PT90897B - Processo para a producao de novos precursores de insulina - Google Patents
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Description
NOVO NORDISK A/S
PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE NOVOS PRECURSORES DE INSULINA
são os 21 resíduos de aminoácidos da cadeia A da insulina humana, representa uma ligação peptídica ou um ou mais resíduos de aminoácidos arbitrários Xg representa Glu ou Asp, e Y1 e Y2 representam cada um Lis ou Arg, as posições A6 e A11, A7 e B7 e A20 e B19 respectivamente, estão ligados através de pontos bissulfureto e, caso se pretenda, um ou mais dos resíduos de aminoácidos das cadeias B( 1-29) e A( 1-21) são substituídos por um outro resíduo de aminoácido. Os precursores de insulina são preparados através da cultura de uma estirpe de levedura transformada com um veículo de expressão replicável compreendendo uma sequência de DNA codificadora de um precursor de insulina da fórmula anterior num meio adequado e isolamento do precursor da insulina assim formado a partir do meio de cultura.
CAMPO TÉCNICO
O presente invento relaciona-se com novos propeptídeos. Mais especificamente, o invento está relacionado com novos precursores da insulina os quais podem ser usados na preparação de insulina humana ou insulinas apresentando acção prolongada de acção acelerada inerente. Ainda, 0 invento relaciona-se com sequências de DNA codificadoras dos referidos precursores da insulina assim como um processo para a preparação de tais precursores, e com um processo para a preparação de insulina humana Ou de análogos de insulina.
TRABALHOS ANTERIORES
E casos graves ou crónicos a doença dos Diabetes é geralmente tratada com preparações para injecção contendo insulina, e.g. insulina de porco, insulina bovina ou insulina humana.
São conhecidos uma série de processos diferentes para a produção biossintética de insulina humana. E comum a todos eles a cadeia de DNA codificadora da proinsulina na sua totalidade, uma sua forma modificada ou a cadeia A e a cadeia B separadamente, ser inserida num pias mídeo replicável contendo um promotor adequado. Usando este sistema para transformar um determinado organismo hospedeiro pode-se produzir um produto que pode ser convertido em insulina humana autênctica de modo conhecido per se, cf. e.g. EP B1 85083 ou EP B1 88.117.
Abaixo são descritos alguns proces-4-
sos conhecidos para a biossíntese da proinsulina ou de precursores semelhantes de insulina e a sua conversão em insulina.
A proinsulina pode ser preparada biossintéticamente usando 0 método descrito na especificação do pedido de Patente Europeia N2 121.884. Neste método O gene codificador da proinsulina é inserido numa estirpe de levedura e, após cultura, esta proinsulina de estirpe de levedura transformada pode ser isolada a partir do meio de cultura. Daqui em diante a proinsulina pode ser convertida em insulina de modo conhecido per se . Rendimentos de prôinsulina obtida por este método são, contudo satisfatórios e baixos para a produção comercial.
Precursores da insulina da fórmula B-X-A em que B é A representam a cadeia B e A, respectivamente, da insulina humana e X representa um polipeptídeo com preeendendo pelo menos 2 resíduos de aminoácidos, de preferência de 6 a 35 resíduos de aminoácidos, são conhecidos da especificação do pedido de patente dinamarquesa N2 5284/87. Os precursores podem ser digeridos enzimáticamente para dar insulina humana por tratamento com tripsina e carboxipeptidase B na presença de certos iões metálicos.
pedido de Patente EP Ns 195.591, revela precursores da insulina intimamente relacionados da fórmula B-X-Y-A onde B e A representam a cadeia B e A respect i vamente, da insulina humana, interligadas através de pontes dissufureto como na insulina humana e X e Y representam cada um resíduo lisina ou arginina, assim como a preparação dos referidos precursores, Estes precursores podem ser digeridos enzimáticamente para darem insulina humana por tratamento com tripsina e carboxipeptidase B. Ainda,
Os referidos precursores podem sofrer digestão tríptica para dar des-B30-insulina, no entanto, forma-se uma quantidade
considerável de AoArg-des(B30)-insulina que apenas muito lentamente sofre mais digestão.
