NO177499B - Insulin-forstadier, DNA-sekvenser, replikerbare ekspresjonsvektorer og vertsceller - Google Patents

Description

Teknisk område

Foreliggende oppfinnelse angår nye propeptider for insulin og spesielt nye insulin-forstadier som definert i krav l's karakteriserende del som kan brukes ved fremstilling av human insulin eller insulintyper som viser iboende forsin-ket virkning eller akselerert virkning. Videre angår oppfinnelsen DNA-sekvenser og replikerbare ekspresjonsvek-torer som koder for disse insulin-forstadier såvel som vertsceller egnet for fremstilling av slike forstadier av human insulin eller insulinanaloger.

Bakarunnsteknikk

I alvorlige eller kroniske tilfeller av lidelsen diabetes behandles det vanligvis med injeksjonspreparater inneholdende insulin såsom svineinsulin, bovininsulin eller human insulin.

Et antall forskjellige fremgangsmåter for biosyntetisk fremstilling av human insulin er kjent. Felles for alle disse er at DNA-kjeden som koder for enten det fullstendige proinsulin, en modifisert form derav eller for A- og B-kjeden separat, settes inn i et replikerbart plasmid inneholdende en egnet promoter. Ved å transformere dette system i en gitt vertsorganisme, kan et produkt fremstilles som kan omdannes til autentisk human insulin på i og for seg kjent måte, se f.eks. EP Bl 85,083 eller EP Bl 88,117.

Enkelte kjente fremgangsmåter for biosyntese av proinsulin eller lignende insulin-forstadier og for omdannelse til insulin er beskrevet nedenfor.

Proinsulin kan fremstilles biosyntetisk ved å bruke fremgangsmåten beskrevet i beskrivelsen til Europeisk patent- søknad nr. 121,884. I denne fremgangsmåte settes genet som koder for proinsulin inn i en gjærstamme og etter dyrkning av en slik transformert gjærstamme kan proinsulin isoleres fra kulturmediet. Deretter kan proinsulin omdannes til insulin på i og for seg kjent måte. Utbytter av proinsulin erholdt ved denne metode er imidlertid utilfredsstillende lave for kommersiell produksjon.

Insulin-forstadier av formelen B-X-A hvor B og A representerer henholdsvis B- og A-kjeden av human insulin og X representerer et polypeptid omfattende minst to aminosyreresiduer, fortrinnsvis fra 6 til 3 5 aminosyreresiduer, er kjent fra beskrivelsen til Dansk patentsøknad nr. 5284/87.Forstadiene kan fordøyes enzymatisk til human insulin ved behandling med trypsin og karboksypeptidase B i nærvær av visse metallioner.

Europeisk patentsøknad nr. 195,691 beskriver nært relaterte insulin-forstadier av formel B-X-Y-A hvor B og A representerer henholdsvis B- og A-kjeden av human insulin tverr-bundet via svovelbroer som i human insulin, og X og Y representerer hver et lysin eller argininresiduum, såvel som fremstillingen av slike forstadier. Disse forstadier kan fordøyes enzymatisk til human insulin ved behandling med trypsin og karboksypeptidase B. Videre kan disse forstadier undergå tryptisk fordøying til des-B30-insulin, men en vesentlig mengde A0Arg-des(B30)-insulin dannes som undergår kun sakte videre fordøying.

Det er et mål for oppfinnelsen å fremskaffe nye insulin-forstadier som dannes i høyt utbytte i gjær og som videre kan omdannes til human insulin eller insulinanaloger med minimal dannelse av uønskede biprodukter.

Insulin-forstadiene i følge oppfinnelsen er særpreget ved den følgende aminosyresekvens hvor B(l-29) er de 29 første aminosyreresiduer av B-kjeden av human insulin som starter fra N-terminalen, A(1-21) er de 21 aminosyreresiduer av A-kjeden hos human insulin, X1representerer en peptidbinding eller Leu eller Asp, X2representerer Glu eller Asp, og Y1og Y2representerer hver Lys eller Arg, hvor henholdsvis posisjonene A6 og All, A7 og B7 og A20 og B19 er forbundet via svovelbroer og om ønsket er én eller fler av aminosyreresiduene av kjedene B(l-29) og A(1-21) substituert med andre aminosyreresiduer.

