JPH022388A - 新規なヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、医薬として有用な新規なヒト顆粒球マクロフ
ァージコロニー刺激因子（以下、ヒト顆粒球マクロファ
ージコロニー刺激因子をＧＭ−Ｃ３Ｆと略称する　）に
関する。

〔従来の技術および課理を解決するための手段〕ＧＭ−
Ｃ３Ｆは骨髄を刺激して、感染防御、免疫などに重要な
役割を果たす顆粒球マクロファージなど白血球の分化・
増殖を促進するサイト力インの一種であり、その−次構
造はすでに報告されている。（Ｇｏｒｄｏｎ　Ｇ、　Ｗ
ｏｎｇ　ｅｔ、ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２２８８１
０−８１５．（１９８５）；＾ｎｔｏｎｙ　Ｗ、Ｂｕｒ
ｇｅｓｓ　　ｅｔ、ａｌ。

Ｂｌｏｏｄ、６９４３−５１（１９８７）本発明者らは
、遺伝子組換え法により形質転換した大腸菌の菌体内に
産生させたＣＭ−Ｃ３Ｆを単離し、回収するにあたり、
大腸菌内では０ＭＣ３Ｆが不活性な不溶性の凝集体とし
て得られるため、適当な条件で可溶化還元して直鎖状の
ＧＭ−Ｃ３Ｆとして単離し、これを酸化して２組のジル
スフイド結合を有する活性なＧＭ−Ｃ３Ｆを導く過程に
おいて、すでに報告されているものとは異なる新規なＧ
Ｍ−Ｃ３Ｆを得、本発明を完成した。

本発明のＧＭ−ＣＳＦは、第１図記載のアミノ酸配列（
第１番目から第１２８番目まで）で特定されるＮ末端に
メチオニン残基が先行したＧＭ−Ｃ３ＦのＮ末端からア
ミノ酸が２個（Ｍｅｔ−Ａｌａ）除去された、第１図記
載のアミノ酸配列の第３番目から第１２８番目のアミノ
酸配列で特定される新規なＧＭ−Ｃ３Ｆである。（以下
、本明細書では第１図記載のアミノ酸配列（第１番目か
ら第１２８番目まで）で特定されるＮ末端にメチオニン
残基が先行したＧＭ−Ｃ３ＦをＡ型とし、Ａ型ＧＭＣ３
ＦのＮ末端かアミノ酸が２個（Ｍｅｔ−Ａｌａ）除去さ
れた本発明の新規な組換えＧＭ−Ｃ３ＦをＢ型とする。

） 本発明のＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ｂ型は、以下に記す方法によ
り得られる。

第１図記載のＧＭ−Ｃ３ＦをコードするＧＭＣ３ＦＪＩ
伝子を常法により単離し、これを発現する組換え大腸菌
を常法により作成する。好ましくはヒト白血病細胞Ｕ９
３７株（ＡＴＣＣＣＲＬ１５９３）由来のヒトＧＭ−Ｃ
３Ｆ遺伝子を有するプラスミドによって大腸菌に一１２
株由来のＳＧ　　９３６株を形質転換し、得られた大腸
菌をＬブロス培地等の適当な培地で常法に従い培養し、
ＧＭ−Ｃ３Ｆを産生させる（ＰＣＴ出瀬ＷＯ３７１０２
０６０参照）。ＧＭ−ＣＳＦは不溶性の凝集体として宿
主内に蓄積される。

遠心分離等により培養した菌体を集め、適当な手段（例
えば超音波処理、フレンチプレス処理など）を用いて菌
体を破砕して、遠心分離によって不溶性の凝集体をとり
出す。この凝集体を適当な可溶化剤（例えば高濃度のグ
アニジン塩酸又は尿素）及び、分子内及び分子間に存在
すると思われるジスルフィド結合を切断するための還元
剤（例えば２−メルカプトエタノール）を用いて可溶化
する。還元体として含まれるＧＭ−Ｃ３Ｆをゲルろ過ク
ロマトグラフィーなどの手段によって一次精製する。凝
集体をとり出す段階でＧＭ−Ｃ３Ｆに夾雑している宿主
由来のタンパク質や核酸、また、細胞膜成分などのうち
可溶性成分および０ＭＣ３Ｆと分子量の異なる夾雑成分
を上記の操作により除く。このようにして得られたＧＭ
−ＣＳＦの還元体は適当な酸化還元系（例えばグルタチ
オン又はシスティンの酸化型及び還元型の混合物）を有
する溶液中で２組のジスルフィド結合を形成させ、活性
なＧＭ−Ｃ３Ｆを再生させる。

