PT98410A - Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas de libertacao continua contendo polipeptidos - Google Patents

Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas de libertacao continua contendo polipeptidos Download PDF

Info

Publication number
PT98410A
PT98410A PT98410A PT9841091A PT98410A PT 98410 A PT98410 A PT 98410A PT 98410 A PT98410 A PT 98410A PT 9841091 A PT9841091 A PT 9841091A PT 98410 A PT98410 A PT 98410A
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
solution
release
residue
polypeptide
preparation
Prior art date
Application number
PT98410A
Other languages
English (en)
Inventor
Roger Camble
David Timms
Anthony James Wilkinson
Original Assignee
Ici Plc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB909016138A external-priority patent/GB9016138D0/en
Priority claimed from GB909018416A external-priority patent/GB9018416D0/en
Priority claimed from GB909018418A external-priority patent/GB9018418D0/en
Priority claimed from GB909018415A external-priority patent/GB9018415D0/en
Priority claimed from GB909018417A external-priority patent/GB9018417D0/en
Priority claimed from GB909018414A external-priority patent/GB9018414D0/en
Application filed by Ici Plc filed Critical Ici Plc
Publication of PT98410A publication Critical patent/PT98410A/pt

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/642—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a cytokine, e.g. IL2, chemokine, growth factors or interferons being the inactive part of the conjugate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2022—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/2031—Organic macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyethylene oxide, poloxamers
    • A61K9/204—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Description

