JPH03505206A - プロペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 プロペプチド 挟Ｊし九野 この発明は新規なプロペプチドに関する。さらに詳しくはこの発明は、ヒトイン シュリンもしくは固有の持続作用もしくは加速作用を示すインシュリン類の製造 に用いることができる新規なインシュリン前駆物質に関する。さらに、この発明 は、前記のインシュリン前駆物質をコードするＤＮＡ配列と、これら前記物質の 製造方法、ならびにヒトのインシュリンもしくはインシュリン類似体の製造法に 関する。

１１Ｊ口支歪 重篤もしくは慢性の症例の糖尿病は、通常、ブタインシュリン、ウシインシュリ ンまたはヒトインシュリンのようなインシュリンを含有する注射製剤で治療され る。

ヒトインシュリンの各種の生合成法がいくつか知られている。これらの方法のす べてについて共通なのは、全プロインシュリン、その修飾形、またはそのＡとＢ のチェーンをコードするＤＮＡをストランドを別個に、適切なプロモーターを有 する複製可能なプラスミドに挿入することである。上記の系を所定の宿主微生物 に形質転換させることによって、それ自体公知の方法で標準のヒトインシュリン に転換できる生成００物を生産させることができる（例えばヨーロッパ特許Ｂｌ 　　８５，０８３号もしくは同Ｂｌ　　８８．１１７号参照）。

プロインシュリンまたは類似のインシュリン前駆物質を生合成してインシュリン に変換する公知の方法のい（つかを以下に述べる。

プロインシュリンは、ヨーロッパ特許願１２１，８４５号の明細書に開示されて いる方法を用いることによって生合成することができる。この方法では、プロイ ンシュリンをコードする遺伝子を酵母菌株に挿入し、このように形質転換された 酵母菌株を培養した後、プロインシュリンを培地から単離することができる。つ いでプロインシュリンはそれ自体公知の方法でインシュリンに変換することがで きる。しかし、この方法で得られるプロインシュリンの収率は、商業的生産とし ては低く不満足なものである。

式Ｂ−Ｘ−Ａ　（式中ＢとＡはそれぞれヒトインシュリンのＢとＡのチェーンを 示す、およびＸは少なくとも２つのアミノ酸残基、好ましくは６〜３５のアミノ 酸残基からなるポリペプチドを示す）で表わされるインシュリン前駆物質が、デ ンマーク特許願５，２８４／８７号の明細書によって知られている。この前駆物 質は、ある種の金属イオンの存在下、トリプシンとカルボキシペプチダーゼＢで 処理することによって、酵素的に消化してヒトインシュリンにすることができる 。

ヨーロッパ特許願１９５．６９１号には、式Ｂ−Ｘ−Ｙ−Ａ（式中、ＢとＡはそ れぞれヒトインシュリンのＢとＡのチェーンを示し、これらのチェーンはヒトイ ンシュリンの場合と同様に硫黄ブリッジで架橋されている、ＸとＹは各々リシン もしくはアルギニンの残基な示す）で表わされる密接に関連するインシュリン前 駆物質類、並びにこれら前記前駆物質の製造について開示している。これらの前 駆物質は、トリプシンとカルボキシペプチダーゼＢで処理することによって酵素 的に消化してヒトインシュリンとすることができる。さらに前記前駆物質は、ト リプシンによって消化して、デスーＢ３０−インシュリンにすることができるが 、かなりの量のＡ　ｏ　Ａ　ｒ　ｇ−デス（Ｂ２Ｏ）−インシュリンが生成し、 これはご（ゆっくりとさらに消化される。　この発明の目的は、酵母内に高収率 で生成され、さらに望ましくない副生物の生成を最小限にしてヒトインシュリン もしくはインシュリン類似体に変換することができる新規なインシュリン前駆物 質を提供することである。

この発明のインシュリン前駆物質は、下記アミノ酸配列を特徴とするものである 。　すなわち、式：Ｂ（１−２９）　−Ｘ　＋　　Ｘ　＊　−Ｙ　ｚ　−Ｙ　＋ 　−Ａ　（１−２１）〔式中、Ｂ　（１−２９）は、Ｎ−末端から始まる、ヒト インシュリンのＢチェーンの２９個の第１アミノ酸残基である。Ａ　（１−２１ ）は、ヒトインシュリンＡチェーンの２１個のアミノ酸残基である　Ｘ　、は１ つのペプチド結合もしくは１つ以上の任意のアミノ酸残基な示す、Ｘ２はＧＩＵ もしくはＡｓｐを示す、およびＹ、とＹ２は各々ＬｙｓもしくはＡｒｇを示す、 Ａ６とＡｌｌ、Ａ７とＢ７、およびＡ２０と８１９の位置はそれぞれ硫黄ブリッ ジを通じて連結され、所望により、Ｂ　（１−２９）チェーンとＡ（１−２］） チェーンのアミノ酸残基の１つ以上が他のアミノ酸残基で置換される〕で表わさ れるアミノ酸配列である。

