DK164456B - Insulinprecursor, dna-sekvens, som koder derfor, replicerbart ekspressionsmiddel indeholdende en saadan dna-sekvens samt fremgangsmaade til fremstilling af insulinprecursoren - Google Patents

Description

i

DK 164456 B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte insu-1 inprecursorer, der kan anvendes til fremstilling af humaninsulin eller insuliner, som udviser indbygget 5 protraheret virkning eller accelereret virkning. Opfindelsen angår desuden DNA-sekvenser, der koder for sådanne insul inprecursorer, et replicerbart ekspressionsmiddel ideholdende disse samt en fremgangsmåde til fremstilling af disse precursorer.

10 I alvorlige eller kroniske tilfælde behandles sygdommen diabetes sædvanligvis med injektionspræparater, som indeholder insulin, f.eks. svineinsulin, okseinsulin eller humaninsul in.

Der kendes en række forskellige fremgangsmåder til biosyn-15 tetisk fremstilling af humaninsulin. Fælles for dem alle er, at DNA-strengen, som koder for hele proinsulinet, for en modificeret form deraf eller for A- og B-kæden hver for sig indsættes i et replicerbart plasmid, der indeholder en egnet promotor. Ved transformation af dette system til en 20 given værtsorganisme kan der produceres et produkt, som på i og for sig kendt måde kan omdannes til autentisk humaninsulin, jf. f.eks. EP-PS nr. 85.083 og EP-PS nr. 88.117.

Nogle kendte fremgangsmåder til biosyntese af proinsulin eller lignende insulinprecursorer og deres omdannelse til 25 insulin beskrives i det følgende.

Proinsulin kan fremstilles biosyntetisk ved anvendelse af den fremgangsmåde, som er beskrevet i beskrivelsen til EP-patentansøgning nr. 121.884. Ved denne fremgangsmåde indsættes genet, som koder for proinsulin, i gærstammen, 30 og efter dyrkning af den transformerede gærstamme kan proinsulin isoleres fra dyrkningsmediet, hvorefter proinsulin kan omdannes til insulin på i og for sig kendt måde. Imidlertid er de proinsulinudbytter, som opnås på denne måde, ikke tilstrækkeligt høje til kommerciel produktion.

2

DK 164456 B

Insulinprecursorer med formlen B-X-A, hvor B og A betyder henholdsvis B- og A-kæden i humaninsulin, og X betyder et polspeptid indeholdende mindst to aminosyrerester, for-5 trinsvis mellem 6 og 35 aminosyrerester, er kendt fra beskrivelsen til DK-patentansøgning nr. 5284/87. Precur-sorerne kan spaltes enzymatisk til humaninsulin ved behandling med trypsin og carboxypeptidase B i nærværelse af visse metalioner.

10 Fra beskrivelsen til EP-patentansøgning nr. 195.691 kendes nært beslægtede insulinprecursorer med formlen B-X-Y-A, hvor B og A betyder henholdsvis B- og A-kæden i humaninsulin, tværbundet gennem svovlbroer som i humaninsulin, og X og Y hver for sig betyder en lysin- eller argininrest, 15 samt. en fremgangsmåde til fremstilling af precursorerne. Disse precursorer kan spaltes enzymatisk til humaninsulin ved behandling med trypsin og carboxypeptidase B. Endvidere kan de ved tryptisk spaltning nedbrydes til des-B30-insulin, men der dannes en betydelig mængde 20 AoArg-des(B30)-insulin, hvis fortsatte spaltning kun forløber langsomt.

Det er formålet med opfindelsen at tilvejebringe hidtil ukendte insulinprecursorer, som dannes i høje udbytter i gær, og som endvidere kan omdannes til humaninsulin eller 25 insulinanaloger med minimal dannelse af uønskede biprodukter.

Insulinprecursorerne ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de har aminosyresekvensen B( 1-29 ί-Χχ^^-Υΐ-Αί 1-21) 30 hvor B(l-29) er de første 29 aminosyrerester i humaninsulins B-kæde med udgangspunkt i N-terminalen, A(l-21) er de 21 aminosyrerester i humaninsulins A-kæde, Χχ betyder en peptidbinding eller en aminosyrerest, X2 er Glu eller Asp, 3

DK 164456 B

og Y2 uafhængigt af hinanden er Lys eller Arg, hvor der er svovlbroer mellem positionerne henholdsvis A6 og All, A7 og B7 og A20 og B19, og hvor en eller flere af 5 aminosyreresterne i kæderne B(l-29) og A(l-21), om ønsket, er erstattet med en anden aminosyrerest.