Descrição referente à patente de invenção de IMPERIAL CHEMICAL INDUSTRIES PLC, britânica, industrial e comercial, com sede em Imperial Chemical House, Millbank, London SV/1P 3JE, Inglaterra, (inventores: Roger Gamble, David Timms e Anthony James Wilkimson, residentes na Inglaterra) para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS DE LIBERTAglO CONTÍNUA CONTENDO POLIPEPTIDOS".
DESQRIQAO A presente invenção refere-se a composições farma ceuticas de polipéptidos fisiologicamente activos que proporcionam a libertação contínua do polipéptido ao longo de um pro longado intervalo de tempo quando a composição é colocada num ambiente aquoso fisiológico (como se define mais adiante na presente memória descritiva).
Enquadramento G-eral da Invenção
Desde há muito tempo que se achou conveniente con seguir uma libertação contínua de certos fármacos ao longo de prolongados intervalos de tempo a seguir a uma única administração, o que pode ter vantagens significativas do ponto de vista prático na sua utilização clínica e desenvolveram-se já - 1 - 1
composições que proporcionam a libertação prolongada de um certo número de fármacos clinicamente úteis, depois de adminis tração por via oral (veja-se, por exemplo, Remington’s Pharma ceutical Sciences, publicado por Mack Publishing Company, Sas ton, Pensilvânia, Estados Unidos da América, 15- Edição, 1975, páginas 1618 - 1631), depois de administração por via parente rica (ibidem, páginas 1631 - 1643) e depois de administração por via tópica (veja-se, por exemplo, Patente de Invenção Bri tânica Numero 1 351 409). Um método apropriado de administração parentérica é a injecção subdérmica ou a implantação de um corpo sólido, por exemplo, um grânulo ou uma película, con tendo o fármaco, e descreveu-se já grande variedade desses dispositivos implantáveis. Em particular, sabe-se que, para muitos fármacos, dispositivos implantáveis ou suspensões de micropartícuias injectáveis apropriados para proporcionar a libertação prolongada do fármaco podem obter-se encapsulando o fármaco num polímero biodegradável ou dispersando o fármaco numa matriz desse polímero, de modo que o fármaco se liberte à medida que a degradação da matriz de polímero prossegue.
Os polímeros biodegradáveis apropriados para utilização em formulações de libertação retardada são bem conhecidos e incluem poliésteres que gradualmente se degradam por hidrólise quando são colocados em ambiente aquoso do tipo fisiológico. Os poliésteres particulares que têm sido utilizados são os derivados de ácidos hidroxi-carboxílicos e grande parte do trabalho da técnica antiga foi dirigido no sentido da obtenção de polímeros derivados de ácidos alfa-hidroxi-carbo-xílicos, especialmente ácido láctico em ambas as suas formas racémica e opticamente activas e ácido glicólico e os seus co polímeros; vejam-se, por exemplo, Patentes de Invenção Morte--Americanas Numeros 3 773 919 e 3 387 699; Jackanicz e col., Contraception, 1973, 3, 227 - 234; Anderson e col., ibidem. 1976, 11, 375 - 334; Wise e col., Life Sciences, 1976, 19, 867 - 374; Woodland e col., J. of Medicai Ghemistry, 1973, 16, • 397 - 901; Yolles e col., Bulletin of the parenteral Drug As- - 2 -
sociation, 1976, 30, 306 - 312; Wise e col., J. of Pharmacy and Pharmacology, 1978, 30, 686 - 689 e 1979, 31, 201 - 204.
Deve notar-se que a libertação "sustentada" ou "prolongada" de um fármaco pode ser contínua ou descontínua. Por exemplo, a libertação de um polipéptido de um polímero de polilactida, como se descreve na memória descritiva da Patente de Invenção Britânica Numero 1 325 209, ó muitas vezes pre cedida de um intervalo de tempo de indução significativo, durante o qual não se liberta polipéptido, ou é bifásica e compreende um intervalo de tempo inicial, durante o qual se liberta algum polipéptido, e um segundo intervalo durante o qual se liberta pouco ou nenhum polipéptido e um terceiro período, durante o qual se liberta a maior parte restante do po lipéptido.
Em contraste, é um objectivo da presente invenção proporcionar composições de polipéptidos a partir das quais, além de possivelmente um intervalo de tempo de indução inicial relativamente curto, o polipéptido se liberta continua-mente, sem quaisquer períodos durante os quais não se liberta polipéptido ou se liberta apenas uma pequena quantidade. As palavras "libertação contínua" são utilizadas na presente memória descritiva apenas para desaever um perfil de libertação que é essencialmente monofásico, muito embora possa ter um ponto de inflexão, mas certamente não tem uma fase com a forma de "planalto" quando se representa graficamente a libertação cumulativa do fármaco em função do tempo.
Na Patente de Invenção Europeia Numero 58 481, de positada pela Requerente, descreve-se a libertação contínua de composições farmacêuticas que permitem obter uma libertação essencialmente monofásica de polipéptidos estáveis em áci do. Estas composições, em geral, compreendem uma polilactida, que é um polímero de apenas ácido láctico, um copolímero de . ácido láctico e glicólico, uma mistura desses polímeros, uma - 3 -
I
mistura desses copolímeros ou uma mistura desses polímeros e copolímeros e um polipêptido estável a ácido (tal como se define mais adiante na presente memória descritiva), que não ó significativamente hidrolisado sob condições que se encontram dentro da composição durante o período de utilização previsto, composição essa que, quando é colocada num ambiente do tipo fisiológico aquoso (como se define mais adiante na presente memória descritiva), liberta polipêptido para o ambiente do tipo fisiológico aquoso de maneira contínua, originando um perfil de libertação essencialmente monofásico, muito embora possa ter um ponto de inflexão, mas certamente não tem uma fa se com a forma de "paramar" ao longo de um intervalo de tempo de pelo menos uma semana. A Publicação da Patente de Invenção Europeia EÚme ro 53 431 acima referida refere-se a formulações de polipépti dos que são apropriados sob as condições que se encontram den tro da formulação reivindicada. Ho entanto, certos polipépti-dos, tais como G-CSP humano natural (Met-^), são inerentemente instáveis sob tais condições, sofrendo de uma larga gama de problemas de instabilidade, que incluem, inter ala, a tendência para a agregação. A presente invenção baseia-se na de_s coberta de que a conjugação com um polímero solúvel em água pode resolver ou pelo menos melhorar o problema da instabilidade presente em certos polipêptidos, que não poderiam ser de outra forma estáveis sob as condições que se encontram dentro do depósito e que, portanto, não se libertariam adequadamente. A presente invenção baseia-se também na descoberta de que a utilização de uma substância fisiologicamente activa em que um polipêptido fisiologicamente activo está covalentemente conjugado com um polímero solúvel em água, melhora o perfil de libertação em relação ao correspondente polipêptido não conjugado em composições farmacêuticas de libertação contínua.
Recentemente, M. S. Hora e col., publicaram nas páginas 509 - 510 de Proceed. Intern. Symp. Control. Rei. Bio_ - 4 - «
act. Mater. 16 (1989), N2 268, um trabalho sobre desenvolvimento de uma formulação de interleucina-2 sob a forma de micro-esferas de libertação controlada. M. S. Hora e col. demonstram que se obtém um modelo de libertação trifásico quando se liberta interleucina-2 (IL-2) complexada com polietile-no glicol covalentemente conjugada com polietilenoglicol (PEG) e designada na presente memória descritiva como PEG IL--2, na presença de soro de feto de vitela a partir de micro--esferas de poli-(DL-lactido-co-glicólido) e que ainda se en-contra um longo período de indução ou de inicio de actuaçao compreendido entre cinco e quinze dias. M. S. Hora e col. pr£ curam resolver os problemas identificados tentando melhorar a molhagem e a ressolubilização do PEG IL-2 pela albumina do S£ ro humano (HS1). Esta tentativa introduz um outro problema que é a presença da proteína solubilizante. A presença dessa proteína numa formulação farmacêutica é inconveniente, inter alia, porque aumenta o risco de reacções secundárias adversas e impede o rigor analítico.
Além disso, a publicação de M, S. Hora e col. aci ma referida não define nem as características de solubilidade do polímero de poli-(Dl-lactido-co-glicólido) (especificamen-te, não refere se o polímero é insolúvel ou solúvel em benze-no) nem a polidispersibilidade (como se define mais adiante na presente memória descritiva), Ia ausência destes factos e na ausência de um processo de preparação, o trabalho não pode ser repetido e a publicação torna-se assim ineficaz. Note-se ainda que a publicação falha adicionalmente em definir o peso molecular do polietilenoglicol (PEG) ou o nível de pegilação, factores esses que são ambos necessários se o trabalho se de_s tinar a ser repetido.
Tendo em vista os fracos resultados de libertação contínua obtidos por i-I. S. Hora e col. com IL-2 pegilada, é particularmente surpreendente que, de acordo com a presente • invenção, se possa obter um tão bom perfil de libertação por . utilização de polipéptidos fisiologicamente activos covalente - 5 -
mente conjugados com um polímero solúvel em água.
Sumário da Invenção
Assim, de acordo com um aspecto característico da presente invenção, proporciona-se uma composição farmacêutica para libertação contínua de uma substância activa fisiológica mente estável em ácido (como se define mais adiante na presen te memória descritiva) de material da composição para um ambiente do tipo aquoso fisiológico (como se define mais adiante na presente memória descritiva), em que a referida substân cia e um polipeptido covalentemente conjugado com um polímero solúvel em água, substância essa que não á significativamente hidrolisada sob as condições que se encontram no interior da composição durante o período de utilização previsto, composição essa que i) quando e colocada num ambiente do tipo fisiológico aquo so, liberta o polipeptido para o ambiente do tipo fisio lógico aquoso de maneira contínua, originando um perfil de libertação que é essencialmente monofásico (como se define na presente memória descritiva) durante um inter valo de tempo de pelo menos uma semana; ii) apresenta duas fases sucessivas de libertação do poli-péptido, sendo este polipeptido libertado na primeira fase por difusão a partir da superfície e sendo liberta do na segunda fase em consequência da degradação do material da composição, caracterizadas pelo facto de a fa se de difusão e a fase provocada pela degradação se sobreporem no tempo e a libertação do polipeptido se veri ficar durante um intervalo de tempo de pelo menos uma semana; ou iii) absorve água de maneira contínua originando um perfil de absorção de água essencialmente monofásico, até que o material da composição se tenha degradado e essencial- - 6 -
mente todo o polipéptido se tenha libertado para o ambiente aquoso de tipo fisiológico, durante um intervalo de tempo de pelo menos uma semana.
De acordo com uma outra propriedade característi-ca específica da presente invenção, proporciona-se um método para conseguir uma terapia hematopoiétiea a um mamífero, tera pia que compreende a administração de uma composição farmacêu tica de acordo com a presente invenção ao mencionado mamífero para fornecer uma quantidade efectiva de um polipéptido conju gada com um polímero solúvel em água, tendo o citado polipéptido pelo menos uma das propriedades biológicas de G-GSF de ocorrência natural.
De acordo com uma outra propriedade característi-ca específica da presente invenção, proporciona-se um método para parar a proliferação de células leucémicas de um mamí fero, que compreende a administração de uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção ao referido mamífero, por meio da qual se fornece uma quantidade eficaz de um polipéptido conjugado com um polímero solúvel em água, tendo o mencionado polipéptido pelo menos uma das propriedades biológicas de G-OSF de ocorrência natural.
De acordo com uma outra propriedade característi-ca específica da presente invenção, proporciona-se um método para o tratamento da osteoporose ou da doença de Paget num ser humano que sofra dessas doenças, método esse que compreen de a administração de uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção ao citado ser humano com o fim de pro porcionar uma quantidade efectiva de calcitonina humana conju gada com um polímero solúvel em água.
De acordo com uma outra, propriedade característica específica da presente invenção, proporciona-se um proces-• so para o tratamento de neoplasmas ou de imunodeficiência num - 7 - t
mamífero que sofra dessa deficiência, método esse que compreen de a administração de uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção ao referido mamífero a fim de fornecer uma quantidade efectiva de interleucina-2 conjugada com um polímero solúvel em água.
De acordo ainda com uma outra propriedade earacte rística específica da presente invenção, proporciona-se um processo para o tratamento de um neoplasma ou uma infecção provocada por vírus num mamífero que sofra dessas perturbações processo esse que compreende a administração de uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção ao mencionado mamífero de modo a fornecer uma quantidade efectiva de um interferão (preferivelmente, interferão alfa, especialmente interferão alfag) conjugado com um polímero solúvel em á-gua.
Ainda de acordo com uma outra propriedade caracte rística específica da presente invenção, proporciona-se um processo para estimular o crescimento de um ser humano, processo esse que compreende a administração ao citado ser humano de uma quantidade efectiva de hormona, de crescimento humana conjugada com um polímero solúvel em água.
De acordo com uma outra característica específica da presente invenção, proporciona-se um processo para a prepa ração de composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, que compreende a dissolução do material da composição e da substância fisiologicamente activa num dissolvente orgânico desses materiais ou a dispersão uniforme do material da composição e da substância fisiologicamente activa num meio orgânico ou aquoso, seguida de secagem e formulação para a obtenção de uma composição apropriada para a implantação ou para a injecção num organismo animal.
Essa composição pode ser vantajosamente preparada, - S - *
por exemplo, por formulação com obtenção de uma forma sólida apropriada para implantação, convenientemente, uma formulação de depósito sólida cilíndrica, ou pode preparar-se por formulação com obtenção de uma forma de partículas múltiplas apropriada para injecção, por exemplo, por trituração ou microni-zação. 1 forma de partículas múltiplas pode ser formulada numa solução ou numa emulsão apropriadas para injecção. A formu lação pode ser efectuada, por exemplo, em meio aquoso ou em qualquer óleo, tal como óleo de amendoim ou cremophor (veja--se também Martindale, "The Extra Pharmacopoeia", 28ã Edição, página 694). Os veículos para injecção incluem carboximetilce lulose (veja-se também Martindale, "The Extra Pharmacopoeia", 28ã Edição, página 947).
Quando ae pretende formar uma dispersão, emprega--se, preferivelmente, um meio aquoso. 0 processo pode ser empregado para produzir um dispositivo de fornecimento de um fármaco com a forma de vare ta, esfera, película ou granulo para implantação. O material da composição pode ser, por exemplo, uma polilactida (como se define mais adiante na presente memória descritiva) e, vantajosamente, pode ter pelo menos 25%, preferivelmente 40^ em mo les de unidades de ácido láctico e até 75% em moles de unidades de ácido glicólico, convenientemente sob a forma de blocos com uma média de pelo menos duas unidades de monómeros i-dênticas. A polilactida é preferivelmente ou solúvel em benz_e no e tem uma viscosidade inerente (solução de 1 g/100 ml em benzeno) menor do que 0,3, ou é insolúvel em benzeno e tem u-ma viscosidade inerente (solução lg/100 ml em clorofórmio ou dioxano) menor do que 4. 0 processo de acordo com a presente invenção é preferivelmente realizado na prática utilizando um dissolvente comum secável por congelação, tal como, por exemplo, ácido acético (preferivelmente, ácido acético glacial), seguida de - 9 -
congelação e secagem em congelação. Pode ser conveniente preparar uma primeira solução do material da composição num dissolvente orgânico e uma segunda solução da substância fisiolo gicamente activa num dissolvente orgânico e, em seguida, misturar as duas soluções. 0 dissolvente orgânico empregado é preferivelmente comum à primeira e à segunda soluções e é van tajosamente secável por congelação. Este processo I ilustrado na Patente de Invenção Europeia Numero 58 481. Gaso se preten da, no entanto, o processamento pode realizar-se por processa mento de fusão de uma mistura sólida íntima do material da composição com a substância fisiologicamente activa.
De acordo com uma outra característica específica da presente invenção, proporciona-se um processo para a prepa ração de uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção, em que o material da composição compreende polilac-tida (como se define mais adiante na presente memória descritiva) que pode encontrar-se sob a forma de hidrogel, processo esse que compreende incorporar-se a substância fisiologicamen te activa numa matriz que compreende uma polilactida que tem pelo menos 25% em moles, preferivelmente, 40% em moles de áci do láctico e até 75% em moles de unidades de ácido glicólico, compreendendo ainda o processo a mistura uniforme da substância fisiologicamente activa e do material da composição por processamento em fusão de uma mistura íntima de sólidos da substância e do material da composição.
De acordo com outra propriedade característica da presente invenção, proporciona-se a utilização de uma substân cia fisiologicamente activa que compreende um polipéptido co-valentemente conjugado com um polímero solúvel em água para a preparação de uma composição farmacêutica de acordo com a pre sente invenção.
Descrição Geral [ A. Substância Fisiologicamente Activa 10 -
Era geral, quanto maior for a massa molecular do polipéptido, maior é o número de moléculas de polímero solúvel em água que podem ser conjugadas com o polipéptido para proporcionar um perfil de libertação óptimo. Preferivelmente, conjuga-se pelo menos uma molécula de polímero solúvel em á-gua com um polipéptido com até 8 000 Da de massa molecular e, pelo menos, uma molécula de polímero solúvel em água é empregada por cada 3 000 a 8 000 Da, especialmente, 4 000 a 6 500 Da de massa molecular de polipéptido. Uma molécula de polipéjD tido pode possuir tantas moléculas de polímero solúvel em á-gua quantas as que são consistentes com a retenção do nível pretendido de actividade 'biológica. Na verdade, sujeito a esta restrição, o polipéptido é vantajosamente conjugado com o número máximo de moléculas solúveis em água,. Ê apreciado que, quando existem sítios múltiplos para a conjugação de polímeros solúveis em água num dado polipéptido, a conjugação máxima pode ter como resultado uma mistura heterogénea de produtos. Assim, por exemplo, quando o polipéptido tem quatro sítios para conjugação de moléculas solúveis em água, a proporção máxima de polipéptido para polímero solúvel em água obtida pode ser não maior do que, por exemplo, 3,9. A.l Polipéptido A substância fisiologicamente activa empregada nas composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção pode, por exemplo, compreender calcitonina humana, interleuci na-2, hormona de crescimento humana ou um interferão, tal como, por exemplo, interferão alfa, por exemplo, interferão al-fa2, covalentemente conjugado com um polímero solúvel em água ou, preferivelmente, um polipéptido que tem pelo menos uma das propriedades biológicas de G-CSP de ocorrência natural e, convenientemente, parte ou toda a sequência de aminoácidos do G-CSf de ocorrência natural, covalentemente conjugado com um polímero solúvel em água. Preferivelmente, o péptido não con-• tém nenhum agrupamento tiol livre e assim, relativamente aos 11 - polipéptidos que têm pelo menos uma das propriedades biológicas de G-CSE de ocorrênica natural, a cisteína na posição 17 estará preferivelmente ausente ou será substituída por outro aminoácido, tal como alanina ou, preferivelmente, serina, por exemplo. A.1,1 Polipéptidos que têm pelo menos uma das propriedades biológicas de G-QSE_
Quando se pretende utilizar um polipéptido que tem pelo menos uma das propriedades biológicas de G-GSP de o-corrência natural, pode empregar-se qualquer derivado que tenha essa propriedade, mas, vantajosamente, o polipéptido empregado é um derivado de G-OSP, de acordo com o Pedido de Patente de Invenção Europeia Ifúmero 91303868.3, depositado pela Requerente, que descreve derivados de G-GSP que têm uma estabilidade em solução aperfeiçoada. 0 Pedido de Patente de Invenção Europeia Humero 91303868.3, depositado pela Requerente, descreve derivados de Gr-CSP de ocorrência natural que têm pelo menos uma das propriedades biológicas de G—CS3? de ocorrência natural e uma estabilidade em solução (como se define na presente memória descritiva) pelo menos igual a 35% a 5 mg/ml, tendo o referido derivado pelo menos Gys ' da sequência natural substituída por um resíduo de Ser1^ e Asp2^ da sequência na natural substituída por um resíduo de Ser .
Preferivelmente, os derivados têm pelo menos uma outra modificação escolhida de a) 11 Glu Α Arg11j b) leu^ Glu15; c) lys2^ sequência natural substituida por um resíduo de sequência natural substituida por um resíduo de sequência natural substituida por um resíduo de - 12
9
Arg25; 26 a f G-ly da sequência natural substituida por um resíduo de Ala26; 23 r λ -i 28 Ala ; lys5° ou de Arg^; 2o a f G-ly da sequencia natural substituído por um resíduo de 28
Ala^ da sequência natural substituida por um residuo de 30 ^ a„„30 lys54 da sequência natural substituida por um resíduo de Arg54; lys40 da sequência natural substituida por um resíduo de Arg40; 44 a ^ Pro da sequenica natural substituida por um resíduo de Ala44; ,49 leu da sequencia natural substituida por um residuo de τ 49 lys; 51 f
Gly da sequencia natural substituído por um residuo de Ala51; 55 t G-ly da sequencia natural substituida por um residuo de Ala55 í
Irp^8 da sequência natural substituído por ura resíduo de Iffs58;
Pro5 da sequenica natural substituida por um resíduo de 60 60 > o 60
Ser ; 65 .
Pro da sequencia natural substituida por um residuo de
Ser65;
111 A
Pro da sequência natural substituida por um resíduo 13 -
111 de Glu ; q) Thr"^ da sequência natural substituída por um resíduo de Ser115; ~ “1 ~J s* r) -Thr 0 da sequência natural substituída por um resíduo de Ser11^; e s) Tyr D da sequência natural substituída por um resíduo de Arg1^5.
Prefere-se a presença de, pelo menos, uma outra modificação escolhida de (b) a (s), mas a presença de pelo me nos uma outra modificação escolhida de b), d), e), f), n) e o ) é particularmente preferida, das quais é muito especialmen te preferida a modificação o).
Mais preferivelmente, a modificação posterior com preende pelo menos uma das seguintes modificações i) n-1 11 Gin e λ 11 Arg e ii) 111 Ala i por G-lu' iii) Gin11, ; por Arg' iv) Leu15, ' das por V) Pro^, ; 38 io60,65 £a sequ|ncia natural substituídos por 115 116 e Thr , da sequência natural substituídos ,165 da sequência natural substituídos A modificação posterior pode também compreender pelo menos uma das seguintes modificações 15 26 28 30 Λ vi) leu , G-ly * e Ala'' da sequência natural substitui - 14 -
das por G-lu^, Ala^*^ e Arg^; vii) Pro^ da sequência natural substituída por Ser^; viii) Pro^0*^ da sequência natural substituída por Ser^1^; ou ix) G-lu"^ e Pro^ da sequência natural substituídos por Árg·^· e Ser^.
As modificações acima definidas podem assim, caso se pretenda, ser introduzidas em qualquer poliplptido que tem pelo menos uma das propriedades biológicas de G-GSP de ocorrência natural a fim de aumentar a solubilidade da solução das moléculas. As modificações acima definidas podem assim ser aplicadas a esses polipéptidos que diferem na sequência de aminoácidos em relação à especificada na presente memória descritiva para os G-GSE dé ocorrência natural em termos da identidade ou da localização de um ou mais resíduos (por exem pio, substituições, adições e supressões terminais e internas). Gomo exemplos, esses polipéptidos podem incluir aqueles que são previamente encurtados, por exemplo, por supressões; ou aqueles que são mais estáveis à hidrólise (e, por consequêb. cia, têm efeitos mais pronunciados ou mais prolongados do que no caso de ocorrência natural); ou.que foram alterados para suprimir um ou mais sítios potenciais para a O-glicosilação (o que pode ter como resultado maiores actividades dos produtos produzidos por leveduras); ou que têm um ou mais resíduos de cisteína suprimidos ou substituídos, por exemplo, por resí duos de alanina ou de serina e que são potencialmente isolados com maior facilidade na forma activa dos sistemas microbianos ; ou que têm um ou mais resíduos de tirosina substituídos por fenil-alanina e podem ligar-se mais ou menos facilmen te a receptores de 0-0351 humano em células que servem de alvo. As modificações propostas pelo Pedido de Patente de Invenção Europeia Sumero 91303368,3, depositado pela Requerente e acima referido, podem assim, por exemplo, ser aplicadas ou a G~ - 15 -
17 -GSE natural que tem a Gys da sequência natural substituída por Ser ou a variantes alélicos e analogos respectivos que se sabe possuirem pelo menos uma das propriedades biológicas de G-CSE de ocorrência natural, tal como se desaeve na Publicação da Patente de Invenção PCI da Organização Mundial da Propriedade Industrial Numero WG 37/01132, na Publicação da Patente de Invenção Europeia Numero 243 153, na Publicação da
Patente de Invenção Europeia Numero 256 343, na Publicação da
Patente de Invenção Europeia Numero 272 603, em Biochemical and Biophysical Research Communications (1939), Volume 159, llúmero 1, páginas 103-111* Kuga e col. e na Patente de Inven-çao Norte-Americana Numero 4 904 534.
Esses derivados de G-GSE que foram ensaiados veri ficou-se possuirem uma estabilidade de solução melhorada em relação aos correspondentes polipéptidos não modificados com ou sem diferença significativa na actividade biológica ou com uma actividade biológica melhorada. A estabilidade da solução ó medida, de acordo com a presente memória descritiva, determinando a percentagem de derivado de G-CSP que permanece em solução numa solução salina tamponizada com fosfato depois de catorze dias a 37°C, com uma concentração inicial de 1 mg/ml, 5 mg/ml e/ou 10 mg/ml. A medição da estabilidade da solução ó descrita pormenorizadamen te mais adiante na presente memória descritiva no Exemplo de Referência 26. Convenientemente, os derivados de G-CSP empregados nas composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção têm uma estabilidade da solução a 5 mg/ml de pelo me nos 35%, vantajosamente, pelo menos 50% e, preferivelmente, pelo menos 75%. Preferivelmente, os polipéptidos de acordo com a presente invenção têm uma estabilidade de solução a 10 mg/ml pelo menos igual a 75%, especialmente, pelo menos igual a 85%.
Vantajosamente, os derivados de G-GSP empregados - 16 -
nas composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção são escolhidos de modo a possuirem uma das modificações posteriores i), ii), iii), iv), v), vi), vii), viii) ou ix), como se definiu antes na presente memória descritiva, preferivelmente uma das modificações posteriores i), ii), iv), vi), vii), viii) ou ix) e, especialmente, a modificação posterior ii), iv), vi), vii), viii) ou ix).
Os derivados particularmente preferidos para utilização nas composições farmacêuticas de acordo, com a presente invenção, em virtude da sua boa estabilidade em solução, in cluem /"Arg11, Ser17,27,60,65_7G-CSF;
/"Glu15, Ser17,27, Ala26,23, Lys3°_7S-CSF /"Arg11, Glu15, Ser17»27’60'65, Ala26,23, Lys3°jG-CSF JTArg11*23, Ser17’27'60 * ^.JG-GSF /-Arg11’54, Ser17’27>6°>65_7G-CSP
JTArg11,4*5, Ser17’27»60 *^^G-OSF /"Ala1, Thr3, Tyr4,Arg5’^Ser17»27»60» 65_7G-CSF /"Arg11,Glu15’ni,Ser17’27’60’65’115,116>Âla26,28>
Lys30 7MSF
/"Argn’l65,Glu15, Ser17»27»60’65, Ala26’28, Lys30’58J-G-OSF /"Arg11,Glu15, Ser17 ’27 ’60 ’65,Ala26 *23’44’51’55,lys30’ 49,5Sjg_csí, - 17 -
rArg^-^.&lu^-^.Ser17-27'60-65-115·116,
Ala2 6’23’44 *51’5 5,Lys 3 0’49’5 SJf G-GSP /“Glu15,Ser17’27,Ala26 *23,Arg5u_7hu-G-GS ΐ
Os derivados de G-CSP especialmente preferidos pa ra utilização nas composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, em virtude da sua excelente estabilidade~ em solução e da boa actividade específica, incluem i) /“Arg11, Ser17’27,60,65_7G-GSi>, ii) /“Glu15, Ser17’27, Ala26’28, Iys^Jfà-GSf, iii) /“Arg11, Glu15, Ser17»27»60»65» Ala26»23, Iys3°jG- -CSf, iv) /“Arg11’40, Ser17 ’27 ’60 ’ 65__7g-CS i?, v) ΓArg11,23, Ser17»27 ’60» 65_7g-GSJ' , vi) /“Arg11’165, Glu15’Ser17’27’6Q’65,Ala26^S, Iíys3°’5S_7G-GSF, VI1 ) /-Arg11,Glu15’111,Ser17’27’60’63’119’116,Ala26’28, lys3°_7G-CSl,
ii) /”Glu15,Ser17’27,Ala26’28,Arg30_7G-GS£‘, e ) CAla1, fhr3, Tyr4, Arg5 ’11, Ser17 ’27 ’60 >65Jg-G SF ) /~SeT17>27f60’65jG-GSF xi) /“Arg11,Ser17’27’65_jG-CSF, e i) /“Ser17’27’63jG-GSF
Vlll
IX
X
Xll IS - dos quais os mais preferidos são os derivados i), ii), iii), vi), vii), viii), x ), xi) e xii).
Estes últimos derivados de Gr-CSE humano apresentam não só excelentes propriedades de estabilidade em solução, mas possuem também uma actividade específica aperfeiçoada relativamente e ao G-GSE humano de ocorrência natural.
Uma pré-sequência de metionina pode estar presente ou ausente nos polipéptidos de acordo com a presente inven ção, mas encontra-se convenientemente presente.
Relativamente à preparação de derivados de G-CSE para emprego nas composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção, verificou-se ser vantajoso o uso de um ve_ç tor de produção baseado em pAT153, que compreende i) um promotor e, quando isso for apropriado, um operador para o mesmo, por exemplo, um promotor trp ou um promo tor T7A3. 0 promotor T7A3 é o promotor A3 do bacterió-fago T7 (veja-se J. J. Dunn e E. b. Studier, J. Mol. Biol. 166, 477 - 535 (1983)). A sequência de nuoleóti-dos completa do bacteriófago TI AM e as localizações dos elementos genéticos 1'7 são estabelecidas nesta referência; ii) uma sequência do sítio de ligação de ribossoma, por e-xemplo, uma sequência de ligação do sítio de ribossoma de líder trp; iii) um sítio de clonação do gene a ser expresso; iv) uma sequência de acabamento de transcrição TJ (veja-se SEQ ID 3P 51 e a Eigura 4); v) uma sequência cer (D. Summers e col. MG-G-, 201, páginas 19 334 - 333, 1985); vi) um gene repressor de tetraciclina. (let R); vii) um gene de resistência a tetraciclina (fet A); viii) sequências de reconhecimento de enzimas de restrição múltiplas. A SEQ ID 12 47 estabelece uma sequência que inclui um sitio de endonuclease de restrição BcoRI (nucleótidos 1 -- 6), a sequência do promotor A3 (nucleotidos 7 - 52), a sequência do sítio de ligação do ribossoma líder trp (nucleóti-dos 53 - 78) e o codão de iniciação da translação (nucleóti-dos 79 - 81).
Pode ser vantajoso cultivar o hospedeiro capaz de exprimir um derivado de G-GSE (como se definiu antes na presente memória descritiva) de acordo com a presente invenção num meio de desenvolvimento e adicionar um suplemento que inclui extracto de levedura ao meio de desenvolvimento durante a cultura. É preferível que a adição do suplemento que inclui o extracto de levedura se inicie num momento predeterminado depois do início da cultura. A taxa de adição do suplemento que compreende o extracto de levedura é preferivelmente tal que o meio de cultura não fique exausto de extracto de levedu ra. Isto é particularmente vantajoso quando o vector de produ ção é utilizado com um promotor T7A3.
Pode também ser vantajoso cultivar um hospedeiro transformado com um vector recombinante que transporta materiã. genético que codifica um derivado de G-CS3?, como se definiu anteriormente na presente memória descritiva, na presença de leucina e/ou de treonina, numa quantidade suficiente para ori ginar uma acumulação melhorada de derivado de G-CSP. Isso é • particularmente vantajoso para efectuar a fermentação na pre- 20 - sença de leucina em que o vector de produção e utilizado com o promotor trp. A purificação do derivado de G-CSE pode efectuar--se como se descreveu na Publicação da Patente de Invenção PCT da Organização Mundial da Propriedade Industrial numero ¥0 37/01132, mas não há aí referencias sobre a remoção de detergente, particularmente de U-lauroil-sarcosina sob a forma de sal (por exemplo, Sarkosyl) dos análogos de G-CSE preparados nesta publicação da PCT. A separação do detergente efec-tua-se preferivelmente na presença de uma solução salina tam-ponizada com fosfato (pH 7,2 - 7,5)· A solução salina tamponi zada com fosfato pode preparar-se convenientemente a partir de solução salina isotonica e, assim, por exemplo, pode ter uma composição como se descreve no Exemplo de Referência 3. A este respeito, a Requerente descobriu que outros tampões eram menos preferidos visto que ou a eliminação do detergente, par ticularmente a remoção de E-lauroil-sarcosina (sob a forma de sal), era mais lenta ou maior quantidade de proteína precipitava, separando-se. Ê ainda preferido efectuar a remoção do de tergente por diafiltração visto que se verificou que este método melhora a eficiência sem provocar aumento de precipitação da proteína. Por exemplo, verificou-se que a diafiltração era preferível em relação à diálise convencional por difusão. Além disso, verificou-se que a concentração de detergente, particularmente a concentração de l-lauroil-sarcosina sob a forma de sal (por exemplo, Sarkosyl), podia ser reduzida de maneira a ser inferior a 1%, ao mesmo tempo que se retinha a resolução durante a cromatografia. Uma redução da concentração inicial de detergente ajuda a eliminar 0 detergente e, as sim, prefere-se usar a concentração mínima de detergente, por exemplo, de N-lauroil-sarcosina( sob a forma de sal, por exem pio, Sarkosyl), compatível com a retenção da resolução durante a cromatografia. Uma concentração de detergente particular, por exemplo, de lí-lauroil-sarcosina (sob a forma de sal), por • exemplo, de Sarkosyl, está assim compreendida entre 0,8 e 0,2%, 21 -
preferivelmente, entre 0,5 e 0,2%, espeoialmente igual a cerca de 0,3%.
Além do que se referiu acima, a Requerente descobriu que a eliminação de detergente, tal como íí-lauroil-sarco sina (sob a forma de sal), por exemplo, Sarkosyl, activa os vestígios de actividade proteolítica que podem complicar a ava liação do produto. Ainda se verificou que esta actividade pr£ teolítica pode ser significativamente reduzida, e mesmo eliminada se, depois da eliminação do detergente por diafiltração, o pH foi diminuído para cerca de 7,0 antes da proteólise subs tancial, convenientemente por diafiltração e, preferivelmente, por diálise. Assim, a redução ou a eliminação dos vestígios de actividade proteolítica podem efectuar-se a um pH inferior a 7,0, mas que é suficientemente elevado para evitar uma hidrólise significativa do polipéptido. G pH está vantajosamente compreendido dentro do intervalo de 6,0 a 4,5, preferivelmente, entre 5,3 a 5,0, especialmente igual a cerca de 5,4.
Uma outra vantagem desta forma de realização consiste no facto de os contaminantes de 5» coli e/ou de proteína degradada ou incorrectamente dobrada podem ser precipitados efectuando este abaixamento do pH. Rrefere-se que a purificação inclua a operação de cromatografia de exclusão de tamanhos, visto que, caso contrário, o problema de degradação pro teolítica é aumentado e enquanto a presente forma de realização reduz essa degradação, torna difícil a sua eliminação.
Além dos processos acima referidos, a introdução da estabilidade em solução num G-OSí ou num seu derivado permite a simplificação substancial do processo de extracção. As sim, um processo para extrair um derivado activo de acordo com a presente invenção (tal como se definiu anteriormente na presente memória descritiva) de um corpo de inclusão compreen de 22 - 1)
a suspensão do referido corpo de inclusão num detergente, particularmente, B-lauroil-sarcosina sob a for ma de sal (por exemplo, Sarkosyl); 2) oxidação; 3) eliminação do detergente, por exemplo, como se descre veu anteriormente na presente memória descritiva; e 4) manutenção da solução obtida depois da remoção do detergente a uma temperatura elevada, por exemplo, 30 a 45°0, vantajosamente, 34 a 42°G, de modo a precipitar a proteína bacteriana contaminante, os produtos oligo méricos e/ou os produtos da degradação; a referida s£ lução é convenientemente conservada à referida temperatura elevada durante seis a vinte e quatro horas, vantajosamente, durante oito a dezoito horas, preferi velmente, durante dez a catorze horas e, especialmente, durante cerca de doze horas. 0 processo de extracção pode efectuar-se, por e-xemplo, submetendo a lise células hospedeiras, seguida de cen trifugação, para se obter o corpo de inclusão, por exemplo, sob a forma de pelete. 0 corpo de inclusão pode então ser sus penso num detergente, tal como, por exemplo, N-lauroil-sarco-sina sob a forma de sal (por exemplo, Sarkosyl), preferivelmente 1 a 3%, especialmente cerca de 2% de h-lauroil-sarcosi-na sob a forma de sal (por exemplo, Sarkosyl). á suspensão em detergente pode ser seguida de oxidação, por exemplo, na presença de sulfato de cobre (CuSO^) que, por sua vez, pode ser seguida de centrifugação.
Quando é possível lavar o corpo de inclusão, pre-fere-se utilizar ureia., de preferência em vez de, por exemplo, desoxi-colato. - 23 -
0 processo de extracção permite que o processo de produção seja simplificado, por exemplo, por eliminação da ne cessidade de emprego de colunas de exclusão de tamanhos. Além disso, a elevada recuperação de produto a partir da operação de tratamento térmico parece ser uma das vantagens da maior estabilidade da solução dos derivados de Gr-CSF como se definiu antes na presente memória descritiva. Ha realidade, quanto maior for a estabilidade da solução mais apropriada é a proteína para o novo processo de extracção. Assim, por exemplo, prefere aplicar-se este processo de extracção à extracção dos derivados de G-OSE que têm uma estabilidade em "solução de pelo menos 85% a 10 mg/ml. Quando se extraiu o análogo conheci-do (!-íet , Ser ) G-CSE pelo processo acima referido, a rpHPIC indicou que apenas A0°% do produto pretendido se mantinha em solução depois do tratamento térmico de um produto retido con tendo 1 mg/ml de proteína total. A 3 mg/ml de proteína total, apenas 19%> do análogo permanecia em solução. A.1.2 Outros Polipéptidos A calcitonina humana é descrita na memória descri tiva da Patente de Invenção Britânica Numero 1 270 595 e pode preparar-se, por exemplo, por síntese de péptidos ou por técnicas recombinantes (vejam-se, por exemplo, as Publicações das Patentes de Invenção Europeias Numeros 77 689, 70 675, 95 351, 197 794, 201 511 e 308 067 e as Patentes de Invenção Norte-Americanas Numeros 3 391 614 e 3 926 933). A produção de calcitonina humana covalentemente conjugada com um polímero solúvel em água por síntese de péptidos pode ser preferível em virtude da disponibilidade de um grupo amino N-terminal livre, assim como de um outro grupo amino livre no resíduo de lisina simples para conjugação covalente do polímero solúvel em água. A formação de calcitonina humana tanto por sm. tese de péptidos como por técnicas recombinantes, antes da con jugação com o polímero solúvel em água, pode ter como resulta • do uma mistura heterogénea de produtos. Se, no entanto, o re- - 24 -
síduo pretendido do aminoácido relevante ou os resíduos relevantes de aminoácidos forem covalentemente conjugados com o polímero solúvel em água antes da incorporação na síntese total de péptidos, pode formar-se uma única entidade molecular como produto, de preferência a uma mistura heterogénea. Caso se pretenda, no entanto, a calcitonina humana pode preparar--se, evidentemente, quer por síntese de péptidos quer por téc nicas recombinantes e a calcitonina humana assim formada pode em seguida ser covalentemente conjugada com o polímero solúvel em água. A interleucina-2 é uma glicoproteína solúvel que aumenta a imunidade produzida por linfácitos 1 a seguir à ac-tivação por antigénios ou mitogénios na presença de interleu-cina-1. A interleucina-2 provoca o crescimento e a proliferação de células 1, potência a libertação de gama-interferão, do factor de crescimento de células B e do factor de diferenciação de células B, reforça a actividade células naturais que provocam a morte e restaura a função das células T nos es, tados de doença imunodeficiente. 0 isolamento do gene IIr-2 foi descrito por S. Mita e col. em Biocliem. Biophys. Res. Com mun. 117. 114 (1983) e a produção microbiana de interleucina--2 foi descrita, por exemplo, na Publicação da Patente de Invenção Europeia Número 142 263. Além disso, vários análogos 12 q de interleucina-2, tais como desalanil-Ser -IL-2 foram também descritos, por exemplo, na,s Patentes de Invenção Norte-Americanas Números 4 518 584 e 4 53-0 737. A conjugação de um polipéptido tendo actividade de IL-2, tal como desalanil--Ser -IL-2, com polietilenoglicol foi também descrita na Pu blicação da Patente de Invenção PCI da Organização Mundial da Propriedade Industrial ¥0 37/00056. Os péptidos que possuem actividade de interleucinas2, tal como IL-2 per se e seus aná logos, assim como tais péptidos covalentemente conjugados com polímeros solúveis em água, tal como polietilenoglicol, são de interesse potencial no tratamento do cancro. - 25 -
A hormona de crescimento humana (HGH) é uma espécie de proteína anabálica específica que promove o crescimento somático, estimula a síntese proteica, regula o metabolismo dos hidratos de carbono e dos lípidos e aumenta os níveis de somatomedinas no soro. A sequência de aminoácidos da HG-H e a clonação e a expressão de ADN para a I1GH em bactérias é descrita por D. Y. Goeddel e col. em Mature 281, 544 (1979) e na Patente de Invenção Belga número 884 012 e na Patente de Invenção Norte-Americana Numero 4 342 332. A clonação e a expressão de ADN para HGH. em células de mamíferos é descrita por G. N. Pavakis e col. em Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78, 7398 (1931) e na Patente de Invenção Prancesa Numero 2 534 273·
Apreciar-se-á que a HGH contém duas espécies de proteínas, uma com a massa molecular igual a 22 KDa e a outra igual a 20 KDa (veja-se U. J. lewis e col., J. Biol. Ghem. 253, 2679 - 2687 (1978) e R. N. P. Singli e U. J. lewis, Prep. Biochem. 11, 559 - 570 (1981)). A forma da variante de 20 KDa da hormona de crescimento (20K-HGH), constitui 5 a 10iá da HGH total na glândula pituitária humana anterior, plasma e uirina. A análise da sequência de aminoácidos mostra que a 20E-HGH di: fere de 22K-HGH sá pelo facto de não possuir a sequência de a-minoácidos 32-46. A forma 20E-HGH possui actividade de promoção do crescimento e outras actividades biológicas comparáveis, mas não mostra actividade semelhante a insulina ou uma menor actividade semelhante a insulina. A clonação molecular do ADN que codifica a variante 20K-HGH é descrita em Biochimi ca et Biophysica Acta 949 (1983), 125 - 131, por N. Masuda e col.. "Interferão" é 0 nome dado a uma família de espécies de proteínas específicaa dos vertebrados, que conferem resistência não específica a uma larga gama de infecções provocadas por vírus, afectam a proliferação de células e modulam as respostas imunes. Os interferões foram largamente descritos na literatura (veja-se, por exemplo, C. Weissmann, H. We- 26 -
ber, Prog. Nucl. Acid. Res. í-Iol. Biol. 33, 251 - 300 (1986) θ K. C. Zoon, Interferon 9, 1-12 (1987)). Os tres componentes mais importantes da família dos interferões são designados al fa-interferão, beta-interferão e gama-interferão e foram iden tificados com base nas suas propriedades antigénicas e físico -químicas, na natureza dos seus indutores e na fonte celular de que derivam. (Matura 286, 110 (1980)). Os interferões podem preparar-se por qualquer técnica pretentida, tal como, por exemplo, por tecnologia de AM recombinante. A produção do interferão alfa foi descrita por S. Nagata e col. em Matura 284. 316 (1930) e por D. V. Goeddel e col. em Nature 287. 411 (1930), mas uma descrição particularmente boa da produção do interferão alfa^ é feita por M. D. Edge e col., em Mucleic Acids Res., Vol. 11, N9 18, 6419 - 6435 (1933). A produção do interferão beta por processos recombinantes foi descrita por '1. Taniguchi e col. em Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77, 5230 (1980) e por R. Derynck e col. em Nature 285, 542 (1980). A produção do interferão gama por processos recombinantes foi descrita por P. V/. G-ray e col. em Nature 295, 503 (1982) e a estrutura do gene do interferão gama humano foi descrita por P. ¥. G-ray e D. 7. G-oeddel em Nature 298, 859 (1982). Os interferões são ainda descritos em Biotechnology and G-enetic En gineering Reviews, Yol. 2, página 215 (1984) por M. D. Edge e R. Cambie.
Note-se que pelo menos certos interferões podem ser lábeis a pH igual a cerca de 8,5. 0 interferão empregado é vantajosamente interferão alfa ou interferão beta, preferivelmente interferão alfa e, especialmente, interferão alfag.
Em geral, os péptidos para utilização na presente invenção podem produzir-se por técnicas recombinantes ou por síntese de péptidos. A síntese de péptidos pode ser uma técni ca preparativa preferida quando o tamanho do péptido o permi- - 27 -
te e guando mais do que um grupo amino livre (por exemplo, o grupo amino-N-terminal e um ou mais resíduos de lisina) se en contra presente para conjugação covalente com um polímero solúvel em água, como se exemplificou acima. Essa técnica prepa rativa tem a vantagem de que os resíduos de lisina covalente-mente conjugados com o polímero solúvel em água podem ser introduzidos em sítios específicos da molécula para formarem uma única entidade molecular de preferência a mistura heterogénea de produtos que podem resultar da conjugação covalente do polímero solúvel em água com um péptido que possui grupos múlti pios amino livres.
Independentemente da técnica preparativa empregada, pode ser vantajoso modificar o péptido; i) substituindo os resíduos existentes por outros resíduos, tais como resíduos de lisina, para ligação de moléculas de polímeros solúveis em água; ii) por adição de novos resíduos para ligação de moléculas de polímeros solúveis em água, por exemplo, na extremidade N e/ou 0 ou em outra qualquer posição da molécula, desde que a actividade não seja destruída ou inaceitavelmente reduzida; e/ou iii.) substituindo ou eliminando um ou mais desses resíduos, por exemplo, resíduos de lisina, para diminuir o grau de ligação de moléculas de polímero solúvel em água com o fim de diminuir a natureza heterogénea do produto e/ou evitar a ligação de polímero solúvel em água em sítios da molécula em que essa ligação re duza ou destrua a actividade do péptido. A conjugação covalente de moléculas de polímero solúvel em água, como polietilenoglicol, ao péptido formado ou a aminoácidos específicos antes da formação do péptido pode efectuar-se por quaisquer meios convenientes, tais como os 28 -
métodos descritos na presente memória, descritiva. A.2 Polímero Solúvel em Água 0 polímero solúvel em água covalentemente conjuga do com o polipéptido pode ser, por exemplo, um dextrano ou po li-(N-vinil-pirrolidona), mas é preferivelmente escolhido de polietilenoglicol, homopolímeros de polipropileno-glicol, po-liáis polioxietilatos e álcool polivinílico, em que o mencionado homopolímero é não substituído ou substituído em uma extremidade por um grupo alquilo,
Os polímeros particulares aos quais o polipéptido é ligado incluem um homopolímero de polietileno-glicol (PEG) ou um poliol polioxietilado, desde que o polímero seja solúvel em água à temperatura ambiente. Os exemplos de poliéis po lioxietilados incluem, por exemplo, glicerol polioxietilado, sorbitol polioxietilado ou glucose polioxietilada. A cadeia de glicerol do glicerol polioxietilado é a mesma cadeia que ocorre naturalmente em, por exemplo, animais e seres humanos em monoglicéridos, diglicéridos e trigli céridos. Portanto, esta ramificação não deve ser necessáriamente considerada como um agente estranho no organismo.
Preferivelmente, o polímero é polietilenoglicol não substituído (PEG), monometil-PEG (mPEG) ou glicerol po lioxie tilado (POG), especialmente monometil-PEG (mPEG), e é con venientemente acoplado com o polipéptido por meio de uma liga ção de amida ou de uretano, formada, por exemplo, a partir do éster de 4-hidroxi-3-nitrobenzeno-sulfonato ou do éster de -hidroxi-succinimida de um PEG·, mPEG ou POG ácido carboxílico ou do carbonato de p-nitrofenilo ou do 2,4,5-triclorofenil--carbonato de um PEG, mPEG ou POG. Oaso se pretenda, o polipéptido pode ser ligado a mPEG por meio de um aminoácido ou • de um polipéptido como um ramo distanciador (veja-se L. Sarto 29 -
re e col., em Appl. Biochem. Biotechnol. 27, 45 - 54 (1991)).
Prefere-se que a massa molecular do polímero este ja compreendida entre cerca de 300 e ICO 000, mais preferível mente, entre 350 e 40 000, dependendo, por exemplo, do poli-péptido particular empregado. A este respeito, a massa molecu lar indicada em relação aos polímeros solúveis em água é uma massa molecular média em número, mas como esses polímeros devem ter uma polidispersibilidade (como ae define más adiante na presente memória descritiva) igual a cerca de 1, o valor da massa molecular média em número é aproximadamente igual ao da massa molecular média em peso. 0 homopolímero de PEG· pode ser não substituído mas pode também ser substituído numa extremidade por um grupo alquilo. Preferivelmente, o grupo alquilo é um grupo alquilo em C-j-C^ e mais preferivelmente, um grupo metilo. Vantajosamente, o polímero é um homopolímero não substituído de PEG-, um homopolímero substituído por monometilo de PEG- ou glicerol polioxietilado e tem um limite inferior de massa molecular pre ferivelmente igual a 1 000, mas preferivelmente 1 250 e, espe cialmente, 1 500, e um limite superior de massa molecular, por exemplo, igual a 20 000. 0 limite superior da massa molecular pode, caso ae pretenda, ser tão elevado como 40 000, mas vantajosamente, é igual a 15 000 e, preferivelmente, igual a 10 000. Preferivelmente, a massa molecular está compreendida dentro do intervalo de 1 000 a 15 000, por exemplo, 2 000 a 10 000, especialmente 2 000 a 5 000.
Quando o polipéptido tem pelo menos uma das propriedades de G-OSP de ocorrência natural e um homopolímero não substituído de PEG- ou um homopolímero de PEG· substituído por monometilo, é utilizado como polímero solúvel em água, sendo a massa molecular mínima do polímero solúvel em água tão peque na como 750, mas será normalmente de 1 000, vantajosamente 1 250, preferivelmente, 1500 e, especialmente, cerca de 2 000. - 30 -
0 polipeptido é covalentemente conjugado com um polímero solúvel em agua tal como polietilenoglicol, homopolí meros de polipropilenoglicol, polióis polioxietilados e álcool polivinílico, em que o citado homopolímero é não substituído ou substituído numa extremidade por um grupo alquilo.
Os polipéptidos acima descritos podem, por exemplo, ser conjugados com o polímero por intermédio ou de 1) um grupo ou vários grupos amino livres, 2) pelo menos, um agrupa mento de hidrato de carbono na proteína, ou 3) um grupo ou vá rios grupos sulfidrilo livres que estão quer presentes na mo-lecula natural ou sao incorporados na molécula.
Estas técnicas estão pormenorizadamente descritas na Publicação da Patente de Invenção PCI da Organização Mundial da Propriedade Industrial. ¥0 39/06546 em relação a M-CSP.
De maneira particular, a presente invenção propor ciona um processo para a preparação de um polipeptido G-GSP (tal como se define na presente memória descritiva) co valente^ mente conjugado com um polietilenoglicol ou um polipeptido G~ -CSP covalentemente conjugado com um poliol polioxietilado, que compreende fazer contactar um excesso de um éster activa-do ou um carbonato de polietileno-glicol (PEG) ou de poliol polioxietilado (POP) com um polipeptido G-OSP, tal como se de fine na presente memória descritiva, de modo a formar um poli péptido G—CSP substancialmente eovalentemente conjugado no ma ximo com PEG ou com POP. 0 carbonato activado de PEG ou de POP, é preferivelmente preparado fazendo contactar PEG ou POP, que têm pelo menos um grupo hidroxilo, e um cloroformeato, de modo a formar o referido carbonato activado.
Preferivelmente, a proporção molar de éster acti-vo ' ou de carbonato de PEG ou de POP para polipeptido G-GSP está compreendida entre 200 j 1 e 50 : 1, mais preferivelmen-• te entre 150 : 1 e 50 : 1 e, especialmente, é igual a cerca - 31 - de 100 ϊ 1 0 processo empregado é semelhante ao descrito em Applied Biochem. and Biotech. 11 : 141 - 152 (1935) por Vero-nese e col. e subsequentemente aplicado a 11-2 por Oetus Corporation e reivindicado na sua Patente de Invenção Norte-Americana Numero 4 902 502 (depositada em 23 de Janeiro de 1939).
Quando a conjugação do polímero solúvel em água com o polipéptido reduz a actividade fisiológica do conjugado para um valor abaixo do nível pretendido, isto pode ser evita do, por exemplo, 1) empregando uma ligação clivável entre o polipéptido e o polímero solúvel em água, de modo a que, a seguir à libertação do conjugado in vivo, o polímero solúvel em água seja clivado do polipéptido para proporcionar polipéptido com boa actividade fisiológica; ou 2) pondo a molécula do polipéptido (por exemplo, como se descreve na Patente de Invenção Norte-Americana Número 4 904 534) de modo a que a conjugação do polímero solúvel em água se verifique em sítios do polipéptido que não afectem adversamente de maneira significativa a actividade fisiológica do conjugado.
Caso assim se pretenda, no entanto, pode evitar--se a redução da actividade fisiológica do polipéptido simplesmente ou pelo menos minimizar-se essa redução aumentando a quantidade de conjugado presente na composição farmacêutica, de acordo com a presente invenção. B. Material da Composição 0 material da composição pode ser um qualquer tipo de polímero conveniente ou mistura de polímero como, por e- - 32
xemplo, polilactida (tal como ae define mais adiante na presente memória descritiva) ou hidrogeles biodegradáveis deriva dos de copolímeros em bloco anfifáticos (por exemplo, como se descreve na Patente de Invenção Europeia Kumero 92 913) e mis turas de polilactidas com esses Mdrogeles. Os hidrogeles podem ter uma utilidade particular visto que podem ser designados de forma tal que um componente do copolímero em bloco linear ou ramificado tenham uma identidade termodinâmica, semelhante à da unidade hidrofílica (polímero solúvel em água) li gada ao polipéptido. Assim, por exemplo, pode ser particularmente útil empregar polipáptidos complexados com polietileno-gliool com anfipáticos que contêm polietilenogliCol. 0 material da composição pode assim, por exemplo, ser uma polilactida (tal como se define mais adiante na presente memória descritiva), por exemplo, como se descreve na Publicação da Patente de Invenção Europeia ITumero 53 431. A libertação de fármacos macromoleculares a partir de polilactidas depende da estrutura do polilactida (isto e, da sua distribuição e do comprimento das unidades de como-nómero em copolímeros de ácido láctico/ácido glicólico), da massa molecular de homopolímeros e copolímeros de ácido lácti co/ácido glicólico e da distribuição de massas molecular ou da polidispersibilidade dos mencionados homopolímeros e copolímeros. Oonsequentemente, as polilactidas preferidas (mas não só essas) sao aquelas que são insolúveis em benzeno e que têm uma viscosidade inerente a 1% em peso/volume em clorofórmio a 25°G superior a 0,09 dl/g, mas inferior a 4 dl/g ou que são solúveis em benzeno e têm uma viscosidade inerente e 1% em peso/volume em clorofórnio maior do que 0,09 dl/g, mas menor do que 0,5 dl/g, mais preferivelmente, menor do que 0,3 dl/g. Uma outra classe de polilactidas preferidas e constitui da por compostos que têm uma massa molecular média em múmero maior do que 2 000 e qúe têm polidispersibilidades controladas de tal maneira que, para massas moleculares médias em nú- - 33 -
mero compreendidas entre 2 000 e 10 000, as polidispersibili-dades estão compreendidas entre 1,2 e 50 e, para massas molecu. lares médias em número compreendidas entre 5 000 e 30 000, as polidispersibilidades estão compreendidas entre 1,4 e 15· A gama de massas moleculares médias em número preferida é de 2 000 a 20 000. As propriedades de viscosidade da solução e a sua determinação e a determinação das massas moleculares são descritas em "Preparative Methods of Polymer Ohemistry", 2â Edição, páginas 43 a 52, por W. R. Sorenson e lod W. Campbell, 1986, Interscience Publishers. Estas várias propriedades dos polímeros determinam os perfis de degradação das polilactidas sozinhas, assim como das composições farmacêuticas neles baseados. Os perfis de degradação incluem a formação de micropo rosidade na polilactida que se degrada, a absorção de água pe la polilactida que se degrada e, finalmente, a erosão e perda de peso da polilactida que se degrada. A este respeito, a difusão da substância fisiologicamente activa através do polím^ ro sozinho é uma função da solubilidade/compatibilidade da substância fisiologicamente activa com o polímero que controla a velocidade, assim como o tamanho das moléculas da substância fisiologicamente activa. Por uma qualquer ou por ambas estas razões, uma substância fisiologicamente activa (tal como se definiu anteriormente na presente memória descritiva) pode não ser capaz de difundir-se através da fase de polímero. Nesta situação, a libertação tem de ocorrer por meio de qualquer outro mecanismo, tal como por exemplo através dos poros aquosos existentes na matriz polimérica. Por consequência, pode ser desejável conceber polímeros que tenham uma absorção contínua de água em função do tempo e esta absorção contínua de água esta associada com a formação de microporos aquosos na matriz que se degrada e que, por fim, origina fragmentos e se corrói.
Embora a Requerente não pretenda ficar ligada por considerações de ordem teórica, tem a opinião.de que a conju-, gação covalente de polipéptido com um polímero solúvel em á- 34 -
gua, particularmente polímeros de polioxietileno, para formar uma substância fisiologicamente activa (como se definiu antes na presente memória descritiva) afecta vantajosamente o limiar de percolação (como se define na presente memória descritiva) de uma, composição farmacêutica de libertação contínua. 0 limi te de percolação é função do nível de incorporação no polímero e da compatibilidade da substância fisiologicamente activa com a matriz de polímero da composição anidra, assim como da natureza e o grau de separação de fases por hidratação da com posição. 0 comprimento da cadeia do polipéptido, a massa mole cular do polímero solúvel em água e o nível de incorporação de polímero solúvel em água são propriedades características que afectam a compatibilidade das substâncias fisiologicamente activas.
Gaso assim se pretenda, as composições farmacêuti cas de libertação contínua de acordo com a presente invenção podem ter um curto período de indução antes de começar a libertação da substância fisiologicamente activa. 0 valor deste período de indução pode variar dependendo da quantidade de substância fisiologicamente activa a ser libertada e do período durante o qual se pretende que ela seja libertada.
As composições farmacêuticas de libertação contínua de acordo com a presente invenção encontram-se, preferivelmente, numa forma diferente de microcápsulas, por exemplo, na forma de micro-esferas em que a substância fisiologicamente activa está dispersa através do polímero até à superfície e incluindo a superfície ou outras formas de micropartículas em que a substância fisiologicamente activa se prolonga até à su perfície.
As composições de libertação contínua de acordo com a presente invenção podem ser colocadas no organismo de um animal (como seres humanos) que se pretende tratar com um polipéptido por, por exemplo, injecção intramuscular ou subcu - 35 -
tânea ou por implantação cirúrgica subdérmica, de acordo com a maneira de proceder clínica ou veterinária convencional. B.l Processo para a Preparação de Composições Farmacêuticas de Libertação Contínua
As composições farmacêuticas de libertação contínua de acordo com a presente invenção podem preparar-se por qualquer processo conveniente. Assim, por exemplo, o material da composição, por exemplo como se definiu acima, pode encontrar-se presente sob a forma de solução num dissolvente orgânico, tal como ácido acético glacial, em que a substância fi-siologicamente activa, como se definiu anteriormente na presente memória descritiva, pode dissolver-se, por exemplo, como se descreve na Patente de Invenção Europeia Eumero 58 481. B.2 Processo Aquoso
As composições farmacêuticas de libertação contínua de acordo com a presente invenção podem também preparar--se, por exemplo, por meio da produção de uma dispersão aquosa de um polímero ou de um copolímero tendo um ou mais grupos de ácido carboxílico terminais, caracterizado pelo facto de o polímero ou o copolímero ter uma massa molecular média em peso igual a pelo menos cerca de 3 000 e se encontrar sob a for ma de um seu sal da amónio ou de metal alcalino e pelo facto de pelo menos 80% em peso de teor de sólidos da dispersão ser capaz de passar através de um filtro bacteriano com 200 m de tamanbo de poros. A produção dessa dispersão aquosa pode efectuar--se misturando uma solução do polímero ou do copolímero num dissolvente orgânico miscível em água e pelo menos uma quanti dade estequiometrica de uma solução de um sal ou de um hidróxi do de amónio ou de um metal alcalino solúvel em água, para formar uma dispersão do correspondente sal de amónio ou de me - 36
tal alcalino do polímero ou do copolímero num dissolvente mi£ to aquoso/orgânico, essencialmente a pH neutro e, em seguida, evaporando o dissolvente orgânico miscível com água para originar uma dispersão aquosa de sal do polímero ou do copolímero, do qual pelo menos 80^ em peso do teor de sólidos e capaz
f r —Q de passar através de um filtro para bactérias com 200 m de dimensões de poros. 0 polímero ou o copolímero utilizado no processo acima referido podem ser escolhidos, por exemplo, de homopolí meros de poli-(ácido D-láctico, 1-láctico e DL-láctico), poli -(D-lactida, L-lactida e DL-lactida), ácido poliglicólico, p£ liglicólidas, poli-E-caprolactona e ácido poli-(hidroxi-butí-rico); copolímeros derivados de dois ou mais monómeros de que derivam estes homopolímeros; copolímeros em bloco enxertados ou ramificados que compreendem um destes homopolímeros e eop£ límeros e um polímero hidrofílico escolhido de poli-(álcool vinílico), poli-(vinil-pirrolidona), poli-(óxido de etileno), poli-(etileno-glicol), poliacrilamida, polimetacrilamida, dex trano, ácido algínico, alginato de sódio, gelatina ou um eopolí mero de dois quaisquer ou vários dos monómeros de que estes derivam.
Os polímeros ou os copolímeros preferidos para u-tilização no processo de acordo com a presente invenção são os homopolímeros de poli-(ácido D-láctico, L-láctico e DL-lᣠtico) e poli-(D-lactida, L-lactida e DL-lactida) e os copolímeros de poli-(ácido D-láctico, L-láctico ou DL-láctico e de ácido glicólico) e poli-(D-lactida, L-lactida ou DL-lactida--co-glicólida).
Um dissolvente miscível com água preferido para utilização neste processo aquoso é acetona, 2-butanona (metil -etil-cetona), dioxano, hexaflúor-isopropanol, tetra-hidrofu-rano, metanol ou etanol e, particularmente, acetona; e um sal ou um hidróxido de amónio ou de metal alcalino solúvel em á- - 37 -
gua preferido I bicarbonato de sódio, de potássio ou de amónio, carbonato de sódio, de potássio ou de amónio ou hidróxido de sódio, de potássio ou de amónio.
Um dissolvente que se pode utilizar como variante neste processo aquoso é um dissolvente imiscível com água, como diclorometano. Um tal dissolvente permite obter como resul tado uma dispersão aquosa de sal de copolímero com um maior ta manho de partículas. A solução do sal ou do hidróxido de amónio ou de metal alcalino solúvel em água pode ser uma solução em água ou uma mistura de uma solução em água e num dissolvente orgânico miscível com água, por exemplo, metanol ou etanol. A evaporação do dissolvente miscível com água rea liza-se preferivelmente sob pressão reduzida e a uma temperatura o mais baixa possível acima da temperatura ambiente.
Se a solução de polímero ou de copolímero num dis solvente orgânico for adicionada à fase aquosa e esta adição se completar antes de se evaporar o dissolvente orgânico, só se obtem elevados rendimentos de partículas capazes de passa- , _q rem através de um filtro de 200 m se a concentração do polx-mero ou do copolímero no dissolvente orgânico não ultrapassar cerca de 1,5% em peso por volume.
Neste processo, a mistura da solução do polímero ou do copolímero num dissolvente orgânico miscível em água com a solução de um sal ou de um hidróxido de amónio ou de me tal alcalino solúvel em água realiza-se, preferivelmente, sob agitação de elevado corte, por exemplo, com um homogeneizador Ystral capaz de proporcionar agitação com até cerca de 25 000 rotações por minuto, ou num aparelho semelhante.
Preferivelmente, proteínas solubilizantes, tais - 38 -
Λ como por exemplo soro de feto de vitela (EGS) e albumina de soro humana (I-íSA), estão ausentes da composição farmacêutica.
Na preparação das composições farmacêuticas de a-cordo com a presente invenção, os parâmetros preferidos de uma dada composição podem ser determinados por aproximações sucejs sivas com base na discussão pormenorizada acima referida como directiva. Gom respeito a certos polipéptidos, tais como in-terleucina-2 (11-2), hormona de crescimento humana (HG-H) e in terferão alfag (iPNalfa^), um parâmetro que pode ser alterado com vantagem para se obter o perfil de libertação pretendido e a carga de proteína da composição que, no caso de IIr-2, HG-H e I]?Ialfa2, estará normalmente compreendida entre 5 e 20% em peso, preferivelmente entre 10 e 13% em peso e, especialmente, entre 12,5 e 16% em peso.
Deve realçar-se o facto de que os investigadores com os polímeros solúveis em água, tal como polietileno-gli-col, verificaram ate agora ser necessário restringir a propor ção de modificação do polipéptido pretendido se se pretender conservar uma elevada actividade fisiológica. Assim, a conjugação de um excesso de um polímero solúvel em água, com um p£ lipéptido fisiologicamente activo teve como resultado até ag£ ra a substancial redução da actividade fisiológica ou a sua perda completa. A necessidade de restringir a extensão da modificação do polipéptido tem como resultado o aumento da distribuição heterogénea de um dado número de moléculas de polímero solúveis em água em volta de certo número, normalmente um grande número, de sítios de modificação potenciais. Este elevado grau de heterogeneidade pode ter um pequeno efeito so bre certos parâmetros como a solubilidade e a vida média mas podem ser inconvenientes para a libertação controlada e completa a partir de uma composição farmacêutica de libertação contínua, visto que uma população heterogénea de isómeros pode fazer diminuir a consistência e o completamento da liberta • ção da composição. Surpreendentemente, a Requerente verificou - 59 -
que os derivados de G-CSF do Pedido de Patente de Invenção Eu ropeia número 91303868.3, depositado pela Requerente, e, esp_e cialmente, (Arg"^*, Ser'^,2^,^,^) G-OSF (com ou sem sequência previa de metionina, mas convenientemente com essa sequên cia prévia de metionina), pode ser submetida a modificação e-xaustiva com um polímero solúvel em água tal como se descreveu acima, especialmente um polietileno-glicol (PEG), tal como monometil-polietileno-glicol (mPEG), enquanto retém pelo menos uma das propriedades biológicas do G-GSF de ocorrência natural em grau significativo. Assim, por exemplo, os derivados de G-OSF pegilados que foram ensaiados verificou-se que retêm a actividade de G-OSF da G-OSF de ocorrência natural dentro de um factor de cerca de 2 in vitro. Na realidade, as curvas de respostas à dose obtidas com base em estudos in vivo com (Arg^, G-CSF pegilado mostram uma actividade que é igual a cerca do dobro da actividade da G-OSF natural. Essa modificação exaustiva tem como resultado uma população substancialmente menos heterogénea de isémeros que, numa composição farmacêutica de libertação contínua, aumenta substancialmente a consistência e o completamento da libertação a par tir dessa composição.
Assim, a substancia fisiologicamente activa mais preferida para utilização na composição de acordo com a presente invenção é o (Arg^, Ser^^^^J-G-CSF humano pegilado, em que se encontra ou presente ou ausente uma sequência prévia de metionina, mas está convenientemente presente, no a grupamento de G-OSF e em que cada agrupamento de polietileno--glicol (PEG) tem uma massa molecular compreendida entre 2 000 e 5 000 Da, sendo a pnporção de agrupamentos de G-GSF para a-grupamentos de PEG compreendida entre 1 : 3 e 1 :4, especialmente, igual a cerca de 1 : 3,9. 0. Glossário de lermos
Para ajudar o leitor, indica-se o seguinte glossá - 40 -