Constitui um objecto do invento fornecer novos precursores de insulina que são gerados com altos medicamentos em levedura e que, além disso, podem ser convertidos em insulina, humana ou análogos de insulina com formação mínima de subprodutos não desejados.
Os precursores da insulina do invento são caracterizados pela seguinte sequência de aminoác idos,
B( 1 -29 )-X 1 -X2-Y2-Y1-A(1-21) onde B( 1-29) são os 29 primeiros resíduos de aminoácidos da cadeia B da insulina humana começando no extremo N, A( 1-2 1) são os 21 resíduos de aminoácidos da cadeia A da insulina humana, X1 representa uma ligação peptídica Ou um ou mais resíduos de aminoácidos arbitrários, representa Glu ou Asp e Y1 e Y2 representam cada um Lis ou Arg, as posições A6 e A11, A7 e B7 e A20 e B19, respectivamente estão ligados através de pontes dissulfureto e, caso se pretenda, um ou mais dos resíduos de aminoácidos das cadeias B( 1-29) e A( 1-21) são substituídos por um outro resíduo de aminoácidos .
invento está baseado no reconhecimento de que os precursores da insulina anleriores são gerados com um rendimento extremamente elevado comparado côm 0 composto B-Lis-Arg-A conhecido do pedido de patente EP N9 121.884 ou que quando estes precursores são digeridos por tripsina obtem-se des-(B(30)-insulina com rendimento elevado com nenhuma Ou com muito pouca formação de Ao-Arg-des-B(30> -insulina ou Ao-Lis-Des-B(30)insu1ina.
Prefere-se que represente uma ligação peptidica ou um resíduo de aminoácido.
Os precursores preferidos do invento são representados pelas fórmulas B( 1-29 )-rAsp-Lis-Arg-A (1-21) e B(1-29)-Glu-Lis-Arg-A( 1-2 1).
Des-B(30 )-insu1ina pode ser convertida em e.g. insulina humana por processos semi-sintéticos da catálise enzimática de modo conhecido per se.
Os precursores podem também ser convertidos em insulina humana pelo método de transpeptida ção e.g. como descrito na Memória Descritiva da Patente dos E.U.A. NO. 4.343.898.
As insulinas em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos nas cadeias B(1-29) e A( 1-21) são substituidos por um outro resíduo de aminoácidos podem e.g. ser os derivados de insulina com acção prolongada e descritos na especificação do pedido de patente internacional WO 86/05497. Nos referidos derivados da insulina com acção prolongada um ou mais dos resíduos de aminoácidos das posições A4, A17, B13 e B21 são substituidos por um resíduo de aminoácidos tendo uma cadeia lateral não carregada e.g. um éster de alquilo ou uma amida.
Outros análogos de insulina que podem de acordo com o presente invento são aquelas insulinas descritas nos pedidos de patente EP Nos. 194.864 e 274.826.
Os precursores da insulina do invento podem ser preparados por expressão de uma sequência de DNA codificadora de um precursor da insulina do invento num sistema de expressão adequado, de preferência um sistema de expressão de levedura.
A sequência de DNA codificadora dos precursores da insulina do invento podem ser preparados a partir de uma sequência de DNA codificadora de um precursor da insulina B( 1-30)-Lis-Arg-A( 1-21) por mutagénese in vitro ou por síntese de oligonucleotídeos da sequência de DNA com pleta.
invento está também relacionado com um processo em que, se cultiva uma estirpe de levedura transformada por um veículo de expressão replicável compreendendo uma sequência de DNA codificadora do precursor da insulina com a fórmula anterior num meio de cultura adequado e depois se converte o precursor assim formado, facultativamente após o seu isolamento, em des-B(30 )-insu 1 ina por digestão triptica.
presente invento está além disso relacionado com um método para a preparação de insulina humana ou análogos de insulina pela qual uma estirpe de levedura transformada com um veículo de expressão replicável compreendendo uma sequência de DNA codificadora de um precursor de insulina da fórmula anterior é cultivada num meio de cultura adequado, após 0 que 0 precursor assim formado é convertido em insulina humana ou em análogos da insulina por meios conhecidos.