この再生溶液には、−吹精製によって除き得なかった宿
主由来物質の他、酸化還元剤、キレート剤等の夾雑物が
存在するので、イオン交換高速液体クロマトグラフィー
を用いて該夾雑物を除去する。このようにして得られた
ＣＭ−Ｃ３Ｆ　　Ａ型。

Ｂ型の混合物は逆相高速液体クロマトグラフィーにより
分離する。各ＣＭ−Ｃ３Ｆ活性画分を分取し、更に精製
し、ＧＭ−Ｃ３Ｆの構造を検定することにより、目的の
ＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ｂ型を得ることができる。以上の各操
作により得られたＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ｂ型はＡ型と同様、
好中球生存維持活性およびハムスター骨髄細胞コロニー
形成活性などの生物活性を有することが認められた。以
下実施例により、この発明をさらに詳しく説明する。

丈止炎上 ヒト白血病細胞Ｕ９３７株　（ＡＴＣＣＣＲＬ　　１５
９３）由来のｈＧＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子を有するプラスミド
によって大腸菌に一１２株由来の　５Ｇ９３６株（ＡＴ
ＣＣ３９２６４）を形質転換し、得られた大腸菌（０３
Ｍ３４７４）（ＰＣＴ出願　ＷＯ３７１０２０６０に記
載の公知菌株）を用いてアンピシリン、カナマイシンを
含むＬプロス培地で１４時間、３０°Ｃで培養し、次に
４２°Ｃに温度をあげて誘導をかけ、さらに３時間培養
した。培養後に、菌体を超音波破砕により破壊し、１２
゜０００ｒｐ−で３０分間遠心分離してペレット化した
。

得られたペレットを０．１Ｍ　Ｔｒｉ−ＨＣＩ（ｐＨ７
，５）で洗浄後、６Ｍグアニジン塩酸及び１０ｍＭ　２
−メルカプトエタノールを含む０．ＩＭ　Ｔｒｉ−ＨＣ
Ｉ（ＰＨ７，５）を用いて可溶化し、次いでセファクリ
ル５２００スーパーフアインカラム　（商標：ファルマ
シア社製）（２゜６ｃｍ　Ｘ　９４ｃｍ、　５００ｍ１
樹脂）にかけて４°Ｃでゲルろ過クロマトグラフィーを
行った。）８出したＧＭ−Ｃ３Ｆ含有画分を４ｍＭシス
ティン０．４ｍＭシスチンを含む０．１Ｍ　Ｔｒｉ−Ｈ
ＣＩ（ＰＨ７，５）で４°Ｃ１１２時間透析を行い、さ
らに新しいバッファー溶液で４°Ｃ１１晩透析を行って
、酸化型ＧＭ−Ｃ３Ｆを含む再生溶液を得た。　次にこ
の再生液に混在する酸化還元剤および界面活性剤等の夾
雑物を除去するため、下記条件でＨＰＬＣを用いて精製
をおこなった。

（ＨＰＬＣ−１３ カラム：　ＴＳＫｇｅｌ　ＤＥＡＥ−５ＰＷ、（粒子径
１０μｍ、孔径１０１００ｎ　（２１，５Ｘ　１５０ｍ
ｍ）　（東ソー製） 移動相：Ａ液２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１緩衝液（ＰＨ
７，３）Ｂ液　０．５Ｍ塩化ナトリウム含有２０ｍＭＴ
ｒｉｓ−１１ＣＩＩＩ衝液（ＰＨ７，３）グラジェント
条件＝Ｂ液を５％で１０分間流した後、Ｂ液を４５％ま
で６０分間で直線 的に増加させる。

？ＡＮ　：　　８．Ｏｍｊ！／ｍｉｎ カラム温度：室温 検出器：紫外線吸収計（測定波長２８０ｎｍ）保持時間
：４３分 以上の各操作を行って得られたＧＭ−Ｃ３Ｆとして１０
５ｍｇを含む再生溶液について下記条件でトｆＰＬＣに
よりＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ａ型およびＢ型を分画した。