rio de termos utilizados na presente memória descritiva. A expressão "ambiente aquoso de tipo fisiológico" significa o organismo, particularmente a musculatura ou os te eidos subcutâneos ou o sistema circulatório de animais de san gue quente, muito embora, nas investigações de laboratório, es se ambiente possa ser imitado por líquidos aquosos, opcionalmente tamponizados a um pH fisiológico, a uma temperatura com preendida entre cerca de 35 e 40°0, A expressão "libertação contínua” e utilizada na presente memória descritiva simplesmente para definir um perfil de libertação essencialmente monofásico, muito embora po£ sa ter um ponto de inflexão, mas certamente não tem fase ”em patamar", quando se representa graficamente a libertação acumulada da substância fisiologicamente activa em função do tem po. 0 termo "monofásico" tal como é utilizado na presente memória descritiva, significa a libertação contínua durante um intervalo de tempo durante o qual pode existir um ponto de inflexão, mas certamente não existe uma fase em pata mar, quando se representa graficamente a libertação acumulada da substância fisiologicamente activa em função do tempo. 0 termo "polilactida" ó utilizado em sentido gené tico de modo a incluir polímeros de ácido láctico sozinhos, copolímeros de ácido láctico e de ácido glicólico, misturas desses polímeros, mistura.s desses copolímeros e misturas desses polímeros e desses copolímeros, encontramdo-se o ácido láctico ou na forma racómica ou numa forma opticamente acti-va. À expressão "estável em meio ácido" significa que a substância fisiologicamente activa I estável sob as condições que se encontram dentro da formulação reivindicada duran - 41 -
te o período de utilização previsto. 0 pH dentro da formulação reivindicada varia, mas geralmente não é maior do que 3 e normalmente não é menor do que 2. Estes valores de pH representam normalmente extremos e o pH dentro de uma dada formula ção nunca será menor do que 2,5 ou 3· A temperatura relevante é normalmente a temperatura do organismo do mamífero, geralmente inferior a cerca de 40°G. 0 período de utilização previs to pode variar desde, por exemplo, uma semana até seis meses. 0 termo "polidispersibilidade" é definid como o quociente Mw/fên, em que o símbolo Kw representa a massa molecular média em peso e o símbolo Mn representa a massa molecular média em número. A determinação absoluta da massa molecular média em número pode realizar-se por análise dos grupos terminais ou por osmometria de pressão de vapor. A determinação das massas moleculares médias em número e em peso, bem as sim como da polidispersibilidade, pode também fazer-se por cromatografia de exclusão de tamanhos em relação aos padrões de polistireno. A expressão "limiar de percolação" é utilizada na presente memória descritiva para definir o estado que se atin ge quando um fármaco aquoso (substância fisiologicamente acti va tal como se definiu anteriormente na presente memória descritiva) atinge a continuidade com o ambiente externo e com outros domínios de fármaco aquoso (substância fisiologicamen te activa tal como se definiu anteriormente na presente memória descritiva) dentro da composição farmacêutica de libertação contínua de acordo com a presente invenção. A expressão "G-GSP de ocorrência natural", tal co mo é utilizada na presente memória descritiva, refere-se a G~ -031' que foram encontrados na Hatureza e que incluem os dois polipéptidos que têm as sequências de aminoácidos indicadas em SEQ ID H2 32 (tal como se define mais adiante na presente memória descritiva). Estes dois polipéptidos diferem apenas - 42 -
na medida em que se encontra presente um inserto constituído pelo tripéptido Val-Ser-G-lu num polipéptido entre as posições 35 e 36, mas está ausente no outro. 0 sistema de numeração u-tilizado ao longo de toda a presente memória descritiva baseia-se no polipéptido de ocorrência natural sem o inserto de Yal-Ser-G-lu e o termo "natural", tal como ó usado na presente memória descritiva, também se refere a esse polipéptido sem o inserto de Val-Ser-G-lu. Gompreende-se que as modificações de_s critas na presente memória descritiva sao aplicáveis a todas as formas de G-CSP que ocorrem naturalmente e os seus análogos, como se descreveu acima e que possa ser necessário reali zar a consequente revisão dos números das posições do polipéjD tido dependendo da forma da G-GSP de ocorrência natural escolhido para modificação. A expressão "que tem pelo menos uma das proprieda des biológicas da G--0SP de ocorrência natural", tal como é a-plicada a um polipéptido, significa que o polipéptido é aeti-vo em pelo menos um dos ensaios biológicos pormenorizados na Publicação da Patente de Invenção PGT da Organização Mundial da Propriedade Industrial Numero ¥0 87/01132. A expressão "estabilidade de solução" significa a tendência diminuída de uma substancia para precipitar a partir duma solução sob as condições fisiológicas de pH, temperatura e força iónica. A propriedade da estabilidade de solução é as sim diferente da de solubilidade.
Breve Descrição dos Desenhos A Pigura 1 representa a sequência de nucleótidos do fragmento de 167 pb referido no Exemplo de Referência 5. A Pigura 2 representa a sequência de aminoácidos e a correspondente sequência de nucleótidos do G-GSP humano (hu) natural e os sítios de restrição. - 43 -
A Figura 3 representa a sequência de aminoácidos e a correspondente sequência de nucleótidos do G-CSF (Ser^* 27 r ~ ') hu e os sítios de restrição. A Figura 4 representa a sequência de nucleótidos do terminador de transcrição 54 que tem a) sítios de restrição terminais Sall e HindIII; e b) sítios de restrição terminais Sall e Styl; A Figura 5 representa um mapo de restrição de pTB357 (também designado na presente memória descritiva como pl£004). A Figura 6 representa a sequência de nucleótidos do fragmento EcoRI-SalI referido no Exemplo de Referência 6 (b), mas omitindo a sequência do gene do interferão alfa^. A Figura 7 representa um mapa de restrição de pEB015 (também designado na presente memória descritiva como pIOIOOSG). A Figura 8 representa um mapa de restrição de pIGI 1079. A Figura 9 representa um mapa de restrição de pIOI 54 (também designado na presente memória, descritiva como pOG-54)» A Figura 10 representa um mapa de restrição de pOG-61. A Figura 11 representa um mapa de restrição de pICI1107, em que a área tracejada representa a sequência do gene que codifica (Ser^*^) G-OSF hu. A Figura 12 representa um mapa de restrição de - 44 - 4
pGG-300 (também designado na presente memória descritiva como pICI 1295). A Figura 13 representa a libertação de PEG 5000 (Liet”\ Ser^,^^) G-CSF hu a partir de um copolímero contendo 50% de d,l-laetida/50% de glicólida a partir das composições farmacêuticas A e B (vejam-se os Exemplos 4 e 5), tendo ambas as oomposições sido preparadas por um processo de ácido acéti co glacial. A Figura 14- representa, a libertação de (Met \ Ser1^*2^) G-08F bu não complexado com polietilenoglicol (não pegilada) a partir das composições farmacêuticas 0 e D de libertação contínua a partir do copolímero constituído por 50% de d,l-lactida/50% de glicólida (vejam-se os Exemplos Gompara tivos 1 e 2), em que a composição G compreende Met” , Ser ' * 2^) G-CSF hu não pegilado sozinho e a composição D compreende uma mistura de (Met” , Ser * ') G-GSF hu não pegilado e complexado com metil-PEG 5000, sendo ambas as composições preparadas por um processo com ácido acético glacial. A Figura 15 representa a libertação acumulada de PEG 5000 (Met"^, Ser"^*2^) G-CSF hu a partir de duas composições farmacêuticas diferentes de libertação contínua G e H do copolímero contendo 50% de d,l-lactida/50% de glicólida (veja -se o Exemplo 24), sendo essas composições preparadas por um processo por via a.quosa. A Figura. 16 representa a liberta.ção acumulada de (Met” , Ser'* ) G-GSF hu a partir de uma composição farmacêutica de libertação contínua de copolímeros contendo 50% de d,l-lactida/50% de glicólida contendo (Met”1, Ser1^,2^) G-CSF hu apenas (veja-se o Exemplo Comparativo 3) e de uma composição farmacêutica de libertação contínua a base de copolímero contendo 50% de d,l-lactida/50% glicólida contendo uma mistu-• ra de (Met~\ Ser 2^) G-GSF hu e de metil-PEG 5000 (veja-se - 45 -
o Exemplo Comparativo 4), tendo ambas as composições sido pre paradas por um processo aquoso. A Figura 17 representa a libertação acumulada de PEG 5000 (Ket"1, Glu15, Ser17,27, Ala26,28, Lys50) G-CSF hu a partir das composições farmacêuticas de libertação contínua E à base de copolímero constituído por 50% de d,l-lactida/50% de "glicolida (veja-se o Exemplo 3), K (veja-se o Exemplo 25) e íi (veja-se o Exemplo Comparativo 5), tendo sido a composição E preparada pelo processo do ácido acético glacial e as composições K e M preparadas por um processo aquoso, A Figura 18 representa a libertação acumulativa de PEG 5000 (Met”1, Arg11, Ser17*27»60»65) G-CSF hu a partir de composições farmacêuticas de libertação contínua F à base de copolímero de 50% de d,l-3-acJtida/50% de glicolida (veja-se o Exemplo 4), L (veja-se o Exemplo 26) e N (veja-se o Exemplo Comparativo 6), sendo a composição F preparada pelo processo do ácido acético glacial e as composições L e N preparadas por um processo aquoso.
Os seguintes produtos são referidos na presente memória descritiva nos Exemplos de Referência e nos Exemplos e a sua constituição é a seguinte. TAMPÕES PARA ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Estabilidade: estável a -20°C. Composição do Tampão:
- 46 -
Componentes do Tampão Concentração final em milimoles/ /litro (conjunto do tampão diluído 1:10)
A B 1 M H
Tris acetato 33 Tris-IíCl - 10 10 10 50 Mg-acetato 10 - - - - i-igClg - 5 10 10 10 K-acetato 66 - - - - NaCl - 100 - 50 100 Ditioeritritol (DTE) - - 1 1 1 Ditiotreitol (DTT) 0.5 - - - - 2-Mercaptoetanol - 1 - - — pH a 37°C 7,9 8,0 7,5 7,5 7,5
Os tampões acima mencionados podem ser adquiridos na firma Boehringer Manniieim.
Na maneira de proceder de mutagénese dirigida para o sítio - Exemplo de Referencia 4, usam-se
Tampão 1 100 mM Tris HG1 pH 3,0 100 mM NaCl 20 ml-í í-ígCl2
Tampão 2 10 mM Tris HC1 pH 3,0
20 mM NaCl 1 mM EDTA
Tampão 3 12 mM Tris HC1 pH 7,7 30 mM NaCl 10 mM MgCl2 8 mM 2-mercapto-etanol - 47 -
Tampao 4 60 mM Sr is HC1 pH 3,0 90 mM NaCl 6 m.; ;:gci2
10 mM DST
Mistura de nucleótidosϊ 1 : 250 micromolar de cada um dos pro dutos dATP, dG-TP, dCTP=S (derivado de fosfotioato de dCTP), dlTP e 1 mM de ATP.
Mistura de nucleótidos 2 : 250 micromolar de cada um dos pro dutos dATP, dGTP, dTSP e 350 micromolar de á'IP.
Greneclean (TM) 0 estojo contém : 1) iodeto de sódio 6 molar; 2) uma solução concentrada de cloreto de sódio, Tris e BDTA, para preparar uma solução de lavagem contendo cloreto de sódio/ /etanol/agua; 3) &lassmilkv 1 - uma embalagem de 1,5 ml contendo 1,25 ml de uma suspensão de matriz de sílica em água.
Esta é uma técnica para purificação de ADN baseada no método de Vogelstein e G-illespie, publicado em Procee-dings of the National Academy of Sciences USA (1979)» Yolume 76, página 615.
Gomo variante, pode usar-se ^^m qualquer dos métodos descritos em "Molecular Cloning - a laboratory manual", 2§ Edição, Sambrook, Eritsch e Maniatis (Qold Spring Harbor laboratory, 1989).
Estojo de Marcação Aleatória (produto de Pharmacia NQ 27-9250)
Esta maneira de proceder eneontra-se descrita em "Molecular Cloning - a laboratory Manual", 2^ Edição, Sam- - 48 -
brook, Iritsch e Maniatis, páginas 10,13 - 10.17 (publicado por Gold Spring Harbor laboratiry, 1989).
Sequenase^^ T7 ADN polimerase modificada quimicamente, baseada na. maneira de proceder de labor e Richardson, publicada em "Proceedings of the National Academy of Sciences USA (1987), volume 84, páginas 4767 - 4771.
G-eles de Ultrogel AcA
Uma matriz mista de poliacrilamida e de agarose, que proporciona a elevada resolução da poliacrilamida e a rigidez da agarose numa associaçao sinergica dos dois componentes. 0 gel Ultrogel AcA 54 contem 5% de poliacrilamida e 4% de agarose.
Aeio Mínimo M9
Cloreto de amónio 1 g
Hidrogeno-ortofosfato de dis-sádio 6 g
Di-hidrogeno-ortofosfato de potássio 3 g
Cloreto de sódio 0,5 g
Agua destilada até perfazer 1 litro
Suplementos/75 ml 300 μΐ 50% de glucose 75 μΐ 1Μ de MgSO^ 75 μΐ 0,1M de CaCl2 75 μΐ 4mg/ml de tiamina 75 μΐ 20% de aminoácidos de caseína - 49 -
Solução de Elementos Vestigiais (TES) A TES tem a seguinte composição; A101„6Ho0 3 2 0,1 mg 1—1 1 H 100 μδ I-1 CoCl2 6H20 0,04mg r1 40 μδ 1-1 KCr(S0^)212H20 0,01mg r1 10 μδ I-1 CuCl2 2H20 0,01mg r1 10 μδ I-1 ELB0„ 3 3 0,005mg r1 5 μδ 1-1 Kl 0,1 mg l-1 100 μδ I-1 MnSO^HgO 0,1 mg r1 100 μδ ι"1 HiSO^ 6H20 0,0045ng r1 4.5 μδ I-1 HagMoO^HgO 0,02 mg l”1 20 μδ I-1 ZnS047H20 0,02 mg r1 20 μδ I-1 e é adicionada a meios de desenvolvimento na proporção de 0,5 ml/litro. T4 ADF ligase
Descrita em "Molecular Gloning - a Laboratory ila-nual", 2^ Edição, Sambrook, íritsch e Maniatis, páginas 5.60-- 5.64 (publicado por Cold Spring Harbor laboratory, 1939} ® também por 3. Weiss e col. em J. 3iol. Gbem., Volume 243, Pagina 4543 (1968).
Solução Salina Tanrponizada. com Eosfatos QXOID A solução salina tamponizada com fosfatos OZCID, tal como é utilizada na presente memória descritiva, é conseguida por comprimidos de Dulbocco "A", que tem a seguinte for mula:
Oloreto de sódio 8,0 gramas por litro • Cloreto de potássio 0,2 grama por litro 50 -
Hidrogeno fosfato dissódio 1,15 gramas por litro
Di-hidrogeno-fosfato de potássio 0,2 grama por litro. pH 7,3.
Dissolvem-se dez comprimidos em 1 litro de água destilada e aquece-se em autoclave durante dez minutos a 115 C, para se obter uma solução isenta de matéria insolúvel. A solução acima referida corresponde à formulação original de Dulbecco e Yogt (1954), J. Exp. lied. 99(2), 167 -- 132, com a excepção de se ter omitido cálcio e magnésio.
Todas as sequências de nucleótidos referidas na presente memória descritiva são especificadas no sentido convencional 5 * - 3f.
Os derivados da presente invenção baseiam-se em G-CSE humano, que é também designado como hu G-OSF.
Como os derivstlos preparados nos Exemplos são todos preparados utilizando E. coli, está geralmente presente u-ma pré-sequência de metionina. A expressão ,,l\T-lau3ΠLl-sarcosina,,, tal como se uti liza na presente memória descritiva, refere-se à utilização da mencionada substância sob a forma de sal. Assim, nos Exemplos, lí-lauroil-sarcosina é usada sob a forma de sal de sódio. 0 monometil-polietileno-glicol 5000 é também desig nado na presente memória descritiva como metil-polietileno-gli col 5000 e é designado em certos catálogos de produtos químicos de investigação como metoxi-polietileno-glicol 5000.
Os seguintes Exemplos não limitativos são apresen tados apenas a título de ilustração. - 51 -
EXEMPLOS
Exemplo 1
Composição farmacêutica de libertação contínua contendo PEG· 5000-(Mét~ , Ser) &-GSF hu
Processo do ácido acético glacial
Formulação A (proteína com uma carga igual a 20%)
Dissolveram-se 27,7 miligramas de polilactida (c£ polímero constituído por 50% em peso de d,l-lactida/50% em pe so de glicolida, massa molecular média em peso 7673, polidis- persibilidade 2,59) em 0,1 ml de ácido acético glacial. Liofi ~ —1 Í7 lizou-se 1 ml de uma solução aquosa de PEG· 5000-(Met” , Ser ' * ) Gr-CSF hu (9 mg/ml) (proveniente do Exemplo de Referencia 3) e, em seguida, dissolveu-se numa posterior amostra de 1 ml de ácido acético glacial. Misturaram-se as duas soluções e u-saram-se mais 2 x partes alíquotas de 0,5 ml de ácido acético glacial para lavar o material de vidro. Congelou-se imediatamente a solução num banho de diclorometano/gelo seco e liofi-lizou-se durante a noite. Misturou-se o pé liofilizado cuida.-dosamente usando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a S5°C e depois moldou-se a esta temperatura para se obter uma amostra com a espessura de 1 milímetro. Cortou-se a amostra em pedaços pesando aproximadamente 10 mg. Colocaram-se então os pedaços em frascos de plástico contendo 2 ml de solução sa lina tamponizada com fosfato OXOID e 0,02% de azida de sódio e guardou-se a 37°0. Em intervalos regulares de tempo, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. Deter minou-se a libertação de PEG- 5000-(Met”^, Ser^>2-1) &_08;ρ hu por análise de HPLC do meio e calculou-se a libertação de pr£ teína acumulada (veja-se a Figura 15).
Exemplo 2
Composição farmacêutica de libertação contínua contendo PEG 5000-(Met"1, Ser17,27) G-CSF hu _ 52 -
Processo do ácido acético glacial Formulação B (carga de 15,36% de proteína)
Dissolveram-se 155,43 mg de polilactida (copolime ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli da, massa molecular média em peso 7791,2, polidispersibilida-de 2,65) em 2,0 ml de ácido acético glacial. liofilizaram-se 3,79 ml de uma solução aquosa de PEG· 5000-(Met”^, Ser^*^) G-CSF hu (10,56 mg/ml) (proveniente do Exemplo de Referencia 3) (peso após a liofilização : 104,94 mg) e, em seguida, dissolveu-se num volume posterior de 2,0 ml de ácido acético gla ciai. Histuraram-se as duas soluções e usaram-se 4 alíquotas x 0,5 ml de ácido acético glacial para lavar o equipamento de vidro. Diofilizou-se imediatamente a solução em banho de di-clorometano/gelo seco e secou^se por liofilização durante a noite. Misturou-se o pó seco por liofilização cuidadosamente usando uma prensa hidráulica com as placas aquecidas a 70°C e, em seguida, moldou-se a esta temperatura para se obter uma chapa com 1 mm de espessura. Gortou-se a chapa em pedaços com o peso aproximado de 70 mg. Golocaram-se então os depósitos em frascos de embalagem de plástico contendo 2 ml de solução salina tamponizada com fosfato 0I0ID e 0,02% de azida de sódio e armazenou-se a 37°C. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG· 50C0-(Met”\ Ser^*^) G-CSF hu por análise de HP10 do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína (veja-se Figura 13).
Exemplo Comparativo 1
Composição farmacêutica de libertação contínua contendo apenas (Met**1. Ser17,27) G-OSF hu
Processo do ίο ido Acético Glacial
Formulação C (carga, de 20% de proteína)
Dissolveram-se 160,73 mg de polilactida (copolíme - 53 -
ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli-da, massa molecular média em peso 7673, polidispersibilidade 2.59) em 2,0 ml de ácido acético glacial, liofilizaram-se 4,088 ml de uma solução aquosa de (Met”\ Ser17*27) G--GSF hu (10,0 mg/ml) e, em seguida, dissolveu-se em mais um volume de 2,0 ml de ácido acético glacial. Misturaram-se as duas soluções e utilizaram-se mais 2 volumes x 0,5 ml de ácido acético glacial para lavar o equipamento de vidro. Oongelou-se imedia tamente a solução em banho de diclorometano/gelo seco e liofi lizou-se durante a noite. Misturou-se cuidadosamente o pé lio filizado usando uma prensa hidráulica com as placas aquecidas a 95°0 e, em seguida, moldou-se a esta temperatura para se ob ter uma chapa com 1 milímetro de espessura. Oortou-se a chapa em troços com o peso aproximado de 74 mg. Os troços foram em seguida colocados em embalagens de plástico contendo 2 ml de solução salina tamponizada com fosfato OXOID e 0,02$ de azida de sédio e armazenou-se a 37°C. Em intervalos de tempo regula res, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fres^ co. Determinou-se a libertação de (ϊ-íet , Ser * ) G—OSP hu por analise de HPLO do meio e calculou-se a libertação cumula tiva da proteína (veja-se a Figura 14).
Exemplo Comparativo 2
Composição farmacêutica de libertação contínua contendo (Met ^ Ser17»27) G-CSF hu e metil-PEG· 5000
Processo do Ácido Acético G-laoial
Formulação D (proteína com a carga de 20%)
Dissolveram-se 120,66 mg de polilactida (copolíme ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli da, massa molecular média em peso 7673, polidispersibilidade 2.59) em 2,0 ml de ácido acético glacial, liofilizaram-se 3,935 ml de uma solução aquosa, de (Met , Ser * ') G-CSF hu (10,0 mg/ml) e, em seguida, dissolveu-se em 2,0 ml de uma solução que contém 40,82 mg de metil-PEG- 5000 em ácido acético - 54 -
glacial, Histuraram-se as duas soluçoes e usaram-se mais 2 partes alíquotas de 0,5 ml de ácido acético glacial para lavar o equipamento de vidro. Gongelou-se imediatamente a solução em banho de diclormetano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite, liisturou-se cuidadosamente o pá liofilizado usando uma prensa hidráulica com as placas aquecidas a 95°G e depois mol dou-se a esta temperatura para se obter uma chapa com 1 mm de espessura. Gortou-se a chapa em troços com o peso aproximado de 74 mg. Os troços foram então colocados em embalagens de plástico contendo 2 ml de solução salina tamponizada com fos-fato OXGID e 0,02<% de azida de sodio e armazenou-se a 37 0.
Sm intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituiu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de (líet"*1, Ser1^*2^) G-CSE hu por análise de HPLG do meio e calculou-se a libertação acumulada, de proteína (veja-se a figura 14).
Sxemplo 5
Composição farmacêutica de libertação contínua contendo PEG 5000-(Het"1. Glu13, Ser17*27. Ala26*28. Lys3°) G-GSE hu
Processo do Xcido Acético Glacial formulação B (proteína com a carga de 20'%)
Dissolveram-se 120,54ng de polilactida (copolíme-ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli da, massa molecular média em peso 7673, polidispersibilidade 2,59) em 2,0 ml de ácido acético glacial. Liofilizaram-se 3,738 ml de uma solução aquosa de PEG 5000-(met”^, Glu^, Ser'^’2^, ála2^*2®, Lys^) G-GSE hu (10,7 mg/ml) (proveniente do Exemplo de Referência 8) e, em seguida, dissolveu-se em mais 2,0 ml de volume de ácido acético glacial, iíisturaram-se as duas soluções e usaram-se mais 2 x alíquotas de 0,5 ml de ácido acético glacial para lavar o equipamento de vidro. A s£ lução foi congelada imediatamente em banho de diclorometano/ /gelo seco e liofilizou-se durante a noite, kisturou-se cuida 55 -
dosamente o po seco liofilizado usando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 85°C e, em seguida, moldou-se a essa tsr peratura para se obter uma placa com a espessura de 1 milímetro. Cortou-se a placa em troços com o peso aproximado de 70 mg. Colocaram-se depois os troços em embalagens de plástico contendo 2 ml de solução salina tamponizada com fosfato OXOID e 0,02<j,o de azida de sódio e armazenou-se a 37°C. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituiu -se por tampão seco. De terminou-se a libertação de PEG· 5000--(r!et , Grlu , Ser * , nla » , Lys ) G~'JoF nu por anali se de I1PIC do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína (veja-se a Figura 17).
Exemplo 4
Composição farmacêutica de libertação contínua contendo PEG-5 OOO-Giet"1. Arg11, Ser17 »27» 3° >65) G-CSF hu
Processo do Ácido Acético Glacial
Formulação F (Proteína com 20% de carga de polipeptido)
Dissolveram-se 120,40 mg de polilactida (copolíme ro contendo $0% em peso de d,l-lactida/50Já em peso de glicoli da, massa molecular média em peso 7673, polidispersibilidade 2,59) em 2 ml de ácido acético glacial. Liofilizaram-se 3,473 ml de uma solução aquosa de PEG· 5000-(Met-1, Arg11, Ser^*^* 60,65^ q_osp hu (11,5 mg/ml) (proveniente do Exemplo de Referência 7) e, em seguida, dissolveu-se em um volume adicional de 2 ml de ácido acético glacial. Misturaram-se as duas soluções e usaram-se mais 2 x alíquotas de 0,5 ml de ácido acético glacial para lavar 0 equipamento de vidro. Congelou-se ime diatamente a solução em banho de diclorometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuidadosamente 0 pó liofilizado usando uma prensa hidráulica com as placas a-quecidas a 85°C e, em seguida, moldou-se a esta temperatura para se obter uma chapa com 1 mm de espessura. Cortou-se a chapa em troços com o peso aproximado de 72 mg. Colocaram-se - 56 -
então os troços em embalagens de plástico contendo 2 ml de so lução salina tamponizada com fosfato QXOID e 0,02%' de azida de sódio e guardou-se a 37°C. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fres co. Determinou-se a libertação de PEG 5000-(Met , Arg , Ser'^,^,f^,^) G- CSP hu por análise de HP1C do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína (vega-se a Figura 18).
Exemplo 5
Composição farmacêutica de libertação contínua contendo PEG--5000 (Met”1) G-CSF hu A. Processo do Ácido Acético Glacial
Dissolveram-se 120,11 mg de polilactida (copolime ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicosi da, massa molecular média em peso 9429, polidispersibilidade 2,02) em 20 ml de ácido acético glacial isento de anidrido. Liofilizaram-se 3»733 ml de uma solução aquosa de PEG 5000--(Met-1) G-CSF (10,7 mg/ml) e, em seguida, dissolveu-se em mais 2,0 ml de ácido acético glacial. Misturaram-se as duas soluções e utilizaram-se mais 4 x alíquotas de 0,5 ml de ácido acético glacial para lavar o equipamento de vidro. Congelou-se a solução imediatamente em banho de diclorometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuidadosamente o pó liofilizado utilizando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 65°C e depois moldou-se para se obter uma placa com 1 mm de espessura,. Cortou-se a placa em troços com o peso aproximado de 70 mg. Colocaram-se então os troços em embalagens de plástico contendo 2,0 ml de solução a 0,02% em peso/volume de azida de sódio em solução salina tamponizada com fosfato OXOID e armazenou-se a 37°C. Em intervalos de tem po regulares, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG-5000 (Met”'1') G-CSF por análise de HPLO do meio e calculou-se a libertação - 57 -
cumulativa de proteína (veja-se a Tabela 1 mais adiante na presente memória descritiva). B. Processo Aquoso
Dissolveram-se 4,0 gramas de polilactida (copolí-mero contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glico lida, massa molecular media em peso igual a 9429, polidisper-sibilidade 2,02) em 16,0 ml de diclorometano e colocaram-se num misturador de elevada taxa de corte (homogeneizador Xs-tral 1500). A esta solução adicionaram-se gota a gota 4 ml de solução aquosa de bicarbonato de sódio (20 mg/ml). Adicionaram -se mais 40 ml de água destilada e formou-se uma fina dispersão branca. Eliminou-se então o diclorometano usando um evap£ rador rotativo. Gongelou-se imediatamente a dispersão em banho de diclorometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Guardou-se depois este sal de sódio do polímero, sob vácuo à temperatura, ambiente antes da sua utilização. Dispersaram-se 120,37 mg do sal de sódio do polímero em 2 ml de água destilada. Liofilizaram-se 5,733 ml de uma solução aquosa de PEG- 5000-(í'Iet~^) G-CSE hu (10,7 mg/ml) e, em seguida, dissolveu-se em mais 2,0 ml de água destilada. Adicionou-se a solução à suspensão e misturou-se. Utilizaram-se mais 4 x alíquo-tas de 0,5 ml de água destilada para lavar o equipamento de vidro. Gongelou-se a solução imediatamente em banho de diclo-rometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou--se cuidadosamente o pó liofilizado usando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 65°0 e depois moldou-se para se ob ter uma chapa com a espessura de 1 milímetro. Gortou-se a cha pa em troços com o peso aproximado de 30 mg. Oolocaram-se em seguida os troços em embalagens de plástico contendo 2,0 ml de uma solução a 0,02% em peso/volume de azida de sódio em so luçao salina tamponizada com fosfato QXOID e armazenou-se a 37°0. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio a-quoso e substituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a li-. bertação de PEG· 5000-(Met-^) G-CSB hu por análise de HPLG do - 53 -
meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína (veja--se a Tabela 1 mais adiante na presente memória descritiva).
Exemplo 6
Composição farmacêutica de libertação contínua contendo PEG--5OOO~'0:et“1, Ser3'7) G-OSP hu 1. Processo do Ácido Acético Glacial
Dissolveram-se 119,75 mg de polilactida (copolímero contendo 50% em peso de d,l-lactida/50?o em peso de glicolida, massa molecular média em peso igual a 9429, polidispersibilida de 2,02) em 20 ml de ácido acético glacial isento de anidrido. Liofilizaram-se 4,95 ml de uma solução aquosa de PSG-50C0 (í-:et”\ Ser^) C-CSí? hu (8,0-S mg/ml) (veja-se o Exemplo de Re ferencia 13) e, em seguida, dissolveu-se em mais 2,0 ml de á-cido acético glacial, '“isturaram-se as duas soluções e utilizaram-se roais 4 x alíquotas de 0,5 ml de ácido acético glacial para lavar o equipamento de vidro. Congelou-se de imedia to a solução num banho de diclorometano/gelo seco e liofili-zou-se durante a noite, fíisturou-se cuidadosamente o pó obtido por liofilização usando uma prensa hidráulica com placas a quecidas a 65°C e depois moldou-se para se obter uma chapa com a espessura de 1 mm. Oortou-se a chapa em troços com o p£ so aproximado de 70 mg. Colocaram-se então os troços em embalagens de plástico contendo 2,0 ml de solução 0,02>í em peso/ /volume de azida de sódio em solução salina tamponizada com fosfato ΟΣΟΙΰ e guardou-se a 37°0. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituiu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG-500Q (Met-^, Ser^) G-CSP hu por análise de HPLC do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína (veja-se a Tabela 1 mais adiante na presente memória descritiva). B. Processo Aquoso
Dissolveram-se 4 gramas de polilactida (copolíme- - 59 -
ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli da, massa molecular média em peso 9429, polidispersibilidade 2,02) em 16,0 ml de diclorometano e tratou-se sob condições de uma elevada taxa de corte (homogeneizador ístral 1500). A este, adicionaram-se gota a gota 4 ml de solução aquosa de bi carbonato de sódio (20 mg/ml). Adicionaram-se mais 40 ml de agua destilada e formou-se uma dispersão branca fina. Elimi-nou-se então o diclorometano usando um evaporador rotativo. 0 Congelou-se infediatamente a dispersão em banho de diclorometa no/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Subsequentemente, armazenou-se o sal de sódio do polímero sob vácuo à tempe ratura ambiente antes da sua utilização.
Dispersaram-se 120,80 mg de sal de sódio do polímero em 2,0 ml de água destilada. Liofilizaram-se 4,95 ml de uma solução aquosa de PEG- 5000 (aet"1, Ser1^) G-CSP hu (8,08 mg/ml) e, em seguida, dissolveram-se em mais 2,0 ml de água destilada. Adicionou-se a solução à suspensão e misturou-se. Utilizaram-se mais 4 x alíquotas dé 0,5 ml de água destilada para lavar o equipamento de vidro. A solução foi imediatamen-te congelada em banho de diclorometano/gelo seco e liofiliza-da durante a noite. Misturou-se cuidadosamente o pó seco por liofilização usando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 65°0 e, em seguida, moldou-se para se obter uma chapa com 1 milímetro de espessura. Cortou-se a chapa em troços com o peso aproximado de 80 mg. Colocaram-se então os troços em embalagens de plástico contendo 2,0 ml de solução de azida de sódio contendo 0,02% em peso/volume em solução salina tamponi zada com fosfato OXOID e foram guardados a 37°C. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituiu -se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG· 5000-(l-íet” , Ser ' ) G-CSE hu por análise de HPEC do meio e calculou-se a libertação acumulada de proteína (veja-se a labela 1 mais adiante na presente memória descritiva). 60 -
Exemplo 7
Composição farmacêutica de libertação contínua contendo PEG-- γαλλ" /- ,-r Ϊ 11,16 õ "17 »27» 60,65 \ -u -5000 Uet . Arg * , Ser 1,11 * J) Gr-CSE hu A. Processo do Ácido Acético G-lacial
Dissolveram-se 120,72 mg de polilaetida (copolíme ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli da, massa molecular media em peso 9429, polidispersibilidade 2,02) em 2,0 ml de ácido acético glacial isento de anidrido, Liofilizaram-se 5,47 ml de uma solução aquosa de PEG-5000 (i-íet”1, Arg11’16, Ser17’27,60’65) G-CSP hu (11,53 mg/ml) (veja-se 0 Exemplo de Referencia 19) e, em seguida, dissolveu-se em mais 2,0 ml de ácido acético glacial. Misturaram-se as duas soluções e utilizaram-se mais 4 x alíquotas de 0,5 ml de ácido acético glacial para lavar 0 equipamento de vidro. A s£ lução foi imediatamente congelada em banho de diclorometano/ /gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuida dosamente 0 pó liofilizado utilizando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 65°C e, em seguida, moldou-se para se obter uma chapa com 1 milímetro de espessura. Gortou-se a cha pa em troços com 0 peso aproximado de 65 mg. Os troços foram então colocados em embalagens de plástico contendo 2,0 ml de solução de azida de sódio contendo 0,02% em peso/volume em so lução salina tamponizada com fosfato OXOID e guardaram-se a 37°0. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio a-quoso e substituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG- 5000 (Met"1, Arg11»16, Ser17’27’60’65) G-CSP hu por análise de HPLG do meio e calculou-se a libertação acu mulada de proteína (veja-se Tabela 1 mais adiante na presente memória, descritiva). B. Processo Aquoso
Dissolveram-se 4 gramas de polilaetida (copolíme-ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli • da, massa molecular média em peso 9429, polidispersibilidade 61 -
2,02) em 16 ml de diclorometano e tratou-se sob condições de uma elevada taxa de corte (homogeneizador Istrai 1500). A esta solução a„dicionou-se gota a gota 4 ml de solução aquosa de bicarbonato de sódio (20 mg/ml), Adicionaram-se mais 40 ml de água destilada e formou-se uma fina dispersão branca. Elimi-nou-se então o diclorometano utilizando um evaporador rotativo. Oongelou-se imediatamente a dispersão em banho de diclorjo metano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Guardou-se subsequentemente esse sal de sódio do polímero sob vácuo à temperatura ambiente antes da sua utilização.
Dispersaram-se 119,71 mg do sal de sódio do polí-| mero em 2,0 ml de água destilada. liofilizaram-se 3,47 ml de uma solução aquosa de PEG 5000 (Met”7, Arg^,“^, Ser77*^7’^' °) G-OSF hu (11,53 mg/ml) e, em seguida, dissolveram-se em mais 2 ml de água destilada. Adicionou-se a solução à suspensão e misturou-se. Utilizaram-se mais 4 x alíquotas de 0,5 ml de água destilada para lavar 0 equipaáento de vidro. A solução foi imediatamente congelada em banho de diclorometano/ge-lo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuidadosamente o pó liofilizado utilizand„o uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 65°C e depois moldou-se de modo a obter-se uma chapa com a espessura de 1 mm. Gortou-se a chapa em troços com 0 peso aproximado de 70 mg. Golocaram-se em seguida | os troços em embalagens de plástico contendo 2,0 ml de uma so f lução de azida de sódio contendo 0,02% em peso/volume em solu ção salina tamponizada com fosfato OZOID e guardou-se a 37°G. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se 0 meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG-5000- (Met-1, Arg11’16, Ser17 »27,6° ’65) G-GS3? hu por a-nálise de HPLG do meio e calculou-se a libertação de proteína cumulativa (veja-se a Tabela 1 mais adiante na presente memória descritiva).
Exemplo 8
, Composição farmacêutica de libertação continua contendo PEG - 62 -
5000 (l-Iet"1. Arg11»23. Ser17»27 >60 ’ 65 ) S-OSff hu A. Processo do Icido Acético G-lacial
Dissolveram-se 120,11 mg de polilactida (copolime ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli da, massa molecular média em peso 9429, polidispersibilidade 2,02) em 2,0 ml de ácido acético glacial isento de anidrido. Diofilizaram-se 3,66 ml de solução aquosa de PEG 5000 (Met , Arg11’23, Ser17,27,60»65) G-CSE hu (10,93 mg/ml) (veja-se o Exemplo de Referência 14) e depois dissolveram-se em mais 2,0 ml de ácido acético glacial. Misturaram-se as duas soluções e utilizaram-se mais 4 x alíquotas de 0,5 ml de ácido acético glacial para lavar o equipamento de vidro. A solução foi imediatamente congelada em banho de diclorometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se o pé liofilizado cuidadosamente usando uma prensa hidráulica com chapas aqueci das a 65°0 e depois moldou-se para se obter uma chapa com a espessura de 1 mm. Oortou-se a chapa em troços com o peso a-proximado de 80 mg. Em seguida colocaram-se os troços em emba lagens de plástico contendo 2 ml de uma solução de azida de sódio a 0,02% em peso/volume em solução salina tamponizada com fosfato OXOID e armazenou-se a 37°G. Em intervalos regula res de tempo, retirou-se o meio aquoso e substituxu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG 5000 (Met”^, Arg11’23, Ser17,27,60»65) G-CSP hu por análise de HPLG do meio e calculou-se a libertação cumulativa da proteína (veja--se a labela 1 mais adiante na presente memória descritiva). B. Processo Aquoso
Dissolveram-se 4,0 gramas de polilactida (copolí-mero contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glico lida, massa molecular média em peso 9429, polidispersibilida-de 2,02) em 16 ml de diclorometano e tratou-se sob condições de uma alta taxa de corte (homogeneizador Istrai 1500). A esta mistura adicionaram-se gota a gota 4 ml de solução aquosa de bicarbonato de sódio (20 mg/ml). Adicionaram-se mais 40 ml - 63
de água destilada e obteve-se uma fina dispersão branca. Eliminou-se então o diclorometano usando um evaporador rotativo. Gongelou-se imediatamente a dispersão em banho de diclorometa no/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Subsequentemente guardou-se este sal de sódio do polímero sob vácuo à temperatura ambiente antes de ser utilizado.
Dispersaram-se 120,71 mg do sal de sódio do polímero em 2 ml de água destilada, liofilizaram-se 3,66 ml de u-ma solução aquosa de PEG- 5000 (Met”\ Arg^"*^, Ser^,^,^, G--0SP hu (10,93 mg/ml) e, em seguida, dissolveram-se em mais 2 ml de água destilada. Adicionou-se a solução à suspensão e misturou-se. Usaram-se mais 4 x alíquotas de 0,5 ml de água destilada para lavar o equipamento de vidro. Gongelou-se imediatamente a solução num banho de diclorometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuidadosamente o pó liofilizado usando uma prensa hidráulica com placas aqueci das a 65°Q e, em seguida, moldou-se para se obter uma chapa com 1 milímetro de espessura. Gortou-se a chapa em troços com o peso aproximado de 70 mg. Em seguida, colocaram-se os troços em embalagens de plástico contendo 2,0 ml de solução de a zida de sódio contendo 0,02% em peso/volume em solução salina tamponizada com fosfato GXQID e guardou-se a 37°G. Em interva los de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituiu -se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG- 5000 (Met"\ Arg^*^, Ser -*-7,27,60,65^ q-CSP hu por análise de HPX»C do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína (veja-se a Tabela 1, mais adiante na presente memória descritiva).
Exemplo 9
Composição farmacêutica, de liberta-ção contínua contendo PEG-5000 (Het"1, Arg11’^, Ser17,27,60,65) G--GSE hu A. Processo do Icido Acético Glacial
Dissolveram-se 120,65 mg de polilactida (copolíme - 64 -
ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli da, massa molecular média, em peso 10 691, polidispersibilida-de 1,75) em 2 ml de ácido acético glacial isento de anidrido. I-iofilizaram-se 3 »310 ml de uma solução aquosa de PEGr 5000 (Ke-íf1, Arg11»34, Ser17»27,60»65) G-CSF hu (10,5 mg/ml) (ve;ja--se o Exemplo de Referência 20) e depois dissolveram-se em mais 2 ml de ácido acético glacial. ílisturaram-se as duas soluções e utilizaram-se ma,is 4 x alíquotas de 0,5 ml do ácido acético glacial para lavar o equipamento de vidro. A solução foi imediatamente congelada em banho de diclorometano/gelo s_e co e liofilizada durante a noite. Histurou-se cuidadosamente o pó liofilizado usando uma prensa hidráulica com placas aque cidas a 90°0 e, em seguida, moldou-se para se obter uma chapa com 1 milímetro de espessura. Gortou-se a chapa em troços com o peso aproximado de 70 mg. Em seguida, colocaram-se os troços em embalagens de plástico contendo 2,0 ml de solução de a-zida de sódio a 0,02% em peso/volume em solução salina tampo-nizada com fosfato OXOID e armazenou-se a 37°C. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG 5000-(Met"1, Arg11’54, Ser17’27’60’65) G-CSF hu por análise de HPLC do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína (ve ja-se Tabela 1, mais adiante na presente memória descritiva). B. Processo Aquoso
Dissolveram-se 5 gramas de polilactida (copolíme-ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/5G% de glicolida, massa molecular média em peso 10 691, polidispersibilidade 1,75) em 20 ml de diclorometano e tratou-se em condições com uma eleva da taxa de corte (homogeneizador Istral 1500). A esta solução, adicionaram-se gota a gota 5 ml de solução aquosa de bicarbonato de sódio (20 mg/ml). Adicionaram-se mais 50 ml de água destilada e obteve-se uma fina dispersão branca. Eliminou-se o dissolvente utilizando um evaporador rotativo. Congelou-se imediatamente a dispersão em banho de diclorometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Subsequentemente, guardou-se - 65 -
este sal de sódio do polímero sob vácuo à temperatura ambiente antes de ser utilizado.
Dispersaram-se 120,15 mg do sal de sódio do polímero em 2,0 ml de água destilada, Liofilizaram-se 3,810 ml de solução aquosa de PEG 5000 (Met""1·, Arg^4*34, Ser"L7,27,^,^3) G-CSE hu (10,5 mg/ml) e, em seguida, dissolveram-se em mais 2,0 ml de água destilada. Adicionou-se a solução à suspensão e misturou-se. Utilizaram-se mais 4 x alíquotas dé 0,5 ml de água destilada para lavar o equipamento de vidro. A solução foi imediatamente congelada num banho de diclorometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuidadosamente o pó liofilizado usando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 90° 0 e, em seguida, moldou-se para se obter uma chapa com 1 milímetro de espessura. A chapa foi cortada em troços com o peso aproximado de 75 mg. Em seguida, colocaram-se os troços em embalagens de plástico contendo 2,0 ml de solução de azida de sódio a 0,02% em peso/volume em solução salina tamponizada com fosfato OXOID e guardou-se a 37°C. Sn intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e sub£ tituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG 5000 (Met"1, Arg^34, Ser17,27,60’65) G-CSF hu por análi se de HP1C do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína (veja-se a Tabela 1, mais adiante na presente memória descritiva).
Exemplo 10
Composição farmacêutica de libertação contínua contendo PEG 5000 (Met"1. Arg11*40. Ser17>27>6Q>65^ G-CSE hu A. Processo do icido Acético Glacial
Dissolveram-se 120,74 mg de polilactida (copolíme ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli da, massa molecular média em peso 10 691, polidispersibilida-de 1,75) em 2,0 ml de ácido acético glacial isento de ânidri-• do. Liofilizaram-se 3,77 ml de solução aquosa de PEG 5000 66 -
(Meif1, Arg11,4O, Ser17»27’60’65) G-CSE hu (10»6 mg/ml) (veja -se o Exemplo de Referência 21) e, em seguida, dissolveram-se em mais 2,0 ml de ácido acético glacial. Misturaram-se as duas soluções e usaram-se mais 4 x alíquotas de 0,5 ml de ácido acético glacial para lavar o equipamento de vidro. Congelou--se imediatamente a solução em banho de diclorometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuidadosamente o pó liofilizado usando uma prensa hidráulica com placas aqueci das a 95°C e, em seguida, moldou-se para se obter uma chapa com 1 mm de espessura. Gortou-se a chapa em troços com o peso aproximado de 85 mg. Em seguida, colocaram-se os troços em em balagens de plástico contendo 2 ml de solução de azida de sódio a 0,02% em peso/volume em solução salina tamponizada com fosfato 0X0ID e guardou-se a 37°0, Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão ~ -1 11 fresco. Determinou-se a libertação de PEG 5000 (Met , Arg 1
Ser^7’27 *^*^) G-CSE hu por análise de HPLO do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína (veja-se a *J?a bela 1, más adiante na presente memória descritiva). J3. Processo Aquoso
Dissolveram-se 5 gramas de polilactida (copolime-ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli da, massa molecular média em peso 10 691, polidispersibilida-de 1,75) em 20 ml de diclorometano e trataram-se sob condições de elevada taxa de corte (homogeneizador Xstral 1500). A esta mistura adicionaram-se gota a gota 5 ml de solução aquosa de bicarbonato de sódio (20 mg/ml). Adicionaram-se mais 50 ml de água destilada e obteve-se uma dispersão branca e fina. Em seguida, retirou-se o diclorometano usando um evaporador rotativo. Oongelou-se imediatamente a dispersão em banho de diclorometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Sub-sequentemente, guardou-se este sal de sódio do polímero sob vácuo à temperatura ambiente, antes de se utilizar.
Dispersaram-se 120,20 mg de sal de sódio do polí- - 67 -
mero em 2,0 ml de água destilada. Liofilizaram-se 3,77 ml de uma solução aquosa de PEG 5000 (Met"1, Arg11,40, Ser17,27’60’ ^3) G-CSE hu (10,6 mg/ml) e, em seguida, dissolveram-se em mais 2,0 ml de água destilada. Adicionou-se a solução à suspensão e misturou-se. Utilizaram-se mais 4 x alíquotas de 0,5 ml da água destilada para lavar o equipamento de vidro. Conge lou-se imediatamente a solução em banho de diclorometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuidadosamente o pó liofilizado usando uma prensa hidráulica com as placas aquecidas a 95°C e, em seguida, moldou-se para se ob-ter uma chapa com a espessura de 1 milímetro, Cortou-se a cha pa em troços com o peso aproximado de 72 mg. Colocaram-se então os troços em embalagens de plástico contendo 2,0 ml de s£ lução de azida de sódio a 0,02% em peso/volume em solução salina tamponizada com fosfato OXOID e armazenou-se a 37°C, Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG 5000 (Met-1, Arg11,4°, Ser17»27»60»65) G-CSP hu por análi se de HPLC do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína (veja-se Tabela 1, mais adiante na presente memória descritiva).
Exemplo 11
Composição farmacêutica de libertação contínua contendo PEG 5000 (Met"1, Ala1, Thr3, Tyr4,Arg3’11, Ser'*'7,27 * ^ >^5) g-Çgp hu A. Processo do Ácido Acético Glacial
Dissolveram-se 119,79 mg de polilactida (copolíme ro contendo 60% em peso de d,l-laetida/40% em peso de glicoli. da, massa molecular média em peso 10 691, polidispersibilida-de 1,75) em 2,0 ml de ácido acético glacial isento de anidri-do. Liofilizaram-se 3,175 ml de uma solução aquosa de PEG 5000 (Met""1, Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5'11, Ser17»27»60»65) G-CSE hu (veja-se Exemplo de Referência 22) (12,6 mg/ml) e, em segui * da, dissolveram-se em mais 2,0 ml do ácido acético glacial, • 7 68 -
Misturaram-se as duas soluções e utilizaram-se mais 4 x 0,5 ml alíquotas de ácido acético glacial para lavar o equipamento de vidro. Congelou-se imediatamente a solução em banho de diclorometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuidadosamente o pó liofilizado usando uma prensa hi dráulica com placas aquecidas a 95 C e, em seguida, moldou-se para se obter uma chapa com a espessura de 1 milímetro. Cortou-se a chapa em troços pesando aproximadamente 80 mg. Em se guida, colocaram-se os troços em embalagens de plástico contendo 2,0 ml de solução de azida de sódio contendo 0,02% de peso/volume em solução salina tamponizada com fosfato QXQID e guardou-se a 37°C. Em intervalos de tempo regulares, retirou--se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. Betermi-nou-se a libertação de PEG· 5000 (Met-1, Ala"*·, Thr^, Tyr4, Arg^*11, Ser17,27,k®,^) Gr-CSE hu por análise de HP1C do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína (veja-se a Tabela 1 mais adiante na presente memória descritiva). B. Processo Aquoso
Bissolveram-se 5,0 gramas de polilactida (copolí-mero constituído por 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicolida, massa molecular média em peso 10 691, polidis-persibilidade 1,75) em 20 ml de diclorometano e tratou-se sob intensa taxa de corte (homogeneizador Ystral 1500). A esta suspensão, adicionaram-se gota a gota 5 ml de solução aquosa de bicarbonato de sódio (20 mg/ml). Adicionaram-se mais 50 ml de água destilada e obteve-se uma fina dispersão branca. Reti rou-se então o diclorometano usando um evaporador rotativo. Congelou-se imediatamente a dispersão em banho de diclorometa no/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Armazenou-se subsequentemente este sal de sódio do polímero sob vácuo à temperatura ambiente antes da utilização. Dispersaram-se 119,67 mg de sal de sódio do polímero em 2 ml de água destilada. lio filizaram-se 3,175 ml de uma solução aquosa de PEG- 5000 (Met"1 Ala1, Thr5, Tyr4, Arg5’11, Ser17»27’60’65) G-CSP hu (12,6 mg/ - 69 -
/ml) e em seguida, dissolveram-se em mais 2,0 ml de água destilada. Adicionou-se a solução à suspensão e misturou-se. Uti lizaram-se mais 4 x alíquotas dé 0,5 ml de água destilada para lavar o equipamento de vidro. Congelou-se imediatamente a solução em banho de diclorometano/gelo seco e liofilizou-se du rante a noite. Misturou-se cuidadosamente o pó liofilizado u-sando uma prensa hidráulica com chapas aquecidas a 95°C e depois moldou-se para se obter um paralelepípedo com 1 milímetro de espessura. Cortou-se o paralelepípedo em porções com o peso aproximado de 90 mg. As porções foram então colocadas em frascos de plástico que continham 2,0 ml de uma solução de a-zida de sódio a 0,02% em peso/volume em solução salina tampo-nizada com fosfato OXOID e armazenados a 37°0. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG 5000 (Met"1, Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5»11, Ser17*27»60»65) G-OSP hu por análise de HP1C do meio e calculou-se a libertação cumula tiva de proteína (veja-se a Tabela 1 mais adiante na presente memória descritiva).
Exemplo 12
Libertação continua da composição farmacêutica contendo PEG 5000 (Met"1. Glu^~3. Ser17*27. Ala26*28. Árg3^) G-CSE hu A. Processo do ácido Acético Glacial
Dissolveram-se 120,25 miligramas de polilactida (copolímero contendo 50% em peso de d,l-lactida/50%.em peso de glicolida, massa molecular média em peso 10 691» polidis-persibilidade 1,75) em 2 ml de ácido acético glacial isento de anidrido acético, liofilizaram-se 2,899 ml de uma solução aquosa de PEG- 5000 (Met”1, Glu15, Ser17'27, Ala26'28, Arg30) G-CSE hu (veja-se Exemplo de Referência 15) (13,8 mg/ml) e, em seguida, dissolveram-se em mais 2 ml de ácido acético glacial. Misturaram-se as duas porções e depois utilizaram-se 4x x alíquotas de 0,5 ml de ácido acético glacial para lavar o - 70 - equipamento de vidro. Congelou-se imediatamente a solução em banho de diclorometano/gelo seoo e liofilizou-se durante a noi te. Misturou-se cuidadosamente o pó liofilizado usando uma prensa hidráulica com as placas aquecidas a S0°0 e depois mol dou-se de maneira a obter-se um paralelepípedo com 1 milímetro de espessura. Cortou-se o paralelepípedo em parcelas com o peso aproximado de 100 mg. Colocaram-se então as parcelas em frascos de plástico contendo 2 ml de solução a 0,02% em peso/ volume de azida de sódio em solução salina tamponizada com fosfato OXOID e guardou-se a 37°C. Sn intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG 5000 (Met~\ Glu^, Ser1?»2?, Ala26»28, Arg5°) G-CSE hu por análise de HPLC e cal culou-se a libertação cumulativa de proteína (ve^a-se a Tabela 1 mais adiante na presente memória descritiva) B. Processo Aquoso
Dissolveram-se 5,0 gramas de polilactida (copolí-mero contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glico lida, massa molecular média em peso 10 691, polidispersibili-dade 1,75) em 20 ml de diclorometano e submeteu-se a condições de elevado corte (homogeneizador Xstral 1500). A esta solução adicionaram-se gota a gota 5 ml de solução aquosa de bicarbonato de sódio (20 mg/ml). Adicionaram-se mais 50 ml de água destilada e obteve-se uma fina dispersão branca. Então, eliminou-se o diclorometano usando um evaporador rotativo. Congelou-se imediatamente a dispersão em banho de dielorometa no/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Guardou-se subsequentemente este sal de sódio ou o polímero sob vácuo à tem peratura ambiente, antes de se utilizar.
Dispersaram-se 120,57 miligramas do sal de sódio do polímero em 2,0 ml de água destilada. Liofilizaram-se 2,899 ml de uma solução aquosa de PEG 5000 (Met”1, Glu1'3, Ser17,27, Ala26»28, Arg50) G-CSP hu (13,8 mg/ml) e, em seguida, dissolveu-se em mais 2 ml de água destilada. Adicionou-se - 71 -
a solução à suspensão e misturou-se. Utilizaram-se 4 x alíqu£ tas de 0,5 ml de água destilada para lavar o equipamento de vidro. Oongelou-se imediatamente a solução em "banho de diclo-rometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou--se cuidadosamente o pó liofilizado usando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 95°C e, em seguida, moldou-se de maneira a ohter-se um paralelepípedo com 1 milímetro de espejs sura. Gortou-se o paralelepípedo em parcelas com o peso aproximado de 100 mg. Em seguida, colocaram-se as parcelas em frascos de plástico contendo 2 ml de uma solução a 0,02% em peso/volume de azida de sódio em solução salina tamponizada com fosfato OXOID e guardou-se a 37°C. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG 5000 (Met”·*", Glu"^, Ser^7*27, Ala2^*2®, Arg^) G-CSE hu por análise de HP1C do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína (veja-se a Tabela 1 mais adiante na presente memória descritiva).
Exemplo 15
Libertação contínua da composição farmacêutica contendo PEG 5000 (Met"1, ger1^27»11^116. Glu111) G-CSP hu A. Processo do Icido Acético Glacial
Dissolveram-se 120,80 miligramas de polilactida (copolímero contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicolida, massa molecular média em peso 10 691, polidis-persibilidade 1,75) em 2 ml de ácido acético glacial isento de anidrido acético, liofilizaram-se 3,333 ml de uma solução aquosa de PEG 5000 (Met"1, Ser17’27,115,116, Glu111) G-CSF hu (veja-se Exemplo de Referência 16) (12,0 mg/ml) e, em seguida, dissolveram-se em mais 2,0 ml de ácido acético glacial. Mistur raram-se as duas soluções e utilizaram-se mais 4 x alíquotas de 0,5 ml de ácido acético glacial para lavar o equipamento de vidro. Gongelou-se imediatamente a solução em banho de di-clorometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Mistu- 72 -
rou-se cuidadosamente o pó liofilizado usando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 90°C e depois moldou-se para se obter uma paralelepípedo com a espessura de 1 milímetro. Cortou-se o paralelepípedo em parcelas com o peso aproximado de 95 miligramas. As parcelas foram em seguida colocadas em frascos de plástico contendo 2,0 ml de uma solução a 0,02% em peso/volume de azida de sódio em solução salina tamponizada com fosfato OXOID e guardou-se st 37°C. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG 5000 (Met~\ Ser17,27,115,i;L6, Glu111) G-CSE hu por análise de HPLO do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína (veja-se a Tabela 1 mais adiante na presente memória descritiva). B. Processo Aquoso
Dissolveram-se 5 gramas de polilactida (copolíme-ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli da, peso molecular médio em peso 10 691, polidispersibilidade 1,75) em 20 mililitros de diclorometano e colocou-se sob condições de um intenso corte (homogeneizador Is trai 1500;. A e_s ta solução adicionaram-se gota a gota 5 ml de solução aquosa de bicarbonato de sódio (20 mg/ml). Adicionaram-se mais 50 ml de água destilada e obteve-se uma fina dispersão branca. Em seguida, separou-se o diclorometano usando um evaporador rotativo. Oongelou-se imediatamente a dispersão em banho de diclo-rometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Guardou--se subsequentemente este sal de sódio do polímero sob vácuo a temperatura ambiente antes de se utilizar.
Dispersaram-se 119,83 miligramas do sal de sódio do polímero em 2 ml de água destilada. liofilizaram-se 3,333 ml de uma solução aquosa de P1G 5000 (Met-^, Ser ^7*27,
Glu^1) G-OSP hu (12,0 mg/ml) e, em seguida, dissolveram-se em outros 2 ml de água destilada. Adicionou-se a solução à suspen sao e misturou-se. Utilizaram-se mais 4 x alíquotas de'0,5 ml 73 -
Λ. de agua destilada para lavar o equipamento de vidro. Congelou -se a solução imediatamente em banho de dielorometano/gelo se co e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuidadosamente o pó liofilizado usando uma prensa hidráulica com placas aque cidas a 95°C e, em seguida, moldou-se para se obter um parale lepípedo com a espessura de 1 mm. Cortou-se o paralelepípedo em parcelas pesando aproxamidamente 95 mg. Em seguida, coloca ram-se as parcelas em frascos de plástico contendo 2 ml de u-ma solução a 0,02% em peso/volume de azida de sódio em solução salina tamponizada com fosfato QXQID e guardou-se a 37°C. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG 5000 (Met"1, Ser17,27,115,i;L6, GluHl) Q_CSP hu por análi se de HPLC do meio e calculou-se a libertação cumulativa da proteína (veja-se a Tabela 1 mais adiante na presente memória descritiva).
Exemplo 14
Libertação contínua de uma composição farmacêutica contendo PEG SOOO^CMet"1, Arfí11»1^, Ser17»27, lys58)'G-OSE hu A. Processo do ácido Acético Glacial
Dissolveram-se 119,23 mg de polilactida (copolíme ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli da, massa molecular media em peso 10 691, polidispersibilida-de 1,75) em 2 ml de ácido acético glacial isento de anidrido acético. Liofilizaram-se 2,224 ml de uma solução aquosa de PEG 5000 (Met-1, Arg11’165, Ser17»27, Lys58) G-CSE hu (17,905 mg/ml) e, em seguida, dissolveu-se em outros 2 ml de ácido a-cético glacial. Misturaram-se as duas soluções e utilizaram--se mais 4 x alíquotas de 0,5 ml de ácido acético glacial para lavar o equipamento de vidro. Congelou-se imediatamente a solução em banho de diclorometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuidadosamente o pó liofilizado u-sando uma prensa hidráulica com as placas aquecidas a 90°C e, em seguida, moldou-se para se obter um paralelepípedo com a - 74 -
A
espessura de 1 mm. Cortou-se o paralelepípedo em parcelas com o peso aproximado de 100 mg. As parcelas foram em seguida colo cadas em frascos de plástico contendo 2 ml de uma solução a 0,02% em peso/volume de azida de sódio em solução salina tam-ponizada com fosfato OXOID e guardou-se a 37°0. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituiu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG 5000 (Met-^, Arg^*·^, Ser"^,2^, Bys·^) G-CSP hu por análise de HPIiC do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína (veja-se Tabela 1 mais adiante na presente memória descritiva), B. Processo Aquoso
Dissolveram-se 5 gramas de polilactida (copolíme-ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli da, massa molecular média em peso 10,691, polidispersibilida-de 1,75) em 20 ml de diclorometano e submeteu-se a condições de uma elevada taxa de corte (homogeneizador Ystral 1500). A esta solução adicionaram-se gota a gota 5 ml de solução aquosa de bicarbonato de sódio (20 mg/ml). Adicionaram-se mais 50 ml de água destilada e originou-se uma fina dispersão branca. Em seguida, eliminou-se o diclorometano usando um evaporador rotativo. Congelou-se imediatamente a dispersão em banho de diclorometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Sub-sequentemente, guardou-se este sal de sódio do polímero sob vácuo à temperatura ambiente antes da utilização.
Dispersaram-se 119,82 mg do sal de sódio do polímero em 2 ml de água destilada, liofilizaram-se 2,224 ml de uma solução aquosa de PEG 5000 (Met”1, Arg11*1^, Ser1^*2^,
Lys ) G-CSP hu (17,985 mg/ml) e, em seguida, dissolveram-se em mais 2 ml de água destilada. Ádicionou-se a solução à suspensão e misturou-se. Utilizaram-se mais 4 x alíquotas de 0,5 ml de água destilada para lavar o equipamento de vidro. Con-gelou-se imediatamente a solução num banho de diclorometano/ - 75 -
/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se completamente o pó liofilizado usando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 95°C e, em seguida, moldou-se de maneira a obter-se um paralelepípedo com 1 milímetro de espessura. Cortou-se o paralelepípedo em parcelas com o peso aproximado de 90 mg. Em seguida, colocaram-se estas parcelas em frascos de plástico contendo 2 ml de uma solução a 0,02% em peso/volume de azida de sódio em solução salina tamponizada com fosfato 010ID e guardou-se a 37°C. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se 0 meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. ~ -1 11
Determinou-se a libertação de PEG 5000 (Met , Arg ,165, Ser17*^ Lys9^) G-CSE hu por análise de HPLG do meio e calcu lou-se a libertação cumulativa de proteína ^veja-se a Tabela 1 mais adiante na presente memória descritiva).
Exemplo 15
Libertação contínua de uma composição farmacêutica contendo PEG 5000 (Met"\ Ser17’27, hys49’58, Ala44*51,55) G-CSE hu A. Processo do Ácido Acético Glacial
Dissolveram-se 119,83 mg de polilactida (copolime ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli da, massa molecular média, em peso 10.691, polidispersibilida de 1,75) em 2 ml de ácido acético glacial isento de anidrido acético. Liofilizaram-se 2,317 ml de uma solução aquosa de PEG 5000 (Met"1, Ser17»27, Lys49’58, Ala44,51*55) G-GSP hu (veja-se Exemplo de Referênica 18) (17,262 mg) e, em seguida, dissolveram-se em mais 2 ml de ácido acético glacial. Mistura ram-se as duas soluções e utilizaram-se mais 4 x alíquotas de 0,5 ml do ácido acético glacial para lavar 0 equipamento de vidro. Congelou-se imediatamente a solução em banho de diclo-rometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou--se cuidadosamente o pé liofilizado usando uma prensa hidráulica com chapas aquecidas a 90°C e depois moldou-se para se obter um paralelepípedo com a espessura de 1 milímetro. Cor- - 76 - tou-se o paralelepípedo em parcelas com o peso aproximado de 100 mg. As parcelas foram colocadas em seguida em frascos de plástico contendo 2 ml de solução a 0,02% em peso/volume de a zida de sódio em solução salina tamponizada com fosfato OXOID e guardou-se a 37 0. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. Deter minou-se a libertação de PEG 5000 (Met”1, Ser17,27, Lys49,53, ΛΛ Cl CE „
Ala ' * ) G-CSE hu por analise de HP1C do meio e calculou- -se a libertação cumulativa de proteína (veja-se labela 1 mais adiante na presente memória descritiva). B. Processo Aquoso
Dissolveram-se 5 gramas de polilactida (copolíme-ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli da, massa molecular média em peso 10 691, polidispersibilida-de 1,75) em 20 ml de diclorometano e colocou-se sob condições de intenso corte num homogeneizador Ystral 1500. A esta solução adicionaram-se gota a gota 5 ml de solução aquosa de bicarbonato de sódio (20 mg/ml). Adicionaram-se mais 50 ml de água destilada e obteve-se uma fina dispersão branca. Eliminou-se então o diclorometano usando um evaporador rotativo. Congelou-se imediatamente a dispersão em banho de diclormeta-no/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Lavou-se depois este sal de sódio do polímero sob vácuo, à temperatura ambien te antes de utilizar-se.
Dispersaram-se 120,32 miligramas do sal de sódio do polímero em 2 ml de água destilada. Liofilizaram-se 2,317 ml de uma solução aquosa de PEG 5000 (Met”\ Ser17,27, Lys^9* 93, Ala^‘,9'*',99) G-CSF hu (17,262 mg/ml) e depois dissolveram -se em mais 2 ml de água destilada. Adicionou-se a solução à suspensão e misturou-se. Empregaram-se mais 4 x alíquotas dé 0,5 ml de água destilada para lavar o equipamento de vidro. Congelou-se imediatamente a solução em banho de diclorometano/ /gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuida 77 -
dosamente o pó liofilizado usando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 95°C e, em seguida, moldou-se para se obter um paralelepípedo com a espessura de 1 mm. Cortou-se o parale lepípedo em parcelas pesando aproximadamente 100 mg. Em segui da, colocaram-se as parcelas em frascos de plástico contendo 2 ml de solução a 0,02% em peso/volume de azida de sódio em solução salina tamponizada com fosfato OXOID e guardou-se a 37°C. A intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquo so e substituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a liberta ção de PEG 5000 (Met"1, Ser17,27, Lys49,58, Ala44,51,55) G--CSE hu por análise de HP1C do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína (veja-se a Tabela 1 mais adiante na presente memória descritiva).
Exemplo 16
Libertação contínua de uma composição farmacêutica contendo 1-· 1 ...................T<| 11........TH Vc------ ---------- """*--— PEG 750 (Met . Arg . Ser ' *àl ) G-CSEhu
Processo do Ácido Acético glacial
Dissolveram-se 150,11 mg de polilactida (copolíme ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli da, massa molecular média em peso 10 691, polidispersibilida-de 1,75) em 2 ml de ácido acético glacial isento de anidrido acético. Liofilizaram-se 4,673 ml de uma solução aquosa de PEG 750 (Met**1, Arg11, Serl7,27,80,É^) G-GSE hu (veja-se Exem pio de Referência 24), (8,55 mg/ml) e, em seguida, dissolveram-se em mais 2 ml de ácido acético glacial. Misturaram-se as duas soluções e utilizaram-se mais 4 x alíquotas de 0,5 ml de ácido acético glacial para lavar o equipamento de vidro. Oongelou-se imediatamente a solução em banho de diclorometano/ /gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuida dosamente o pó liofilizado usando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 90°G e depois moldou-se para se obter uma paralelepípedo com 1 milímetro de espessura. Cortou-se o para lelepípedo em parcelas pesando aproximadamente 75 mg. Coloca- - 78 - I k
ram-se em seguida as parcelas em frascos de plástico contendo 2 ml de solução a 0,02% em peso/volume de azida de sódio em solução salina tamponizada com fosfato OXOID e guardou-se a 37UC. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio a-quoso e substituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG 750 (Met"1, Arg11, Ser17,27’60»65; G-CSE hu por análise de HPLO do meio e calculou-se a libertação cumula tiva de proteína (veja-se a Tabela 1 mais adiante na presente memória descritiva).
Exemplo 17 libertação contínua de uma composição farmacêutica contendo PEG· 2000 (Met , Arg11. Ser17>27,6Q’65) G-GSÊ hu A. Processo do Icido Acético G-lacial
Dissolveram-se 140,32 mg de polilactida ( copo lime ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli da, massa molecular média em peso 10 691, polidispersibilida-de 1,75) em 2 ml de ácido acético glacial isento de anidrido acético, liofilizaram-se 4,695 ml de uma solução aquosa de PEG 2000 (Met"1, Arg11, Ser17,27,60,ò5) G-CSF hu (veja-se E-xemplo de Referencia 23) (8,52 mg/ml) e, em seguida, dissolveu-se em mais 2 ml de ácido acético glacial. Misturaram-se as duas soluções e utilizaram-se mais 4 x aliquotas de 0,5 ml de ácido acético glacial para lavar o equipamento de vidro. Oongelou-se imediatamente a solução em banho de diclorometano/ /gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuida dosamente o pó liofilizado usando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 90°C e, em seguida, moldou-se para se obter um paralelepípedo com a espessura de 1 milímetro. Gortou--se o paralelepípedo em parcelas com o peso aproximado de 70 mg. Em seguida, colocaram-se as parcelas em frascos de plásti co contendo 2 ml de solução a 0,02% em peso/volume de azida de sódio em solução salina tamponizada com fosfato OXOID e guardou-se a 37°G. Em intervalos de tempo regulares, retirou-1 -se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. Determi- - 79 -
nou-se a libertação de PEG 2000 (Met-^, Arg1^, Ser^,^,^> /Γ pr D) G-CSE hu por analise de HPLO do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína (veja-se a Tabela 1 mais a-diante na presente memória descritiva). B. Processo Aquoso
Dissolveram-se 5 gramas de polilactida (copolíme-ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% de glicolida, massa molecular média em peso 10 691» polidispersibilidade 1,75) em 20 ml de diclorometano e colocou-se sob condições de mistura, com uma elevada intensidade de corte (homogeneizador Istral 1500). A esta solução adicionaram-se gota a gota 5 ml de solu ção aquosa de bicarbonato de sódio (20 mg/ml). Adicionaram-se mais 50 ml de água destilada e obteve-se uma fina dispersão branca. Em seguida, eliminou-se 0 diclorometano utilizando um evaporador rotativo. Gongelou-se imediatamente a dispersão em banho de diclorometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Subsequentemente, guardou-se sob vácuo à temperatura ambiente este âal de sódio do polímero, antes ãe se utilizar.
Dispersaram-se 140,85 mg do sal de sódio do polímero em 2 ml de água destilada. Liofilizaram-se 4»695 ml de uma solução aquosa de PEG 2000 (Met""\ Arg^\ Ser'^,‘^,^,^) G-CSE hu (8,25 mg/ml) e, em seguida, dissolveram-se em 2 ml de água destilada. Adicionou-se a solução à suspensão e mistu rou-se. Utilizaram-se mais 4 x alíquotas de’ 0,5 ml de água destilada para lavar o equipamento de vidro. Gongelou-se imediatamente a solução em banho de diclorometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuidadosamente o pó liofilizado usando uma prensa hidráulica com placas aqueci das a 90°C e depois moldou-se para se obter um paralelepípedo com a espessura de 1 milímetro. Cortou-se este paralelepípedo em parcelas pesando aproximadamente 70 mg. Golocaram-se então as parcelas em frascos de plástico contendo 2 ml de uma solu-• ção a 0,02% em peso/volume de azida de sódio em solução sali- 80 -
na tamponizada com fosfato OXOID e guardou-se a 37°C. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substi tuíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG 2000 (Met”1, Arg11, Ser17 ’27'60*65 ) G-CSI hu por análise de HPLC do meio e caleulou-se a libertação cumulativa de proteína (veja-se a Tabela 1 mais adiante).
TABELA IA
Numero do Exemplo Libertação de análogos de G-OSB a par- tir de formulações de lactida/glicolida/ /G 1 : 1 Pro- Oarga de cesso proteína em peso) Oarga de Polímero (% em peso) D2 do Polímero Temperatura da Prensa (em °G) 5A GAA 16,26 43,81 310 65 5B Aq 16,16 43,83 310 65 6A GAA 16,89 50,56 310 65 6B Aq 16,34 50,87 310 65 7A GAA 17,49 52,79 310 65 7B Aq 17,65 52,82 310 65 3A GAA 16,94 50,88 310 .65 3B Aq 16,83 50,95 310 65 9A GAA 16,54 49,37 312 90 9B Aq 16,60 49,87 312 90 10A GAA 16,49 49,77 312 95 10B Aq 15,73 47,27 312 95 11A GAA 15,23 45,60 312 95 11B Aq 14,37 44,48 312 95 12A GAA 16,08 48,35 312 90 12B Aq 16,12 48,52 312 95 13A GAA 16,51 49,85 312 90 13B Aq 16,33 49,06 312 95 14A GAA 16,19 48,27 312 90 31 -