Oppfinnelsen er basert på den overraskende oppdagelse at ovenfor nevnte insulin-forstadier enten dannes i ekstremt høyt utbytte sammenlignet med forbindelsen B-Lys-Arg-A, kjent fra Europeisk patentsøknad nr. 121,884, eller at når disse forstadier fordøyes med trypsin, erholdes des-B(30)-insulin i høyt utbytte med ingen eller meget liten dannelse av A0-Arg-des-B(30)-insulin og A0-Lys-des-B(3 0)-insulin eller begge deler.

Foretrukne forstadier ifølge oppfinnelsen er representert ved formlene B(l-29)-Asp-Lys-Arg-A(l-21) og B(l-29)-Glu-Lys-Arg-A(l-21).

Des-B(30)-insulin kan omdannes til f.eks. human insulin ved en enzymatisk katalysert semisyntetisk prosess på i og for seg kjent måte.

Forstadiene kan også omdannes til human insulin ved trans-peptideringsmetoden f.eks. som beskrevet i US patent nr. 4,343,898.

Insuliner hvor én eller fler av aminosyreresiduene i B(l-29)- og A(1-21)-kjedene er substituert med andre aminosyreresiduer kan f.eks. være insulinderivatene som viser forlenget virkning og beskrevet i Internasjonal patentsøknad WO 86/0.5497. I nevnte insul inder ivater som viser forlenget virkning, er én eller fler av aminosyrere siduene ved posisjonene A4, A17, B13 og B21 substituert med et aminosyreresiduum med en uladet sidekjede såsom en alkylester eller et amid. Ytterligere insulin-analoger som kan fremstilles i henhold til foreliggende oppfinnelse er slike insuliner som beskrevet i Europeisk patentsøknad nr. 194,864 og 214,826.

Insulin-forstadiene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved å uttrykke en DNA-sekvens som koder for et insulin-forstadium i følge oppfinnelsen i et egnet ekspresjonssystem, fortrinnsvis et gjærekspresjonssystem.

DNA-sekvensen som koder for insulin-forstadiene ifølge oppfinnelsen kan fremstilles fra en DNA-sekvens som koder for et insulin-forstadium B(1-30)-Lys-Arg-A-(1-21) ved in vitro mutagenese eller ved oligonukleotidsyntese av hele DNA-sekvensen.

Oppfinnelsen angår også en gjærstamme transformert med en replikerbar ekspresjonvektor omfattende en DNA-sekvens som koder for insulin-forstadiet med ovenfor nevnte formel. Gjærstammen dyrkes i et egnet kulturmedium og forstadiet således dannet, eventuelt etter isolering derav, omdannes til des-B(30)-insulin ved tryptisk fordøying.

Fremstilling av human insulin eller insulinanaloger ifølge oppfinnelsen kan foregå ved at en gjærstamme transformert med en replikerbar ekspresjonsvektor omfattende en DNA-sekvens som koder for et insulin-forstadium av ovenfor nevnte formel, dyrkes i et egnet kulturmedium hvorpå forstadiet således dannet omdannes til human insulin eller insulinanaloger ved kjente midler.

For å oppnå sekresjon til kulturmediet kan DNA-sekvensen som koder for insulin-forstadiene fuseres til andre DNA-sekvenser som koder for et signalpeptid som er funksjonelt i gjær. Sekresjon kan oppnås ved å innsette ekspresjons vektoren av gjær MFosl-ledersekvensen (Kurjan & Herskowitz, Cell 30., 933-943, 1982) eller deler derav. En foretrukket konstruksjon bruker DNA-sekvensen som koder for den fullstendige MFal-ledersekvens innbefattende det dibasiske Lys-Arg-setet, men uten Glu-Ala-Glu-Ala som er substratet for gjærproteasen DPAP (dipeptidyl aminopeptidase). På denne måte blir en effektiv sekresjon av insulin-forstadiene med den riktige N-terminal oppnådd. Andre egnede ledersekvenser er syntetiske gjær lederpeptider som beskrevet i

WO 89/02463.

Ekspresjonen av den ønskede DNA-sekvens er under kontroll av en DNA-sekvens som er en promoter for transkripsjon riktig plassert i forhold til DNA-sekvensen som blir uttrykket. I den foretrukne utførelsesform blir GAPDH (glyceraldehyd-3-fosfat-dehydrogenase)-promoteren brukt. Som terminator for transkripsjonen blir terminatorsekvensen for MFal-genet brukt.