Para se conseguir secreção para 0 meio de cultura, a sequência de DNA codificadora dos precur sores da insulina pode ser fundida a uma Outra sequência de DNA codificadora de um peptídeo sinal funcional em levedura A secreção pode ser conseguida por inserção no veículo de expressão da sequência condutora MF 1 de levedura (Kurjon & Herskowitz, Cell 30, 933-943, 1982) ou suas partes. Uma
construção preferida utiliza uma sequência de DNA codificadora da totalidade da sequência condutora MF 1 incluindo 0 sítio dibásico LisArg mas excluindo Glu-Ala-Glu-Ala que é o substrato para a protease de levedura DPAP (dipeptidil-aminopeptidase). Daquele modo consegue-se uma secreção eficaz dos precursores da insulina tendo o extremo N correcto.
Outras sequências condutoras adequadas são os peptídeos conduroezs de levedura, como descrito em WO 89/02463.
A expressão da sequência de DNA pretendida está sob o controle de uma sequência de DNA que é um promotor da transcrição correctamente colocado em relação à sequência de DNA a ser expresso. Na execução preferida usa-se 0 promotor GAPDH (g1icera 1 deido-3-fosfato-desidrogenase). Como terminador da transcrição usa-se a sequência terminadora do gene MF^ç-l.
invento é ainda ilustrado com referência aos desenhos em que
Figura 1 mostra 0 plasmídeo pYGAIC3 e
Figura 2 mostra o vector plasmídeo pAB24. Os exemplos que se seguem ilustram ainda o invento.
1. Descrição de uma sequência de DNA codificadora de um sinal de transcrição, um sinal de secreção e o precursor da insulina B-Lis-Arg-A.
A cassete de expressão que está contida no fragmento de restrição BamHI no plasmídeo pYGAIC3 como se mostra na Figura 1 tem um comprimento de 1112 pares de bases e contem essêncialmente 0 seguinte (descritos sucessivamente a partir do extremo 5'):
promotor GAPDH (Travis et al., J. Biol. Chem., 260, 4384-4389, 1985) seguido da região codificadora constituída por: Os 83 aminoácidos N-terminais da sequência condutora MF 1 codificados pela sequência de DNA de levedura selvagem como descritos por Kurjan & Herôkowitz (referência dada atrás) seguido dos dois codões AAA e AGA codificadores de'Lis e de Arg e novamente seguido da região codificadora de B(1-30)-Lis-Arg-A( 1-2 1) que é um gene construído sintéticamente usando codões preferidos de levedura. Após dois codões de paragem está colocado um sítio de restrição Sall e a restante parte da sequência consiste em sequências MF -1 contendo a região terminadora. A cassete de expressão é construída usando técnicas convencíqbis.
2. Preparação de sequências de DNA codificadoras de um sinal de secreção e precursores da insulina modificados.
Sequências de DNA codificadoras de precursores da insulina do invento foram construídas a partir da cassete de expressão descrita atrás. 0 método empregue foi mutagénese dirigida in vitro que está descrito por Zoller & Smiths, DNA, Vol. _3> N9 6, 479-488 (1984). Segue-se uma descrição rápida do método que está descrito detalhadamente no Exemplo 1. Isolada a partir do plasmídeo de expressão a sequências precursora da insulina é inserida num vector bacteriofágico de cadeia simples circular M13.
Ao vector de cadeia simples é emparelhado uma cadeia de DNA complementar obtida por síntese química. A cadeia de DNA contem a sequência pretendida rodeada por sequências completamente homólogas das sequências da insulina no DNA circular. In vitro, o iniciador é então prolongado ao longo de todo o comprimento do genoma circular usando a DNA-polimerase Klenow. Deste modo obtem-se uma molécula de DNA de cadeia dupla uma cadeia da qual tem a sequência pretendida. Esta cadeia dá origem a fagos de cadeia simples que se replicam em £. coli . Deste modo obtem-se DNA de cadeia dupla com a sequência pretendida. A partir deste DNA de cadeia dupla pode-se isolar um fragmento de restrição e reinseri-lo no vector de expressão. Deste ncio foram construídos sequências de precursores da insulina que se mostram abaixo juntamente com os iniciadores usados na preparação.