14Β Aq 15,92 47 ,68 312 95 15Α OAA 15,63 46 ,81 312 90 15Β Aq 15,06 45 ,43 312 95 16 GAA 19,17 71,95 312 90 17 A GAA 17,30 60 ,93 312 90 17 B Aq 17,56 62 ,82 312 90 As designações "GAA" e "Aq" utilizadas acima refe rem-se aos processos de preparação de formulações, respectiva mente, com ácido acético glacial e aquoso. TABELA 1B Taxa de libertaç ão da proteína a partir das formulações acima referidas Exemplo % de proteína libertada até ao dia lúmero 1 4 6 11 16 18 5A 27,1 36,5 37,1 37,5 37,5 37,5 5B 33,3 37,5 38,6 39,1 40,1 40,1 6A 77,0 96,4 102,7 106,7 111,3 112,9 6B 56,8 86,6 93,3 103,9 109,4 7A 42,5 55,9 60,4 64,5 67,9 70,8 7B 46,5 59,5 65,3 74,5 80,7 81,5 8A 50,3 66,4 72,4 73,2 85,2 86,6 8B 55,5 78,4 34,8 87,8 89,5 90,1 % de proteína libertada até ao dia 1 4 8 11 15 18 9A 16,2 21,8 24,6 40,1 43,9 9B 27,2 37,3 41,6 45,0 54,1 10A 29,6 41,3 46,2 10B 33,3 51,1 59,9 64,6 69,3 82 -
11A 45,9 60,1 65,7 11B 42,0 66,0 72,9 74,6 % de proteína libertada até ao dia 1 3 8 11 15 18 12â* 56,3 84,4 99,4 99,4 12B* 51,7 74,9 89,3 93,8 99,2 13A* 37,3 67,7 35,8 108,6 13 B* 36,2 75,7 95,2 104,0 105,2 14A* 28,6 47,2 55,6 74,3 14B* 24,2 48,3 61,0 77,8 81,6 15A* 58,1 84,4 96,0 96,2 15B* 50,3 111,3 127,2 129,7 131,9 132,3 % de proteína libertada até ao dia 1 4 8 11 15 18 16 6,2 6,7 6,8 6,9 6,9 6,9 17 A 22,6 32,7 41,0 43,1 45,6 46,5 17 B 26,2 56,3 42,8 44,8 48,2 49,3 * Os números referentes à libertação foram processados utilizando o teor de protéina da formulação calculado em peso não por análise de aminoácidos.
Exemplo 18
Libertação contínua de uma composição farmacêutica contendo BSG- 5000 (Met"1, Arg11. SerÍ7,27,6(3’6g) G-OSÃ hu (Lactida/Gli-colida, 80 : 20) A. Processo do Icido Acético G-lacial (proteína utilizada com uma carga de 5*52.%)
Dissolveram-se 158,91 mg de polilactida (copolím^ , ro contendo 80% em peso de d,l-lactida/20% em peso de glicoli - 83 -
da, massa molecular média em peso 7952, polidispersibilidade 2,01) em 2 ml de ácido acético glacial isento de anidrido acé tico. Dissolveram-se 41,9 mg de iàma preparação liofilizada de PEG 5000 (Met”1, Arg11, Ser17 ’27»60 *'65 ) G-CSE hu em mais 2 ml de ácido acético glacial. Misturaram-se as duas soluções e u-tilizaram-se mais 4 x alíquotas de 0,5 ml de ácido acético glacial para lavar o equipamento de vidro. Oongelou-se imedia tamente a solução deixando-a cair gota a gota em banho de azo to líquido e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuida dosamente o pá liofilizado usando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 75°C e moldou-se obtendo-se parcelas pesando aproximadamente 80 mg. Colocaram-se então as parcelas em frascos de plástico contendo 2 ml de uma solução a 0,02% em peso/volume de azida de sódio em solução salina tamponiza-da com fosfato OXOID e guardou-se a 37°C. Em intervalos de tem po regulares, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG 5000 (Met-1, Arg11, Ser17*^7*^^^ ^“CSE hu por análise de HP1C do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína. libertação de Proteína da Eormulação
Dia Percentagem de 1 10,41 4 17,36 7 21,73 11 24,47 14 27,67 18 30,69
Exemplo 19 libertação contínua de uma composição farmacêutica contendo PEG 5000 (Met"1, Arg11. Ser17»27»60»65) G-CSff hu (80% de (lao-tida/glioolida, 50 : 50/20% de metil-polietileno-glicol 2000) A. Processo do ácido Acético Glacial - 84 -
(proteína oom uma carga de 5.23%)
Dissolveram-se 159,87 mg de um hidrogel (60,7% em peso de copolímero de d,l-lactida/glicolida, 19,3% em peso de 2000 MePEG) em 2 ml de ácido acético glacial isento de anidri do acético. Dissolveram-se 40,26 mg de uma preparação liofili zada de PEG 5000 (Met-1, Arg11, Ser17,27,6D’65) G-CSP hu (26,46% em peso de proteína) em 2 ml de ácido acético glacial. Misturaram-se as duas soluçoes e utilizaram-se mais 4 x alí-quotas de 0,5 ml de ácido acético glacial para lavar o equipa mento de vidro. Congelou-se imediatamente a solução deixando--a cair gota a gota em banho de azoto líquido e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuidadosamente o pó liofilizado utilizando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 60°G e, em seguida, moldou-se de maneira a obterem-se parcelas pesando aproximadamente 80 mg. Em seguida, colocaram-se as parcelas em frascos de plástico contendo 2 ml de uma solução a 0,02% em peso/volume de azida de sódio em solução salina tam-ponizada com fosfato OXOID e guardou-se a 37°C. A intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG 5000 (Met"1, Arg11, Serl7,27,^0,^) G-CSP hu por análise por HPLC do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína. libertação de Proteína da Formulação Dia Percentagem de libertação 1 4 8 11 15 24.57 40,85 67,16 79,91 91.57
Exemplo 20 libertação contínua a partir de uma composição farmacêutica contendo PEG 5000 (Met"1, Arg11, Ser17,2γ > 6'θ>65') g-GSP hn - 85 -
(80% de (lactida/glicolida, 100 : 0)/20% de metil-polietileno--glicol 2000) A. Processo do Icido Acético G-lacial (•proteína oom uma carga de 5*23%)
Dissolveram-se 159,70 mg de um hidrogel (82,5$ em peso de poli-d,l-lactida, 17,5% em peso de 2000 MePEG·) em 2 ml de ácido acético glacial isento de anidrido acético. Dis-solveram-se 39,50 mg de uma preparação liofilizada de PEG· 5000 (Met-1, Arg11, Ser17»27,60,65) G-CSE hu (26,46% em peso de proteína) em 2 ml de ácido acético glacial. Misturaram-se as duas soluções e utilizaram-se mais 4 x alíquotas de 0,5 ml de ácido acético gla,cial para lavar o equipamento de vidro. Congelou-se imediatamente a solução deixando-a cair gota a go ta sopre azoto líquido e liofilizou-se durante a noite. Mistu rou-se cuidadosamente o pó liofilizado usando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 60°0 e moldou-se com a obtenção de parcelas pesando aproximadamente 70 mg. Em seguida, co locaram-se as parcelas em frascos de plástico contendo 2,0 ml de solução a 0,02% em peso/volume de azida de sódio em solução salina tamponizada com fosfato QXOID e guardou-se a 37°C. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG 5000 (Met-1, Arg11, 3β^7,27»60,δ5) G-CSP hu por análi se por HPLC do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína.
Libertação de Proteína a partir da Pormulação
Dia Percentagem de 1 25,19 4 63,52 3 86,20 11 93,67 15 97,50 18 98,88 86 -
Exemplo 21
Libertação contínua de uma composição farmacêutica contendo PEG 5000 (Metr\ Arg11,Ser17,27>bU>65) G- CS E hu ~(Lactida : : Glioolida, 50 : 50) A. Processo do Ácido Acético Glacial (proteína com a carga igual a 4.14%)
Dissolveram-se 160,34 mg de polilactida (copolime ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/5Q% em peso de glicoli da, massa molecular média em peso 9827, polidispersibilidade 2,13) em 2 ml de ácido acético glacial isento de anidrido acé tico. Dissolveram-se 40,73 mg de uma preparação liofilizada de PEG 5000 (Mef1, Arg11, Ser17’27»60»65) G-CSP hu em mais 2 ml de ácido acético glacial. Misturaram-se as duas soluções e utilizaram-se mais 4 x alíquotas de 0,5 ml do ácido acético glacial para lavar o equipamento de vidro. Congelou-se imedia tamente a solução deixando-a cair gota a gota em banho de azo to líquido e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuida dosamente o pé liofilizado usando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 60°C e moldou-se em parcelas com o peso a-proximado de 60 mg. Colocaram-se depois as parcelas em frascos de plástico contendo 2 ml de uma solução a 0,02% em peso/ /volume de azida de sodio em solução salina tamponizada com fosfato OXOID e guardou-se a 37°C. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão — —1 ]] fresco. Determinou-se a libertação de PEG 5000 (Met , Arg , Ser17,^7,^,^) G-CSE hu por análise de HPLC do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína.
Libertação de Proteína a Partir da Eormulacão
Dia Percentagem de Libertação 1 18,05 4 40,00 8 57,47 - 87 -
11 66,18 14 72,06 18 77,77
Exemplo 22
Libertação contínua a partir de uma composição farmacêutica contendo PEG 5000 (Met .Arg11. Ser17’27,6()’63) G-CSP hu, (Lactida : Glicolida, 75 : 25)
Processo do ácido Acético Glacial
Dissolveram-se 161,46 miligramas de polilactida (copolímero contendo 75 por cento em peso de d,1-lactida/ 25 por cento em peso de glicolida, massa molecular em peso 12933, polidispersibilidade 1,31) em 2,0 mililitros de ácido acético glacial isento de anidrido acético. Dissolveram-se 39,03 mili gramas de uma preparação liofilizada de PEG TG-50 noutros 2,0 mililitros de ácido acético glacial. Misturaram-se as duas so luções e utilizaram-se mais quatro alíquotas de 0,5 mililitro de ácido acético glacial para lavar o equipamento de vidro. Gongelou-se imediatamente a solução deixando-a cair gota a g£ ta dentro de azoto líquido e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuidadosamente o pé liofilizado usando uma prensa hidráulica aquecida a 75°0 e moldou-se em parcelas com o peso aproximadamente igual a 30 miligramas. Golocaram-se em seguida as parcelas em frascos de embalagem de plástico contendo 2,0 mililitros de solução salina fisiológica tamponizada com fosfato OXOID contendo 0,02 por cento em peso/volume e guar-dou-se a 37°G. Sn intervalos regulares de tempo, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG 5000 (Met*1, Arg11, Ser17»27'60»65) G-CSP hu mediante análise por cromatografia em camada fina do meio e calculou-se a libertação acumulada de proteína.
Libertação de Proteína a partir da Pormulação - 83
Dia Percentagem de 1 7,32 4 12,27 7 15,46 11 17,25 14 19,33 13 21,06
Bxemplo 23 libertação continua de uma composição farmacêutica contendo PEG 5000 (Met"1, Arg11, Ser17’^7*™*65) G-CSE hu (LactidasSli-colida 100:0)
Processo do Ácido Acético Glacial (proteína com a carga igual a 5,37%)
Dissolveram-se 153,67 miligramas de polilactida (copolímero contendo 100 por cento em peso de d,l-lactida/ 0 por cento em peso de glicolida, massa molecular em peso igual a 9042, polidispersibilidade 1,96) em 2,0 mililitros de ácido acético glacial isento de anidrido acético. Noutro volume de 2,0 mililitros de ácido acético glacial dissolveram-se 40,42 miligramas de PEG 5000 (Met-^, irg^, Ser·^*^*^*^) G-CSE hu. Misturaram-se as duas soluções e utilizaram-se mais 4 x aliquotas com o volume de 0,5 mililitro do ácido acético glacial para lavar o equipamento de vidro. Gongelou-se imediatamente a solução deixando-a cair gota a gota em azoto liquido e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuidadosamente o pé liofilizado empregando uma prensa hidráulica com placas a-quecidas a 75°0 e moldou-se de maneira a obter parcelas com o peso aproximadamente igual a 70 miligramas. Em seguida, colocaram-se as parcelas moldadas em frascos de embalagem de piás tico contendo 2,0 mililitros de uma solução contendo 0,02 por cento em peso por volume em solução salina fisiológica com tampão de fosfato OXOID e guardou-se a 37°0. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por - 39 -
tampão fresco. De terminou-se a libertação de DBG- 5000 (Het“·*", Arg^, Ser^'^’ ^°>65 j q_qgj? ^ mediante análise por HPLG do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína. libertação de proteína a partir da formulação
Dia Percentagem de 1 13,02 4 22,46 7 29,44 11 33,15 14 36,34 13 41,31
Bxemplo 24 libertação contínua a partir de uma composição farmacêutica contendo PEG 5000 (Met~~ , Ser^*^) G— QSF hu
Processo Aquoso i; Formulação G (Proteína com uma carga de 20%)
Dissolveram-se 4 mg de polilactida (copolímero contendo 50% em peso de d,l-lactida/5Q% em peso de glicolida, massa molecular média em peso 7673, polidispersibilidade 2,59) em 12 ml de diclorometano e colocou-se submetida a condições de uma elevada taxa de corte (homogeneizador Ystral 1500). A esta solução adicionaram-se gota a gota 4 ml de solução aquo-aa de bicarbonato de sódio (20 mg/ml). Adicionaram-se mais 60 ml de água destilada e obteve-se uma fina dispersão branca. Eliminou-se o diclorometano utilizando um evaporador rotativo. Gongelou-se imediatamente a solução num banho de diclorometa-no/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Guardou-se subsequentemente este sal de sódio do polímero sob vácuo à tempje ratura ambiente.
Dispersaram-se 160,31 mg do sal de sódio do polí- - 90 - mero em 2 ml de água destilada. Diluíram-se 4»396 ml de uma s£ lução aquosa de PEG 5000 (Met”1, Ser17,27) G-CSF hu (9,1 mg/ /ml) até 5 mg/ml e.Qm água destilada e adicionaram-se à suspen são do sal do polímero. Utilizaram-se mais 4 x alíquotas de 0,5 ml de água destilada para lavar o equipamento de vidro. Congelou-se imediatamente a solução em banho de diclorometano/ /gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuida dosamente o pó liofilizado usando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 90°0 e depois moldou-se a esta temperatura para se obter um paralelepípedo com 1 mm de espessura. Cortou -se o paralelepípedo em parcelas pesando aproximadamente 105 mg. Em seguida, colocaram-se as parcelas em frascos de piásti co contendo 2 ml de solução salina tamponizada com fosfato OXOID contendo 0,02% de azida de sódio e armazenaram-se a 37° C. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG 5000 (Met"1, Ser17,27) G-CSF hu por análise de HPLC do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína. ii) Formulação H (contendo 20% de carga de proteína)
Dissolveram-se 4 gramas de polilactida (copolíme-ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicol£ da, massa molecular média em peso 7791,2, polidispersibilida-de 2,65) em 16 ml de diclorometano e submeteu-se a mistura a agitação sob uma elevada taxa de corte (homogeneizador Tstral). A esta solução adicionaram-se gota a gota 4 ml de solução aquo sa de bicarbonato de sódio (20 mg/ml). Adicionaram-se mais 40 ml de água destilada e obteve-se uma fina dispersão branca. E liminou-se o diclorometano usando um evaporador rotativo. Con gelou-se imediatamente a solução em banho de diclorometano/ge lo seco e liofilizou-se durante a noite. Guardou-se subsequen temente esse sal de sódio do polímero sob vácuo à temperatura ambiente.
Dispersaram-se 39,84 mg do sal de sódio do políme ro em 2 ml de água destilada. Adicionaram-se 3,33 ml de uma - 91 -
solução aquosa de PEG 5000 (Ket~\ Ser^’^) G-CSF hu (9 mg/ /ml) à suspensão do sal do polímero. Usaram-se mais 4 x alí-quotas de 0,5 ml de água destilada para lavar o equipamento de vidro. Congelou-se imediatamente a solução em banho de di-elorometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuidadosamente o pó liofilizado usando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 95°C e moldou-se depois a esta temperatura para se obter um paralelepípedo com 1 mm de es pessura. Cortou-se o paralelepípedo em parcelas pesando apro-ximadamente 65 mg. Em seguida, colocaram-se as parcelas em frascos de plástico contendo 2 ml de solução salina tamponiza da com fosfato 0X0ID contendo 0,02% de azida de sódio e guardou-se a 37°C. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG 5000 (Met-1, Ser1^) g-CSF hu por análi se de HP1C do meio e calculou-se a libertação cumulativa da proteína. Na Figura 15, está representada a comparação da libertação cumulativa para as Formulações G e H.
Exemplo Comparativo 5
Libertação contínua a partir de uma composição farmacêutica contendo (Met" , Ser ^) G-CSF sozinho hu
Processo Aquoso
Formulação I (proteína com a carga igual a 20%)
Dissolveram-se 4 gramas de polilactida (copolíme-ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli da, massa molecular média em peso igual a 7791,2, polidisper-sibilidade 2,65), em 16 ml de diclorometano e submeteu-se a mistura a uma operação de mistura com elevada taxa de corte (homogeneizador Istral 1500). 1 esta solução adicionaram-se gota a gota 4 ml de solução aquosa de bicarbonato de sódio (20 mg/ml). Adicionaram-se mais 40 ml de água destilada e obteve-se uma fina dispersão branca. Removeu-se o diclorometano usando um evaporador rotativo. Congelou-se imediatamente a so _ 92 -
lução em banho de diclorometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Guardou-se subsequentemente este sal de sódio do polímero sob vácuo à temperatura ambiente.
Dispersaram-se 160,20 mg do sal de sódio do polímero em 2 ml de água destilada. Diluíram-se 4,000 ml de uma solução aquosa de (Met-\ Ser"^,^') G-OSP hu (10,0 mg/ml) até 5 mg/ml com água destilada e adicionou-se à suspensão do sal do polímero. Utilizaram-se mais 4 x alíquotas de 0,5 ml de á-gua destilada para lavar o equipamento de vidro. Oongelou-se imediatamente a solução em banho de diclorometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuidadosamente o pó liofilizado usando uma prensa hidráulica com placas aqueci das a 95°0 e depois moldou-se a esta temperatura para se obter um paralelepípedo com a espessura de 1 mm. Oortou-se o parale lepípedo em parcelas pesando aproximadamente 81 mg. Em seguida, colocaram-se as parcelas em fras.cos de plástico contendo 2 ml de solução salina tamponizada com fosfato OXOID contendo 0,02% de azida de sódio e guardou-se a 37°0· A intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substitui-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de (Met- , Ser , ) G-CSE hu por análise de HP1C do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína. A libertação cumulativa de proteí na na Formulação I I representada graficamente na figura 16.
Exemplo Comparativo 4
Libertação contínua a partir de uma composição farmacêutica contendo (Met~\ Ser~^*^) G-OSF hu e metil-PEG 5000
Processo Aquoso
Formulação J (Proteína com a carga igual a 20%)
Dissolveram-se 4 gramas de polilactida (copolímero contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli da, massa molecular media em peso 7791,2, polidispersibilida-de 2,65) em 16 ml de diclorometano e colocaram-se num disposi - 93 -
tivo de mistura sob elevado corte (homogeneizador Ystral 1500). A esta solução adicionaram-se gota a gota 4 ml de solução a-quosa de bicarbonato de sódio (20 mg/ml). Adicionaram-se mais 40 ml de água destilada e obteve-se uma fina dispersão branca. Eliminou-se o diclorometano usando um evaporador rotativo. Gon gelou-se imediatamente a solução em banho de diclorometano/ge lo seco e liofilizou-se durante a noite. Guardou-se subsequen temente este sal de sódio do polímero sob vácuo à temperatura ambiente.
Dispersaram-se 119,77 mg do sal de sódio do polímero em 2 ml de água destilada. Diluíram-se 4,000 ml de uma solução aquosa de (Met-^, Ser'^,‘^) G-GSE hu (10,0 mg/ml) até 5 mg/ml com solução aquosa contendo 40,43 mg de metil-PEG 5000 e adicionou-se à suspensão de sal do polímero. Utilizaram -se mais 4 x alíquotãs de 0,5 ml de água destilada para lavar o equipamento de vidro. Gongelou-se imediatamente a solução em banho de diclorometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuidadosamente o pó liofilizado usando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 95°0 e moldou-se depois a esta temperatura para se obter um paralelepípedo com a espessura de 1 mm. Gortou-se o paralelepípedo em parcelas pesando aproximadamente 83 mg. Em seguida, colocaram-se as parcelas em frascos de plástico contendo 2 ml de solução salina tamponizada com fosfato OXOID contendo 0,02% de azida de sódio e guardou-se a 37°0. Em intervalo de tempo regulares, removeu -se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. Determi-nou-se a libertação de (Met~ , Ser * ) G-GSE hu por análise de HP1C do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína. A libertação cumulativa de proteína para a Eormulação J está representada graficamente na Eigura 16.
Exemplo 25
Libertação contínua a partir de uma composição farmacêutica contendo PEG 5000 (Met"1, Glu15, Ser17’27, Ala26’28, Lys30)- - 94 -
G-CSE hu
Processo Aquoso
Formulação K (proteína com carga igual a 20%)
Dissolveram-se 4 gramas de polilactida (copolíme-ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli da, massa molecular média em peso 7.791,2, polidispersibilida de 2,65) em 16 ml de diclorometano e submeteu-se a mistura sob uma elevada taxa de corte (homogeneizador Ystral 1500). A esta solução adicionaram-se gota a gota 4 ml de solução aquosa de bicarbonato de sódio (20 mg/ml). Adicionaram-se mais 40 ml de água destilada e obteve-se uma fina dispersão branca. Eliminou-se o diclorometano utilizando um evaporador rotativo. Oongelou-se imediatamente a solução em banho de diclorometano/ /gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Subsequentemente, guardou-se esta solução de sal de sódio do polímero sob vácuo à temperatura ambiente.
Dispersaram-se 120,8 mg do sal de sódio do políme ro em 2 ml de água destilada. Adicionaram-se 3,733 ml de uma solução aquosa de PEG 5000 (Met-1, Glu15, Ser17»27, Ala26,2S, Dys ) G-OSP hu (10,7 mg/ml) a suspensão do sal do polímero. Utilizaram-se mais 4 x alíquotas de 0,5 ml de água destilada para lavar o equipamento de vidro. Gongelou-se imediatamente a solução em banho de diclorometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuidadosamente o pó liofilizado utilizando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 30°G e, em seguida, moldou-se a esta temperatura para se obter um paralelepípedo com a espessura de 1 mm. Gortou-se o paralelepípedo em parcelas com o peso aproximado de 95 mg. Em seguida, colocaram-se as parcelas em frascos de plástico contendo 2 ml de solução salina tamponizada com fosfato QXOID contendo 0,02% de azida de sódio e guardou-se a 37°G. Em intervalos de tempo regulares, removeu-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG 5000 (Met - 95 -
Glu^, Ser^’2^, Ala2^’28, Lys^°) G-CSF hu por análise de HPLC do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína. A libertação cumulativa de proteína da Formulação K está representada graficamente na Figura 17.
Exemplo 26
Libertação contínua a partir de uma composição farmacêutica contendo PEG 5000 (Met, Arg11, Ser17»^7»68’6^) G-CSP hu“"
Processo Aquoso i) Formulação L (proteína com a carga igual a 20%)
Dissolveram-se 4 gramas de polilactida (copolíme-ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli da, massa molecular média em peso 7791,2, polidispersibilida-de 2,65) em 16 ml de diclorometano e submeteu-se a mistura sob uma elevada taxa de corte (homogeneizador Ystral 1500). A esta solução adicionaram-se gota a gota 4 ml de solução aquosa de bicarbonato de sódio (20 mg/ml). Adicionaram-se mais 40 ml de água destilada e obteve-se uma fina dispersão branca. E liminou-se o diclorometano usando um evaporador rotativo. Con gelou-se imediatamente a solução em banho de diclorometano/ge lo seco e liofilizou-se durante a noite. Subsequentemente, guardou-se este sal de sódio do polímero sob vácuo à tempera tura ambiente.
Dispersaram-se 120,5 mg do sal de sódio do políme ro em 2 ml de água destilada. Adicionaram-se 3,473 ml de uma solução aquosa de PEG 5000 (Met-1, Arg7-^, Ser"*-7 *27 *80 * ^ ) G--OSF hu (11,5 mg/ml) à suspensão do sal de polímero. Utilizaram-se mais 4 x alíquótas de 0,5 ml de água destilada para la var o equipamento de vidro. Congelou-se imediatamente a solução em banho de diclorometano/gelo seco e liofilizou-se duran te a noite. Misturou-se cuidadosamente o pó liofilizado utili zando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 90°G e, em seguida, moldou-se a esta temperatura de maneira a obter-se - 96 -
um paralelepípedo com a espessura de 1 milímetro. Cotou-se o paralelepípedo em parcelas pesando aproximadamente 84 mg. Em seguida, colocaram-se as parcelas em frascos de plástico contendo 2 ml de solução salina tamponizada com fosfato G10ID contendo 0,02% de azida de sódio e guardou-se a 37°C. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituí u-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG 5000 (Met-1, Arg11, Ser17,27,60,65) G-CSE hu por análise de HPIO do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína. A libertação cumulativa de proteína na Formulação 1 es tá representada graficamente na Figura IS.
Exemplo Comparativo 5 libertação contínua a partir de uma composição farmacêutica contendo (Met^/Gla15? Ser·17»27. Ala26,2S. lys50) G-CSF hu sozinho
Processo Aquoso
Formulação M (proteína com a carga igual a 20%)
Dissolveram-se 4 gramas de polilactida (copolíme-ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% en peso de glicoli-da, massa molecular média em peso 7673, polidispersibilidade 2,59) em 12 ml de diclorometano e submeteu-se a condições de agitação com uma elevada taxa de corte (homogeneizador Istral 1500). A esta solução adicionaram-se gota a gota 4 ml de solu ção aquosa de bicarbonato de sódio (20 mg/ml). Adicionaram-se mais 60 ml de água destilada e obteve-se uma fina dispersão branca. Separou-se o diclorometano usando um evaporador rotativo. Congelou-se imediatamente a solução em banho de dicloro metano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Guardou-se subsequentemente este aal de sódio do polímero sob vácuo à temperatura ambiente.
Dispersaram-se 160,98 mg de sal de sódio do polímero em 2 ml de água destilada. Diluíram-se 4,124 ml de uma 97 - solução aquosa de (Met-^, Glu^^, Ser^*^, Ala^*^, Lys^) G-CSF hu (9,7 mg/ml) até 5 mg/ml com água destilada e adicionou-se à suspensão do sal do polímero. Utilizaram-se mais 4 x alíquotas de 0,5 ml de água destilada para lavar o equipamento de vidro. Oongelou-se imediatamente a solução em banho de diclorometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuidadosamente o pó liofilizado usando uma prensa hi dráulica com placas aquecidas a 75°0 e, em seguida, moldou-se a esta temperatura para se obter um paralelepípedo com 1 milí metro de espessura. Gortou-se o paralelepípedo em parcelas pe sando aproximadamente 31 mg. Em seguida, colocaram-se as parcelas em frascos de plástico contendo 2 ml de solução salina tamponizada com fosfato 0X0ID contendo 0,02% de azida de sódio e guardou-se a 37°G. Em intervalos de tempo regulares, re tirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de (Met-\ G-lu"^, Ser^*^, Ala^*^, lys ) G-CSF hu por analise de HPLG do meio e calculou-se a libertação cumulativa de proteína. A libertação cumulativa de proteína na Formulação M está representada graficamente na Fi gura 17.
Exemplo Comparativo 6
Libertação contínua a partir de uma composição farmacêutica contendo (Met~ , Arg1 , Ser1’7*2'7* °» 5) Gr-CSF hu
Formulação N (proteína com a carga igual a 20%)
Dissolveram-se 2 gramas de polilactida (copolíme-ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli-da, massa molecular média em peso 7673, polidispersibilidade 2,59) em 3 ml de diclorometano e submeteu-se a condições de elevado corte (homogeneizador Istrai 1500). A esta solução a-dicionaram-se gota a gota 2 ml de solução aquosa de bicarbona to de sódio (20 mg/ml). Adicionaram-se mais 30 ml de água de£ tilada e obteve-se uma fina dispersão branca. Eliminou-se o diclorometano usando um evaporador rotativo. Gongelou-se ime- - 93 diatamente a solução em banho de diclorometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. G-uardou-se subsequentemente es te sal de sódio do polímero sob vácuo à temperatura ambiente.
Dispersaram-se 159»99 mg do sal de sódio do polímero em 2 ml de água destilada. Diluíram-se 3,933 ml de uma solução aquosa de (Met"”^, Arg^\ G-CSF hu (10,03 mg/ml) ate à concentração de 5 mg/ml com água destilada e adicionou-se á suspensão do sal do polímero. Utilizaram--se mais 4 x alíquótas de 0,5 ml de água destilada para lavar o equipamento de vidro. Gongelou-se imediatamente a solução em banho de diclorometano/gelo seco e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se o pó liofilizado cuidadosamente utilizando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 95°0 e depois moldou-se a esta temperatura para se obter um paralelepípedo com 1 milímetro de espessura. Cortou-se o paralelepípedo em parcelas com o peso aproximado de 31 mg. As parcelas foram en tão colocadas em frascos de plástico contendo 2 ml de solução salina tamponizada com fosfato OXOID contendo 0,02% de azida de sódio e guardou-se a 37°C. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fres “| 1 1 *|Γ7 ΛΠ co. Determinou-se a libertação de (Met~ , Arg , Ser '* '* * 65 ) G-CSF hu por analise de HP1G do meio e calculou-se a libertação acumulada de proteína. A libertação acumulada de pro teína na Formulação N está representada graficamente na Figura 13.
Exemplo 27 libertação contínua de PEG- 5000-calcitonina humana a partir de uma composição farmacêutica A. Processo do Ácido Acético G-lacial (proteína com a carga igual a 5% em peso/peso; liofilizaram-se 396,23 mg de polilactida (copolí-mero contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glico - 99 -
lida, massa molecular média em peso 1ϋ 691, polidispersibili-dade 1,75) em 4 ml de ácido acético glacial isento de anidri-do. Liofilizaram-se 2,955 ml de uma solução aquosa de PEG 5000-calcitonina humana (3,46 mg/ml) e, em seguida, dissolveram-se em mais 2 ml de ácido acético glacial. Misturaram-se as duas soluções e utilizaram-se mais 4 x alíquotas de 1 ml de ácido acético glacial para lavar o equipamento de vidro. Gongelou-se imediatamente a solução deixando-a cair gota a g£ ta em banho de azoto líquido e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuidadosamente o pé liofilizado utilizando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 75°C e, em seguida, submeteu-se a extrusão através de uma abertura de saída de ta manho 16. Cortou-se o produto obtido por extrusão em parcelas pesando aproximadamente 10 mg. Em seguida, colocaram-se as parcelas em frascos de plástico contendo 2 ml de solução de azida de sódio contendo 0,02% em peso/volume em solução salina tamponizada com fosfato OXOID e guardou-se a 37°C, Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e subs-tituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG 5000-calcitonina humana por análise de HPLG do meio e cal culou-se a libertação acumulada de proteína, (veja-se a Tabela 2, mais adiante). B. Processo Aquoso
Dissolveram-se 5 gramas de polilactida (copolíme-ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli. da, massa molecular média em peso jgual a 10 691, polidispersi bilidade 1,75) em 20 ml de diclorometano e submeteu-se a uma operação de agitação sob uma intensa tensão de corte (homoge-neizador Istral 1500), A esta solução adicionaram-se gota a gota 5 ml de uma solução aquosa de bicarbonato de sódio (20 mg/ml). Adicionaram-se mais 50 ml de água destilada e obteve--se uma fina dispersão branca. Eliminou-se em seguida o diclo rometano usando um evaporador rotativo. Congelou-se imediata-. mente a dispersão em banho de diclorometano/gelo seco e liofi 100
lizou-se durante a noite. Subsequentemente, guardou-se este sal de sódio do polímero sob vácuo à temperatura ambiente antes de ser utilizado.
Dispersaram-se 392,62 mg de sal de sódio do polímero em 4 ml de água destilada, liofilizaram-se 2,955 ml de uma solução aquosa de PEG· 5000-calcitonina humana (3,46 mg/ /ml) e depois dissolveu-se em mais 2 ml de água destilada. A-dicionou-se a solução à suspensão e misturou-se. Utilizaram-se mais 4 x alíquotas de í ml de água destilada para lavar o e-quipamento da vidro. Oongelou-se imediatamente a solução deixando-a cair gota a gota em banho de azoto líquido e liofili-zou-se durante a noite. Misturou-se cuidadosamente o pó seco liofilizado usando uma prensa hidráulica com placas aquecidas Q ^ f a 60 0 e depois submeteu-se a extrusao através de uma abertura de saída com o número 16. Cortou-se o material obtido por extrusao em parcelas pesando aproximadamente 10 mg. Em seguida, colocaram-se as parcelas em frascos de plástico contendo 2 ml de solução de azida de sódio contendo 0,02%, em peso/volume de solução salina tamponizada com fosfato OXOID e guardou-se a 37°C. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio a-quoso e substituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG- 5000-calcitonina humana por análise de HP1C do meio e calculou-se a libertação acumulada de proteína ^ve-ja-se a Tabela 2, mais adiante,). TABELA 2
Libertação ”in vitro” de Peptidos (processo G-AA)
Dia Composição A Composição B % acumulada % acumulada 10.9 10.9 10.9 1 15,4 2 15,4 7 15,4 101 -
3 56,5 41,3 16 66,5 57,2 Ma Composição C Composição D % acumulada % acumulada 1 6,9 7,9 2 6,9 7,9 7 6,9 7,9 9 27,9 27,9 16 45,4 31,6 Libertação "in vitro" de Peptidos (Processo Aguoso) Ma Composição A Composição B % acumulada % acumulada 1 20,9 24,7 2 30,5 35,6 7 41,5 57,1 3 51,3 72,3 16 65,0 33,3 Composição 0 Composição D % acumulada % acumulada 1 26,3 20,5 2 32,0 25,2 7 46,6 36,4 3 53,9 42,2 16 60,6 49,9
Exemplo 28
Libertação contínua a partir de uma composiQão farmacêutica contendo calcitonina humana não pegilada 1. Processo do Ácido Acético G-lacial 102 - (proteína ao nível de carga de 5% em peso/peso)
Dissolveram-se 473,5 mg de polilactida (copolíme-ro contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicoli da, massa molecular média em peso 10 691, polidispersibilida-de 1,15) em 4 ml de áddo acético glacial isento de anidrido acético. Dissolveram-se também 25,56 mg de uma preparação lio filizada de calcitonina humana em 2 ml de ácido acético glacial. Misturaram-se as duas soluções e utilizaram-se mais 4 x alíquotas de 2 ml de ácido acético glacial para lavar o equipamento de vidro. Oongelou-se imediatamente a solução deixando-a cair gota a gota em banho de azoto líquido e liofilizou--se durante a noite. Misturou-se o pó liofilizado cuidadosamen te usando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 75°G e depois submeteu-se a extrusão através de uma abertura de saída de tamanho 16. Oortou-se o produto obtido por extrusão em parcelas pesando aproximadamente 10 mg. Em seguida, colocaram -se as parcelas em frascos de plástico contendo 2 ml de uma solução de 0,02% em peso/volume de azida de sódio em solução salina tamponizada com fosfato 0I0ID e guardou-se a 37°G. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e subs tituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de calcitonina humana por análise de HPLG do meio e calculou-se a libertação acumulada de proteína. As análises foram realiza das nos dias 1, 2, 7, 8 e 16 e não se detectou libertação em quantidades significativas durante este período de tempo. B. Processo Aquoso (.proteina ao nível de carga de 5% em peso/peso)
Dissolveram-se 5,0 gramas de polilactida (.copolí-mero contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glico lida, massa molecular média em massa igual a 10 691, polidis-persibilidade 1,75) em 20 ml de diclorometano e submeteu-se a mistura sob condições de elevada tensão de corte (homogeneíza dor Ystral 1500). A esta solução adicionaram-se gota a gota 5 - 103 -
ml de uma solução aquosa de bicarbonato de sódio (20 mg/ml). Ádicionaram-se mais 50 ml de água destilada e obteve-se uma dispersão branca, e fina. Em seguida, eliminou-se o diclorome tano usando um evaporador rotativo. Congelou-se imediatamente a dispersão em banho de diclorometano/gelo seoo e liofilizou- --se durante a noite. Guardou-se subsequentemente este sal de sódio do polímero sob vácuo, à temperatura ambiente antes de se utilizar. Dispersaram-se 4-74,34 mg do sal de sódio do poli mero em 4 ml de água destilada. Dissolveram-se também 25,65 mg de uma preparação liofilizada de calcitonina humana em 2 ml de água destilada. Adicionou-se a solução à suspensão e misturou-se. Utilizaram-se mais 4 x alíquotas de 1 ml de água destilada para lavar o equipamento de vidro. Congelou-se imediatamente a solução deixando-a cair gota a gota em banho de azoto líquido e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuidadosamente o pó liofilizado usando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 55°C e depois submeteu-se a extrusão a través de uma abertura de saída de tamanho 16. Cortou-se o produto obtido por extrusão em parcelas pesando aproximadamen te 10 mg. Em seguida, colocaram-se estas parcelas em frascos de plástico contendo 2 ml de solução a 0,02% em peso/volume de azida de sódio em solução salina tamponizada com fosfato OXOID e guardou-se a 37°C. Em intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco, Determinou-se a libertação de calcitonina humana por análise de HP1C do meio e calculou-se a libertação acumulada de proteína. Realizaram-se análises nos dias 1,2, 7, 8 e 16 e não se detectou uma libertação significativa durante este intervalo de tempo.
Exemplo 29 libertação contínua a partir de uma composição farmacêutica contendo PEG 5000-interleucina-2 (PEG 5000 IL-2)
Processo do Ácido Acético Glacial (Proteína ao nível de carga igual a 20% em peso/peso) - 104 - £cisxvtt’xiwmj»m a-
Dissolveram-se 113,42 mg de polilactida (copolíme ro contendo 50% em peso de d,l-laetida/5Q% em peso de glicoli da, massa molecular média em peso 10 691, polidispersiMlidade 1,75) em 2 ml de acido acético glacial isento de anidrido acé tico. liofilizaram-se 4,38 ml de uma solução aquosa de PEG 5000 11-2 (7,35 mg/ml) e, em seguida, dissolveram-se em mais 1 ml de ácido acético glacial. Misturaram-se as duas soluções e utilizaram-se mais 4 x alíquotas de 0,5 ml de ácido acético glacial para lavar o equipamento de vidro. Gongelou-se imedia tamente a solução deixando-a cair gota a gota em banho de azoto líquido e liofilizou-se durante a noite. Misturou-se cuida dosamente o pé liofilizado usando uma prensa hidráulica com placas aquecidas a 75°C e transformaram-se em parcelas pesando aproximadamente 30 mg. Em seguida, colocaram-se as parcelas em frascos de plástico contendo 2 ml de uma solução conten do 0,02% em peso/volume de azida de sódio em solução salina tamponizada com fosfato 0X0ID e guardou-se a 37°C. Em interva los de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituiu -se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de PEG 5000 11-2 por análise de HP1C do meio e calculou-se a libertação a cumulada de proteína (vega-se a Tabela 3 seguinte). TABELA 3
Libertação "in vitro” de péptido
Dia Composição A Composição B % acumulada % acumulada 1 31,3 37,7 2 41,3 41,1 4 43,9 45,3 8 45,5 47,0 16 46,5 47,7
Exemplo 30 • Libertação contínua a partir de uma composição farmacêutica - 105 -
contendo interleucina-2 não pegilada (IL-2)
Processo do Ácido Acético Glacial (proteína com um nível de carga igual a 20% em peso/peso)
Dissolveram-se 54,9 mg de polilactida (copolímero contendo 50% em peso de d,l-lactida/50% em peso de glicolida, massa molecular media em peso 10 691, polidispersibilidade 1,75) em 4 ml de ácido acético glacial isento de anidrido acé tico. Dissolveram-se também 45,09 mg de uma preparação liofi-lizada de 11-2 em mais 1 ml de ácido acético glacial. Mistura ram-se as duas soluções e utilizaram-se 4 x alíquotas de 0,5 ml de ácido acético glacial para lavar o equipamento de vidro, liofilizou-se imediatamente a solução deixando-a cair gota a gota sobre um banho de azoto líquido e liofilizou-se durante a noite..Misturou-se cuidadosamente o pó liofilizado usando u ma prensa hidráulica com placas aquecidas a S0°G e, em seguida, formaram-se parcelas pesando aproximadamente 30 mg. Sn se guida, colocaram-se as parcelas em frascos de plástico conten do 2 ml de uma solução a 0,02% em peso/volume de azida de sódio em solução salina tamponizada com fosfato OXOID e guardou -se a 37°C. A intervalos de tempo regulares, retirou-se o meio aquoso e substituíu-se por tampão fresco. Determinou-se a libertação de 11-2 por análise de HPIO do meio e calculou-se a libertação acumulada de proteína. Realizaram-se análises nos dias 1, 2, 4, 3 e 16 e nao se detectou qualquer sinal evidente de libertação significativa durante este intervalo de tempo .
Exemplo de Referência 1
Preparação de ÇMet’*'1') G-CSP humano modificado com metil-poli-etileno-glicol 5000 A. Preparação de (Met"1) G-QSF humano a) Preparação de um gene sintético de (Met ~^) G-OSP humano
Concebeu-se uma sequencia de ADN (Pigura 2 e SEQ 106 -
ID is 45) que codifica a sequência de aminoácidos do polipép-tido da figura 2 (G-OSjt humano) de acordo com as seguintes con sideraçoes: 1) Extremidades coesivas de fita simples para permitir a li gação a sítios apropriados de um plasmídio. 2) Uma série de sequências de endonucleases de restrição ao longo do gene para facilitar a subsequente manipulação genética. 3) Godão para acabamento da translação. 4) Codões na extremidade 5' da região de codificação foram normalmente escolhidos para serem ricos em A/T, Escolhe-ram-se normalmente outros codões como preferidos para a expressão em Ξ. ooli.
Construíu~se o gene a partir de dezoito oligonu-c^-eótidos (SEQ ID 12 i _ SEQ ID 12 13) indicados mais adiante na presente memória descritiva.
Preparação de oligonucleótidos
Prepararam-se as sequências de oligonucleótidos indicadas mais adiante na presente memória descritiva num sin tetizador de ADI de Applied Biosystems 330A a partir de 2-cia no-etil-I,I-di-isopropil-fosforamidites protegidos com base de 5’-dimetoxitritilo e de nucleósidos protegidos ligados a suportes de vidro de porosidade controlada numa escala de 0,2 micromole de acordo com os protocolos fornecidos por Applied Biosystems, Inc.,
Gomo variante, as sequências de oligonucleótidos podem preparar-se por métodos manuais como os descritos por Atkinson e Smith em "Oligonucleotids Synthesis, a Praticai Ajd proach” (Μ. T. G-ait, Editor, IRL Press, Oxford, Washington DG, páginas 35 - 31). - 107 -
Pormenorizadamente, a preparação das sequências de oligonucleótidos utilizando o sintetizador de ADN de Appli ed Biosystems 380A efectuou-se procedendo de acordo com a seguinte maneira de proceder.
Cada oligonucleótido, depois da clivagem a partir do suporte sólido e da eliminação de todos os grupos de pro-tecção, foi dissolvido em água (1 ml). Âs soluções do oligonu eleótido (400 mierolitros), adicionou-se uma solução de aceta to de sódio 3 molar (pH 5,6; 40 mierolitros) e etanol (1 ml) e guardaram-se as misturas a -70°C durante vinte horas. Colecta ram-se os precipitados resultantes por centrifugação (13 000 rotações por minuto durante dez minutos) e lavaram-se os pele tes com etanol : água (7:3) (200 mierolitros); em seguida, secaram-se rapidamente em vácuo e dissolveram-se em água (15 mierolitros) e 10 mierolitros de uma mistura de formamida/co-rante (10 mM de 1'IaOH, 0,5 mM de ADTA, 0,01% de azul de bromo-fenol, 0,01% de xileno-cianol, 80% de formamida).
Purificaram-se os oligonucleótidos num gel a 10% de poliacrilamida com solução de Tris-borato 50 mM (pH 8,3) contendo 8,3 M de ureia. Identificaram-se os oligonucleótidos com o comprimento correcto por meio de manchas provocadas por UV (Narang e col., 1979, em "Methods in Enzymology", Vol. 68, páginas 90 - 98) - normalmente a banda mais importante - cortada a partir do gel e electro-eluída em Tris-borato (pH 8,3) 5 mM a 300 mV durante tres a quatro horas. Concentraram-se as soluções aquosas ató cerca de 200 mierolitros por tratamento com, n-butanol (mistura, centrifugação e separação da camada orgânica superior). Precipitaram-se os oligonucleótidos purificados a -70°C durante vinte horas a partir de uma solução 0,3 M de acetato de sódio por adição de etanol (2,5 volumes).
Construção do G-ene
Posforilaram-se oligonucleótidos da 31¾ ID 3P 2 - 108 -
SEQ ID N2 17 (400 pM de cada) (indicados mais adiante na presente memória descritiva) com T4 polinucleótido-quinase (3,6 unidades) durante duas horas a 37°0 em 25 microlitros de uma
•Z O solução contendo ATP (800 pM contendo 25 pH de gama-9 p ATP), 100 micromolar de espermidina, 20 mH de MgClg, 50 mM de Tris--H01 (pH 9) e 0,1 mM de EDTA. As soluções foram aquecidas a 100 0 durante cinco minutos para terminar as reacçoes; depois misturaram-se aos pares, como se indica na Tabela 1, para se ohterem os duplexes A a I (o ligo nucleó tidos SEQ ID SF2 1 e SEQ ID I2 18 (400 mM em 25 microlitros) foram usados não fosfori-lados). Adicionou-se acetato de sódio 0,3 molar (pH 5,6; 200 microlitros) e etanol (350 microlitros) e os duplexes foram precipitados a -20°C durante vinte horas. Oolectaram-se os precipitados resultantes por centrifugação e lavaram-se com etanol : água (7 : 3) e depois dissolveram-se em água (50 microlitros). Temperaram-se os pares de oligonucleótidos conjun tamente aquecendo primeiramente as soluções a 100°C durante dois minutos em banho-maria em ebulição. Em seguida, deixou-se arrefecer lentamente o banho atl 40°C (cerca de quatro horas). Gombinaram-se as soluções que contêm três pares de duplexes como se indica (veja-se a Tabela 1) para se obterem os grupos I a III, liofilizaram-se e dissolveram-se em 30 microlitros de uma solução contendo T4-ADH--ligase (1 unidade; BRL), 50 mM de Tris (pH 7,6), 10 mH de cloreto de magnésio, 5% (em peso/-volume) de PEG 8000, 1 mH de ATP, 1 mH de DTT. (BRL, Pocus, Vol. 8 Μ2 1, Inverno de 1936) e ligou-se o ADN a 30°G durante cinco minutos, seguidos de vinte horas a 16°G. Adicionou-se acetato de sódio 3 molar (20 microlitros) e água (150 microli tros) e precipitou-se o produto por adição de etanol (750 microlitros ) e arrefecimento a -20°G durante vinte horas. Cole£ tou-se o precipitado por centrifugação e lavou-se com etanol (1 ml) e, em seguida, dissolveu-se em água (15 microlitros) e mistura de formamida/corante (10 microlitros) e purificou-se num gel contendo 10% de poliacrilamida 50 mM de Tris-borato (pH 3,3), 1 mM de EDTA e 8,3 M de ureia. Identificaram-se as bandas resultantes de fitas com os comprimentos apropriados 109 -
(173 - 136 bases) por auto-radiografia e isolaram-se conjunta mente por eleetro-eluição a partir de uma única, camada de gel, como se descreveu acima para as sequendas de oligonucleótidos individuais. Recozeram-se as fitas de ADI aquecendo primeiramente uma solução aquosa (50 microlitros) a 100°G durante dois minutos, e depois deixando arrefecer até 40°C. durante cerca de quatro horas, ligaram-se os grupos I, II e III uns com os outros essencialmente como se descreveu para a prepara,çao do grupo para se obter como produto a sequência genética representada na Eigura S. Depois da precipitação, fosforilou-se o gene com ’T4-poli-nucleótido-quinase como se descreveu ante-riormente para os oligonucleótidos individuais e depois dissolveu-se em água (20 microlitros). ΪΑΒΕ1Α 1
DUPLEX OLIGOMJGLEÕTIDOS NÚMERO DE BASES NA
EI IA SUPERIOR EliA INEERIQR A SEQ ID N2 1 + SEQ ID NS 2 62 64 B SEQ ID Ns 5 + SEQ ID NS 4 60 60 0 SEQ ID m 5 + SEQ ID NS 6 43 51 D SEQ ID N2 7 + SEQ ID NS 3 63 60 E SEQ ID NS 9 + SEQ ID NS 10 63 63 E SEQ ID NS 11 + SEQ ID NS 12 60 63 G SEQ ID NS 13 + SEQ ID NS 14 63 60 H SEQ ID NS 15 + SEQ ID NS 16 60 60 I SEQ ID NS 17 ' + SEQ ID NS 13 55 53 I A + B · 0 170 175 II D + E + E 186 136 III G + H · t· I 173 173 ) Clonação do gene sintético para (Met“ ’*)-G-CS E humana
Clonou-se o gene sintético acima descrito no vec-tor de plasmídio pSIPl (Windass e col,, Nucleic Acids Re. 110
(1983), Vol. 10, página 6639).
Para a preparação do vector, dissolveram-se 10 mi crogramas de STP1 em água (37>5 microlitros) e tampão de restrição diluído 10 x (4,5 microlitros) (BOI). Adicionou-se a endonuclease de restrição Sall (3 microlitros) (BG1, 3 unida-des/microlitros) e incubou-se a mistura a 37°0 durante uma h£ ra até que o pla.smídio linearizado fosse predominante sobre as formas super-helicoidais e circulares entalhadas. Precipitou-se o ADR com etanol a 4°C durante trinta minutos, lavou-se com etanol : água (7 : 3) e, depois, dissolveu-se em água (39,5 microlitros), com tampão H diluído 10 x (4,5 microlitros) (BOL). Adicionou-se a endonuclease de restrição EcoRI (1 microlitro) (BOI, 90 unidades/microlitro) e incubou-se a mistura a 37°C durante uma hora até ser predominante o fragmento de grandes dimensões EcoRI-SalI. Precipitou-se o ADN a -20°C durante vinte horas, lavou-se com etanol : água (7 : 3) e, em seguida, dissolveu-se em água (20 microlitros).
Purificou-se o fragmento de grandes dimensões Eco-Rl-Sall em gel de agarose preparativo a 1% e electro-eluíu-se e precipitou-se como se descreveu antes e depois dissolveu-se em água (20 microlitros). Para a ligação do gene sintético, incubou-se a 16°C durante quatro horas uma mistura do AM veç tor (2 microlitros da solução do fragmento EcoRI-SalI), gene sintético (5 microlitros da solução aquosa anteriormente descrita), 5 x tampão de ligase (6 microlitros - 250 mM de Tris, pH 7,6, 50 mM de MgClg, 25% em peso/volume de PEG· 3000, 5 mM de ATP, 5 mM de DTT exBRI, água (15 microlitros) e 14-AM-ligase (2 microlitros, 1 U/microlitro). Usou-se directamente a mistura de AM (ou 1 microlitro de mistura de ligação pura ou 2 microlitros de mistura de ligação diluída 5 x com água) para transformar a estirpe HB101 de E. coli. Adicionou-se a mis tura de ADR (1 ou 2 microlitros) às células HB101 competentes de E. coli (20 microlitros, BRI) á gelo e incubou-se a mistu-. ra em gelo durante quarenta e cinco minutos e, em seguida, a- 111 -
queceu-se com choque térmico a 42°C durante quarenta e cinco segundos. Depois de dois minutos em gelo, adicionaram-se 100 microlitros de tampão SOC (bactotriptona 2%; extracto de leve dura 0,5%; NaCl 10 mm; KOI 2,5 mm; Mgd2, MgSO 20 mm (10 mm de cada um); glucose 20 mm) e incubou-se a mistura a 37 0 durante uma hora. Placaram-se alíquotas da suspensão em placas 1 com 50 microlitros/mililitro de ampicilina. Seleccionaram-se os transformantes relativamente a presença do gene sintético clonado por análise de hibridização de colónias utilizando mé todos padrão descritos em "Molecular Gloning i a laboratory Manual", por Maniatis e col., (Gold Spring Harbor) e no Pedido de Patente de Invenção Britânica Humero 3502605. Passou-se para filtros um total de cem colónias (Schleicher e Schuell), desenvolveram-se a 37°C durante vinte horas, lisou-se e cozeu -se. Hibridizou-se o filtro durante vinte horas a 65°C com u-ma amostra radioactiva preparada a partir da sequência de oli gonucleótidos SBQ ID 12 i (veja-se a presente memória descritiva mais adiante), utilizando um estojo de marcação aleatória (Pharmacia). Desenvolveram-se cinco colónias 1-5 que o-riginam sinal de hibridização positivo no caldo L a 37°0 durante vinte horas em escala pequena (100 microlitros) e plas-mídio de ADN preparado por centrifugação no gradiente de clore to de césio essencialmente como se descreve em "Molecular Cl£ ning s a laboratory Manual" por Maniatis e col. (Gold Spring Harbor).
Sequenciou-se o ADH pelo método padrão de acabamento da cadeia didesoxidada, como é descrito por Sanger e col., em Proc. Hat. Acad. Sei. USA 74, 5463 - 5467 (1977)» u-sando um estojo Sequenase (marca registada) (United States Biochemical Corporation). Utilizaram-se os oligonucleótidos SEQ ID H2 19 e SEQ ID IP 23 (veja-se mais adiante na presente memória descritiva) como primários de sequenciamento. 112 - TABELA 2 Oódigo SEQ ID 10 19 SEQ ID NS 20 SEQ ID N2 21 SEQ ID Ifl 22 SEQ ID m 23 Sítio de primagem 214 - 234 da fita superior 333 - 353 da fita superior 375 - 395 da fita inferior 207 - 227 da fita inferior 69 - 93 da fita inferior 0 plasmídio de ADI do clone 5 continha a sequência de ÁDI representada na Eigura 6. Utilizou-se o plasmídio (pAG-33) para transformar células competentes das estirpes de E. coli por meio de procedimentos padrao: HB101 CGSC 6300 (daqui por diante na presente memória descritiva também designado por MSD 522).
As estirpes HB101 e MSD 522 de E. coli estão livremente à disposição. Assim, por exemplo, podem ser obtidas a partir do E. coli Genetic Stock Centre, Universidade de Ya-le, Estados Unidos da América. Além disso, a estirpe HB101 de Ξ. coli pode adicionalmente ser obtida, por exemplo, a partir de BRC fornecido por GIBCO Limited (Unit 4, Cowley Mi11 Tra-ding Estate, Longbridge Way, Uxbridge UB8 2YG, Middlesex, Inglaterra) ou de GIBCO Laboratories, Life Technologies, Inc., 3175 Staley Road, Grand Island, NY 14072, Estados Unidos da América. c) Olonação do gene para (r-let"1) G-CSE humano num vector de expressão clonou-se 0 gene acima descrito no plasmídio pICI0020 como se descreve no Exemplo de Referência 3 (c), para se obter 0 plasmídio de expressão pICI1056. - 113 -
d) fermentação
Transformou-se o plasmídio e efectuou-se a fermen tação como se descreveu no Exemplo de Referência 3 e) para se conseguir a expressão de (I-íet-1 J G-GSE humano. e) Purificação A purificação efectuou-se como se descreveu no s_e gundo procedimento de purificação desenvolvido para se obterem maiores quantidades de (Het“^) G-GSE hu descrito nas pági nas 48 e 49 da Publicação da Patente PCT da Organização Mundial da Propriedade Industrial Numero WO 87/01132, sendo a diá lise final efectuada contra solução salina tamponizada com fos fato. B. Preparação de (Met-1) G-GSE hu modificado com metil-poli-etileno-glicol-5000
Concentrou-se uma solução de (Met-1) G-GSE hu (300 mg), preparada como se descreveu na alínea A acima referida, de maneira a obter-se 8 mg/ml mediante ultrafiltração contra acetato de sódio 20 mM, e cloreto de sódio 37 mM de pH 5,4, através de uma membrana Amicon IM10 (corte de massa mole cular igual a 10 KDa). A esta solução, adicionou-se um volume igual de borato de sódio 0,8 M de pH 8,8, seguida de carbonato de metil-polietilenoglicol-p-nitrofenilo com a massa molecular aproximadamente igual a 5 000 (Sigma Chemical 00. Ltd.) (100 equivalentes por mole de (Met“^) G-GSE hu dissolvida em água. Deixou-se prosseguir a reacção a 20°C durante três horas com ligeira agitação e interrompeu-se por adição de clori drato de etanolamina 1 M de pH 8,0 (10 equivalentes por mole de metil-polietileno-glicol activado). Ajustou-se imediatamen te a mistura reaccional a pH 5,4 por titulação com ácido acético 1 M e diluíu-se até perfazer 500 ml com solução 20 mM de • acetato de sódio, 100 mM de NaCl, de pH 5,4· Submeteu-se a - 114 -
mistura a filtração com diálise contra lOMitros do mesmo tam pão usando um sistema de cartucho em espiral Amicon CH2A-1S adaptado com uma memhrana SIY30 (massa molecular de corte 30 EDa), até deixar de ser visível a presença de p-nitrofenol ama relo no líquido retido. Ooncentrou-se o líquido retido até cerca de 300 ml e colocou-se numa célula Amicon 3400 agitada, com uma memhrana YM30 (30 EDa de corte). 0 líquido retido foi concentrado até 50 ml e diluído até 300 ml com solução 20 mM de acetato de sódio e 100 mH de UaOl, pH 5,4. Repetiu-se quatro vezes esta maneira de proceder e concentrou-se finalmente o produto até cerca de 25 ml. Submeteu-se a cromatogra,fia este concentrado numa coluna (5 x 90 centímetros) de Ultrogel AcA54 equilibrada com acetato de sódio 20 mM e 100 mM de NaCl de pH 5,4. Identificaram-se as fracções que contém a proteína modificada controlando a proteína a 230 nm e o metil-polieti-lenoglicol por titulação com iodo/iodeto de potássio (CR Acad. Sei. Paris 274, 1617, 1972), reuniram-se e dialisou-se exausti. vamente com água. Goncentrou-se o produto final até uma concentração maior do que 11,5 mg/ml por ultrafiltração numa mem brana Amicon YK30, filtrou-se através de um filtro de 0,22 mi crómetro em condições esterilizadas e guardou-se a 4°G para estudos posteriores. 0 ensaio de SDS-PAG-Ξ realizado sobre o produto fi ~ —1 nal modificado mostrou que nao estava presente (Met ) G-CSP hu que não reagira, tendo todo o produto um valor elevado de massa molecular. As titulações dos filtrados e dos‘ líquidos retidos com iodo/iodeto de potássio mostrou que a diafiltra-ção repetida a pH 5,4 numa membrana 17130 (massa molecular de corte 30 EDa) efectivamente removeu todo o metil-polietileno--glicol não ligado a proteína. 0 produto final continha cerca de 4 moles de metil-polietileno-glicol covalentemente ligado por mole de proteína. A actividade específica do derivado não modificado, 0,8 x 10^ U/mg, desceu para 0,2 x 10^ U/mg (25%) no produto modificado. 0 produto obtido era completamente estável e não apresentava alteração na actividade específica na - 115 -
solução até 10 mg/ml (de proteína) a 37° C durante catorze dias.
Neste Exemplo de Referencia, o pH da solução de (Met *") G-CSE hu é cuidadosamente controlado antes da pegila-ção a fim de evitar ou de pelo menos minimizar a dimerização.
Exemplo de Referencia 2
Preparação de (Met ^~) G-CSF humano modificado com metil-poli-etileno-glicol 5000
Repetiu-se o Exemplo de Referencia 1, com a diferença de se ter efectuado a purificação de (Met*"^) G-CSP hu procedendo como se descreve seguidamente.
Submeteu-se a lise pasta de células congelada (500 gramas) e separou-se a fracção do pelete bruto, lavou-se e solubilizou-se como se descreve no Exemplo de Referência 4 (veja-se mais adiante na presente memória, descritiva). Clari-ficou-se o extracto solúvel de sarcosilo por centrifugação a 30 000 rotaçoes por minuto durante trinta minutos. A 1 litro de sobrenadante adicionou-se gota a gota 1 litro de acetona, com agitação a 4°0. Golectou-se a proteína precipitada ao fim de dez minutos por centrifugação a 15 000 x g durante trinta minutos e rejeitou-se o sobrenadante. Ressolubilizou-se o pelete em acetato de sódio 40 mM, cl£ ridrato de guanidina 6 M, pH 4,0 (500 ml), utilizando um homo geneizador Polytron 1110-35 equipado com uma sonda de PTA 20 e deixou-se agitar durante uma hora a 4°G antes de se realizar a diálise exaustiva num tubo de colódio (Spectrapor, massa molecular de corte 6-8 KDa) contra acetato de sódio 20 mil, pH 5,4. Separou-se a proteína precipitada a 15 000 x g du rante trinta minutos e carregou-se o.sobrenadante numa coluna de 50 ml de CM-celulose (vvhatman CM52) equilibrada com aceta- 116 -
to de sodio 20 mM de pH 5,4· Lavou-se a coluna com o mesmo tam pão até que o e-Luen'fce diminuiu até à linha de base, d_e pois lavou-se com quatro volumes da coluna de solução de aceta to de sódio 20 mH de pH 5,4 contendo 20 mM de laOl. fíluíu-se a fracção do produto que contém (Met"1; G-OSE hu por meio de NaOl 37 mi»; em acetato de sódio 20 mM, pH 5,4, reuniram-se as fracções e ou se modificou imediatamente com metil-polietile-no-glicol 5000 ou guardou-se a -20°G até serem necessárias pa ra estudos posteriores.
Exemplo de Referencia 3 ~ —1 17 27
Preparaçao de (Met , Ser * ) G-CSE Modificado humano com metil-polietileno-glicol 5000 A. Preparação de (Met~~*~, Ser^*^) G-GSff humano
Repetiu-se a maneira de proceder descritas nas fa ses A. a) e A. b) do Exemplo de Referência 1, fazendo as seguintes modificações.
Os oligonucleótidos das SEQ ID NQ 24, 25, 26 e 27 (como se pormenoriza mais adiante na presente memória descritiva) substituem as SEQ ID IP 1, 2, 3 e 4, respectivamente. Ί Ί 7 97 c) Clonação do gene da (Met" , Ser * ') G-GSE humano num vector de expressão
Olonou-se 0 gene acima descrito (veja-se a Eigura 3) no plasmídio vector pICI0020. Este vector é um plasmídio baseado em pET153 em que a região de 651 bp EcoRI-AccI é subis tituída por um fragmento de 167 bp EcoRI-Clal, que consiste em 1) um promotor trp de E. coli sintético e um sítio de ligação de ribossoma líder trp; 2) um codão de iniciação da translação; - 117 -
3) uma sequência de reconhecimento de enzima de restrição múltipla derivada de Í!13mpl8, contendo sítios para Ehpl, BamHI, Xbal, Sall, PstI, Sphl e HindIII; 4) uma sequência de terminação da transcrição sintética. A sequência de ADI desta região está representada esquematicamente na Figura 1 (veja-se também SEQ ID IP 44).
Digeriu-se o vector de expressão pIGI0020 completamente com Knpl (BG1) em 10 mM de Tris HG1 (pH 7,5), 10 mM de cloreto de magnésio. Precipitou-se ο ADI com etanol a -20° G a partir de uma solução que contém acetato de sódio 0,3 molar e, em seguida, removeram-se as extremidades 3’ pegajosas por tratamento com T4-ADI-polimerase durante dez minutos a 37°G como se indica em seguida ADI (1 tfg) em água (16 μΐ)
Tampão T4 polimerase diluído 10 x (2 μΐ) 0,33M Tris acetato pH 7>9 0,1 H de acetato de magnésio Ο,ββ M acetato de potássio 5 mM ditiotreitol 1 mg/ml albumina de soro bovino BSA PSITAX fracção V) 2 mM mistura dlTB (1 μΐ) T4 ADI polimerase (1 μΐ; 2,5 unidades/pl BCL)
Adicionou-se água (80 microlitros) e extraíu-se a mistura com fenol/clorofórmio (100 microlitros) e, em seguida, com clorofórmio (100 microlitros). Precipitou-se o ADI com e-tanol (250 microlitros) a -20°0 depois da adição de acetato de sódio 3 M (10 microlitros) e depois digeriu-se completamen te com Sall (BGL) em 150 mM de laGl, 10 mM de MgCl^ e 10 mM de Tris-HCl (pH 7,5). Purificou-se 0 Enp insensível terminado para 0 vector Sall num gel de agarose a 0,7% e isolou-se utilizando Geneclean (marca registada), seguindo a maneira de proceder recomendada pelo fabricante (BiolOl, Estados Unidos 118 -
da América).
Isolou-se o gene sintético a partir de vectores pSTPl procedendo da seguinte maneira: digeriram-se os vecto-res com Seal e Sall (ambos fornecidos por BCL) em laCl 100 mm, íigGlg 10 mM e Tris-HOl 10 mM (pH 7,.5)- Purificou-se o fragmen to de 530 pb a partir de gel de agarose a 0,7% e isolou-se com utilização de Geneclean (marca registada) seguindo a reco mendações do fabricante (BiolOl).
Para a ligação, incubou-se a 16°G durante vinte horas uma mistura constituída pelo fragmento do gene Scal--SalX (50 ng) e pelo fragmento do vector pIGXG020 (100 ng) em 20 micro litros de uma solução que contém Tris-HCl 50 mM (plí 7,6), MgOlg 10 mM, ATP 1 mM, DTT 1 mí-í, 5% em peso/volume de PEG· 3000 e T4 AM ligase (duas unidades; BRL). Utilizou-se a mistura, resultante para transformar células competentes da es tirpe ΕΒ101 de E. coli (fornecidas por BRL), como se descreve na presente memória descritiva. Seleccionaram-se transforman-tes por desenvolvimento em placas de agar contendo 50 microli tros/mililitro de ampicilina e seleccionaram-se relativamente à presença do gene por hibridização de colonias com uma amos- 32 tra marcada com p XD IP 24), como se descreve na pre sente memória descritiva. Preparou-se o plasmídio de ABI a par tir de seis colónias que se hibridizam positivamente, purificou-se por centrifugação com um gradiente de cloreto de césio e confirma-se a sequência por sequenciamento de didesóxi, como se descreve na presente memória descritiva. 0 plasmídio que contém este gene foi designado pICXIOSO. d)
Subclonação de uma cassete de expressão contendo um gene para (Het"1, Ser17,27) G-OSE em M13mpl3
Efectuou-se a subclonaçao seguinte para proporcÍ£ - 119 -
nar um ponto de partida para a preparação dos derivados de G--031% pormenorizados nos Exemplos de Referencia 7 e 3.
Digeriu-se o plasmídio de ADIí de pIGUOSO (purifi cado por centrifugação de densidade com cloreto de césio) com pletamente com EcoRI e Sall (BOI) de acordo com as instruções do fabricante. Isolou-se o fragmento de pequenas dimensões EcoRI-SalI contendo o promotor trp e isolou-se o gene (Met“^, Ser ’ ) G-C8E a partir de gel contendo 0,7% de agarose por utilização de Geneclean (marca registada). Glonou-se este fragmento no vector M13mpl8 cortado com EcoRI-SalI (ADR forne eido por Amersham International; enzimas fornecidas por BGL). Ligaram-se os fragmentos conjuntamente em 5 tampão de ligação BRL utilizando BRL 14 ADR ligase (como se descreveu anterior-mente). Utilizou-se a mistura de ligação para transfectar células TG-1 de Έ. coli competentes (tornadas competentes de a-cordo com o método de cloreto de cálcio de Mandei e Higa, des crito em Molecular Gloning : a laboratory Manual - Maniatis e col., Gold Spring Harbor). Suspenderam-se as células transfec tadas em agar com TI no topo contendo 2% de X-G-al em DMP e 200 microlitros de células de B. coli TG-1 na fase de desenvol vimento logarítmico e placaram-se em 2 x placas de agar TX (TI agar do topo - 3 gramas de bactotriptona, 5 gramas de ex-tracto de levedura, 5 gramas de cloreto de sódio, 3,75 gramas de bacto-agar em 500 microlitros de HgO; placas de TI - 3 gra mas de bactotriptona, 5 gramas de extracto de levedura, 5 gra mas de cloreto de sódio, 7,5 gramas de bacto-agar em 500 ml de HgO estéril).
Picaram-se quatro placas brancas para 4 x 2 ml de células TG-1 de E, coli a 1% em caldo de TI (3 gramas de bactc) triptona, 5 gramas de extracto de levedura e 5 gramas de cloreto de sódio em 500 ml de água esterilizada) e desenvolveram -se durante seis horas a 37°G. Subdividiram-se as culturas de 2 ml em partes alíquotas de 0,5 ml e 1,5 ml. As bactérias fo-* ram separadas por centrifugação numa microcentrífuga Eppendorf - 120 -
(marca registada) e transferiram-se os líquidos sobrenadantes para tubos de Eppendorf (marca regista.da) estéreis. Guardaram -se as alíquotas de 0,5 ml a -20°0 como reserva de fagos. As alíquotas de 1,5 ml foram usadas para preparar AM de cinta ú nica segundo o método descrito no manual de sequenciamento de Amersham International M13 (veja-se mais adiante). Estas amos tras de AM foram então sequenciadas utilizando oligonucleoti dos SEQ ID US 22, SEQ ID iís 23 e o primário de sequenciamento M13 Universal. As reacções realizaram-se usando o estojo Se-quenase (marca registada) de acordo com as instruções do fabricante. Todos os quatro clones tinham a sequência de ABN correcta para (Ser^*^) G-GSP.
Preparação em larga escala de ABE de fita única
Para as preparações de AM de fita única que compreendem entre 200 e 500 microgramas de ADI/ml, utilizou-se o método descrito em "Oligonucleotide Birected Mutagenesis” da Amersham International. Uma maneira de proceder pormenorizada consiste em efectuar as seguintes operações. PEEPARAQlO DE ADN DE PITA MIGA EM GRAEDE ESCALA A. Preparação de 1 ml de solução de armazenagem de fagos 1. Pica-se uma única colónia de TG1 E, coli de uma placa com meio de glucose mínimo. Desenvolve-se durante a noite em 10 ml de meio de TI diluído 2 x e agita-se a 37°C. Adicionam-se 10 microlfros a 20 ml de meio fresco e saco de-se a 37°Q durante tres horas. 2. Inocula-se 1 ml meio de TY di luí do 2 x num tubo de cultura esterilizado, de 10 ml, com 100 niorolitros da cultu ra durante tris horas proveniente da operação 1. 3. Inocula-se a cultura de 1 ml numa placa, recombinante. 121 -
4. Incuta-se durante quatro boras com sacudimento a 37°C. Transfere-se para um tubo de microcentrifugagão. 5. Oentrifuga-se durante cinco minutos à temperatura ambien te. Despeja-se o líquido sobrenadante para um tubo fresco G-uarda-se durante a noite a 4°G. Estabelece-se a cultura durante a noite de TG-1 E, coli para a fase seguinte. B. Desenvolvimento de 100 ml de cultura de fago 1. Inoculam-se 100 ml de meio de ΤΪ diluído 2 x com 1 ml de cultura TG-1 durante a noite e sacode-se a 37°0 até uma densidade óptica a 500 igual a 0,3. 2. Adiciona-se 1 ml de sobrenadante de fago proveniente de A 5. (acima) à cultura de 100 ml. 3. Incuba-se durante cinco boras com sacudimento a 37°0. Transfere-se para tubos de centrífugas. 4. G'entrifuga-se a 5 000 x g durante trinta minutos a 4°C. 5. Transfere-se o líquido sobrenadante para um tubo de centrífuga limpo. Toma-se o cuidado necessário para não transferir quaisquer células (retém-se a pelete de bacté rias para a preparação de AM RE). 6. Adiciona-se 0,2 volume de 20% em peso/volume de PEG- 6000 em ITaGl 2,5 M ao sobrenadante. Mistura-se bem e, em seguida, deixa-se repousar durante uma hora a 4°0. 7. Oentrifuga-se a 5 000 x g durante vinte minutos a 4°0. Rejeita-se o líquido sobrenadante. S. Oentrifuga-se a 5 000 x g durante cinco minutos e separa -se todo o PEG/lTaCl restante com uma pipeta de Pasteur. 9. Ressuspende-se o pelete de vírus em 500 microlitros de
água (bidéstilada) e transfere-se para um tubo de micro-centrífuga (1,5 ml). 10. Oentrifuga-se durante cinco minutos numa microcentrífuga para separar quaisquer células restantes. Transfere-se o líquido sobrenadante para um tubo de mierocentrifugação £resco, 11. Adicionam-se 200 microlitros de 20% de PEG- em 12,5 M de HaOl ao sobrenadante, mistura-se bem e em seguida deixa--se repousar à temperatura ambiente durante quinze minutos . 12. Centrifuga-se durante cinco minutos e rejeita-se o sobre nadante. 13. Gentrifuga-se durante dois minutos. Removem-se cuidadosa mente todos os vestígios de PEGr/HaCl com uma pipeta de
Pasteur. 14. Ressãspende-se 0 pelete de vírus em 500 microlitros de água bidestilada. 15. Adicionam-se 200 microlitros de fenol saturado com 10 mí! de Tris-HCl, pH 8,0 e 1 mM de EDTA. Agita-se com formação de vortex durante curto intervalo de tempo. 16. Deixa-se repousar o tubo durante quinze minutos à temperatura ambiente. 17· Gentrifuga-se durante três minutos. 18. Transfere-se 0 sobrenadante para um tubo fresco. 19. Repetem-se as operações 15 a 18. 20. Adicionam-se 500 microlitros de clorofórmio e extrai-se a fase aquosa por duas vezes. 21. Juntam-se 50 microlitros de solução 3 M de acetato de só 123 -
dio e 1 ml de etanol absoluto. Mistura-se. 22. Golocam-se em banho de gelo seco e etanol durante vinte minutos. 23. Centrifuga-se durante quinze minutos. 24. lava-se cada pelete com 1 ml de etanol a -20°G. Deita-se fora. 25. Seca-se 0 pelete em vácuo e deixa-se subir a temperatura em 50 microlitros de água bidestilada.
Esta maneira de proceder origina 100 a""200 microgramas de ADI de fita única. e) Fermentação '.Transformou-se pICIlOSO na estirpe ilSD 522 (OG-SG 6300; de E. coli (referida no Exemplo de Referencia IA (b)j e purificam-se os recombinantes resultantes e mantêm-se em gli-cerol como reserva a -80°G.
Retirou-se uma alíquota da cultura de reserva e colocou-se em placas de agar com l-ampicilina para separar as colónias individuais depois do desenvolvimento durante a noite a 37°C. Removeu-se uma colónia única pretendida e ressuspen-deu-se em 10 ml de caldo de l-ampicilina e inocularam-se imediatamente 100 microlitros em cada um dos dez balões de Erlen meyer com a capacidade de 250 ml, contendo 75 ml de caldo de l-ampicilina. Depois de se desenvolver durante dezasseis horas a 37°0 num sacudidor com movimento alternativo, reuniram-se os teores dos balões e utilizaram-se para inocular um fermen-tador que contém 20 litros de meio de desenvolvimento 1GM50. - 124 -
Composição... de LCM50
Pormado por Água Destilada ãil ZH2P04 3,0
HagHPO 6,0
NaOl 0,5
Caseína hidrolisada (Oxoid Ϊ41) 2,0 (íih4)2so4 10,00
Extracto de levedura (Difco) 10,00
Glicerol 35,00 l-Leucina 2,5 1-Treonina 0,9
MgS04. 7H20 0,5
CaCl2. 2H20 0,03
liamina 0,DOS
PeS04/Ácido cítrico 0,94/0,02
Solução de elementos vestigiais (lES) 0,5 ml
Realizaram-se então as fermentações à temperatura de 37°C e a pH controlado por adiçao automatica de solução 6M de hidróxido de sódio de pH 6,7'. 0 ponto de regulação da tensão do oxigénio dissolvido (dOl) foi correspondente a 50% da saturação do ar e foi inicialmente controlado por ajustamento automático da, velocidade do agitador do fermentador. 0 caudal de ar de alimentação do fermentador, inicialmente igual a 20 litros por minuto, corresponde a um volume por volume por minuto (WM), foi aumentado para 50 litros por minuto (2,5 WM) quando a velocidade do agitador do fermentador se aproximou de 30 a 90% do seu máximo. Como a taxa de transferência do o-xiglnio (OTR) dos fermentadores é incapaz de satisfazer a taxa de velocidade da ahsorção de oxigénio (OUR) das bactérias - 125