この発明は、上記のインシュリン前駆物質が、ヨーロッパ特許願１２１，８８４ 号によって公知の化合物Ｂ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａと比べて著しく高い収率で生成 し、またはこれらの前駆物資がトリプシンで消化されると、デス−Ｂ（３０）− インシュリンが好収率で得られ、しかもＡ、−Ａｒｇ−デス−Ｂ　（３０）−イ ンシュリンとＡｏ　−Ｌｙｓ−デスーＢ　（Ｂｏ）−インシュリンが全く生成し ないかまたは殆ど生成しない。

Ｘｌは１つのペプチド結合もしくは１つのアミノ酸残基を示すものが好ましい。

この発明の好ましい前駆物質は、式Ｂ　（１−２９）−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ −Ａ　（１−２１）と式Ｂ　（１−２９）−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ　（１ −２１）で表わされる。

デス−Ｂ（３０）’−インシュリンは、それ自体公知の酵素触媒生合成法で例え ばヒトインシュリンに変換することができる。

またこれらの前駆物質は、米国特許４，３４３，８９８号の明細書に記載されて いるようなペプチド転移法でヒトインシュリンに変換することもできる。

Ｂ　（１−２９）チェーンとＡ（１−２１）チェーンの１つ以上のアミノ酸残基 が他のアミノ酸残基によって置換されているインシュリンとしては、例えば、持 続作用を示すインシュリン誘導体があり、国際特許願ＷＯ８６１０５４９７号の 明細書に開示されている。遅延作用を示す前記インシュリン誘導体においては、 Ａ４、Ａ１７、Ｂ１３およびＢ２１の位置のアミノ酸残基の１つ以上が、例えば アルキルエステルもしくはアミドのような電荷なしの側鎖を有するアミノ酸残基 で置換されている。この発明の方法で製造できる別のインシュリン類似体は、ヨ ーロッパ特許願１９４゜８６４号と同２１４，８２６号に記載されているような インシュリンである。

この発明のインシュリン前駆物質は、この発明のインシュリン前駆物質をコード するＤ　Ｎ　Ａ配列を、適切な発現系、好ましくは酵母発現系内で発現させるこ とによって製造することができる。

この発明のインシュリン前駆物質をコードするＤＮＡ配列は、インシュリン前駆 物質Ｂ　（１−３０）　−Ｌ　ｙ　ｓ　＝　Ａｒｇ−Ａ　（１−２１）をコード するＤＮＡ配列から生体外突然変異誘発法で製造するか、または、全ＤＮＡ配列 のオリゴヌクレオチド合成法で製造することができる。

またこの発明は、前記式で表わされる・インシュリン前駆物質をコードするＤＮ Ａ配列からなる複製可能な発現ビークルで形質転換された酵母菌株を適切な培地 内で培養し、生成した前駆物質を任意に単離した後、トリプシンで消化すること によってデス−（３０）インシュリンに変換するこの発明はさらに、前記式で表 わされるインシュリン前駆物質をコードするＤＮＡ配列からなる複製可能な発現 ビークルで形質転換された酵母菌株を適切な培地内で培養し、その結果生成され た前駆物質を公知の手段でヒトインシュリンもしくはインシュリン類似体に変換 する方法による、ヒトインシュリンもしくはインシュリン類似体の製造法に関す る。

培地に分泌させるために、インシュリン前駆物質をコードするＤＮＡ配列を、酵 母中で機能をするシグナルペプチドをコードする他のＤＮＡ配列を融合させるこ とができる、分泌は、酵母のＭＦａｌ−リーダー配列ＣＫｕｒｊａｎ　＆　）ｌ ｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、　Ｃｅ１ｌ、　３０巻、９３３〜９４３頁、１９８２年） もしくはその一部を発現ビークルに挿入することによって達成できる。二塩基部 位ＬｙｓＡｒｇを含むが、酵母プロテアーゼＤＰＡＰ　（ジペプチジルアミノペ プチダーゼ）に対する基質であるＧｌ　ｕ−Ａｌ　ａ−Ｇｌ　ｕ−Ａｌ　ａを除 外した全ＭＦα１−リーダー配列をコードするＤＮＡ配列を使う構築法が好まし い、このような方法で、適切なＮ−末端を有するインシュリン前駆物質が有効に 分泌される。その外の適切なリーダー配列は国際特許願ＷＯ８９１０２４６３号 に記載されている合成酵母のリーダーペプチドである。

所望のＤＮＡ配列の発現は、発現されるＤＮＡ配列に対して適切に位置している 、転写のためのプロモーターでありＨ（グリセルアルデヒド−３−ホスファ−ト ープヒドロゲナーゼ）プロモーターが用いられる。転写のターミネータ−として は、ＭＦａｌ−遺伝子のターミネータ−配列が使われる。

