PT97529A - Processo para a preparacao de polipeptidos derivados do factor estimulante de colonias de granulocitos - Google Patents

Description

Descrição referente à patente de invenção de Imperial Chemical Industries PLC, britânica, indus trial e comercial, com sede em Imperial Chemical House, Millbank London SW1P 3JF, Inglaterra, (inventores: Roger Cambie, Heather Carr, David Timms e Anthony James Wilkinson, residentes no Reino Unido), para, "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE POLIPETICOS DERIVADOS DO FACTOR ESTIMULANTE DE COLÓNIAS DE GRANULOCITOS". A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de derivados do factor de estimulação de colónia de granulócitos (G-CSF) possuindo uma boa estabilidade em solução e de composições farmacêuticas que os contêm.

Os factores de estimulação de colónias são uma classe de hormonas de proteínas que estimulam a proliferação e a função de tipos específicos de células sanguíneas, como por exemplo, os granulócitos. Os granulócitos absorvem e devoram os invasores microbianos e resíduos celulares e representam assim • um factor vital na resposta a infecções. Neste aspecto os granu- 1

lócitos podem estender pseudopódes e deslizar para fora da árvore vascular entre as células de revestimento do endotélio. Os granu-lócitos neutrofílicos podem em seguida entrar em contacto directo com os microorganismos e destrui-los utilizando apenas sistemas de enzimas, como por exemplo, os que produzem aniões de superóxi-do. Dado que os granulócitos têm apenas um curto período de vida na circulação (aproximadamente 6-12 horas) e são destruídos no decurso da sua função, é necessário que as células principais da medula espinal produzam tantos granulócitos como glóbulos vermelhos de sangue em cada dia. Além disso, esta taxa de produção de granulócitos tem de aumentar muito se se pretendem cumprir as necessidades da infecção. Como resultado de seu consumo rápido, a contagem de granulócitos diminui rápidamente se a medula espinal for danificada por, por exemplo, quimioterapia do cancro, radiações, SIDA ou doenças hematológicas e os pacientes se tornam susceptíveis a uma infecção muito grande. De facto, a sepsia é uma causa comum de morte em pacientes de cancro cuja medula espinal é suprimida por tratamento com radiações, quimioterapia ou a sua doença neoplástica. 0 factor de estimulação da colónia de granulócitos (G-CSF) foi descrito na literatura por Wallet K. col Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. Vol. 82, pâgs. 1526-1530 e também descrito na Publicação da Patente Europeia N2 169 566 e Publicação de Patente PCT N2 Wo 87/01132. Foi demonstrado que o G-CSF estimulava a produção de granulócitos in vivo e funcionava com efeitos laterais mínimos. Como resultado disso verifica-se que o G-CSF humano tem utilidade potencial na gestão da neutropenia associada com a quimioterapia, terapia de radiações, acidentes de radiações ou transplante de autólogo da medula óssea.

Além disso, o G-CSF pode ter utilidade na estimulação da supressão da medula óssea associada com a SIDA, no tratamento dos síndromas mielodiplásticos caracterizados por anor , malidades funcionais de granulócitos e como aditivo para o tra-* tamento de infecções severas. 2

Para além dos certos análogos de G-CSF acima referidos foram descritos na Publicação PCT Ns Wo 87/01132, na Publicação da Patente Europeia Ns 243 153, na Publicação de Paten te Europeia N9 256 843, na Publicação de Patente Europeia Ns 272 703 e na Biochemical and Biophysical Research Communication[ 1989] Vol. 159, N2 1, pãgs. 103-111 Kuga T. e col. Além disso a modificação de G-CSF e [Ser17] G-CSF foi efectuado por substituição dos resíduos de cisteína e serina na posição 17, mas essas alterações não conseguiram atingir o efeito pretendido (Protein Engineering, Vol. 3, N2 4 página 360 (1990)). 0 G-CSF e os análogos acima referidos tendem a sofrer de estabilidade em solução dado que em repouso eles tendem a precipitar da solução resultando assim numa vida pequena em armazém e problemas na armazenagem a concentrações elevadas. Além disso o G-CSF e alguns dos análogos referidos acima têm uma tendência para uma agregação covalente durante a armazenagem. A presente invenção ê baseada na descoberta das modificações que podem ser feitas ao G-CSF ou a um seu derivado possuindo parte ou toda a sequência de aminoácidos e pelo menos uma das propriedades biológicas do G-CSF de ocorrência natural, por exemplo do G-CSF humano de ocorrência natural, para se aumentar assim a estabilidade em solução.

Assim, de acordo com uma das caracteristicas da presente invenção, é proporcionado um derivado de G-CSF de ocorrência natural possuindo pelo menos uma das propriedades biológicas do G-CSF de ocorrência natural e uma estabilidade em solução (tal como aqui definida) de pelo menos 35% a 5mg/ml, possuindo o referido derivado o Cys17 da sequência nativa substituído por um resíduo de Ser17 e Asp^7 da sequência nativa substituído por um resíduo Ser^7. 3

Os derivados da presente inenção podem convenientemente ter pelo menos uma modificação escolhida de entre: a) Glu11 de sequência nativa substituído por um resíduo Arg11; b) Leu15 de sequência nativa substituído por um resíduo Glu15; c) Lys23 de sequência nativa substituído por um resíduo Arg23; d) Gly26 de sequência nativa substituído por um residuo Ala26; e) Gly28 de sequência nativa substituido por um resíduo Ala28; f) Ala30 Lys30; de sequência nativa substituído por um resíduo Arg30 e g) Lys34 de sequência nativa substituido por um resíduo Arg34; h) Lys40 de sequência nativa substituido por um resíduo Arg46; i) Pro44 de sequência nativa substituido por um resíduo Ala44; j) Leu48 de sequência nativa substituido por um resíduo Lys48; k) Gly51 de sequência nativa substituido por um resíduo Ala51; D Gly55 de sequência nativa substituido por um resíduo Ala55; m) Trp58 de sequência nativa substituido por um resíduo Lys58; n) Pro60 de sequência nativa substituido por um resíduo Ser60; o) Pro65 de sequência nativa substituido por um resíduo Ser65; P) Pro111 de sequência nativa substituido por um resíduo Glu111; q) Thr115 115. de sequência nativa substituído por um resíduo Ser

r) Thr118 de sequência nativa substituido por um resíduo Ser118; s) Tyr185 de sequência nativa substituido por um resíduo Arg185; A presença de pelo menos uma modificação adicional escolhida de entre (b) a (s) é preferida, mas a presença de pelo menos uma outra modificação escolhida de entre (b), (d), (e), (f), (n) e (o) é particularmente preferida, das quais a modificação (o) é especialmente preferida.

Mais preferivelmente a modificação adicional compreende pelo menos uma das seguintes: i) Gin11, Pro88'85 de sequência nativa substituido por Arg11, Ser60,65; ii) Ala11*·, Thr115'118 de sequência nativa substituido por Glu111 Ser115'118; iii) Gin11, Trp58, Tyr185 de sequência nativa substituido por Arg11'165, Lys58; iv) Leu15, Gly28'28, Ala30 de sequência nativa substituido por Glu15, Ala28'28, Lys38; ou v) Asp2?, Pro^4, Leu^8, Gly51'55, Trp58 de sequência nativa substituido por Lys^3'58, Ala^'51'55. A modificação adicional pode também compreender de preferência pelo menos uma das seguintes: vi) Leu15, Glu28»28, Ala38 de sequência nativa substituido por . um resíduo Glu 15 Ala 26 »28 Arg 38; 5 :¾ 0* r^' vii) Pro65 de sequência nativa substituído por um resíduo Ser65; viii) Pro60'65 (je sequência nativa substituído por um resíduo Ser60'65; ix) Glu-^, Pro65 de sequência nativa substituído por um resíduo Arg1·1·, Ser65.

As modificações acima definidas podem assim, se desejado, ser introduzidas em qualquer polipeptido possuindo pelo menos uma das propriedades biológicas do G-CSF de ocorrência natural de modo a aumentar a estabilidade em solução da molécula. As modificações da presente invenção podem ser assim aplicadas aos polipéptidos que diferem na sequência de aminoácidos da aqui especificada para os G-CSF de ocorrência natural em termos da identidade ou localização de um ou mais resíduos (por exemplo substituições, adições terminais e internas e, eliminações). Como exemplos esses polipéptidos podem incluir os que são a seguir resumidos, por exemplo, por eliminações; ou os que são mais estáveis à hidrólise(e, portanto, podem ter os efeitos mais pronuncia dos ou de maior duração do que os de ocorrência natural); ou que foram alterados para eliminar um ou mais pontos potenciais para a glicosilação (que podem resultar em actividades superiores para os produtos obtidos de leveduras); ou que tem um ou mais resíduos de cisteína eliminados ou substituídos, por exemplo, por resíduos de alanina ou serina e são potencialmente mais fácilmente isolados em forma activa dos sistemas microbianos; ou que podem ter um ou mais resíduos de tirosina substituídos por fenilalanina e podem ligar mais ou menos fãcilmente a receptores humanos de G-CSF em células alvo. As modificações propostas (a) até (s), de preferência (i) até (ix) podem assim, por exemplo, ser aplicadas ao G-CSF nativo possuindo o Cys17 da sequência nativa substituído por Ser^7 ou a variantes alélicas e seus análogos que se sabem possuir pelo menos uma das propriedades biológicas do G-CSF de • ocorrência natural como as descritas nas publicações acima refe-, ridas. 6

Os polipéptidos da presente invenção que foram ensaiados revelaram possuir maior estabilidade em solução em relação ao polipéptido não modificado correspondente embora retendo uma significativa actividade biológica ou mesmo possuindo uma maior actividade biológica.

Deve notar-se do acima descrito que a proprie dade de estabilidade em solução é diferente da solubilidade. A estabilidade em solução é a tendência reduzida de uma substância para precipitar da solução em condições fisiológicas de pH, temperatura e força iónica. A estabilidade em solução é aqui medida por determinação da percentagem de derivados de G-CSF que permanecem em solução numa solução salina tamponada com fosfato após 14 dias a 372 C dada uma concentração inicial de 1 mg/ml, 5 mg/ml e/ou 10 mg/ml. A medida da estabilidade em solução é descrita com pormenor a seguir no exemplo de referência 4. Os polipéptidos da presente invenção terão convenientemente uma estabilidade em solu ção a 5mg/ml de pelo menos 35%, e com vantagem pelo menos 50% e de preferência pelo menos 75% . Os polipéptidos da presente inven ção terão de preferência uma estabilidade em solução a 10 mg/ml de pelo menos 75%, especialmente de pelo menos 85% .

A expressão "G-CSF de ocorrência natural" aqui utilizada refere-se aos G-CSF que revelaram existir na natureza e inclui os dois polipéptidos que possuem a sequência de aminoácidos representada na SEQ.ID.N237. Estes dois polipéptidos diferem apenas numa inserção de tripéptido Val-Ser-Glu que está presente num polipéptido entre as posições 35 e 36, mas ausente no outro. 0 sistema de numeração utilizado ao longo da presente invenção é baseado no polipéptido de ocorrência natural sem a inserção Val-Ser-Glu e o termo "nativo" aqui utilizado refere-, se a este polipéptido sem a inserção Val-Ser-Glu. Deve notar-se * que a presente invenção é aplicável a todas as formas de G-CSF 7

de ocorrência natural e aos seus análogos da forma acima descrita e a revisão em consequência dos números de posição do polipéptido pode ser necessária dependendo da forma do G-CSF de ocorrência natural escolhido para a modificação.

De acordo com uma outra caracteristica da pre sente invenção é proporcionado uma sequência de ADN que codifica toda ou parte da sequência de aminoácidos de um derivado de G-CSF de ocorrência natural tal como anteriormente descrito. Essas sequências podem, por exemplo, incluir: 1) a incorporação de codãos preferidos para a expressão por hospedeiros não mamiferos; 2) a produção de pontos para clivagem por en-donucleases de restrição; e/ou 3) a produção de sequências de ADN iniciais, terminais ou intermédias adicionais que facilitam a construção de vectores de expressão fácil.

As sequências de ADN da presente invenção incluem as que são úteis na efectivação da expressão em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas e os derivados da presente invenção podem estar numa forma ou glicosilada ou não glico silada dependendo da célula hospedeira escolhida. Quando o derivado da presente invenção é obtido numa forma não-glicosilada, por exemplo, após expressão em células hospedeiras procarióticas, o derivado pode, se desejado, ser quimicamente glicosilado, por exemplo, com carbohidratos de mamíferos ou de outros seus euca-rióticos.

De acordo com uma caracteristica adicional , da presente invenção ê proporcionado um vector recombinante con-• tendo uma sequência de ADN tal como anteriormente definida. 0 8

vector recombinante pode, por exemplo, ser um plasmídio funcional do ponto de vista biológico ou um vector de ADN virai.

De acordo com uma outra caracteristica da pre sente invenção é proporcionado um processo para a preparação de um vector recombinante, tal como anteriormente definido, que compreende inserir-se uma sequência de ADN como atrás definida num vector.

De acordo com uma outra caracteristica da presente invenção é proprocionada uma célula hospedeira procarió-tica ou eucariótica estável transformada ou transfectada com um vector recombinante tal como anteriormente definido.

De acordo com uma outra caracteristica da presente invenção é proporcionado um processo para a preparação de uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica tal como anteriormente definida que compreende transformar-se ou transfec-tuar-se uma célula procariótica ou eucariótica com um vector recombinante tal como anteriormente definido obtendo-se um hospedei ro procariótico ou eucariótico estávelmente transformado ou trans fectuado.

De acordo com ainda uma outra caracteristica da presente invenção é proporcionado um processo para a preparação de um derivado de G-CSF de ocorrência natural da presente invenção que compreende cultivar-se uma célula hospedeiro procariótica ou eucariótica da invenção de forma a se obter o referido derivado. 0 processo também incluirá com vantagem a fase de se isolar o referido derivado produzido por expressão da sequência de ADN no vector recombinante da invenção.

As células hospedeiro para utilização na pre-• sente invenção são de preferência procarióticas como por exemplo 9

E. coli, mas podem ser células de levedura como por exemplo a Saccharomyces cerevisiae ou células de mamíferos como por exemplo células CHO (células do ovário da hamster chinesa).

De acordo com uma outra caracteristica da pre sente invenção é proporcionada uma composição farmacêutica compre endendo como ingrediente activo pelo menos derivado de um G-CSF de ocorrência natural da presente invenção em associação com um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.

De acordo com uma outra caracteristica da pre sente invenção é proporcionado um método para uma terapia hemato-poiêtica a um mamífero que compreende a admnistração de uma quantidade eficaz de um derivado da presente invenção.

De acordo com uma outra caracteristica da pre sente invenção é referido um método para parar a proliferação de células leucémicas que compreende a admnistração de uma quantidade eficaz de um derivado da presente invenção.

Breve Descrição dos Desenhos A figura 1 mostra a sequência de nucleótidos do fragmento de 167 do referido no exemplo 1; A figura 2 mostra a sequência de aminoãcidos e a sequência de nucleótidos correspondentes de G-CSF humano nativo (hu) e pontos de restrição; A figura 3 mostra a sequência de aminoácidos e a sequência de 10

nucleótidos correspondentes [Ser17»27] £e g-CSF e pontos de restrição. A figura 4 mostra a sequência de nucleótidos do terminador de sequência de transcrição T4 possuindo: a) pontos de restrição de terminais Sail e HindIII; e b) pontos de restrição de terminais Sail e Styl; A figura 5 mostra um mapa de restrição de pTB 357 (também aqui referido como pLB004); A figura 6 mostra a sequência de nucleótidos do fragmento de EcoRI-Sail referido no Exemplo de Referência 6 (b) mas omitindo o interferão 2 da sequência de genes; A figura 7 mostra um mapa de restrição de pLB015 (também aqui referido como pICI0080); A figura 8 mostra um mapa de restrição de pICI1079; A figura 9 mostra um mapa de restrição de pICI54 (também aqui referido como pCG54); A figura 10 mostra um mapa de restrição de pCG61; A figura 11 mostra um mapa de restrição de pICI1107 em que a área a sombreado representa a sequência de genes que codifica para [Ser17'27] hu G-CSF; A figura 12 mostra um mapa de restrição de pCG300 (também aqui referido como pICI1295). 11

Descrição Detalhada

Os derivados da presente invenção são com vantagem seleccionados de forma a possuírem uma das modificações adicionais (i), (ii), (iii), (iv), (v), (vi), (vii), (viii) e (ix), tal como anteriormente definidas, de preferência uma das outras modificações adicionais (i), (ii), (iv), (vi), (vii), (viii) ou (ix) e especialmente qualquer outra das modificações (ii), (iv), (vi), (vii), (viii) ou (ix).

Os derivados particularmente preferidos da presente invenção em virtude da sua boa estabilidade em solução incluem: [Arg11, Ser17'27'6°,65]G-CSF; [Glu15, Ser17^27, Ala26/28,Lys30]G-CSF; [Arg11, Glu15, Ser17»27'59/85, Ala28»28, Lys38]G-CSF; [Arg11/23, Ser17'27'60'65]G-CSF; [Arg11/34, Ser17»27'6°/65]G-CSF; [Arg11/40, Ser17'27/80/65]g-CSF; [Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5'11, Ser17'27'8°/85]G-CSF; [Arg11, Glu15,111, Ser17,27,60,65,115,116^ Ala25,28, Lys38]G-CSF; [Arg 11 /155 Glu 15 Ser 17,27,60,65^ Ala 26,28^ LyS 30,58jg_£gp.

[Arg11, Glu15, Ser17'27'60/65, Ala26/28»44/51/55, Lys30/49/58]G-. CSF; 12 [Argllf165#Glu15,lllfSer17f27f60,65f115,116#Ala26#28f44#51,55/

Lys30/49,58]g-Csf; [Glu15, Ser17/27, Ala26'28, Arg30]hu G-CSF;

Os derivados especialmente preferidos da invenção em virtude da excelente estabilidade em soluçk) e boa actividade específica incluem: i) [Arg11, ser17,27,60,88]G-CSF, ii) [Glu15, Ser17'27, Ala26'28, Lys30]G-CSF, iii) [Arg11, Glu15, Ser17*27'60'65, Ala26'28, Lys30]G-CSF, iv) [Arg11'40, Ser17'27'80'85]G-CSF, v) [Arg11'23, Ser17'27'60'65]G-CSF, vi) [Arg11'185, Glu15, Ser17'27'80'85, Ala28'28, Lys30'58]hu G-CSF, vii) [Arg11, Glu15'111, Ser17,27'80'85'115'118 , Ala28'28, Lys30] hu G-CSF, viii) [Glu15, Ser17'27, Ala28'28, Arg30]hu G-CSF, ix) [Ala1, Thr 3 Tyr 4, Arg5'11, Ser 17'27'80'85|G-CSF, k) [Ser17'27'80f68]hu G-CSF, xi) [Arg11, Ser17'27'85]hu G-CSF, e xii) [Ser17'27'85]hu G-CSF. • dos quais se preferem especialmente (i), (ii), (iii), (vi), (vii) 13 (viii), (x), (xi) e (xii).

Estes últimos derivados de G-CSF humano mostra não apenas umas excelentes propriedades de estabilidade em solução, mas possuem também uma actividade específica superior em relação ao G-CSF humano de ocorrência natural.

Pode estar presente ou ausente uma pré-sequê-cia de metionina nos polipéptidos da presente invenção mas ela está convenientemente presente.

Verificou-se ser vantajoso utilizar umvector de produção com base em pAT153, compreendendo: i) um promotor e quando adequado um operador para ele, por exemplo um promotor trp ou T7A3. 0 promotor T7A3 é o promotor A3 do bacteriofago T7 [ver Dunn J.J. e Studier F.W.J. Mol. Biol. 166, 477-535 (1983)]. A sequência completa de nucleótidos do ADN do bacteriofago T7 e as localizações dos elementos genéticos de T7 são referidos nesta referência; ii) uma sequência de pontos de ligação de ribossomas, por exemplo uma sequência líder de ligação de tecidos de ribossoma trp; iii) um ponto de clonação para o gene que se pretende expressar; iv) uma sequência de terminação de transcrição T4 (ver SEQ. ID. N2 51 da figura 4); • v) uma sequência cer (Summer D. e col. MGG, 201, p334-338, 1985); 14

vi) ura gene repressor da tetraciclina (Tet R); vii) um gene de resistência à tetraciclina (Tet A); viii) sequências de reconhecimento de enzimas de restrição múltiplas. A SEQ.ID.N® 50 estabelece uma sequência que inclui um local de endonuclease de restrição EcoRI (nucleótidos 1-6), a sequência promotora A3 (nucleótidos 7-52), a sequência do local de ligação de ribossomas líder trp (nucleótidos 53-78) e o cordão de iniciação de translacção (nucleótidos 79-81).

Pode ser vantajoso cultivar o hospedeiro sus-ceptível de expressar um derivado da invenção, num meio de cultura e adicionar um suplemento que inclui extractos de levedura ao meio de cultura durante a cultura. E preferível que a adição do suplemento que inclui extracto de levedura seja iniciada a um tem po pré-determinado após o início da cultura. A taxa de adição do suplemento que compreende extracto de levedura é preferivelmente tal que o meio de cultura não se torna exausto de extracto de levedura. Isto é particularmente vantajoso quando o vector de produ ção é utilizado com um promotor T7A3.

Podè também ser vantajoso cultivar um hospedeiro, transformado com um vector recombinante contendo material genético que codifica para um derivado da presente invenção, na presença de leucina e/ou treonina numa quantidade suficiente para dar uma maior acumulação do derivado da presente invenção. Assim é particularmente vantajoso efectuar a fermentação na presença de leucina quando o vector de produção é utilizado com o promotor trp. 15

Para além das descobertas das modificações que podem ser feitas num G-CSF ou um seu derivado possuindo parte ou toda da sequência de aminoácidos e pelo menos uma das propriedades biológicas de G-CSF de ocorrência natural, para aumentar a estabilidade em solução, a presente invenção é ainda baseada na descoberta de técnicas modificadas para a purificação desses G-CSF e dos seus derivados.