com uma densidade de células maior do que a correspondente a uma DOç-,-q igual a 50 sob as condições descritas, dOT no fermen tador no caso de densidades de células maiores do que estes valores foi mantida a 50% de saturação de ar restringindo a taxa de absorção de oxigénio pelas bactérias. Isso conseguiu--se formulando o meio de maneira a ficar limitado pelo carbono a uma D0,-,-q igual a 50 e, em seguida fornecendo uma alimen tação da fonte de carbono limitante juntamente com sulfato de amonio e extracto de levedura, com uma taxa que restringiu a taxa de desenvolvimento das bactérias.
Realizaram-se as fermentações durante deza,sseis horas e durante esse tempo retiraram-se amostras para medir a densidade éptica (OD^^q), peso seco das células e a acumulação de G-G8F dentro das células. Mediu-se a acumulação de G--GS3? observando por varrimento geles de SDS-PÁG-E manchados com azul de Goomassie de lisatos das células completos das bactérias amostradas como se conhece na técnica.
Quando OD^q atingiu 25, bombeou-se solução de ca seína hidrolisada (100 g/1 Oxzoid 141) para dentro dos fermen tadores com uma taxa de 1,5 gramas/hora.
Quando a D0,_,_0 atingiu aproximadamente o valor 50» o abastecimento da fonte de carbono à carga de fermentação fi cou exausto originando o rápido aumento de dOI de 50% de satu raçao de ar. Ao atingir-se este momento, bombeou-se para dentro dos fermentadores uma solução de alimentação contendo gli cerol (470 g/1), extracto de levedura (118 g/1) e sulfato de amónio (118 g/1) a uma taxa que fez aumentar e, em seguida, manter o dOT igual a 50% de saturação de ar com o fermentador agitado a cerca de 80% do seu máximo. Depois de cerca de treze a catorze horas, substituíu-se esta alimentação do banho de fermentação por uma segunda alimentação contendo glicerol (715 g/1) e sulfato de amónio (143 g/1) apenas. Manteve-se a alimentação de caseína hidrolisada a um nível de 1,5 gramas/ - 126 -
/litro/hora ao longo de todo o ensaio. Depois de aproximada-mente dezasseis horas, quando o exame microscópico da cultura mostrou a presença de grandes corpos de inclusão dentro da maior parte das células, recolheram-se as bactérias com uma centrífuga Sorvai RC3B (7 Q00 g, trinta minutos, 4°C) e guardaram-se as bactérias congeladas a -S0°0. f) Purificação
Ressuspendeu-se pasta de células congelada (500 gramas) a 4°C em 50 mM de Tris-HCl, 25 mM de SDTA, pH S (5 li tros) usando um homogeneizador Silverson de modelo AXR. Subme teu-se a suspensão a lise fazendo-a passar três vezes através-de um homogeneizador Manton-G-aulin à pressão de 420 quilogra-mas/centímetro quadrado (6 000 psi) e centrifugou-se a 5 000 x x g durante trinta minutos numa centrífuga Sorvall RC3C usando um rotor H6000A. Rejeitou-se o líquido sobrenadante e guar dou-se a fracção do pelete a -20°0 antes da posterior purificação .
Descongelou-se a fracção do pelete (60 a 100 gramas) e ressuspendeu-se em solução de ácido desoxicólico (sal de sódio) a 1% em peso/volume em BDTA 5 mM, ditiotreitol 5 mM, Tris-HCl 50 mlí, pH 9,0 (1200 ml) contendo 1 mg/ml de azida de sódio, utilizando um homogeneizador Polytron com um agitador PTA 20 no ponto de velocidade 5. Misturou-se a suspensão durante trinta minutos à temperatura ambiente e centrifugou-se a 6500 x g durante trinta minutos numa centrífuga Sorvall RC5G usando um rotor G-SA. Rejeitou-se o líquido sobrenadante e tor nou-se a tratar o pelete procedendo da mesma maneira. Em seguida, ressuspendeu-se o pelete duas vezes em água (1 litro) e centrifugou-se a 15 000 x g durante vinte minutos. 0 pelete final contendo corpos de inclusão lavados foi solubilizado em sal de sódio de N-lauroil-sarcosina (Sarkosil) a 2% em peso/ /volume em Tris-HCl 50 mH de pH 8 (150 ml) contendo 1 mg/ml • de azida de sódio. Adicionou-se sulfato de cobre de modo a que - 127 -
a solução fica 20 micromolar e agitou-se a mistura durante de zasseis horas a 20°0, antes de realizar a centrifugação a 30 000 x g durante trinta minutos numa centrífuga Sorvall RC5C usando um rotor SS34· Guardou-se o líquido sobrenadante conten do o derivado a -20°G em volumes alíquotas de 50 ml antes de posterior purificação.
Descongelou-se o derivado solubilizado ^20 mlj e passou-se através de um filtro de 5 micrómetros para retirar qualquer material em partículas. Aplicou-se o filtrado a uma coluna (5 x 90 centímetros) de Ultrogel AcA54 equilibrada com G-lauroil-sarcosina (sal de sódio) a 0,3% em peso/volume em Iris-HCl 50 mM de pH igual a 3,0, contendo 1 mg/ml de azida de sódio a 4°C. Eluíu-se a coluna com 0 mesmo tampão a um cau dal igual a 2,5 ml/minuto e colectaram-se fracções de 10 ml. Reuniram-se as fracções que continham 0 derivado da proteína (aproximadamente 100 ml) e guardaram-se a 4°0.
Combinaram-se as fracções derivadas reunidas provenientes das diversas colunas (300 a 500 ml) e dialisaram-se contra fosfato de sódio 10 mM e cloreto de sódio 150 mM a pH igual a 7>4 (3 a 5 litros) contendo 1 mg/ml de azida de sódio utilizando um aparelho de diafiltração de cartucho em espiral Âmicon CH2A-1S equipado com uma membrana 81Y1Q (10 KDa de cor te). Centrifugou-se 0 líquido retido a 30 000 x g durante trinta minutos numa centrífuga Sorvall RC5C com um rótor SS34 e dialisou-se 0 líquido sobrenadante num tubo de diálise Spec trapor de 6 a 3 KDa de corte durante quarenta horas contra tres mudanças (8 litros/300 mililitros de sobrenadante) de a-cetato de sódio 20 mM e cloreto de sódio 100 mM, pH 5»4, contendo 1 mg/ml de azida de sódio. Separou-se 0 precipitado for mado por centrifugação a 30 000 x g durante trinta minutos e dialisou-se 0 sobrenadante durante vinte a quatro horas contra água contendo 1 mg/ml de azida de sódio, seguida de seten ta e duas horas contra seis mudanças de água. Glarificou-se o líquido retido final por centrifugação a 30 000 x g durante - 123 -
trinta minutos e guardou-se congelado a -20°0 (concentração de proteína igual a cerca de 1 mg/ml) ou a 4°C depois de se liofilizar. Â concentração de N-lauroil-sarcosina (sal de sódio) tinha descido para um valor menor do que 0,001% em peso/ /volume depois da diafiltração e estava a "baixo do limite de detecção (cerca de 0,0001%) do método de rpHPLO usado depois da diálise contra a água. B. Preparação de (iet~^, Ser^7*27) G-OSP hu modificado com metil-propilenoglicol 5000
Preparou-se esta substância como se descreveu no Exemplo de Referência 7. 0 produto final continha cerca de 4,1 moles de metil-polietilenoglicol covalentemente ligado, por mole de proteína. A actividade biológica específica de (Met-^, Ser17,27) G-OSP hu (1,4 x 10^ U/mg) desceu apenas para 2,4 x Q ^ x 10 U/mg (17%) depois da modificação. 0 produto era completamente estável e não apresentou modificação da actividade e_s pecífica em solução até 10 mg/ml (por proteína) em PBS a 37°0 durante catorze dias. Estes resultados são muito semelhantes aos obtidos no Exemplo de Referência 7 e indicam a consistência de resultados obtidos com determinado arranjo de grupos amino.
Exemplo de Referência 4
Preparação de (Het-1, Arg'*'1, ser'*'7,27,^C>,ei!)) g._Qgg humano modificada com metil-propilenoglicol 5000
Repetiu-se a maneira de proceder descrita no Exem pio de Referência 7, com excepção dos seguintes pontos.
Ressuspendeu-se pasta de células congelada (500 gramas) a 4°0 em Tris-HOl 50 mH e EDSA 25 mM de pH 3,0 (5 li- - 129 -
tros) usando um homogeneizador Polytron PT6000. Submeteu-se a suspensão a lise fazendo-a passar três vezes através de um ho o mogeneizador Hanton-G-aulin a 420 kg/cm (6 000 psi) e centri-fugou-se a 5 000 x g durante trinta minutos a 4°C numa centrí fuga Sorvall RC3G equipada com um rotor H6000A. Rejeitou-se o líquido sobrenadante e guardou-se a fracçio do pelete a -20°G antes de posterior purificação.
Descongelou-se a fracção do pelete (200 a 250 gra mas) e ressuspendeu-se em ácido desoxicólico (sal de sódio) a 1% em peso/volume em EDI1! 5 mM, ditiotreitol 5 mM e Iris-HCl 50 mM a pH 9 contendo 1 mg/ml de azida de sódio (3 litros), utilizando um homogeneizador Polytron PI10-35 com um agitador PTA20. Misturou-se a suspensão durante trinta minutos a 20°G e centrifugou-se a 5000 x g durante trinta minutos numa centrífuga Sorvall RC30 que contém um rótor H6000A. Rejeitou-se o líquido sobrenadante e tornou-se a tratar o pelete duas vezes procedendo da mesma maneira. Em seguida, ressuspendeu-se o pelete duas vezes em água (3 litros) e centrifugou-se a 5000 x g durante trinta minutos.
Solubilizou-se o pelete final que contém corpos de inclusão lavados com uma solução de sal de sódio de ií-lau-roil-sarcosina (Sarkosyl) a 2% em peso/volume em iris-HCl 50 mM a pH 8,0 (300 ml) contendo 1 mg/ml de azida de sódio. Adicionou-se sulfato cúprico até à concentração de 20 micromolar e agitou-se a mistura durante dezasseis horas a 20°G antes de efectuar a centrifugação a 30 000 x g numa centrífuga Sorvall RC5C usando um rótor SS34. Purificou-se imediatamente o sobre nadante que contém o derivado e guardou-se a -20°G até ser ne cessário.
Ajustou-se o derivado solubilizado de maneira a que a solução contém 15 mg/ml de proteína total (calculada por ^230^ em solução de Sarcosilo e 2% em peso/volume em íris -HG1 50 mM de pH 8 contendo 1 mg/ml de azida de sódio e fez-se - 130 - passar através de um filtro de 5 micrómetros para remover qualquer material em partículas. Aplicou-se o filtrado em par tes alíquotas parciais de 30 ml a uma coluna (10 x 90 centíme tros) de Sephacryl S200 HR equilibrada com uma solução de Sar cosilo (sal de sódio) contendo 0,3?o em peso/volume em Iris--HC1 50 mM de pH 8,0 contendo 1 mg/ml de azida de sódio a 4°C. Eluíu-se a coluna com o mesmo tampão e com o caudal de 10 ml/ /minuto e colectaram-se fracções de 40 ml. Reuniram-se as fracções que contem o derivado da proteína e guardou-se a 4°0.
Gombinaram-se as fracções derivadas depois de reu nidas, provenientes de diversas experiências de colunas (cerca de 1000 ml) e dialisaram-se contra, 10 litros de fosfato de sódio 10 mM e cloreto de sódio 150 mM, pH 7,4, contendo 1 mg/ /ml de azida de sódio, usando um aparelbo de diafiltração A-micon GH2A-IS equipado com um cartucho de membrana 3ΙΪ10 (10 IÍDa de corte). Centrifugou-se o líquido retido, se necessário a 15 000 x g durante trinta minutos numa centrífuga Sorvall RC5C usando um rótor G-SA e dialisou-se o líquido retido depois de clarificado em tubos de diálise Spectrapor com 6-3 KDa de corte durante vinte e quatro horas contra três mudanças (3 litros/300 mililitros de líquido retido) de acetato de sódio 20 mM e cloreto de sódio 100 mM de pH 5»4 a 4°C. Sepa-rou-se o precipitado que se formou por centrifugação a, 15 000 x g durante trinta minutos e dialisou-se o líquido sobrenadan te durante quarenta, e oito horas contra quatro cargas de água (3 litros/300 ml de sobrenadante). Clarificou-se o líquido re tido final por centrifugação a 15 000 x g durante trinta minu tos e regiilou-se a pH 8 com solução de borato de sódio 0,1 M. uodificou.-se o derivado modificado com metil-polietilenogli-col imediatamente ou guardou-se a -20°C até ser necessário.
Exemplo de Referência 5 ~ 1 17 27
Preparação de (Met , Ser 1’ 1) G-CSR humano modificado com metil-polietilenoglicol 5000 - 131 -
Repetiu-se a maneira de proceder que se descreveu na parte A do Exemplo de Referência 3, com as seguintes excej) ções.
Eosforilou-se o duplex I com 14 polinucleótido--quinase e digeriu-se com MstII (10 unidades) em uma vez de tampão H (BG1; 30 microlitros) durante duas horas a 37°0. A seguir à purificação com etanol, purificou-se o fragmento de EcoRI-MstII de cento e quarenta e três pares de "bases num gel de poliacrilamida a 10% contendo ureia 7 M, iso lado por electro-eluição de uma fatia de gel e recozeram-se as fitas de ÃJM como se descreveu no Exemplo de Referência 1.
Olonou-se o fragmento de EcoRI-MstII sintético a-cima descrito no plasmídio vector pAGr88 descrito no Exemplo de Referência 1. Rara a preparação do vector, digeriu-se pAG68 (10 microgramas) com MstII (20 unidades; BG1) em 1 x tampão H (BCl; 100 microlitros) durante duas horas a 37°C. Erecipitou--se o ADE com etanol a partir de acetato de sódio 0,3 M a -20°C e depois digeriu-se com EcoRI (20 unidades; SCI) em tam pão Η 1 x (BC1; 100 microlitros) durante duas horas a 37°G. A seguir à precipitação com etanol, purificou^se o fragmento EcoRI-MstII em gel com 1% de agarose e usando G-eneclean (marca registada) procedendo como é indicado pelo fabricante (Bio 101, Estados Unidos da América). Realizou-se a ligação do fra_g mento de gene com 143 pb no fragmento de grandes dimensões EcoRI-MstII, como se descreveu no Exemplo de Referência 1 (b).
Confirmaram-se as colónias que contêm o fragmento sintético por selecção com uma amostra radiactiva preparada a partir do oligonucleótido (SEQ ID ES 24) e confirmou-se a sequência correcta por sequenciamento de ADH como se descreveu no Exemplo de Referencia 1. 0 plasmídio que contém o gene para (Met-1, Ser1^*2^) G-GSP foi designado pICIllG7, Clonou-se o gene no vector de expressão pICIGG2G e efectuou-se a purifi - 132 -
cação como se,descreve no Exemplo de Referência 3·
Exemplo de Referência 6
Preparação de G-enes para Derivados de G--GSE Humana por I-luta-génese Dirigida ao Sitio
Utilizou-se o método do fosforotioato de Eckstein e colaboradores : J. W. Taylor e col., ííucleic Acids Re. (1935), Vol páginas 3749 - 3764; J. W. Taylor e col., llucleic Acids Research (1935), Vol. páginas 3765 - 3785; K. Nakamaye e col., Hucleic Acids Re. (1986), Vol. páginas 9679 - 9698; J. R. Sayers e col., ITucleic Acids Re. (1933), Vol. páginas 791 - 302. 0 processo pode realizar-se utilizando um estojo fornecido por Amersham International. 0 método é esquematiza- «S# 4W / do em seguida e incorpora, alterações em relaçao ao método ori ginal tendo em vista a utilização de mais do que um oligonucle otido mutagénico e as temperaturas de incubação para os o ligo nucleótidos com mais de trinta bases de comprimento. 1. Recozimento de Ollgonucleótidos Mutantes de Acordo com o Modelo de ADR de Pita Única
Modelo de ADR de fita única (1 μβ/ρ.1) 5 jul
Oligonucleótido mutagénico fosforilado (1,6 pmol/1 μΐ) 2,5 ^.1
Tampão 1 3,5 μΐ água 6 p.1
Quando se utilizaram simultaneamente dois oligonu cleótidos mutagénicos, adicionaram-se 2,5 microlitros (1,6 pi comoles/1 microlitro) de cada oligonucleótido fosforilado a 5 microlitros do modelo de ADR de fita única (1 micrograma/mi-crolitro) em 3,5 microlitros de tampão 1 e 3,5 microlitros de | água. Quando se utilizaram três oligonucleótidos mutagénicos - 133
adicionaram-se 2,5 microlitros (1,6 picomoles/microlitro) de cada oligonucleotido fosforilado a 5 microlitros de ADU de fita única (1 micrograma/microlitro em 3,5 microlitros de tampão 1 e 1 microlitro de água). Oolocaram-se os ingredientes a cima mencionados num tubo fechado num banho de água a 7Q°U du rante três minutos se o oligonucleotido tinha menos de trinta ba.ses de comprimento ou em banho de água em ebulição se o oli gonucleótido tinha mais de trinta bases de comprimento. Em s_e guida, colocou-se o tubo num banho de água a 37°0 durante trin *fccl minutos. 2. Síntese e ligação de Ei ta de ADI:T Hutante λ mistura reaccional de recozimento adicionaram-se seguintes produtos Solução de i-lgO^ 5 μΐ Mistura de nucleétidos 1 19 μΐ (contém dCIP alfa S) Água 6 μΐ Eragmento de IQenow (6 unidades,) 1.5 μΐ Ϊ4 ADU ligase (5 unidades) 2 μΐ
Colocaram-se os ingredientes acima indicados num
s O banho de agua a 16 C e deixou-se durante a noite. 3. Eliminação de ΑΡΗ de Pita Única (Hão Mutante) Usando Unidades de filtração por Centrifugação Descartáveis 1 mistura reaccional proveniente da operação 2, a dicionaram-sé os seguintes ingredientes: Água 170 microlitros
Solução de NaGl 5 M 30 microlitros A amostra de 250 microlitros foi adicionada à metade superior da unidade de filtração e centrifugada a 1 500 - 134 -
rotações por minuto durante dez minutos à temperatura ambiente numa centrífuga para utilização em bandada, Sorvall RÍT6000B u-sando um rotor oscilante Sorvall H10GGB. A amostra passa atra vós de duas membranas de níirocelulose que ligam o MM de fita única, deixando passar o ADN de fita dupla para o tubo de reco llia colocado por baixo.
Adicionaram-se 100 microlitros de solução 5G0 mM de NaCl e recentrifugou-se durante dez minutos para lavar qual__ quer AM RR que tenha permanecido.
Ao filtrado adicionaram-se os seguintes ingrediei^ tes
Acetato de sódio 3M (pH 6,0) 23 μΐ
Etanol frio (-20°0) 700 μΐ
Colocou-se a mistura em banho de gelo seco e etanol durante vinte minutos e centrifugou-se numa microeentrífu ga Eppendorf durante quinze minutos.
Em seguida, ressuspendeu-se o pelete em 10 microlitros de tampão 2. 4. Entalhe da Rita não Mutante Usando Ncil λ mistura reaccional proveniente da operação 3, a dicionaram-sé 65 microlitros de tampão 3 e 8 unidades de Ecil (1 microlitro). Colocou-se a mistura em banho de água a 37°C durante noventa minutos. 5. Digestão de Exonuclease III Usando Eita não Mutante λ mistura reaccional proveniente da operação 4 aii cionou-se - 135 -
NaCl 500 mil 12 μΐ
Tampão 4 10 μΐ
Exonuclease III (50 unidades) 2 μΐ
Colocou-se a mistura em lanho de água a 37°0 e in cubou-se durante trinta minutos a 37°0; 50 unidades de exonu-clease ΙΙΪ digerem aproximadamente 3 000 bases em trinta minu tos. Em seguida, colocou-se a mistura num banho de água a 70° G durante quinze minutos para inactivar as enzimas. 6. Repolimerização e Ligação do AM com Intervalo A mistura reaccional proveniente da operação 5 a- dicionou-se i-íistura de nucleótidos 2 13 μΐ
Solução de MgCl^ 5 lil ADI polimerase I (4 unidades) 1 μΐ T4 ADI ligase (2,5 unidades) 1 μΐ
Golocou-se a mistura em banho de água a 16°C durante três horas.
7. Transformação de células Hospedeiras de E, o o li TG-1 Competentes com o ADI
Transformaram-se 300 microlitros de células de E. coli TG-l competentes recentemente preparadas (preparadas de a-cordo com o método de Mandei e Higa) com 20 microlitros de mistura reaccional proveniente da operação 6 (em duplicado).
Placaram-se os transformantes num conjunto de células TG-l na fase de desenvolvimento logarítmico em agar supjs rior TY colocado sobre placas de TY e incubou-se durante a noite a 37°G. - 136 -
A estirpe fGl de E. coli é livremente disponível, por exemplo, a partir do E. coli Genetic Stock Centre, Uni ver sidade de Yale, Estados Unidos da América e também de Amersham International plc, Amersham Place, Little Ghalfont, Amersham, Buckinghamshire, Bngland HP7 9NA, Grã-Bretanha, tal como é fornecido no respectivo estojo "in vitro mutagenesis system, oligonucleotide directed" (produto' com o número de código RPN 1523;.
Exemplo de Referencia 7
Preparação de (í-let"1, Arg11, G-GSE Humano Mo dificada com íietil-Polietilenoglicol 5000 A. Preparação de (Het~\ Arg~^\ Ser^*^*^»^ j fl-osp Huma-no
Repetiu-se a maneira de proceder que se descreveu no Exemplo de Referencia 6 usando 0 modelo mutagénico ííl3mpl8 η ηγ p7 _ contendo 0 gene para (í-Iet” , Ser ' * ) G-OSE descrito no Exem pio de Referência 3 ou 5. Os oligonucleótidos mutagénicos uti lizados são designados SEQ ID ITS 2S e SEQ ID Na 29 e são defi nidos mais adiante na presente memória descritiva. 0 tripleto AGG em SEQ 1D Ha 23 serve para transformar Gin na posição 11 em Arg e o primeiro e o último tripleto s AGA em SEQ 1D NS 29 servem para transformar Pro nas po sições 65 e 60 por Ser. Realizou-se a mutagénese como se descreveu no Exemplo de Referência 6 usando SEQ 1D Ns 29 numa ú-nica mutagénese de escorvamento. Esta operação originou uma ú nica placa que incorporava, as alterações Pro 60 Ser e Pro 65 Ser. Preparou-se ADR de fita única a partir desta placa como se descreveu no Exemplo de Referência 6. Este ÂDH foi utiliza do como modelo mutagénico numa mutagénese de escorvamento usan do SEQ 1D NS 28 como primário mutagénico. Este tratamento ori ginou mais do que 100 placas, três das quais foram selecciona • das por sequenciamento de ADN como se descreveu antes. Iodas - 137 -
estas três placas tinham o conjunto completo de alterações in corporado. Preparou-se AM RE de fita dupla a partir de uma das placas seguindo a maneira de proceder para a preparação em grande escala, de ADR de fita única (operação d no Exemplo de Referência 3 ate à operação B5). 0 ADR RE foi extraído a partir do pelete de bactérias pelo procedimento de lise alcalina de acordo com Birnboim e Doly (Rucleic Acids Research (1979) 7, 1513 - 1523) e purificou-se por centrifugação em gradiente de densida.de de cloreto de césio, como se descreve em "Molecular Cloning - a laboratory Manual", por Sambrook, Eritsch e Maniatis (Cold Spring Harbor Publication). 0 ADR Ri’ purificado foi digerido com EcoRI e Sall em tampão H, como se descreveu anteriormente e isolou-se o fragmento de 619 pb contendo o promotor trp, o sítio de ligação de ribossomas, 0 codão de iniciação, da translação e 0 ge -1 17 27 ne que codifica (Met , Ser * ) G-CSi' por meio de um gel de agarose a 0,7% por utilização de Geneclean (marca registada;. Ligou-se 0 fragmento num vector pICI0020 digerido com EcoRI--Sall, usando um excesso 2 ; 1 molar de inserto para vector, com T4 ADR ligase (BRL) e tampão de ligase, essencialmente co mo se descreveu anteriormente. Utilizou-se a mistura de ligação para transformar a estirpe HB101 de E. coli. Selecciona-ram-se os transformantes por desenvolvimento em placas de L--agar contendo 50 micro gramas /ml de arnpicilina. Seleccionaram -se as colónias por meio da presença, de ADR inserido por análise de restrição de ADR de plasmídio preparado pelo método de Birnboim e Doly, como se descreve em "Molecular Gloning « a laboratory Manual" Sambrook, Pritsch e Maniatis (Gold Spring Harbor Publication). Utilizou-se ADR do plasmídio de uma coió nia que contém o inserto de BcoRI-SalI 619 bp esperado para transformar a estirpe MSD522 de E, coli e designou-se pI0I1239* A purificação efectuou-se como se descreveu no Exemplo de Referência 3.
B . Preparação de (hf1· Ara11· g8I17,27,60,65) 6-08 J Huma- - 13S -
no Modificado com Hetil-Propilenoglicol 5000
Fez-se subir o pH de uma solução de (Met Arg^", G-CSF hu (4-18 mg) em água (400 ml) de modo a atingir o valor 8,0 mediante a adição de solução 0,8 K de borato de sódio de pH igual a 8,8 e concentrou-se até 50 ml (8 mg/ml) por ultrafiltração através de uma membrana de Amicon IFilO (massa molecular de corte 10 KDa). Â esta solução adicio nou-se um volume igual de solução 0,8 M de borato de sódio de pH igual a 8,8, seguida de carbonato de metil-propilenoglicol -p-nitrofenilo, com a massa molecular aproximadamente igual a 5 000, Sigma Chemical Co., Itd. (11,3 gramas, 100 equivalentes, 20 equivalentes por grupo amino existente em (Met , Arg , Ser'^,'^,^,^) G-CSF hu dissolvidos em água (100 ml). Deixou -se prosseguir a reacção à temperatura ambiente com uma ligei ra agitação durante três horas e interrompeu-se por adição de cloridrato de etanolamina, pH 8 (10 equivalentes por mole de metil-polietileno-glicol activado). Goncentrou-se a mistura reaccional numa membrana de Amicon IH30 (massa molecular de corte 30 KDa) a 4°C, até um volume final de líquido retido i-gual a 50 ml. Diluíu-se o líquido retido com solução 0,1 M de bicarbonato de amónio de pH 8 (200 ml) e reconcentrou-se até 50 ml como anteriormente por ultrafiltração. Repetiu-se esta maneira de proceder quatro vezes e concentrou-se finalmente o produto até cerca de 25 ml. Cromatografou-se a solução concen trada numa-coluna (5 x 90 cm) de Ultrogel AcA45 equilibrada ccm solução de fosfato de sódio 10 mi-i e de cloreto de sódio 150 mM, pH 7,4, contendo 1 mg/ml de azida de sódio (PBS-azida). I dentificaram-se as fracções que contém a proteína modificada controlando a proteína a 280 nm e o polietilenoglicol por titulação com iodo/iodeto de potássio (0. R. Acad. Sei., Paris 274. 1617, 1972), reuniram-se as fracções e dialisaram-se e-xaustivamente contra água. Concentrou-se 0 produto final por ultrafiltação numa membrana de Amicon 11130 ate uma concentração maior do que 11,5 mg/ml, Filtrou-se através de um filtro de 0,22 micrómetro sob condições estéreis e guardou-se a 4°C - 139 -
para estudos posteriores.
Os cálculos da proteína por análise de aminoácidos depois de hidrólise ácida indicaram uma recuperação global de 51% de ( et”^, Arg"^, Ser‘^,^,^,^() G-CSE hu no produto final modificado. 0 ensaio de PAG-E-SDS da mistura reaccional in dicou a ausência, de (met , nrg , Ser * * 9 j G-GoP hu que não reagiu, passando todo 0 produto como um produto com um elevado valor da massa, molecular. A titulação dos filtrados e dos materiais retidos com iodo/iodeto de potássio mostrou que a ultrafiltração repetida a pH 8 com uma membrana Ϊ130 removeu efectivamente todos os derivados ligados a metil -polietilenoglicol diferentes de proteína. Este facto foi con firmado por cromatografia de exclusão de tamanho numa coluna de "ultrogel AcA54 calibrada subsequentemente com metil-polie-tilenoglicol activado interrompido com etanolamina a qual ser ve de ensaio em branco. A titulação com iodo/iodeto de potássio de (ílet”\ Arg^, Ser"^ ’ ^ ^ ^ ) Gr-CSí1 hu covalentemente ligado a metil-polietilenoglicol combinado com os cálculos da proteína por análise de aminoácidos depois de hidrólise ácida indicou a presença de cerca de 3,9 moles por mole de proteína. A actividade biológica, específica de (liet-" , Arg , Ser'* 9 6G,65j q._0SE hu (1,2 x 10^ U/mg) desceu para 2,2 x 103 U/mg (19?o) depois da modificação com metil-polietilenoglicol. 0 produto era completamente estável e não demonstrou alteração da actividade específica em solução até 10 mg/ml (de proteína) em PBS a 37°C durante catorze dias.
Exemplo de Referência 3
Preparação de (Met"\ G-lu~^, Ser^’^, Ala^*^3, Eys^j G-CSE Humano modificado com Hetil-Polietilenoglicol 50Q0 A. Preparação de (i-Iet~^, G-lu^, Ser^*^, Ala^*^3, hys^j G—GSP Humano a) Repetiu-se a maneira de proceder que se descreveu - 140 -
no Exemplo de Referência 7, utilizando o modelo mutagénico M13mpl3 contendo o gene que codifica (met , Ser * ' ) G-CS3? descrito no Exemplo de Referência 3 ou 5. Os oligonucleótidos mutagénicos utilizados são designados SBQ 1D IP 33 e SEQ 1D N2 34 e são definidos mais adiante na presente memória descri tiva. 0 tripleto TTC em SEQ 1D IP 33 serve para transformar leu na posição 15 em G-lu. Em SEQ 1D IP 34, o primeiro tripleto ΪΪΤ serve para transformar Ala na posição 30 em Lys e os tripletos AGC servem para transformar Gly nas posições 23 e 26 em Ala. A maneira de proceder utilizada na mutagénese foi essencialmente como se descreveu no Exemplo de Referencia 6 como experiência de dupla escorvagem e a cassete de expressão foi transferida para o plasmídio de expressão para se obter ΡΙ0Ι1266. b) Purificação
Submeteu-se a pasta de células congelada a um ensaio de lise e a fracção da pelete bruta foi separada como se descreveu no Exemplo de Referência 3. Os corpos de inclusão existentes no pelete que contém esta proteína foram solubili-zados por meio de tampão de ácido desoxicólico (sa.1 de sódios como se descreveu no Exemplo de Referência 3. Para esta proteína, utilizou-se a seguinte maneira’de proceder modificada.
Descongelou-se a fracção do pelete (60 a 100 gramas) bruto e ressuspendeu-se em solução de EDTA 25 mi-I, Iris--HC1 50 mM, pH 3 (1 200 ml), usando um homogeneizador Poly-tron com um acessório PíOA 20 ao valor de regulação de velocidade 5. Misturou-se a suspensão à temperatura ambiente durante trinta minutos e centrifugou-se a 6 500 x g durante trinta . minutos numa centrífuga Sorvall RG5C usando um rótor GSA. Re- - 141 -
jeitou-se o sobrenadante e voltou a tratar-se o pelete por duas vezes procedendo da mesma maneira. 0 pelete foi em segui, da ressuspenso por duas vezes em água (1 litro) e centrifuga-do como no Exemplo de Referência 3. Em seguida, a maneira de proceder de purificação foi como se descreveu no Exemplo de Referência 3. B. Preparação de (Het G-lu^, Ser^*^, Ala^*^, Lys^) (t-Q3E Humano Modificado com Metil-polietilenoglicol 3000
Preparou-se a solução necessária como se descreveu no Exemplo de Referência 7, utilizando de novo 100 eçuiva lentes molares de reagente, muito embora este derivado contenha um resíduo adicional de lisina na posição 30. 0 produto fi nal continha cerca de 4,7 moles de metil-polietilenoglicol co valentemente ligado por mole de proteína. Este nível de incor poração aumentado é consistente com a presença de um sítio po tencial extra de modificação e reflecte-se num aumento da mas sa molecular no ensaio de PAG-E-SBS. A actividade biológica e_s pecífica do derivado não modificado, 1,2 x 10^ U/mg, desceu para 4,4 x 10 U/mg (3%) no produto modificado. 0 produto era completamente estável e não apresentou alterações de activida de específica em solução até 10 mg/ml (por proteína) em PBS a 37°0 durante catorze dias.
Exemplo de Referência 9
Repetiu-se a maneira de proceder que se descreveu nos Exemplos de Referência 1, 3 e 5, usando B. coli fG-l em vez da estirpe MSB522 de Ξ. coli na operação de fermentação (veja -se o Exemplo de Referência 3 (e)).
Exemplo de Referência 10
Processo de Extracgão Utilizado como Alternativa para CMet \ Arg11, Ser17’217’60’65) G-CSF Humano - 142 -
Repetiu-se o Exemplo de Referência 7» com a diferença de se ter efectuado o processo de extraoção procedendo como se descreve segnidamente.
Ressuspendeu-se pasta de células congelada (640 gramas) a 4°C em Tris-HGl 50 mH, EDTÁ 5 mH, ditiotreitol 5 mH, ureia 2 II, pH 8, contendo 1 mg/ml de azida de sódio (5 litros), usando um homogeneizador Polytron com um acessório PTA2C a u-ma regulação de velocidade de 7/3. Submeteu-se a suspensão a lise fazendo-a passar três vezes através de um homogeneizador de Manton-G-aulin Lab 60/60 a 420 kg/cm (6 000 psi) e lavou--se com mais 1 litro de tampão. Arrefeceu-se utilizando um ar refecedor Oonair de passagem única a -20°G. Centrifugou-se o material submetido a lise a 5 000 x g durante trinta minutos numa centrífuga Sorvall RC3C usando um rótor H6000A.
Rejeitou-se o líquido sobrenadante e ressuspendeu -se o pelete (cerca de 450 gramas) no mesmo tampão (10 litros). Misturou-se a suspensão durante trinta minutos à temperatura ambiente e centrifugou-se a 5 000 rotações por minuto durante trinta minutos em duas centrífugas Sorvall RC3G usando rotores H6000A. Rejeitou-se o líquido sobrenadante e voltou-se a tratar o pelete duas vezes da mesma maneira. Em seguida, ressuspendeu-se o pelete duas vezes em água (10 litros) e centrifugou-se a 5 000 rotações por minuto durante trinta minutos. Ressuspenderam-se os peletes finais contendo corpos de inclusão lavados em sal de sódio de H-lauroil-sarcosina a 2% em pe; so/volume em Tris-HGl 50 mH, pE 3 (1 litro) contendo 1 mg/ml de azida de sódio, utilizando um homogeneizador Polytron no ponto de regulação de velocidade de 7. Adieionou-se solução de sulfato cúprico 20 mH em água (1,5 ml) e agitou-se a mistura durante a noite à temperatura ambiente antes de se proceder à centrifugação a ÍO 000 rotações por minuto durante trinta minutos numa centrífuga Sorvall RC5C usando um rotor G-SA.
Filtrou-se o líquido sobrenadante que contém o de - 143 -
rivado através de um filtro de 5 micrómetros para. remover qual quer matéria em partículas, diluíu-se seis vezes com solução de Tris-HGl 50 míí de pH 8, contendo 1 mg/ml de azida de sódio a 4°0 e ultrafiltrou-se à pressão máxima num dispositivo de ultrafiltração Amicon DC20 dotado com um cartucho S10I10 (10 KDa de corte) contra fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 150 im, pH 7,4 (90 litros), contendo 1 mg/ml de azida de sódio. Formou-se um precipitado perto do fim da ultrafiltração.
Colectou-se o líquido retido (2,1 mg/ml de proteí na total, 1,7 mg/ml de produto) em recipientes de polipropile no com a parte superior enroscada, de 4 litros, e incubou-se durante a noite a 37°0. Separou-se o precipitado que se formou por centrifugação a 5 000 rotações por minuto durante qua renta e cinco minutos numa. centrífuga Sorvall RC3C e guardou--se o sobrenadante a 4°C. 0 controlo por meio dos ensaios de SDS-PAG-E e de rpKPLO mostrou que, durante o tratamento térmico final, as proteínas E. coli que contaminam os oligómeros do produto e os produtos de degradação foram selectivamente precipitados, mantendo-se em solução cerca de 35)o do produto pretendido. A solução obtida como produto tratado termicamente, clarificada e muito enriquecida era completamente biologicamente activa e estável a 20 mg/ml a 37°0 durante duas semanas, sem qualquer evidência de degradação proteolítica e menos do que 20% de precipitação. Obteve-se assim um excelente produto intermediá rio para posterior purificação por crornatografia.
Exemplo de Referência 11
Preparação de (Met"*1, Arg11, Ser1^*2^*^0»^ j G-GSff Humano Usando um vector de Produção que Inclui o Promotor trp a) Digeriu-se plasmídio pI0I1239 (descrito no Exem plo de Referência 7) com EcoRI e Sall em tampão H como se de_s - 144 -
creveu antes. 0 fragmento EcoRI-SalI de pequenas dimensões contendo o promotor trp, o sítio de ligação de ribossornas e gene que codifica (líet” , Arg"^, Ser^7,27,0^,^) Gr-CSF hu, foi isolado por meio de gel de agarose a 0,1% com utilização de Geneclean (marca registada). Preparou-se um fragmento vector a partir de pIGIOOSO (ve;ja-se o Exemplo de Referência 6) por digestão com EcoRI e Xhol em tampão H e isolou-se o fragmento de grandes dimensões EcoRI-Xhol a partir de um gel de agarose a 0,7% com utilização de Geneclean (marca registada). Ligou--se o fragmento EcoRI-SalI de pequenas dimensões no fragmento vector EcoRI-Xhol usando um excesso molar 2 ; 1 entre o inser to e o vector como se descreveu antes e utilizou-se a mistura de ligação para transformar a estirpe MSD522 de B. coli. Se-leccionaram-se transformantes para desenvolver em placascte L--agar contendo tetraciclina (15 microgramas/mililitro). Escolheram-se tris colónias e desenvolveram-se em meio mínimo K9 (75 ml) contendo suplementos e tetraciclina (15 microgramas/ /mililitro) a 37°0 durante vinte horas num agitador com movimento de vai-vém. Mediu-se a acumulação de proteína detectan-do os geles de SDS-PAGB manchados com azul-de-Coomassie de to do o produto da lise das células. Todos os três clones expres saram (Met"1, Arg11, Ser17,27,60,65) G-GSB hu. 0 AJM do plas-mídio de uma das colónias foi designado pIGI1327 e a sequência do promotor e do gene foi confirmada por maneiras de proceder de didesóxi padrão como se descreveu anteriormente. b) Fermentação
Transformou-se o pIGI1327 na estirpe MSD522 de E. coli e purificaram-se os recombinantes resultantes e guardaram -se em reservas de glicerol a -80°0.
Retirou-se da reserva uma alíquota da cultura e aplicou-se em placas de agar contendo tetraciclina para separar as colónias únicas depois de desenvolvimento durante a • noite a 37°C. Removeu-se uma única colónia pretendida e res- - 145 -
suspendeu-se em 10 ml de ca,ldo contendo tetraciclina e inocu-laram-se imediatamente 100 microlitros em cada um de três balões de Erlenmeyer com 250 ml de capacidade contendo 75 ml de caldo de tetraciclina. Depois de desenvolvimento durante dezas seis horas a 37°C num agitador com movimento de vaivém, reuni ram-se os conteúdos dos balões e utilizaram-se para inocular um fermentador contendo 20 litros de meio de desenvolvimento.
Composição do Meio de Desenvolvimento 0 meio de desenvolvimento é constituído por água destilada que contém eh2?o4 gramas/litro 3,0 Ia2HP04 6,0 íTaCl 0,5 Caseína hidrolisada (Oxoid 141) 2,0 (HH4)2S04 10,00 Extracto de levedura (Difco) 10,00 Glicerol 35,00 l-Leucina 0,625 MgS04. 7H20 0,5 CaCl2. 2H20 0,03 liamina 0,008 EeSO^/ácido cítrico 0,04/0,02 Solução de elementos vestigiais (TES) 0,5 ml 1 Tetraciclina 10 mg l"1
ΛΤ H O
Realizaram-se fermentações a temperatura de 37 C e a um valor de pH igual a 6,7, controlado por adição automática de solução de hidróxido de sódio 6 molar. 0 ponto de regulação da tensão de oxigénio dissolvido (dOT) era 50% de saturação com ar e foi inicialmente controlado por ajustamento automático da velocidade do agitador do fermentador. Aumentou , -se o caudal de ar através do fermentador, inicialmente igual - 146 -
a 20 litros/minuto, o que corresponde a um volume por volume por minuto (WM), para 50 litros/minuto (2,5 WM), quando a velocidade do agitador do fermentador se aproximou de 80 a 90% do seu máximo. Como a taxa de transferência de oxigénio (O-UR) dos fermentadores era incapaz de satisfazer a taxa de absorção de oxigénio (OUR) das bactérias com uma densidade de célu las maior do que a que corresponde a uma 1)0^^ igual a 50 sob as condições descritas, manteve-se o dOT no fermentador no ca so de densidad® de células maiores do que esta valor a 50% de saturação de ar restringindo a taxa de absorção de oxigénio das bactérias. Isso conseguiu-se formulando o meio de maneira a ficar limitado em carbono a DO^q igual a 50 e depois forne cendo uma alimentação de fonte de carbono limitante, juntamen te com sulfato de amónio e extracto de levedura, a uma taxa que restringiu a taxa de crescimento das bactérias.
Realizaram-se as fermentações durante dezoito horas e durante este período de tempo retiraram-se amostras para medição da densidade óptica (D0„q), peso seco das células e acumulação de (Met~\ Arg^, Ser '»27,60,65j {j_0SP humano dentro das células. Mediu-se a acumulação de (Met-1, Arg"1"^, ger^>27,60,65^ humano observando os geles de SDS-PAGE manchados canazul de Coomassie dos produtos de lise das células completas das bactérias da amostra, como se sabe na téeni ca.
Quando a DO^^ atingiu o valor de 35 (3,5 horas), bombeou-se solução de produto da hidrólise de caseína (100 gramas/litro; Oxoid 141) para dentro dos fermentadores com um caudal massico igual a 0,75 gramas/litro/hora.
Quando a DO^q atingiu aproximadamente o valor de 50, o abastecimento da fonte de carbono à carga de fermentação ficou exausto, originando o rápido aumento do dOT a partir de 50% de saturação de ar. leste ponto, bombeou-se um líquido de alimentação contendo glicerol (470 gramas/litro), ex - 147 -
tracto de levedura (113 gramas/litro) e sulfato de amónio (113 gramas/litro) para dentro dos fermentadores com um caudal que refazia as necessidades e em seguida mantinha o dOT a 30%> de saturação de ar com o agitador do fermentador a cerca de 70 a 30% do seu máximo. Manteve-se a alimentação do produto de hidrólise da caseína ao caudal mássico de 0,75 gramas/litro /hora. Depois de aproximadamente dezoito horas, quando o exame microscópico da cultura mostrou a presença de grandes corpos de inclusão dentro de uma grande parte das células, c£ lheram-se as bactérias com uma centrífuga Sorvall RC3B (7 000 g, 30 minutos, 4°0) e guardaram-se congeladas a -80°G. c) Purificação
Efectuou-se a purificação como se descreveu no E-xemplo de Referência 3 (f).
Exemplo de Referência 12
Preparação de (Met~\ Arg^, Ser^ ) G-GSF humano u- tilizando -um vector de produção que inclui o promotor 17A3 a) Subclonou-se um fragmento de EcoRI-SalI contendo um promotor T7A3, uma sequência do sítio de ligação do ribos-soma líder trp e um gene para codificar (Met” , Ser y ) G--G3P hu, de modo a obter-se Ív113mpl8, como se descreveu na par te d) do Exemplo de Referencia 3. A sequência do fragmento EcoRI-SalI é apresentada em SEQ ID IP 47 e na Figura 3. A SEQ ID IP 47 consiste no sítio de restrição EcoRI (nucleótidos 1 --6), a sequência do promotor A3 do bacteriófago T7 (nucleóti dos 7 - 52), a sequência do sítio de ligação de ribossomas de trp líder (nucleótidos 53 - 73) e o codão de iniciação da translação (nucleótidos 79 - 81). A Figura 3 representa a se-quência de nucleótidos de (Met” , Ser ’ ) G--0SF hu, que ter mina no sítio de restrição Sall. Ê conveniente que o codão ASG da extremidade 3’ da SEQ ID IP 47 preceda imediatamente 0 codão ACT que codifica a treonina (aminoácido 1) na Figura 3. - 148
Assim, a sequência de nucleótidos AATfCAG-I da extremidade 5' está ausente do fragmento EcoRI-SalI. 0 fragmento EcoRI-SalI pode também preparar-se por excisão de pIGI1295 (reja-se Exem pio de Referência 31). Realizou-se a mutagénese dirigida ao sítio em AM de fita única como se descreveu no Exemplo de Re ferência 6, usando o oligonucleótido SBQ ID RS 28 para transformar o codão para G-ln na posição 11 em Arg. Breparou-se AM RE de fita dupla a partir de uma placa que contém a modificação G-ln11 —Ψ Arg11 como se descreveu no Exemplo de Referência 7, com a diferença de, na incubação da fase B3, ter demorado três horas em vez de cinco horas e digeriu-se com EcoRI (como se descreveu anteriormente) e SnaBI (como se descreve no Exem pio de Referência 13). Isolou-se o fragmento BcoRI-SnaBI com 144 pb resultante contendo o promotor T7A3, a sequência do sí tio de ligação de ribossomas líder trp e o fragmento do gene ~ 11 com o codao Arg e ligou-se a um vector de corte BcoRI-SnaBI proveniente de pICI1327 (que contém codães para Ser^ e Ser^ e é descrito no Exemplo de Referência 11). Utilizou-se a mistu ra de ligação para transformar a estirpe KSD522 de E. coli e escolheram-se os transformantes por desenvolvimento em placas de L-agar contendo tetraciclina (15 microgramas/miligrama). Identificou-se o plasmídio de ADR de uma colónia que contém o promotor T7A3 esperado e a sequência do gene (Met”1, Arg11, Ser1^,^,^>^) G-GSE hu por sequenciamento do ADR do plasmídio isolado e designou-se por pICI13S6.
Efectuou-se a fermentação de acordo com os dois processos alternativos (b) e (c) abaixo referidos. Efectuou--se o processo b) a 37°0 e, depois de dezasseis horas de fermentação como se descreve, a biomassa microbiana era igual a -1 11 17 27 35 gramas/litro e verificou-se que o (Met , Arg , Ser * ’ 60t65j G—OSE humano se tinha acumulado no caldo de fermentação até se obter a concentração de 7 gramas/litro. Efectuou--se o processo c) a 30°G e, por consequência, a, fermentação foi mais lenta devido à menor temperatura de fermentação. Relativamente ao processo c), ao fim de trinta e cinco horas, a - 149 -
biomassa microbiana era igual a 55 gramas/litro e calculou-se que o rendimento em (Met”\ Ârg^", Ser^ ’ ^ ^) G-GS1 huma no que se tinha acumulado no caldo de fermentação era de 15 gramas/litro. b) Transformou-se a estirpe CG-SC630Q de E. coli (ge- nótipo B , \ ~, lac+j, obtida a partir do E, coli G-enetic Stock Centre, com o plasmídio pIC11336. Purificou-se a estirpe resultante CG-SG6300 (pICI1386) e manteve-se em reserva de glicerol a -30°c. Retirou-se da cultura em reserva uma alíquo ta e aplicou-se em placas de agar de L-tetraciclina para sepa rar as colónias individuais depois de desenvolvimento durante a noite (dezasseis horas) a 37°C. Retirou-se uma única colónia de CGSC6300 (pICT1386) e ressuspendeu-se em 10 ml de caldo contendo L-tetraciclina e inocularam-se imediatamente 100 microlitros em cada um de vinte balões de Srlenmeyer de 250 ml, contendo 75 ml de caldo de L-tetraciclina. Depois de se desenvolver durante dezasseis horas a 37°C num agitador com movimento de vaivém, reuniram-se os conteúdos dos balões e u-tilizaram-se para inocular o fermentador contendo 20 litros de meio de desenvolvimento LGM50 modificado. A composição do meio de desenvolvimento está indicada na Tabela 1 ; TABELA 1
Composição do Meio de Desenvolvimento Meio de desenvolvimento LCM50 modificado (A) feito com água destilada
Eli KH2P04 3,0
Ia2HP04 6,0
HaCl 0,5
Caseína hidrolisada (Oxoid L41) 2,0 (hh4)2so4 10,0
Extracto de levedura (Difco) 20,0 - 150 -
G-licerol
MgS04.7H20 0,5 GaCl2.2H20 0,03 fiamina 0,003 ReSO^/Ácido cítrico 0,04/0,02 Solução de elementos vestigiais (TES) (0,5 ml 1" -1) •Tetraciclina (10 mg 1* -1)
Realizou-se então a fermentação à temperatura de 37°0 e a um pH controlado por adição automática de solução de hidróxido de sódio 6 molar de pH 6,7· 0 ponto de regulação da tensão de oxigénio dissolvido (dOT) era 50% de saturação.de ar e foi inicialmente controlado por ajustamento automático da velocidade do agitador do fermentador. 0 caudal de ar para o fermentador foi inicialmente igual a 20 litros por minuto, o que corresponde a 1,0 volume por volume por minuto (YTú) e foi aumentado manualmente para 45 litros por minuto quando a velocidade do agitador do fermentador atingiu o seu máximo (l 000 rotações por minuto). Realizou-se a fermentação durante dezasseis horas e durante este intervalo de tempo retiraram-se amostras para medição de densidade óptica (DO^^q) da concentração da cultura de biomassa, concentrapão total da proteína dos micróbios e acumulação de (Met~ , Arg , Ser ' * 0*7 C^C\ * * G-CSR humano dentro das células bacterianas. Mediu- -se a acumulação por varrimento de geles de 3BS-PAG-E manchados com azul de Goomassie de produtos completos resultantes da lise de células das bactérias amostradas, como se conhece na técnica. Calculou-se a proteína total dos micróbios pelo método de Lowry. Bombeou-=se uma solução de extracto de levedu ra (225 gramas/litro) para dentro do fermentador a partir de 4,5 horas depois da inoculação, com o caudal mássico de 1,7 gramas/litro/hora.
Quando o fornecimento da fonte de carbono (glice-rol) no meio de desenvolvimento ficou exausto, o dOT aumentou rapidamente a partir do valor da saturação de 50% de ar. Res- - 151 -
te momento, bombeou-se alimentaçao contendo glicerol (714 gra mas/litro) e sulfato de amónio (143 gramas/litro). Gomo a taxa do oxigénio bacteriano de sulfato se aproximou da taxa máxima. de transferência de oxigénio do fermentador (0TB.) precisamente antes da fonte de carbono no meio de desenvolvimento de carga ter ficado exausta, a alimentação foi bombeada para o fermentador a uma taxa que restringiu a OUR bacteriana para apro ximadamente SG a 90% do valor máximo OTR do fermentador. A velocida.de de alimentação foi ajustada manualmente para vol tar e em seguida manter o dOf a 50% de saturação de ar sob as condições descritas. c) Repetiu-se o processo de fermentação descrito em (b), mas à temperatura de 30°G durante trinta e cinco horas. Gom a diferença de a temperatura de fermentação ser igual a 30°G, as condições do meio e da fermentação foram idênticas às descritas ei b). d) Efectuou-se a purificação como se descreveu no E-xemplo de Referência 3 (f).
Exemplo de Referência 13 A. Preparação de (Met~ , Ser ' ) G-GSP humano
Repetiu-se a maneira de proceder descrita no Exem pio de Referência 5 para a preparação de (líet"*^, Ser"^*^) G--G3E hu, com excepção do seguinte: 1) Preparou-se o duplex para fosforilação a partir das sequências de oligonucleótidos SEQ ID Numeros 24, 25, 3 e 4, substituindo as sequências SEQ ID Numeros 3 e 4, respectivamente, as sequências SEQ ID Números 26 e 27, empregadas nos Exemplos de Referência 3, 4 e 5. 2) Eosforilou-se o duplex referido em 1) com T4 polinu-cleótido quinase mas digeriu-se com SnaRI (10 unidades) em tampão 1 M (BC, 30 microlitros) durante duas - 152 -
horas a 37°0. 3) A seguir à purificação com etanol, purificou-se o frag mento EcoRI-SnaBI com 72 pb em oposição ao fragmento EcoRI-MstII de 143 pb. 4) Clonou-se o fragmento sintético EcoRI-SnaBI no vector plasmídio pAG-33 como se descreveu no Exemplo de Referência 1 e, para a preparação do vector, digeriu-se plGrSS com SnaBI (20 unidades, BCL) com tampao 1 x R (BCL, 100 microlitros) durante duas horas a 37°G, em vez de RstII em tampão 1 x H. 5) A seguir à precipitação com etanol, purificou-se o fragmento EcoRI-SnaBI de grandes dimensões em gel de agarose a 1% em oposição ao fragmento de grandes dimen soes EcoRI-RstII. 6) Designou-se por pI0I1105 o plasmídio que contém o gene para codificar (Het-^, Ser^) Ct-OSE hu. B. Preparação de (í-íet~ , Ser ' ) G-GSE humano Modificado com metil-polietilenoglicol 5000
Diluiu-se uma solução de (íiet- , Ser ) G-GSE hu (300 mg, 6,25 mg/ml) em água até perfazer 75 ml com borato de sódio 1,1 A de pH 3,9, para se obter uma solução de proteína (4 mg/ml) em borato 0,4 A de pH 3,7· A esta solução adicionou -se gota a gota com agitação uma solução aquosa (75 ml) de carbonato de metil-polietilenoglicol-p-nitrofenilo de massa molecular aproximadamente igual a 5 000 (Sigma Chemical Co., -Iitd.) (100 equivalentes por mole de proteína; 20 equivalentes por grupo amino). Agitou-se a mistura reaccional à temperatura ambiente durante três horas e interrompeu-se a reacção por adição gota a gota de cloridrato de etanolamina de pH 3 (10 equivalente por mole de metil-polietilenoglicol activado). Di luíu-se a mistura reaccional até perfazer 350 ml com solução 0,1 molar de bicarbonato de amónio, pH 3 e concentrou-se e di - 153 -
luíu-se sucessivamente com este dissolvente numa célula Ami-con agitada dotada com uma membrana YK30 (massa molecular de corte 30 ICDa) até não existir cor amarela. Cromatografou-se 0 concentrado final (25 ml) numa coluna (5 x 90 centímetros) de Ultrogel AcA54 equilibrada e eluída com PBS-azida. Identifica ram-se as fracções que contêm a proteína modificada controlan do a proteína a 230 nm e determinou-se 0 metil-polietilenogli col por titulação com iodo/iodeto de potássio, reuniu-se e dialisou-se exaustivamente contra água. Concentrou-se este produto numa membrana de Amicon ΪΜ30 (massa molecular de corte 30 KDa) até 5 mg/ml, filtrou-se em condições esterilizadas ©.través de um filtro de 0,22 micrómetro e guardou-se a 4°C pa ra estudos posteriores. 0 ensaio de SDS-PAG-E realizado com o produto fi-nal modificado indicou que não permanecia (Met” , Ser ') G~ -CSE1 hu que não reagira, encontrando-se todo o produto sob a forma de elevada massa molecular. A titulação dos produtos re tidos e dos filtrados com iodo/iodeto de potássio mostrou que a ultrafilicação repetida a pH 3 com uma membrana de YM30 remo ve efectivamente todo 0 metil-polietilenoglicol não ligado à proteína. 0 produto final continha cerca de 3,5 moles de metil-polietilenoglicol covalentemente ligado por mole de proteína. A actividade específica do derivado não modificado,
Q Q 0,8 x Kr U/mg, desceu para 0,3 x 10 U/mg {10%) com o produto modificado. 0 produto era completamente estável e não apre sentou diferença de actividade específica em solução até 10 mg/ml (por proteína) a 37°0 durante catorze dias.
Bxemplo de Referência 14
Preparação de (Met \ Arg^"*2^, Ser^*^*^^0^) G-OSi? humano modificado com metil-polietilenoglicol 5000 A. Preparação de Çiet~\ Arg^’2·^, Ser^) Q-Qsp humano
Preparou-se um modelo mutagénico, I-!13mpl8, conten - 154 -
do o gene para codificar (líeif*^, Arg^\ G--CSE hu como se descreveu na parte d) do Exemplo de Referência 3, com o plasmídio pIGI1239 a substituir o plasmídio pICIlOSO. Repetiu-se a maneira de proceder que se descreveu no Exemplo de Referência 7, usando o acima referido modelo, com o oligo-nucleótido mutagénico designado por SEQ ID IP 33. Este proces so serve para transformar o codão para lys na posição 23 de Arg. Preparou-se ADR RE de dupla fita a partir de um fago que contém a alteração desejada e isolou-se a cassete de expressão e clonou-se como se descreve no Exemplo de Referência 15 (veja-se mais adiante), para se obter pI0I1333. 0 processamento subsequente para se obter o composto indicado em título efectuou-se como se descreveu nos S-xemplos de Referência 3 e 4. !3. Preparação de (Ket~\ Arg^"»2^. Ser^7*27, 65 j q-QSP hu
Modificado com metil-polietileno glicol 5000 ^ —1 XI 23
Goncentrou-se uma solução de (Ket~ , Arg 1 ,
Ser"^7 * ^7 * ^) G—OSP hu (300 mg) em borato de sódio 0,1 iií, pH 3, até perfazer 37,5 ml, por ultrafiltração com uma membra na Amicon YtflO (massa molecular de corte 10 KDa). Á esta solu ção, adicionou-se um volume igual de borato de sódio 0,8 I-I de pH 8,8, seguida de carbonato de metil-polietilenoglicol-p-ni-trofenilo (massa molecular aproximadamente igual a 5 000) (Sigma Chemical Co. Ltd.) (100 equivalentes por mole de (Met”^ Arg11’25, ser17,27,60,65) G-GSP hu) dissolvido em água (75 ml). Deixou-se prosseguir a reacção a 20°G durante três horas com agitação suave, interrompeu-se por adição de cloridrato de e-tanolamina 1 í-í, pH 8,0 (15 ml, 10 equivalentes por mole de me til-polietilenoglicol activado). Diluíu-se a mistura reaccio-nal até perfazer 500 ml com solução C,1 molar de bicarbonato de amónio de pH 8, diafiltrou-se contra 10 litros do mesmo tampão, usando um sistema de cartucho em especial Amicon CH2A • -Io com membrana 31Y30 (massa molecular de corte 30 KDa) até - 155 -
que, no líquido retido, deixou de ser visível o p-nitrofenol amarelo. Concentrou-se o líquido retido até perfazer 300 ml e colocou-se numa célula agitada Amicon 3400 dotada de uma membrana Ia30 (30 KDa de corte), Coneentrou-se o líquido retido até perfazer 50 ml e diluíu-se de novo a 300 ml com solução 0,1 molar de bicarbonato de amónio, pH 3. Repetiu-se este pr£ cedimento quatro vezes e finalmente concentrou-se o produto até perfazer cerca de 25 ml. Crornatografou-se a solução concen trada do produto numa. coluna (5 x 90 cm) de Ultrogel AcA54 e-quilibrada com fosfato de sódio 10 ml-l, cloreto de sódio 150 miu de pH 7,1» contendo 1 mg/ml de azida de sódio (PBS-azida). Identificaram-se as fracções que contêm a proteína modificada controlando a proteína a 230 nm e determinou-se o metil-poli-etilenoglicol por titulação com iodo/iodeto de potássio (CR Acad. Sei. Paris 274, 1617, 1972), reuniu-se e dialisou-se e-xaustivamente contra água. Concentrou-se 0 produto final por ultrafiltração numa membrana Amicon Yí-130 até um teor maior do que 11,5 mg/ml, filtrou-se através de um filtro de 0,22 micró metro sob condições estéreis e guardou-se a 4°C para estudos subsequentes. 0 ensaio de SDS-PAG-E do produto final modificado indicou que nao permanecia (x-,et , Arg * , Ser ’ ’ ) G-CSE1 hu que não reagiu, passando todo 0 produto como fraeção de elevada massa molecular, A titulação dos líquidos filtrados e dos líquidos retidos com iodo/iodeto de potássio mostrou que a diafiltração repetida a pH 8 através da membrana Yí'í30 eliminou efectivamente todo 0 metil-polietilenoglicol não ligado à proteína. 0 produto final continha cerca de 3,5 moles de metil-polietilenoglicol covalentemente ligado por m£ le de proteína. A actividade específica do derivado não modificado, 2,5 x 10^ ϋ/mg, desceu para 3,5 x 10® U/mg (14%) no produto modificado. 0 produto era completamente estável e não apresentou alteração da actividade específica em solução até 10 mg/ml (por proteína) a 37°C durante catorze dias. - 156 -
Exemplo de Referência 15
Preparação de (let"1. G-lu1^, Ala2^’28, Ser1^. Arfp°) G-CSE humano Modificado com metil-polietilenoglicol 5000 A. Preparação de (Met"1, G-lu1^, Ser"^»2^, Ala28»28, Arg^°) G-CSP hu
Preparou-se um modelo mutagenico, M13mpl8, conten do o gene para codificar (Met"1, G-lu"^, Ser^*2^, Ala2^*28, 30
Lys^ ) G— CSE hu, como se descreveu na parte d) do Exemplo de Referencia 3, com o plasmídio pICI1266, em substituição de pICI1080. Repetiu-se o procedimento descrito no Exemplo de R_e ferência 7, usando o modelo acima referido com o oligonucleó-tido mutagenico designado por SEQ ID IP 37. Isto serve para transformar o aodão para lys na posição 30 em Arg. Preparou-se RE ATM de fita dupla a partir de um fago contendo a modificação pretendida. Isolou-se uma cassete de expressão EcoRI-SalI e clonou-se em pICIOOSO, como se descreveu no Exemplo de Refe rência 11, para se obter PICII343. 0 processamento posterior para se obter 0 composto indicado em título efectua-se como se descreveu no Exemplo de Referência 7 e efectua-se a purificação como se descreveu no Exemplo de Referência 8. B. Preparação de (MetG-lu^, Ala2^»28, Ser~^»2^, Arg^) G-OSE hu modificado com metil-polietilenoglicol 3000
Este complexo preparou-se como se descreveu no S-xemplo de Referência 14. 0 produto final continha cerca de 4 moles de metil-polietilenoglicol covalentemente ligado por mo le de proteína. A actividade específica do derivado nao modi-
Q Q ficado, 0,9 x 10^ U/mg, desceu para 0,6 x 10 U/mg (7%) no produto modificado. 0 produto era completamente estável e não apresentou qualquer alteração de actividade específica em solução até 10 mg/ml (de proteína) a 37°C durante catorze dias. - 157 -
Exemplo de Referência 16
Preparação de (Met"\ 3er^-7»27,115,116^ £iu-^·) g-GSP humano modificado com metil-polietilenoglicol 5000 A. Preparação de (Met"1, Ser17*27,115’116, Glu111) G-CSE humano
Repetiu-se a maneira de proceder descrita no Exem pio de Referência 7, usando o modelo mutagénieo M13mpl3, que contém o gene para (Met” , Ser '* ) G-OSE descrito no Exem plo de Referência 3 ou 3. 0 oligonucleotido mutagénieo utilizado é designado como SEQ ID ΪΤ2 30 (como se define mais adian te na presente memória descritiva). 0 tripleto GCT serve para transformar Thr na posi ção 116 em Ser, 0 tripleto AG-A serve para transformar Thr na posição 115 em Ser e 0 tripleto TTC serve para transformar Ala na posição 111 em Glu. A maneira de proceder utilizada na mutagénese foi essencialmente como se descreveu no Exemplo de Referência 7 e transferiu-se a cassete de expressão para o plasmídio de expressão para se obter ρΙ0Ι1243· A fermentação e a purificação efectuaram-se como se descreveu no Exemplo de Referência 3 e 4. B. Preparação de (Met~\ ger-*-7,27,113,116^ Glu^^) G-CSF humano Modificado com metil-polietilenoglicol 3000
Preparou-se este produto como se descreveu no E-xemplo de Referênica 14. O produto final continha cerca de 4 moles de metil-polietilenoglicol covalentemente ligado por mo le de proteína. A actividade específica do derivado não modificado, 0,7 x 10^ U/mg, desceu para 0,3 x 10^ U/mg (11%) no produto modificado. 0 produto era completamente estável e não apresentava alteraçao da actividade especifica em solução ate 10 mg/ml (de proteína) a 37°0 durante catorze dias. - 158 -
Exemplo de Referencia 17
Preparação de (Met~\ Ser Lys^^) G--CSE huma no Modificado com metil-polietilenoglicol 5000 A. Preparagão de (Metf'1'. Arg11, Ser1^*2^, Lys^8, Arg1^) G-GSff humano
Repetiu-se a maneira de proceder que se descreveu no Exemplo de Referencia 7, usando o modelo mutagénico M13mpl8 que contem o gene de (Met-1, Ser1^*2^) G-CSE descrito no Exem pio de Referencia. 3 e 5· Os oligonucleótidos mutagénieos utilizados são designados SEQ ID E2 28, SEQ ID E2 31 e SEQ ID E2 32 (tal como se define na presente memória descritiva mais a-diante). 0 tripleto ITT na SEQ ID N9 31 serve para transformar Trp na posição 58 em lys e em SEQ ID E2 32, 0 segundo tripleto G-CG- serve para transformar Tyr na posição 165 em Arg. A maneira de proceder de mutagénese realizou-se i nicialmente como experiência de escorvamento duplo usando SEQ ID E2 31 e SEQ ID E2 32 como 0 ligo nucleó tidos mutagénieos, co mo se descreveu no Exemplo de Referência 6. Esta maneira de proceder originou duas placas tendo ambas a alteração da SEQ ID E2 32 (Tyr 165 Arg), mas não a alteração da SEQ ID E2 31. Preparou-se ADE de fita única a partir de uma destas placas como se descreveu no Exemplo de Referência 3. Utilizou-se este ADE como modelo mutagénico numa mutagénese de duplo escorvamento, usando SEQ ID E2 28 e SEQ ID E2 31 como primários mu tagénicos. Este processo originou duas placas uma das quais tinha incorporado o conjunto completo de modificações e trans feriu-se a cassete de expressão para o plasmídio de expressão para se obter pICI1246. Efectuaram-se a fermentação e a purificação como se descreveu no Exemplo de Referência 3 e 4. B. Preparação de (Met-1, Argllyl^~, Ser1^*2^, Lys^) G-CSff - 159 -
humano Modificado com metil-polietilenoglicol 5000
Preparou-se este produto como se descreveu no E-xemplo de Referência 14. 0 produto final continha cerca de 4,5 moles de metil-polietilenoglicol covalentemente ligadas por mole de proteína. A actividade específica do derivado não modificado, 0,3 x 10^ U/mg, desceu para 0,1 x 10^ U/mg (13%) no produto modificado. 0 produto era. completamente estável e não apresentava alteração da activida.de específica em solução até 10 mg/ml (de proteína) a 37°C durante catorze dias.
Exemplo de Referência 18
Preparação de (Met~^t Ser^*^, Ala^*·^*·^, lys^*·^) G--CSE humano Modificado com metil-polietilenoglicol 5000 A. Preparação de (i-!et~^, Ser~^*^, Ala^*·^*'^, Lys^*^) G-CSE humano
Repetiu-se a maneira de proceder que se descreveu no Exemplo de Referência 7, usando o modelo mutagánico M13mpl8 que contêm o gene de (Met"^, Ser^’^) G-CSE descrito nos Exemplos de Referência 3 ou 5· Os oligonueleotidos mutagê nicos utilizados são designados por SEQ ID iT2 35 e SEQ ID 3P 36 (como se define na presente memória descritiva mais adiante). Em SEQ ID N2 35, os tripletos AGC servem para transformar G-ly em Ala na posição 51 e Pro em Ala na posição 44 e o tripleto TTT serve para transformar leu em lys na posição 49. Em SEQ ID N2 36, o tripleto TTT serve para transformar Trp em lys na posição 58 e o segundo tripleto AG-C serve para transfor mar G-ly ero Aln na posição 55. A mutagenese realizou-se como experiência de es-corvamento duplo como se descreveu no Exemplo de Referência 6. Este processo originou dezasseis placas. Oito placas foram s_e leccionadas por sequeneiamento de ADR como se descreveu no E-xemplo de Referência 7. Todas as placas tinham as modifica- - 160 -
ções de SEQ ID IP 36 (Grly55Ala, Irp58Iiys) mas nenhuma delas tinha as modificações de SEQ ID IP 35. Preparou-se ADH de fita única a partir de uma destas placas como se descreveu no Exemplo de Referencia 3 (d) e utilizou-se como modelo mutagá-nico numa mutagenese de escorvamento único usando SEQ ID IP 35 como primário mutaglnieo. Este processo originou cinquenta placas, três das quais foram seleccionadas por sequenciamento de ADN, duas tinham o congunto completo de modificações. Trans feriu-se a cassete de expressão para o plasmídio de expressão para se obter pICI1297. A fermentação e a purificação efectua ram-se como se descreveu nos Exemplos de Referência 3 e 4. B. Preparação de (Het""1. Ser1^*2^. Ala^-*^^, Eys^*^8) G-OSP humano Modificado com 1etil-polietilenoglicol 5000
Preparou-se este produto tal como se descreveu no Exemplo de Referência 14. 0 produto final continha cerca de 3,5 moles de metil-polietilenoglicol covalentemente ligadas por mole de proteína. A actividade específica do derivado não modificado, 0,75 x 10^ U/mg, desceu para 0,32 x 10^ U/mg (47%) no produto modificado. 0 produto era completamente estável e não apresentou alteração de actividade específica em solução até 10 mg/ml (de proteína) a 37°0 durante catorze dias.
Exemplo de Referência 19
Preparação de (Met-1. Arg^,^t Ser^,^,^>^) G-OSP humano Modificado com metil-polietilenoglicol 5000 A. Preparação de (Met"1. Arg11*16, Ser17’27,60’65) Q-QSE hu
Repetiu-se a maneira de proced.er descrita no Exem pio de Referência 14, com o oligonucleotido designado por SEQ ID H- 33 substituido por SEQ ID NQ 42 (este serve para transformar o codão de lys na posição 16 em Arg), de modo a obter--se pI0I1387. 161 -
0 processamento posterior para a obtenção de (Met Arg^·*^, Ser^,^*^,^) G-CSP hu e a purificação deste composto realizaram-se como se descreveu nos Bxemplo de Referencia 3 e 4. B. Preparação de (Het"1, Ara11*16, Ser17,27>60,65) G~CSP humano modificado com metil-ροlietilenoglicol 5000
Esta. proteína precipitou quando dialisada exausti vamente contra água na fase final do processo de purificação descrito no Exemplo de Referência 4. Redissolveu-se o precipi tado em borato de sódio 0,1 H de pH 8 e modificou-se com me-til-polietilenoglicol 5000 como se descreveu no Exemplo de Re ferência 14. 0 produto final continha cerca de 3,5 moles de metil-polietilenoglicol covalentemente ligadas por mole de pro teína. k actividade específica do derivado não modificado, 2,3 x Kr U/ml, desceu para 3,6 x 10 U/mg {16%) no produto modificado. 0 produto era completamente estável e não mostrou alteração da actividade específica em solução atl 10 mg/ml (de proteína) a 37°0, durante catorze dias.
Exemplo de Referência 20
Preparação de (Met"'*', Arg^*5^, Ser^^^Éiiõ) qsg humano líodificado com metil-polietilenoglicol 5000 A. Preparação de (Met"1, Arg11»34, Ser17,27,60’65) G-GSE humano
Repetiu-se a maneira de proceder que se descreveu no Exemplo de Referência 14, com 0 oligonucleótido designado SEQ ID RS 33 substituído por SEQ ID RS 39 (este oligonucleóti do serve para transformar 0 codao de Lys na posição 34 em Arg), de maneira a obter-se pI0I1389. 0 processamento posterior para se obter o eompos-, to indicado em título e a purificação do composto indicado em 162 -
título efectuaram-se como se descreveu nos Exemplos de Referência 3 e 4· B. Preparação de (Met"1, Arg11’34, Ser17 >27 ’60 >65 ) G-CSE hu modificado com metil-polietilenoglicol 5000
Preparou-se este composto como se descreveu no E-xemplo de Referência 14. 0 produto final continha cerca de 4 moles de metil-polietilenoglicol covalentemente ligadas por mole de proteína. A actividade específica do derivado não mo-dificado, 1,4 x 10 U/mg, desceu para 2,0 x 10 U/mg (14%) no produto modificado. 0 produto era completamente estável e não apresentou alteração da actividade específica em solução até 10 mg/ml (de proteína) a 37°0 durante catorze dias.
Exemplo de Referência 21
Preparação de (Met~4t Arg^*4^ ger^-7,27,60,63^ Q-pgp humano modificado com metil-polietilenoglicol 5000 A. Preparação de (Met-1, Arg11,40. Ser17*27*60,65 ) G-OSE hu
Repetiu-se a maneira de proceder que se descreveu no Exemplo de Referência 14, com o oligonucleotido SEQ ID IP 38 substituído por SEQ ID IP 40 (este oligonucleotido serve para transformar o codão de Lys na posição 40 em Arg), para se obter pI0I1390. 0 processamento posterior para se obter o composto indicado em título e a purificação do composto indicado em título efectuaram-se como se descreveu nos Exemplos de Referência 3 e 4· B. Preparação de (Met"1. Arg11’40, Ser17’27,60’65) G-CSE humano Modificado com metil-polietilenoglicol 5000
Preparou-se este composto como se descreveu no E- - 163 -
xemplo de Referencia 14. O produto final continha cerca de 4 moles de metil-polietilenoglicol covalentemente ligadas por mole de proteína. A actividade específica do derivado não modi q . 8 ficado, 1,3 x 10 U/mg, desceu para 3,0 x 10 U/mg (23%) no produto modificado. 0 produto era eompletamente estável e não apresentava alteração de actividade específica em solução até 10 mg/ml (de proteína) a 37°0 durante catorze dias.
Exemplo de Referência 22
Preparação de (Met~\ Ala1, fhr^, Tyr^, Arg^*1'1', Ser1^’2^*^» Zc G-GSP humano Modificado com metil-polietilenoglicol 3000 A. Preparação de (Met"^, Ala^, Ihr^, lyr^, Arg^,~*'^. Ser^* 27,60,^5)"G_GSg hu
Repetiu-se a maneira de proceder que se descreveu no Exemplo de Referencia 14, com o oligonucleotido SEQ ID Re 38 substituído por SEQ ID IP 41 (este oligonucleotido serve para transformar os codões de Thr, Leu, G-ly e Pro, nas posições 1, 3, 4 e 5, em Ala, Thr, lyr e Arg, respectivamente) pa ra se obter pI0I1391. 0 polipéptido deste Exemplo mostra que se pode aplicar a modificação de acordo com a presente invenção a um polipéptido que se sabe possuir actividade de G-GSF, a fim de melhorar a estabilidade em solução do polipéptido. 0 polipéptido conhecido é (Met \ Ala\ Ihr^, lyr^, Arg^, Ser^) G-CSF hu que é descrito na publicação da memória descritiva da Patente de Invenção Europeia Eumero 272 703, depositado por Kyowa Hakko Kogyo Oo. I>td.. 0 processamento posterior para originar 0 composto indicado em título e a purificação do composto indicado em título efectuaram-se como se descreveu nos Exemplos de Referencia. 3 e 4. 00,65 B. Preparação de (Met"1, Ala1, Thr^, lyr^, Arg^, Ser1^,2'^, ) G--0SF humano modificado com metil-polietilenogli- - 164 -
col 5000
Este produto preparou-se como se descreveu no E-xemplo de Referencia 14. 0 produto final continha cerca de 4 moles de metil-polietilenoglicol covalentemente ligadas por mole de proteína. A actividade específica do derivado não mo- Q Ω dificado, 1,5 x Kr U/mg, desceu para 2,0 x 10 U/mg (14%) no produto modificado. 0 produto era completamente estável e não apresentou alteração de actividade específica em solução até 10 mg/ml (de proteína) a 37°0 durante catorze dias.
Exemplo de Referencia 23 'Preparação de (Met“^, Arg~^t Ser1^ ’^^) g~gse humano modificado com metil-polietilenoglicol 2000 a) Preparação de carbonato de metil-polietilenoglicol-p-ni-trofenilo com massa, molecular igual a cerca de 2000 A uma solução de cloroformiato de p-nitrofenilo (2,32 gramas, 11,5 milimoles) em acetonitrilo (250 ml) a 0 - - 5°C adicionou-se com agitação metil-polietilenoglicol com a massa molecular média, igual a 2000 (Sigma Chemical Co. Ltd.) (20 gramas, 10 milimoles), seguida de trietilamina (1,11 gramas, 1,53 ml, 11 milimoles), gota a gota. Deixou-se aquecer a mistura reaccional até à temperatura ambiente e agitou-se a 20°C durante vinte e quatro horas. Separou-se 0 cloridrato de trietilamónio precipitado por filtração (0,46 grama de um valor teórico igual a 1,375 gramas) e guardou-se o filtrado depois de diluição com 1 litro de éter dietílico(anidro) a 0 -
- 5°C durante vinte e quatro horas. Colectou-se um precipitado branco por filtração e reprecipitou-se dissolvendo-o num volume mínimo de etanol a 35 - 40°C e arrefecendo até 0°C. Re precipitou-se 0 produto em acetonitrilo/éter dietílico ( 1 : 5, volume/volume) para se obter um produto final, que se lavou com éter e se secou em vácuo para se obter um sólido bran co com 15,5 gramas. A microanálise mostrou C 53,5; H 9,1; N j 0,4; 01 0, 0 que corresponde à ausência de cloroformiato no - 165
nSSS&SBBR produto. b) Preparação de (Het ", Arg*^, 3^^^7,60,65^ g._r;sg huma no Modificado com metil-polietilenoglicol 2000
Dialisou-se uma solução de (Met-\ Arg^\ Ser^’ 27,60,65) Msp Μ ^1>5 gramas) em PBS-azida (300 ml, 5 mg/ /ml) contra borato de sódio 0,4 molar, pH 8,8 (7 χ 71) ate se obter o volume final de 375 ml (4 mg/ml). A esta solução adicionou-se gota a gota com agitação uma solução aquosa (375 ml) de metil-polietilenoglicol-p-nitrofenilo-carbonato^ com massa molecular aproximadamente igual a 2 COO (10 gramas, 60 equivalentes, 12 equivalentes por grupo amino de (Met^^rg1^, Ser1^,2^,^0,^) G-CSP hu. Deixou-se prosseguir a reacção à temperatura ambiente durante tres horas com agitação suave e interrompeu-se por adição gota a gota de cloridrato de etano-lamina, pH 8 (10 equivalentes por mole de metil-polietileno-glicol activado). Ooncentrou-se a mistura reaccional numa mem brana líílO numa célula de Amicon agitada (massa molecular de corte 10 KDa) a 4°0 até se obter o volume final retido de 50 ml. Diluíu-se o líquido retido com solução 0,1 M de bicarbona to de amónio, pH 8 (450 ml) e reconcentrou-se até 50 ml como anteriormente. Repetiu-se esta maneira de proceder sete vezes. 0 concentrado final foi transferido para uma segunda célula Amicon agitada que tinha uma membrana YM30 (massa molecu lar de corte 30 KDa), diluíu-se até perfazer 500 ml e reconcentrou-se até 50 ml. Repetiu-se esta maneira de proceder duas vezes e concentrou-se o produto até ao volume final de 50 ml. Cromatografou-se a solução concentrada do produto em duas partes numa coluna (5 x 90 centímetros) de Ultrogel AcA54 equilibrada do PBS-azida. Identificaram-se as fracções que contém a proteína modificada detectando a proteína a 280 nm e determinou-se o metil-polietilenoglicol por titulação com iodo/iodeto de potássio (0. R. Acad. Sei. Paris 274, 1617, 1972), reuniu-se e dialisou-se exaustiva.mente contra água. . Concentrou-se a solução aquosa final numa célula Amicon agita - 166 -