［ＨＰＬＣ−２］ カラム二マイクロボンダスフェアーＣ１６（粒子径５μ
ｍ＋孔径１２ｎｍ）　（１９Ｘ　１５０ｎｖ）　（ミリ
ポア類） 移動相：Ａ液　５ｍＭ　　テトラ−ｎ−ブチルアンモニ
ウム含有２０ｍＭリン酸塩緩衝？ｆｆ１（ｐｏ７．ｏ）
Ｂ；夜　アセトニトリル グラジェント条件：Ｂ液を２０％で１０分間流した後、
２０％から３７％まで２０分間、３７ ％から４０％までを９０分間、次 いで４０％から６０％までを１０分 間でそれぞれ直線的に増加さ せる。

流”ｌ　：　　８．Ｏｄ／ｍｉｎ カラム温度；室温 検出器二紫外線吸収計（測定波長２８０ｎｍ）保持時間
：ＧＭ−Ｃ５Ｆ　　Ａ型　９１分ＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ｂ型
　９５分 上記操作により得られたＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ｂ型の両分に
ついてさらに下記条件によりＨＰＬＣを用いて精製をお
こない、ＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ｂ型を得た。

（ＨＰＬＣ−３） カラム：スミパックスＯＤＳ　　Ａ−２１１（４，６ｍ
ｍ×２５０ｍｒａ’）　（住友化学製）移動相：Ａ液　
５ｍＭテトラ−ｎ−ブチルアンモニウム含有２０ｍＭリ
ン酸塩緩衝液（ＰＨ７，０）Ｂ液　アセトニトリル グラジェント条件：Ｂ液を２０％から４０％まで１ｏ分
間、次いで４０％から５０％まで ５０分間でそれぞれ直線的に増 加させる。

流Ｎ　：　１　ｍｌ／ｍｒｎ カラム温度二室温 検出器：紫外線吸収計（測定波長２８０ｎｍ）保持時間
：３５分 以上の方法により、精製したＣ、Ｍ−Ｃ３Ｆ　　Ａ型お
よびＢ型について下記条件でＨＰ　Ｌ　Ｃにより測定し
た結果、ＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ａ型８２．１ｍｇ、　Ｇ　Ｍ
Ｃ３Ｆ　　Ｂ型０．７７ｍｇを得た。

なお、ＧＭ−Ｃ３Ｆの粗製品の高速液体クロマトグラム
を第２図に示す。

ＨＰ　Ｌ　Ｃ条件： カラム二マイクロボンダスフェアーＣ＋ｓ（粒子径５μ
ｍ、細孔径１２ｎｍ）　（４，６Ｘ　２５ｃｍ）　（ミ
リポア類） 移動相：Ａ液　５ｍＭ　　テトラ−ｎ−ブチルアンモニ
ウム含有２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ＰＩ（７，０）Ｂン
佼　アセトニトリル グラジェント条件：Ｂ液を２０％から３８％まで１０分
間、３８％から４２％まで４０分間 で直線的に増加させる。

流量：　１成／ｍｉｎ カラム温度：室温 検出器：紫外線吸収計（測定波長２３０ｎｍ＞実画ｌ生
Ｚ 実施例１で得たＣＭ−Ｃ３Ｆ　　Ｂ型について気相アミ
ノ酸シークエンサーを用いてＮ末端アミノ酸配列を分析
した。その結果、ＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ｂ型はＡ型のＮ末端
アミノ酸が２個（Ｍｅｔ−Ａｌａ）欠失したものである
ことが判明した。

さらに以下のとおり解析を進めた。

まず実施例１で得たＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ａ型を１％炭酸水
素アンモニウム溶液（ＰＨ８，０）に）容解し、トリプ
シンを用いて常法通り分解した。得られた分解物につい
て高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰ　Ｌ　Ｃと
記す）を用いて下記条件で分画をおこない次いで各両分
についてＦＡＢ−マススペクトルを測定し、それぞれに
相当するペプチド断片を同定した。