この発明を以下の図面を参照してさらに説明する。

第１図はプラスミドｐＹＧＡＩ　Ｃ３を示し、第２図は酵母ベクターｐＡＢ２４ を示す。

以下に述べる実施例によってこの発明をさらに説明する１、　　　シグナル、　 ゛・・シグナルおよび仁ム２土ｉＺ工ＩＢ−ＬｓＡｒ−ＡをコードするＤＮＡ　 １の１日第１図に示すプラスミドｐＹＧＡＩＣ３のＢａｍＨＩ制限断片に入って いる発現カセットは、１１１２塩基対の長さであり、次のものをＣ５°末端から 出発して順に１必須に含有している。すなわち、ＧＡＰＤＨプロモーター（Ｔｒ ａｕｉｓら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２６０巻、４３８４−４３８９頁、 １９８５年）と、これに続＜　Ｋｕｒｊ　ａｎ＆Ｈｅｒｓｋｏｗｉ　ｔｚが発表 した野生型酵母のＤＮＡ配列（前記文献）でコードされるＭ　Ｆ　ａ　１−リー ダー配列の８３個のＮ−末端アミノ酸と、これに続＜ＬｙｓとＡｒｇをコードす る２つのコドンＡＡＡとＡＧＡと、さらにこれに続く、好ましい酵母のコドンを 用いて合成して構築した遺伝子である、Ｂ　（１−３０）−ＬｙｓＡｒｇ−Ａ（ １−２１）のコーディング領域である。２つの終止コドンの後に５ａｌＩ制限部 位が位置し、配列の残りの部分は、ターミネータ−領域を含むＭＦａｌ−配列で 構成されている。その発現カセットは標準の方法を用いて構築される２、−′パ シグナルと　立インシュリンプ　　　　コードＬ立笠ＡＩ−肚立１１ この発明のインシュリン前駆物質をコードするＤＮＡ配列は、上記の発現カセッ トから構築した。使用した方法は、ＺｏｌｌｅｒとＳｍ１ｔｈ、ＤＮＡ、第３者 、第６号、４７９−４８８頁、１９８４年に記載されている“特定部位の生体外 での突然変異誘発法”である、この方法については以下に概要を述べ実施例１で 詳細に述べる０発現プラスミドから単離されたインシュリン前駆物質配列が一本 鎖で環状のＭ１３バクテリオファージベクター内に、挿入される。得られた一本 鎖ベクターに、化学的合成された相補的Ｄ　Ｎ　Ａ　鎖がアニールされる。得ら れたＤ　Ｎ　Ａ　ＳＲは、前記の環状ＤＮＡのインシュリン配列に対し完全に相 同性の配列にかこまれた所望の配列を含有している。生体外で、次にブライマー が、クレノウボリメラーゼを生化学的に使って、環状ゲノムの全長に延長される 。このようにして二本鎖分子が得られ、そのうちの一本のストランドが所望の配 列をもっている。このストランドは、イー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ）中で増殖す る一本鎖ファージを生成する。このようにして所望の配列をもった２本鎖ＤＮＡ が得られる。この２本鎖ＤＮＡから制限断片を単離し、発現ベクターに再挿入す ることができる。どのようにして、製造に用いたブライマーとともに以下に示す インシュリン前駆物質の配列が構築された。

Ｈ３：　Ｂ（１−２９）−ＬｅｕＡｓｐＬｙｓＡｒｇ−Ａ（１−２１）５°ＣＡ ＡＣＡＡＴＡＣＣＴＣＴＣＴＴＧＴＣＣＡＡＣＴＴＴＧＧＡＧＴＧ３　’Ｈ５： 　Ｂ（１−２９）−ＡｓｐＬｙｓＡｒｇ−Ａ（１−２１）５　’　ＣＡＡＣＡＡ ＴＡＣＣＴＣＴＣＴＴＧＴＣＣＴＴＴＧＧＡＧＴＧ３゜Ｈ６：　Ｂ（１−２９） −ＧｌｕＬｙｓＡｒｇ−Ａ（１−２１）５°ＣＡＡＣＡＡＴＡＣＣＴＣＴＣＴＴ ＴＴＣＣＴＴＴＧＧＡＧＴＧ３゜Ｈ８：　Ｂ（１−２９）−ＬｅｕＧｌｕＬｙｓ Ａｒｇ−Ａ（１−２１）５　’ＣＡＡＣＡＡＴＡＣＣＴＣＴＣＴＴＴＴＣＣＡＡ ＣＴＴＴＧＧＡＧＴＧ３゜夫Ｍ インシュリン前駆物質のＢチェーンとＡチェーンとの間の領域は、生体外の突然 変異誘発法、すなわちＺｏｌｌｅｒとＳｍ１ｔｈ、ＤＮＡ、第３巻、第６号、４ ７９−４８８頁、１９８４年に記載されている原理で修飾することができる。こ の実施例では、ＺｏｌｌｅｒとＳｍ１ｔｈのプロトコールをわずかに変形した方 法を用いている。