Parte experimental
A região entre as cadeias B e A dos precursores de insulina pode ser modificada por mutagénese in vitro, os principies dos quais estão descritos em Zoller & Smith, DNA, Vol. 3, N9 6, 479-488 (1984). Neste exemplo é usado um método ligeiramente modificado do protocolo de Zoller & Smith.
EXEMPLO 1
Construção de um plasroideo de expressão que pode ser usado na produção de B( 1-29)-61u-LisArg-A(1-21)(=H6):
Isolamento de fragmento de restrição contendo a cassete de expressão
A cassete de expressão que está contida no plasmídeo de expressão pYGAIC3 apresentado na Figura 1 num fragmento de restrição BamHI foi isolado como se segue: 0 plasmídeo de expressão foi incubado com a endonuclease de restrição BamHI. As condições foram as seguintes 20 jug de plasmídeo, 50 unidades de BamHI, 100 mM NaCl, mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgC^ e 1 mM DTT num volume de reacção de 100 fjl. k temperatura foi de 37°C e o tempo de reacção de 2 horas. Os dois fragmentos de DNA foram separados num gel de 1% de agarose de baixo ponto de fusão e o fragmento pretendido foi isolado por processos convencionais.
Ligação ao vector M12mp18 fragmento de restrição isolado foi ligado ao vector bacteriófago M13mp18 cortado com a endonuclease de restrição BamHI na seguinte mistura de reacção: Fragmento 0,2 pg , vector 0,02 ug, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 10 mM MgCl2, 10 mM DTT e 1 mM ATP num volume de 20 pl.
pl desta mistura foram usados para transformar E. coli estirpe JM101 por processos convencionais. A presença de fragmento no vector assim como a orientação do fragmento foi determinado por mapeamento com enzimas de restrição em DNA de M13 de cadeia dupla isolado a partir dos transformantes.
Isolamento do DNA (molde) de cadeia simples (ss):
A partir do trnasformante descrito atrás isolou-se ss-DNA de acordo com o método descrito por Messing e Vieira em Gene 19, 269-276 (1982).
Fosforilação 5' do iniciador de mutagénisação:
iniciador de mutagenisação foi fosforilado no extremo 5' num volume de reacção de 30 pl contendo 70 mM Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP, 100 pmoles de oligonucleotídeo e 3,6 unidades de polinucleotídeo-cinase de T4. A reacção foi efectuada durante 30 minutos a 37°C. Em seguida a enzima foi inactivada por incubação da mistura durante 10 min. a 65°C.
Empare1hamento do molde e iniciador de mutagenização empare1hamento do molde e iniciador foi efectuado num volume de 10 pl contendo 0,5 pmoles de molde, 4 pmoles do iniciador, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, mM MgCl2> 50 mM NaCl e 1 mM DTT através do aquecimento a 65°C durante 10 min e depois arrefecimento até 0°C.
Reacção de extensão/1igação:
A mistura de reacção formada atrás adicionou-se 10 pl da seguinte mistura: 0,3 mM dATP, 0,3 mM dCTP, 0,3 mM dGTP, 0,3 mM TTP, 1 mM ATP, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 3 unidades de DNA-ligase de T4 e 2,5 unidades de polimerase Klenow. Em seguida a reacção decorreu durante 16 horas a 16°C.
Trnadformação de JM101
A mistura de reacção formada atrás foi usada para transformar em várias diluições células de coli JM101 tratadas com CaCl2 usando técnicas convencionais e semeada em agar de topo 2XYT em placas de agar 2xYT. (2xYT=triptona 16 g/litro, extracto de levedura, 10 g/litro, NaCl 5g/litro. Agar de topo 2χΥΤ = 2χΥΤ com adição de 0,4% de agarose e aquecido sob pressão. Placas de agar 2xYT= =2χΥΤ com adição de agar a 2% e aquecido sob pressão. As placas foram incubadas a 37°C durante a noite.