Assim, por exemplo, não existe referência na Patente PCT Publicação Ns. WO 87/01132 da remoção de detergente, particularmente N-lauroil sarcosina em forma salina (por exemplo Sarkosyl) a partir de análogos de G-CSF preparados nesta publicação PCT. Foi assim necessário identificar uma técnica de modo a que a estabilidade em solução dos derivados de G-CSF da presente invenção pudesse ser avaliada a alta concentração e de forma a que os estudos de formulação pudessem ser conseguidos. Numa realização da invenção a remoção de detergente foi efectuada na presença de uma solução salina tamponada com fosfato (pH 7,2 a 7,5). A solução salina tamponada com fosfato pode ser convenientemente preparada a partir de uma solução salina isotónica e pode assim por exemplo ter uma composição como descrito no Exemplo 1. A este respeito foi verificado que outros tampões eram menos preferidos dado que ou a remoção de detergente, particularmente N-lauroil sarcosina (em forma salina) era mais lenta ou precipitava mais proteína. Ê ainda preferido efectuar a diafiltração, preferivelmente nesta fase, dado que se verificou que se aumentava o rendimento sem provocar um aumento da precipitação de proteína. Por exemplo, verificou-se que a diafiltração era preferível à diálise por difusão convencional. Além disso foi verificado que a concentração de detergente, L-lauroil sarcosina na forma salina (por exemplo Sarkosyl) podia ser reduzida a valores inferiores a 1% mantendo contudo a resolução durante a cromatrografia. Uma redução da concentração inicial de detergente auxilia a remoção de detergente e assim é preferível utilizar a concentração mínima de detergente, por exemplo N-lauroil sarcosina (na forma salina por exemplo Sarkosyl), coerente com a retenção da resolução duran • te a cromatrografia. Uma concentração particular de detergente, 16 7 ....... 7·. ‘Vií ' ’ίΛ-Τη··"'*1',

por exemplo, N-lauroil sarcosina (em forma salina por exemplo Sarkosyl), e assim de 0,8% a 0,2%, de preferência de 0,5% a 0,2%, e especialmente de 0,3% .

Para além do acima referido foi verificado que a remoção de detergente como por exemplo N-lauroil sarcosina (na forma salina por exemlo Sarkosyl) activa um traço da activi-dade proteolítica que pode complicar a avaliação do produto. Foi ainda verificado que esta actividade proteolítica podia ser signi ficativamente reduzida e mesmo até eliminada se, após a remoção do detergente por diafiltração, o valor do pH fosse reduzido para valores inferiores a 7,0 antes da proteólise substancial, convenientemente por diafiltração e de preferência por diálise. Assim numa outra invenção da presente invenção a redução ou remoção da actividade proteolítica traço pode ser efectuada a um valor de pH que é inferior a 7,0 mas que é suficientemente elevado para evitar uma hidrólise significativa do polipéptido. 0 valor do pH está vantajosamente na gama de 6,0 a 4,5 , de preferência de 5,8 a 5,0 especialmente de cerca de 5,4. Uma outra vantagem desta realização da invenção é de que os contaminantes de E.coli. e/ou proteína degradada ou incorrectamente dobrada pode ser precipitada por afectação deste abaixamento do valor de pH. Ê preferível que o processo de purificação inclua a fase de cromatografia de exclusão de tamanho dado que de outra forma o problema da degradação proteolítica é aumentado e embora a presente invenção reduza essa degradação ela torna-se difícil de a eliminar.

Para além dos processos acima mencionados, a introdução da estabilidade em solução num G-CSF ou num seu derivado permite uma simplificação substancial do processo de extra cção. Assim de acordo com uma outra caractristica da presente invenção é proporcionado um processo para a extracção de um derivado activo da invenção (como anteriormente definido) a partir de um seu corpo de inclusão que pode compreender: • * 1) a suspensão do referido corpo de inclusão num detergente, par- 17

salina (por exemplo Sar ticularmente N-lauroil sarcosina em forma kosyl); 2) oxidação; 3) remoção do detergente, por exemplo, como acima descrito; e 4) mantendo a solução obtida após a remoção do detergente a uma temperatura elevada por exemplo a 30-45SC, com vantagem 34-42SC para precipitar a proteína bacteriana contaminante, oligómeros do produto e/ou produtos de degradação. A referida solução é convenientemente mantida à referida temperatura elevada durante 6 a 24 horas, com vantagem 8 a 18 horas e de preferência 10 a 14 horas, especialmente cerca de 12 horas. 0 processo de extracção da presente invenção pode por exemplo ser efectuado por lisagem das células hospedeiro seguida de filtração para se obter o corpo de inclusão, por exemplo, na forma de um agregado. 0 corpo de inclusão pode ser em seguida suspenso um detergente tal como por exemplo, N-lauroil sar-casina em forma salina (por exemplo Sarkosyl), de preferência 1 a 3%, especialmente cerca de 2% de N-lauroil sarcosina em forma salina (por exemplo Sarkosyl). A suspensão em detergente pode ser seguida por oxidação, por exemplo na presença de sulfato de cobre (CUSO4) que por sua vez pode ser seguida por centrifugação.

Quando for possível lavar o corpo de inclusão é preferível utilizar ureia em vez de, por exemplo, desoxicolato. 0 processo de extracção da presente invenção permite que o processo de produção seja simplificado por exemplo por eliminação da necessidade de utilização das colunas de exclusão de tamanho. Além disso a elevada recuperação do produto da fase de tratamento térmico parece ser uma das vantagens do aumen-• to da solubilidade em solução dos derivados da presente invenção. 18

De facto quanto maior for a estabilidade em solução mais adequada é a proteína para o novo processo de extracção. Assim, por exemplo é preferível aplicar este processo de extracção à extracção de derivados da presente invenção que possuem uma estabilidade em solução de pelo menos 85% a 10 mg/ml. Quando o análogo conhecido [Met-l, Ser17]G-CSF foi extraído pelo processo acima referido, o ensaio de rpHPLC indicou que apenas 40% do produto pretendi do permanecia em solução após o tratamento térmico de um produto retido contendo 1 mg/ml de proteína total. Para uma proteína total de 3 mg/ml, apenas 19% do análogo permaneciam em solução.

Todas as sequências de nucleótidos aqui referidas são especificadas no sentido convencional 5' - 3'.

Os derivados da presente invenção são baseados em G-CSF humano que é também referido como G-CSF hu.

Dado que os derivados preparados nos Exemplos são todos preparados utilizando E.coli, estará geralmente presente uma pré-sequência de metionina. São referidos em seguida os seguintes materiais nos Exemplos de Referência e Exemplos e a sua constituição é a seguinte: 0 termo "N-lauroil sarcosina" aqui utilizado refere-se à utilização da referida substância sob a forma salina. Assim, nos Exemplos a N-lauroil sarcosina é utilizada sob a forma do sal de sódio. 19

TAMPÕES PARA ENZIMAS DE RESTRIÇÃO

Estabilidade: estável a 20SC. Composição do tampão:

Componentes do tampão Concentração final em mmol/1 (tampão diluido a 1:10) A B L M H Tris acetato 33 - - - - Tris-HCL - 10 10 10 50 Acetato de magnésio 10 - - - - MgCl2 - 5 10 10 10 Acetato de potássio 66 - - - - NaCl - 100 - 50 100 Ditioeritritol (DTE) - - 1 1 1 Ditiotreitol (DTT) 0.5 - - - - 2-Mercaptoetanol - 1 - - - pH a 37SC 7.9 8.0 7.5 7.5 7.5

Os tampões acima referidos estão disponíveis da Boehringer Mannheim.

Procedimento de mutagenése dirigido a pontos Exemplo de Referência 2

Tampão 1 100 mM Tris HCL pH 8.0 100 mM NaCl 20 mM MgCl2

Tampão 2

10 mM Tris HCL pH 8.0 20 mM NaCl 1 mM EDTA

Tampão 3 12 mM Tris HCL pH 7.7 30 mM NaCl 10 mM MgCl2 20

Tampão 4 60 mM Tris HCL pH 8.0

90 mM NaCl 6 mM MgCl2 10 mM DTT

Mistura de nucleótidos 1 - 250 M de cada dos seguintes; dATP, dGTP, dCTP=S (derivado fósforotioato de dCTP), dTTP e 1 mM de ATP Mistura de nucleótidos 2 - 250 jiM de cada dos seguintes dATP,

dGTP, dCTP, dTTP e 350 M ATP

Meio mínimo M9

Cloreto de Amónio lg Hidrógeno ortofosfato de dissódio 6g Hidrógeno ortofosfato de potássio 3g Cloreto de sódio 0.5g Em água destilada 11

Suplementos/75ml 300 1 50% glicose 75 1 1M MgS04 75 1 0.1M CaCl2 75 1 4 mg/ml thiamine 75 1 20% casinaminoâcidos

Solução de elemento traco (TES) TES tem a seguinte composição: A1C13 6H20 0. CoCl2 6H20 0. KCr(S04)212H20 0. CuCl22H20 0. H3BO3 0. Kl 0. MnS04H20 0. 1 mg l-1 100 g l"1 04 mg l"1 40 g 1_1 01 mg l-1 10 g l"1 01 mg l"1 10 g l"1 005 mg 1“1 5 g Γ1 1 mg l-1 100 g l"1 1 mg l-1 100 g l”1 21 s

0.0045 ng 1“1 4.5 g i-i 0.02 mg l"1 20 g 1_1 0.02 mg l”1 20 g i-i

NiS046H20

Na2Mo042H20

ZnS047H20 e é adicionado ao meio de cultura a 0,5 mg/ml.

Geneclean (TM)

O dispositivo contém: 1) iodeto de sódio 6M 2) uma solução concentrada de cloreto de sódio, Tris e EDTA para preparar uma solução de lavagem de cloreto de sódio/etanol/água; 3) Glassmilk (TM) - um frasco de 1,5 ml con tendo 1,25 ml de uma suspensão de matriz de sílica em água.

Esta é uma técnica para a purificação de ADN baseada no método de Volgelstein e Gillespie publicado em Procee-dings of the National Academy of Sciences U.S.A. (1979) Vol. 76, pãg. 615.

Alternativamente pode ser utilizado qualquer dos métodos descritos em ‘'Molecular Cloning-a laboratory manual" Segunda edição, Sambrook, Fritsch e Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Dispositivo de Marcação Aleatória Produto de Pharmâcia Ns.27-9250 0 procedimento é descrito em "Molecular Cloning-a laboratory manual" Segunda edição, Sambrook, Fritsch e Maniatis, pág.10.13-10.17 (Publicado por Cold Spring Harbor . Laboratory, 1989). 22

Polimerase de T7 ADN quimicamente modificada baseada no procedimento de Tabor e Richardson publicado em "Pro-ceedings of the National Academy of Sciences USA (1987) vol. 84 pãg. 4767-4771. T4 ADN ligase

Descrito em "Molecular Cloning-a laboratory manual" Segunda edição, Sambrook, Fritsch e Maniatis, pãg.5.60-5.64 (Publicado por Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) e também por Weiss B. e col. J. Biol. Chem. Vol.243 pãg.4543 (1968).

Os seguintes Exemplos não limitativos são dados apenas para ilustração.

Exemplo 1

Preparação de [Serl?,27] humana G-CSF

Foi repetido o procedimento seguido nas fases a) e b) do Exemplo de Referência 1 com as seguintes modificações:

Os oiligonucleótidos SEQ.ID:Nss.24, 25, 26, 27 (como a seguir definidos) substituem SEQ.ID.N9s.l, 2, 3 e 4 (como a seguir definidos) respectivamente. c) A clonação do gene para [Ser-^,27] humana de G-CSF num vector de expressão. O gene acima descrito (ver figura 3 e SEQ.ID. 23

N9.49) foi clonado no vector plasmídio pICI0020. Este vector é um plasmídio com base em pAT 153 em que a região de 651 pb de EcoRI-AccI é substituída por um fragmento de 167 pb de EcoRI-Clal (SEQ.ID.N9.47) consistindo em: 1) um promotor trp de E.coli sintético e um local de ligação do ribossoma líder trp; 2) um códão de iniciação de translacção; 3) uma sequência de reconhecimento de enzima de restrição múltiplo derivado de M13mpl8, contendo locais para Kpnl, BamHI, Xbal, Sall, PstI, Sphl e HindiII; 4) uma sequência de terminação de transcrição sintética. A sequência de ADN desta região é representa da na Figura 1. 0 vector de expressão pICI0020 foi digerido até ao fim com Kpnl (BCL) em Tris HCL 10 mM (pH 7,5), cloreto de magnésio 10 mM. 0 ADN foi precipitado com etanol a -20SC de uma solução contendo acetato de sódio 0,3 M e em seguida as extremidades aderentes 3' foram removidas por tratamento com T4 ADN poli merase durante 10 minutos a 37SC da forma seguinte: ADN (1 pg) em água (16 μΐ)

Tampão 10X T4 polimerase (2 /il)

Tris acetato 0.33M pH 7.9 Magnésio acetato de 0.1M Potássio acetato de 0.66M Ditiotreitol 5mM

Soro de albumina de bovino a lmg/ml (BSA PENTAX fracção V) Mistura 2mM dNTP (1 jil)

T4 ADN polimerase (1 μΐ; 2.5 unidades/ μΐ BCL 24

Foi adicionada água (80 jjI) e a mistura foi extraída com fenolclorofórmio (100 μΐ). 0 ADN foi precipitado com etanol (250 μ!) a -20SC após adição de acetato de sódio 3 M (10 μΐ) e em seguida digerido até ao final com Sall (BCL) em NaCl 150 mM, MgCÍ2 10 mM e Tris HC1 10 mH (pH 7,5). A extremidade cega de Kpn terminada no vector Sall foi purificada de um gel de agaro se a 0,7% e isolada por utilização de um Geneclean (marca comercial) seguindo o procedimento recomendado pelo fabricante (Bio 101, Estados Unidos da América). 0 gene sintético foi isolado dos vectores pSTPl da forma seguinte. Os vectores foram digeridos com Seal e Sall (ambos de BCL) em NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM e Tris HCl 10 mM (pH 7,5). 0 fragmento de 530 pb foi purificado de um gel de agarose a 0,7% e isolado por utilização de Geneclean (marca regis tada) seguindo o procedimento recomendado pelo fabricante (Bio 101) .

Para a ligação, foram incubadas a 168C a 20 horas uma mistura do fragmento de genes Scal-Sall (50 ng) e o fragmento do vector pICI0020 (100 ng) em 20 ul de uma solução contendo 50 mM de Tris HCl (pH 7,6), 10 mM de MgCl2, 1 mM de ATP, 1 mM de DTT, 5% p/v de PEG 8000 e T4 ADN ligase (2 unidades;BRL). A mistura resultante foi utilizada para transformar as células de E. coli HB 101 competentes (fornecidas por BRL) da forma aqui descrita. Os transformantes foram escolhidos pelo crescimento em placas de L-ãgar contendo 50 pg/ml de ampicilina e foram escrutinados para determinar a presença do gene por hibridização de colónias com uma sonda marcada 32p (SEQ.ID.NS.24) da forma aqui descrita. O ADN de pasmídio foi preparado de 6 colónias hibri-dizantes, purificadas por centrifugação num gradiente de cloreto de césio e a sequência foi confirmada por sequenciação de didesox da forma aqui descrita. 0 plasmídio contendo este gene foi designado 25

por pICI1080. d)Subclonacão de um bloco de expressão contendo um gene para Γ Ser-ί^-—TG-CSF M 13 mp 18

Foi efectuada a seguinte subclonação para proporcionar um ponto de partida para a preparação dos derivados de G-CSF pormenorizados nos Exemplos 3-8. 0 ADN do plasmidio de pICI1080 (purificado por centrifugação de densidade com cloreto de césio) foi digerido até final com EcoRI e Sall (BCL) de acordo com as instruções do fabricante. 0 pequeno fragmento de EcoRI-SalI contendo o promotor trp e o gene de [Ser17'27]G-CSF foi isolado de um gel de agarose a 0,7% e por utilização de Geneclean (marca registada). Este fragmento foi clonado num vector M13mpl8 de corte de EcoRI-SalI (ADN fornecido por Amersham International; enzimas adquiridas de BCL). Os fragmentos foram ligados em conjunto num Tampão de ligação de 5x BRL utilizando BRL T4 ADN ligase (descrita anteriormen-te) . A mistura de ligação foi utilizada para transfectar as células de E. coli TG1 competentes (tornadas competentes de acordo com o método do cloreto de cálcio de Mandei e Higa descrito em "Molecular Cloning - A Laboratory Manual" - Maniatis e col. Cold Spring Harbor). As células transfectadas foramsuspensas num ágar de topo TY contendo 2% de X-Gal em dimetilformamida (DMF) e 200ul da fase logarítmica das células de E. coli TG1 e foram colocadas em placas de ágar 2x TY (TY ágar de topo - 8 g de Bactotriptona, 5 g de Extracto de levedura, 5 g de NaCl, 7,5 g de Bactoágar em 500 ul de água esterilizada). Foram tomadas 4 placas brancas em 4 x 2 ml de células de E. coli TG1 a 1% em caldo TY (8 g de Bacto triptona, 5 g de Extracto de levedura, 5 g de NaCl em 500 ml de água esterilizada) em aliquotas, e foi feita a cultura durante 6 horas a 37SC. As culturas de 2 ml foram divididas em aliquotas de 0,5 ml e 1,5 ml. As bactérias foram separadas por centrifugação da solução em microfugo de Eppendorf (marca registada) e os 26

sobrenadantes foram transferidos para tubos de eppendorf esterilizados. As alíquotas de 0,5 ml foram armazenadas a -20SC como armazém de fagos. As alíquotas de 1,5 ml foram utilizadas para preparar ADN de espira simples seguindo o método de Amersham International M13 e do seu livro de sequência, de referência (ver a seguir). Estas amostras de ADN foram em seguida sequenciadas utilizando oligonucleótidos SEQ.ID.N2.22, SEQ.ID.N2.23 e M13 de primário de sequenciação universal. As reacções foram efectuadas utilizando o dispositivo de Sequenase (marca registada) de acordo com as instruções do fabricante.Todos os 4 clones tinham a sequên cia de ADN correcta para [Ser^,27]q_csf.

Preparação de ADN de espira uníca a grande escala

Para as preparações de ADN de espira única de 200-500 μg de ADN/ml, foi utilizado o processo referido em Amersham International "Oligonucleotide Directed Mutagenesis". 0 procedimento detalhado é o seguinte:

Preparação de ADN de espira uníca a grande escala:

A. PREPARAÇÃO DE lml DE MATERIAL DE FAGO 1. Toma-se uma colónia simples de E. coli TG1 de uma placa de gli cose/meio/mínimo. Faz-se a cultura durante a noite em 10 ml de meio 2 x TY, agita-se a 37SC. Adicionam-se 10 μΐ a 20 ml de meio fresco, e agita-se a 372C durante 3 horas. 2. Inocula-se 1 ml de meio de 2 x TY em 10 ml num tubo de cultura esterilizada com 100 pl de uma cultura de 3 horas obtida na fase 1. , 3. Inocula-se a cultura de lml com uma placa recombinante. 27

4. Incuba-se durante 3 horas com agitação a 372C. Transfere-se para um tubo de microcentrifugação. 5. Centrifuga-se durante 5 minutos à temperatura ambiente. Deita-se o sobrenadante num tubo fresco. Guarda-se durante a noite a 4SC. Estabelece-se uma cultura durante a noite de TG1 E. coli para a fase seguinte. B. CRESCIMENTO DE 100 ml DE CULTURA DE FAGO. 1. Inoculam-se 100 ml de meio 2 x TY com 1 ml da cultura obtida durante a noite de TG1 e agita-se a 37SC até se atingir um valor de ODgQQ de 0,3. 2. Adiciona-se o 1 ml de fago sobrenadante de A5 (anterior) à cultura de 100 ml. 3. Incuba-se durante 5 horas com agitação a 37SC. Transfere-se para os tubos de centrifugação. 4. Centrifuga-se a 5000 x g durante 30 minutos a 4SC. 5. Transfere-se o sobrenadante para um tubo de centrifugação limpo. Tem-se o cuidado de não se arrastarem quaisquer células (o agregado bacteriano retido para a preparação de RF ADN). 6. Adicionam-se 0,2 volumes de PEG 6000 a 20% p/v em NaCl 2,5 M ao sobrenadante. Mistura-se bem e em seguida deixa-se em repouso durante uma hora a 4SC. 7. Centrifuga-se a 5000 x g durante 20 minutos a 42C. Despreza-se o sobrenadante. 8. Centrifuga-se a 5000 x g durante 5 minutos e remove-se todo o PEG/NaCl restante con uma pipeta de separação de Pasteur. 9. Ressuspende-se o agregado virai em 500 μΐ de água (duplamente destilada) e transfere-se para um tubo de microcentrifugação (1,5 ml). 10. Centrifuga-se durante 5 minutos numa nicrocentrifugadora para remover quaisquer células restantes. Transfere-se o sobrenadante para um tubo de microcentrifugação fresco. 11. Adicionam-se 200 μΐ de PEG a 20% em NaCl 12,5 M ao sobrenadan te, mistura-se bem e em seguida deixa-se em repouso à temperatura 28

ambiente durante 15 minutos. 12. Centrifuga-se durante 5 minutos, e despreza-se o sobrenadan-te. 13. Centrifuga-se durante 2 minutos. Removem-se cuidadosamente todos os traços de PEG/NaCl com pipeta de separação de Pasteur. 14. Ressuspende-se o agregado virai em 500 ml de água duplamente destilada. 15. Adicionam-se 200 ,μΐ de fenol saturado com 10 mM Tris HC1 pH 8,0, 1 mM de EDTA. Agita-se ligeiramente. 16. Faz-se o repouso do tubo durante 15 minutos à temperatura ambiente. 17. Centrifuga-se durante 3 minutos. 18. Transfere-se o sobrenadante para um tubo fresco. 19. Repetem-se os passos 15-18. 20. Adicionam-se 500 jul de clorofórmio e extrai-se duas vezes a fase aquosa. 21. Adicionam-se 50 jil de acetato de sódio 3 M e 1 ml de etanol absoluto. Mistura-se. 22. Coloca-se em gelo seco e num banho de etanol durante 20 minutos . 23. Centrifuga-se durante 15 minutos. 24. Lava-se cada agregado com 1 ml de etanol a -20SC. Retiram-se-as da lavagem. 25. Seca-se em vazio o agregado e adiciona-se a 50 μΐ de água duplamente destilada.