（ＨＰＬＣ条件） カラム：ＴＳＫ　　０ＤＳ−１２０７（粒子径５μ４．
６ｍｍＸ２５０ｍｍ）　（東ソー製）移動相：Ａ液　０
．１２％トリフルオロ酢酸水溶液Ｂ？夜　０．１％トリ
フルオロ酢酸アセトニド　リルン容ン夜 グラジェント条件二Ｂ液を５％から３６％まで３１分間
で次いで３６％から６５％まで ５８分間でそれぞれ直線的に増 加させる。

流ＭＬ　：　１　ｍＮ／ｍｉｎ カラム温度：室温 検出器：紫外線吸収計（測定波長２３０ｎｍ）同様に、
ＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ｂ型のトリプシン分解物をＨＰＬＣを
用いて分析し、Ａ型のトリプシン分解物のＨＰＬＣによ
る分析結果を比較したところＢ型ではＡ型のアミノ酸配
列１番から５番のペプチド断片に相当するピークが消失
し、新たなピークが検出された。このピークをＨＰＬＣ
を用いて分！し、そのＦＡＢ−マススペクトルを測定し
た結果、Ａ型のアミノ酸配列３番から５番のペプチド断
片の分子量に相当するピークが検出された。

以上の結果、ＣＭ−Ｃ３Ｆ　　Ｂ型はＧＭ−Ｃ３ＦＡ型
のＮ末端アミノ酸が２個欠失したものであることが判明
した。

試験方法 ハムスター大腿骨を無菌的に摘出し、２％牛脂児血清含
有ａ　−Ｍ　Ｅ　Ｍ培養？ｆｆ１（Ｓｔａｎｎｅｒｓ、
Ｃ，Ｐ、、ｅｔ。

ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、２３
０：５２（１９７２）　（Ｆｌｏ−社製））を注入し、
骨髄細胞を洗い出した。この細胞をピベンティングでば
らばらにし、３分間静置する。細胞浮遊液をとり、同じ
培養液で洗浄した後、４０％０％牛脂清含有α−ＭＥＭ
培養液でｌＸｌ０／ｍｌの細胞濃度に調製する。この骨
髄細胞浮ｉ液および２％牛脂児血清含有α−ＭＥＭ培養
液で段階的に希釈したヒトＧＭ−Ｃ３Ｆをウェルに１０
０μｉずつ入れて、３７°Ｃ，５％−酸化炭素の条件下
で培養する。培養４２時間後にα−ＭＥＭ培養液で４０
μｃｉ／ｒｎ１に調製したトリチウム標識チミジンを２
５μｌずつ各ウェルに添加しさらに６時間培養後、細胞
に取り込まれた放射活性を測定する。

（ＣＶ／ＣＣ）／２のトリチウム標識チミジン取り込み
を誘導するＧＭ−Ｃ３Ｆｆｆｌを５０単位／ｄと定義し
てＧＭ−Ｃ３Ｆの比活性を求めた。但し、ＣＭは最大ト
リチウム標識チミジン取り込み量。

ＣＣはＧＭ−Ｃ３Ｆ非存在下に取り込まれたトリチウム
標識チミジン量を表わす。

試験結果　　　　　　　　表１ ＳＦ　　Ａ型と同等のハムスター骨髄細胞コロニー形成
活性を有することが認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図は組み換え大腸菌由来のＧＭ−Ｃ３Ｆのアミノ酸
配列を示す。但し、Ａ：アラニン、Ｃニジスティン、Ｄ
：アスパラギン酸、Ｅ：グルタミン酸、Ｆ：フェニルア
ラニン、Ｇニゲリシン、Ｈ：ヒスチジン、■：イソロイ
シン、Ｋ：リジン、Ｌ：ロイシン、Ｍ：メチオニン、Ｎ
：アスパラギン、Ｐニブロリン、Ｑ：グルタミン、Ｒ；
アルギニン、Ｓ：セリン、Ｔ：スレオニン、■：バリン
、Ｗニトリブトファン、Ｙ：チロシンを各々表す。 第２図は実施例にて用いた粗製品ＧＭ−Ｃ３Ｆの高速液
体クロマトグラムを示す。 表１の結果から、ＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ｂ型はＧＭ−Ｃ第１
図 保持時間（分）

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 第１図記載のアミノ酸配列の第３番目から第１２８番目
   のアミノ酸配列で特定されるヒト顆粒球マクロファージ
   コロニー刺激因子