Opfindelsen er baseret på den overraskende erkendelse, at insulinprecursorerne ifølge opfindelsen enten dannes i et særdeles stort udbytte, sammenlignet med den fra beskri-10 velsen til EP-patentansøgning nr. 121.884 kendte forbindelse B-Lys-Arg-A, eller at der ved spaltning af insulin-precursorerne ifølge opfindelsen med trypsin opnås des-B(30)-insulin i store udbytter under meget lav eller slet ingen dannelse af A0-Arg-des-B( 30)-insulin eller 15 A0-Lys-des-B(30)-insulin eller begge.

Insulinprecursorer er tillige beskrevet i DK-patentansøgning nr. 1257/86. Disse kendte insulinprecursorer har imidlertid ikke en sur aminosyre på X2's plads, hvilket er tilfældet med insulinprecursorerne ifølge opfindelsen.

20 Dette generelle træk ved insulinprecursorerne ifølge opfindelsen medvirker til opnåelse af en høj ekspression og især til, at der ikke eller næsten ikke dannes biprodukter ved spaltningen af insulinprecursorerne, hvilket bevirker opnåelse af et højere totaludbytte og en lettere oprens-25 ning, også i de tilfælde, hvor ekspressionsniveauet for en enkelt insulinprecursor ifølge opfindelsen "kun" skulle være af samme højde som for den i beskrivelsen til DK-patentansøgning nr. 1257/86 foretrukne forbindelse B-Lys-Arg-A = B(1-29)-Thr-Lys-Arg-A(1-21), som giver et 30 meget højere udbytte end de andre precursorer, som er omtalt i beskrivelsen til ans.nr. 1257/86.

Resultater af sammenligningsforsøg er anført i nedenstående tabel, hvoraf det klart fremgår, at insulin-precursorerne ifølge opfindelsen fremstilles i over-35 raskende høje udbytter, og at spaltningen deraf forløber 4

DK 164456 B

uden dannelse af biprodukter.

Forbindelses- Fermt.udb Spaltn. A^Arg-des peptid mellem i % af udb. i % (B30)ins.

B(l—29) og udb. af af el. AflLys- A(l-2l) Thr-Lys- precursor des(B30)

Arg ins.prec.

Ala-Lys-Arg 50 52 40

Ser-Lys-Arg 55 50 22

Gly-Ser-Lys-Arg 50 50 37

Asp-Asp-Lys-Arg* 172 47 0 * ifølge opfindelsen.

Foretrukne precursorer ifølge opfindelsen er sådanne med 5 formlerne B(1-29)-Asp-Lys-Arg-A(1-21) og B(l-29)-Glu-Lys-Arg-A(1-21).

Des-B(30)-insulin kan omdannes til f.eks. humaninsulin på i og for sig kendt måde ved enzymatisk katalyseret semi-synteti ske fremgangsmåder.

10 Precursorerne kan også omdannes til humaninsulin ved den f.eks. fra US-PS nr. 4.343.898 kendte transpeptiderings-fremgangsmåde.

Insuliner, hvori en eller flere af aminosyreresterne i B(l-29)- og A(1-21)-kæderne er erstattet med en anden' 15 aminosyrerest, kan eksempelvis være de fra beskrivelsen til international patentansøgning W0 86/05497 kendte insulinderivater med protraheret virkning. I disse insulinderivater, som udviser protraheret virkning, er en eller flere af aminosyreresterne i positionerne A4, A17, 5

DK 164456 B

B13 og B21 erstattet med en aminosyrerest, som har en uladet sidekæde, f.eks. en alkylester eller et amid. Andre insulinanaloger, som kan fremstilles ifølge den forelig-5 gende opfindelse, er de insuliner, som er beskrevet i beskrivelsen til EP-patentansøgningerne nr. 194.864 og nr. 214.826.

Insulinprecursorerne ifølge opfindelsen kan fremstilles ved at udtrykke en DNA-sekvens, som koder for en insulin-10 precursor ifølge opfindelsen, i et egnet ekspressionssystem, fortrinsvis i et gærekspressionssystem.

DNA-sekvensen ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at den koder for en insulinprecursor ifølge opfindelsen.