Este procedimento permite obter 100-200 ug de ADN de espira simples. e)Fermentação

Foi Transformado pICHOSO em E. coli em estirpe MSD 522 e os recombinantes resultados foram purificados . e mantidos em banho de glicerol a -80SC. 29

y

Foi removida uma alíquota da cultura de armazém e riscada em placas de ágar de L-ampicilina para separar as colónias únicas após cultura durante a noite a 372C. Foi removida uma única colónia pretendida e foi ressuspensa em 10 ml de caldo de L-ampicilina e foram inoculados imediatamente 100 ;il em cada um dos 10 frascos de Erlenmeyer de 250 jul contendo 75 ml de caldo de L-ampicilina. Após cultura durante 16 horas a 372C num agitador reciprocante os conteúdos dos frascos foram juntos e utiliza-zados para inocular um fermentador contendo 201 de meio de cultura LCM50.

Composição de LCM50

Feito a volume com água destilada aZi kh2po4 Na2HP04 NaCl Hidrolisado de Caseína (NH4)2S04 Extracto de levedura Glicerol L-Leucina L-Treonina MgS04. 7H20 CaCl2. 2H20 Tiamina FeS04 Acido citrico Solução de elementos traços (TES) 3.0 6.0 0.5 2.0 10.0 10.0 35.0 2.5 0.9 0.5 0.03 0.008 0.94/0.02 0.5 ml

Foram efectuadas as fermentações a uma temperatura de 37SC e a um valor de pH controlado por adição automática de solução de hidróxido de sódio 6 M, com valor de pH 6,7. A tensão de oxigénio dissolvido (dOT) fixada ou ajustada foi de 50% de saturação de ar e foi inicialmente controlada por ajustamento automático da velocidade de agitação do fermentador. Foi aumenta- 30

do o caudal de ar ao fermentador, inicialmente 20 1/min, correspondente a 1 volume por volume por minuto (VVM) para 50 1/min (2,5 VVM) quando a velocidade do agitador do fermentador se aproximava de 80-90% do seu valor máximo. Dado que a taxa de transferência de oxigénio (OTR) dos fermentadores foi incapaz de atingir a taxa de absorção de oxigénio (OUR) das bactérias para uma densi dade de células superior à correspondente a um valor de OD55Q de 50 nas condições descritas, foi mantido o valor de dOT no fermentador para densidades de células superiores a este valor com 50% de saturação de ar por restrição da taxa de absorção de oxigénio das bactérias. Isto foi conseguido por formulação do meio para se tornar limitado em carbono para valores de OD^O de 50 e em seguida alimentando-o com uma fonte limitante de carbono, juntamente com sulfato de amónio e extracto de levedura, a uma taxa em que havia uma taxa de crescimento bacteriano restrito.

As fermentações foram efectuadas durante 16 horas e durante esse tempo as amostras foram tomadas para medida da densidade õptica (OD550), P®sa9em das células secas e acumulação de G-CSF dentro das células. A acumulação de G-CSF foi medida por escrútinio de azul de Coomassie revelado com geís de SDS PAGE de lisados de células integrais das bactérias da amostra tal como é bem conhecido.

Quando o valor de OD50 atingiu 25, foi introduzido por bombagem numa solução do hidrolisado de hidrato de caseína (100 g/1 de Oxzoid L 41) dos fermentadores a uma taxa de 1,5 g/1 h.

Quando o valor de OD55Q atingiu aproximadamen te 50, o fornecimento da fonte de carbono no lote de fermentação consumiu-se todo dando origem a um aumento rápido no valor de dOT do ar com 50% de saturação. Nesta altura, foi itroduzido por bom- * bagem uma alimentação contendo glicerol (470 g/1), extracto de • levedura (118 g/1) e sulfato de amónio (118 g/1) nos fermentado- 31

res a um caudal que regressava e que em seguida mantinha o valor de dOT a 50% de saturação de ar com o fermentador agitado a cerca de 80% do seu valor máximo. Após cerca de 13-14 horas esta alimen tação foi substituída com uma segunda alimentação contendo glice-rol (715 g/1) e sulfato de amónio (143 g/1) apenas. Foi mantida a alimentação de hidrolisado de caseína a 1,5 g/l/h em todo o pro cesso. Após aproximadamente 16 horas, quando o exame microscópico da cultura revelou a presença de grandes corpos de inclusão dentro da maior parte das células as bactérias foram colhidas numa centrifugadora Sorvai RC3B (7000 g, 30 min, 49C) e armazenadas congeladas a -80SC. f)Purificação

Foi ressuspensa a 42C uma pasta de células congeladas (500 g) em Tris HC1 50 mM, EDTA 25 mM, pH 8,0 (5 litros) utilizando um homogenizador de Silvereon modelo AXR. A suspensão foi lisada fazendo-a passar três vezes através de um homogenizador de Manton-Gualin a 4/MPa e centrifugado a 5000xg durante 30 minutos numa centrifugadora Sorvai RC3C utilizando um rótor H6000A. 0 sobrenadante foi desprezado e a fracção de agrega do foi armazenada a -20SC antes de purificação adicional. A fracção do agregado (60-100 g) foi descongelada e ressuspensa em ácido desoxicólico a 1% p/v(sal de sódio) em EDTA 5 mH, ditiotreitol 5 mM, Tris HC1 50 mM, pH 9,0 (1200 ml) contendo 1 mg/ml de azida de sódio e utilizando um homogenizador de Polytron com uma sonda PTA20 a uma velocidade ajustada de 5. A suspensão foi misturada durante 30 minutos à temperatura ambien te e foi centrifugada a 6500 x g durante 30 minutos numa centrifu gadora de Sorvai RC5C utilizando um rótor GSA. 0 sobrenadante foi desprezado e a pastilha foi retratada por duas vezes da mesma maneira. A pastilha é em seguida ressuspensa por duas vezes em água . (1 litro) e centrifugada a 15000 x g durante 20 minutos. A pasti- * lha final contendo corpos de inclusão lavados foi solubilizada 32

em sal de sódio de N-lauroil sarcosina a 2% p/v (Sarkosyl) em Tris HC1 50 mM, pH 8,0 (150 ml) contendo 1 mg/ml de azida de sódio. Foi adicionado sulfato cúprico até 20 mM e a mistura foi agi tada durante 16 horas a 202C antes da centrifugação a 30000 x g durante 30 minutos numa centrifugadora de Sorvai RC 5C utilizando um rótor SS34. 0 sobrenadante contendo o derivado foi armazenado a -202C em alíquotas de 50 ml antes de purificação posterior. 0 derivado solubilizado (20 ml) foi descongelado e feito passar através de um filtro de 5 uM para remover qualquer material em partículas. 0 filtrado foi aplicado a uma coluna (5 x 90 cm) de Ultrogel AcA54 equilibrada com N-lauroil sarcosina (sal de sódio) a 0,3% p/v em Tris HC1 a 50 mM, pH 8,0 contendo 1 mg/ml de azida de sódio a 42C. A coluna foi eluída com 0 mesmo tampão a um caudal de 2,5 ml/min e as fracções de 10 ml foram recolhidas. As fracções contendo a proteína derivada foram combinadas (aproximadamente 100 ml) e armazenadas a 4SC.

As fracções contendo o derivado combinadas de várias colunas foram de novo combinadas (300-500 ml) e diali-sadas contra fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 150 mM pH 7,4 (3-5 litros) contendo 1 mg/ml de azida de sódio utilizando um dispositivo de cartucho de espiral Amicon CH2A-1S equipado com uma menbrana de S1Y10 (10 kD de corte). 0 retido foi centrifugado a 30000 x g durante 30 minutos numa centrifugadora Sorvai RC5C utilizando um rótor SS34, e o sobrenadante foi dialisado numa tubagem de diálise com corte de 8kD de Spectropor - 6 durante 40 horas contra 3 mudanças (8 litros/300 ml de sobrenadante) de acetato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 100 mM, pH 5,4 contendo 1 mg/ml de azida de sódio. 0 precipitado que se formou foi removi do por centrifugação a 30000 x g durante 30 minutos e o sobrenadante foi dialisado durante 24 horas contra água contendo 1 mg/ml de azida de sódio seguida de 72 horas contra 6 mudanças de água. 0 retido final foi clarificado por centrifugação a 30000 x g du- • rante 30 minutos e armazenado congelado a -202C (concentração de , proteínas a 1 mg/ml) ou a 42C após liofilização. 33

A concentração do L-lauroil sarcosina (sal de sódio) caiu para valores inferiores a 0,001% p/v após diafil-tração e era inferior ao limite de detecção (cerca de 0,0001%) do método de Mp HLPC utilizado após diãlise contra a água.

Exemplo 2

Preparação de [Serl7,27] humano G-CSF

Foi repetido o procedimento descrito no Exemplo 1 com as excecçóes seguintes: 0 duplex I foi fosforilado com T4 polinucleó-tido quinase e digerido com MstII (10 unidades) em tampão 1 H (BCL ; 30 >il) durante duas horas a 37SC.

Após precipitação com etanol, o fragmento de 143 pb de EcoRI-MstII foi purificado num gel de poliacrilamida a 10% contendo ureia a 7 M, isolado por electroeluição de um pedaço de sílica e as hélices de ADN foram tratadas da forma descri ta no Exemplo de Referência 1. 0 fragmento sintético de EcoRI-MstII acima descrito foi clonado no vector plasmídio pAG88 descrito no Exemplo de referência 1. Para a preparação do vector, foi digerido o pAG88 (10 ^g) com MstII (20 unidades; BCL) em tampão 1 H (BCL 100 ;ul) durante 2 horas a 379C. 0 ADN foi precipitado com etanol de acetato de sódio 0,3 M a -20SC e em seguida digerido com EcoRI (20 unidades; BCL) em tampão 1 H (BCL; 100 jul) durante 2 horas a 372C. Após precipitação com etanol, o fragmento maior de EcoRI-MstII foi purificado em gel de agarose a 1% e purificado utilizan do Geneclean (marca registada) da forma descrita pelo fabricante , (Bio 101, Estados Unidos da América) . As colónias contendo o fra-* gmento sintético foram confirmadas por escrutínio com uma sonda 34

radioactiva preparada do oligonucleótido (SEQ.ID.N2.24) e a sequência correcta foi confirmada por sequenciação de ADN da forma descrita no Exemplo de Referência 1. 0 plasmídio contendo o gene para [Ser17#27]G-CSF foi designado como pICI1107. 0 gene foi clo-nado com o vector de expressão pICI0020 e fermentação e a purificação de proteína foi efectuada da forma descrita no Exemplo 1.

Exemplo 3

Preparação de [Arg11, Ser·*·'7'27,60,65] humano G-CSF

Foi repetido o procedimento descrito no Exemplo de Referência 2 utilizando o molde mutagénico M13mpl8 contendo o gene para [Ser17'27] G-CSF descrito no Exemplo 1 ou 2. Os oligonucleótidos mutagénicos utilizados são designados por SEQ. ID.N2.28 e SEQ.ID.N2.29 (como a seguir definidos). 0 tripleto ACG em SEQ. ID. N2.28 serve para con verter Gin na posição 11 para Arg e o primeiro e últimos triple-tos AGA em SEQ.ID.N2.29 servem para converter Pro nas posições 65 e 60 para Ser. A mutagênese foi efectuada da forma descrita no Exemplo de Referência 2 utilizando SEQ.ID.N2.29 numa única mu-tagénese de primagem. Isto produziu uma placa única que incorporava as alterações de Pro 60 Ser e Pro 25 Ser. O ADN de hélice única foi preparado a partir desta placa da forma descrita no Exemplo de Referência 2. Este ADN foi utilizado como molde mutagénico numa mutagênese de primagem única utilizando SEQ.ID.N2.28 como primário mutagénico. Isto permitiu obter mais de 100 placas, 3 das quais foram escrutinadas por sequenciação de ADN da forma anteriormente descrita. Todas as 3 tinham o conjunto completo de alterações incorporadas. 0 RF ADN de dupla hélice foi preparado a partir duma das placas seguindo o procedimento para a preparação a grande escala de ADN de hélice única (fase d no Exemplo 1) para a fase B5. O RF ADN foi extraído do agregado bacteriano pelo • procedimento de lise alcalina de Birnboim e Doly (Nucleic Acids , Research (1979) 7, 1513-1523) e purificado por centrifugação em 35

J

*AsJ ·'. ! . “Τ’’·”.· M gradiente de densidade com cloreto de césio da forma descrita em "Molecular Cloning - a Laboratory Manual" de Sambrook, Fritsch e Maniatis (Cold Spring Harbor Publication) . 0 RF ADN foi digerido com EcoRI Sall no tampão H da forma anteriormente descrita e o pequeno fragmento, contendo o promotor trp, sítio de ligação de ribossomas, códão de inicio de translação e gene para [Arg11, ger17,27,60,65] q-cSF isolado de um gel de agarose a 0,7% por utilização de Geneclean (marca registada). O fragmento foi ligado no vector pICI0020 digerido com EcoRI-SalI, utilizando um excesso de 2:1 molar para inserir o vector, com o tampão de T4-ADN ligase e essencialmente da forma anteriormente descrita. A mistura de ligação foi utilizada para transformar E. coli estirpe HB101. Os transformantes foram escolhidos pelo crescimento em placas de L-ágar contendo 50 >ig/ml de ampicilina. As colónias foram escrutinadas para a determinação da presença de ADN inserido por análise de restrição do ADN do plasmídio preparado pelo método de Birn-boim e Doly descrito em "Molecular Cloning - a Laboratory Manual" Sambrook, Fritsch e Maniatis (Cold Spring Harbor Publication). O ADN de plasmídio de uma colónia contendo a inserção esperada de 619 pb de EcoRI-SalI foi utilizado para transformar E. coli estirpe MSD522 e designada por pICI1239. A fermentação e purificação foram efectuadas da forma descrita no Exemplo 1.

Exemplo 4

Preparação do [Ser17>27,115,116, ç^ulll] humano G-CSF

Foi repetido o procedimento descrito no Exem pio 3 utilizando um molde mutagénico de M13mpl8 contendo um gene para [Ser17'27] G-CSF descrito no Exemplo 1 ou 2. 0 oligonucleóti do mutagénico é designado por SEQ.ID.N9.30 (como a seguir é definido) . O tripleto GCT serve para converter Thr na posição 116 para Ser, o tripleto AGA serve para converter Thr na 36 v> ,x ,.y-' posição 115 para Ser e o tripleto TTC serve para converter Ala na posição 111 para Glu. 0 procedimento de mutagénese foi essencialmente o descrito no Exemplo 3 e o bloco de expressão foi transformado no plasmidio de expressão para se o Ser pICI1243. A fermentação e purificação foram efectuadas da forma descrita no Exemplo 1.

Exemplo 5

Preparação de [Arg11, Ser17'27, Lys58, Arg165] humano G-CSF

Foi repetido o procedimento descrito no Exemplo 3 utilizando um molde mutagénico M13mpl8 contendo o gene para [Ser17'27] G-CSF descrito no Exemplo 1 ou 2. Os oligonucleótidos mutagénicos utilizados são designados por SEQ.ID.N2.28, SEQ.ID. N9.31 e SEQ.ID.N9.32 (como anteriormente definidos). 0 tripleto TTT em SEQ.ID.N2.31 serve para converter Trp na posição 58 para Lys e em SEQ.ID.N2.32 o segundo tripleto GCG serve para converter Tyr na posição 165 para Arg, 0 procedimento de mutagénese foi igualmente efectuado como experiência de primagem dupla utilizando SEQ.ID. N9.31 e SEQ.ID.N9.32 como oligonucleótidos mutagénicos da forma descrita para o Exemplo de Referência 2. Isto produziu 2 placas em que ambas tinham alteração SEQ.ID.N2.32 (Tyr 165 Arg) mas não a alteração de SEQ.ID.N2.31. 0 ADN de hélice simples foi preparado a partir de uma dessas placas da forma descrita no Exemplo 1. Este ADN foi utilizado como molde mutagénico numa mutagénese de primário dupla utilizando SEQ.ID.N2.28 e SEQ.ID.N9.31 como primários mutagénicos. Isto permitiu obter 2 placas uma das quais tinha o conjunto completo de alterações incorporadas e o bloco de expressão foi transferido para o plasmidio de expressão para se , obter pICI1246. A fermentação e purificação foi efectuada na for-* ma descrita no Exemplo 1. 37 |\ ^çlSSsasBssajs,,:

Exemplo 6

Preparação de [Glu15I\ Ser17'27, Ala26'28, Lys30] humano G-CSF a) Foi repetido o procedimento descrito no Exemplo 3 utilizando o molde mutagénico M13mpl8 contendo gene para [Ser17'27] G-CSF descrito no Exemplo 1 ou 2. Os oligonucleótidos mutagénicos utilizados são designados por SEQ.ID.NS.33 e SEQ.ID.N2.34 (como a seguir definidos). 0 tripleto TTC em SEQ. ID. Ns . 33 serve para con verter Leu na posição 15 para Glu. Na SEQ.ID.N2.34 o primeiro tri pleto TTT serve para converter Ala na posição 30 para Lys e os tripletos AGC servem para converter Gly na posição 28 e 26 para Ala. O procedimento de mutagénese foi essencialmente descrito no Exemplo de Referência 2 como experiência de dupla primagem e o bloco de expressão foi transferido para o plas-mídio de expressão para se obter pICI1266. A fermentação foi efectuada da forma descrita no Exemplo 1. b) Purificação

Fez-se a lisagem de pasta de células congeladas e a fracção do agregado foi separada da forma descrita no Exemplo 1. Os corpos de inclusão na pastilha contendo esta proteí na foram solubilizados pelo tampão de ácido desoxicólico (sal de sódio) que é o tampão descrito no Exemplo 1. Foi utilizado o seguinte procedimento modificado para esta proteína.

Foi feita a descongelação da fracção da pasti • lha bruta (60-100 g) e ressuspensa em EDTA 25mM, Tris HC1 50 mM, 38

ρΗ 8,0 (1200 ml) utilizando um homogeneizador Polytron com uma sonda PTA 20 a um ajustamento de velocidade de 20. A suspensão foi misturada à temperatura ambiente durante 30 minutos e centri-fugada a 6500 x g durante 30 minutos numa centrifugadora Sorvai RC5C utilizando um rótor GSA. 0 sobrenadante foi desprezado e a pastilha foi retratada duas vezes da mesma forma. A pastilha foi em seguida duas vezes ressuspensa em água (1 litro) e centrifuga-da da forma descrita no Exemplo 1. Em seguida o procedimento de purificação foi o referido no Exemplo 1.

Exemplo 7

Preparação de [Ser17'27, Lys49,58f Ala^4f51,55] humano G-CSF

Foi repetido o procedimento no Exemplo 3 utilizando o molde mutagénico M13mpl8 contendo o gene para G-CSF [Ser17'27] descrito no Exemplo 1 ou 2. Os oligonucleótidos mutagé nicos utilizados são designados por SEQ.ID.N2.35 e SEQ.ID.N2.36 (como a seguir definidos). Na SEQ.ID.NS.35 os tripletos AGC servem para converter Gly em Ala na posição 51 em Pro em Ala na posi ção 44 e o tripleto TTT serve para converter Leu em Lys na posição 49. Na SEQ.ID.N2.36 o tripleto TTTserve para converter Trp em Lys na posição 58 e o segundo tripleto AGC serve para converter Gly em Aln na posição 55. A mutagénese foi efectuada como experiência de primagem dupla da forma descrita no Exemplo de Referência 2. Foram assim obtidas 16 placas. Foram escrutinadas 8 placas por sequenciaçlo de ADN da forma descrita no Exemplo 3. Todas as placas tinham as alterações de SEQ.ID.N9.36 (Gly 55Ala, Trp 58 Lys) mas nenhuma tinha as alterações de SEQ.ID.N9.35. 0 ADN de hélice única foi preparado a partir de uma destas placas da forma descri ta no Exemplo 1 (d) e utilizado como molde mutagénico numa mutagé nese de primagem única utilizando SEQ.ID.N9.35 como primário muta gênico. Isto permitiu obter 50 placas, 3 das quais foram escruti-• nadas por sequenciação de ADN, 2 tinham o conjunto completo de 39

alterações. 0 bloco de expressão foi transferido para plasmídio de expressão para se obter pICI1297. A fermentação e a purificação foram efectuadas da forma descrita no Exemplo 1.

Exemplo 8

Preparação de [Arg11, Glu15, Ser17'27'60'65, Ala26'28, Lys30] G-CSF humano

Foi repetido o procedimento descrito no Exemplo 3 utilizando o molde mutagénico M13mpl8 contendo o gene para [Glu·*·8, Ser·*·7'27, Ala28'28, Lys38] G-CSF humano descrito no Exemplo 6. 0 oligonucleótido mutagénico utilizado é designado por SEQ.ID.N9.28 que serve para converter Gin na posição 11 para Arg. 0 gene modificado foi isolado e ligado no vector pICI0020 (Exemplo 1). Este vector foi utilizado para transformar aE. coli estirpe MSD 522 como descrito no Exemplo 3 e foi designado por pICI1347. 0 ADN do plasmídio pICI1347 foi isolado de MSD522, puri ficado por centrifugação de densidade em cloreto de césio e digerido até final com ADN BamHI e o de plasmídio Sall (BCL) (5 jiig) foi incubado a 379C durante 2 horas num tampão de alto valor salino de BCL (100 jul) (50 mM de Tris HC1 ph 7,5, 10 mH de MgCl2, 100 mM de NaCl, lmM de ditioeritritol) contendo Bam Hl (40 unidades) . 0 ADN foi precipitado por adição de acetato de sódio 3M (10 μΐ) e etanol absoluto (250 jul) e arrefecido para -20SC durante 2 Horas, recolhido por centrifugação durante 10 minutos (a 10 000 rpm), seco em vazio e dissolvido em água (10 jul). Foi adicionada amostra contendo tampão (2 ;il contendo 240 mH de Tris acetato pH 7,8, 6 mM de EDTA, 20% de sacarose, 0,2% de xileno cianol e 0,2% de bromofenol azul) e a mistura foi carregada num gel preparativo de agarose a 0,7% (40 mM de Tris acetato pH 7,8 e 1 mM de EDTA) contendo brometo de etídio (0,5 jag/ml) e sujeito a electro-forese a 100 volts durante 1 hora. 0 grande fragmento do vector BamHI-SalI foi isolado de um gel de agarose a 0,7% utilizando Ge-neclean (marca comercial). Foi isolado de forma semelhante o ADN . do plasmídio pICI1239 do Exemplo 3 e digerido com BamHI e Sall. | 0 pequeno fragmento de BamHI-SalI, contendo os codões Ser nas po- 40 «gqpamiLi*

siçoes 60 e 65, foi isolado e ligado ao grande fragmento de vec-tor BamHI-SalI acima descrito. A mistura foi utilizada para trans formar E. coli estirpe MSD522 e o plasmidio foi designado por PICI1348. A fermentação e a purificação foram efectuadas da forma descrita no Exemplo 6.