da dotada de membrana 13430 até ao volume de 50 ml. Diluíu-se o concentrado com água até ao volume de 500 ml, reconcentrou--se e repetiu-se a maneira de proceder cinco vezes. Filtrou--se o concentrado final através de um filtro de 0,22 micráme-tro em condições esterilizadas e guardou-se a 4°0 para estudos posteriores. 0 cálculo das quantidades de proteína por análise de aminoácidos depois de hidrólise ácida indicou uma recupera ção global de 47% de (Met""*”, Arg^\ G--GSF hu no produto final modificado. 0 ensaio de SDS-PAGE, realizado com a mistura reaccional depois de três horas e com a solução final aquosa do produto, indicou a ausência de proteína não re agida, passando todo o produto como fracção de elevada massa molecular. A titulação dos filirados e dos líquidos retidos com iodo/iodeto de potássio mostrou que a ultrafiltração repe tida na membrana ΪΜ30 eliminou essencialmente todos os deriva dos de metil-polietilenoglicol não ligados a proteína. Isto foi confirmado pela análise cromatográfica por HP1C em rpC4 (Dynamax 300A 12 micrometros) eluindo com um gradiente de 40 a 90% de acetonitrilo - 0,1$ de TFA em água - 0,1% de T1A e detectando a absorção de radiação ultravioleta a 280 nm e que originou um pico único coincidente. Liofilizaram-se as frac-ções, reconstituíram-se com água e analisaram-se relativamente à proteína a 280 nm e determinou-se metil-polietilenoglicol por titulação com iodo/iodeto de potássio e apresentaram um pico coincidente. Qualquer metil-polietilenoglicol residual não ligado a proteína teria sido detectado como um pico distinto, que se elui precocemente positivo a iodo/iodeto de potássio. A titulação com iodo/iodeto de potássio de (Met-^, Arg^, Ser"^ * ^ ^ ) G-CSP hu oovalentemente ligado a metil
-polietilenoglicol 2 000 originou resultados erráticos e não permite fazer o cálculo das proporções PEG· : proteína. A acti • vida.de biológica específica do derivado não modificado, 1,2 X - 167 -
X IO9 U/mg, desceu para 1,5 x 10S U/mg (13?Q no produto modificado. 0 produto era completamente estável e não apresentou alteração da actividade específica ate 10 mg/ml (de proteína) em solução em BBS, a 57 C durante catorze dias.
Exemplo de Referencia 24
Preparação de (Met"1, Arg11. Ser17,27,6°’65) G-CSE humano Modificado com metil-polietilenoglicol 750 a) Preparação de carbonato de metil-polietilenoglicol-p-ni-trofenilo com massa molecular aproximadamente igual a 750 A uma solução de cloroformiato de p-nitrofenilo (5,1 gramas, 25,3 milimoles) em acetonitrilo (50 ml) a 0 - 5° C, adicionou-se com agitação metil-polietilenoglicol de massa molecular média igual a 750 (Sigma Chemical Oo Itd) (20 gramas, 26,67 milimoles), seguido de trietilamina (2,69 gramas, 3,71 ml, 26,63 milimoles), gota a gota durante trinta minutos. Deixou-se aquecer a mistura reaccional até à temperatura ambiente e agitou-se durante oito horas. Separou-se por filtração o cloridrato de trietilamánio precipitado a partir da mis tura reaccional e diluíu-se o filtrado com éter dietílico (a-nidro) (1 litro), arrefeceu-se a 0°C durante quatro horas e voltou a filtrar-se. Colectou-se um total de 3,4 gramas de cloridrato de trietilamánio. Evaporou-se o filtrado sob pressão reduzida e secou-se em vácuo para se obterem 23,5 gramas de um solido amarelo com o aspecto de cera. A microanálise demonstrou que o teor de Cl era i-gual a 0%, o que mostra a ausência de cloroformiato no produto .
Dialisou-se uma solução de (Met-1, Arg11, Ser1^* 27,60,65·) Q._Q3p hu,(250 mg) em PBS-azida (50 ml) contra água e, em seguida, contra borato de sodio 0,4 M de pH 8,8. λ so- 168 -
lução final (50 ml) à temperatura ambiente, adicionoú-se gota a gota com agitação uma solução aquosa (50 ml) de carbonato de metil-polietilenoglicol-p-nitrofenol de massa molecular a-proximadamente igual a 750 (100 equivalentes, 20 equivalentes por grupo amino em (Met"1, Arg11, Ser1^,2^ >60»65) q._qSI> Agitou-se a mistura reaccional á temperatura ambiente durante três horas e interrompeu-se a reacção por adição gota a gota de cloridrato de etanolamina, pH 8 (10 equivalentes por mole de metil-polietileno-glicol activado).
Transferiu-se a mistura reaccional para uma célula Amicon agitada dotada com uma membrana ΪΜ10 (massa molecular de corte 10 KDa) e concentrou-se. Diluíu-se o concentrado (25 ml) com bicarbonato de amónio 0,1 M de pH 8 ate perfazer 350 ml e concentrou-se ate perfazer aproximadamente 25 ml. Repetiu -se cinco vezes esta maneira de proceder. Oromatografou-se o concentrado final (27 ml) numa coluna (5 x 90 centímetros) de Ultrogel AcA54 equilibrada e eluída com PBS-azida. Identifica ram-se as fracções que contêm proteína, modificada detectando a proteína a 280 nm e analisou-se o metil-polietilenoglicol por titulação com iodo/iodeto de potássio, reuniram-se as fra£ ções e dialisaram-se exaustivamente contra água. Concentrou--se o produto final numa célula Amicon agitada equipada com u ma membrana ΪΜ10 através da qual se filtrou. Riltrou-se o eon centrado final para esteriliza-lo através de um filtro de 0,2 micrómetro e guardou-se a 4°0 para estudos posteriores.
Os cálculos da proteína por análise de aminoáci-dos depois da hidrólise ácida indicaram uma recuperação global de aproximadamente 80% de (Met'"'1', Arg^, Ser'^,‘^,^,^ ) G-CSP hu no produto final modificado. 0 ensaio de PAG-E-SDS do produto mostrou uma banda intensa e indicou que não estava presente (Met""\ Ãrg^, Ser1^*^) G-GSR hu que não reagiu. A titulação dos filtados e dos líquidos retidos - 169 -
com iodo/iodeto de potássio mostrou que a ultrafiltração rep_e tida a pH S numa membrana ΪΚ10 eliminou essencialmente todos os derivados de metil-polietilenoglicol não ligados a proteína. A titulação com iodo/iodeto de potássio de (Met”1, Arg^, Ser^) G-CSE hu covalentemente ligado ao metil-polietilenoglicol originou resultados muito erráticos e não permi tiu o cálculo das proporções PEG- ; proteína., á actividade bi£ lógica específica do derivado não modificado, 1,2 x 10^ U/mg,
O desceu para 4 x 10 U/mg (53%) no produto modificado. 0 produ to era completamente solúvel e não apresentava alteração na actividade específica em solução em 3?BS até 10 mg/ml (de proteína) a 37°0 durante catorze dias.
Exemplo de Referência 23
Caracterização dos derivados de G-OSF antes da modificação com metil-polietilenoglicol
Concentrou-se uma solução aquosa dos derivados dos Exemplos de Referencia 1, 3, 7, 8 e 13 a 24 (concentração de proteína igual a cerca de 1 mg/ml) até pelo menos 11 mg/ml de proteína numa membrana Amicon 71410 a. 4°C. Para evitar qual. quer precipitação durante a concentração, ajustou-se o pH 5,5 da solução de partida, primeiramente a pH 8,5 por adição de hidróxido de amónio para se obter uma concentração final igual a cerca de 0,25 mM. Depois da concentração, 0 pH da solução tinha descido para, cerca, de 8,0.
Ajustou-se a concentração da solução concentrada de proteína a 10 mg/ml de proteína (calculada a partir de uma solução 1 mg/ml que origina um &23Q igual a 1,0) por adição de solução de cloreto de sódio tamponizada com fosfato concen trada vinte vezes. Esta solução contendo 10 mg/ml de derivado em fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 150 mM, pH 7,4 (PBS) proporcionou uma solução de reserva comum a partir da qual se estabelece a homogeneidade, a identidade, a activida-[ de biológica e a estabilidade da solução de proteína. - 170 -
Verificou-se çjue cada derivado tinha pelo menos uma concentração de 95% de um componente pelo ensaio de PAG-E--PBS em condições redutoras e não redutoras e por ensaio de HPLC em fase inversa. Á análise repetida da, composição dos a-minoácidos depois da hidrólise ácida em H01 6 N a 110°C forne ceu as proporções de aminoácidos de cada derivado e uma medição rigorosa da concentração de proteína na solução de reserva. Esta concentração de proteína juntamente com a média dos títulos de ensaio biológico obtidos em pelo menos seis dias diferentes foi utilizada para determinar a actividade específica do derivado. A análise da sequência terminal N e a análi se espectrométrica de massas por electropulverização dos deri vados escolhidos proporcionou as sequências esperadas e as massas moleculares esperadas.
Prepararam-se soluções de reserva de derivados de G~0SE modificados com metil-polietilenoglicol (Exemplos de Re ferencia 1, 3, 7, 8 e 13 a 24) procedendo de acordo com uma maneira de proceder semelhante para obter os dados apresentados nestes Exemplos de Referência.
Exemplo de Referência 26
Estabilidade da solução de G-OSE e dos seus derivados
Ensaiaram-se diluições aproximadas da solução de reserva de G-CSE, dos seus derivados e dos derivados de G-CSE modificados com metil-polietilenoglicol em solução salina tam ponizada com fosfato (PBS) a 4°0 descritos no Exemplo de Refe rência 25 relativamente à estabilidade da solução. Incubaram--se soluções de 1 mg/ml, '5 mg/ml e, por vezes, de 10 mg/ml de proteína em PBS a 37°0 durante catorze dias. Inspeccionaram--se visualmente as soluções a intervalos de tempo regulares relativamente à presença de sinais de precipitação. Depois de catorze dias, centrifugou-se cada solução a 14 000 rotações por minuto durante vinte minutos, separou-se o sobrenadante por decantação e redissolveu-se o pelete assim obtido em PBS - 171 -
contendo 1% de N-lauroil-sarcosina em peso/volume. 0 teor total de proteína, em cada sobrenadante e o precipitado redissol vido foram calculados por medições de e calculou-se o teor de monómero em G-CSP não modificado e dos seus derivados por HPIO em fase inversa. Exprimiram-se estes valores como per centagem dos correspondentes dados fornecidos pelas soluções no inicio da incubação e por uma solução contendo 1 mg/ml incubada a 4°C durante catorze dias. Observaram-se as diferenças entre a proteína total e os cálculos do monómero apenas em alguns peletes redissolvidos. A percentagem d.e proteína que fica em solução nos sobrenadantes em cada concentração de partida pode assim ser determinada. A seguir à modificação com metil-polietilenogli-col, o Gr-CSP e todos os derivados apresentaram completa estabilidade em solução até 10 mg/ml, como se mencionou nos Exemplos de Referencia 1, 3, 7, 8 e 13 a 24·
Verificou-se que a actividad.e específica do produ to em cada sobrenadante após a incubação era a mesma que na solução de partida e não se observaram diferenças no ensaio de PAGE-SDS em condições redutoras e não redutoras.
Exemplo de Referencia 27 Ensaios Biológicos 1) Ensaio Biológico de G-OSE
Clonou-se uma linha, de células dependente do fac-tor, Paterson - G-CSE (PDGP-G·), obtida do Paterson Institute, Manchester, Inglaterra, por diluição limite na presença de Gr-CSP. Utilizou-se um clone que responde a G--GSF, denominado clone E7, para determinar a actividade de G-CSP recombinante humana. 3
Adicionaram-se 2,5 x 10 células de clone E7 de - 172 -
J FDCP-G em 100 micro litros de RPMI 1640 + 10% de PCS a um volu me igual de RPML 1640 + 10% de PCS contendo G-CSF. Cada amostra de G-CSF foi ensaiada ao longo de dez diluições de duplicação. 0 volume final de RPMI 1640 (veja-se Mo ore GE e col. (1967), JAMA, 199, 519) + 10% de FCS (soro de feto de vitela) em cada reentrância de uma placa de microtitulação de noventa e seis reentrâncias era igual a 200 microlitros. Incubou-se a placa de micro titulação a 37°C em 5% ‘de CO^ num incubador humidificado durante quatro dias. Por cada reentrância, adicionou-se 1,0 microcurie de timidina titulada em cada reentrância durante as últimas seis horas. Colectaram-se as células em papéis de filtro com fibra de vidro e determinou-se o nível de radiactividade por contagem de cintilações de líquido. Yerificou-se que o nível de incorporação de timidina tritiada era directamente proporcional a quantidade de G-CSP presente. Calibrou-se o ensaio com o clone Ξ7 de FDCP-G usando G-CSP hu mano recombinante obtido de Amersham International com a acti vidade específica declarada de 10 3 unidades/miligrama de proteína.
Determinaram-se as potências das amostras de G— -GSF por comparação com um padrão de actividade conhecido.
Calcularam-se as unidades de actividade de G-CSP por mililitro de acordo com a seguinte formulai
Unidades de actividade x do padrão de G-CSP por mililitro
Diluição do padrão de G-CSP que origi na 50% de aumento máximo de incorpo-raçao de H-timidina
Diluição da amostra que origina 50% de aumento ma ximo de incorpora ~ 3 ”” çao de H-timidina
Ensaio Biológico de Interleucina-2 (IL-2)
Ensaiou-se a interleucina-2 relativamente à actividade biológica controlando o desenvolvimento de uma linha - 173 -
de células ΟΤΙ dependente de IL-2 murínica, como é descrito por Robb e col., em J. Exp. Med. 160, 1126, 1986, com a diferença de as células serem incubadas com IL-2 durante quarenta e oito horas e depois marcadas com I-í-timidina durante seis a oito horas.
Ensaio Biológico de Oalcitonina Usando Qélulas 147E 0 ensaio biológico para a oalcitonina baseou-se no princípio de que a linha de células T47B de cancro da mama possui receptores ligados a adenilato-ciclase para a calcito-nina (líartin e col. (1980), Biochem. Biophys. Res. Commun. 98, 150 - 156). 0 estímulo das células T47E pela calcitonina leva à produção de níveis intracelulares aumentados de AHP cíclica que pode ser quantificada por ensaio de rádio-imunidade. A quantidade de calcitonina ou de calcitonina ligada a PEG· em amostras desconhecidas pode ser quantificadas por comparação com uma curva padrão preparada utilizando amostras padrão de calcitonina e de calcitonina ligada a PEG·.
No ensaào biológico, prepararam-se células T47D sob a forma de suspensão em meio isento de soro ou em solução salina tamponizada com fosfato. As células foram divididas em partes alíquotas para. tubos de ensaio e estimuladas com calei tonina padrão ou com calcitonina ligada a PEG· ou com amostras que contém calcitonina ou calcitonina ligada a PEG·, na presen ça de isobutil-metil-xantina 10""^' M durante vinte minutos. In terrompeu-se a incubação colocando as suspensões de células num banho de água em ebulição durante cinco minutos. As células foram submetidas a lise por meio de dois ciclos de conge-lação/descongelação em presença de 0,01% de Iriton X-100 e os fragmentos das células foram sedimentados por centrifugação a 10 000 x g durante cinco minutos.
Quantificou-se a AMP cíclica existente no sobrena • dante lisado por ensaio de rádio-imunidade utilizando um esto - 174 -
jo comercialmente disponível (Amersham International PRK432). Preparou-se uma curva padrão desenhando graficamente a quanti dade de calcitonina padrão ou de calcitonina ligada a PEG· em função dos níveis de AMP cíclica. Determinou-se a quantidade de calcitonina ou de calcitonina ligada a PPG· presente nas a-mostras desconhecidas por interpolação a partir de uma curva padrão apropriada.
Exemplo de Referência 28
Preparação de calcitonina humana (hGP) modificada com metil--polietilenoglicol 5000
Adquiriu-se a hCP quimicamente sintetizada e lio-filizada à firma Oambridge Research Biochemicals, Gadhrook Park, Rudhearth, Horthwich, Gheshire, Inglaterra. 0 ensaio de HPLO em fase inversa e de permuta de iões mostrou um único pi co. Modificaram-se 300 mg em 75 ml de Ξ^Ο com metil-ροlietile noglicol como se descreveu no Exemplo de Referencia 3, com a diferença de se terem utilizado 5 equivalentes de reagente por grupo amino presente em hCI. Diafiltrou-se a mistura reac cional numa membrana Amicon ΪΜ10 (massa molecular de corte 10 EDa) a 4°0 contra solução 0,1 M de bicarbonato de amónio, a pH 3, para eliminar a hCI que não reagiu. Ooncentrou-se o líquido retido até 36 ml e perfez-se o volume até 60 ml com solução 50 mm de fosfato de sódio, pH 7, contendo sulfato de a-mónio 1,7 M. Oromatografou-se esta solução em cargas de 5 x 12 ml numa coluna de fenil-superose de 3 ml (Pharmacia, MB) equilibrada em solução 50 mlí de fosfato de sódio de pH 7, con tendo 0,63 M de sulfato de amónio. 0 metil-polietilenoglicol livre não se ligou à coluna, nestas condições e foi eliminado por lavagem. Eluíu-se a, hOT modificada, com metil-polietilenoglicol usando solução 50 mM de fosfato de sódio de pH 7· Dia-lisou-se 0 péptido eluído com água usando uma membrana de diá lise Spectrapor (massa molecular de corte 6-3 EDa) e concen trou-se utilizando uma membrana Amicon ΪΚ10 a 4°0, até se ob- - 175 -
ter a concentração final de 11 mg/ml, determinada por analise de aminoácidos depois de hidrólise em meio ácido. Este produto, que continha 1,5 moles de metil-polietilenoglicol covalen temente ligadas por mole de hGT, conservava a actividade biológica e isentou-se de material de partida não modificado.
Exemplo de Referência 29
Preparação de interleucina-2 (11-2) humana modificada com metil-polietilenoglicol 5000
Obteve-se 11-2 humana recombinante liofilizada produzida em E. coli na firma Biosource International, Califórnia, Estados Unidos da America, linha um grau de pureza maior do que 93%, determinado por análise de PAGE-SDS. Os pro cessos para a produção de 11-2 em E. coli e a sua subsequente purificação foram já descritos (Kato e col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 150, 692 (1983); liang e col., Biochem. J. 229, 429 (1985); Koths e col., Patente de Invenção Horte-Americana número 4569790 (1986)). Modificou-se uma solução de 211 mg em 30 ml de HgO com metil-polietilenoglicol de massa molecular a, proximadamente igual a 5 000 e purificou-se como se descreveu no Exemplo de Referencia 3, usando 20 equivalentes por grupo amino presente em 11-2. 0 produto final continha 3,4 moles de metil-polietilenoglicol por mole de proteína, era isento de material de partida não modificado e retinha a actividade bio lógica.
Exemplo de Referencia 30 Construção de pJCI0080 a) Construção de plB357 (também designado 11a presente memória descritiva por p!B004) 0 plasmídio pTB357 utiliza um determinante da resistência à tetraciclina reprimido, tal como se encontra no . plasmídio RP4 de ocorrência natural. Este sistema, reprimido - 176 - não efectua a expressão do gene tetA na ausência de tetraci-clina, enquanto que a maior parte dos mecanismos de resistência, ao fármaco têm expressão constitutiva. 0 sítio tet foi primeiramente mapeado em SP4 por Barth e Crinter (J. Mol. Biol. 113, 455 - 474, 1977). Verifi-cou-se que este consiste em dois genes adjacentes: tetA, o ge ne da resistência estrutural, e tetR, o gene repressor; este região foi sequenciada (ICLock e col., J. Bacteriol. 161, 326-- 332, 1935). Estes clones estão situados em fragmentos adjacentes, BglII-Smal e Smal-Smal. 0 sítio BglII ê único em RP4, mas há cinco sítios Smal (Lanka, Burz e Burste, Plasmid 10, 303 - 307, 1933).
i) Olonação dos Genes tetA *- tetR 0 plasmídio RP4 esta. bem documentado (Datta e col., J. Bacteriol. 108, 1244, 1971) e I livremente disponível. A-lém disso, o plasmídio KP4 foi depositado na National Collee-tion of Type Cultures, 61 Oolindale Av., London NW9 5ΗΪ (Colec ção Nacional de Culturas 1'ípicas) do Reino Unidos, sob os números de acesso 50078 e 50437. Desenvolveram-se estirpes de E. coli contendo este plasmídio em culturas de caldo selecti-vo e isolou-se plasmídio ADI usando uma mudança de escala para cima do método de Holmes e Quigley (Holmes e Quigley, Anal. Biochem. 114, 193 - 197» 1931). Desproteinizou-se por tratamento com acetato de amónio 2,5 molar e reprecipitou-se com isopropanol. Tratou-se o ADI plasmídio, de acordo com as condições recomendadas pelo fornecedor, com a enzima de restrição BglII e cortou-se completamente. 3Poi em seguida cortado parcialmente Xmal usando enzima diluída e curtos tempos de in cubaçao. Xmal e um iso-esquizomero de Smal. mas que produz 4--nucleótidos de extremidades coesivas nos seus sítios de corte . 0 vector plasmídio pUCS (lanisch-Perron, Vieira e - 177 -
Messing, Gene 33, 103 - 119, 1935) foi preparado de maneira semelhante e cortado com BamHI e Xmal até ao completamento.
Os fragmentos RP4 foram clonados neste vector por ligação com T4 ligase a 12°G durante dezasseis horas. Utilizou-se este vector pare, transformar B. coli C600 tornado competente pelo método do cloreto de cálcio (I-íaniatis e col., Gold Spring Har bor Laboratory, 1932). Em seguida, placaram-se as culturas em meio que seleccionava a resistência à tetraciclina. 0 E. coli 0600 encontra-se livremente disponível em inúmeras fontes incluindo muitas colecçães de cultura, tais como o E. coli Genetic Stock Centre, Universidade de Ya-le, Estados Unidos da América, sob 0 número de acesso GCSC 3004. 0 genótipo de Ξ. coli 0600 é K12 thr-1 leuB6 thi-1 hsdSl lacll tonA21 A”supE44.
Detectaram-se diversas colónias com esta resistên cia relativamente ao fenótipo esperado (resistência a ampici-lina e a tetraciclina mas sem resistência a canamicina indica tiva de RP4 propriamente dito). Submeteram-se colónias com as resistências eorrectas a análise dos clones isolando o plasmí dio AM (método de Holmes e Quigley). Estas preparações foram cortadas com EcoRI e Hind III e analisadas por electroforese em gel de agarose. Este método estabeleceu 0 tamanho do inser to clonado que se verificou ser igual a 2,45 kb previsto para 0 fragmento BglII-Xmal-Xmal de RP4. 0 clone que possui este fragmento contendo os genes tetA e tetR foi designado píB344. ii) Eliminação do gene tet de pAI155
Foi necessário remover 0 gene tet do plasmídio vec tor pAT153 antes de inserir a cassete tetA + tetR de RP4 para evitar a duplicação de genes, que pode ser fonte de instabili dade genética. Também pode ser efectivamente suprimido 0 gene tet, mas tetR não cognato. A remoção fez-se isolando plasmí-. dio pAT153 e cortando-o com EcoRI e Aval. Entre estes sítios, - 178 -
clonaram-se oligonucleótidos sintéticos com a sequência SEQ ID 12 56 5' AAT IGGCAIGC G&ATC0ATGGAÍDG3 ’ 3 'GCGTAGGGClAGGTAGGltâGAGGG5 *
Estes adaptam-se às extremidades coesivas de EcoRI e Aval e, além disso, contem sítios Sphl, BamHI e Olal. Depois da trans formação e da selecção, ensaiaram-se as colónias relativamente à perda da determinante da resistência a tetraciclina. Se-quenciou-se o ADH do plasmídio de um clone para confirmar que a sequência prevista era a correcta. Este plasmídio foi desig nado pCH19.
iii) Inserção dos genes tetA + tetR
Isolaram-se os genes tetA e tetR de pIB344 num fragmento de EcoRI até BstI. Destruíu-se o vector pUCS tratan do-o com SspI, porque possui o mesmo determinante de selecção (resistência a ampicilina) que pOH19. 0 plasmídio pGH19 foi cortado com EcoRI e PstI e depois ligado com o fragmento de 2,45 kb que possui os genes tet. Utilizou-se este para transformar Ξ. coli C600, sendo a cultura placada sob selecção das colónias resistentes a tetraciclina. A inserção dos genes tet foi concebida para substituir a maior parte dos genes bla em pOH19, que perdeu assim a sua determinante de resistência a ampicilina. Oonfirmou-se a perda da resistência a ampicilina nos transformantes. Usaram-se então alguns clones para isolar o plasmídio ADN, que foi submetido a análise de restrição. Is to confirmou que o plasmídio construído tinha a estrutura pre tendida; foi designado pTB351. iv) Inserção da sequência cer 0 plasmídio ColEI de ocorrência natural é muito estavelmente mantido em B. coli enquanto que os seus deriva- - 179 -
dos pBR322 e pÁT153 nao o são. Summers e Sherratt (Ge11 36, 1097 - 1103, 1934) demonstraram que este facto se devia aos derivados que não contêm uma sequência curta (233 pb) chamada cer, que se encontra presente no plasmídio de que derivam. Es ta sequência contém um sistema de resolução multimérica do plasmídio específico do sítio que evita a acumulação de multí meros do plasmídio formados por recombinação homóloga. Estes multímeros têm um efeito deletério sobre 0 processo de distri buição que normalmente assegura a herança estável dos plasmí-dios filhos durante a divisão celular das bactérias.
Isolou-se a sequência cer (D. Summers e col., MG-Gr, 201, páginas 334 - 333, 1935) do plasmídio pKS492 (fornecido por D. Sherratt) sob a forma do fragmento de 239 pb, cortando com BamHI e Taql. Isolou-se o plasmídio plB351 como AM de u-ma estirpe dam de E, coli, para, evitar que o seu sítio Glal fosse bloqueado pelo sistema de dam * metilação. Gortou-se es te ADI com BamHI e Glal (tendo sido ambos estes sítios introduzidos no oligonucleótidos sintético para esta clonação). Li gou-se o fragmento cer com 0 vector cortado e em seguida utilizou-se para transformar E. coli 0600, sendo a selecção feita relativamente à resistência a tetraciclina. Submeteram-se as colónias transformantes a análise de clones por restrição com Aval e electroforese em gel. A presença de uma banda de ADI extra a cerca de 300 pb indicou a aquisição do fragmento cer. Usaram-se outras análises de restrição para confirmar que os plasmídios resultantes tinham a estrutura correcta. Um destes foi designado pTB357 (figura 5) e também designado pLB004. b) Plasmídio pGHIOl 0 plasmídio pGHIOl corresponde a pICI0020 (veja--se 0 Exemplo 1 c), com a diferença de 0 fragmento EcoRX-SalI (veja-se a Figura 1) ser substituído por um fragmento que con • siste em SEQ ID IS 50 (veja-se também a Figura 6) e a sequên- 130 -
cia do gene do interferão alfa 2 como é descrito por ií.D. Ed-ge e col., em lucleic Acids Res. 1933, Volume 11, páginas 6419 - 6435· A este respeito, o codão ÁTG· da extremidade 3' do SSQ ID U2 50 precede imediatamente o codão IG-T que codifica a cisteína (aminoácido 1) na sequência do interferão alfa2 na acima, mencionada referência, (M. D. Edge e col., lucleic Acids Research). A sequência, de núcleo tidos GA.T00ATG- na. extremidade 5’ e a sequência de núcleo tidos 3’ complementar, GTAC, são a.s sim omitidas da sequência de nucleotidos da referência acima mencionada. c) Inserção de uma cassete de expressão em PIB557
Isolou-se uma cassete de expressão que consiste no promotor trp, um sítio de ligação do ribossoma e o gene do interferão alfa2, do plasmídio pGHIOl (veja-se b, acima) num fragmento de restrição EcoRI a Sphl. ligou-se este num vector de produção (pIB 357) (veja-se a alínea a, acima) cortado de maneira semelhantemente com EcoRI e Sphl. Utilizou-se este ADI para transformar uma cultura competente de E. ooli C60Q e iso la.ram-se as colónias resistentes a tetraciclina. Algumas destas foram ensaiadas por análise de clones de ADI para a aquisição do sítio de restrição 3stl, existente na cassete de expressão. Os clones positivos a este respeito foram em seguida ensaiados por mapeamento de restrição para verificar se o construto esperado estava correcto. Também foi ensaiada relativamente à capacidade conferida para produzir proteína de in terferão alfa2 como se analisa com gel de poliacrilamida-SDS manchada com azul de Coomassie. Um tal clone confirmado foi designado plB005. d) Inserção do terminador de transcrição 14 em pTB244
Inseriu-se a sequência terminadora de transcrição T4 sob a forma do fragmento Sall a HindIII (67 pares de bases de comprimento) (veja-se SEQ ID'jP 43 e a Eigura 4o) num sí- 131 -
tio de cionação múltipla de um vector intermédio pT3244 (descrito na Patente de Invenção Europeia Numero 237 269) entre os seus sítios Sall e HindXII. Utilizou-se a análise de clo-nes para confirmar a estrutura deste construto (pí3244 14 ter). A partir deste vector, isolou-se então um fragmento SstI a Sphl contendo a maior parte dos sítios de clonação múltipla, e o terminador 14· Inseriu-se este em pLB005, igualmente cortado com SstI e Sphl, substituindo dessa forma o gene do inter-ferão alfa2, mas deixando uma cassete que consiste num promotor, sítios de clonação múltipla e terminador 14. Oonfirmou--se este construto por análise de clones e designou-se o pias mídio por pLB013. e) Substituição do sítio de clonação múltipla 0 sítio de clonação múltipla em pLB013 não é o ideal para este vector por diversos motivos : os sítios de Sall, BamHI e Smal não são únicos mas existem algures no pias mídio. Esse fragmento foi por consequência cortado por corte com SstI e Xbal (ambos únicos) e, em seu lugar, inseriram-se oligonúcleotidos sintéticos com a sequência SEQ ID P 51
5' i GCIC Cil ΪΑ IG G'I AC C AG-AT C ‘ LO1 TC GAGA Gi'AG T T G GIAΪ AC C A TG GT C JAGAGAGC1010 A1GAAGAT 0 51
Analisaram-se os clones relativamente à aquisição dos novos sítios de restrição e em seguida confirmaram-se por sequenciamento. Um tal plasmídio foi designado pIB014. Os novos sítios de clonação inseridos desta forma são Ndel, Ehpl, BglII. Xhol e Seal, com os sítios prévios Xbal e Sall a seguir. f) Outra modificação A Requerente descobriu que os sítios SstI e Ndel adjacentes em plB014 não podiam ser cortados por ambas estas 1S2 -
enzimas de restrição nem simultânea nem sequencialmente, presumivelmente por causa da sua proximidade. Portanto, inseriu--se uma sequência adicional entre eles. Isso fez-se cortando p!íB014 com SstI e Knpl e depois inserindo o oligonucleótido sintético de SBQ ID Ija 52 5' aGGTGAGOIGCAGCATATGGIÃC G1C GACGTCGTA TAC 5’
Analisaram-se os clones relativamente à aquisição do sítio extra PvuII ou PstI e, em seguida, confirmou-se por sequenclamento. Um tal plasmídio foi designado pIB015 (= pICI0080) (veja-se a Eigura 7)· Este plasmídio, ao contrário de pIB014, é eficientemente cortado por SstI e Mel. Isto destina-se a proporcionar um sítio para inserir uma variedade de sequências de sítios de ligação a ribossomas correctamente posicionados em relação ao promotor de montante trp e com Ndel concebido para proporcionar 0 codão de iniciação ATG do gene a expressar.
Exemplo de Referência 31
Construção do Plasmídio PIGI1295 (também designado por pC&300) a) Produção de pQG-54 a partir de pIQI1079 pICI1079 é um plasmídio derivado de pÂT153 resistente a ampicilina, que contém os seguintes elementos entre os sítios de restrição EcoRI e Styl i) um 01857 do fago lambda; ii) um promotor lambda P-^; iii) um sitio de ligaçao de ribossoma sintético; iv) uma sequência do gene do interferão alfa2 sintética; v) uma sequência terminadora de transcrição sintética, derivada do fago 14 entre os sítios de restrição Sall e - 183 - 3.
Styl. A sequência de ADN deste terminador de transcrição está representada na Figura 4 e SEQ ID N2 53· 0 plasmídio pIGI1079 está representado na Figura 0 plasmídio pICI1079 foi depositado, de acordo com o Tratado de Budapeste, nas Colecções Nacionais de Bactérias Industriais e Marinhas Limitada (National Collections of Industrial and Marina Bactéria Limited (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB2 1RY, Escócia, Reino Unido (NCIMB N2 40370, data de depósito : 19 de Fevereiro de 1991).
Construíu-se pCG-54 a fim de tornar disponível um vector de expressão contendo o mesmo promotor, sítio de ligação de ribossoma e sequências terminadoras de transcrição como se referiu acima, isto e lambda ?L» RBS7 e T4, mas a que falta a sequência de genes que codifica a produção de uma pro teína específica. Esse construto proporcionaria a facilidade de se obter um vector de expressão básico que contem os elementos essenciais que permitem a transcrição e a translação para produzir qualquer proteína de interesse que possa ser in troduzida neste vector por subsequentes acontecimentos de cio nação * A construção do vector iniciou-se por clivagem com endonuclease de restrição de pIGI1079 nos respectivos sítios EcoRI e Sall. Esta operação de clivagem libertou um frag mento vector que contêm 0 esqueleto de pICI1079 completo com genes para replicaçao dos plasmidios e as funções de resisten cia a antibióticos, mais a sequência terminadora da transcrição T4. Isolou-se este fragmento por operações de purificação em gel de agarose utilizando Geneclean na purificação final do fragmento de ADN.
Neste fragmento vector, introduziu-se um segundo - 184 -
fragmento de ADR mais pequeno com aproximadamente 1,2 kb de tamanho. Este segundo fragmento pode ser obtido, por exemplo, por síntese de ADR ou por mutagenese dirigida ao sítio ou por PCR do fragmento de restrição de pequenas dimensões EcoRI--Sall, obtido a partir de pICI1079, como se descreveu acima. Este segundo fragmento continha exactamente o equivalente a promotor e as sequências do sítio de ligação de ribossoma como originalmente presentes em pICI1079 e, adicionalmente, tinha sítios EcoRI e Sall disponíveis nas suas extremidades 5' e 3', respectivamente, de maneira a proporcionar extremidades compatíveis para ligação ao fragmento pIGI1079. A reacção de ligação na presença de T4 ADE ligase, enzima de G-ibco-BRIi e do seu respectivo tampão, teve como resultado a formação do construto pCG-54.
Isolaram-se originalmente clones deste construto seguindo-se a transformação de uma parte alíquota da mistura reaccional de ligação em células competentes da estirpe HB101 de E. coli. 0 construto pGG-54 assim recuperado tinha o tamanho correspondente a 3,682 kb e continha caracterísricas espe cíficas essenciais como se esboça no mapa representado na Ei-gura 9. b) Produção de pGG-61 a partir de pGG54 (também designado por pI0I54)
Conceberam-se sequências de oligonucleótidos sintéticas de modo a incluírem tanto a sequência natural do promotor I7A3 como também uma sequência que proporcionasse uma região de iniciação da translação efectiva para permitir 0 processamento correcto de qualquer sequência de genes de poli-péptidos elonadas a ele adjacentes. Uma sequência candidata a propriada para esta última região foi identificada como RBS1,
Λ M a sequencia de ligaçao de ribossojnas trp. Por conseguinte, - 185 -
sintetizaram-se dois oligonucleotidos complementares identifi cados como SEQ ID P 54 e SEQ ID P 55, para originar um liga dords AM de fita dupla que incorpora o promotor T7A3 e as se, quências RBS1.
Prepararam-se os oligonucleotidos como 34 meros de acordo com a maneira de proceder normal, usando um sinteti zador de genes ABI. Eles foram concebidos de modo que na forma de fita dupla os fragmentos sintéticos tivessem sítios de en-donuclease de restrição, EcoRI e Knpl, nas extremidades 5' e 3', respectivamente. Devido ao seu comprimento, os oligómeros não puderam ser purificados por meio de HPLO e a purificação realizou-se por meio de electroforese em gel de acrilamida, u sando um gel com 10% de acrilamida : ureia 7 M.
Antes da purificação, os oligómeros foram primeiramente verificados num gel de separação de tamanhos para garantir que eles não só são de tamanho correcto mas que também as amostras preparadas contem como proporção maior os oligeme ros necessários e não uma proporção altamente contaminante de oligonucleotidos secundários mais pequenos que resultam como subprodutos da síntese.
Prepararam-se os geles de acrilamida por métodos normais com persulfato de amónio e N,,Ν'-tetrametilenodia mina usados como catalisadores para a polimerização dos geles. A distribuição dos tamanhos dos oligonucleotidos necessitava que pudessem ser visualizados depois da electrofo rese. Portanto* foi necessário marcar radiactivamente as amojs % P f tras usando P. Isto tornou possível verificar a qualidade da amostra a seguir à electroforese por meio de auto-radiogra fias.
As amostras de oligonucleotidos foram fornecidas • sob a forma não fosforilada bruta. Este factor tornou possí- - 186 -
vel a utilização para finalidades de rádio-marcação devido ao facto de as amostras poderem ser marcadas "a quente" nas extremidades 5’ por fosforilação usando a enzima 14 polinucleó-tido-quinase.
Os oligómeros foram obtidos a partir da síntese sob forma não fosforilada e, assim, depois da purificação, ca da oligómero foi individualmente submetido a uma reacção de fosforilação em que se utilizou ATS para fosforilar a extremi dade 5’ de cada molécula na presença de T4 polinucleótido-qui nase (veja-se Molecular Oloning : A laboratory Manual, 2& Edi ção, Sambrook, Eristch e Maniatis, páginas 5.68 - 5*71). Uma vez fosforilados, os dois oligonucleótidos complementares foram cozidos conjuntamente para formar o AM duplo de fita dupla que contém o promotor Ϊ7Α3 e a sequência RBS1. A molécula vectora pGG-54 foi clivada com enzimas de restrição EcoRI e Enpl. Por digestão de restrição, geram--se um fragmento vector de 2,3 kb e um fragmento de 1,1 kb que contêm o promotor lambda e a sequência RBS1. Esta operação de clonação é planeada para substituir a sequência lambda V -RBS1 por um fragmento sintético EcoRI a Ehpl que compreende a sequência T7A3-RBS1. 0 fragmento vector de 2,3 kb resultante da digestão de pCG-54 foi purificado por um modo operatório que utiliza a electroforese em gel de agarose e a metodologia de G-eneclean para remover o ADR de fragmentos de agarose.
Ligou-se o fragmento sintético EooRI-KnpI de 84 pb à molécula vectora acima preparada e utilizou-se o ADR assim ligado para transformar células de E. coli HB101. A selec ção de clones recombinantes positivos fez-se por resistência a ampicilina. A seguir a transformação, seleccionou-se um numero de colónias que contêm plasmídio recombinante para finalidades de selecção. 0 fragmento sintético incorporado no vector duran - 187 - te a clonação era de um tamanho (84 meros) tal que torna a aná lise de restrição das amostras de AM do plasmídio recombinan te inadequada como simples método de separação. Os insertos de tamanho assim tão pequeno não são facilmente evidenciados na electroforese em gel de agarose. 0 fragmento propriamente dito não contém sítio de clivagem por endonuclease de restrição que possa servir como diagnóstico da sua presença. A se-lecção inicial dos clones recombinantes realizou-se, portanto, pelo método da hibridização das colónias (veja-se G-runstein e Hogness, Proc. lati. Acad. Sei. J2, 3961 (1975))· Eiltros de nitrocelulose que contém o plasmídio AM imobilizado provenien te dos clones recombinantes foram hibridizados contra uma a-mostra preparada por radiomarcação aleatória dos oligonucleó-
tidos recozidos sintéticos SEQ ID 12 54 e SEQ ID 12 55. 0 AM =52 ~ foi marcado usando alfa^ P-dGTP e por incubaçao com polimera-se de Elenow a 37°G durante duas horas. Escolheram-se as colo nias recombinantes que originaram reacção de hibridização posi tiva para a preparação do ADI do plasmídio. Preparou-se ADN plasmídico em cada caso por um processo em relativamente larga escala incorporando a centrifugação por densidades em gradiente de GsCl, para garantir a pureza (veja-se "Molecular Gloning - A laboratory Manual", 2â Edição, Sambrook, Eritsch e Maniatis (Gold Spring Harbor laboratory, 1989), páginas 1.42 - I.52). A preparação de ADI por este método garante um material de elevada qualidade, apropriado para utilização em subsequentes manipulações de clonação e análises de sequências.
Todo o plasmídio ADI isolado a partir de clones recombinantes foi incluído numa segunda selecção por análise de sequências para garantir que a sequêniea de oligonucleóti-dos nas junções de clonação e do fragmento T7A3-RBS1 propriamente dito era absolutamente correcta. A maneira de proceder de sequenciamento utilizada foi a de Sequenase e 0 primário de sequenciamento escolhido para utilização foi, por exemplo, pBR322 UP (primário universal pBR322). 0 sequenciamento efec- - 188 - tuou-se usando a técnica de sequenciamento da terminação de didesoxi da cadeia de Sanger.
Os clones que têm a sequência correcta foram designados como novo construto de expressão pCG-ôl e contêm o promotor T7A3, a sequência RBS1 e a sequência 14 terminadora (veja-se a Pigura 10). c) Produção de pGG-300 a partir de pOG-61 (também designado o primeiro como pIGI1295)
As operações de sequência e de síntese envolvidas na construção do análogo (Ser"^*^) G--0SP hu de G-CSP foram as descritas no Exemplo de Referência 3 (veja-se Pigura 3). Esta sequência do análogo de G-CSP foi isolada a partir de um construto em que se tinha incorporado o gene no plasmídio pSTPl para se obter pICI1107 (veja-se o Exemplo 2). Bigeriu--se pIGI1107 com Seal e isolou-se o fragmento de grandes dimensões a seguir à electroforese com gel de agarose e purificação com Genecleán. Este fragmento foi então digerido com a endonuclease de restrição Sall para originar um gene (Met , Ser^*^) G-CSP hu num fragmento de restrição Seal a Sall a-propriado para clonar em pCG-61 (veja-se a Eigura 10). A seguir à restrição com Sall, isolou-se o frag-mento necessário usando mais uma vez técnicas de purificação em gel de agarose.
Digeriu-se a molécula vectora pOG61 com enzima de restrição Knpl. A clivagem com esta enzima cria um prolongamento saliente 3'» que, em seguida, é transformado de maneira a ficar com a extremidade insensibilizada usando a enzima T4 polimerase (veja-se "Molecular Gloning - a laboratory Manual", 2^ Edição, Sambrook, Eritsch e Maniatis, páginas 5»44 - 5-47)· Inactivou-se então a actividade de T4 polimerase por acção do • calor mediante a incubação a 70°G durante trinta minutos e re - 189 -
cuperou-se ο ADR por precipitação com etanol. Dissolveu-se o pelete em água destilada esterilizada e clivou-se o AM solu-bilizado com Sall. Recuperou-se o fragmento do vector Knpl (agora com a extremidade insensibilizada) até Sall por meio de precipitação com etanol, seguida de electroforese em gel de agarose e técnicas de purificação. 0 fragmento (Met”1, Ser1^*^) G-QSE hu de Seal até Sall foi então ligado ao vector Enpl a Sall com a extremi dade insensibilizada. 0 AM ligado foi transformado em estirpe HB101 de E. coli. A selecção dos clones recombinantes foi feita por resistência a ampicilina. A selecção inicial de cio nes recombinantes potenciais foi feita por meio de hibridiza-ção.
Preparou-se uma amostra radlomarcada por marcaçao aleatória de um fragmento EcoRI a Sall (contendo a sequência -1 17 ?7 do gene (Met , Ser * ) G-CSE hu) preparado a partir de plasmídio pICI1107. Utilizou-se este em hibridização contra colonias cujo ADR foi imobilizado sobre a superfície de filtros de nitrocelulose. Subsequentemente, preparou-se o plasmí dio AM a partir de vinte e quatro clones que tinham sido hi-bridizados nesta selecção.
Todas as preparações de ADR foram feitas pelo método rápido da mini-preparação (veja-se Birnboim e Doly, Ru-cleic Acids Research, 7» 1515, 1979)· Estas preparações de ADR recombinante foram submetidas a uma segunda selecção por meio de análise de restrição. A linearização do ADR com BamHI, que é um sítio único dentro da cassete de expressão, é indica Λ — 1 Ί *7 27 * tiva da presença da sequência de (Met" , Ser ') G-CSE hu.
Realizou-se a análise de sequência para confirmar a presença do gene (Met”1, Ser1^*^) G-CSE hu e para verificar que a sequência de base nas junções de clonação e através do • gene (Met”1, Ser1^) G-GSE hu era correcta. Para esta fina- - 190 -
lidade, prepararam-se amostras do plasmídio áDN em larga esca la a partir de dezasseis clones recombinantes, usando a tecni ca de centrifugação com gradiente de densidade de GsCl para garantir a pureza. Realizaram-se as operações de sequenciamen to de acordo com a maneira de proceder de sequenciamento e o primário de sequenciamento escolhido era o primário universal pBR322 (EcoRl). Dois dos clones recombinantes continham a sequência correcta na extremidade de Seal do fragmento (Met"*\ Ser1 * 1 ) (t-CSF hu e ao longo da própria sequencia do peptido Gr-CS3P. Os clones foram identificados como construto de expres são pCG300 (veja-se a Eigura 12).
- 191 -
(2) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 1: (i) CARACTERÍSTIOAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 62 (B) TIPO: Icido nucleico (0) TIPO DE PITA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 1: AATTCAGT ACT OOA CTG GGT GOA GCA ÁGC TCT CTG CCG CAG TCT TTC47 CTG CTG AAG TGT O TC 62 (2) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N® 2: (i) GARAGTERÍ STIC AS DA SEQUÊNCIAí (A) COMPRIMENTO: 64 (B) TIPO; Icido nucleico (0) TIPO DE PITA: Única (B) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 2: CTG 1 TTC GAG ACA CTT CAG CAG GAA AGA CTG CGG TGG . ACC CAG TGG AGT ACTG (2) INPORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N5 3: (i) CARACTERÍSTIOAS DA SEQUÊNCIA; (A) COMPRIMENTO: 60 (B) TIPO: Ãcido nucleico (0) TIPO DE PITA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 3: 64 GAA GAG GTA CGT AAA ATT GAA GGG GAT GGT GOG GCT GTG GAG GAA 45 AAG CTG TGC GCA ACC 60 - 192· "
(2) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 4í (i) CARAGTERÍSTIOÂS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 60 (B) TIPO: Ácido nucleico (c) TIPO DE FITA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NS 4: ΤΤΤ GTA GGT TGC GOA DAG CTT TTC CTG GAG AGO GGC ACG ATC GCG 45 TTG AAT TTT ACG TÁC 60 (2) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID Ne 5: (i) GARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 48 (B) TIPO: Ácido nucleico (c) TIPO DE FITA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID m 5: TAG AAA CTG TGC O.AG CGT GAG GAA CTG GTG CTG GTG GGT GAG TCT 45 CTG 48 (2) (i) (A) (B) (G) (B) (xi) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID RS 6; CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO: 51 TIPO: Ácido nucleico TIPO DE FITA: Única TOPOLOGIA: Linear DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 6: GGG GAT GCG CAG AGA GTG AGC GAG CAG CAC GAG TTG CTG AGG GTG 45 GCA CAG 51 - 193 -
(2) INIORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID NS 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 63 (B) TIPO: Ácido nucleico (c) TIPO DE PITA: tíni ca (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÁO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID Nô 7: GGG ΑΤΟ 00G TGG GCT GOA CTG AGO TCT TGO OCG TOO GAA GOT TTA 45 OAA OTG GOA GGO TGO TTG 63 (2) INEORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N^ 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA' SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO; 60 (B) TIPO: Ácido nucleico (0) TIPO DE EITA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÁO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 8: CTG GOT CAA GCA GCC TGC CAG TTG TAA AGO TTG GGA OGG GOA AGA 45 GOT CAG TGG AGO OCA 60 (2) INEORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N^ 9: (i) CARACTERÍSTIOAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 63 (B) TIPO: Ácido nucleico (C) TIPO DE EI TA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÁO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NS 9: AGC CAG OTG OAC TGC GGT OTG TTG OTG TAO CAG GGT CTG CTG CAG 45 GCT CTA GAA GGO ATO TOT 63 - 194 "
(2) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 10: (i) GARAOTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 63 (B) TIPO: Icido nucleico (0) TIPO DE FITA: Única (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇlO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 10: TTC AGG AGA GAT GGO TTG TAG AGC CTG GAG CAG AGG CTG GTA GAG 45 GAA GAG AGG GGA GTG GAG 63 (2) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 11 (i) GARAGTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 60 (B) TIPO: acido nucleico (c) TIPO DE FITA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇlO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 11: GCT GAA TTG GGG GGG AGG CTG GAG ACA CTG GAG GTG GAG GTT GCC 45 GAC TTO GGT AOT AGG 60 (2) (D (A) (B) (0) (D) (xi) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 12: CARACTERÍSTIGAS DA SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO: 63 TIPO: Icido nucleico TIPO DE EITA: Única TOPOLOGIA: linear DESCRIçlO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 12: TTG CCA TAT GGT AGT AGG GAA GTG GGC AAO GTG CAG GTG CAG TGT 45 GTC GAG GGT GGG GGG GAA 63 - 195
ATA TGG CAA CAG ATG- GAG GAA CTG GGT ATG GGT GCG GCÁ GIG GAG 45 CCG ACI CAG GGI GCG ATG 65 (2) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 14 (D OARAC TERÍ SUGAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 60 (B) TIPO: Ácido nucleieo (C) TIPO DE FITA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID IP 14: IGC TGG OAT CGC ACC CIG AGT CGG GIG GAG TGG GGG AGG GAI AGC 45 GAG ITC CTC CAT GTG 60
(2) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 13 (i) CARACIERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 63 (B) TIPO: Ácido nucleieo (0) TIPO DE EITA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESORIÇlO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID IP 13: (2) (D (A) (B) (0) (D) (xi) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID Ne 15: CARACTERÍSTICAS DE SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO: 60 TIPO: Ácido nucleieo TIPO DE PITA: Única TOPOLOGIA: Linear DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 15: CGA GOA ITC GCG 101 GGI TIC GAG CGG CGC GCÁ GGG GGI GTI CIG 45 GIT GCC TCC CAI CTI 60 - 196 -
(2) (i) (A) (B) (0) (D) (xi) INIOMÁÇDBS SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 16: CARAGTERÍ STICAS DA SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO: TIPO: TIPO DE PITA: 60 Ácido nucleico Única TOPOIO GIÁ: linear DESCRIÇlO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NS 16: GCT CTG AAG ATG GGA GGG AAG CAG AAG AOO GGG TGG GGG GGG CTG 45 GAA AGO AGA GGG GAA 60 (2) (i) (A) (B) (C)(D) (xi) INPORKÂçOES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 17: OARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO: 55 TIPO: TIPO DE PITA: TOPOLOGIA: Ácido nucleico Única Linear DESCRIÇlO DA SEQUÊNGIA: SEQ ID N2 17: CAG AGG TTC CTC GAG GTG TCT TAC CGC GTT CTG CGT CAC CTG GCC 45 CAG CCG TTAG 55 (2)(D (A) (B) (0) (D) (xi) INPORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 18: CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO: TIPO: 53 Ácido Nucleico TIPO DE PITA: Única TOPOLOGIA: Linear DESCRIÇÁO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 18: TCGACTTA CGG CTG GGC CAG GTG ACG CAG AAC GCG GTA AGA CAC CTC47 GAG GAA 53 197 -
(2) INEORMAÇÕES SOBRE á SEQUÊNCIA ID N2 19« (1) OARACTERÍSTICAS EA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO; 21 (B) TIPO: Ácido nucleieo (C) TIPO BE EITA: Única (B) TOPOLOGIA; Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA; SEQ ID Nô 19: 21
TACAACTGGC AGGCTGCTTG A (2) INEORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 20: (1) OARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 (B) TIPO: Ácido nucleieo (C) TIPO DE EITA: Única (D) TOPOLOGIA; Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 20: 21
GACGTTGCCG ACTTCGCTAC T (2) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 21: (i) OARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 (B) TIPO: Ácido nucleieo (C) TIPO DE EITA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID m 21:
TGCCGGAGCC ATACCCAGTT C (2) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 22 (i) OARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 21 (B) TIPO: Ácido nucleieo (C) TIPO DE EITA: Única - 198 21
(D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 22:
GCCTGCCAGI TGTAAAGCTT G (2) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 23 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 (B) TIPO: Icido nueleico (C) TIPO DE PITA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 23:
GCACCATCGC CTTGAATTTT ACGTAG (2) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 62 (B) TIPO: Icido nueleico (c) TIPO DE EITA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 24: AATTCAGT ACT CCA CTG GGT CCA GOA AGC TCT CTG CCG CAG TCT TTC47 CTG CTG AAG TCT CTC 62 (2) INFORMAÇÕES SOBRE Á SEQUÊNCIA ID N2 25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 64 (B) TIPO: Icido nueleico (c) TIPO DE EITA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 25: CTG TTC GAG AGA CTT CAG CAG GAA AGA CTG GGG CAG AGA GCT TGC 45 • TGG ACC CAG TGG AGT ACTG 64 - 199 - (2)
(D (A) (B) (0) (D) (xi) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID R2 26: CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO í TIPO: TIPO DE FITA: TOPOLOGIA: 60 Ácido Nucleico Única Linear DESCRIÇÁO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 26: GAA CAG GTA CGT AAA ATT CAA GGC AGC GGT GCG GCT CTG CAG GÁA 45 AAG CTG TGC GCA ACC 60 (2) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 60 (B) TIPO: Ácido nucleico (c) TIPO DE FITA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÁO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 27: TTT GTA GGT TGC GCA CAG GTT TTC CTG CAG AGC CGC ACC GCT GCC 45 TTG AAT TTT ACG TAC 60 (2) (i) (A) (B) (C) (D) (xi) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 28: CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO; 29 TIPO: Ácido nucleico TIPO DE FITA: Única TOPOLOGIA: Linear DESCRIçlO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 28: CTT CAG CAG GAA AGA ACG CGG CAG AGA GC 29 (2) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2,29: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO 33 • (B) TIPO: Ácido nucleico 200 -
I > (0) (D) (xi)
TOPOLOGIA: linear DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID Re 29:
GC TTG GGA AGA GCA AGA GCT CAG AGA AGC CCA C (2)(D (A) (B) (G) (D) (xi) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID R2 30: CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA; COMPRIMENTO: 40 TIPO: Ácido nuoleico TIPO DE FITA: Única TOPOIOGIA: Linear DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 30; 33 CTG TTG CCA TAT GGT AGA AGC GAA GTC TTC AAC GTC CAG G 40
(2) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNGIA ID NQ 31ϊ (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO; 27 (B) TIPO: Ácido nueleico (G) TIPO DE FITA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID m 31: GGT CAG TGG AGC TTT CGG GAT CCC CAG 27 (2) (i) (A) (B) (G) (D) (xi) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID Ν$ 32: CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO: 27 TIPO: Ácido nueleico TIPO DE FITA: Única TOPOLOGIA: Line ar DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 32:
ACG CAG AAC GCG GCG AGA CAC CTC GAG 201 - (2)
(i) (A) (£) (σ) (d) (xi) INPORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 33: CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO: 29 TIPO: Icido nucleico TIPO DE PITA: Única TOPOLOGIA: Dinear DESCRIçlO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 33: 29
I
G TTC GAG AGA CTT TTC CAG GAA AGA CTG C (2) INPORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 34 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 (B) TIPO: Icido nucleico (0) TIPO DE PITA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇlO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 34; C CTG CAG TTT CGC AGC GCT AGC TTG AAT TTT AC 33 (2)(i) (A)(B) (G) (D) (xi) INBORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 35: CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO: TIPO: 37 Icido nucleico TIPO DE PITA: Única TOPOBOGIA: Linear DESCRIÇlO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 35; 37
CAG AGA GTG AGC GAG CTT CAC CAG TTC CTC AGC GTG G (2) (i) (A) (B) (G) (D) (xi) INPORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 36: CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO: 29 TIPO: Icido nucleico TIPO DE PITA: Única TOPOLOGIA: Linear
DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 36: ; GCT CAG TGG AGC TTT CGG GAT AGC CAG AG 202 -
(2) INPORMAÇÕES SOBRE a SEQUÊNCIA ID N2 37: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 (B) TIPO: Icido nueleico (C) TIPO DE PITA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 37: CAG < 3TT TTC CTG CAG ACG CGC AGC GCT ÂGC (2) INPORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 38: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 (B) TIPO: Icido nueleico (0) TIPO DE PITA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID Ne 33: CC GCT GCC TTG AAT ACU ACU TAC CTG TTC 29 (2) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 39: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 (B) TIPO: Ãcido nueleico (c) TIPO DE PITA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 39: GGT 1 TGC GCA CAG ACG TTC CTG CAG AGC CGC (2) INPORMAÇOES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 40: (D CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 (B) TIPO: Icido nueleico (c) TIPO DE PITA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 40: - 203 - 29
G GTG GCA CAG ACG GTA GGT TGC GCA CAG C (2) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID NS 41: (i) CARAOTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 45 (B) TIPO: ácido nucleico (0) TIPO DE PITA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NS 41: CG GGG CAG AGA GCT TGC ACG GTA GGT TGG AGC OAT TGTCGATÁCC 45 > (2) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 42: (D CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 (B) TIPO: ácido nucleico (c) TIPO DE PITA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID m 42: G TAC CTG TTC GAG AGA ACG CAG CAG GAA AGA (2) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID NQ 43: (D CARAOTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 174/177 amino ácidos (B) TIPO: Ámino ácido (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 43: Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin 1 5 10 31
Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gin Vai Árg 15 20
Lys Ile Gin Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gin Glu 25 30 - 204 -
lys leu (Vai Ser Glu) Oys Ala Thr Tyr lys : 35 40 Cys His Pro Glu Glu leu Vai leu leu Gly His 45 50 Ser leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro leu Ser Ser 55 60 Cys Pro Ser Gin Ala leu Gin leu Ala Gly Cys 65 70 leu Ser Gin leu His Ser Gly leu Phe leu Tyr 75 80 85 Gin Gly leu leu Gin Ala leu Glu Gly Ile Ser 90 95 Iro Glu leu Gly Pro Thr leu Asp Thr leu Gin 100 105 leu Âsp Vai Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp 110 115 Gin Gin Met Glu Glu leu Gly Met Ala Pro Ala 120 125 leu Gin Pro Thr Gin Gly Ala Met Pro Ala Phe 130 135 I40 Ala Ser Ala me Gin Arg Arg Ala Gly Gly Vai 145 I50 leu Vai Ala Ser His leu Gin Ser Phe leu Glu 155 160 Vai Ser Tyr Arg Vai leu Arg His leu Ala Gin 165 170 Pro (em que m é 0 ou 1), 1 - 205 -
(2) INEORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 44 (D CARAGTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 168 + 166 (B) TIPO: Ácido nucleico (0) TIPO DA EITA: Dupla (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 44:
AATTCTGGCA AATATTCTGA AATGAGCTGT GACCGT TTATAAGACT TTÀCTCGAGA
AGTTAACTAG TACGCAAGTT GACGTAÁAAA TCAATTGATC ATGCGTTCAA GTGCATTTTT
AATGGTACCG GGGGATCCTC TAGAGTGGAC TTACCATGGG CCCCTAGGAG ATCTCAGCTG
CCCGCCTAAT GÂGCGGGCTT TTTTTTAT GGGCGGATTA CTOGCOGGAA AAAAAATAGG TGACAATTAA TCATCGAAOT 50 ACTGTTAATT AGTAGCTTGA 46 GGGTATCGAC 90 CCOATAGCTG 86 CTGCAGGCAT GCAAGCTTAG 140 GACGTCCGTA CGTTCGAATC 136 168 166
(2) INEORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 45: (i) CARAGTERÍSTIOAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: (B) TIPO: (0) TIPO DE EITA: (D) TOPOLOGIA: (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA 554
Nucleótido com correspondente proteína Única
Linear SEQ ID m 45s AATTOAGT AGT CGA GTG GGT CCA GOA AGO TOT GTG GGG OAG TGT TTG CTG 50
Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu 15 10 GTG AAG TGT OTO GAA OAG GTA GGT AAÁ ATT OAA GGG GAT GGT GGG GCT 93 206 -
vo CM O oo vo σ\ σ> IO co H H CM CM tO to o3 O «4 P O R cb P O K*5 EH H O cb •P H to *4 H cb CD EH ra cb H EH ctf H EH ra *4 cb cb -4 CO O R cb cb cb > H •4 g cá cb P LA cb 2 cb P -4 P O Pi EH Kb LA H <3E| H 4- EH ra *4 H -4 H «4 ra H CM cb cb O R D cb cb cb cb -4 3 cb rH í>t EH o <4 o o O R <4 P cb P cb P H O r O R CO cb ra EH ra EH ra EH ra tb o ft O Ph <4 co O R O Hl O H Pt o ra EH 03 cb P LA EH cô cb P -4 P ra <4 •H p H EH ra O H •4 rH *4 H *4 o cb <4 EH Hi cb -4 o cb cb cb rb O ra cb Pi O ra cb p O cb P cb P H O >>3 cb R cb i>3 <4 H cn EH ra <4 H Cb EH O EH EH EH O o cb O Hl cb cb P in cb P cb O o rb cb P <4 R LA cb -P rH CM EH 0) o R cb r-1 EH ra o rp O EH ra cb O R o Ph cb cb o Hl <4 EH rH <4 S ra -4 ra O o ra <4 05 cb p o Pí cb P O H <4 4- EH H 3 H EH ra -4 ra <4 rH CM H «4 R <4 H <4 o Hl cb -4 O cb r-1 ra O R cb Kb LO cb P EH >» cb p *4 P í-b *4 í>3 cb H in EH ra cb H EH ra <4 H 1-3 Eh EH cb cb O Hl cb cb O PI o cb hO O R cb p -4 P o cb P O R cb Pi R O R EH ra -4 H !> 4 H O rP cb R -4 <4 EH O Hl O cb O cb <4 EH EH EH H <aj 05 EH R <4 P O R LA O O <4 ra /tf H O ra EH ra *4 hs 00 O R EH H í> cb <4 EH co EH R EH EH o Ph <4 H P Q o ra O ra EH ctí cb P cb O O R H CM cb rb *4 •H O rH EH ra cb H O O Λ cb EH O O ffl cb O Hl cb cb H -4 EH P cb P LA EH rb <4 P O ra cb P EH R IA H EH CD to Cb H <4 H EH Λ EH ra O Λ H cb O R cb cb o cb EH Ph EH R <4 EH H P cb ra o P o o R cb P -4 P EH ctí <D <4 !jb EH ra IA o ra EH ra <4 rH O H 1-3 <4 h3 O M EH co O i—1 cb cb cb <4 ra *4 P cb P cb o IA EH Kb EH O o ra rb •4 H EH ra o R CO cb H O R EH rP O cb cb O 1-3 o Ph cb cb o Ph EH Ph CQ cb £ cb H o ra o R o EH R O P< çb <4 H EH o3 cb rH o ra ω O ra •4 ra O cb cb !> EH O EH CO EH co cb -4 P LA cb 3 cb P EH R O ra O ra LA o o3 CD rH EH 0) EH ra o ra <4 •H EH H CA O rH Hl O (-3 O Hl EH co o K *4 H cb -4 - 207 - )
•Φ C\J O CA 00 IA •Φ "Φ LA cd ri cb VH EH ri cb ri o Φ © O (D *4 H O ri c- P Eh 02 O cb o s H o ri te o cd EH ri cb ri o rH EH © *=4 H p *=4 O H O P © -P a © O EH 03 o cd ri EH *4· «4 H o rH © EH te H O ffi cb <4 X) ri o «4 cd O ri IA cb ri O rH O © tn EH © te P < EH 03 rH O p CQ *«4 O O cd O KJ Q © ri O ri o H «4 •H C— ri o Ph cb <4 O W H • 1 o CD o CÍ5 -p EH H EH b0 ri Φ ·· EH (D EH cd P S CD <tj F—H cb >> O *4 O! o 'Φ CÍ3 te o cd cb ri P ri Ol o H EH © EH © o o te p *4 O P O P H te •H P EH la EH H EH H <4 ·· H cb H ia EH cd EH n3 H <4 vO ri P cb H Cb > P > O H © cd 3 θ’ te O rH o © te P ri EH »>5 IA O bO HpH te •"Φ O •H ri 02 «4 H cb H Φ P ri te <p£] IA ri ri •H O cb cb cb rH o «4 θ’ te LA te «te P ·% te σ *£4 EH ri O >? o ri ia m te H O Λ cb rH «4 ÈH CD 02 O •«4 EH cb cb EH H <4 te P •4 «te O «4 cd EH ri "Φ m P te O ri o H O © CA g Qf o Ph δ < EH 02 LA pq 02 te o <4 03 P ri o b0 P H 02 o ·* <4 H cb ri EH cd H ·· *4 *4 o cb O < P í> 02 EH O EH P cb PP 02 EH te >« P ri O bfl P ri o Ή te te <4 0 EH © IA cb ri «4 H o> te te M l<4 O H rH o «4 P P <4 te g te P O EH H P Q H <4 cd cb ri IA o ri prj o te ·* P P4 s H <4 rH Φ EH © O <d te o O O O <4 O P H O p te Ph S te te te 02 P te <r| o H H o te o o © O © o H O o EH EH EH P o ri EH Λ EH Λ CD P o Ph EH Ph EH Ph H EH cd EH cd O ri «d -—·> S s N r—\ -·—* •H O r4 P rH P © *4 OJ "H «4 te O P M p <4 cb < -4 02 EH v_t s_> v_·» '—/ AATTCAGT ACT GOA CIG GGl CCA GOA AGG TCT CTG GGG GAG TGT TTG GTG Thr Tro leu Gly Pro Ala Ser Ser leu Pro Gin Ser Phe Leu - 208 - 00cn OTG AAG TCT CTC GAA CAG GTA GGT AAA ATT GAA GGO AGC GGT GGG GGT leu Ιξβ Ser leu Glu Gin Vai Arg lys Ile Gin Gly Ser Gly Ala Ala o ia lac\i
O
LD «M· C\J 0 co -M- cn Ά cn LA H H CM CM CA ΙΠ δ <4 P O ri CÍJ ri Ο ί>5 δ δ *4 H δ 0) EH Φ δ δ δ cd δ δ «4 CO O μ} δ δ δ > δ ri LA CÍS 2 CÍJ ti «4 Cá ο Ά -4 H EH Φ <4 Η •4 δ <4 CQ δ Cts O H O δ δ δ δ <4 Eh O <4 O Q O ti *4 cá δ ri O ti O C-j CD CÍJ φ δ φ δ φ a β{ O m <4 C0 ο δ Ο δ 0 CQ EH cd CÍJ Cá ΙΑ δ cti δ ri <4 •H Q H EH ω C- Ρ δ <4 δ 0 M δ <4 EH δ δ <4 Ο δ 0 m CÍJ Pi O CQ δ ti Ο δ ri CÍJ {>5 CÍJ ti CÍJ κ*3 <4 δ cn δ φ δ o EH EH EH Ο Ο δ Ο δ δ ri CÍJ O P ^*5 δ Cá <4 ri δ 0) 0 ri δ Η δ φ ο δ O δ 0 Ph δ δ ο δ <4 δ <4 ra Q 0 0) <4 cd δ Cá Ο Ρι »>5 'Μ EH iH ο δ δ © *4 CQ <4 δ «t* H δ «4 ο δ δ <4 O CÍJ LA δ Cá ΕΗ κΊ δ ri *4 R CÍJ δ LA ΕΗ Φ δ δ δ φ δ EH CÍJ CÍJ Ο δ δ δ ο δ O CÍJ ri <4 Ρ Ο δ ri ο ri O δ Eh 0) <=4 Η C» <4 δ ο δ "4 EH O δ Ο δ ο δ *4 δ -=4 cd EH ri *4 cá ο ti LA ο ο O H O (D ΕΗ φ <4 R> 00 ο ri δ <4 EH CO ΕΗ δ δ δ ο ΡΗ O m O m ΕΗ cd δ ri δ ί’ί δ i-^ <4 •H Ο δ δ φ δ δ EH 0 O jxj δ *4 ο δ δ δ δ ri ΙΑ EH Ra Ρ ο φ δ ri Eh 0) CA CÍJ δ <4 δ δ δ δ φ 0 δ CÍJ CÍJ Ο δ δ δ δ δ δ CQ 0 ri O Ο ti δ ri <4 ri <4 1¾ EH ω LA ο φ ΕΗ φ *4 δ <4 δ O δ ΕΗ C0 Ο δ δ δ *=4 ri CÍJ ri δ ο ΙΑ δ ί» δ ο <4 H EH ω ο ti LD δ δ ο ri cb CÍJ 0 δ ο Ρ4 δ δ ο Ρη δ ti CÍS rH ο CQ ο ri Ο δ ri <4 H EH ,çd δ ο φ 00 ο φ O cb CÍJ !> ΕΗ Ο δ C0 δ co δ ri CÍJ ri ΕΗ ri ο CQ ο φ EH Φ EH ω Ο φ <4 •Η δ δ O δ O Hl ΕΗ C0 ο Μ *4 Η 100 105 110 209
GCC GAG ITG GGT AGI AGG ΑϊΑ TGG GAA GAG ATG GAG GAA CTG GGT ATG 434 Ala Pro Ala leu Gin Pro Thr Gin Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser 130 135 140 OJ o «d- O oo IA A a a a cb tí cb O Ph •'d- <s{ rH o C— O cb o PH rH EH 2 cb £ EH CD <tj H O i-P o cb EH m o cd <4 •H o H O O ix! cb <tj O < O Pt A cb EH o 4) IA EH Φ Cb EH m H D EH «d O cd O ω O cb O H <í •H l> o Cb «4 O W H »· *4 C- EH H EH b0 U Ή- EH EH & cb cb Cb > D -¾ Ol o cb CÍ5 cb o o 3 3 •H EH CD EH CD n CD o O i-P O pi H H O *4 EH H EH rH <4 • t 3 EH cd eh cd H *4 sb EH cb P" cb ρ O H Ph JP O o cd cd cb eh A o ω <FP 'm xb o CD <4 CÍJ H cb Pt <FP •H •rl Pb *4 cb cb H o «4 5* H o sb •Η cb m <y 00 vaj \]ÍD EH o o Pl A ca fp «4 cb H *=4 i>5 CD ca O cb cb EH EH rH <í *4 «4 o <4. cd EH Ph M 3 g H O Φ m «4 EH m ca *4 cb o cb o bO rH ca o ·· EH cB ÍH EH cd H »· <1 EH o cb !>· ca EH O EH cb cb fp ca EH H «· cb W cb $ ÍO Ή S h <4 o cb fH rH o Pd Fp H <4 o «ή cb cb «4 FP S FP cb «4 EH w Q o <4 cb fí A O P § O Pd ·· iTJ n =4 H -Ρ- EH CD O <£{ Ph O O o «4 o cb rH O i—l Ph Pm fcM P—K Ph Ph Ph O P5 *4 o H H O <4 o 0) O <D O H O o EH EH EH EH Λ EH Λ VD O EH Ph EH Ph H cb EH cd ' EH EH O Pi *3? /—s r\ Ov ' <4 O r-f cb CD *=1} OJ <4 pq O R cb <4 *=4 ca EH v—' —' N—✓ cb
AOAAGTTGAC GTAAÁAAGGG TATCGACAATG - 210 -
Ο co ΚΩ LTV
C- C— U3 ΚΩ Q ΚΩ ΚΩ m
Cb Ο3 61 5 ΕΗ ΕΗ ΕΗ ΕΗ *4 ΕΗ ΕΗ ΓΤ_| ΕΗ Η ΕΗ ΕΗ ΕΗ ΕΗ <4 <· <aj *4 ΕΗ «4 •4 4 4 <3} 4
J ·* ο cb C0 cn 4* ο cb 4* ·· ΕΗ <4 CTi οι ω cb o Ol o •4- S ω cb O iS, OX o CQ *4 EH <D •H Ol Ρ tó ο cb O P XSX 0) is; Η 42 -d *4 EH H ai H •Η ΕΗ <4 P O P 4 1« C- -Ρ Ο cb <4 ·· d H Η <4 νο κο ÍH Ο cb H CM d Ο Η ω ai «3 O H tr- d θ’ Ο + Η Η ω ο cb p O o d d PP <ί^ ο Ρι d <4 EH <pq + d H 03 ca Ρ <f§j c- ρ d Ρ cb O £> <3 •H P d ο· ϊ=> co is; Ρ Ρ CÍ5 O θ’ CM O d •H ·· Ρ Ο' cb O PP O* c- *4 P ca Ρ cb o ca pq H ca EH <4 ca O 4 EH <4 <4 is; <4 4 EH •4 <pq pq ο <1 EH pq P D 04 P <y Ρ ca EH <4 pq CQ pq Ο <4 EH «4 o *4 ca ta ο »· 4 EH ca O ·· Η ·* *4 *4 EH H ·· <4 4 C0 ΕΗ Ο ΕΗ EH ca EH o EH P pq ca Bi Η «* O cb PP ca EH H ·· 20 Ή S Ρη <4 *4 EH 20 VH S Ph <4 O ο> pq Η EH *4 o·» flH P H 24 <4 ίϋ| fcr-H γεΙ» Η cb EH *4 4 Pq çC-»t 4 cb O» ΕΗ Η Ρ Ο *4 EH «'JIh EH H R o H SJ Ο ρ4 »« 1-4 <4 <3 o P4 ·· f-H Ph ο <4 Ρη Ο Ο Ο EH <4 cb P «d PH O O o O ρ Ρη *^Η (•'Η Ρη Ρη Ρη <4 EH o Ph pi y=-< Ph Ph Ph ca Ρ «4 Ο Η Η Ο EH <4 EH is; «4 O H H O P Η ο Ο ΕΗ ΕΗ ΕΗ EH «4 *4 EH H O O EH EH EH P <4 EH cb O O cb p cb 4 Φ o /“Ν «—> ο .·—Ν /—Ν cb Eh *4 *’“N /"·> •H (Μ •Η *=4 PQ Ο ρ o *4 EH CM •H 4 P O P -—· Vw' ι—^ EH o cb '—' ___* v—' V-/ v-/ ΕΗ ΕΗ <4 <4 4 ΕΗ «3 ΕΗ ΕΗ «4 Ο cb <4 ΕΗ ΕΗ <4 ΕΗ <4 «4 ΕΗ ΕΗ ã 3 ΕΗ «4 «4 ΕΗ ο cb 4 cb ο ΕΗ Ο Cb Ο cb ο cbο cb ΕΗ «I cb Ο cb Ο 4 ΕΗ cb Ο <5 ΕΗ ΕΗ 4 Ο Cb ο cb ο cb *4 ΕΗ Ρ Ο ψ Ο Φ Οcb ο ΕΗ 4 ΕΗ «4 «4 ΕΗ *3} ΕΗ <4 ΕΗ 211 -
CATGCGGATC CG GTACGOCTAG GGGAAC 72 72 (2) (i) (A) (B) (0) (D) (xi) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 50: CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO: TIPO: TIPO DE PITA; TOPOLOGIA: 11S bases Ãcido nucleico Única Linear DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 50
AATTCTGGOA AATATTCTGA AATGAGCTGT TGACAATTAA TCATCGAACT AGTTAACTAG TACGCAGAGC TCAATCTAGA GGGTATTAAT AATGTTCCCA TTGGAGGATG ATTAAATG 50 100 118 (2) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 51: (D CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 35 + 35 Bases (B) TIPO: Ãcido nucleico (c) TIPO DE PITA: Dupla (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO LA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 51: AGCTGCATAT GGTACCAGAT CTCTCGAGAG TACTT GGTATA CCATGGTCTA GAGAGCTCTC ATGAAGATC (2) INFORMAÇÕES SOBRE Á SEQUÊNCIA ID N2 52: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 23 + 15 bases (B) TIPO: Acido nucleico (c) TIPO DE FITA: Dupla (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 52: 35 35
AGCTCAGCTG CAGCATATGG TAC GTCGAC GTCGTATAC 23 15 212 -
O vo VO LTi CM CM E— C-
Lf\ ri· ri- 00 INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 53: CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: COMPRIMENTO: 72+72
Cb O <4 P ri EH «4 P ri p ri p P ri P <tj P ri P ri ri P P «4 P <4 P <aj P «a! p «4 P <aj o cb o cb o cb o o •H <D H O d fí
CM ·Η pq O P M O Cd H •Η P4 o d "ri P ri •H Η1 <4 ã H P P P ·· o o Ph Ph Η H EH EH • 4 O cb LT\ *4 CSA EH ri- LT\ cb o ol o IA cb o 1¾ o Ol ri P Ή Ol Í25 cb o o Φ ri; ri P H H P P -ri O P P O cb ri ·* d H o cb r. í Uri ri ri σ O H Fh cy p o cb P O o cd cd P co ri P <P 1¾ di o (D co cb o P <P •H •H ri ·· cb o Qf D O d •H ·· ri cb o P cy (X) 'ri P ri H cb o co PI H O p <4 co O rii P ri ri S <4 P p ri <P P <í P P P θ’ P4 cy p P <4 pq CO p co P ri o ri co <1 P to o ·· <! <4 P H *♦ ri ri P P ri o to P o P P O cb ri p co EH P »4 O <4 P ri ra Ή Ph ri o Iri P ri cb Oi P 0 H ?ri o P ri O cb ri p P cb 0> H <4 P O cb ιϋ.} P H P Q H Ph ri o Ph • · Ên P4 O P ri o cb o Ph o O O O co ri P P ri P Pm r—4 Ph Ph Ph CO P P ri ri P P <£j o H H O p P P ri cb o H O o P EH P P P cb o o cb o cb -^s ri cb o --N •H cb P ri '—\ -—> '—H •H o ri P CM •H ri PP O P P o cb v-x —· N-/ •—'
AAT TOA ACA AAA CG-G TTG- ACA ACA TGA AG-T AAA C.AG GGT ACG ATG TAC CAC AAG TTC ACG TAA AAA GGG TAT GG-A CAA TGG TAC - 215 -
(2) INFORMAÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID N2 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 76 (B) TIPO: Ácido nucleico (G) TIPO DE PITA: Única (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 55 CAT TGT CGA TAG CCT TTT TAG GTG MC TTG TGG TÁG ATG GTA GGG 45 TGT TTA CTT CAT GTT GTC AAG CGT TTT GTT G 76 (2) IN PORK AÇÕES SOBRE A SEQUÊNCIA ID Ne (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (D COMPRIMENTO: 24 + 24 (B) TIPO: Ácido nucleico (C) TIPO DE PITA: Dupla (D) TOPOLOGIA: Linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N2 56 24 24
AATTCGCATG OGGATCCATC GATC
GCGTAC GCCTAGGTAG CTAGAGCC
- 214 -