Identificação de clones positivos método usado foi o da hibridação de placas que se descreve assim: um filtro de nitrocelulose foi colocado numa placa com uma densidade de placas adequada de modo a que o filtro ficasse molhado com líquido de placa. 0 filtro foi então banhado nas seguintes soluções:
1,5 m NaCl, 0,5 NaOH durante 30 segundos, 1,5 m NaCl , 0,5M Tris-HCl, pH 8,0 durante 1 min., 2xSSC (0,3 M NaCl, 0,03M citrato de sódio) até ser seco mais tarde. 0 filtro foi então seco em papel 3MM e aquecido durante pelo menos 2 horas a 80°C numa estufa sob vãcuo.
Marcação 5 com
P do iniciador de mutagenização iniciador de mutagenização com a sequência 5 1CAACAATACCTCTCTTTTCCTTTGGACTG3' foi marcado radioact i vamente no extremo 5' num volume de 50 ^il de reacção contendo 70 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl?, 5 mM DTT, ^32 pmoles de oligonucleotídeo e 50 pmoles de P-ATP.
Os reagentes foram aquecidos a 37°C e a reacção foi iniciada pela adição de 3,5 unidades de polinucleotídeo-cinase de T4. A mistura foi incubada a 37°C durante 30 min. e em seguida a enzima foi inactivada por aquecimento a 100°C durante 3 min.
Hibridação com iniciador radioactivo a filtros de nitroce1 u lose:
Os filtros secos foram pré-hibridados durante 2 horas a 65°C em 50 ml da seguinte solução:
0,9M NaCl, 0,09M citrato de sódio 0,2% albumina do soro bovina, 0,2% de Ficoll 0,2% de poliviniIpirrolidona 0,2% de dodeci1su1fato de sódio (SDS) e 50 ug/ml de DNA de esperma de salmão. Em seguida, metade da mistura de reacção de marcação foi adicionada como sonda a 15 ml de tampão de pré-hibridação recente e o filtro foi imerso nele durante a noite a 37°C com agitação suave. Após hibridação o filtro foi lavado a 30°C 3 vezes, 15 min. cada em 0,3M NaCl, 0,03 citrato de sódio e autorradiografado. Após lavagem no mesmo tampão a 60°C e uma outra autorradiografia , as placas contendo sequências de DNA complementares do iniciador de mutagenização foram identificadas. A frequência de mutagénese foi de 43%.
Purificação de DNA de cadeia dupla do fago M13:
Após sementeira de um clone positivo e uma outra identificação de placas positivas por hibridação um dos clones positivos foi usado para infecções
O de E^. co 1 i estirpe JM101. Aproximadamente 10 fagos e 5 colónias de JM101 foram cultivadas durante 5 horas em 5 ml de meio 2xYT. Em seguida purificou-se DNA de cadeia dupla circular a partir do sedimento celular de acordo com um método descrito por Birnboim & Dolly, Nucleic Acids Res.,
2, 1513 (1979).
Isolamento de um fragmento de restrição contendo uma ligação B-A modificada:
A preparação de DNA (aprox. 5 ug) isolado atrás foi digerido com 10 unidades da endonuclease de restrição BamHI em 60 /il de 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgC^ e 1 mM DTT durante 2 horas a 37°C, Os produtos de DNA foram separados por electroforese num gel agarose e o fragmento pretendido foi purificado a partir do gel por técnicas convencional.
Ligação ao vector de levedura pAB24:
fragmento de restrição isolado foi ligado ao vector de levedura pAB24 apresentado na Figura 2 cortado com a endonuclease de restrição BamHI na seguinte mistura de reacção: Fragmento 0,2 /jg , vector 0,02 pg , 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgC^, 10 mM DTT, 1 mM ATP num volume de 20 pl 5 pl desta mistura de reacção foi usada na transformação de E\ coli estirpe MC1061, na qual o plasmídeo de expressão modificado foi identificado e propagado. 0 plasmídeo foi designado pYGAB-H6-A e tinha a mesma sequência de pYGAIC3, excepto na região alterada.
