend aus einem Polylactid, das wenigstens 25 Mol-% Milchsäureeinheiten und bis zu 75 Mol-% Glykolsäureeinheiten aufweist, eingebaut wird und weiterhin die physiologisch aktive Substanz und das Material der Zusammensetzung durch Schmelzverarbeitung eines innigen Feststoffgemischs aus dem Material der Zusammensetzung und der Substanz gleichmäßig miteinander vermischt werden.
  13. Verwendung einer physiologisch aktiven Substanz, die ein kovalent an ein wasserlösliches Polymer konjugiertes Polypeptid umfaßt, bei der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1–10.
  14. Säurestabile physiologisch aktive Substanz, bei der es sich um ein Derivat von G-CSF mit wenigstens einer der biologischen Eigenschaften von natürlich vorkommendem G-CSF und einer Lösungsstabilität von mindestens 35% bei 5 mg/ml handelt, wobei in dem Derivat wenigstens Cys17 der nativen Sequenz durch einen Ser17-Rest und Asp27 der nativen Sequenz durch einen Ser27-Rest ersetzt ist und das Derivat weiterhin kovalent an ein wasserlösliches Polymer konjugiert ist.
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