DNA-Sekvensen, der koder for insulinprecursorerne ifølge 15 opfindelsen, kan fremstilles ud fra en DNA-sekvens, som koder for en insulinprecursor B(1-30)-Lys-Arg-A(1-21) ved in vitro mutagenisering eller ved oligonucleotidsyntese af hele DNA-sekvensen.

Det replicerbare ekspressionsmiddel ifølge opfindelsen er 20 ejendommeligt ved, at det indeholder en DNA-sekvens ifølge opfindelsen.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at en gærstamme transformeret med et replicerbart ekspressionsmiddel, der indeholder en DNA-sekvens, som koder for 25 insul inprecur soren med den ovenfor anførte formel, dyrkes i et egnet dyrkningsmedium, og at insulinprecursoren udvindes fra dyrkningsmediet.

Den dannede insulinprecursor kan omdannes til humaninsulin eller insulinanaloger på kendt måde.

30 For at opnå udskillelse til dyrkningsmediet kan DNA-sekvensen, der koder for insulinprecursorerne, være for- 6

DK 164456 B

bundet med en anden DNA-sekvens, som koder for et signal-peptid, som er funktionelt i gær. Udskillelse kan opnås ved at indsætte gær MFal -1 eader sekvensen (Kur jan & 5 Herskowitz, Cell 30, 933-943, 1982) eller dele deraf i ekspressionsmidlet. En foretrukken konstruktion udnytter DNA-sekvensen, som koder for hele MFal-leadersekvensen inklusive det dibasiske site LysArg men uden

Glu-Ala-Glu-Ala, som er substratet for gærproteasen DPAP 10 (dipeptidylaminopeptidase). På denne måde opnås en effektiv udskillelse af insulinprecursorer med den korrekte N-terminal. Andre egnede leadersekvenser er syntetiske gærleaderpeptider beskrevet i beskrivelsen til international patentansøgning WO 89/02463.

15 Ekspressionen eller udtrykkeisen af den ønskede DNA-sekvens er under kontrol af en DNA-sekvens, som er en promotor for transskription, og som er anbragt korrekt i forholdet til den DNA-sekvens, som udtrykkes. I den foretrukne udførelsesform anvendes GAPDH (glyceraldehyd-20 3-phosphat-dehydrogenase)-promotoren. Som terminator for transkriptionen anvendes terminatorsekvensen fra MFal-gehet.

Opfindelsen belyses nærmere i det følgende under henvisning til tegningen, hvor 25 fig. 1 viser plasmidet pYGAIC3, og fig. 2 viser gærvektoren pAB24.

Opfindelsen illustreres nærmere i de efterfølgende eksempler.

7

DK 164456 B

1. Beskrivelse af en DNA-sekvens, som koder for et tran-skriptionssignal, et udskillelsessignal og insulinprecur-soren B-LysArg-A

5 Ekspressionskassetten, der er indeholdt i BamHI-restrik-tionsfragmentet på plasmidet pYGAIC3 som vist i fig. 1, har en længde på 1112 basepar og indeholder i det væsentligste følgende (anført i rækkefølge startende i 5'-enden): GAPDH-promotoren (Travis et al., J. Biol.

10 Chem., 260, 4384-4389, 1985) efterfulgt af kodningsområdet bestående af de 83 N-terminale aminosyrer af MFal-leader-sekvensen, som indkodes af vildtype gær-DNA-sekvensen som beskrevet af Kurjan & Herskowitz (loc. cit.) efterfulgt af de to kodons AAA og AGA for Lys og Arg og igen efterfulgt 15 af det kodende område for B( 1-30)-LysArg-A( 1-21), som er et syntetisk fremstillet gen, hvor der benyttes foretrukne gærkodons. Efter to stopkodons findes et Sall-restrik-tionssted, og den resterende del af sekvensen består af MFal-sekvenser, som indeholder terminatorområdet. Ekspres-20 sionskassetten er fremstillet ved anvendelse af standardteknikker.