見立上ユ Ｂ　　１−２９　−ＧｌｕＬ　　ｓＡｒ　　−Ａ　　ｌ−２１＝Ｈ６の°′告に 　いることができる−　ブラストの↑築カセットの　った１　　　の 第１図に示す発現プラスミドｐＹＧＩＣ３のＢａｍＨＩ制限断片に含まれている 発現カセットは、次のようにして単離される。

発現プラスミドを制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩとともに培養した。培養条 件は次のとおりである。すなわち１００ｕｌの反応容積中、２０μｇのプラスミ ド、５０単位のＢａｍＨＩ、１００ｍＭＮａＣＬ、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝 液（ｐＨ７，５）　、１０ｍＭＭｇＣ１ｔおよびｌ　ｍ　Ｍ　Ｄ　Ｔ　Ｔを含有 する条件であった。温度は３７℃で反応時間は２ｈｒであった。２つのＤＮＡ断 片を１％の低融点アガロースゲル上で分離し、所望の断片を標準の方法で単離し た。

ベクターＭ１３ｍ１８への１１ 単離した制限断片を、下記反応混合物：断片０．２μｇ、ベクター０．０２ｕｇ 、５０ｍＭ）リス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，４）、１０ｍＭＭｇＣ１＊　、１０ ｍＭＤＴＴおよび１　ｍ　Ｍ　Ａ　Ｔ　Ｐを２０μ℃の容積に含有する反応混合 物中で、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩによって切断されたバクテリオファ ージベクターＭ１３ｍｐ１８に連結した。この混合物の５μ℃を、標準法によっ てイー・コリ菌株ＪＭＩＯＩに形質転換した。ベクター中に断片が存在すること とその断片の配向は、形質転換細胞から単離された２本！ＩＭ１３−ＤＮＡの制 限酵素地図を作製することによって決定された。

−ＳＳ　　ＤＮＡ　　！刑　の ＭｅｓｓｉｎｇとＶｉｅｉｒａ、Ｇｅｎｅ、１９巻、２６９−２７６頁、１９８ ２年に記載された方法によって、５Ｓ−ＤＮＡが上記の形質転換細胞から単離さ れた。

、・・　−ブライマーの苧°　Ｉリン 突然変異誘発プライマーを、７０ｍＭトリスＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，０）　、　 １０ｍＭＭｇＣ１ｘ　、５ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＡＴＰ、１００１００ｐのオリゴ ヌクレオチドおよび３．６単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含有する３０ μρの反応容積内で５゛−末端をリン酸化した。この反応を３７℃で３０分間行 った。次に混合物を６５℃で１０分間保温することによって酵素を不活性化させ た。

飛と　然・　　　ブライマーのアニーリング鋳型とブライマーのアニーリングを 、０．５μｍｏｌの鋳型、４μｍｏｌブライマー、２０　ｍ　Ｍ　トリスＨＣｌ 緩衝液（ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭｇＣ１ｇ、５０ｍＭＮａＣ１および１ｍＭＤ ＴＴを含有する１０μρ容積中で、６５℃に１０分間加熱し、次いで０℃にまで 冷却することによって行った。

１ｌＺ１旦返ｌ 生成した上記の反応混合物に、１０μ℃の下記混合物＝０．３ｍＭｄＡＴＰ、０ ．３ｍＭｄＣＴＰ、０．３ｍＭｄＧＴＰ、０．３ｍＭＴＴＰ、１ｍＭＡＴＰ、２ ０ｍＭ）リス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭｇＣ１ｚ、１０ｍＭＤ ＴＴ、３単位のＴ４ＤＮＡリガーゼおよび２゜５単位のクレノウボリメラーゼか らなる混合物を加えた。

次いで、反応を１６℃で１６ｈｒ行った。

ＪＭＩＯＩの多 生成した上記の反応混合物を、種々の稀釈度で、標準の方法を用いて、Ｃａ　Ｃ １ｚで処理したイー・コリＪＭＩＯ１細胞に形質して、２ｘＹＴ寒天プレート上 の２ｘＹＴ）ツブ寒天に、プレートした（２ｘＹＴ＝）−リブトン１６ｇ／ρ、 酵母エキス１０ｇ／ｎ、ＮａＣ１５ｇ／ｊ２）、２ｘＹＴトツプ寒天は、０．４ ％アガロースを加えて加圧下で加熱された２ｘＹＴである＊　２　ｘ　Ｙ　Ｔ寒 天プレートは２％寒天を加えて加圧下で加熱された２ｘＹＴである。プレートを ３７℃で一夜培養した。

のクローンの四 利用した方法は、下記のブラークーリフトハイブリッド法である。すなわちニト ロセルローズのフィルターを適当なプラーク密度を有するプレートの上にのせて 、上記フィルターをプレートからの液体でぬらした。そのフィルターを以下の溶 液に浸漬した。すなわち、１．５ＭＮａＣ１，０，５ＭＮａＯＨに３０秒間、１ ．５ＭＮａＣ１，０，５Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８，０）に１分間９，２ ＸＳＳＣ（０，３ＭＮａＣ１，０，０３Ｍクエン酸ナトリウム）に後で乾燥する まで浸漬した。