Exemplo 9

Foi repetido o procedimento dos Exemplos 1 e 2 utilizando E. coli estirpe TG1 em vez de E. coli estirpe MSD522 na fase de fermentação (ver por exemplo o Exemplo (e) 1).

Exemplo 10

Processo alternativo de extracção para [Met-·*-, ArgH, Ser-^f27, 60,65] g-CSF humano

Foi ressuspensa a pasta de células congeladas (640 g) a 4SC em 50 mM de Tris HC1, 5 mM de EDTA, 5 mH de ditio-treitol, 2 M de ureia pH 8,0 contendo 1 mg/ml de azida de sódio (5 litros) utilizando um homogeneizador Polytron com uma sonda PTA20 a uma velocidade ajustada de 7/8. A suspensão foi lisada fazendo-a passar por três vezes através de um homogeneizador de Manton-Gaulin Lab 60/60 a 1 Mpa e purgou-se com mais um litro de tampão. Foi feito o arrefecimento por meio de um arrefecedor de Conair de passo único a -20SC. 0 lisado foi centrifugado a 5000 x g durante 30 minutos numa centrifugadora Sorvai RC3C utilizando um rótor H6000A. O sobrenadante foi desprezado e a pastilha (cerca de 450 g) foi ressuspensa no mesmo tampão (10 litros). Misturou-se a suspensão durante 30 minutos à temperatura ambiente . e centrifugou-se a 5000 rpm durante 30 minutos em duas centrífuga doras Sorvai RC3C utilizando rotores H6000A. 0 sobrenadante foi 41

desprezado e a pastilha foi retratada por duas vezes de forma idêntica. A pastilha foi em seguida ressuspensa 2 vezes em água (10 litros) e centrifugada a 5000 rpm durante 30 minutos. As pastilhas finais contendo corpos de inclusão lavados foram ressus-pensas em 2% p/v de sal de sódio de N-lauroil sarcosina em 50 mM de Tris HC1, pH 8,0 (1 litro) contendo 1 mg/ml de azida de sódio utilizando um homogeneizador Polytron a uma velocidade ajustada de 7. Foram adicionados 20 mM de sulfato cúprico em água (1,5 ml) e a mistura foi agitada durante a noite à temperatura ambiente antes da centrifugação a 10 000 rpm durante 30 minutos numa cen-trifugadora Sorvai RC5C utilizando um rótor GSA.

Foi filtrado o sobrenadante contendo o derivado através de um filtro de 5 um para remover qualquer matéria em particulas, diluiu-se por 6 vezes com 50 mM de Tris HC1, pH 8,0 contendo 1 mg/ml de azida de sódio a 4SC, e diafiltrou-se à pressão máKima num dispositivo de ultra-filtração Amicon DC20 equipado com um cartucho S10Y10 (10 kd de corte) contra 10 mM de fosfato de sódio, 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,4 (90 litros) contendo 1 mg/ml de azida de sódio. Formou-se um precipitado no final da diafiltração.

Foi recolhida a parte retida (2,1 mg/ml de proteína total, 1,7 mg/ml de produto) em recipientes de 4 litros com tampa aparafusada, de polipropileno e incubou-se durante a noite a 372C. O precipitado que se formou foi removido por centri fugação a 5000 rpm durante 45 minutos num dispositivo Sorvai RC3C e o sobrenadante foi armazenado a 4SC. A monitorização por SDS-PAGE e rpHPLC revelou que durante o tratamento térmico final foram selectivamente precipitados as proteínas de E. coli contaminantes, oligómeros do produto, e produtos de degradação, com cerca de 85% do produto pretendido a permanecer em solução. A solução de produto clarificada altamente enriquecida, e tratada termicamente era totalmente 42

activa do ponto de vista biológico e estável a 20 mg/ml a 37SC durante 2 semanas sem evidência de degradação proteolítica e menos de 20% de precipitação. Isto proporcionou um excelente intermediário para purificação cromatográfica, adicional.

Exemplo 11

Caracterização de G-CSF e seus derivados

Foi concentrada uma solução em água de [Met"l Serl?]G-CSF e seus derivados (Exemplos 1-9) (concentração de proteínas de cerca de 1 mg/ml) a pelo menos 11 mg/ml de proteí na numa membrana Amicon YM10 a 4SC. Para evitar qualquer precipitação durante a concentração, pH 5,5 da solução de partida foi ajustado a pH 8,5 pela adição de hidróxido de amónio a uma concen tração final de cerca de 0,25 mM. Após a concentração o pH da solução tinha descido para cerca de 8,0. A solução de proteína concentrada foi ajustada a um teor de 10 mg/ml de proteína (estimada de uma solução de 1 mg/ml dando origem a um valor de A28O ãe 1*0) P°r adição de 20 vezes a solução salina tamponada concentrada. Esta solução de 10 mg/ml do derivado em fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 150 mM, pH 7,4 (PBS) proporcionou uma solução de armazém comum a partir do qual se estabeleceu a homogeneidade, identidade, actividade biológica e estabilidade da solução da proteína.

Foi também preparada uma solução de armazém de G-CSF humano com uma concentração de 1 mg/ml em PBS preparada da forma descrita no Exemplo de Referência 1.

Cada proteína revelou ser pelo menos de 95% • de um componente por processamento de PAGE-SDS em condições redu-| toras e não redutoras e por HPLC de fase inversa. A análise repe- 43

U·*· ^T^^^mwaaeae, 4.·'-.*.' >-*r*,„ '*«*;*/_&*"*

X tida da composição de aminoácidos após hidrólise ácida em HC1 6N a 1102C deu proporções de aminoácidos para cada derivado, e uma medida precisa da concentração de proteína na soluçã) de armazém. Esta concentração de proteína juntamente com a média dos títulos de bioensaio obtidos em pelo menos 6 dias diferentes foi utilizada para determinar a actividade específica do derivado. A análise das sequências terminais de N e a análise espectrométri ca de massa por electroatomização de derivados escolhidos deu as sequências e os pesos moleculares esperados.

Exemplo 12

Preparação de [Arg^, Ser^-7'27r60,65jg-CSF humano utilizando o vector de produção incluindo o promotor trp a) Foi digerido o plasmídio pICI1239 (descrito no Exemplo 3) com EcoRI e Sall tampão H de forma anteriormente descrita. O pequeno fragmento EcoRI-SalI contendo o promotor trp, local de ligação de ribossomas e gene para [Arg^, Ser^^'27,60,65]Q«çgp humano foi isolado a partir de um gel de agarose a 0,7% utilizando o Gene-clean (marca comercial). Foi preparado um fragmento do vector a partir de pICI0080 (ver Exemplo de Referência 6) por digestão com EcoRI e Xhol em tampão H e o fragmento grande EcoRI-Xhol isolado de um gel de agarose a 0,7% utilizando Geneclean (MC). 0 pequeno fragmento EcoRI-SalI foi ligado do fragmento vector EcoRI-Xhol, utilizando um excesso molar de 2:1 da inserção no vector da forma anteriormente descrita e a mistura de ligação foi utilizada para transformar a E. coli estirpe MSD522. Os transformantes foram escolhidos para crescimento em placas de L-ãgar contendo tetraci-clina (15 jig/ml). Foram escolhidas 3 colónias e cultivadas em meio mínimo M9 (75 ml) contendo suplementos e tetraciclina (15 yig/ml) a 37SC durante 20 horas num agitador reciprocante. A acumulação de proteína foi medida por varrimento de azul de Coomas-sie revelado em géis de SDS-PAGE de lisado de células integrais. Todos os 3 clones expressavam [Arg11, Ser17'^7,60,65] g-CSF hu. t 0 ADN de plasmídio de uma das colónias foi designado como pICI • 1327 e a sequência do promotor e gene foi confirmada pelos proce- 44

dimentos de sequenciaçlo de didesoxi convencionais da forma ante-riormente descrita. b)Fermentação

Foi transformado o pICI1327 em E. coli estirpe MSD522 e os recombinantes resultantes foram purificados e mantidos em soluções de glicerol a -802C.

Foi removida uma alíquota da cultura de arma-zêm e riscada em placas de ãgar de tetraciclina para separar colónias simples após crescimento durante a noite a 379C. Foi removida uma colónia simples e ressuspensa em 10 ml de caldo de tetra ciclina e foram imediatamente inoculados 100 μΐ em cada um de 3 frascos de Erlenmeyer de 250 ml contendo 75 ml de caldo de tetraciclina. Após crescimento de 16 horas a 37SC num agitador recipro co os teores dos frascos foram combinados e utilizados para inocu lar um fermentador contendo 20 litros de caldo de crescimento.

Composição do meio de cultura

Preparado com água destilada aZi 3.0 6.0 0.5 2.0 10.0 10.0 35.0 0.625 0.5 kh2po4

Na2HP04

NaCl

Hidrolisado de Caseína (NH4)2S04

Extracto de levedura

Glicerol L-Leucina

MgSO^. 7H20 45

CaCl2. 2H20 0.03

Tiamina 0.008

FeSO^ Acido citrico 0.04/0.02

Solução de elementos traços (TES) 0.5 ml l-^

Tetraciclina 10 mg 1“·*·

As fermentações foram em seguida efectuadas a uma temperatura de 37SC, e um valor de pH controlado por adição automática de uma solução 6M de hidróxido de sódio, com pH 6,7. A tensão de oxigeno dissolvida (dOT) ajustada foi de 50% da saturação de ar e foi inicialmente controlada por ajustamento automático da velocidade de agitação do fermentador. O caudal de ar para o fermentador, que era inicialmente de 20 1/min, correspondente a um volume por volume por minuto (VVM) foi aumentado para 50 1/min (2,5 VVM) quando a velocidade do agitador de fermentação se aproximava de 80 a 90% do seu valor máximo. Dado que a taxa de transferência de oxigénio (OTR) dos fermentadores era incapaz de manter a taxa de absorção de oxigénio (OUR) das bactérias a uma densidade de células superior correspondente a um valor de OD55Q de 50 nas condições descritas, o valor de dOT no fermentador para densidades de células superiores a este valor foi mantida a 50% de saturação de ar por restricção da taxa de absorção de oxigénio das bactérias. Isto foi conseguido por formulação do meio de forma a tornar-se limitado em carbono a um valor de OD550 de 50 e em seguida fornecendo uma fonte de carbono limitada, juntamente com sulfato de amónio e extracto de levedura, a uma taxa que restringia a taxa de crescimento bacteriano.

As fermentações foram efectuadas durante 18 horas e durante esse tempo foram tomadas amostras para medida da densidade óptica (OD550), peso seco de células e acumulação de [Argl·1, ser17,27,60,65] dentro das células. A acumulação de • [ArgH, Ser17'27'60'65] foi medida por varrimento de azul de . Coomassie revelado em géis de SDS-PAGE de lisados integrais de 46

células da bactéria da amostra como é bem conhecido.

Quando o valor de OD550 atingiu 35 (8,5horas) foi enviada por meio de uma bomba uma solução de hidrolisado de caseína (100 g/1 de Oxzoid L41) para os fermentadores a um caudal de 0,75 g/l/h.

Quando o valor de OD550 atingiu aproximadamen te 50, o fornecimento da fonte de carbono no caldo de fermentação foi consumido conduzindo a um aumento rápido no valor de dOT de 50% de ar de saturação. Nesta altura, foi enviado por meio de bomba uma alimentação contendo glicerol (470 g/1), extracto de levedura (118 g/1) e sulfato de amónio (118 g/1) para os fermentadores a um caudal com retorno e em seguida mantendo o valor de dOT a 50% do ar de saturação com a agitação do fermentador a cerca de 70 a 80% do seu valor máximo. Foi mantida a alimentação de hidrolisado de caseína a 0,75 g/l/h em todo o ensaio. Após aproxi madamente 18 horas, quando o exame microscópio da cultura revelou a presença de grandes corpos de inclusão dentro da maior parte das células, foram recolhidas as bactérias numa centrifugadora de Sorvall RC3B (7000 g, 30 min., 4SC) e armazenou-se na forma congelada a -80SC. c)Purificação A purificação foi efectuada da forma descrita no Exemplo 1 (f).

Exemplo 13

Preparação de [Arg·^, Ser^,27,60,65] g-CSF hu utilizando o vec-tor de produção incluindo um promotor T7A3. • a) Foi sub-clonado um fragmento de EcoRI-SalI, contendo um promo- 47

tor T7A3, uma sequência líder trp de locais de ligação de ribos-somas e um gene para [Ser-*-7,27] g-CSF hu em Ml3 mpl8 da forma des crita na parte d do Exemplo 1. A sequência do fragmento de EcoRI-Sall é apresentada na SEQ.ID.N2.50 e Figura 3, e a SEQ.ID.N2.50 consiste num local de restrição de EcoRI (nucleótidos 1-6), a sequência promotora A3 do bacteriófago T7 (nucleótidos 7-52), a sequência líder trp de locais de ligação de ribossoma (nucleótidos 53-78), e o códão da iniciação da translação (nucleótidos 79-81). A Figura 3 mostra a sequência de nucleótidos de [Serl^,27] G-CSF hu terminando no local de restrição Sall. Deve notar-se que o códão do terminal 3' ATG de SEQ.ID.NS.50 precede imediatamente o códão ACT que codifica para a treonina (aminoácido 1) na Figura 3. A sequência de 5' nucleótidos AATTCAGT está assim ausente do fragmento EcoRI-SalI. 0 fragmento EcoRI-SalI pode também ser preparado por excisão de pICI 1295 (ver Exemplo de Referência 7). A mutagénese dirigida a locais foi efectuada num ADN de hélice única como descrito no Exemplo de Referência 2 utilizando o oligo nucleótido SEQ.ID.N9.28 para converter o codão para Gin na posição 11 para Arg. Foi preparado o RF ADN de dupla hélice a partir de uma placa contendo a alteração Gln-*--*--Arg·*··*- da forma descrita no Exemplo 3, com a excepção de na fase B3 a incubação ter sido de 3 horas em vez de 5 horas, e digeriu-se com EcoRI (da forma anteriormente descrita) e SnaBI (como descrito no Exemplo de Refe rência 5). 0 fragmento resultante de 144 pb de EcoRI-SnaBI conten do o promotor T7A3, a sequência de locais de ligação de ribosso-mas líder trp e o fragmento de gene com o codão Arg·*··*· foi isolado e ligado a um vector de corte EcoRI-SnaBI de pICI 1327 (que contém codões para Ser60 e Ser65 e é descrito no Exemplo 12). A mistura de ligação foi utilizada para transformar e E.coli estirpe MSD522 e os transformantes escolhidos para crescimento em placas de L-ágar contendo tetraciclina (15 jpg/mg). 0 ADN de plasmídio de uma colónia contendo o promotor esperado T7A3 e [Arg^··*·, Ser·*·^ 27,60,65] g-CSF hu na sequência de genes foram identificados por sequenciação de ADN do plasmídio isolado e designado por pICI 1386. A fermentação foi efectuada de acordo com 2 48

processos alternativos (b) e (c) a seguir indicados. 0 processo (b) foi efectuado a 37SC e após 16 horas de fermentação da forma descrita, a biomassa microbiana foi de 35 g/1 e foi estimada que a [ArgH, Ser^-^'27,60,65] q-CSF humano era acumulada para 7 g/1 de caldo de fermentação. 0 processo (c) foi conduzido a 30SC e a fermentação foi desta forma mais lenta dada a temperatura mais baixa de fermentação. Em relação ao processo (c), passadas 35 horas, a biomassa microbiana era de 35 g/1 e o [Arg11, Ser17'27'60 65] G-CSF humano foi estimado como sendo acumulado de 15 g/1 de caldo de fermentação. b) A E.coli estirpe CGSC 6300 (genotipo F“, X",lac+) obtida de E.coli "Genetic Stock Centre" foi transformada com o plasmídio pICI 1386. a estirpe resultante CGSC 6300 (pICI 1386) foi purificada e mantida em soluçoes de glicerol a -80SC. Foi removida uma alíquota da cultura de armazém e riscada em placas de ágar de L-tetraciclina para separar colónias simples após crescimento duran te a noite (16 h) a 379C.

Foi removida uma colónia simples de CGSC 6300 (pICI 1386) e ressuspensa em 10 ml de caldo de L-tetraciclina e foram incubados imediatamente 100 jul em cada um dos 20 frascos de Erlenmeyer de 250 ml contendo 75 ml de caldo de L-tetraciclina. Após crescimento de 16 h a 37SC num agitador reciprocante foram combinados os conteúdos dos frascos, e utilizados para inocular um fermentador contendo 20 litros de meio de caldo LCM50 modificado. A composição do meio do caldo é o referido na Tabela 1.

TABELA 1: Composição do meio de cultura Meio de cultura modificado (A) Preparado com água destilada g/1 kh2po4 3.0 Na2HP04 6.0 NaCl 0.5 Hidrolisado de Caseína 2.0 (NH4)2S04 10.0 Extracto de levedura 20.0 Glicerol 35.0 MgS04. 7H20 0.5 CaCl2. 2H20 0.03 Tiamina 0.008 FeS04 Acido citrico 0.04/0.02 Solução de elementos traços (TES) 0.5 ml l-1 Tetraciclina 10 mg l"1 A fermentação foi em seguida efectuada a uma temperatura de 37-Q e a um valor de pH, controlado pela adição de uma solução de 6M de hidróxido de sódio, a pH 6,7. A tensão de oxigénio dissolvido (dOT) foi ajustada a 50% de saturação de ar e foi inicialmente controlada por ajustamento automático da velocidade de agitação do fermentador. O caudal de ar para o fer-mentador foi inicialmente de 20 1/min correspondente a 1,0 volume por volume por minuto (VVM) e foi aumentado manualmente para 45 1/min quando a velocidade de agitação do fermentador atingiu o seu valor máximo (1000 rpm). A fermentação foi efectuada durante 16 horas e durante este periodo foram retiradas as amostras para medida da densidade óptica da cultura (concentração de biomassa OD550, concentração total de proteína microbiana e acumulação de [Arg-'-·*·, Ser 17,27,60,65] g-cSF humano dentro das células bacteria-nas. Foi medida a acumulação por varrimento de azul de Coomassie revelado com géis de SDS-PAGE de lisados de células integrais da , bactéri da amostra seguindo uma técnica bem conhecida. 0 total * de proteína microbiana foi estimado pelo método de Lowry. Foi 50

enviada por meio de uma bomba uma solução de extracto de levedura (225 g/1) para o fermentador 4,5 horas após inoculação a 1,7 g/l/h.

Quando o fornecimento da fonte de carbono (glicerol) no meio de cultura se consumiu totalmente o valor de dOT aumentou rápidamente de 50% da saturação de ar. Nesta altura, foi enviado por meio de uma bomba uma alimentação contendo glicerol (714 g/1) e sulfato de amónio (143 g/1). Dado que a taxa de oxigénio de sulfato bacteriano (OUR) se aproximava da taxa de transferência de oxigénio máxima do fermentador (OTR) imediatamen te antes da fonte de carbono no meio de cultura se tornar exausto foi bombeada o caldo para o fermentador a uma velocidade que restringia o valor de OUR bacteriano para aproximadamente 80 a 90% do valor de OTR máximo dos fermentadores. 0 caudal foi ajustado manualmente para retorno e em seguida foi mantido o valor de dOT a 50% da saturação de ar nas condições descritas. c) Foi repetido o processo de fermentação descrito em (b) mas a uma temperatura de 30SC durante 35 horas. Com excepção da tempera tura de fermentação de 30SC o meio e as condições de fermentação eram idênticos aos descritos em (b). d) Foi efectuada a purificação da forma descrita no Exemplo 1 (£).

Exemplo 14

Preparação de [Glu15, Ser17,27, Ala26'28, Arg30] G-CSF humano

Foi preparado um molde mutagénico, M13 mpl8 contendo o gene para [Glu15, Ser17'27, Ala28'28, Lys30] G-CSF humano da forma descrita na parte (d) do Exemplo 1 ou o plasmídio 51 *

pICI 1266 substituindo o pICI 1080. Foi repetido o procedimento descrito no Exemplo 3 utilizando o molde acima referido com o oligonucleótido mutagénico designado por SEQ.ID.NS . 37. Isto serve para converter o codão para Lys na posição 30 para Arg. Foi preparado o ADN RF de dupla hélice a partir de um fago contendo a alteração pretendida. Foi isolado um bloco de expressão de EcoRI-Sall e clonado em pICI 0080 como descrito no Exemplo 12 para se obter pICI 1343. 0 processamento adicional para se obter o composto do título foi efectuado da forma descrita no Exemplo 3 e a purificação foi efectuada da forma descrita no Exemplo 6.

Exempo 15

Preparação de [Arg·'··'· 123 t ger17,27,60,65] g-CSF humano

Foi preparado um molde mutagénico M13 mpl8 contendo o gene para [Arg·1··1·, Ser·1·^' 2? / 60 > 65 ] g-CSF humano da forma descrita na parte (d) do Exemplo 1 ou o plasmídio pICI 1239 substituindo o pICI 1080. Foi repetido o procedimento descrito no Exemplo 3 utilizando o molde acima referido com o oligonucleótido mutagénico designado por SEQ.ID.N2.38. Isto serve para converter o codão para Lys na posição 30 para Arg. Foi preparado o ADN RF de dupla hélice a partir de um fago contendo a alteração pretendida. Foi isolado um bloco de expressão e clonado como descrito no Exemplo 14 para se obter pICI 1388. O processamento adicional para se obter o composto do título e a purificação do composto do título foram efectuados como descrito no Exemplo 1. 52 1

Exemplo 16 [ Preparação de [Arg·1··1·'^4, Ser-1-7,27,60,65 ] g-CSF humano

Foi repetido o procedimento descrito no Exemplo 15 com o oligonucleótido designado por SEQ.ID.N2.38 substitui do por SEQ.ID.N2.39 (isto serve para converter o codão para Lys na posição 34 para Arg) para se obter pICI 1389. 0 processamento adicional para se obter o composto do título e a purificação do composto do título foram efectuados como descrito no Exemplo 1.