2. Fremstilling af DNA-sekvenser, som koder for et udskillelsessignal og for modificerede insulinprecursorer DNA-Sekvenser, som koder for insulinprecursorer ifølge 25 opfindelsen, konstrueres ud fra ekspressionskassetten beskrevet ovenfor. Den anvendte fremgangsmåde er "site directed in vitro mutagenises", som er beskrevet af Zoller & Smith, DNA, bind 3, nr. 5, 479-488 (1984). Fremgangs måden beskrives detaljeret i eksempel 1 og går kort for-30 talt ud på følgende: Isoleret fra ekspressionsplasmidet indsættes insulinprecursorsekvensen i en enkeltstrenget, cirkulær M13 bakteriofagvektor. Til den enkeltstrengede vektor annelleres en kemisk syntetiseret komplementær DNA-streng. DNA-Strengen indeholder den ønskede sekvens 35 omgivet af sekvenser, der er fuldstændigt homologe med 8

DK 164456 B

insulinsekvenser på det cirkulære DNA. Derpå forlænges primeren in vitro i hele det cirkulære genoms længde ad biokemisk vej under anvendelse af Klenow-polymerase. Her-5 ved opnås et dobbeltstrenget molekyle, hvor den ene streng har den ønskede sekvens. Denne streng vil bevirke dannelse af enkeltstrengede fager, som dyrkes i Escherichia coli.

På denne måde fås dobbeltstrenget DNA med den Ønskede sekvens. Fra dette dobbeltstrengede DNA kan isoleres et 10 restriktionsfragment, som genindsættes i ekspressionsvektoren. På denne måde konstrueres insulinprecursorsekven-ser, som er anført nedenfor sammen med de primere, der anvendes til fremstillingen.

H3: B(1-29)-LeuAspLysArg-A(1-21) 15 - 5’CAACAATACCTCTCTTGTCCAACTTTGGAGTG3' H5: B(1-29)-AspLysArg-A(1-21) 51CAACAATACCTCTCTTGTCCTTTGGAGTG3' H6: B(1-29)-GluLysArg-A(1-21) 5'CAACAATACCTCTCTTTTCCTTTGGAGTG3' 20 H8: B(1-29)-LeuGluLysArg-A(1-21) 5'CAACAATACCTCTCTTTTCCAACTTTGGAGTG3'

Eksperimentelt

Området mellem insulinprecursorernes B- og A-kæder kan modificeres ved hjælp af in vitro mutagenisering, som i 25 hovedtrækkene er beskrevet af Zoller & Smith, DNA, bind 3, nr. 6, 479-488 (1984). I dette eksempel er der anvendt en lettere modificeret form af Zoller & Smith's fremgangsmåde.

Eksempel 1 9

DK 164456 B

Konstruktion af et ekspressionspiasmid/ som kan anvendes ved fremstillingen af B(1-29)-GluLysArg-A(1-21) (=H6): 5 Isolering af restriktionsfragment, som indeholder ekspressionskassetten

Ekspressionskassetten, som er indeholdt i ekspressions-plasmidet pYGAIC3 i et BamHI-restriktionsfragment som vist i fig. 1, isoleres på følgende måde: 10 Ekspressionsplasmidet inkuberes med restriktionsendonu-cleasen BamHI. Der anvendes følgende reaktionsbetingelser: 20 /tg plasmid, 50 enheder BamHI, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2 og 1 mM DTT i et reaktionsrumfang på 100 /il. Temperaturen er 37°C, og reaktionstiden 15 er 2 timer. De to DNA-fragmenter adskilles på en 1% lavt-smeltende agarosegel, og det ønskede fragment isoleres ved standardteknikker.

Ligering til vektoren M13mpl8

Det isolerede restriktionsfragment ligeres til bakterio-20 fagvektoren M13mpl8 skåret med restriktionsendonucleasen BamHI i følgende reaktionsblanding: Fragment 0,2 μg/ vektor 0,02 /tg, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT og 1 mM ATP i et rumfang på 20 /ti. 5 /ti af denne blanding transformeres til E. coli-stammen JM101 ved anvendel-25 se af standardteknik. Tilstedeværelsen af fragmentet i vektoren samt fragmentets orientering bestemmes ved restriktionsenzymkortlægning på dobbeltstrenget M13-DNA isoleret fra transformanterne.

Isolering af enkeltstrenget (ss) DNA (templat):

30 Fra den ovenfor beskrevne transformant isoleres ss-DNA

10

DK 164456 B

under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet af Messing & Vieira i Gene, 19, 269-276 (1982).

5 *-Phosphorylering af mutageniseringsprimeren: 5 Mutageniseringsprimeren phosphoryleres i 5 ’ enden i en 30 μΐ reaktionsblanding indeholdende 70 mM Tris-HCl, pH 7,0, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 1 mM ATP, 100 pmol oligonucleotid og 3,6 enheder T4-polynuoleotidkinase. Reaktionen gennemføres i 30 minutter ved 37°C. Derefter inaktiveres enzymet 10 ved inkubation af blandingen i 10 minutter ved 65°C.