次にフィルターを３ＭＭ紙上で乾燥し、真空オーブン中で８０℃に少なくとも２ ｈｒベークした。

然′・　ｔ　ブライマーの５′−〇　の　・　・（配列＝５°ＣＡＡＣＡＡＴＡ ＣＣＴＣＴＣＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＧＡＧＴＧ３°を有する突然変異誘発ブライ マーを、７０ｍＭ）リスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，５）、　　ｌｏｍＭＭｇｃｌｔ 　　、　５ｍＭＤＴＴ、　　１０ｐｍｏ　１オリゴヌクレオチドおよび５０ｐｍ ｏｌγ、＋　”ｐ−ＡＴＰを含有する５ｅｕ２反応容積中で、５°末端に放射能 の標識を付けた。試薬を３７℃に加熱し、次に３．５単位のＴ４ポリヌクレオチ ドキナーゼを添加することによって反応を開始させた。得られた混合物を３７℃ で３０分間培養し、次に１００℃で３分間加熱することによって酵素を不活性化 した。

・　ブライマーによるニトロセルロースフ　ルターへのハイブリラドン 上記の乾燥したフィルターに、０．９ＭＮａＣ１，０゜０９Ｍクエン酸ナトリウ ム、０．２％ウシ−血清アルブミン、０．２％フィコル（Ｆｉｃｏｌｌ）、０． ２％ポリビニルピロリドン、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および ５０μｇ／ｍρのサケ精液ＤＮＡを含有する溶液の５０ｍρ中で、６５℃にて２ ｈｒ予備ハイブリツド形成を行った。次に標識反応混合物の展を、プローブとし て、新しい予備ハイブリッド形成緩衝液１５ｍｊ２に添加し、次にそのフィルタ ーをこれに３７℃−夜、ゆるやかに振盪しながら浸漬した。ハイブリッド形成を 行った後、フィルターを、３０℃にて、３回各々１５分間づつ、０．３ＭＮａｃ ｌと０．０３Ｍクエン酸ナトリウム中で洗浄し、次にオートラジオグラフにかけ た。同じ緩衝液中で６０℃にて洗浄した後、別のオートラジオグラフィーにかけ て、突然変異誘発ブライマーに対して相補的なりＮＡ配列を含有するプラークを 固定した。突然変異誘発の頻度は４３％であ正のクローンをプレートし、ハイブ リッド形成によって正のプラークの別の同定を行った後、正のクローンの１つを イー・コリー菌株ＪＭＩＯＩの感染に用いた。約１０８のファージと５コロニー のＪＭＩＯＩが、５ｍｊ２の２ｘＹＴ培地中に５ｈｒで生成した。次に、２本鎖 の環状ＤＮＡを、ＢｉｒｎｂｏｉｍとＤｏｌｙ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ、　Ａｃ１ｄ ｓ　Ｒｅｓ、　２巻、１５１３頁１９７９年に記載の方法にしたがって、細胞ペ レットから精製した。

冬介Ｂ−Ａ−リンク　　　　る１　　　の先に単離されたＤＮＡ製剤（約５μｇ ）を、１００ｍＭＮａＣｌ、５０　ｍ　Ｍ　トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７，５ ）、１０　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　ｚおよびｉｍＭＤＴＴを含有する６０μ℃に １０単位の制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩを添加したもので、３４℃にて２ ｈｒ消化した。ＤＮＡ生成物を、アガロースゲルの電気泳動法で分離し、所望の 断片を標準の方法でゲルから精製した。

、ベクター　ＡＢ２４へのｒ 単離した制限断片を、下記反応混合物、すなわち断片０．２ｕｇ、ベクター０． ０２μｇ、５０ｍＭ）リスーＨＣ１緩衝液（ｐＨ７，４）　、１０ｍＭｇＣ１ｇ 　、１０ｍＭＤＴＴ、１　ｍ　Ｍ　Ａ　Ｔ　Ｐを含有する２０μ℃容積の混合物 中で、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩで切断された第２図に示す酵母ベクタ ーｐＡＢ２４に連結した。この反応混合物の５μβをイー・コリ菌株ＭＣ１０６ １を形質転換するのに用いたが、この菌株中には修飾発現ブラストが固定され増 殖した。このプラスミドはｐＹＧＡＢ−Ｈ６−Ａと命名され変化した領域を除い てｐＹＧＩ　Ｃ３と同じ配列を有している。

醒ｊμλ形」Ｕｉ圭 発現プラスミドの、酵母菌株サツカロミセス・セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ｊ　Ｃ４８２△ｐｅｐ△Ｌｅｕ　　ｃｉｒ ’　　（ａ、ｈｉｓ４、ｕｒａ３，１ｅｕ２、Ｃ１ｒ０）への形質転換を、Ｈ， Ｉｔｏら、Ｊ、Ｂａｃｔ。