Claims (1)

  1. REIYIEDIGACÕBS - 1* - Processo para a preparação de composições farmacêuticas de libertação contínua contendo polipéptidos, nomeadamente para a terapia hematopoiética de mamíferos, para interromper a proliferação de células leucémicas de mamíferos, para o tratamento de osteoporose ou doença de Paget, para o tratamento de neoplasias ou imunodeficiências, para o tratamento de neoplasmas e de infecções por vírus e/ou para estimu lar o creseimento em seres humanos, caracterizado por compreen der a dissolução do material da composição e da substancia fi siologicamente aetiva num seu dissolvente orgânico ou a disper são do material da composição e da substância aetiva num meio orgânico ou aquoso e, em seguida, a secagem e formulação para obtenção duma composição para implantação ou injecção num ani mal « - 2fi - Processo para a preparação duma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o material da composição compreender um polilactido e por compreender incorporar a substância fisiologicamente ac tiva numa matriz que compreende um polilactido que tem pelo menos 25% molar de unidades de ácido láctico e até pelo menos 75% molar de unidades de ácido glicolieo e compreender ainda a mistura uniforme da substância fisiologicamente aetiva com o material da composição por processamento por fusão de uma mistura solida íntima da substância e do material da composição. - 3ã - Processo para a preparação de composições farma- - 215 -
    ceuticas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida substancia ser um polipeptido covalente-mente ligada a um polímero solúvel em agua, substancia essa que não á significativamente hidrolisado sob as condições que se encontram dentro da composição durante o período de utilização previsto, de tal maneira que a mencionada composição i) quando colocada num meio aquoso do tipo fisiológico liberta o polipeptido para o meio aquoso do tipo fisi£ lógico de maneira contínua, originando um perfil de li bertação que é esseneialmente monofásico durante um intervalo de tempo de pelo menos uma semana; ii) possui duas fases sucessivas de libertação do polipájD tido, sendo a primeira fase libertada por difusão a partir da. superfície e sendo a segunda fase libertada em consequência da degradação do material da composição, sobrepondo-se a fase de difusão e a fase provoca da pela degradação no tempo e a libertação do polipéj) tido ocorrer durante um intervalo de tempo de pelo me nos uma semana; ou iii) absorver água de maneira contínua, originando um per- ff f fil de absorçao de agua que e essencialmente monofasi co, ate o material da composição se ter degradado e essencialmente todo o polipeptido ter sido libertado para o ambiente aquoso do tipo fisiológico durante um intervalo de tempo igual a pelo menos uma semana. - 4§ - Processo para a preparação de composições farmacêuticas, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de uma molécula de substância fisiologicamente activa compreender pelo menos uma molécula de polímero solúvel em á-gua por 3000 - 3000 Da de massa molecular de polipeptido. 216 -
    -5-- Processo para a preparação de composições farmacêuticas, de acordo com as reivindicações 3 ou 4> caracterizacb por o polipeptido ter pelo menos uma das propriedades biológi cas de G-CSi1, de ocorrência natural. - 6» - Processo para a preparação de composições farmacêuticas, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o polipeptido ser um derivado de G-GSF de ocorrência natural que tem pelo menos uma das propriedades biológicas de G-CSP que ocorre naturalmente e uma estabilidade em solução pelo menos igual a 35% a 5 mg/ml, tendo o mencionado derivado pelo menos um grupo Cysx' da sequência natural substituído por um resíduo Ser1^ e Asp2^ da sequência natural substituído por um resíduo Ser2^. 7* Processo para a preparação de composições farmacêuticas, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o polipeptido compreender pelo menos uma outra modificação es colhida de 11 λ a) Glu da sequência natural substituído por um resíduo λ 11 Arg ; 1 π b) leu da sequência natural substituído por um resíduo Glu15; c) Lys da sequência natural substituído por um resíduo Arg23; 26 A d) Gly da sequencia natural substituído por um resíduo Ala26; 28 λ e) Gly da sequencia natural substituído por um resíduo - 217 -
    £) g) h) i) 3 ) k) D m) n) o) p) a) r) s) lys50 ou Arg50; Ala28; Ala'50 da sequência natural substituído por um resíduo Irys54 da sequência natural substituído por um resíduo Arg54; Lys40 da sequência natural substituído por um resíduo Arg40; Pro44 da sequência natural substituído por um resíduo Ala44; leu4^ da sequência natural substituído por um resíduo Lys49; Gly51 da sequência natural substituído por um resíduo Ala51; G-ly35 da sequencia natural substituído por um resíduo Ala55; Trp58 da sequência natural substituído por um resíduo lys58; Pro60 da sequência natural substituído por um resíduo Ser60; Pro65 da sequência natural substituído por um resíduo Ser65; Pro111 da sequência natural substituído por um resíduo 111. Grlu ; Thr115 da sequência natural substituído por um resíduo Ser115; Thr116 da sequência natural substituído por um resíduo Ser116; e Tyr165 da sequência natural substituído por um resíduo λ 165 Arg 218 -
    Processo para a preparação de composições farmacêuticas, de acordo com as reivindicações 6 ou 7, caracteriza do pelo facto de o polipeptido ser escolhido de i ) /“Arg11, Ser17 ’27»60’63J G-CSP humano; ii) /”Glu15, Ser17»27, Ala26’28, I»ys3°J7 G-CSI humano; 111) £~Arg11, Glu15, Ser17,27,6D,65J Ala26»23, lys30J G-CSP humano; iv) /“Arg11’40, Ser17,27,60,65_7 G-0SP humano; v) /"Arg11»23, Ser17’27’60’65_7 G-CSP humano; vi) /“Arg11’163, Glu15, Ser17’27’60’63, Ala26»28, Lys3°’38J G-CSF humano; Tii) yfArg11, Glu15-111, Ser17,27,60,65.115,U6_ Α1&26,28> I»ys3°__7 G-CS3? humano; viii) /”Glu15, Ser17,27, Ala26,23, Arg3°J7 G-CSF humano e ix) /“Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5,11, Serl7,27’60’65_7 G-CSP humano x) /“Ser17’27’60’65-? human0> xi) jTArg11, Ser17,27,65__7 G-OSP humano e xii) /“Ser17,27’65_7 G-CSF humano. _ ga _ Processo para a preparaçao de composiçoes farmacêuticas, de acordo com as reivindicações 3 ou 4, caracteriza do pelo facto de o polipeptido ser escolhido de G-CSP, calci-tonina humana, interleucina-2, interferão e hormona de crescimento humana. - 219 - 10» - Processo para a preparação de composições farmacêuticas, de acordo oom qualquer das reivindicações anteriores caracterizado pelo facto de o polímero solúvel em agua ser ejs colhido de um homopolímero de polietileno-glicol ou de poli-propileno-glicol, um poliol polioxietilado ou um álcool poli-vinílico em que o citado homopolímero e não substituído ou substituído numa extremidade por um grupo alquilo. - llfi - Processo para a preparação de composições farmacêuticas, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo facto de o polímero solúvel em água ser escolhido de polietileno-glicol não substituído, monometil-polietileno-glicol e glicerol polioxietilado. - 12» - Processo para a preparação de composições farmacêuticas, de acordo com as reivindicações 10 ou 11, caracteri zado pelo facto de o polímero solúvel em água ter uma massa molecular compreendida entre 1000 e 15 000. - 13» - Processo para a preparação de composições farmacêuticas, de acordo com qualquer das reivindicações 3 a S e 10 a 12, caracterizado pelo facto de a substancia fisiológica mente activa ser /”Arg^, Ser^ * ^ ^ G-OSP humano com ou sem uma pre-sequencia de metionina, conjugado com monometil -polietileno-glicol, em que o monometil-polietileno-glicol tem uma massa molecular compreendida entre 2000 e 5000. 220 - - 14* - Processo para a preparação de composições farmacêuticas de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 13, ca racterizado por se empregar uma substância fisiologicamente activa que compreende um polipéptido covalentemente conjugado com um polímero solúvel em água. A requerente reivindica as prioridades dos pedidos "britânicos apresentados em 23 de Julho de 1990, sob o n2 9016133.1, e em 23 de Agosto de 1990, sob os n2s 9018414.4, 9018415.1, 9018416.9, 9013417.7 e 9018418.5. Idsboa, 22 de Julho de 1991
    221 -
PT98410A 1990-07-23 1991-07-22 Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas de libertacao continua contendo polipeptidos PT98410A (pt)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB909016138A GB9016138D0 (en) 1990-07-23 1990-07-23 Continuous release pharmaceutical compositions
GB909018416A GB9018416D0 (en) 1990-08-23 1990-08-23 Continuous release pharmaceutical compositions
GB909018418A GB9018418D0 (en) 1990-08-23 1990-08-23 Continuous release pharmaceutical compositions
GB909018415A GB9018415D0 (en) 1990-08-23 1990-08-23 Continuous release pharmaceutical compositions
GB909018417A GB9018417D0 (en) 1990-08-23 1990-08-23 Continuous release pharmaceutical compositions
GB909018414A GB9018414D0 (en) 1990-08-23 1990-08-23 Continuous release pharmaceutical compositions