Annellering af templat og mutageniseringsprimer:

Annellering af templat og primer gennemføres i et 10 μΐ-rumfang indeholdende 0,5 pmol templat, 4 pmol primer, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl og 1 mM DTT 15 ved opvarmning til 65°C i 10 minutter og efterfølgende afkøling til 0°C.

Forlængelses/ligeringsreaktion:

Til den ovenfor fremstillede reaktionsblanding sættes 10 μΐ af følgende blanding: 0,3 mM dATP, 0,3 mM dCTP, 0,3 mM 20 dGTP, 0,3 mM TTP, 1 mM ATP, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 3 enheder T4-DNA-ligase og 2,5 enheder Klenow-polymerase.

Derpå gennemføres reaktionen i 16 timer ved 16°C. Transformation af JM101: 25 Den ovenfor dannede reaktionsblanding transformeres i forskellige fortyndinger til CaCl2-behandlede E. coli JMlOl-celler under anvendelse af standardteknikker, og der foretages udpladning i 2 x YT-topagar på 2 x YT-agarpla-der. (2 x YT = trypton 16 g/1, gærekstrakt 10 g/1, NaCl 5 11

DK 164456 B

g/l. 2 x YT-topagar = 2 x YT tilsat 0,4% agarose og opvarmet under tryk. 2 x YT-agarplader = 2 x YT tilsat 2% agar og opvarmet under tryk). Pladerne inkuberes natten 5 over ved 37eC.

Identifikation af positive kloner:

Til identifikationen anvendes plaque-lifthybridisering, som beskrives nærmere i det følgende: et nitrocellulosefilter anbringes på en plade med en passende plaquetæthed, 10 således at filteret fugtes med væske fra pladen. Filteret neddyppes derefter i følgende opløsninger: 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH i 30 sekunder, 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl, pH 8,0 i 1 minut, 2 x SSC (0,3 M NaCl, 0,03 M natriumcitrat) indtil -efterfølgende tørring. Filteret tørres derefter på 15 3MM-papir og opvarmes i et vakuumskab i mindst 2 timer ved 80°C.

51-32p-Mærkning af mutageniseringsprimeren:

Mutageniseringsprimeren med sekvensen 5'CAACAATACCTCTCTTTTCCTTGGAGTG3' 20 mærkes radioaktivt i 5'-enden i et reaktionsrumfang på 50 μΐ indeholdende 70 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, 10 pmol oligonucleotid og 50 pmol γ-32ρ_ΑΤΡ. Reagenserne opvarmes til 37°C, og reaktionen startes ved tilsætning af 3,5 enheder T4-polynucleotidkinase. Blandingen 25 inkuberes ved 37°C i 30 minutter, hvorpå enzymet inaktive-res ved opvarmning til 100°C i 3 minutter.

Hybridisering med radioaktiv primer til nitrocellulosefiltre:

De tørrede filtre præhybridiseres i 2 timer ved 65°C i 50 30 ml af en opløsning med følgende sammensætning: 0,9 M NaCl,

DK 164456B

12 0,09 M natriumcitrat, 0,2% okseserumalbumin, 0,2% Ficoll, 0,2% polyvinylpyrrolidon, 0,2% natriumdodecyl sulfat (SDS) og 50 μg/ml laksesperm-DNA. Derefter sættes den ene 5 halvdel af mærkningsreaktionsblandingen som probe til 15 ml frisk præhybridiseringspuffer, hvori filteret henstår natten over ved 37°C med forsigtig rystning. Efter hybri-disering vaskes filteret ved 30eC i 3 x 15 minutter i 0,3 M NaCl, 0,03 M natriumcitrat og autoradiograferes. Efter 10 vask i den samme puffer ved 60°C og yderligere autoradiograf ering identificeres plague, som indeholder DNA-sekvenser, der er komplementære til mutageniseringsprimeren. Mutationsfrekvensen er 43%.

Oprensning af dobbeltstrenget M13-fag-DNA: 15 Efter udstrygning af en positiv klon og fornyet identifikation af positive plaque ved hybridisering anvendes en af de positive kloner til infektion af E. coli-stamme JM101.