Transformação de levedura plasmídeo de expressão foi usado na transformação da estirpe de levedura Saccharomyces cerevisiae JC482 pep Leu cir° ( c\ , Lis 4, ura 3, leu 2, cir°) como descrito por H Ito et a 1. , J. Bact., Vol. 153, Ne 1 , 163-168 (1983). As células transformadas foram semeadas em meio SC-ura (0,7% de Yeast Nitrogen Base, 2,0% de glucose, 0,5% de casaminoácido, 2,0 % de agar) para selecção de células contendo plasmídeo.
EXEMPLO 2
Construção de um plasmídeo de expressão que pode ser usado na produção de B( 1-29 )-Leu-AspLis-Arg-A( 1-21)(=H3) processo usado foi o mesmo descrito no exemplo 1, excepto o iniciador de mutagenização ter a sequência 5 'CAACAATACCTCTCTTGTCCAACTTTGGAGTG3 1 e a temperatura de lavagem após hibridação ser de 63°C. 0 plasmídeo final foi designado pYGAB_H3-A e tinha a mesma sequência de pYGAIC3, excepto para a parte modificada.
EXEMPLO 3
Construção de um plasmídeo de expressão que pode ser usado na produção de B(1-29)-AspLisArg-a( 1-2 1)(=H5) processo usado foi o mesmo descrito no exemplo excepto o iniciador de mutagenização ter a sequência 51CAACAATACCTCTCTTGTCCTTTGGAGTG3 ' e a temperatura de lavagem após hibridação ser de 61°C. 0 plasmídeo final foi designado pYGAB-H5-A e tinha a mesma sequência de pYGAIC3, excepto para aparte modificada.
EXEMPLO 4
Construção de um plasmídeo de expressão que pode ser usado na produção de B(1-29)-LeuGluLisArg-A(1-2 1 (=H8 ) processo usado foi o mesmo descrito no exemplo 1, excepto o iniciador de mutagenização ter a sequência 5’CAACAATACCTCTCTTTTCCAACTTTGGAGTG3 1 e a temperatura de lavagem após hibridação ser de 63°C. 0 plasmídeo final foi designado pYGAB-H8-A e tinha a mesma sequência de pYGAIC3, excepto para a parte modificada.
EXEMPLO 5
Cultura da estirpe de levedura transformada com um plasmídeo de expressão codificador de precursores da insulina do invento
Usaram-se as estirpes de Saccharomy-19-
ces cerevisiae transformadas com os plasmídeos construídos.
Cada uma das estirpes foi cultivada em placas de Petri contendo meio mínimo sem uracilo durante 48 horas a 30°C. Frascos de agitação de 100 ml contendo meio mínimo sem uracilo+5 g/litro de casaminoácidos+ 10g/litro de ácido succínico+ 30 g/litro de glucose pH 5,0 foram então inoculados com uma única colónia da placa de Petri. Os frascos foram agitados durante 72 horas a 30°C num incubador a 180 rpm.
Obteve-se uma densidade correspondente a cerca de 5 g/litro de matéria celular seca.
EXEMPLO 6
Isolamento do precursor a partir do sobrenadante da cultura
Após centrifugação 5 litros do sobrenadante da cultura foi esterilizado por filtração e ajustado pela adição de água destilada e 5M HC1 para uma condutividade de 8mS e pH 4,5. 0 sobrenadante foi então aplicado
D numa coluna (2,6x6,7 cm) de FFS Sepharose Pharmacia equilibrada com 10 volumes de leito de tampão (50 mM ácido acético em etanol a 50% ajustado a pH 4,0 com NaOH). 0 sobrenadante foi aplicado â coluna num caudal de 5,3 ml min-1 usando uma bomba e a coluna foi lavada com 5 volumes do tampão. Após lavagem da coluna o precursor da insulina foi eluido por um gradiente linear de NaCl de 0 a 350 mM em 30 volumes do mesmo tampão num caudal de 25 ml hora-^ e colheram-se fracções de 10 ml. As fracções contendo o precursor foram identificadas por absorvância de UV e análise por RP-HPLC e reunidas. Ao conjunto de fracções foi removido o
/6) sal numa coluna Sephadex,MV G25 ajustada com ácido acético 1M. 0 precursor foi então isolado por 1iofi1Ização.