Oppfinnelsen er videre illustrert under henvisning til tegningene hvor

figur 1 viser plasmidet pYGAIC3 og

figur 2 viser gjærvektoren pAB24.

De følgende eksempler illustrerer ytterligere oppfinnelsen. 1. Beskrivelse av en DNA- sekvens som koder for et transkripsionssicmal. et sekresionssignal og insulin-forstadiet B- Lys- Arg- A.

Ekspresjonskasetten som er inneholdt i BamHI-restriksjons-fragmentet på plasmidet pYGAIC3 som vist i fig. 1, har en lengde på 1112 basepar og inneholder i hovedsak følgende (opplistet i rekkefølge ved å starte fra 5'-ende): GAPDH-promoteren (Travis et al., j. Biol. Chem., 260, 4384-4389, 1985) fulgt av den kodende region omfattende: Den 83 aminosyrers N-terminal av MFal-ledersekvensen kodet for av villtype gjær-DNA-sekvensen som beskrevet av Kurjan ogHerskowitz (referanse gitt ovenfor) fulgt av de to kodoner AAA og AGA som koder for Lys og Arg og igjen fulgt av den kodende region for B(1-3 0)-Lys-Arg-A(1-21) som er et syntetisk konstruert gen ved å bruke foretrukne gjærkodo-ner. Etter to stoppkodoner er det plassert et Sali restrik-sjonssete og den gjenværende del av sekvensen består av MFccl-sekvenser som inneholder terminatorregionen. Ekspresjonskasetten er konstruert ved å bruke standard teknikker. 2. Fremstilling av DNA- sekvenser som koder for et sekresionssignal og modifiserte insulin- forstadier.

DNA-sekvenser som koder for insulin-forstadier ifølge oppfinnelsen ble konstruert fra ekspresjonskasetten beskrevet ovenfor. Den anvendte metode var "seterettet in vitro mutagenese" som er beskrevet av Zoller & Smith, DNA, vol. 3_, nr. 6, 479-488 (1984) . Metoden er kort beskrevet i det følgende og er beskrevet i detalj i eksempel 1. Isolert fra ekspresj onsplasmidet settes insulin-forstadiumsekvensen inn i en enkeltkjedet sirkulær M13 bakteriofagvektor. Til den enkeltkjedede vektor knyttes en kjemisk syntetisert komple-mentær DNA-kjede. DNA-kjeden inneholder den ønskede sekvens omgitt av sekvenser som er fullstendig homologe til insu-linsekvenser på det sirkulære DNA. In vitro blir primeren så biokjemisk utvidet i den fullstendige lengde av det sirkulære genom ved å bruke Klenow-polymerase. Herved erholdes et dobbeltkjedet molekyl hvorav én kjede har den ønskede sekvens. Denne kjede gir opphav til enkeltkjedede fager som dyrkes i E. coli. På denne måte erholdes dobbeltkjedet DNA med den ønskede sekvens. Fra denne dobbeltkje-dede DNA kan et restriksjonsfragment isoleres og settes tilbake i ekspresjonsvektoren. På denne måte ble insulin-forstadiumsekvenser konstruert som er vist nedenfor sammen med primerene som ble brukt ved fremstillingen.

Eksperimentelt

Området mellom B- og A-kjedene av insulin-forstadiene kan modifiseres ved in vitro mutagenese hvorav prinsippene er beskrevet i Zoller & Smith, DNA, Vol. 3, nr. 6, 479-488

(1984) . I dette eksempel anvendes en lett modifisert metode til Zoller & Smith-fremgangsmåten.

Eksempel 1

Konstruksjon av et ekspresionsplasmid som kan brukes ved fremstilling av Bf1- 29)- GluLvsArq- Af1- 21) ( =H6) : Isolasjon av restriksionsfragment inneholdende ekspresj onskasetten

Ekspresjonskasetten som er inneholdt i ekspresjonsplasmidet pYGAIC3 vist i fig. 1 i et BamHI restriksjonsfragment, ble isolert som følger: Ekspresjonsplasmidet ble inkubert med restriksjonsendonukleasen BamHI. Betingelsene var som følger: 20 \ ig plasmid, 50 enheter BamHI, lOOmM NaCl, 50mM Tris-HCl, pH 7,5, lOmM MgCl2og 1 mM DTT i et reaksjonsvolum på 100 Temperaturen var 37 °C og reaksjonstiden 2 timer. De to DNA- fragmenter ble adskilt på en 1% lavsmeltende agarose-gel og det ønskede fragment ble isolert ved standard prosedyrer.