Exemplo 17

Preparação de [Arg11^0, Ser17»27,60,65j g-CSF humano

Foi repetido o procedimento descrito no Exemplo 15 com o oligonucleótido designado por SEQ.ID.N2.38 substitui do por SEQ.ID.N5.40 (isto serve para converter o codão para Lys na posição 40 para Arg) para se obter pICI 1390. 0 processamento adicional para se obter o composto do título e a purificação do composto do título foram efectuados como descrito no Exemplo 1.

Exemplo 18

Preparação de [Ala·*·, Thr^, Tyr^, Arg®»^-·*-, Ser·*·7»27,60,65] q-CSF humano

Foi repetido o procedimento descrito no Exemplo 15 com o oligonucleótido designado por SEQ.ID.N2.38 substitui do por SEQ.ID.N2.41 (isto serve para converter os codões para Thr, Leu, Gly, e Pro nas posições 1, 2, 3, 4 e 5 para Ala, Thr, Tyr e Arg) respectivamente para se obter pICI 1391. 53

Ji

0 polipéptido deste Exemplo ilustra que a modificação da presente invenção pode ser aplicada a um polipéptido que se sabe possuir a actividade de G-CSF para aumentar a estabilidade em solução do polipéptido. 0 polipéptido conhecido é [Ala3· Thr3, Tyr^, Arg^, Ser·*·7] G-CSF humano que é descrito na Publicação da Patente Europeia Ns.272 703 de Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. 0 processamento adicional para se obter o composto do titulo e a purificação do composto do titulo foram efectuados como descrito no Exemplo 1.

Exemplo 19

Preparação de [Arg3-3-, Ser3·7'27] G-CSF humano

Foi repetido o procedimento descrito no Exemplo 4 com o oligonucleótido designado por SEQ.ID.Ns.38 substitui do por SEQ.ID.N2.30 (isto serve para converter o codão para Gin na posição 11 para Arg). O bloco de expressão foi transferido para o plasmídio de expressão pICI 0080, em vez de pICI 0020 da forma descrita no Exemplo 14 para se obter pICI 1405. O processamento adicional para se obter o composto do titulo e a purificação do composto do titulo foram efectuados como descrito no Exemplo 1.

Exemplo 20

Preparação de [Ser17/27,60,65] g-CSF humano

Foi repetido o procedimento descrito no Exemplo 19 com o oligonucleótido designado por SEQ.ID.N2.28 substitui , do por SEQ.ID.NS.29 (isto serve para converter o codão para Pro * na posição 60 e 65 para Ser) para se obter pICI 1400. 54

0 processamento adicional para se obter o composto do título e a purificação do composto do título foram efectuados como descrito no Exemplo 1.

Exemplo 21

Preparação de [Arg·^, Ser·^ *· ^ ] G-CSF humano

Foi repetido o procedimento descrito no Exemplo 6 com os oligonucleótidos designados por SEQ.ID.NS.33 e SEQ. ID.NS.34 substituídos por SEQ.ID.N2.28 e SEQ.ID.N9.42.Isto serve para converter os codãos para Gin na posição 11 Pro na posição 60 para Arg e Ser respectivamente. O bloco de expressão foi trans ferido para o plasmídio de expressão pICI 0080, em vez de pICI 0020 para se obter pICI 1400. 0 processamento adicional para se obter o composto do título e a purificação do composto do título foram efectuados como descrito no Exemplo 1.

Exemplo 22

Preparação de [Arg·*-·*-, Ser^-7,27,65] q-cSF humano

Foi repetido o procedimento descrito no Exemplo 3 com o oligonucleótido designado por SEQ.ID.N®.29 substituído por SEQ.ID.N2.43 (isto serve para converter o codão para Pro na posição 65 para Ser) para se obter pICI 1418. 0 processamento adicional para se obter o composto do título e a purificação do composto do título foram efectuados como descrito no Exemplo 1. 55

Exemplo 23

Preparação de [Ser·*·7>27,60] q_CSF humano

Foi repetido o procedimento descrito no Exem pio 19 com o oligonucleótido designado por SEQ.ID.Ns.28 substitui do por SEQ.ID.Ns.42 (isto serve para converter o codão para Pro na posição 65 para Ser) para se obter pICI 1402. 0 processamento adicional para se obter o composto do titulo e a purificação do composto do título foram efectuados como descrito no Exemplo 1.

Exemplo 24

Preparação de [Ser17'27'65] G-CSF humano

Foi repetido o procedimento descrito no Exemplo 4 com o oligonucleótido designado por SEQ,ID.N9.30 substituído por SEQ.ID.NS.43 (isto serve para converter o codão para Pro na posição 65 para Ser) para se obter pICI 1420. 0 processamento adicional para se obter o composto do título e a purificação do composto do título foram efectuados como descrito no Exemplo 1.

Exemplo 25

Preparação de [Arg^··*·, Glu^,lllf ser17,27,60,65,115,116^ Aia26,28 Lys20] G-CSF humano 0 plasmídio pICI 1348, descrito no Exemplo 8, foi digerido com Xbal no tampão M e em seguida com Sall no tampão H e foi isolado o vector grande Xbal-Sall de um gel de 56

agarose a 0,7% da forma anteriormente descrita. 0 plasmídio pICI 1243, descrito no Exemplo 4, foi digerido com Xbal e Sall da forma acima descrita e o pequeno fragmento Xbal-Sall foi isolado de um gel de agarose a 0,7% e ligado ao fragmento de vector Xbal-Sall anteriormente referido. A mistura de ligação foi utilizada para transferir a estirpe de E.coli MSD522 e os transformantes foram escolhidos para crescimento em placas de L-ãgar contendo ampicilina (50 jjg/ml). Foram escrutinadas 3 colónias para a expressão de proteína da forma descrita no Exemplo 12 mas substituindo a tetraciclina por ampicilina a 50 jig/ml. 0 ADN do plasmídio de uma colónia que expressa a proteína correcta foi designado por pICI 1421. 0 processamento adicional para se obter o com posto do título foi efectuado da forma descrita no Exemplo 3 e a purificação do composto do título foi efectuada da forma descri ta no Exemplo 6.

Exemplo 26

Preparação de [ArgH'·^^, Glu·^, Ser-*-7'27'Ala2^#28í Lys30,58j g-CSF humano

Foi preparado um molde mutagénico, M13 mpl8 contendo o gene para [Arg11·, Glu15, Ser17'27'60'^, ^1^26,28 Lys2^] G-CSF humano da forma descrita na parte (d) do Exemplo 1 com o plasmídio pICI 1348 (descrito no Exemplo 8) substituindo pICI 1080. Foi repetido o procedimento descrito no Exemplo 3 utilizando o molde acima referido com oligonucleótidos mutagéni-cos designados por SEQ.ID.N9.28 e SEQ.ID.N9.29 substituídos por SEQ.ID.N9.44 e SEQ.ID.N9.32.Isto serve para converter os codãos para Trp na posição 53 para Lys e Tyr na posição 165 para Arg) para se obter pICI 1422. 0 processamento adicional para se obter o com 57

láSKufcí, posto do titulo foi efectuado da forma descrita no Exemplo 3 e a purificação do composto do título foi efectuada da forma descri ta no Exemplo 6.

Exemplo 27

Preparação de [Arg11, Glu15, Ser17'27'60'65, Ala26'28'44,51,55^ Lys30,49,58] g-CSF humano

Foi preparado um molde mutagénico da forma descrita no Exemplo 26. Foi repetido o procedimento descrito no Exemplo 4 utilizando o molde acima referido com oligonucleótidos mutagénicos designados por SEQ.ID.NS.30 substituídos por SEQ.ID. N2.45(isto serve para converter os codãos para Pro na posição 44 Leu na posição 49 e Gly na posição 51 e 55 para Ala, Lys, Ala e Ala respectivamente) para se obter pICI 1423. 0 processamento adicional para se obter o com posto do título foi efectuado da forma descrita no Exemplo 3 e a purificação do composto do título foi efectuada da forma descri ta no Exemplo 6.

Exemplo 28

Preparação de [ArgH»1^5f Glu-^#lllf ger17,27,60,65,115,116f Ala26,28,44,51,55f Lys30,49,58] G_CSF humano

Foi preparado um molde mutagénico da forma descrita na parte (d) do Exemplo 1 com pICI 1080 substituído por pICI 1423, da forma descrita no Exemplo 27. Foi repetido o procedimento descrito no Exemplo 3 utilizando o molde acima referido com oligonucleótidos mutagénicos designados por SEQ.ID.Ne.28 e SEQ,ID.N2.29 substituídos por SEQ.ID.N2.32 e SEQ.ID.NS.30 para se obter pICI 1424. 58

0 processamento adicional para se obter o com posto do título foi efectuado da forma descrita no Exemplo 3 e a purificação do composto do título foi efectuada da forma descri ta no Exemplo 6.

Exemplo de Referência 1 Preparação de G-CSF humano a) Preparação de um gene sintético para G-CSF humano

Foi concebida uma sequência de ADN (Figura 2) codificando a sequência de aminoácidos do polipéptido da Figura 2 (G-CSF humano) de acordo com as seguintes considerações: 1) Terminais coesivos de espiral única para permitir a ligação em locais adequados num plasmídio. 2) Uma série de sequências de endonuclease de restrição em todo o gene para facilitar a manipulação genética posterior. 3) Codão da terminação da translacção. 4) os codões na extremidade 5' da região de codificação foram normalmente escolhidos como sendo ricos em A/T. Os outros codões foram normalmente escolhidos como os preferidos para a expressão em E. coli. 0 gene foi construído a partir de 18 oligonu-cleótidos designados por SEQ.ID.N2.! - SEQ.ID.N9.18 que se apre-• sentam em seguida. 59

Foram preparadas as sequências de oligonucleó tidos a seguir apresentadas num sintetisador de ADN da Applied Biosystems 380A a partir de 5'-dimetoxitritilo de base protegida com nucleósido-2-cianoetil-N, N-disopropifosforamiditos enucleó-sidos protegidos ligados a suportes de vidro com poros controlados numa escala 0,2 micromolar, de acordo com os procedimentos recomendados pela Applied Biosystems.

Alternativamente, as sequências de nucleóti-dos podem ser preparadas por processos manuais descritos por Atkinson e Smith em "Olidonucleotide Sunthesys, a Praticai Approa ch" (M.T. Gait, Editor, IRL Press, Oxford, Washington DC, páginas 35-81).

Detalhando, a preparação das sequências de oligonucleótidos utilizando o sintetisador de Applied Biosystems 380A ADN foi efectuada da forma seguinte:

Cada oligonucleótido, após clivagem do suporte sólido e remoção de todos os grupos protectores, foi dissolvido em água (1 ml). Foi adicionada uma solução de acetato de sódio 3M (pH 5,6; 40 /il) e etanol (1 ml) às soluções de oligonucleótidos (400 jdl) e as misturas foram armazenadas a -702C durante 20 horas. Os precipitados resultantes foram recolhidos por centrifugação (13 000 rpm durante 10 minutos) e as pastilhas foram lavadas com etanol:água (7:3) (200 μΐ) e em seguida ligeiramente secas em vazio e dissolvidas em água (15 jal) e 10 jul de uma mistura de formamido/corante (NaOH 10 mM, EDTA 0,5 mH, 0.01% de azul de Bromofenol, 0.01% de xileno cianol, 80% de formamida).

Os oligonucleótidos foram purificados com um 60 1 » >11 ιή! (fi·· •'''^^s^ss^·· . J” ......... t

gel de poliacrilamida a 10% em Tris-borato 50 mM (pH 8,3) contendo ureia 8,3M. Foram identificados os oligonucleótidos com o comprimento correcto por revelação de UV ( Narang e col. 1979 em "Methods Enzymology" Vol. 68, 90-98), normalmente a banda mais importante foi retirada do gel e sujeita a electroeluição em Tris Borato 5 mM (pH 8,3) a 300 mV durante 3 a 4 horas. As soluções aquosas foram concentradas para cerca de 200 jal por tratamento com N-butanol (mistura, agitação e remoção da fase orgânica superior),Os oligonucleótidos purificados foram precipitados a -709C durante 20 horas a partir de uma solução 0,3M de acetato de sódio por adição de etanol (2,5 volumes).

Montagem do oene

Os oligonucleótidos SEQ.ID.NS.2 - SEQ.ID. Ns.17 (400 pM de cada) (tal como a seguir definido) foram sujeitos a fosfoliração com T4 polinucleótidos quinase (3,6 unidades) durante 2 horas a 37SC em 25 jil de uma solução contendo ATP (800 pM contendo 25 pM grama ATP), espermidina 100 um, MgCl2 20 mM, Tris-HCl 50 mM (pH 9,0) e EDTA 0,1 mM. As soluções foram aque cidas a 100SC durante 5 minutos para terminar as reacções, em seguida misturaram-se em pares como se mostra na Tabela 1 para se obterem os duplexes A a I (os oligonucleótidos SEQ.ID.Ns.l e SEQ. ID.NS.18 (400 mM em 25 μΐ) foram utilizados não fosforilados). Foram adicionados acetato de sódio 0,3M (pH 5,6 200 jal) e etanol (850 jil) e os duplexes precipitaram a -20SC durante 20 horas. Os precipitados resultantes foram recolhidos por centrifugação e lavados com etanol:água (7:3) e em seguida dissolvidos em água (50 ^il). Os pares de oligonucleótidos foram recozidos em conjunto por um primeiro aquecimento das soluções a 100SC durante 2 minutos em banho de água ebuliente. 0 banho foi em seguida deixado arrefe cer lentamente para 40SC (cerca de 4 horas). As soluções contendo 3 pares de duplexes foram combinadas da forma apresentada seguir (ver Tabela 1), para se obterem cinco grupos I a III liofilizados e dissolvidos em 3o μΐ de uma solução contendo T4 ADN ligase (1 unidade; BRL), Tris 50 mM (pH 7,6), cloreto de magnésio 10 mM, 61

5% (p/v) de PEG 8000, ΑΤΡ 1 mm, DTT 1 mm, (BRL, Focus Vol. 8 n9l Winter 1986) e o ADN foi ligado a 30SC durante 5 minutos seguido de 20 horas a 169C. Foram adicionados acetato de sódio 3M (20 jil) e água (150 ^1) e o produto precipitou pela adição de etanol (750 jil) e arrefecimento a -209C durante 20 horas. 0 precipitado foi recolhido por centrifugação e lavado com etanol (1 ml) e em segui da dissolvido em água (15 μΐ) e mistura de formamida/corante (10 >il) e purificado um gel de poliacrilamida a 10% em Tris-Borato 50 mM (pH 8,3), EDTA 1 mM e ureia 8,3M. As bandas para as espiras de comprimento adequados (173-186 bases) foram identificadas por auto-radiografia e isoladas em conjunto por electroeluição a partir de uma fatia de gel simples como descrito acima para as sequências individuais de oligonucleótidos. As partes de ADN foram recozidas por meio de um primeiro aquecimento de uma solução aquo sa (50 jil) a 1009C durante 2 minutos, e deixando em seguida arrefecer para 40SC durante 4 horas.

Os grupos I, II, III foram ligados em conjunto essencialmente como descrito para a preparação do grupo para se obter o produto, e a sequência de genes que se mostra na Figura 2. Após precipitação, o gene foi fosforilado com T4 polinucleó tido quinase da forma acima descrita para os oligonucleótidos individuais, e em seguida dissolvido em água (20 pl). TABELA 1

DUPLEX OLIGONUCLEOTIDO NUMERO DE BASES EM

HELICE DE TOPO FUNDO A SEQ.ID.N9.1 + SEQ.ID.N9.2 62 64 B SEQ.ID.N9.3 + SEQ.ID.N9.4 60 60 C SEQ.ID.N9.5 + SEQ.ID.N9.6 48 51 D SEQ.ID.N9.7 + SEQ.ID.N9.8 63 60 E SEQ.ID.N9.9 + SEQ.ID.N9.10 63 63 F SEQ.ID.N9.11 + SEQ.ID.N9.12 60 63 G SEQ.ID.N9.13 + SEQ.ID.N9.14 63 60 62

H SEQ.ID.NS.15 + SEQ.ID.Ns.16 60 60 I SEQ.ID.Na.17 + SEQ.ID.N5.18 55 53 I A+B+C 170 175 II D+E+F 186 186 III G+H+I 178 173 b) Clonacão do gene sintético para G-CSF humano 0 gene sintético acima descrito foi clonado no vector plasmídio, pSTPl (Windass e col., Nucleic Acids Research (1983) Vol.10, pág.6639.

Para a preparação do vector, foram dissolvidos 10 pg de STP1 em água (37,5 ;ul) e em tampão de restrição ΙΟχΗ (4,5 ^1) (BCL). Foi adicionada a endonuclease de restrição Sall (3 jil) (BCL, 8 unidades/ jil) e a mistura foi incubada a 37BC durante 1 hora até o plasmidio linearisado ser predominante em rela cção às formas circulares super enroladas e emaranhadas. O ADN foi precipitado com etanol a 4SC durante 30 minutos, lavado com etanol:água (7:3) e em seguida dissolvido em água (39,5 ^il), tampão ΙΟχΗ (4,5 pl) (BCL). Foi adicionada a endonuclease de restrição EcoRI (1 jil) (BCL, 90 unidades/ jul) e a mistura foi incubada a 37SC durante 1 hora até ser predominante o grande fragmento EcoRI-SalI. 0 ADN foi precipitado a 20SC durante 20 horas, lavado com etanol:água (7:3) e em seguida dissolvido em água (20 jil). 0 fragmento grande de EcoRI-SalI foi purificado num gel de agarose preparativo a 1% e submetido a electroe-luição e precipitado da forma anteriormente descrita, e em seguida dissolvido em água (20 pl). Para a ligação do gene sintético, foi incubada a 16SC durante 4 horas uma mistura do vector de ADN (20 jul da solução do fragmento de EcoRI-SalI), gene sintético (5 63 ^•WSftiaaiIlHMBIl .;tíH(i** ;<J»« .<?*·

Hf pl de uma solução aquosa anteriormente descrita) tampão de 5% de ligase (6 μΐ Tris -250 mM pH 7,6, MgCÍ2 50 mM, 25% p/v de PEG8000 ATP 5 mM, DTT 5 mM, exBRL), água (15 jil) e T4 ADN ligase (2 ;il, 1U/ pl). A mistura de ADN foi utilizada directamente (ou 1 μΐ de mistura de ligação bruta ou 2 jil de mistura de ligação diluída a 3% com água) para transformar E. coli estirpe HB101. A mistura de ADN foi adicionada às células competentes de E. coli HB101 (20 pl de BRL) em gelo e a mistura foi incubada em gelo durante 45 minutos e em seguida aquecida rápidamente a 429C durante 45 segun dos. Passados 2 minutos em gelo, foram adicionados 100 jil de tampão SOC (Bactotriptona 2%; extracto de levedura a 0,5%; NaCl 10 mM; KC1 2,5 mM; MgCl2, MgS04 20 mM (10 mM cada); glicose 20 mM e a mistura foi incubada a 379C durante 1 hora. Foram colocadas em placas aliquotas de suspensões com 50 pl/ml de ampicilina. Os transformantes foram escrutinados para determinar a presença do gene sintético clonado por análise de hibridização de colónias utilizando processos convencionais descritos em "Molecular Clo-ning: A Laboratory Manual" por Maniatis e col. (Cold Spring Har-bor) e no Pedido de Patente N9 8502605. Foram riscadas um total de 100 colónias em filtros (Schleicher e Schuell), cultivaram-se a 372C durante 20 horas, submeteram-se a lisagem e depois a recozimento. 0 filtro foi hibridizado a 65SC durante 20 horas com uma sonda radioactiva preparada a partir da sequência de oligonu-cleótidos SEQ.ID.N2.1 utilizando um dispositivo de sonda aleatória (Pharmacia). Foram cultivadas 5 colónias 1-5 dando um sinal de hibridização positivo em caldo L a 372C durante 20 horas a uma pequena escala (100 ml) e o ADN do plasmídio foi preparado por centrifugação num gradiente de cloreto de césio essencialmente da forma descrita em "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" por Maniatis e col. (Cold Spring Harbor). 0 ADN foi sequenciado pelo processo convencio nal de terminação da cadeia de didesoxi da forma descrita por San ger e col. em Pro. Nat. Acad.Sci. USA 74, 5463-5467 (1977) utilizando um dispositivo de Sequenase (MC) (United States Biochemical . Corporation). Os oligonucleótidos SEQ.ID.NS.19 e SEQ.ID.NS.23 * (tal como a seguir definidos e ver Tabela 2) foram utilizados 64 , _ JV,, ψ '»» .' ”'. '.'Ty.

como primários de sequenciaçao. TABELA 2

CODIGO SEQ.ID.N2.19 SEQ.ID.N2.20 SEQ.ID.N2.21 SEQ.ID.N2.22 SEQ.ID.N2.23

LOCAL DE PRIMAGEM 214-234 Hélice de topo 333-353 Hélice de topo 375-395 Hélice de fundo 207-227 Hélice de fundo 69-93 Hélice de fundo O ADN de plasmídio do clone 5 continha a sequência de ADN representada na Figura 2. O plasmídio (pAG88) foi utilizado para transformar células competentes das seguintes estirpes E. coli por procedimentos convencionais. HB101 CGSC 6300 (em seguida também referido como MSD 522)

As estirpes de E. coli HB101 e MSD522 (CGSC 6300) estão comercialmente disponíveis. Assim, por exemplo, elas podem ser obtidas de E.coli Genetic Centre, Yale University, USA. Além disso a E.coli HB101 pode também ser obtida por exemplo de BRL fornecido por GIBCO Limited Unit 4, Cowley Mill Trading Esta-te, Longbridge Way, Uxbridge, UB8 2YG, Middlesex, Inglaterra ou GIBCO Laboratories, Life Technologies Inc., 3175 Staley Road, Grand Island, NY14072, USA. O genetipo da estirpe HB101 é descrito na acima mencionada referência " Molecular Cloning : A Laboratory Manual" como Sup E44 hsd S20 (rB“ mB“) rec A 13 ara-14 F“leu 6 thi-1 proA2 lac Y1 gal K2 rps L20 xyl“5 mtl~l. 0 genó-tipo do MSD 522 (CGSC 6300) é apresentado no Exemplo 13. 65

c

Clonação do gene para G-CSF humano num vector de expressão

Foi clonado o gene acima descrito no plasmí-dio pICI 0020 como descrito no Exemplo 1 (c) para se obter o plasmídio de expressão pICI 1056. d) Fermentação

Foi transformado o plasmídio pICI 1056 e a fermentação foi efectuada como descrito no Exemplo 1 (e) para se obter a expressão de G-CSF humano. e) Purificação

Foi efectuada a purificação da forma descrita no segundo procedimento de purificação desenvolvido para se obterem maiores quantidades de G-CSF humano referido nas páginas 48 e 49 da Publicação do Pedido de Patente PCT Ns. WO 87/01132 sendo efectuada a diãlise final contra solução salina tamponada com fosfato.