Ca. 10® fager og 5 kolonier af JM101 dyrkes i 5 timer i 5 ml 2 x YT-medium. Derefter oprenses dobbeltstrenget, cir-20 kulært DNA fra cellepelleten under anvendelse af fremgangsmåden beskrevet af Birnboim & Doly, Nucleic Acids Res., 2, 1513 (1979).

Isolering af et restriktionsfragment, som indeholder en modificeret B-A-overgang: 25 Den ovenfor fremstillede DNA-præparation (ca. 5 μg) spaltes med 10 enheder restriktionsendonuclease BamHI i 60 μΐ 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2 og 1 mM DTT i 2 timer ved 37°C. DNA-Produkterne adskilles ved elektroforese på en agarosegel, og det ønskede fragment' 30 oprenses fra gelen ved anvendelse af standardteknik.

Ligering til gærvektoren pAB24:

Det isolerede restriktionsfragment ligeres til gærvektoren 13

DK 164456 B

pAB24 vist i fig. 2 skåret med restriktionsendonucleasen BamHI i følgende reaktionsblanding: Fragment 0,2 μg, vektor 0,02 μg, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM MgCl2 og 10 5 mM DTT, 1 mM ATP i et rumfang på 20 μΐ. 5 μΐ af denne reaktionsblanding anvendes til transformation af E. coli-stamme MC1061, hvori det modificerede ekspressionspiasmid identificeres og propageres. Plasmidet betegnet pYGAB-H6-A og har samme sekvens som pYGAIC3, bortset fra det ændrede 10 område.

Transformation af gær:

Transformation af ekspressionspiasmidet til gærstammen Saccharomyces cerevisiae JC482ApepALeu cir° (a, his4, ura37 leu2, cir°) gennemføres som beskrevet af Η. I to et 15 al., J. Bact., bind 153, nr. 1, 163-168 (1983). De transformerede celler udplades på SC-ura-medium (0,7% Yeast Nitrogen Base, 2,0% glucose, 0,5% casaminosyrer, 2,0% agar) til selektion af plasraidholdige celler.

Eksempel 2 20 Konstruktion af ekspressionsplasmid, som kan anvendes ved fremstillingen af B(1-29)-LeuAspLysArg-A( 1-21) (-H3)

Der anvendes samme fremgangsmåde som beskrevet ovenfor i eksempel 1, bortset fra at den anvendte mutageniserings-primer har sekvensen 25 5’CAACAATACCTCTCTTGTCCAACTTTGGAGTG3', og at der efter hybridiseringen anvendes en vasketemperatur på 63°C. Det endelige plasmid betegnes pYGAB-H3-A og har samme sekvens som pYGAIC3, bortset fra den modificerede del.

DK 164456 B

14

Eksempel 3

Konstruktion af et ekspressionsplasmid, der kan anvendes ved fremstillingen af B(1-29)-AspLysArg-A(1-21) (=H5) 5 Der anvendes samme fremgangsmåde som beskrevet ovenfor i eksempel 1, bortset fra at mutageniseringsprimeren har sekvensen 5 *CAACAATACCTCTCTTGTCCTTTGGAGTG3', og at der efter hybridiseringen anvendes en vasketempera-10 tur på 61°C. Det endelige plasmid betegnes pYGAB-H5-A og har samme sekvens som pYGAIC3, bortset fra den modificerede del.

Eksempel 4

Konstruktion af et ekspressionsplasmid, som kan anvendes 15 ved fremstillingen af B(1-29)-LeuGluLysArg-A(1-21) (=H8)

Der anvendes samme fremgangsmåde som beskrevet ovenfor i eksempel 1, bortset fra at den anvendte mutageniserings-primer har sekvensen 5'CAACAATACCTCTCTTTTCCAACTTTGGAGTG3', 20 og at der efter hybridiseringen anvendes en vasketemperatur på 63°C. Det endelige plasmid betegnes pYGAB-H8-A og har samme sekvens som pYGAIC3, bortset fra den modificerede del.

Eksempel 5 15

DK 164456 B

Dyrkning af gærstamme transformeret med et ekspressions-plasmid, som koder for insulinprecursorer ifølge opfin-5 delsen

Der anvendes Saccharomyces cerevisiae-stammer transformeret med de fremstillede piasmider.