Liaerina til vektoren M13mpl8

Det isolerte restriksjonsfragment ble ligert til bakterio-fagvektoren M13mpl8 spaltet med restriksjonsendonukleasen BamHI i den følgende reaksjonsblanding: fragment 0,2 ug, vektor 0,02 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, lOmM MGC12, 10 mM DTT og 1 mM ATP i et volum på 20 (il. 5 |il av denne blanding ble transformert i E. coli-stamme JM101 ved standard prosedyrer. Til stedeværelsen av fragment i vektoren samt orienteringen til fragmentet ble bestemt ved restriksjons-enzymkartlegging på dobbeltkjedet Ml3-DNA isolert fra transformantene.

Isolering av enkeltkjedet fss) DNA ( templat) :

Fra transformanten beskrevet ovenfor ble ss-DNA isolert i henhold til metoden beskrevet av Messing & Vieira i Gene, 19, 269-276 (1982). 5'- fosforvlering av mutageniseringsprimeren: Mutageniseringsprimeren ble fosforylert i 5'-ende i et 30lii reaksjonsvolum inneholdende 70mM Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM MGC12, 5 mM DTT, 1 mM ATP, 100 pmol oligonukleotid og 3,6 enheter av T4 polynukleotodkinase. Reaksjonen ble utført i 3 0 minutter ved 37°C. Derpå ble enzymet inaktivert ved å inkubere blandingen i 10 min. ved 65°C.

Tilknytning mellom templat og mutageniserin<g>sprimer: Tilknytning mellom templat og primer ble utført i et 10 jil volum inneholdende 0,5 pmol templat, 4 pmol primer, 2 0 mM tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl og 1 mM DTT ved å oppvarme til 65°C i 10 min. og derpå avkjøle til 0°C.

Forlengelses- Zligeringsreaksi on

Til reaksjonsblåndingen dannet ovenfor ble 10 pl av følgen-de blanding tilsatt: 0,3 mM dATP, 0,3 mM dCTP, 0,3 mM dGTP, 0,3 mM TTP, 1 mM ATP, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 3- enheter T4 DNA-ligase og 2,5 enheter av Klenow-polymerase.

Derpå ble reaksjonen utført i 16 timer ved 16°C.

Transformering av JM101:

Reaksjonsblandingen dannet ovenfor ble transformert i forskjellige fortynninger i CaCl2-behandlet E. coli JM101-celler ved å bruke standard teknikker og platet i 2 x YT toppagar på 2 x YT agarplater. (2 'x YT = trypton 16 g/l, gjærekstrakt 10 g/l, NaCl 5 g/l.) 2 x YT toppagar = 2 x YT med 0,4% agarose tilsatt og oppvarmet under trykk. 2 x YT agarplater = 2 x YT med 2% agar tilsatt og oppvarmet under trykk. Platene ble inkubert ved 37°C over natten.

Identifisering av positive kloner:

Den anvendte metode var plaque-lift-hybridisering som er beskrevet i det følgende: et nitrocellulosefilter ble plassert på en plate med en passende plaque-tetthet slik at filteret ble fuktet med væske fra platen. Filteret ble så badet i de følgende oppløsninger: 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH i 3 0 sek., 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0 i 1 min., 2 x SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M natriumcitrat) til senere tørking. Filteret ble så tørket på 3MM papir og bakt i minst 2 timer ved 80°C i en vakuumovn. 5 ' - 32P- merkinq av mutageniseringsprimeren: Mutageniseringsprimeren med sekvensen

51CAACAATACCTCTCTTTTCCTTTGGAGTG31 ble merket radioaktivt ved 5' -ende i et 50 \ il reaksjonsvolum inneholdende 70 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 10 pmol oligonukleotid og 50 pmol x-<32>P-ATP. Reagensene ble oppvarmet til37°C og reaksjonen ble startet ved tilsetning av 3,5enheter T4 polynukleotidkinase. Blandingen ble inkubert ved 37 °C i 30 min. og derpå ble enzymet inaktivert ved opp-varming til 100°C i 3 min.