Exemplo de Referência 2

Preparação de genes para derivados de G-CSF humano por mutagénese dirigida a locais

Foi seguido o processo do fosforotioato de Eckstein e colaboradores:

Taylor, J W e col.Nucleic Acids Research (1985) Vol pp 8749-8764

Taylor, J W e col.Nucleic Acids Research (1985) Vol pp 8765-8785

Nakamaye, K e col.Nucleic Acids Research (1986) Vol pp 9679-9698 * Sayers, J R e col.Nucleic Acids Research (1988) Vol pp 791-802 66

0 procedimento pode ser efectuado utilizando um dispositivo fornecido por Amersham International. 0 método é a seguir descrito e incorpora alterações ao método original em relação à utilização de mais do que um oligonucleótido mutagénico e a temperatura de incubação para os oligonucleótidos superiores a 30 bases de comprimento. 1. Tratamento do oligonucleótido mutante para molde de ADN de hélice única.

Molde de ADN de hélice única (1 pl/ pl) 5 μΐ Oligonucleótido mutagénico fosforilado (1,6pmol/l μΐ) 2.5 μΐ Tampão 1 3,5 μΐ Agua 6 μΐ (Quando se utilizam simultaneamente dois oligonucleótidos mutagé-nicos, foram adicionados 2,5 μΐ (l,6pmol/ pl) de cada oligonucleó tido fosforilado a 5 μΐ de molde de ADN de hélice única (1 μg/μl) em 3,5 μΐ de Tampão 1 e 3,5 jil de água. Quando se utilizaram três oligonucleótidos mutagénicos foram adicionados 2,5μ1 (1,6ρηιο1/μ1) de cada oligonucleótido fosforilado a 5 μΐ de ADN de hélice única (1 μg/μl em 3,5 pl de Tampão 1 e 1 μΐ de água). Os ingredientes acima referidos foram colocados num tubo tapado em água a 70SC durante 3 minutos se o oligonucleótido tiver menos de 30 bases de comprimento ou num banho de água ebuliente durante 3 minutos se o oligonucleótido tiver mais de 30 bases de comprimento. O tubo foi em seguida colocado num banho de água a 37SC durante 30 minutos. 2. Sintese e ligação da hélice de ADN mutante:

Foram adicionados à mistura reaccional de tratamento

Solução de MgCl2 5 pl Mistura de nucleótidos 1 19 pl (contendo dCTP alfa S)

Agua 6 μΐ Fragmento de Klenow (6 unidades) 1.5 pl T4 ADN ligase (õunidades) 2 pl 67

Os ingredientes acima referidos foram colocados num banho de água a 161 2C e deixados em repouso durante a noite. 3. Remoção do ADN de hélice única (não mutante) utilizando unidades de filtração centrífuga descartáveis. A mistura reaccional obtida na fase 2 foram adicionados os seguintes ingredientes:

Agua 170 pl

NaCl 30 pl A amostra de 250 pl foi adicionada à metade superior da unidade de filtração e centrifugada a 1500 rpm durante 10 minutos à temperatura ambiente numa centrifugadora SORVAL RT6000B utilizando um rótor de agitação SORVAL H1000B. A amostra passa através de duas membranas de nitrocelulose que ligam o ADN de hélice única que deixa o ADN de hélice dupla passar para o tubo de recolha colocado por baixo.

Foram adicionados 100 pl de NaCl 500 mM e foi agitado de novo durante 10 minutos para retirar por lavagem qualquer ADN RF restante.

Foram adicionados ao filtrado os seguintes ingredientes:

Acetato de sódio (pH 6,0) 28 pl

Etanol frio {—20sC) 700 pl A mistura foi colocada em gelo seco e banho de etanol durante 20 minutos e centrifugada numa microcentrifuga-dora de Ependorf durante 15 minutos. 0 agregado obtido foi ressus penso em 10 ul de Tampão 2. 68 1

Enrolamento da hélice não mutante utilizando Nci I 2

Foram adicionados 65 pl de Tampão 3 e 8 uni-dades de Nci I (1 pl)

foi colocada num à mistura reaccional obtida na fase 3. A mistura banho de água a 372C durante 90 minutos. 5. Digestão da hélice não mutante utilizando exonuclease III A mistura reaccional obtida na fase 4 foram adicionados:

NaCl 500 mM 12 μΐ Tampão 4 10 pl Exonuclease III (50 unidades) 2 μΐ A mistura foi colocada num banho de água a 37SC e incubada durante 30 minutos a 37SC, 50 unidades de exonuclease III efectuaram a digestão de aproximadamente 3 000 bases em 30 minutos. A mistura foi em seguida colocada num banho de água a 70SC durante 15 minutos para desactivar as enzimas. 6. Repolimerização e ligação de ADN tratado A mistura reaccional obtida na fase 5 foram adicionados:

Mistura de nucleótidos 2 13 pl Solução de MgCl2 5 pl ADN polimerase I (4 unidades) 1 pl T4 ADN ligase (2,5 unidades) 1 pl

A mistura foi colocada num banho a 16SC durante 3 horas.

7. Transformação das células hospedeiro competentes de E. coli TG1 ADN

Foram transformados 300 pl de células competentes de E. coli TG1 (preparadas segundo o processo de Mandei e Higa) com 20 pl da mistura reaccional obtida na fase 6 (em duplicado) . . Os transformantes foram placados num tapete • de células TG1 em fase logarítmica em ágar de topo TY em placas 69

TY e incubados durante a noite a 379C. A E. coli estirpe TG1 está livremente disponível de por exemplo E. coli Genetic Centre, Yale University, USA e de Âmersham International plc, Amersham Place, Little Chalfont, Amersham, Buckinghamshire HP7 9NA, Inglaterra, como fornecido no seu sistema de mutagénese "in vitro", dispositivo dirigido a oligonucleótidos (código de produto RPN 1523).

Exemplo de Referência 3 Bioensaio de G-CSF

Foi clonada uma linha de células dependente de factores, Paterson-G-CSF (FDCP-G), obtida de Paterson Institu-te, Manchester, Inglaterra, por diluição limite na presença de G-CSF. Foi utilizado um clone de resposta de G-CSF, designado como clone E7, para determinar a actividade de G-CSF recombinante humano.

Foram adicionadas 2,5x10·* células E7 do clone FDCP-G em 100 pl de RPMI 1640+10% de FCS a um volume igual de RPMI 1640+10% de FCS contendo G-CSF. Cada amostra de G-CSF foi medida em 10 diluições duplas. 0 volume final de RPMI 1640 (ver Moore GE e col. (1967) JAMA, 199, 519) +10% FCS (soro de vitela fetal) em cada furo de uma placa de microtitulação de 96 furos era de 200 μΐ. A placa de microtitulação foi incubada a 372C em 5% de C02 num incubador humidificado durante 4 dias. Foi adicionado 1,0 jiCi de timidina tritiada por furo e incubou-se durante as últimas 6 horas. As células foram recolhidas em papeis de filtro de fibra de vidro e foi determinado o nível de radioacti-vidade por contagem de cintilação liquida. Verificou-se que o nível de incorporação de timidina tritiada era directamente proporcional à quantidade de G-CSF presente. 0 ensaio de E7 do clone • FDCP-G foi calibrado utilizando G-CSF humano recombinante obtido 70

de Amersham International com uma actividade específica declarada de 108 unidades/mg de proteína.

As potências das amostras de G-CSF foram determinadas por comparação com um padrão de actividade conhecida.

Foram calculadas as unidades de actividade de G-CSF por ml de acordo com a sguinte fórmula:

Diluição de G-CSF padrão dando um aumento máximo de 50% de 3H-Timidina na incorporação

Diluição de amostra padrão dando um • _ aumento máximo de 50% • , de ^H-Timidina na incorporação

X

Unidades por ml activida de em G-CSF padrão

Exemplo de Referência 4

Estabilidade em solução de G-CSF e dos seus derivados

Foram ensaiadas para a determinação da estabi lidade em solução diluições adequadas da solução de armazém de G-CSF e derivados em solução de fosfato tamponada (PBS) a 4SC descrita no Exemplo 9. Foram incubadas soluções de 1 mg/ml, 5 mg/ml e por vezes 10 mg/ml de proteína em PBS a 375C durante 14 dias. Foram inspecionadas visualmente as soluções a intervalos regulares para determinar os sinais de precipitação. Após 14 dias cada solução foi centrifugada a 14000 rpm durante 20 minutos, o sobrenadante foi removido por decantação e a pastilha re-dissolvi da em PBS contendo 1% p/v de N-lauroil sarcosina. 0 teor total de proteína em cada sobrenadante e precipitado re-dissolvido foi estimado por medidas de A28O e estimado o teor de monómeros em cada uma delas por HPLC de fase inversa. Estes foram expressos como percentagem dos dados correspondentes dados por soluções no • início da incubação e por uma solução de 1 mg/ml incubada a 48C 71

• -i A

,**>' durante 14 dias. Foram observadas variações entre as estimativas de proteína total e o monómero apenas em algumas das pastilhas re-dissolvidas. É resumida na Tabela seguinte a percentagem de proteína restante em solução nos sobrenadantes de cada concentração de partida. A actividade específica do produto em cada sobrenadante após incubação revelou ser a mesma da solução inicial, e não foram observadas diferenças em ensaios de PAGE-SDS em condições redutoras e não redutoras.

Foram obtidos os seguintes resultados:

Derivados de G-CSF Esp.Act. Estabilidade em solução (U/mgxlO9) lmg/ml 5mg/ml lOmg/ml

[Met-1]hu G-CSF [Met-1, Ser17]hu G-CSF [Met-1, Ser17'27]hu G-CSF [Met-1,Arg11, Ser17,27'66'66] hu G-CSF

[Met-·*·, Ser17'27, Glu111, Ser115'116]hu G-CSF [Met-·*-, Ser-*-7'27, Arg11'166, Lys58]hu G-CSF [Met”1, Glu16, Ser·*·7»27,

Ala26/28f Lys30]hu G_CSF

[Met-·*·, Ser·*·7'27, Lys'*’9'68,

Aia44,51,55]hu G-CSF

[Met-·*·, Arg11, Glu16, Ser*·7'27' 60'65, Ala26'28, Lys30]hu G-CSF [Met""*·, Glu16, Ser*·7,27, Ala26'28, Arg30]hu G-CSF [Met-*·, Arg*·*· ,231 Ser*·7 ,27,60,65]

. hu G-CSF 0,4 23 nd nd 1,0 80 20 nd 1,5 80 40 nd 1,2 98 94 92 2,7 100 72 50 1,2 92 77 47 1,0 100 100 94 1,0 84 69 44 2,6 100 103 93 0,85 100 100 100 2,5 100 98 88 72 [Met-1,Arg11'34,Ser17,27,60,65 j hu G-CSF 1,4 105 92 80 [Met-1,Arg11'49,Ser17'27'88'68] hu G-CSF 1,3 108 100 87 [Met -1,Ala ^Thr 3,Tyr 4,Arg 5,11 Ser17,27,60,65]hu G-CSF 1,5 106 100 89 [Met-1,Arg11,Glu1^,111,Ser17,27, 60,65,115,116 ^1^26,28 ^Lys30 j hu G-CSF 0,5 100 100 100 [Met-1,Arg11·165,Glu15,Ser17 >27' 60'65,Ala26'28,Lys30'58]huG-CSF 0,65 100 100 100 [Met-1,Arg11,Glu18,Ser17,27,60, 65,Ala26'28'44'51'55,Lys30,49, 58]hu G-CSF 0,20 100 100 95 [Met-1,Arg11> 188,G1u18·111, Ser17,27,60,65,115,116fAla28, 28,44,51,55 ^Lya30,49,58 jhuG-CSF 0.05 100 100 100 [Met-1,Arg11,Ser17»27]hu G-CSF 0,73 97 35 12 [Met-1,Ser17'27'60'65]hu G-CSF 0,71 100 94 86 [Met-1,Arg11,Ser17,27'88] hu G-CSF 0,81 99 65 32 [Met-1,Arg11,Ser17'27'65] hu G-CSF 0,80 100 96 89 [Met-1,Ser17'27'60]hu G-CSF 0,80 95 68 36 [Met-1,Ser17'27'65]hu G-CSF 0,83 100 94 90 * percentagem deixada em solução em PBS após 14 dias a 379C (estabelecido por UV; por HPLC disponível) nd significa não realizado [Met-1, Ser17]hu G-CSF pode ser obtido como descrito no Exemplo de Referência 5. • Os resultados acima representados demonstram que as modificações , da presente invenção aumentam a estabilidade em solução sem perda 73

da actividade de G-CSF [Met Ser^1 2]hu G-CSF numa concentração de 5mg/ml começando a precipitação num periodo de 3 horas.

Exemplo de Referencia 5 Preparação de [Ser^2]hu G-CSF

Foi repetido o procedimento descrito no Exemplo 2 para a preparação de [Met~^, Ser^2'27]hu G-CSF com a excep-ção do seguinte: 1) 0 duplex para a fosforilação foi preparado a partir das sequên cias de oligonucleótidos SEQ.ID.Nss.24, 25, 3 e 4, as SEQ.ID.N8. 3 e 4 substituindo respectivamente as SEQ.ID.N9.26 e 27 utilizadas nos Exemplos 1 e 2. 2) 0 duplex referido em (1) foi submetido a fosforilação com T4 polinucleótido quinase, mas foi digerido com SnaBI (10 unidades) em tampão lxM (BCL; 30 jil) durante 2 horas a 379C. 3) Após purificação com etanol, o fragmento de 72 pb EcoRI-SnaBI foi purificado em oposição ao fragmento de 143 pb EcoRI-MstII. 4) O fragmento sintético EcoRI-SnaBI foi clonado no vector plas-mídio pAG88 conforme descrito no Exemplo de Referência 1 e para a preparação do vector foi digerido pAG88 com SnaBI (20 unidades; BCL) em tampão lxM (BCL; 100 jjI) durante 2 horas a 372C em vez de MstII em tampão lxH. 5) Após precipitação com etanol, foi purificado o fragmento grande de EcoRI-SnaBI num gel de 1% de agarose em oposição ao fragmen to grande de EcoRI-MstII. 74 1 0 plasmidio contendo o gene para [Ser17]hu G-CSF foi designado 2 por pICI1105.

Exemplo de Referência 6 Construção de pICI 0080 a) Construção de pTB357 (também anui referido como pLB 004 0 plasmídio pTB357 utiliza um determinante reprimido da resistência à tetraciclina, como se observa no plasmídio de ocorrência natural RP4. Este sistema reprimido fecha a expressão do gene tetA na ausência de tetraciclina enquanto que a maior parte dos mecanismos resistentes a medicamentos têm uma expressão constituitiva. 0 local tet foi em primeiro lugar mapeado em RP4 por Barth e Grinter (J. Mol.Biol.113:455-474,1977). Isto revelou consistir em genes adjacentes: tetA. o gene da resistência estrutural e tetR. o gene repressor e esta região foi sequenciada (Klock e col., J,Bacteriol:161: 326-332, 1985). Estes genes estão localizados em fragmentos adjacentes BglII-Smal e Smal-Smal. O local BglII é único em RP4 mas existem 5 locais activos de Smal (Lanka, Lurz e Furste, Plasmídio 10: 303-307, 1983).

i) Clonacão dos genes tetA + tetR 0 plasmídio RP4 é bem documentado (Datta e col. J. Bacteriol 108: 1244, 1971) e está comercialmente disponível. Além disso o plasmídio RP4 foi depositado no "National Col-Lection of Type Cultures", 61 Colindale Avenue, Londres, NW9 4HT com os números de acesso 50078 e 50437. As estirpes de E. coli contendo este plasmídio foram cultivadas em caldos de cultura se-Lectivos e o ADN do plasmídio foi isolado à escala pelo método le Holmes e Quigley (Holmes e Quigley, Anal. Biochem 114: 193-^ L97, 1981). Ele foi desproteínizado por tratamento com acetato • Je amónio 2,5 M e reprecipitado com isopropanol. Este ADN de pias 75 mídio foi tratado, de acordo com as condições recomendadas pelo fornecedor, com a enzima de restrição BglII e cortado até finalização. Ele foi em seguida parcialmente cortado por Xmal utilizando a enzima de diluição e pequenos tempos de incubação. 0 Xmal mas que produz um 4-nucleótido com extremidades coesivas nos seus locais de corte. 0 vector plasmídio pUC8 (Yanisch-Perron, Viei ra e Messing, Gene 33: 103-119, 1985) foi preparado de forma seme lhante e cortado com BamHI e Xmal até finalização. Os fragmentos de RP4 foram clonados neste vector por ligação com T4 ligase a 12SC durante 16 horas. Isto foi utilizado para transformar a E. coli C600 que se tornou competente pelo método do cloreto de cálcio (Maniatis e col., Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). As culturas foram em seguida placadas num meio que seleccionava para a resistência à tetraciclina. A E. coli C600 está comercialmente disponível de várias fontes incluindo muitas colecções de cultura tais como a "E. coli Genetic Stock Centre", Yale University, USA com o nume ro de acesso N9. GCSC 3004. 0 genotipo de E. coli C600 é K12 thr-1 leuB6 thi-1 hsdSl lacYl tonA21 X“supE44.

Foram ensaiadas várias colónias com esta resistência para o fenotipo esperado (resistência à ampicilina e tetraciclina mas não a resistência à canamicina indicadora do próprio RP4). As colónias com as resistências correctas foram sub metidas a análises de clones por isolamento do ADN do plasmídio (método de Holmes e Quigley). Estas preparações foram cortadas com EcoRI e HindiII e analisadas por electroforese em gel. Este ensaio estabeleceu a dimensão da inserção clonada que se verificou ser de 2,45 hb prevista para o fragmento de BqlII-Xmal-Xmal de RP4. Foi designado por pTB344 um clone contendo este fragmento e contendo os genes tetA e tetR. 76

,,χ ii) Remoção do gene tet de PAT153

Foi necessário remover o gene tet do plasmí- dio vector pAT153 antes de ser inserido no bloco de tetA + tetR de RP4 para evitar a duplicação de genes que podem ser uma fonte de estabilidade genética. Também o gene tet não pode ser eficazmente suprimido pelo não reconhecedor tetR. A remoção foi feita isolando o ADN do plasmídio pAT153 e cortando-o com EcoRI e Aval. Entre estes locais, foram clonados os oligonucleótidos sintéticos com a sequência SEQ.ID.N2.59: 5' AATTCGCATGCGGATCCATCGATC3' 3'GCGTACGCCTAGGTAGCTAGAGCC5'

Isto é coerente com as extemidades coesivas

EcoRI e Aval e contém os locais Sphl. BamHI e Ciai em adição. Após transformação e selecção, as colónias foram ensaiadas para determinação da perda do determinante da resistência à tetracicli na. 0 ADN de plasmídio de um clone foi sequenciado para confirmar que a sequência prevista estava correcta. Este plasmídio foi desi gnado por pCH19.

iii) Inserção dos genes tetA + tetR

Os genes tetA e tetR foram isolados de pTB344 num fragmento EcoRI a PstI. 0 vector pUC8 foi destruído cortando com SspI dado que ele contem o mesmo determinante de selecção (resistência à ampicilina) de pCH19. 0 ADN de plasmídio pCH19 foi cortado com EcoRI e PstI e em seguida foi ligado com o fragmento de 2,45 hb contendo o gene tet. Este foi utilizado para transformar E. coli C600, sendo a cultura placada por selecção para as colónias resistentes à tetraciclina. A inserção dos genes tet foi feita para substituir a maior parte dos genes bla em pCH19 que 77

devia assim perder o seu determinante da resistência à ampicili-na. A perda da resistência à ampicilina dos transformantes foi confirmada. Alguns clones foram em seguida utilizados para isolar o ADN de plasmídio que foi submetido a análise de restrição. Esta confirmou que o plasmídio construído tinha a estrutura pretendida. Ele foi designado por pTB151. iv) Inserção da sequência cer 0 plasmídio ColEl de ocorrência natural é muito estávelmente mantido em E. coli, enquanto que os seus derivados pBR322 e pAT153 o não são. Summers e Sherrat (Cell, 36: 1097-1103, 1984) demonstraram que isto era devido ao facto de os derivados não conterem uma pequena sequência (283 pb) designada por cer que está presente no plasmídio mãe. Esta sequência contem um sistema de resolução de multimeros de plasmídio específicos de locais que evita a acumulação de multimeros de plasmídios formados por recombinação homóloga. Esses multimeros têm um efeito de eliminação no processo de partição que normalmente assegura a herança estável dos plasmídios filhos durante a divisão celular das bactérias. A sequência cer (Summers, D e col. MGG, 201, págs.334-338, 1985) foi isolada do plasmídio pKS492 (fornecido por D. Sherrat) como um fragmento de 289 pb por corte com BamHI e Taql. O plasmídio pTB351 foi isolado como ADN de uma estirpe dam de E. coli para evitar que o seu local Ciai fosse bloqueado pelo sistema dam + metilação. Este ADN foi cortado com BamHI e Ciai (ambos os locais foram introduzidos no oligonucleótido sintético para esta clonação). 0 fragmento cer foi ligado com o vector de corte e em seguida utilizado para transformar E. coli C600, sendo a selecção feita para a resistência à tetraciclina. As colónias transformantes foram submetidas à análise de clones por electroforese de restrição em Aval e em gel. A presença de • uma banda extra de ADN com cerca de 300 pb indica a aquisição do 78 fragmento cer. Foram utilizadas análises de restrição adicionais para confirmar que os plasmidios resultantes tinham a estrutura correcta. Um destes foi designado por pTB357 (Figura 5) e foi designado por pLB004. b) Plasmídio pCHIOl 0 plasmídio pCHIOl corresponde a pICI 0020 (ver Exemplo 1 (c)) com a excepção de o fragmento EcoRI-SalI (ver Figura 1) ser substituído por um fragmento consistindo na SEQ.ID. N2.53 (ver também Figura 6) e a sequência de genes de interferão <V2 conforme descrito por Edge M.D. e col., Nucleic Acide Research 1983, Vol. 1, págs. 6419-6435. A este respeito o codão ATG do ter minai 3' da SEQ.ID.NS.53 precede imediatamente o codão TGT que codifica para a cisteína (aminoãcido 1) na sequência de interferão 2 da referência acima mencionada de Edge M. D. e col., Nucleic Acida Research. A sequência de nucleótidos 5' GATCCATG e a sequência de nucleótidos 3' complementar GTAC são assim omiti das da sequência de nucleótidos da referência acima mencionada. c) Inserção de um bloco de Expressão em pTB357