Identificação de precursores da insulina isolados
Amostras dos precursores liofilizados foram hidrolisadas em 6M HC1 a 110°C em ampola fechadas e analisadas quanto à composição em aminoácidos usando um analisador de aminoácidos LKB Alpha plus. As amostras dos precursores da insulina foram também analisadas por sequênciação de aminoácidos num sistema de sequênciação de aminoácidos (Applied Bio System Modelo 477A) com um sistema de identificação de aminoácidos no HPLC. Os resultados confirmam que os peptídeos de ligação estavam.-de acordo com as sequências estabe1ecidas .
Digestão de precursores de insulina por tripsina para DES(B-30 )-insu1ina precursor foi dissolvido para uma concentração de 2 mg/ml em 50 mM Tris, 20% etanol ajustado a pH 10,0 com 1M HC1. A reacção foi iniciada por adição de 400 mg de gel escorrido de Sepharose contendo 0,3 mg de tripsina imobilizada. A reacção foi efectuada a 4°C com agitação suave normalmente durante 12 horas. A reacção foi parada por filtração da mistura. 0 rendimento da fermentação do precursor de insulina conhecido intimamente seleccionado B( 1-29 )-Tre-Lis-Arg-A( 1-29) são misturados no seguinte tabela juntamente com a eficiência da digestão do precursor do invento e a formação de sub-produtos.
TABELA
Peptídeo de ligação entre B( 1-29) e A( 1-2 1)
Rendimento da fermentação em % da produção de Tre-Lis-Arg
Rendimento de digestão em % do precursor
Ao Arg-des (B30 ) insu ' i na ou Αθ L i s-des(B3 )) percursor da insulini
| T re-L i s-Ar | 100 | 70 | 27% |
| Leu-Asp-Li s-Arg | 64 | 84 | ~0 |
| Leu-Asp-Lis-Lis | 53 | 80 | -0 |
| Leu-Glu-Lis-Arg | 64 | 76 | -0 |
| Asp-L i s-Arg | 166 | 77 | -0 |
| Giu-Lis-Arg | 286 | 78 | -10 |
| Da tabela | atrás pode- | se concluir | |
| que por conversão | dos precursores | da insulina | do invento |
| obtem-se níveis de des-(B30) insulina considerávelmente | |||
| mais altos por digestão enzimática | do que no | caso do pre- | |
| cursor conhecido | estreitamente relacionado B(1-29)-Tre- | ||
| -Lis-Arg-A( 1-2 1). | Além disso, os | precursores | de insulina |
preferidos são expressos em rendimentos muito mais elevados em insulina.
EXEMPLO 7
Isolamento de des(B30)-insu1ina a partir da mistura de reacção
A mistura de reacção foi filtrada e sujeita a precipitação isoeléctrica e 1iofi1ização.
pg de substância liofilizada foi dissolvida em 2 ml de tampão (20 mM Tris, 7M ureia ajustada a pH 8,1 com 1M NaOH) e aplicado numa coluna (1,6x20 cm) de permutador aniónico FFQ-Sepharose ajustado com 10 volumes de tampão. A coluna foi então eluida com um gradiente linear de NaCl de 0 a 50 mM NaCl em 10 volumes da coluna do mesmo tampão num fluxo de 10 pl por hora. Colheram-se fracçoes de 5 ml. As fracções positivas foram identificadas por absorvância de UV e análise de RP-HPLC e reunidas. Tipicamente obteve-se Des-B(30 )-insu1ina num rendimento de 75% após uma remoção de sal final numa coluna Sepharose®* 6-25 em ácido acético 1M e 1iofi1ização.
A identidade do composto foi confirmada por análise de aminoácidos como descrito no exemplo 6.