Hybridiserin<g>med radioaktiv primer til

nitrocellulosefilteret:

De tørkede filtere ble prehybridisert i 2 timer ved 65°C i 50 ml av den følgende oppløsning: 0,9 M NaCl, 0,09 M

natrumcitrat, 0,2% bovin-serumalbumin, 0,2% Ficoll, 0,2% polyvinylpyrrolidon, 0,2% natriumdodecylsulfat (SDS) og 50|ig/ml lakse-sæd-DNA. Derpå ble en halvdel av den merkende reaksjonsblanding tilsatt som probe til 15 ml av fersk prehybridiseringsbuffer, og filteret ble badet deri over natten ved 37°C med forsiktig risting. Etter hybridisering ble filteret vasket ved 30°C 3 ganger hver i 15 min. i 0,3 M NaCl, 0,03 M natriumcitrat og autoradiografert. Etter vask i samme buffer ved 60°C og nok en autoradiografi, ble plaguer inneholdende DNA-sekvenser som var komplementære til mutageniseringsprimeren identifisert. Mutagenesefre-kvensen var 4 3%.

Rensing av dobbeltkiedet M13- fag- DNA:

Etter plating av en positiv klon og en annen identifisering av positive plaguer ved hybridisering, ble én av de positi ve kloner brukt for infeksjon av E. coli-stammen JM101. Omtrent IO<8>fager og 5 kolonier av JM101 ble dyrket i 5 timer i et 5 ml 2 x YT-medium. Derpå ble dobbeltkj edet sirkulært DNA renset fra celle-pelleten i henhold til metoden beskrevet av Birnboim & Doly, Nucleic Acid Res., 2, 1513 (1979) .

Isolering av et restriksionsfragment inneholdende en modifisert B- A- kiede:

DNA-preparatet (ca. 5 \ ig) isolert ovenfor ble fordøyet med 10 enheter av restriksjonsendonukleasen BamHI i 60 ul 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2og 1 mM DTT i 2 timer ved 37°C. DNA-produktene ble adskilt ved elektro-forese på en agarose-gel og det ønskede fragment ble renset fra gelen ved standard teknikk.

Ligering til gjærvektoren pAB24:

Det isolerte restriksjonsfragment ble ligert til gjærvektoren pAB24 vist i fig. 2 spaltet med restriksjonsendonukleasen BamHI i den følgende reaksjonsblanding: fragment 0,2 \ iq, vektor 0,02 ug, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP i et volum på 20 jxl. 5 \ il av denne reaksjonsblanding ble brukt for å transformere E. coli-stammen MC1061, hvori det modifiserte ekspresjonsplasmid ble identifisert og mangfoldiggjort. Plasmidet ble betegnet pYGAB-H6-A og hadde samme sekvens som pYGAIC3, bortsett fra det endrede området.

Transformasjon av gjær:

Transformasjonen av ekspresjonsplasmidet i gjærstammen Saccharomyces cerevisiae JC482ApepALeu eir<0>(a, his4, ura3, leu2, eir<0>) ble utført som beskrevet av H. Ito et al., J. Bact., Vol. 153, nr.l, 163-168 (1983). De transformerte celler ble platet på SC-ura-medium (0,7% gjærnitrogenbase, 2,0% glukose, 0,5% casaminosyrer, 2,0% agar) for utvelgelse av plasmidinneholdende celler.

Eksempel 2

Konstruksjon av et ekspresionsplasmid som kan brukes ved fremstilling av Bf1- 29)- LeuAspLysArq- Af1- 21) ( =H3)

Fremgangsmåten som ble brukt, var den samme som beskrevet i eks. 1, bortsett fra at mutageniseringsprimeren hadde sekvensen 5<1>CAACAATACCTCTCTTGTCCAACTTTGGAGTG3<1>og at vasketemperaturen etter hybridisering var 63°C. Det endelige plasmid ble betegnet pYGAB-H3-A og hadde samme sekvens som pYGAIC3, bortsett fra den modifiserte del.

Eksempel 3

Konstruksjon av et ekspresionsplasmid som kan brukes ved fremstilling av Bf1- 29)- AspLvsArg- Af1- 21) f=H5)

Fremgangsmåten som ble brukt, var den samme som beskrevet i eks. 1, bortsett fra at mutageniseringsprimeren hadde sekvensen 5'CAACAATACCTCTCTTGTCCTTTGGAGTG3<1>, og at vasketemperaturen etter hybridisering var 61°C. Det endelige plasmid ble betegnet pYGAB-H5-A og hadde samme sekvens som pYGAIC3, bortsett fra den modifiserte del.