％　１５３巻、１号、１６３−１６８頁、１９８３年に記載されているようにし て行った。　形質転換された細胞を、５Ｃ−ｕｒａ培地（０，７％Ｙｅａｓｔ　 Ｎｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ、　２　、０％グルコース、０．５％カザミノ酸、 ２．０％寒天）上にプレートしてプラスミドを含有する細胞を選択した。

１五■ユ Ｂ　（１−２９−ＬｅｕＡｓ　　Ｌ　　ｓＡｒ　　−Ａ　（１−２１）（＝Ｈ３ の°′告に　いることができる　　７５２区二立１１ 利用した方法は、突然変異誘発ブライマーが配列５　’　ＣＡＡＣＡＡＴＡＣＣ ＴＣＴＣＴＴＧＴＣＣＡＡＣＴＴＴＧＧＡＧＴＧ３°を有することとハイブリッ ド形成後の洗浄温度が６３℃であることを除いて実施例１に記載しであるのと同 じ方法であった。最後のプラスミドをｐＹＧＡＢ−Ｈ３−Ａと命名したが、修飾 部分を除いて、ｐＹＧＡＩＣ３と同じ配列をもっていた。

支血ｌユ Ｂ　　１−２９　−Ａｓ　　Ｌ　　ｓＡｒ　　−Ａ工に２土工」＝８５　　のパ 告に　いることができる　　プラスミドの築 利用した方法は、突然変異誘発ブライマーが配列５°ＣＡＡＣＡＡＴＡＣＣＴＣ ＴＣＴＴＧＴＣＣＴＴＴＧＧＡＧＴＧ３°を有し、ハイブリッド形成後の洗浄温 度が６１℃であることを除いて実施例１に記載しであるのと同じ方法であった。

最後のプラスミドをｐｙＧＡＢ−Ｈ５−Ａと命名したが、修飾部分を除いて、ｐ ｙＧＡ　Ｉ　Ｃ３と同じ配置をもっている。

！五■１ Ｂ　　１−２９　−ＬｅｕＧｌｕＡｒ　　−Ａ　　１−２１＝８８　　の　告に 　いることができるー　プラスミドの利用した方法は、突然変異誘発ブライマー が配列５°ＣＡＡＣＡＡＴＡＣＣＴＣＴＣＴＴＴＴＣＣＡＡＣＴＴＴＧＧＡＧＴ Ｇ３°有し、ハイブリッド形成後の洗浄温度が６３℃でることを除いて実施例１ に記載しであるのと同じ方法でった。最後のプラスミドはｐＹＧＡＢ−Ｈ８−Ａ と命名され、修飾部分を除いてｐＹＧＡ　Ｉ　Ｃ３と同じ配列をもっている。

夾ｍ互 この　日のインシュリン１　　　　コード　る　　プラスミドでシ　　　された 　　　　の’Ｕ構築されたプラスミド形質転換されたサツカロミセス・セレビシ ェ菌株を使用した。

各菌株をウラシルを除いた最小培地を含有するベトリ板上で、３０℃にて４８ｈ ｒ培養した。ウラシルなしで５ｇ／氾カザミノ酸＋ｌｏｇ／氾のコハク酸＋３０ 　ｇ　／　Ａグルコース、ｐＨ＝５．０を含有する最小培地の入った１００ｍ℃ 振盪ビンをペトリ皿から得た単一のコロニーとともに培養した。これらのビンは 、インキュベーター内で、１８０ｒｐｍ、３０℃にて７２時間振盪した。約５　 ｇ　／　１２の細胞乾燥物に相当する密度が得られた。

支立土玉 す１　　の　ゝみ′か　の寸　　　の 遠心分離した後、５ρの培地物上澄み液を濾過によって滅菌し、蒸留水と５ＭＨ Ｃｌを添加して、電導率を８ｍｓにｐＨを４．５に調整した０次に、その上澄み 液を、１０カラム体積の緩衝液（５０ｍＭの酢駿を含有する５０％エタノールを ＮａＯＨでｐＨ４，０に調整したもの）で平衡化したＰｈａｒｍａｃｉａ社の“ Ｆ　Ｆ　Ｓ　　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　”　　（登録商標）のカラム（２，６Ｘ６ ．７ｃｍ）に注入した。上澄み液は、ポンプを用いて５．３ｍＡ／ｍｉｎの流速 でカラムに流入し、次に５力ラム体積の緩衝液で洗浄した。カラムの洗浄後、３ ０力ラム体積の同じ緩衝液による０から３５０ｍＭへのＮａＣＬの直線勾配液を 用いて２５ｍβ／　ｈ　ｒの流速でインシュリン前駆物質が溶出され、ｌ　０ｒ ｎＪ２づつの画分を収集した。前駆物質を含有する画分な、紫外光の吸光度とＲ Ｐ−ＨＰＬＣ分析法で固定して、集めた。集めた画分を、１Ｍ酢酸で調整したセ ファデックスＧ２５のカラムで脱塩した８次に前駆物質を凍結乾燥によって単離 した凍結乾燥された前駆物質の試料を、密封ガラスアンプル中で１１０℃にて６ ＭＨＣｌで加水分解し、“ＬＫＢ　　Ａｌｐｈａ　　ｐｌｕｓ″アミノ酸分析器 を用いてアミノ酸組成を分析した。インシュリン前駆物質の試料も、アミノ酸の オンラインＨＰＬＣ固定を行うことにより、自動アミノ酸配列決定装置（Ａｐｐ ｌｉｅｄ　ＢＬｏ　５ｙｓｔｅｏ＋　　モデル４７７Ａ）でアミノ酸配列を決定 することによって分析することができる。