Um bloco de expressão consistindo num promotor trp, um local de ligação de ribossomas e do gene interferão 2 foi isolado do plasmídio pCHIOl (ver (b) acima) num fragmento de restrição EcoRI e Sphl. Este foi ligado ao vector de produção (pTB357) (ver (a) acima) cortado de forma semelhante com EcoRI e Sphl. Este ADN foi utilizado para transformar uma cultura competente de E. coli C600 e foram isoladas colónias resistentes ã tetraciclina. Algumas destas foram ensaiadas para a análise de clones de ADN para aquisição do local de restrição SstI existente no bloco de expressão. Os clones positivos a este respeito foram ainda ensaiados por mapeamento de restrição para confirmar que • a construção esperada estava correcta. Eles foram também ensaia- 79

dos para confirmar a capacidade conferida para produzir a proteína do interferão <* 2 analisada num gel de poliacrilamida-SDS revelado com o azul de Coomassie. Um desses clones confirmados foi designado por pLB005. d) Inserção do terminador de transcrição T4 em PTB244

Foi inserida a sequência do terminador de transcrição T4 na forma de fragmento Sall a HindIII (com 67 pares de bases de comprimento) (ver SEQ.ID.N2.51 e Figura 4a) no local de multiclonação de um vector intermediário pTB244 (descrito na Publicação de Patente Europeia Ns237,269) entre os locais Sall e HindIII. A análise de clones foi utilizada para confirmar a estrutura desta construção (pTB244. T4 ter). A partir deste vector, foi em seguida isolado um fragmento de SstI a Sphl contendo a maior parte do local de multiclonação e o terminador T4. Este foi inserido em pLB005 cortado de forma semelhante com SstI a Sphl substituindo assim o gene do interferão 2 mas deixando um bloco consistindo no promotor trp. local de multiclonação e no terminador T4. Esta construção foi confirmada por análise de clones e o plasmídio foi designado por pLB013. e) Substituição do local de multiclonação 0 local de multiclonação em pLB013 não é ideal para este vector em muitos aspectos: os locais Sall. BamHI e Smal não são únicos mas existem noutra parte no plasmídio. Este fragmento foi portanto retirado por corte com SstI e Xbal (ambos únicos) e os oligonucleótidos sintéticos com a sequência SEQ.ID. Ns.54:

5' AGCTCCATATGGTACCAGATCTCTCGAGAGTACTT GGTATACCATGGTCTAGAGAGCTCTCATGAAGATC 5' 80

foram inseridos no seu lugar. Os clones foram analisados para a aquisição dos novos locais de restrição e em seguida confirmados por sequenciação. Um desses plasmídios foi designado por pLB014. Os novos locais de clonação inseridos desta maneira são: Ndel. Kpnl, BalII, Xhol e Seal com os anteriores Xbal e Sall a segui-los. f) Outras modificações

Foi descoberto que os locais SstI e Ndel em pLB014 não podiam ser cortados por qualquer destes enzimas de res trição quer simultaneamente quer sequencialmente, presumivelmente devido à sua grande proximidade. Foi assim inserida uma sequência adicional entre eles. Isto foi realizado cortando pLB014 com SstI e Kpnl e em seguida inserindo o oligonucleótido sintético de SEQ. ID,NS.55. 5' AGCTCAGCTGCAGCATATGGTAC GTCGACGTCGTATAC 5'

Os clones foram analisados para a aquisiifaD de um local extra PvuII ou PstI e em seguida confirmados por sequenciação. Um desses plasmídios foi designado por pLB015 (=pICI0080) (ver Figura 7). Este plasmídio, ao contrário do pLB014, é cortado eficazmente por SstI e Ndel. Isto proporciona um lugar para inserir várias sequências de pontos de ligação de ribossomas correctamente posicionados em relação ao promotor trp a montante e com Ndel construído para proporcionar o codão de par tida de ATG do gene a ser expresso.

Exemplo de Referência 7

Construção do plasmídio pICI1295 (também referido como pCG300) 81 / a) Produção de PCG54 a partir de PICI1079 0 pICI1079 é um plasmídio resistente à ampici lina derivado de pAT153 contendo os seguintes elementos entre os locais de restrição EcoRI e Styll: (i) um CI857 do fago \ ; (ii) um promotor X ?l; (iii) um sitio de ligação de ribossoma sintético (iv) uma sequência de gene de interf erãoo/2 sintético (v) uma sequência de terminação de transcrição sin tética a partir do fago T4, entre os locais de restrição Sall e Styll. A sequência de ADN deste terminador de transcrição é representada na Figura 4 e SEQ.ID.N2.56. 0 pICI1079 é ilustrado na Figura 8. 0 pICI1079 foi depositado segundo o Tratado de Budapeste, no National Collections of Industrial and Marine Bactéria Limited (NCIMB), 23 St. Machar Drive, Aberdeen, AB2 1RY, Scotland, UK. (NCIMB Ns 40370) com a data de depósito de 19 de Fevereiro de 1991. 0 pCG54 foi construído de forma a tornar disponível um vector de expressão contendo o mesmo promotor, local de ligação de ribossomas e sequências terminadoras de transcrição como acima referido, isto é λ Pl, RBS7 e T4, mas em que falta a sequência de genes que codifica a produção de uma proteína especí fica. Essa construção proporcionaria a capacidade de existir um vector de expressão básico contendo elementos essenciais que permitem a transcrição e a translação para a produção de qualquer proteína de interesse que podia ser introduzida neste vector por fenómenos de clonação posteriores. 82

A construção do vector foi iniciada por clivagem da endonuclease de restrição de pICI1079 nos locais respec-tivos EcoRI e Sall. Esta fase de clivagem libertou um fragmento do vector contendo a estrutura de pICI1079 completa com genes para a replicação do plasmídio e funções de resistência antibióti ca, mais a sequência do terminador de transcrição T4. 0 fragmento foi isolado por fases de purificação em gel de agarose utilizando Geneclean para a purificação final do fragmento de ADN. A este fragmento de vector foi introduzido um segundo fragmento de ADN mais pequeno com aproximadamente 1,2 pb de tamanho. Este segundo fragmento pode ser obtido, por exemplo por sintese de ADN ou por mutagénese dirigida a locais ou PCR do pequeno fragmento de restrição de EcoRI-SalI obtido de pICI 1079 como acima descrito. Este segundo fragmento continha exacta-mente o promotor equivalente e as sequências de local de ligação de ribossoma como originalmente presentes em pICI1079 e tinha adi cionalmente disponível os locais EcoRI e Sall nos seus terminais 5' e 3' respectivamente, proporcionando assim terminais compatíveis para a ligação ao fragmento pICI1079. Uma reacção de ligação na presença da enzima Gibco-BRL T4 ADN ligase e o seu tampão res-pectivo, resultavam na formação da construção pCG54.

Os clones contendo esta construção foram originalmente isolados após transformação de uma alíquota da mistura de reacção de ligação nas células competentes de E, coli da estir pe HB101. A construção pCG54 recuperada tinha o tamanho de 3682 Kb e continha caracteristicas essenciais como referido no mapa representado na Figura 9. 83 h b)

Produção de pÇG61 de pCG54 (também referido como pICI54)

Foram concebidas sequências de oligonucleóti-dos sintéticos de forma a incluir a sequência natural para o promotor T7A3 e também uma sequência que proporcionava uma região de iniciação de translação eficaz para permitir o correcto proces sarnento de qualquer sequência de genes de polipéptido clonada adjacente a ela. Foi identificada uma sequência candidata adequada para esta última região como RBS1, a sequência de ligação de ribossoma trp. Assim foram sintetizados dois oligonucleótidos complementares identificados como SEQ.ID.NS.57 e SEQ.ID.NS.58 para produzir um ligador de ADN de dupla hélice incorporando as sequências promotoras de T7A3 e RBS1.

Os oligonucleótidos foram preparados como 84 meros pelo procedimento convencional utilizando um sintetizador de genes de ABI. Eles foram concebidos de modo que na forma de dupla hélice os fragmentos sintéticos tinham locais de endonuclea se de restrição EcoRI e Kpnl nas extremidades 5' e 3' respectiva-mente. Devido ao seu comprimento os oligómeros não podiam ser purificados por meio de HPLC e a purificação foi levada a cabo por meio de electroforese em gel de acrilamida utilizando um gel de 10% de acrilamida: ureia 7M.

Antes da purificação, os oligómeros foram em primeiro lugar ensaiados num gel de dimensionamento para assegurar que não apenas eles têm a dimensão correcta mas também as amostras preparadas contêm na sua maior parte os oligómeros neces sários e não uma elevada proporção contaminante de oligonucleótidos secundários mais pequenos que resultam em produtos secundários de síntese.

Os géis de acrilamida foram preparados por • processos convencionais com persulfato de amónio e N, N, Ν', Ν'- 84

tetrametilenodiamina utilizada como catalisador para a polimerização em gel. 0 dimensionamento dos oligonucleótidos necessitava que eles pudessem ser visualisados após electroforese. Foi assim necessário marcar radioactivamente as amostras usando 32P. Isto tornou possivel avaliar a qualidade da amostra após electro forese por meio de autoradiografia.

As amostras de oligonucleótidos foram forneci das numa forma bruta não fosforilada. Foi utilizado este factor para objectivos de radiomarcação nas amostras de forma a que as amostras possam ser marcadas de "quente" nos terminais 5' por fosforilação utilizando a enzima T4 polinucleótido quinase.

Foram obtidos oligómeros de síntese numa forma não fosforilada e assim após purificação cada oligómero foi individualmente submetido a uma reacção de fosforilação em que foi utilizado o ATP para fosforilar a extremidade 5' de cada molécula na presença de T4 polinucleótido quinase (ver "Molecular Cloning - a Laboratory Manual" 2- Edição, Sambrook, Fristch e Maniatis, pãgs. 5.68-5.71). Logo que fosforilados os dois oligonucleótidos complementares foram tratados em conjunto para formarem o duplex de ADN de dupla hélice contendo o promotor T7A3 e a sequência RBS1. . A molécula vector pCG54 foi clivada com as enzimas de restrição EcoRI e Kpnl. Na digestão por restrição foram produzidos um fragmento de vector 2,3 Kb e um fragmento de 1,1 Kb contendo o promotor PL e a sequência RBS1. Esta fase de clonação é concebida de forma a substituir a sequência pl~RBS1 pelo fragmento sintético de EcoRI até Kpnl compreendendo a sequên . cia T7A3-RBS1. 0 vector fragmento de 2,3 Kb resultante da diges-* tão de pCG54 foi purificado pelo procedimento habitual utilizando 85

0** electroforese em gel de agarose e a metodologia de Geneclean para a remoção do ADN doa fragmentos de agarose. 0 fragmento sintético de EcoRI-Kpnl de 84 pb foi ligado numa molécula vector acima preparada e o ADN ligado foi utilizado para transformar as células de E. coli HB101. A escolha dos clones recombnantes positivos foi feita pela resistência à ampicilina. Após transformação foram escolhidas várias colónias contendo plasmídio recombinante para objectivos de escrutínio . 0 fragmento sintético incorporado no vector durante a clonação tinha uma dimensão (84 meros) de forma a tornar a análise de restrição das amostras de ADN de plasmídio recom binante inadequadas como único método de escrutínio. As inserções desse tamanho tão pequeno não são fácilmente aparentes na electro forese de gel de agarose. 0 próprio fragmento não contem local de clivagem de endonuclease de restrição interna que podia diagnosticar a sua presença. 0 escrutínio inicial dos clones recombi-nantes foi assim feito pelo método da hibridização de colónias (ver Grunstein e Hogness, Proc. Natl. Acad. Sid 72, 3961 (1975)). Foram hibridizados filtros de nitrocelulose contendo ADN de plasmídio imobilizado dos clones recombinantes contra uma sonda prepa rada por radiomarcação aleatória do oligonucleótido sintético re-cozido SEQ.ID.NS.57 e SEQ.ID.N9.58. 0 ADN foi marcado utilizando λ32p_dCTP e a incubação com a polimerase de Klenow a 37SC durante 2 horas. As colónias recombinantes que produziam uma reacção positiva de hibridização foram escolhidas para a preparação do ADN do plasmídio. 0 ADN do plasmídio foi preparado em cada caso por um método de escala relativamente grande incorporando uma centrifugação de densidade de gradientes de CsCl para assegurar a pureza ver "Molecular Cloning - A Laboratory Manual" segunda edição, Sambrook, Fritsch e Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory, 1989), págs. 1.42-1.52. A preparação de ADN por esse proces so assegura um material de alta qualidade adequado para a utiliza ção em manipulações de clonação posteriores e análises de sequên- 86

cias posteriores.

Todo o ADN do plasmídio isolado de clones re-combinantes foi incluído num escrutínio secundário por análise de sequências, para assegurar que a sequência de oligonucleótidos nas ligações de clonação do próprio fragmento T7A3-RSB1 estava absolutamente correcto. 0 protocolo de sequenciação utilizado foi o de Sequenase e o primário de sequenciação escolhido para utilização foi por exemplo pBR322 UP (primário universal pBR322). A sequenciação foi efectuada utilizando a técnica de sequenciação de determinação de cadeias de didesoxi de Sanger.

Os clones que possuiam a sequência correcta foram designados como novas construções de expressão pCG61, e continha o promotor T7A3, sequência de RBS1 e a sequência termina dora T4 (ver Figura 10). c) Produção de pCG300 (também referido como pICI1295) a partir de PCG61 A sequência e as fases de sintese envolvidas na construção do análogo de G-CSF [Ser·*·7'27] g-CSF são como descritas no Exemplo 1 (ver Figura 3). Esta sequência análoga a G-CSF foi isolada de uma construção em que o gene tinha sido incorporado no plasmídio pSTPl para se obter pICI1107 (ver Exemplo 2). O pICI1107 foi digerido com Seal e o fragmento grande foi iso lado após electroforese em gel de agarose e purificação de Gene-clean. Este fragmento foi em seguida digerido com endonuclease de restrição Sall para produzir um gene de [Ser17'27] hu G-CSF num fragmento de restrição de Seal a Sall adequado para clonação em pCG61 (ver Figura 10). Após restrição com Sall o fragmento pretendi-do foi isolado utilizando mais uma vez a técnica de purificação em gel de agarose. 87 __^ίί'Η " ...... /! :'™^”. 4LÍ^!r,'',i ^. ',^ immtrrs.rr. •raWrtX·**»”*'

Ha.

s^' A molécula vector pCG61 foi digerida com a enzima de restrição Kpnl. A clivagem com esta enzima cria um suporte superior 3' que foi em seguida terminado utilizando a enzima T4 polimerase ver "Molecular Cloning - A Laboratory Manual" segunda edição, Sambrook, Fritsch e Maniatis (Cold Spring Harbor Labora-tory, 1989), págs.5.44-5.47. A actividade de T4 polimerase foi desactivada pelo calor por incubação a 702 C durante 30 minutos e o ADN foi recuperado por precipitação com etanol.A pastilha foi dissolvida em água destilada esterilizada e o ADN solubiliza-do foi clivado com Sall. 0 fragmento de vector Kpnl (agora com o terminal cego) Sall foi recuperado por meio de precipitação com etanol seguido por técnicas de electroforese em gel de agarose e purificação. 0 fragmento de Seal a Sall [Ser17'27] hu q_ CSF foi em seguida ligado ao vector com terminal cego Kpnl a Sall. 0 ADN ligado foi transformado em E. coli estirpe HB101. A selecção dos clones recombinantes foi feita para a resistência à ampicilina. 0 escrutínio inicial dos clones recombinantes potenciais foi efectuada por meio de hibridização. Foi preparada uma sonda radiomarcada por marcação aleatória de um fragmento EcoRI a Sall (contendo a sequência de genes [Ser1?*27] hu G-CSF preparada a partir do plasmídio pICI1107. Esta foi utilizada em hibridização contra colónias cujo ADN foi imobilizado à superfície dos filtros de nitrocelulose. Posteriormente foi preparado o ADN do plasmídio a partir de 24 clones que tinham sido hibridi-zados neste escrutínio. Todas as preparações de ADN foram feitas pelo método da mini preparação rápida (ver Birnboim e Doly, Nu-cleic Acids Research, 7, 1513, 1979. Estas preparações de ADN recombinante foram submetidas a um escrutínio secundário por meio de análise de restrição. A linearização do ADN com BamHI, que é um local único dentro do bloco de expressão, é indicativo da presença da sequência [Ser17'27] hu G-CSF. 88

Foi efectuada a análise de sequências para confirmar a presença de [Ser17'27] G-CSF e para verificar que a sequência de base das ligações de clonação e ao longo do gene [Ser17'27] hu G-CSF estava correcta. Para este fim foram preparadas amostras de ADN de plasmídio de grande escala a partir de 16 clones recombinantes utilizando a técnica de centrifugação por densidade de gradientes de CsCl para assegurar a pureza. As fases de sequenciaçao foram efectuadas de acordo com o procedimento de sequências e o primário de sequenciaçao escolhido foi o primeiro universal pBR322 (EcoRI). Dois dos clones combinantes continham a sequência correcta no terminal Seal de fragmento de [Ser17'27] hu G-CSF e ao longo da própria sequência de péptidos G-CSF. Os clones foram identificados como construção de expressão pCG300 (ver Figura 12). SEQ.ID.NS.l COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 62 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido

Ns. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear AATTCAGT ACT CCA CTG GCT CCA GCA AGC TCT CTG CCG CAG TCT TTC 47 CTG CTG AAG TGT CTC 62 SEQ.ID.N9.2 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 64 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido N9. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear CTG TTC GAG ACA CTT CAG CAG GAA AGA CTG CGG CAG AGA GCT TGC 45 TGG ACC CAG TGG AGT ACTG 64 89

SEQ.ID.N9.3 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 60 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido

Na. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear 45 60

GAA CAG GTA CGT AAA ATT CAA GGC GAT GGT GCG GCT CTG CAG GAA AAG CTG TGC GCA ACC SEQ.ID.NB.4 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 60 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido

Ns. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear TTT GTA GGT TGC GCA CAG CTT TTC CTG CAG AGC CGC ACC ATC GCC 45 TTG AAT TTT ACG TAC 60 SEQ.ID.N5.5 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 48 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido

Ns. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear TAC AAA CTG TGC CAC CCT GAG GAA CTG GTG CTG CTC GGT CAC TCT 45 CTG 48 SEQ.ID.N5.6 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 51 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido N8. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear CGG GAT CCC CAG AGA GTG ACC GAG CAG CAC CAG TTC CTC AGG GTG 45 GCA CAG 51 90 SEQ.ID.NS.7 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 63 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido

Ns. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear GGG ATC CCG TGG GCT CCA CTG AGC TCT TGC CCG TCC CAA GCT TTA 45 CAA CTG GCA GGC TGC TTG 63 SEQ.ID.N®.8

COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: TIPO DE SEQUÊNCIA: Ns. DE HELICES: TOPOLOGIA: CTG GCT CAA GCA GCC TGC CAG GCT CAG TGG AGC CCA

60 BASES Nucleótido Unica Linear TTG TAA AGC TTG

GGA CGG GCA AGA 45 60 SEQ.ID.NS.9 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 63 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido

Ns. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear AGC CAG CTG CAC TCC GGT CTG TTC CTG TAC CAG GGT CTG CTG CAG 45 GCT CTA GAA GGC ATC TCT 63 SEQ.ID.N2.10 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 63 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido

Ns. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear TTC AGG AGA GAT GCC TTC TAG AGC CTG CAG CAG ACC CTG GTA CAG 45 GAA CAG ACC GGA GTG CAG co 91 ^ -tfv d**'^ SEQ.ID.NS.11 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 60 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido Ns. DE HELICES: Uni ca TOPOLOGIA: Linear CCT GAA TTG GGG CCC ACC CTG GAC ACA CTG CAG CTG GAC GTT GCC 45 GAC TTC GCT ACT ACC 60 SEQ.ID.NS.12 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 63 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido Ns. DE HELICES: Uni ca TOPOLOGIA: Linear TTG CCA TAT GGT AGT AGC GAA GTC GGC AAC GTC CAG CTG CAG TGT 45 GTC CAG GGT GGG CCC CAA 63 SEQ.ID.N2.13 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 63 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido Ns. DE HELICES: Uni ca TOPOLOGIA: Linear ATA TGG CAA CAG ATG GAG GAA CTG GGT ATG GCT CCG GCA CTG CAG 45 CCG ACT CAG GGT GCG ATG 63 SEQ.ID.N2.14 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 60 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido N2. DE HELICES: Uni ca TOPOLOGIA: Linear TGC TGG CAT CGC ACC CTG AGT CGG CTG CAG TGC CGG AGC CAT ACC 45 CAG TTC CTC CAT CTG 60 92

SEQ,ID.N2.15 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 60 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido N2. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear CCA GCA TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGG CGC GCA GGC GGT GTT CTG 45 GTT GCC TCC CAT CTT 60 SEQ.ID.N2.16 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 60 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido

Ns. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear GCT CTG AAG ATG GGA GGC AAC CAG AAC ACC GCC TGC GCG CCG CTG 45 GAA AGC AGA GGC GAA 60 SEQ.ID.N2.17 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 55 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido N2. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear CAG AGC TTC CTC GAG GTG TCT TAC CGC GTT CTG CGT CAC CTG GCC 45 CAG CCG TTAG 55 SEQ.ID.N2.18 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 53 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido N2. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear TCGACTTA CGG CTG GGC CAG GTG ACG CAG AAC GCG GTA AGA CAC CTC 47 GAG GAA 53 93 h C: ·ϊ<·'”·^ aí ff ίΐ^τρττ·:· *^·.· XTi;.: •wwsifltnnTr.wttiÃ.iy111 *