Hver enkelt stamme dyrkes på Petri-plader indeholdende minimalmedium uden uracil i 48 timer ved 30°C. 100 ml 10 rystekolber indeholdende minimalmedium uden uracil + 5 g/1 casaminosyrer + 10 g/1 ravsyre + 30 g/1 glucose, pH 5,0, podes derpå med en enkelt koloni fra Petri-pladen. Ryste-kolberne rystes i 72 timer ved 30eC i en inkubator ved 180 o/m.

15 Der opnås en koncentration på ca. 5 g/1 celletørstof.

Eksempel 6

Isolering af precursor fra kultursupernatant

Efter centrifugering steriliseres 5 1 kultursupernatant ved filtrering, og der indstilles på en ledningsevne på 8 20 mS og pH-værdien 4,5 ved tilsætning af destilleret vand og 5 N saltsyre. Supernatanten sættes derefter på en kolonne (2,6 x 6,7 cm) pakket med Pharmacia "FFS Sepharose"® ækvilibreret med 10 kolonnerumfang puffer (50 mM eddikesyre i 50%'s ethanol indstillet på pH-værdien 4,0 med 25 NaOH). Supernatanten sættes på kolonnen med en hastighed på 5,3 ml/min. ved anvendelse af en pumpe, og kolonnen vaskes med 5 kolonnerumfang puffer. Efter vaskning af kolonnen elueres insulinprecursoren med en lineær NaCl-gradient fra 0 til 350 mM i 30 kolonnerumfang af den 30 samme puffer ved en hastighed på 25 ml/time, og der opsamles fraktioner af 10 ml. Precursorholdige fraktioner 16

DK 164456 B

identificeres ved hjælp af UV-absorptionsmåling og RP-HPLC-analyse og hældes sammen. De sammenhældte fraktioner afsaltes på en kolonne pakket med "Sephadex"® G25 5 indstillet med 1 M eddikesyre. Derefter isoleres precurso-ren ved frysetørring.

Identifikation af isolerede insulinprecursorer

Prøver af de frysetørrede precursorer hydrolyseres i 6 M saltsyre ved 110°C i tilsmeltede glasampuller og 10 analyseres for aminosyresammensætning ved anvendelse af en "LKB Alpha plus"-aminosyreanalysator. Prøver af insulinpr ecur sorer analyseres endvidere ved hjælp af amino-syresekvensering på et automatisk aminosyresekvenserings-apparat (Applied Bio System model 477A) med on-line HPLC-15 identifikation af aminosyrer.

Resultaterne bekræfter, at forbindelsespeptiderne er i overensstemmelse med de anførte sekvenser.

Spaltning af insulinprecursor med trypsin til des(B30)-insulin 20 Precursoren opløses i en koncentration på 2 mg/ml i 50 mM Tris, 20% ethanol indstillet på pH 10,0 med 1 M saltsyre. Reaktionen startes ved tilsætning af 400 mg drænet Sepha-rosegel, som indeholder 0,3 mg immobiliseret trypsin. Reaktionen gennemføres ved 4eC med forsigtig omrystning i 25 normalt 12 timer. Reaktionen afbrydes ved filtrering af blandingen. Fermenteringsudbytterne udtrykt i % af udbyttet af den nært beslægtede kendte insulinprecursor B(1-29)-Thr-Lys-Arg-A(1-21) er anført i nedenstående tabel sammen med spaltningseffektiviteten for precursorer ifølge 30 opfindelsen og biproduktdannelsen.

17

DK 164456 B

Tabel

Forbindelses- Fermente- Spaltnings- A0Arg-des peptid mellem ringsudbytte udbytte i % (B30)insu- 5 B(l-29) og i % af udbyt- af precur- lin eller a(1-21) tet af sor A0Lys-des-

Thr-Lys-Arg (B30)insu lin _precursor 10 Thr-Lys-Arg_100_70_27%_

Leu-Asp-Lys-Arg 64 84 0

Leu-Asp-Lys-Lys 53 80 0

Leu-Glu-Lys-Arg_64_76_ 0

Asp-Lys-Arg 166 77 0 15 Glu-Lys-Arg_286_78_ 10

Det fremgår af ovenstående tabel, at der ved omdannelse af insulinprecursorerne ifølge opfindelsen opnås væsentligt større udbytter af des-(B30)insulin ved enzymatisk spaltning, end det er tilfældet med den nært beslægtede kendte 20 precursor B(1-29)-Thr-Lys-Arg-A(1-21). Desuden udtrykkes de foretrukne insulinprecursorer i langt større udbytter i gær.