その結果から、接続しているペプチドが前述の配列にしたがっていることが確認 された。

インシュリン並　　　のトリプシンによるデス（Ｂ　３０インシユリンへの２ 前駆物質を、５０ｍＭトリス、ＩＭＭＣＩでｐＨ１０゜０に調整された２０％エ タノール中に２　ｍ　ｇ　／　ｍΩの濃度に溶解した。反応は、０．０３ｍｇの 固定化されたトリプシンを含有する４００ｍｇの脱水したセファロースゲルを添 加することによって開始された。反応は、４℃でゆるやかに撹拌しながら通常に １２ｈｒ実施した。反応は混合物を濾過することによって停止させた。密接に関 連した公知のインシュリン前駆物質Ｂ　（１−２９）−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ −Ａ　（１−２１）の収率の百分率で表わした醗酵収率な、この発明の前駆物質 の消化の効率と副生物の生成量とともに下記表に示す。

表 ＡｏＡｒｇ−デス− Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−（Ｂ−３０）イン Ｂ（１−２９）　　とＡｆｌ−Ａｒｇの収率　前駆物質の　シュリンま２１）の 間の接続　の百分率で　消化の収率　たはＡｏＬｙｓ−ペプチド　　　　　示す 醗酵　　（％）　　デス−（Ｂ２Ｏ）収率　　　　　　　　　　インシュリ ン前駆物質 Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ　　　　　　１００　　　　　７０　　　２７％Ｌｅｕ −Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ　　　６４　　　　　　８４　　　〜０Ｌｅｕ−Ａｓ ｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ　　　５３　　　　　　８０　　　〜　ＯＬｅｕ−Ｇｌｕ− Ｌｙｓ−Ａｒｇ　　　６４　　　　　　７６　　　〜ＯＡｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ 　　　　　　１６６　　　　　７７　　　〜ＯＧｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ　　　　 　２８６　　　　　７８　　　〜１０上記の表から、この発明のインシュリン前 駆物質の変換によって、密接に関連した公知の前駆物質Ｂ（１−，２９）−Ｔｈ ｒ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ　（１−２１）の場合よりも、酵素による消化によりて かなり高い収率でデス−（Ｂ２Ｏ）インシュリンが得られることは明らかである 。さらに、好ましいインシュリン前駆物質が、酵母内で一層高し）効率で発現さ れている。

良１土ユ ｆ２ユ上ユ」　−インシュリンの、　　、′Ａ　か　の反応混合物を濾過し、等 電点沈澱法にかけて凍結乾燥した。

５０ｍｇの凍結乾燥した物質を２ｍρの緩衝液（２０ｍＭトリス、ＩＭ尿票、Ｉ ＭのＮａＯＨでｐＨ８，１に調節）に溶解し、ｌＯカラム容積の緩衝液で調整し たＰｈａｒｍａｃｉａ社”　Ｆ　Ｆ　Ｑ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅ”　（登録商標 ）アニオン交換体のカラム（１，６ｘ２０ｃｍ）に注入した１次にこのカラムを 、１０カラム容積の同じ緩衝液によるＯから５０　ｍ　ＭまでのＮａＣＬ直線勾 直線勾配−てｌ　Ｏｍ　１２　／　ｈ　ｒの流速で溶離させた。５ｍｌづつの画 分を集めた。正の画分な紫外線吸光度とＲＰ−ＨＰＬＣ分析法で固定し２てプー ルした。デス−Ｂ（３０）−インシュリンは、一般に１Ｍ酢酸で調整した“Ｇ　 ２５５ｅｐｈａｄｅｘ”　（登録商標）のカラムで最後の脱塩を行い凍結乾燥し て７５％の収率で得られた。

得られた化合物の同一性は、実施例６に記載されているアミノ酸分析法によって 確認した。

インシュリン前駆物質とデス（Ｂ２Ｏ）インシュリンの量は、Ｂ、Ｓ、Ｗｅｌｉ ｎｄｅｒ／Ｆ、Ｈ，Ａｎｄｒｅｓｅｎ　：　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔ ｈｅＦＤＡＵＳＰ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ｏｎ　Ｄｒｕｇｓ　ａｎｄ　Ｒｅｆｅｒ ｅｎｃｅ　５ｔａｎｄａｒｄｓ　ｆ。