SEQ.ID.N2.19 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: TIPO DE SEQUÊNCIA: N2. DE HELICES: TOPOLOGIA: TACAACTGGCAGGCTGCTTGA 21 BASES Nucleótido Unica Linear 21

SEQ.ID.N2.20 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: TIPO DE SEQUÊNCIA: N2. DE HELICES: TOPOLOGIA: GACGTTGCCGACTTCGCTACT 21 BASES Nucleótido Unica Linear 21

SEQ.ID.N2.21 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: TIPO DE SEQUÊNCIA: N2. DE HELICES: TOPOLOGIA: TGC CGGAGC CATAC C CAGTTC 21 BASES Nucleótido Unica Linear 21

SEQ.ID.N2.22 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: TIPO DE SEQUÊNCIA: N2. DE HELICES: TOPOLOGIA: GCCTGCCAGTTGTAAAGCTTG 21 BASES Nucleótido Unica Linear 21

SEQ.ID.N2.23 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: TIPO DE SEQUÊNCIA: N2. DE HELICES: TOPOLOGIA: GCACCATCGCCTTGAATTTTACGTAG 26 BASES Nucleótido Unica Linear 94 26 (y#&'' 4>*v SEQ.ID.NS.24 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 62 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido

Ns. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear 47 62

AATTCAGT ACT CCA CTG GGT CCA GCA AGC TCT CTG CCG CAG TCT TTC CTG CTG AAG TCT CTC SEQ.ID.N2.25 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 64 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido N«. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear CTG TTC GAG AGA CTT CAG CAG GAA AGA CTG CGG CAG AGA GCT TGC 45 TGG ACC CAG TGG AGT ACTG 64 SEQ.ID.Ns.26 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 60 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido NS. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear GAA CAG GTA CGT AAA ATT CAA GGC AGC GGT GCG GCT CTG CAG GAA 45 AAG CTG TGC GCA ACC 60 SEQ.ID.NS.27 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 60 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido N2. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear TTT GTA GGT TGC GCA CAG CTT TTC CTG CAG AGC CGC ACC GCT GCC 45 TTG AAT TTT ACG TAC 60 95 V1 SEQ.ID.N2.28 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 29 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido

Ns. DE HELICES: Única TOPOLOGIA: Linear

CTT CAG CAG GAA AGA ACG CGC CAG AGA GC SEQ.ID.N2.29

33 BASES Nucleótido Unica Linear CAG AGA AGC CCA C COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: TIPO DE SEQUÊNCIA: N2. DE HELICES: TOPOLOGIA:

GC TTG GGA AGA GCA AGA GCT SEQ.ID.N2.30 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: TIPO DE SEQUÊNCIA: Ns. DE HELICES: TOPOLOGIA: CTG TTG CCA TAT GCT AGA A'

40 BASES Nucleótido Unica Linear GAA GTC TTC AAC GTC CAG C SEQ.ID.N2.31 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 27 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido N2. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear

GCT CAG TGG AGC TTT CGG GAT CCC CAG SEQ.ID.N2.32 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 27 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido N2. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear

• ACG CAG AAC GCG GCG AGA CAC CTC GAG 96 29 SEQ. ID.N9.33 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 29 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido N9. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear

G TTC GAG AGA CTT TTC CAG GAA AGA CTG C SEQ.ID.N9.34 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 33 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido N9. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear

C CTG CAG TTT CGC AGC GCT AGC TTG AAT TTT AC SEQ.ID.N9.35 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: TIPO DE SEQUÊNCIA:

Ns. DE HELICES: TOPOLOGIA: CAG AGA GTG AGC GAG CTT C, 37 BASES Nucleótido Unica Linear

CAG TTC CTC AGC GTG G 37 SEQ.ID.N9.36 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 29 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido N9. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear GCT CAG TGG AGC TTT CGG GAT AGC CAG AG 29 SEQ.ID.N9.37 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 30 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido N9. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear CAG CTT TTC CTG CAG ACG CGC AGC GCT AGC 30 97 __ ** SEQ.ID.Ν9.38

29 BASES Nucleótido Unica Linear TAC CTG TTC 29 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: TIPO DE SEQUÊNCIA: N9. DE HELICES: TOPOLOGIA:

CC GCT GCC TTG AAT ACG ACG SEQ.ID.N9.39

COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 30 BASES 30

TIPO DE SEQUÊNCIA: N9. DE HELICES: TOPOLOGIA: GGT TGC GCA CAG ACG

Nucleótido Unica Linear TTC CTG CAG AGC CGC SEQ.ID.N9.40 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 29 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido N9. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear G GTG GCA CAG ACG GTA GGT TGC GCA CAG C 29 45

SEQ.ID.N9.41 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: TIPO DE SEQUÊNCIA: N9. DE HELICES: TOPOLOGIA: CG CGG CAG AGA GCT TGC ACG

45 BASES Nucleótido Unica Linear GTA GGT TGG AGC CAT TGTCGATACC SEQ.ID.N9.42 24 BASES Nucleótido Unica Linear COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: TIPO DE SEQUÊNCIA: N9. DE HELICES: TOPOLOGIA: 24

GCA AGA GCT CAG AGA AGC CCA CGG 98 0^ «arrarjwtwfí.·;; *»Wh«^ay.vay«çy7f^.uí&.tX.«*' * J> insa*·»»·» ,*** SEQ.ID.N9.43 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 39 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido N9. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear 39 27

CA GCC TGC CAG TTG TAA AGC TTG GGA GCT GCA AGA GCT C SEQ.ID.N9.44 27 BASES Nucleótido Unica Linear COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: TIPO DE SEQUÊNCIA: N9. DE HELICES: TOPOLOGIA:

GCT CAG AGA AGC TTT CGG GAT CCC CAG SEQ.ID.N9.45 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 46 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido N9. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear CGG GAT AGC CAG AGA GTG AGC GAG TTT CAC CAG TTC CTC AGC GTG G 46 SEQ.ID.N2.46 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA TIPO DE SEQUÊNCIA: TOPOLOGIA: : 174/177 Aminoãcidos

Aminoácido Linear

Thr Pro Leu Gly Pro 1 5 Ser Phe Leu Leu Lys 15 Lys Ile Gin Gly Asp

Ala Ser Ser Leu Pro 10 Gin Cys Leu Glu Gin 20 Vai Arg Gly Ala Ala 30 Leu Gin Glu 99

Lys Leu (Vai Ser Glu) 'mCys Ala Thr Tyr Lys Leu 35 40 Cys His Pro Glu Glu Leu Vai Leu Leu Gly His 45 50 Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser 55 60 Cys Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gly Cys 65 70 Leu Ser Gin Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr 75 80 85 Gin Gly Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gly Ile Ser 90 95 Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin 100 105 Leu Asp Vai Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp 110 115 Gin Gin Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala 120 125 Leu Gin Pro Thr Gin Gly Ala Met Pro Ala Phe 130 135 140 Ala Ser Ala Phe Gin Arg Arg Ala Gly Gly Vai 145 150 Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser Phe Leu Glu 1.55 160 Vai Ser Tyr Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin 165 170 100 4t

Pro (em que m é 0 ou 1). SEQ.ID.N9.47 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 168 + 166 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido

Ns. DE HELICES: Dupla TOPOLOGIA: Linear

AATTCTGGCA AATATTCTGA AATGAGCTGT GACCGT TTATAAGACT TTACTCGACA AGTTAACTAG TACGCAAGTT CACGTAAAAA TCAATTGATC ATGCGTTCAA GTGCATTTTT AATGGTACCC GGGGATCCTC TAGAGTCGAC TTACCATGGG CCCCTAGGAG ATCTCAGCTG CCCGCCTAAT GAGCGGGCTT TTTTTTAT GGGCGGATTA CTCGCCCGAA AAAAAATAGC TGACAATTAA TCATCGAACT 50 ACTGTTAATT AGTAGCTTGA 46 GGGTATCGAC 90 CCCATAGCTG 86 CTGCAGGCAT 140 GACGTCCGTA 136 168 166 SEQ.ID.N9.48

COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 534 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido com proteína correspondente N9. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear AATTCAGT ACT CCA CTG GGT CCA GCA AGC TCT CTG CCG CAG TCT TTC 47 Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe 15 10 CTG CTG AAG TGT CTC GAA CAG GTA CGT AAA ATT CAA GGC GAT GGT 92 Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gin Vai Arg Lys Ile Gin Gly Asp Gly 15 20 25 101 137 h GCG GCT CTG CAG GAA Ala Ala Leu Gin Glu 30 CCT GAG GAA CTG GTG Pro Glu Glu Leu Vai 45 GCT CCA CTG AGC TCT Ala Pro Leu Ser Ser 60 TGC TTG AGC CAG CTG Cys Leu Ser Gin Leu 75 CTG CAG GCT CTA GAA Leu Gin Ala Leu Glu 90 GAC ACA CTG CAG CTG Asp Thr Leu Gin Leu 105 CAA CAG ATG GAG GAA Gin Gin Met Glu Glu 120 CAG GGT GCG ATG CCA Gin Gly Ala Met Pro 135 GGC GGT GTT CTG GTT Gly Gly Vai Leu Vai 150 AAG CTG TGC GCA ACC TAC AAA CTG TGC CAC Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His 35 40

CTG CTC GGT CAC TCT CTG GGG ATC CCG TGG Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp 50 55 TGC CCG TCC CAA GCT TTA CAA CTG GCA GGC Cys Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gly 65 70 CAC TCC GGT CTG TTC CTG TAC CAG GGT CTG His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gin Gly Leu 80 85 GGC ATC TCT CCT GAA TTG GGG CCC ACC CTG Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu 95 100 GAC GTT GCC GAC TTC GCT ACT ACC ATA TGG 182 227 272 317 362

Asp Vai Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp 110 115 CTG GGT ATG GCT CCG GCA CTG CAG CCG ACT Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gin Pro Thr 125 130 GCA TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGG CGC GCA Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gin Arg Arg Ala 140 145 GCC TCC CAT CTT CAG AGC TTC CTC GAG GTG Ala Ser His Leu Gin Ser Phe Leu Glu Vai 155 160 407 452 497 102 534 . Μ.1.. ZLLUi3!í33Kíí?i. m> injuraWMWoncált**^- % y TCT TAC CGC GTT CTG CGT CAC CTG GCC CAG CCG TAA G Ser Tyr Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 174 SEQ.ID.Na.49

COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 534 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido com proteína correspondente

Ns. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear AATTCAGT ACT CCA CTG GGT CCA GCA AGC TCT CTG CCG CAG TCT TTC 47

Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe 15 10 CTG CTG AAG TGT CTC GAA CAG GTA CGT AAA ATT CAA GGC GAT GGT 92 Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gin Vai Arg Lys Ile Gin Gly Asp Gly 15 20 25 GCG GCT CTG CAG GAA AAG CTG TGC GCA ACC TAC AAA CTG TGC CAC 137 Ala Ala Leu Gin Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His 30 35 40 CCT GAG GAA CTG GTG CTG CTC GGT CAC TCT CTG GGG ATC CCG TGG 182 Pro Glu Glu Leu Vai Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp 45 50 55 GCT CCA CTG AGC TCT TGC CCG TCC CAA GCT TTA CAA CTG GCA GGC 227 Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gly 60 65 70 TGC TTG AGC CAG CTG CAC TCC GGT CTG TTC CTG TAC CAG GGT CTG 272 Cys Leu Ser Gin Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gin Gly Leu 75 80 85 CTG CAG GCT CTA GAA GGC ATC TCT CCT GAA TTG GGG CCC ACC CTG 317 Leu Gin Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu 90 95 100 103 .1 “"^ι "1-^TrTaKcrami4** GAC ACA CTG CAG CTG GAC GTT GCC GAC TTC GCT ACT ACC ATA TGG 362 Asp Thr Leu Gin Leu Asp Vai Ala Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp 105 110 115 CAA CAG ATG GAG GAA CTG GGT ATG GCT CCG GCA CTG CAG CCG ACT 407 Gin Gin Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gin Pro Thr 120 125 130 CAG GGT GCG ATG CCA GCA TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGG CGC GCA 452 Gin Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gin Arg Arg Ala 135 140 145 GGC GGT GTT CTG GTT GCC TCC CAT CTT CAG AGC TTC CTC GAG GTG 497 Gly Gly Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser Phe Leu Glu Vai 150 155 160 TCT TAC CGC GTT CTG CGT CAC CTG GCC CAG CCG TAA G 534

Ser Tyr Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro 165 170 174 SEQ.ID.N2.50 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 81 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido N2. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear GAATTCAACA AAACGGTTGA CAACATGAAG TAAACACGGT ACGATGTACC 50 ACAAGTTCAC GTAAAAAGGG TATCGACAATG 81 SEQ.ID.N2.51 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 67+67 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido N2. DE HELICES: Dupla TOPOLOGIA: Linear TCGACATTAT ATTACTAATT AATTGGGGAC CCTAGAGGTC CCCTTTTTTA 50 GTAATA TAATGATTAA TTAACCCCTG GGATCTCCAG GGGAAAAAAT 46 104 ΰ&·

Kr. **ϊ. 67 67

TTTTAAAAAG CATGCGA AAAATTTTTC GTACGCTTCGA SEQ.ID.N9.52 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 72 + 72 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido

Ns. DE HELICES: Dupla TOPOLOGIA: Linear TCGACATTAT ATTACTAATT AATTGGGGAC CCTAGAGGTC CCCTTTTTTA 50 GTAATA TAATGATTAA TTAACCCCTG GGATCTCCAG GGGAAAAAAT 46 TTTTAAAAAG CATGCGGATC CC 72 AAAATTTTTC GTACGCCTAG GGGAAC 72 SEQ.ID.N9.53 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 118 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido N9. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear AATTCTGGCA AATATTCTGA AATGAGCTGT TGACAATTAA TCATCGAACT 50 AGTTAACTAG TACGCAGAGC TCAATCTAGA GGGTATTAAT AATGTTCCCA 100 TTGGAGGATG ATTAAATG 118 SEQ.ID.N9.54 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 35+35 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido

Ns. DE HELICES: Dupla TOPOLOGIA: Linear AGCTCCATAT GGTACCAGAT CTCTCGAGAG TACTT 35 GGTATA CCATGGTCTA GAGAGCTCTC ATGAAGATC 35 105 ί,ιώΐϋ'·

SEQ.ID.N9.55 23 + 15 BASES Nucleótido Dupla Linear 23 15 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: TIPO DE SEQUÊNCIA:

Ns. DE HELICES: TOPOLOGIA:

AGCTCAGCTG CAGCATATGG TAC GTCGAC GTCGTATAC SEQ.ID.N9.56 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 72 + 72 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido N9. DE HELICES: Dupla TOPOLOGIA: Linear TCGACATTAT ATTACTAATT AATTGGGGAC CCTAGAGGTC CCCTTTTTTA 50 GTAATA TAATGATTAA TTAACCCCTG GGATCTCCAG GGGAAAAAAT 46 TTTTAAAAAG CATGCGGATC CC 72 AAAATTTTTC GTACGCCTAG GGGAAC 72 SEQ.ID.N9.57 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 84 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido N2. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear AAT TCA ACA AAA CGG TTG ACA ACA TGA AGT AAA CAC GGT ACG ATG 45 TAC CAC AAG TTC ACG TAA AAA GGG TAT CGA CAA TGG TAC 84 SEQ.ID.N9.58 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: 76 BASES TIPO DE SEQUÊNCIA: Nucleótido N2. DE HELICES: Unica TOPOLOGIA: Linear CAT TGT CGA TAC CCT TTT TAC GTG AAC TTG TGG TAC ATC GTA CCG 45 TGT TTA CTT CAT GTT GTC AAC CGT TTT GTT G 76 106

Claims (2)

1. •*—~*nfs?psrmí % 1\.ι «ra-.TKrrjíTVi;rjr-7 rr^-~^'’τ-çtTr,^^.. :^Γτ;:ττ.»ίτ·, . SS¥OTÍ>ÍTOCiá,;is^ ^ --iyUJ-SfrJtVtf&úS ; SEQ.ID.N9.59 COMPRIMENTO DE SEQUÊNCIA: TIPO DE SEQUÊNCIA: N9. DE HELICES: TOPOLOGIA: AATTCGCATG CGGATCCATC GATC GCGTAC GCCTAGGTAG CTAGAGCC 24 + 24 BASES Nucleótido Dupla Linear 24 24 REIVINDICAÇÕES - 1* - Processo para a preparação de um derivado do factor estimulante de colónias de granulócitos G-CSF de ocorrência natural possuindo pelo menos uma das propriedades biológicas do factor estimulante de colónias de granulócitos G-CSF de ocorrência natural e uma estabilidade em solução de pelo menos 35% a 5 mg/ml, possuindo o referido derivado pelo menos Cys17 da sequência nativa substituído por um resíduo Ser·*·7 e o Asp^7 da sequência nativa substituído por um resíduo Ser17 por extracção de um seu corpo de inclusão, caracterizado por compreender as seguin tes fases: 1) suspensão do referido corpo de inclusão num detergente, 2) oxidação, 3) remoção do detergente e 4) manutenção da solução obtida após remoção do detergente a uma temperatura eleva da para precipitar a proteína bacteriana contaminante, oligómeros do produto e/ou produtos de degradação, retendo-se contudo o referido derivado em solução sob a forma activa. 107
2. - 2§ - Processo de acordo com a reivindicação 1, ca-racterizado por se obter um derivado possuindo pelo menos uma modificação adicional escolhida de entre: a) Leu15 de sequência nativa substituído por um resíduo Glu15; b) Lys23 de sequência nativa substituído por um resíduo Arg23; c) Gly26 de sequência nativa substituído por um residuo Ala26; d) Gly28 de sequência nativa substituído por um resíduo Ala28; e) Ala30 de sequência nativa substituído por um resíduo Arg38 i Lys30; f) Lys34 de sequência nativa substituído por um resíduo Arg34; g) Lys40 de sequência nativa substituído por um resíduo Arg40; h) Pro44 de sequência nativa substituído por um resíduo Ala44; i) Leu48 de sequência nativa substituído por um resíduo Lys49; j) Gly51 de sequência nativa substituído por um resíduo Ala51; k) Gly55 de sequência nativa substituído por um resíduo Ala55; D Trp58 de sequência nativa substituído por um resíduo Lys58; Hl) Pro60 de sequência nativa substituído por um resíduo Ser60; n) Pro 65 de sequência nativa substituído por um resíduo Ser 6^ o) Pro111 de sequência nativa substituído por um resíduo Glu111; 108 h? y-‘i i'A rí»»*i.-~,, I iiUiiiii·! |l ~Ύ I ~~H ~'~ Γ ' ' " " i ...*r } iie p) Thr115 de sequência nativa substituido por um resíduo Ser ; q) Thr116 <je sequência nativa substituido por um resíduo Ser11**; A £ JJ r) Tyr165 de sequência nativa substituido por um resíduo Arg ; - 3a - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2 caracterizado por se obter um derivado em que a modificação adicional compreende pelo menos uma das seguintes: a) Gin11, Pro60»65 de sequência nativa substituido por Arg11, Ser60'65; b) Ala111, Thr115'116 de sequência nativa substituido por Glu111 Ser115'116; c) Gin11, Trp58, Tyr183 de sequência nativa substituido por Arg11'165, Lys58; d) Leu15, Gly26'28, Ala30 de sequência nativa substituido por Glu15, Ala26'28, Lys30; ou e) Pro4^, Leu^8, Gly51»55, Trp58 de sequência nativa substituido por Lys^8'58, Ala^'51»55. Leu15, Glu28'28, Ala30 de sequência nativa substituido por um resíduo Glu15, Ala26'28, Arg30; Pro65 de sequência nativa substituido por um resíduo Ser65; Pro60'65 de sequência nativa substituido por um resíduo Ser60'65; Glu11, Pro65 de sequência nativa substituido por um resíduo Arg11, Ser65. 109 Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterizado por se obterem nomeadamente os seguintes derivados: [Arg11, Ser17'27'60'65]G~CSF, [Glu15, Ser17'27, Ala26'28, Lys30]G-CSFf [Arg11, Glu·*·5, Ser17'27'80'85, Ala25'28, Lys30]G-CSF, [Arg11'185, Glu·*·5, Ser17·27·88·88, Ala28'28, Lys30'58]hu G-CSF, [Arg1·*·'23, Ser17'27'80'85]G-CSF, [Arg11'40, Ser17'27'60'65]G-CSF, [Glu15'111, Ser17'27'80'85'115'118, Ala28,28, Lys30]hu G-CSF, [Ala1, Thr3, Tyr4, Arg5'11, Ser17'27'80'85]G-CSF, [Glu15, Ser17'27, Ala28'28, Arg30]hu G-CSF, [Arg11, Ser17'27'65]hu G-CSF, [Ser17'27'85]hu G-CSF. [Ser17'27'60»85]hu G-CSF, Processo para a preparação de um vector recom binante contendo uma sequência de ADN que codifica toda ou parte 110 ».WiL,iúL

   da sequência de aminoâcidos de um derivado quando preparado de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por se inserir essa sequência de ADU num vector. Processo para a preparação de uma célula hospedeiro procariótica ou eucariótica estãvelmente transformada ou transfectada com um vector recombinante quando preparado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se transformar ou transfectar uma célula hospedeiro procariótica ou eucariótica com esse vector recombinante de forma a ser obtido um hospedeiro pro-cariótico ou eucariótico estávelmente transformado ou transfecta-do. - 7* - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 4 caracterizado por se cultivar uma célula hospedeiro procariótica ou eucariótica quando preparada de acordo com o processo 6 de forma a serem obtidos esses derivados. - 8â - Processo de acordo com a reivindicaifaD 1, caracterizado por o derivado a ser extraído ter uma estabilidade em solução de pelo menos 85% a 10 mg/ml. 111 α _ gi - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica caracterizado por se incorporar um derivado de G-CSF de ocorrência natural quando preparado de acordo com as reivindicações 1 a 4 em associação com um veículo ou excipiente far-maceuticamente aceitável. A requerente reivindica as prioridades dos pedidos britânicos apresentados em 30 de Abril de 1990, 20 de Junho de 1990, 24 de Julho de 1990 e em 11 de Fevereiro de 1991, sob os nss. 9009623.1, 9013773.8, 9016215.7 e 9102799.5, respec-tivamente. Lisboa, 30 de Abril de 1991

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