Eksempel 7

Isolering af des(B30)-insulin fra reaktionsblanding 25 Reaktionsblandingen filtreres, og der foretages isoelek-trisk udfældning og frysetørring.

50 mg frysetørret stof opløses i 2 ml puffer (20 mM Tris, 7 M urinstof, indstillet på pH 8,1 med 1 M NaOH) og sættes på en kolonne (1,6 x 20 cm) pakket med Pharmacia 30 "FFQ-Sepharose"® anionbytter indstillet med 10 kolonnerumfang puffer. Kolonnen elueres derpå med en lineær NaCl-gradient fra 0 til 50 mM NaCl i 10 kolonnerumfang af den samme puffer med en hastighed på 10 ml pr. time. Der opsamles fraktioner å 5 ml. De positive fraktioner identi- 18

DK 164456 B

ficeres ved UV-absorptionsmåling og RP-HPLC-analyse og hældes sammen. Des-B(30)-insulin opnås typisk i et udbytte på 75% efter en afsluttende afsaltning på en kolonne 5 pakket med "G25 Sephadex"® i 1 M eddikesyre og frysetørring.

Forbindelsens identitet bekræftes ved hjælp af aminosyre-analyse som beskrevet i eksempel 6.

Mængden af insulinprecursor og af des(B30)insulin 10 bestemmes ved hjælp af RP-HPLC-analyse som beskrevet af B.S. Welinder/F.H. Andresen: Proceedings of the FDA-USP Workshop on Drugs and Reference Standards for Insulin, Somatotropins and Thyroid-axis Hormones, Bethesda, Maryland, maj 19-21, 163-176 (1982).

15 Puffersystemet består af en A-puffer (0,125 M ammoniumsulfat 22,5% (vol/vol) acetonitril indstillet på pH 4,0 med svovlsyre) og en B-puffer (0,125 M ammoniumsulfat 45% acetonitril indstillet på pH 4,0 med svovlsyre). Der anvendes en Hibar Lichrosorp RP-18-kolonne, 5 μ, 250 x 4 20 mm, som elueres med en hastighed på 1,5 ml pr. minut. Prøver' indeholdende des(B30)insulin elueres med et gradientsystem anbefalet af Welinder og Andresen (1982), hvorimod prøver indeholdende insulinprecursorer elueres med en lineær gradient fra 0 til 35% B-puffer med en 25 forøgelse på 1% pr. minut. Koncentrationen bestemmes ved sammenligning med en standardopløsning af den autentiske insulinprecursor.

Claims (7)

19 DK 164456 B

1. Insulinprecursor, kendetegnet ved, at den har aminosyresekvensen

2. Insulinprecursor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den har formlen B(1-29)-Asp-Lys-Arg-A(1-21).

3. Insulinprecursor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den har formlen

20 B(1-29)-Glu-Lys-Arg-A(1-21).

4. Insulinprecursor ifølge et af kravene 1-3, kendetegnet ved, at en eller flere af glutaminsyreresterne i positionerne A4, Al7, B13 og B21 er erstattet med en anden aminosyrerest med uladet sidekæde.

5. DNA-Sekvens, kendetegnet ved, at den koder for en insulinprecursor ifølge et af kravene 1-4.

5 B(1-29)-X!-X2-Y2-Yl-A( 1-21) hvor B(l-29) er de første 29 aminosyrerester i humaninsu-lins B-kæde med udgangspunkt i N-terminalen, A(l-21) er de 21 aminosyrerester i humaninsulins A-kæde, Χχ betyder en peptidbinding eller en aminosyrerest, X2 betyder Glu eller 10 Asp, og Υχ og Y7 uafhængigt af hinanden er Lys eller Arg, hvor der er svovlbroer mellem positionerne henholdsvis A6 og All, A7 og B7 og A20 og B19, og hvor en eller flere af aminosyreresterne i kæderne B(l-29) og A(l-21), om ønsket, er erstattet med en anden aminosyrerest.

6. Replicerbart ekspressionsmiddel, kendetegnet ved, at det indeholder en DNA-sekvens ifølge krav 5. 20 DK 164456 B

7. Fremgangsmåde til fremstilling af en insulinpre- cursor ifølge et af kravene 1-4, kendetegnet ved, at en gærstamme transformeret med et replicerbart ekspressions-5 middel ifølge krav 6, dyrkes i et egnet dyrkningsmedium, og at insulinprecursoren udvindes fra dyrkningsmediet.