Eksempel 4

Konstruksjon av et ekspresjonsplasmid som kan brukes ved fremstilling av Bf1- 29)- LeuGluLvsArg- Af1- 21) f=H8)

Fremgangsmåten som ble brukt var den samme som beskrevet i eks. l, bortsett fra at mutageniseringsprimeren hadde sekvensen 5'CAACAATACCTCTCTTTTCCAACTTTGGAGTG3<1>og at vasketemperaturen etter hybridisering var 63 "C. Det endelige plasmid ble betegnet pYGAB-H8-A og hadde samme sekvens som pYGAIC3, bortsett fra den modifiserte del.

Eksempel 5

Kultur av gjærstamme transformert med et ekspresionsplasmid som koder for insulin- forstadier i følge oppfinnelsen

Saccharomyces cerevisiaae-stammer transformert med de konstruerte plasmider ble brukt. Hver stamme ble dyrket på Petri-skåler inneholdende minimalt medium uten uracil i 48 timer ved 30 °C. 100 ml risteflasker inneholdende minimalt medium uten uracil + 5 g/l casaminosyrer + 10 g/l racsyre + 30 g/l glukose, pH 5,0 ble så inokulert med en enkel koloni fra Petri-skålen. Flaskene ble ristet i 72 timer ved 3 0 °C i en inkubator ved 180 rpm.

En tetthet tilsvarende ca. 5 g/l tørt cellemateriale ble erholdt.

Eksempel 6

Isolering av forstadium fra kultursupematanten

Etter sentrifugering ble 5 liter kultursupernatant sterili-sert ved filtrering og justert ved tilsetning av destillert vann og 5 M HCl til en konduktivitet på 8 ms og pH 4,5. Supernatanten ble så påført en kolonne (2,6x 6,7 cm) av Pharmacia "FFS Sepharose"<®>ekvilibrert med 10 bedvolumdeler buffer (50 mM eddiksyre i 50% etanol justert til pH 4,0 med NaOH). Supernatanten ble påført kolonnen ved en strømnings-hastighet på 5,3 ml/min. ved bruk av en pumpe og kolonnen ble vasket med 5 bedvolumdeler buffer. Etter vask av kolonnen ble insulin-forstadiet eluert med en lineær gradient av NaCl fra 0 til 350 mM i 30 bedvolumdeler av samme buffer ved en strømningshastighet på 25 ml pr. time og fraksjoner på 10 ml ble samlet opp. Fraksjoner inneholdende forstadium ble identifisert med UV-absorbanse og RP-HPLC-analyse og ble slått sammen. De sammenslåtte fraksjoner ble avsaltet på en kolonne av "Sephadex<11®>G25 justert med 1 M eddiksyre. Forstadiet ble så isolert ved frysetør-king.

Identifisering av isolerte insulin- forstadier

Prøver av de frysetørkede forstadier ble hydrolysert i 6 M HC1 ved 110"C i forseglede glassampuller og analysert for aminosyresammensetning ved bruk av en "LKB Alpha plus"-aminosyreanalysator. Prøver på insulin-forstadier ble også analysert ved aminosyresekvensering og et automatisk aminosyresekvenseringssystem (Applied Bio System Model 477A) med online HPLC-identifisering av aminosyrer.

Resultatene bekreftet at de forbindende peptider var i samsvar med de angitte sekvenser.

Fordøying av insulin- forstad. im med trypsin til des( B30)-insulin

Forstadiet ble oppløst til en konsentrasjon på 2 mg/ml i 50 mM Tris, 20% etanol justert til pH 10,0 med 1 M HC1. Reaksjonen ble startet ved tilsetning av 400 mg adskilt Sepharose-gel inneholdende 0,3 mg immobilisert trypsin. Reaksjonen ble utført ved 4°C ved forsiktig risting normalt i 12 timer. Reaksjonen ble stoppet ved filtrering av blandingen. Fermenteringsutbyttene uttrykket i prosent av utbytte av det nært relaterte kjente insulin-forstadium B(l-29)-Thr-Lys-Arg-A(l-21) er vist i den følgende tabell sammen med effektiviteten av fordøyingen av forstadier ifølge oppfinnelsen og dannelsen av biprodukter.