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT98410A true PT98410A (pt) 1992-06-30

Family

ID=27547094

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT98410A PT98410A (pt) 1990-07-23 1991-07-22 Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas de libertacao continua contendo polipeptidos

Country Status (18)

Country Link
US (2) US5320840A (pt)
EP (1) EP0473268B1 (pt)
JP (1) JP3188292B2 (pt)
KR (1) KR920002164A (pt)
AT (1) ATE251641T1 (pt)
AU (1) AU655187B2 (pt)
BG (1) BG94861A (pt)
CA (1) CA2047540A1 (pt)
CS (1) CS228591A3 (pt)
DE (1) DE69133324T2 (pt)
FI (1) FI913410A (pt)
GB (1) GB2246295B (pt)
HU (1) HUT60632A (pt)
IE (1) IE912365A1 (pt)
IL (1) IL98831A0 (pt)
NZ (1) NZ238889A (pt)
PT (1) PT98410A (pt)
ZW (1) ZW9391A1 (pt)

Families Citing this family (113)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5718893A (en) * 1984-04-15 1998-02-17 Foster; Preston F. Use of G-CSF to reduce acute rejection
IE912365A1 (en) * 1990-07-23 1992-01-29 Zeneca Ltd Continuous release pharmaceutical compositions
US6565841B1 (en) 1991-03-15 2003-05-20 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
US5876452A (en) * 1992-02-14 1999-03-02 Board Of Regents, University Of Texas System Biodegradable implant
US6013853A (en) * 1992-02-14 2000-01-11 The University Of Texas System Continuous release polymeric implant carrier
US5581476A (en) 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
US5981719A (en) 1993-03-09 1999-11-09 Epic Therapeutics, Inc. Macromolecular microparticles and methods of production and use
US6090925A (en) 1993-03-09 2000-07-18 Epic Therapeutics, Inc. Macromolecular microparticles and methods of production and use
US6284727B1 (en) 1993-04-07 2001-09-04 Scios, Inc. Prolonged delivery of peptides
US6191105B1 (en) * 1993-05-10 2001-02-20 Protein Delivery, Inc. Hydrophilic and lipophilic balanced microemulsion formulations of free-form and/or conjugation-stabilized therapeutic agents such as insulin
US20050181976A1 (en) * 1993-05-10 2005-08-18 Ekwuribe Nnochiri N. Amphiphilic oligomers
NZ260909A (en) * 1993-07-05 1995-04-27 Takeda Chemical Industries Ltd Production of sustained release preparation by allowing a water-soluble polypeptide to permeate into a biodegradable matrix in an aqueous solution
IL110787A0 (en) 1993-08-27 1994-11-11 Sandoz Ag Biodegradable polymer, its preparation and pharmaceutical composition containing it
DE69521880T2 (de) * 1994-02-08 2002-01-03 Amgen Inc Orales verabreichungssystem von chemischmodifizierten proteinen g-csf
CA2183871C (en) 1994-02-23 2008-11-04 Motoo Yamasaki Platelet growth accelerator
US5795569A (en) * 1994-03-31 1998-08-18 Amgen Inc. Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation
WO1995026746A1 (en) * 1994-03-31 1995-10-12 Amgen Inc. Compositions and methods for stimulating megakaryocyte growth and differentiation
US5536495A (en) * 1994-04-15 1996-07-16 Foster; Preston F. Use of G-CSF to reduce acute rejection
EP0782633A4 (en) * 1994-09-23 2002-01-02 Sydney D Finkelstein TOPOGRAPHIC GENOTYPING
US20030053982A1 (en) 1994-09-26 2003-03-20 Kinstler Olaf B. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US5770577A (en) * 1994-11-14 1998-06-23 Amgen Inc. BDNF and NT-3 polypeptides selectively linked to polyethylene glycol
US5576197A (en) * 1995-04-07 1996-11-19 Molecular Bio-Products Polymerase chain reaction container and methods of using the same
EP0832220A1 (en) * 1995-06-07 1998-04-01 Amgen Inc. Ob protein compositions and method
FR2738827B1 (fr) * 1995-09-18 1997-10-17 Bio Merieux Detection des enterobacteries
US20020064546A1 (en) 1996-09-13 2002-05-30 J. Milton Harris Degradable poly(ethylene glycol) hydrogels with controlled half-life and precursors therefor
US6258351B1 (en) 1996-11-06 2001-07-10 Shearwater Corporation Delivery of poly(ethylene glycol)-modified molecules from degradable hydrogels
SE9704186D0 (sv) * 1997-11-14 1997-11-14 Astra Ab New composition of matter
CZ302155B6 (cs) 1998-10-23 2010-11-18 Kirin-Amgen Inc. Sloucenina, která se váže na mpl receptor, zpusob její výroby, farmaceutická kompozice s jejím obsahem, polynukleotid, vektor a hostitelská bunka
US6245740B1 (en) 1998-12-23 2001-06-12 Amgen Inc. Polyol:oil suspensions for the sustained release of proteins
US6319510B1 (en) 1999-04-20 2001-11-20 Alayne Yates Gum pad for delivery of medication to mucosal tissues
US7169889B1 (en) * 1999-06-19 2007-01-30 Biocon Limited Insulin prodrugs hydrolyzable in vivo to yield peglylated insulin
US6638906B1 (en) * 1999-12-13 2003-10-28 Nobex Corporation Amphiphilic polymers and polypeptide conjugates comprising same
US6646110B2 (en) * 2000-01-10 2003-11-11 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF polypeptides and conjugates
US6831158B2 (en) * 2000-01-10 2004-12-14 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
US6555660B2 (en) * 2000-01-10 2003-04-29 Maxygen Holdings Ltd. G-CSF conjugates
TR200401573T4 (tr) 2000-02-29 2004-08-23 Pfizer Products Inc. Stabilize edilmiş granülosit koloni uyarıcı faktör
US6716811B1 (en) 2000-07-20 2004-04-06 Affymax, Inc. Compounds having affinity for the granulocyte-colony stimulating factor receptor (G-CSFR) and associated uses
US8435939B2 (en) 2000-09-05 2013-05-07 Biokine Therapeutics Ltd. Polypeptide anti-HIV agent containing the same
GB0022877D0 (en) * 2000-09-18 2000-11-01 Isis Innovation Analogues
AU2002220002B2 (en) 2000-10-31 2006-12-14 Evonik Corporation Methods and compositions for enhanced delivery of bioactive molecules
AU2001298061A1 (en) 2000-12-13 2003-07-09 Purdue Research Foundation Microencapsulation of drugs by solvent exchange
KR20030005204A (ko) * 2000-12-25 2003-01-17 가부시키가이샤 시세이도 교감신경 활성화 향료 조성물
TWI246524B (en) 2001-01-19 2006-01-01 Shearwater Corp Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles
US7265186B2 (en) 2001-01-19 2007-09-04 Nektar Therapeutics Al, Corporation Multi-arm block copolymers as drug delivery vehicles
US6867183B2 (en) * 2001-02-15 2005-03-15 Nobex Corporation Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US6835802B2 (en) 2001-06-04 2004-12-28 Nobex Corporation Methods of synthesizing substantially monodispersed mixtures of polymers having polyethylene glycol moieties
US6858580B2 (en) 2001-06-04 2005-02-22 Nobex Corporation Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US7713932B2 (en) * 2001-06-04 2010-05-11 Biocon Limited Calcitonin drug-oligomer conjugates, and uses thereof
US6828305B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
WO2005004792A2 (en) * 2003-06-24 2005-01-20 Nobex Corporation Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates and methods of use in pain treatment
US6713452B2 (en) 2001-06-04 2004-03-30 Nobex Corporation Mixtures of calcitonin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
US6828297B2 (en) * 2001-06-04 2004-12-07 Nobex Corporation Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same
PL371781A1 (en) 2001-07-11 2005-06-27 Maxygen Holdings, Ltd. G-csf conjugates
US6488952B1 (en) * 2001-08-28 2002-12-03 John P. Kennedy Semisolid therapeutic delivery system and combination semisolid, multiparticulate, therapeutic delivery system
US7196059B2 (en) 2001-09-07 2007-03-27 Biocon Limited Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith
US7557195B2 (en) 2002-03-20 2009-07-07 Biopolymed, Inc. Stoichiometric conjugates of biocompatible polymers at the unpaired cysteine residue of the wild-type G-CSF
US20030199464A1 (en) * 2002-04-23 2003-10-23 Silviu Itescu Regeneration of endogenous myocardial tissue by induction of neovascularization
AU2003236521A1 (en) * 2002-06-13 2003-12-31 Nobex Corporation Methods of reducing hypoglycemic episodes in the treatment of diabetes mellitus
SI21273A (sl) * 2002-07-31 2004-02-29 LEK farmacevtska dru�ba d.d. Priprava inkluzijskih teles z visokim deležem pravilno zvitega prekurzorja heterolognega proteina
EP1541585B1 (en) 2002-08-27 2013-01-30 Biokine Therapeutics Ltd. Cxcr4 antagonist and use thereof
ATE466085T1 (de) * 2002-09-09 2010-05-15 Hanall Pharmaceutical Co Ltd Protease-resistente modifizierte interferon alpha polypeptide
WO2004043396A2 (en) * 2002-11-09 2004-05-27 Nobex Corporation Modified carbamate-containing prodrugs and methods of synthesizing same
CN100558398C (zh) * 2002-11-26 2009-11-11 拜奥康有限公司 修饰的钠尿化合物、缀合物及其应用
US7648962B2 (en) * 2002-11-26 2010-01-19 Biocon Limited Natriuretic compounds, conjugates, and uses thereof
WO2004091494A2 (en) 2003-04-11 2004-10-28 Pr Pharmaceuticals Inc. Method for preparation of site-specific protein conjugates
US20070041937A1 (en) * 2003-08-22 2007-02-22 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research G-csf derivative for inducing immunological tolerance
US8338373B2 (en) 2003-10-24 2012-12-25 Nora Therapeutics, Inc. Method for reducing the risk of spontaneous abortion in a human female subject
EP2198875A1 (en) * 2003-10-24 2010-06-23 Nora, LLC A method for reducing the likelihood of preterm labour in a subject in need thereof
US20090226397A1 (en) * 2003-10-24 2009-09-10 Nora Therapeutics, Inc. Compositions and methods for reducing the likelihood of implantation failure or miscarriage in recipients of artificial insemination
US7220407B2 (en) 2003-10-27 2007-05-22 Amgen Inc. G-CSF therapy as an adjunct to reperfusion therapy in the treatment of acute myocardial infarction
US20060182692A1 (en) 2003-12-16 2006-08-17 Fishburn C S Chemically modified small molecules
CN102895666B (zh) * 2003-12-16 2015-08-19 尼克塔治疗公司 化学改性的小分子
MX2007000216A (es) 2004-07-08 2007-03-15 Amgen Inc Peptidos terapeuticos.
AU2005269753B2 (en) * 2004-07-19 2011-08-18 Biocon Limited Insulin-oligomer conjugates, formulations and uses thereof
US20060115844A1 (en) 2004-10-22 2006-06-01 Finkelstein Sydney D Enhanced amplifiability of minute fixative-treated tissue samples, minute stained cytology samples, and other minute sources of DNA
AU2005306894B2 (en) 2004-11-05 2011-11-24 Northwestern University Use of SCF and G-CSF in the treatment of cerebral ischemia and neurological disorders
WO2006076471A2 (en) * 2005-01-12 2006-07-20 Nobex Corporation Bnp conjugates and methods of use
TW200640492A (en) * 2005-02-21 2006-12-01 Lg Life Sciences Ltd Sustained release composition of protein drug
MX2007015156A (es) * 2005-06-01 2008-02-15 Maxygen Holdings Ltd Polipeptidos g-csf pegilados y metodos para la produccion de los mismos.
EP1926768B1 (en) 2005-07-18 2011-09-14 Nektar Therapeutics Branched functionalized polymers using branched polyol cores
US20080214480A1 (en) * 2005-07-22 2008-09-04 Trf Pharma, Inc. Method for Treating Sickle Cell Disease and Sickle Cell Disease Sequalae
SI1984009T1 (sl) * 2006-01-18 2013-02-28 Qps, Llc Farmacevtski sestavki z izboljĺ ano stabilnostjo
US7678838B2 (en) * 2006-08-04 2010-03-16 University Of Memphis Research Foundation Nanothin polymer films with selective pores and method of use thereof
US7829155B1 (en) 2006-11-22 2010-11-09 The University Of Memphis Research Foundation Nanothin polymer coatings containing thiol and methods of use thereof
FR2909560B1 (fr) * 2006-12-06 2012-12-28 Fabre Pierre Dermo Cosmetique Gel d'acide hyaluronique pour injection intradermique
EP3011961B1 (en) 2006-12-21 2020-11-11 Biokine Therapeutics LTD. 4f-benzoyl-tn14003 for the mobilisation of hematopoietic progenitor cells in view of transplantation
MX2010003979A (es) 2007-10-16 2010-06-02 Biocon Ltd Composicion farmaceutica oralmente administrable y proceso para su preparacion.
NZ586947A (en) 2008-02-08 2012-11-30 Ambrx Inc Modified leptin polypeptides and their uses
US20110171168A1 (en) * 2008-05-13 2011-07-14 Nora Therapeutics, Inc. Human g-csf analogs and methods of making and using thereof
US10138283B2 (en) 2008-07-23 2018-11-27 Ambrx, Inc. Modified bovine G-CSF polypeptides and their uses
WO2010079340A2 (en) 2009-01-08 2010-07-15 Eisai R & D Management Co., Ltd. Assay
EP2396023A2 (en) 2009-02-11 2011-12-21 Yeda Research and Development Co. Ltd. Short beta-defensin-derived peptides
WO2010146578A2 (en) 2009-06-14 2010-12-23 Biokine Therapeutics Ltd. Peptide therapy for increasing platelet levels
US20120201873A1 (en) 2009-08-05 2012-08-09 Pieris Ag Controlled release formulations of lipocalin muteins
MX349301B (es) 2009-12-21 2017-07-21 Ambrx Inc Polipéptidos de somatotropina bovina modificados y sus usos.
GB0922438D0 (en) 2009-12-22 2010-02-03 Ucl Business Plc Agents having tissue generative activity
CA2791361C (en) 2010-03-04 2018-06-12 Pfenex Inc. Method for producing soluble recombinant interferon protein without denaturing
CA2794740C (en) 2010-04-01 2019-12-31 Pfenex Inc. Methods for g-csf production in a pseudomonas host cell
TWI480288B (zh) 2010-09-23 2015-04-11 Lilly Co Eli 牛顆粒細胞群落刺激因子及其變體之調配物
JP2014506116A (ja) 2010-11-12 2014-03-13 ウェルズ ファーゴ バンク ナショナル アソシエイション Ｉｌ−２部分とポリマーとのコンジュゲート
US8440309B2 (en) 2011-01-31 2013-05-14 Confluent Surgical, Inc. Crosslinked polymers with the crosslinker as therapeutic for sustained release
EP2841084B1 (en) 2012-04-24 2018-05-30 Biokine Therapeutics Ltd. Cxcr4 antagonist peptide for use in the treatment of large cell lung cancer
US9341628B2 (en) 2012-11-30 2016-05-17 Interpace Diagnostics Corporation Methods for measuring carcinoembryonic antigen
WO2015057724A1 (en) 2013-10-14 2015-04-23 Nora Therapeutics, Inc. Use of g-csf for treating or preventing villitis of unknown etiology in a human female
KR20210089270A (ko) 2015-07-16 2021-07-15 바이오카인 테라퓨틱스 리미티드 암 치료용 조성물 및 방법
KR102231217B1 (ko) * 2015-09-24 2021-03-24 한미약품 주식회사 면역글로불린 단편의 특정 위치를 연결 부위로 이용한 단백질 결합체
KR101763644B1 (ko) * 2015-12-03 2017-08-02 윤안구 폐 생리대 수거함
BR112018016924A2 (pt) 2016-02-23 2019-01-02 Biokine Therapeutics Ltd método de seleção de regime de tratamento para indivíduo que tem leucemia mieloide aguda (lma), método de maximização de resposta ao tratamento de leucemia mieloide aguda (lma), método de tratamento de lma, antagonista de cxcr4 e agente quimioterápico no tratamento de lma
WO2018138267A1 (en) 2017-01-27 2018-08-02 Cinfa Biotech S.L. Method for determining the efficacy of a g-csf containing composition
US11267858B2 (en) 2019-05-31 2022-03-08 Spectrum Pharmaceuticals, Inc. Methods of treatment using G-CSF protein complex
US11684655B2 (en) 2019-05-31 2023-06-27 Spectrum Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating neutorpenia using G-CSF protein complex
US10758329B1 (en) 2019-08-20 2020-09-01 Raymond L. Wright, III Hydrating mouth guard

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL6812443A (pt) * 1968-08-31 1970-03-03
US4179337A (en) * 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
IE52535B1 (en) * 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4414147A (en) * 1981-04-17 1983-11-08 Massachusetts Institute Of Technology Methods of decreasing the hydrophobicity of fibroblast and other interferons
EP0092918B1 (en) * 1982-04-22 1988-10-19 Imperial Chemical Industries Plc Continuous release formulations
US4609546A (en) * 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
EP0154316B1 (en) * 1984-03-06 1989-09-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified lymphokine and production thereof
GB8430252D0 (en) * 1984-11-30 1985-01-09 Beecham Group Plc Compounds
US4732863A (en) * 1984-12-31 1988-03-22 University Of New Mexico PEG-modified antibody with reduced affinity for cell surface Fc receptors
US4766106A (en) * 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US4917888A (en) * 1985-06-26 1990-04-17 Cetus Corporation Solubilization of immunotoxins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
DE3676670D1 (de) * 1985-06-26 1991-02-07 Cetus Corp Solubilisierung von proteinen fuer pharmazeutische zusammensetzungen mittels polymerkonjugierung.
US4810643A (en) * 1985-08-23 1989-03-07 Kirin- Amgen Inc. Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor
US4818769A (en) * 1985-09-20 1989-04-04 Cetus Corporation Method of controlling stress-related disease in livestock by administration of human IL-2
JP2514950B2 (ja) * 1986-03-10 1996-07-10 エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体
US4894226A (en) * 1986-11-14 1990-01-16 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polyproline conjugation
GB2209937B (en) * 1987-09-21 1991-07-03 Depiopharm S A Water insoluble polypeptides
US4904584A (en) * 1987-12-23 1990-02-27 Genetics Institute, Inc. Site-specific homogeneous modification of polypeptides
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
ES2058351T3 (es) * 1988-01-29 1994-11-01 Sumitomo Pharma Un procedimiento para producir una formulacion de liberacion sostenida que es adecuada para el uso humano y veterinario.
CA1340810C (en) * 1988-03-31 1999-11-02 Motoo Yamasaki Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor
FR2630329B1 (fr) * 1988-04-20 1991-07-05 Merieux Inst Conjugues macromoleculaires d'hemoglobine, leur procede de preparation et leurs applications
GB8824591D0 (en) * 1988-10-20 1988-11-23 Royal Free Hosp School Med Fractionation process
CA2006596C (en) * 1988-12-22 2000-09-05 Rika Ishikawa Chemically-modified g-csf
US5055555A (en) * 1989-01-05 1991-10-08 Helmut Sassenfeld Purification of G-CSF
GB9107846D0 (en) * 1990-04-30 1991-05-29 Ici Plc Polypeptides
IE912365A1 (en) * 1990-07-23 1992-01-29 Zeneca Ltd Continuous release pharmaceutical compositions

Also Published As

Publication number Publication date
HU912442D0 (en) 1991-12-30
ATE251641T1 (de) 2003-10-15
AU655187B2 (en) 1994-12-08
JP3188292B2 (ja) 2001-07-16
GB2246295A (en) 1992-01-29
FI913410A (fi) 1992-01-24
HUT60632A (en) 1992-10-28
GB9115207D0 (en) 1991-08-28
JPH0532559A (ja) 1993-02-09
DE69133324T2 (de) 2004-07-29
AU8123891A (en) 1992-01-30
NZ238889A (en) 1993-08-26
GB2246295B (en) 1994-05-11
BG94861A (en) 1994-03-24
IL98831A0 (en) 1992-07-15
IE912365A1 (en) 1992-01-29
US5320840A (en) 1994-06-14
ZW9391A1 (en) 1992-03-25
DE69133324D1 (de) 2003-11-13
EP0473268B1 (en) 2003-10-08
EP0473268A3 (en) 1992-09-16
EP0473268A2 (en) 1992-03-04
KR920002164A (ko) 1992-02-28
CA2047540A1 (en) 1992-01-24
US5773581A (en) 1998-06-30
CS228591A3 (en) 1992-03-18
FI913410A0 (fi) 1991-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PT98410A (pt) Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas de libertacao continua contendo polipeptidos
CN111212661B (zh) 白介素-2多肽偶联物及其用途
US6399588B1 (en) Cancer treatment method utilizing plasmids suitable for IL-2 expression
EP1090645B1 (en) Oral delivery of chemically modified proteins
PT97529A (pt) Processo para a preparacao de polipeptidos derivados do factor estimulante de colonias de granulocitos
TWI604850B (zh) 藥學製劑
JPS6253999A (ja) インシユリン類似体
EP0741188A2 (en) Single chain insulin with high bioactivity
CA2201721A1 (en) Microorganisms as therapeutic delivery systems
CN103079586A (zh) G-csf二聚体在治疗嗜中性粒细胞减少症中的应用
EP2926829B1 (en) Sugar chain-attached linker, compound containing sugar chain-attached linker and physiologically active substance or salt thereof, and method for producing same
EP0785950B1 (en) Keratinocyte growth factor analogs
EP2691119B1 (en) Pharmaceutical preparation
AU2005335186A1 (en) Human growth hormone conjugated with biocompatible polymer
EP1440982A2 (en) Ifn-thy fusion protein, dna coding therefore, its preparation and application
US20060134736A1 (en) Human growth hormone conjugated with biocompatible polymer
HUT52154A (en) Recombinant interleukin-2 hybrid proteins.
WO2006061853A2 (en) Novel erythropoietic compounds and a process for producing erythropoietic compounds
JPH05103666A (ja) ヒト神経成長因子を発現させるための方法
WO1988001511A1 (en) Succinylated interleukin-2 for pharmaceutical compositions
KR102461760B1 (ko) 돼지 g-csf 변이체 및 그 용도
JP2006508695A (ja) 単量体インスリン

Legal Events

Date Code Title Description
BB1A Laying open of patent application

Effective date: 19920204

FC3A Refusal

Effective date: 19981016