A quantidade de precursor da insulina e de des(B30) Insulina foi determinado por análise de RP-HPLC como descrito em B.S. Welinder/F.A. Andesen: Proceedíngs of the FDA-USP Werkshop ou Droges and Reference Standords for Insulina, Somatotropins and Thyroid-axis Hormones. Bethesda, Maryland, 19-21 de Maio, 163-176 (1982).
sistema tampão é composto por um tampão A (0,125M sulfato de amónio, 22,5% (vol/vol) de acetonitrilo ajustado a pH 4,0 com ácido sulfúrico) e um tam-23-
pão B (0.125M sulfato deamónio, 45% de acetonitrilo ajustado a pH 4,0 com ácido sulfúrico). A coluna foi uma Hibar Lichrosorp RP-18, 5u, 250x4 mm, que foi eluida com um fluor de 1,5 ml por minuto. As amostras contendo des(B30) insulina foram eluidas com um sistema gradiente recomendado por Welinder e Andresen (1982), enquanto as amostras contendo precursores da insulina foram eluidas com um gradiente linear de 0 a 35% de tampão B aumentando 1% por minuto. A concentração foi determinada por comparação com uma solução padrão do precursor da insulina autêntico.
Claims (6)
- REIVINDICAÇÕES1â. - Processo para a preparação de υπ _ρη6^ρη5 0ΐι_ύ&_ίτΐ5υίΙ4-ηά tendo a sequência de aminoác idosB( 1-29)-X1-X2-Y2-Y1-A( 1-21) onde B(1-29) são os 29 primeiros resíduos de aminoácidos de cadeia B da insulina humana começando ao extremo N,A(1-21) são os 21 resíduos de aminoácidos da cadeia A de insulina humana, X1 representa uma ligação peptidica ou um ou mais resíduos de aminoácidos arbitrários, X2 representa Glu ou Asp e Y1 e Y2 representam cada um Lis ou Arg, as posições A6 e A11, A7 e B7 e e A20 e B19, respectivamente estão ligados através de pontes bissulfureto e, caso se pretenda, um ou mais dos resíduos de aminoácidos das cadeias B(1-29) e A(1-21) são substituidos por um outro resíduo de aminoácido, caracterizado por compreender a cultura de uma estirpe de levedura transformada com um veículo de expressão replicável compreendendo uma sequência de DNA que codifica o referido precursor de insulina num meio de cultura adequado e o isolamento do precursor de insulina a partir do meio de cultura.
- 23. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir um precursor da insulina sendo a fórmulaB( 1-29)-Asp-Lis-Arg-A( 1-21 ) .33. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se produzir um precursor da insulina tendo a fórmulaB(1-29)-Asp-Lis-Arg-A(1-21).43. - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a
- 3, caracterizado por se produzir um percursor da insulina em que um ou mais dos resíduos de glutamina nas posições A
- 4, A17, B13 e B21 são substituídos por um outro resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral não carregada.
- 5^. - Processo para a produção de uma sequência de DNA que codifica um percursor da insulina de uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por se submeter a mutagénese in vitro uma sequência de DNA que codifica um percursor de insulina B(1-30)-Lis-Arg-A(1-21) ou se efectuar uma síntese de oligonucleotídeos da sequência de DNA completa.63. - Processo para a preparação de um veículo de expressão replicãvel, caracterizado por se incluir no referido veículo uma sequência de DNA de acordo com a reivindicação 5.73. - Processo para a produção de des(B30)-insulina caracterizado por compreender a cultura-26de uma estirpe de levedura transformada com um veículo de expressão replicável da reivindicação 6 num meio de cultura adequado e, em seguida a conversão do precursor, assim formado, facultativamente após isolamento, em des(B30)insulina por digestão tríptica.
- 8®. - Processo jDara..a. prodtição_,de i n s u 1 ina humana o u de a n á _1o g qs _ de__ín s _u 1 i na c a r a c t e r i z a d o por compreender a cultura de uma estirpe de levedura trans formada com um vector de expressão replicável da reivindicação 6 num meio de cultura adequado e, em seguida, a conversão do precursor, assim formado, em insulina humana ou num análogo de insulina através de um tratamento enzimático conhecido.
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| WO2003105768A2 (en) * | 2002-06-13 | 2003-12-24 | Nobex Corporation | Methods of reducing hypoglycemic episodes in the treatment of diabetes mellitus |
| WO2004085472A1 (en) * | 2003-03-27 | 2004-10-07 | Novo Nordisk A/S | Method for making human insulin precursors and human insulin |
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|---|---|---|---|---|
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