Fra ovenfor angitte tabell observeres det at ved konversjon av insulin-forstadiene ifølge oppfinnelsen, blir vesentlig høyere utbytter av des-(B3 0)-insulin erholdt ved enzymatisk fordøying enn tilfellet er med det nært beslektede kjente forstadium B(l-29)-Thr-Lys-Arg-A(l-21) . Videre uttrykkes de foretrukne insulin-forstadier i meget høyere utbytter i gjær.

Eksempel 7

Isolering av des( B30 )- insulin fra reaksjonsblanding

Reaksjonsblandingen ble filtrert og underkastet iso-elek-trisk fokusering og frysetørking.

50 mg frysetørket substans ble oppløst i 2 ml buffer (20 mM Tris, 7 M urea justert til pH 8,1 med 1 M NaOH) og påført en kolonne (1,6 x 2 0 cm) med Pharmacia "FFQ-Sepharose<M®>anionebytter justert med 10 kolonnevolumdeler buffer. Kolonnen ble så eluert med en lineær gradient av NaCl fra 0 til 50 mM NaCl i 10 kolonnevolumdeler av samme buffer med en strømningshastighet på 10 ml pr.time. Fraksjoner på 5 ml ble samlet opp. De positive fraksjoner ble identifisert med UV-absorbanse og RP-HPLC-analyse og ble slått sammen. Des-B(30)-insulin ble typisk erholdt i et utbytte på 75% etter en endelig avsaltning på en kolonne av "G25 Sephadex"<®>i 1 M eddiksyre og frysetørket.

Identiteten av forbindelsen ble bekreftet med aminosyre-analyse som beskrevet i eks. 6.

Mengden av insulin-forstadium og av des(B30)-insulin ble bestemt med RP-HPLC-analyse som beskrevet i B. S. Welinder/ F. H. Andresen: proceedings of the FDA-USP Workshop on Drugs and Reference Standards for Insulin, Somatotropins and Thyroid-axis Hormones. Bethesda, Maryland, May 19-21, 163-176 (1982).

Buffersystemet besto av en A-buffer (0,125 M ammoniuym-sulfat 22,5% (vol/vol) acetonitril justert til pH 4,0 med svovelsyre) og en B-buffer (0.125 M ammoniumsulfat 45% acetonitril justert til pH 4,0 med svovelsyre). Kolonnen var en Hibar Lichrisorp RP-18, 5\ i, 250 4 mm, som ble eluert med en strømningshastighet på 1,5 ml pr. minutt. Prøver inneholdende des(B30)-insulin ble eluert med et gradientsystem anbefalt av Welinder & Andresen (1982), mens prøver inneholdende insulin-forstadier ble eluert med en lineær gradient fra 0 til 35% B-buffer som økte 1% pr. minutt. Konsentrasjonen ble bestemt ved sammenligning med en standardoppløsning av det autentiske insulin-forstadium.

Claims (6)

1. Insulin-forstadium, karakterisert vedaminosyresekvensen

hvor B(l-29) er de første 29 aminosyreresiduer av B-kjeden av human insulin som starter fra N-terminalen, A(1-21) er de 21 aminosyreresiduer av A-kjeden av human insulin, X1er en peptidbinding eller Leu eller Asp, X2er Glu eller Asp og Y1og Y2er hver Lys eller Arg, hvor henholdsvis posisjonene A6 og All, A7 og B7 og A20 og B19 er forbundet via syovelbroer og om ønsket ett eller flere av aminosyreresiduene av kjedene (B(l-29) og A(1-21) er substituert med et annet aminosyreresiduum.

2. Insulin-forstadium ifølge krav 1,karakterisert vedformelen

3. Insulin-forstadium ifølge krav 1,karakterisert vedformelen

4. DNA-sekvens, karakterisert vedat den koder for et insulin-forstadium ifølge ethvert av kravene 1-3.

5. Replikerbar ekspresjonsvektor som koder for et insulin-forstadium med aminosyresekvensen B (1-29) -X1-X2-Y1-Y2-A(l-21), hvor de enkelte bestanddeler av aminosyresekvensen er som angitt i krav 1, karakterisert vedat ekspresjonsvektoren omfatter en DNA-sekvens ifølge krav 4 fusert til andre DNA-sekvenser som koder for et signalpeptid som er funksjonelt i gjær, i kombinasjon med transkripsjons- og translasjons-regulerende sekvenser som muliggjør ekspresjon og sekresjon i en egnet vertscelle.

6. Vertsceller, karakterisert vedat de er gjærceller transformert med ekspresjonsvektorene ifølge krav 5.