ｒ　Ｉｎ５ｕｌｉｎ、　Ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｉｎｓ　ａｎｄ　Ｔｈｙｒｏｉｄ ａｘｉｓ　Ｈｏｒｍｏｎｅｓ。

Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ、　　５月１９〜２１日、１６３−１７ ６頁、１９８２年に記載されているＲＰ−ＨＰＬＣ分析法で測定した。

緩衝液系は、Ａ緩衝液（０，１２５Ｍ硫酸アンモニウム２２．５％　（Ｖ／Ｖ） ７セトニトリル、硫酸でｐＨ４，０に調整）とＢ緩衝液（０，１２５Ｍ硫酸アン モニウム４５％アセトニトリル、硫酸でｐＨ４，０に調整）とで構成されている 。カラムＨｉｂａｒ　ＬｉｃｈｒｏｓｏｒｐＲＰ　−１８，５μ、２５０Ｘ４ｍ ｍであり、１．５ｍρ／　ｍ　ｉ　ｎの流速で溶離した。デス（Ｂ２Ｏ）インシ ュリンを含有する試料は、ＷｅｌｉｎｄｅｒとＡｎｄｒｅｓｅｎが推奨する勾配 系（１９８２年）で溶離した。一方インシュリン前駆物質を含有する試料は、１ 分間の直線勾配液で溶離した。濃度は、基準のインシュリン前駆物質の標＄溶液 と比較して測定した。

Ｆｉｇ−１ アラスミド充図：　　ＰＶ（ｊａ１ｃ３、Ｃａｎ　＋ｚフック：　３２８　　　 　　　ｊＦ＋！　　１４２８５ＩＱＣ１，９８８俸５月２５８３綺３２金Ｆｉｇ 、２ ２ｍラスミド′ｉ也ＩＢ’　　　Ｐａｂ２４．ＣＱｎ　’ｒｚ−／り：　　５４ ５４　　　　　　ｊ　１５ｉ　　１３１７９Ｉｇｃ　　１９８８’！ｌ−４月Ｓ 日　１０吟４７今国際ｖ４査報告

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．アミノ酸配列： Ｂ（１−２９）−Ｘ１−Ｘ２−Ｙ２−Ｙ１−Ａ（１−２１） （式中、Ｂ（１−２９）は、Ｎ末端から始まるヒトインシュリンのＢチェーンの ２９個の第１アミノ酸残基である、Ａ（１−２１）はヒトインシュリンのＡチェ ーンの２１個のアミノ酸残基である、Ｘ１は１つのペプチド結合もしくは１つ以 上の任意のアミノ酸残基を示す、Ｘ２はＧｌｕもしくはＡｓｐを示す、およびＹ １とＹ２は各々ＬｙｓもしくはＡｒｇを示す、Ａ６とＡｌ１、Ａ７とＢ７、およ びＡ２０とＢ１９の位置はそれぞれ、硫黄ブリッジで連結され所望により、Ｂ（ １−２９）チェーンとＡ（１−２１）チェーンのアミノ酸残基の１つ以上が他の アミノ酸残基で置換される）で特徴づけられるインシュリン前駆物質。
2. ２．式：Ｂ（１−２９）−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ（１−２１）で特徴づけ られる請求の範囲第１項記載のインシュリン前駆物質。
3. ３．式：Ｂ（１−２９）−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａ（１−２１） で特徴づけられる請求の範囲第１項記載のインシュリン前駆物質。
4. ４．Ａ４、Ａ１７、Ｂ１３およびＢ２１の位置のグルタミン酸残基の１つ以上が 、電荷のない側鎖を有する他のアミノ酸残基で置換されていることを特徴とする 請求の範囲第１〜３項のいずれか１つに記載のインシュリン前駆物質。
5. ５．請求の範囲第１〜４項のいずれか１つに記載のインシュリン前駆物質をコー ドすることを特徴とするＤＮＡ配列。
6. ６．請求の範囲第５項に記載のＤＮＡ配列からなることを特徴とする複製可能な 発現ビークル。
7. ７．請求の範囲第６項に記載の複製可能な発現ビークルで形質転換された酵母菌 株を適切な培地で培養し、その培地からインシュリン前駆物質を単離することを 特徴とする、請求の範囲第１〜４項のいずれか１つに記載のインシュリン前駆物 質の製造方法。
8. ８．請求の範囲第６項記載の複製可能な発現ビークルで形質転換された酵母菌株 を適切な培地で培養し、生成した前駆物質を、任意に単離した後、トリプシンで 消化することによってデス（Ｂ３０）−インシュリンに変換することを特徴とす るデス（Ｂ３０）−インシュリンの製造方法。
9. ９．請求の範囲第６項記載の複製可能な発現ビークルで形質転換された酵母菌株 を適切な培地で培養し、生成した前駆物質を、公知の酵素処理によって、ヒトイ ンシュリンもしくはインシュリン類似体に変換することを特徴とするヒトインシ ュリンもしくはインシュリン類似体の製造方法。