JPH022389A - メチオニン残基がスルホキシド化されたヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、医薬として有用な新規なヒト顆粒球マクロフ
ァージコロニー刺激因子（以下、ヒト顆粒球マクロファ
ージコロニー刺激因子をＧＭ　　Ｃ３Ｆと略称する　）
に関する。

〔従来の技術および課題を解決するための手段〕ＧＭ−
Ｃ３Ｆは骨髄を刺激して、感染防御、免疫などに重要な
役割を果たす顆粒球、マクロファージなど白血球の分化
・増殖を促進するサイト力インの一種であり、その−次
構造はすでに報告されている。（Ｇｏｒｄｏｎ　Ｇ、　
Ｗｏｎｇ　ｅｔ、ａｌ、、　５ｃ４ｅｎｃｅ２２８、８
１０−８１５（１９８５）：Ａｎｔｏｎｙ　Ｗ、Ｂｕｒ
ｇｅｓｓ　ｅｔ、ａｌ、。

Ｂｆｏｏｄ、　６９．４３−５１（１９８７））。

本発明者らは、遺伝子＆１１換え法により形質転換した
大腸菌の菌体内に産生させた０ＭＣ３Ｆを単離し、回収
するにあたり、大腸菌内では０ＭＣ３Ｆが不活性な凝集
体として得られるため、適当な条件で可溶化還元して直
鎖状のＧＭ−Ｃ３Ｆとして単層し、これを酸化して２組
のジスルフィド結合を有する活性なＣＭ−Ｃ３Ｆを導く
過程において、すでに報告されているものとは異なる新
規なＧＭ−Ｃ３Ｆが得られることを見出し、本発明を完
成した。

本発明のＧＭ−Ｃ３Ｆは、第１図記載のアミノ酸配列で
特定されるＧＭ−Ｃ３ＦのＮ末端のメチオニン残基ある
いは、ポリペプチド中のメチオニン残基が、少なくとも
ひとつ以上スルホキシド化された新規なＧＭ−Ｃ３Ｆで
ある。

具体的な例は下記に示す通りである。

（１）Ｎ末端アミノ酸であるメチオニン残基がスルホキ
シド化された組換えＧＭ−Ｃ３Ｆ （２）３７番目のアミノ酸であるメチオニン残基がスル
ホキシド化された組換えＧＭ−Ｃ３Ｆ （３）４７番目のアミノ酸であるメチオニン残基がスル
ホキシド化された組換えＧＭ−Ｃ３Ｆ （４１８０番目のアミノ酸であるメチオニン残基がスル
ホキシド化された組換えＧＭ−Ｃ３Ｆ 本発明のＧＭ−Ｃ３Ｆはいずれも大腸菌を宿主として生
産した組換えＧＭ−Ｃ３Ｆであり、Ｎ末端にメチオニン
残基が付加した蛋白質として産生され、Ｎ末端のメチオ
ニン残基を１番めのアミノ酸とする。

以下、本明細書では第１図記載のアミノ酸配列で特定さ
れるメチオニン残基が先行する組換えＧＭ−Ｃ３ＦをＡ
型とし、本発明者らが初めて見出した第１図記載のアミ
ノ酸配列で特定されるＧＭＣ３ＦのＮ末端のメチオニン
残基あるいは、ポリペプチド中のメチオニン残基がスル
ホキシド化さ″れた新規な組換えＧＭ−Ｃ３Ｆのうち上
記（１）〜（４）のＧＭ−Ｃ３ＦをそれぞれＢ型　（（
１）に相当）・Ｃ型（（２）に相当）・Ｄ型（（３）に
相当）・Ｅ型（（４）に相当）とする。

本発明のＧＭ−Ｃ３Ｆは、以下に記す方法により得られ
る。

第１図記載のＧＭ−Ｃ３Ｆをコードする０ＭＣ３Ｆｉｊ
！伝子を常法により単離し、これを発現する組換え大腸
菌を常法により作成する。

好ましくはヒト白血病細胞Ｕ９３７株（ＡＴＣＣＣＲＬ
　　１５９３）由来のヒトＧＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子を有する
プラスミドによって大腸菌に一１２株由来のＳＧ　　９
３６株を形質転換し、得られた大腸菌をＬブロス培地等
の適当な培地で常法に従い培養し、ＣＭ−Ｃ３Ｆを産生
させる（ＰＣＴ出願　−０８７１０２０６０参照）、Ｇ
Ｍ−Ｃ３Ｆは不溶性の凝集体として宿主内に蓄積される
。

遠心分離等により培養した菌体を集め、適当な手段（例
えば超音波処理、フレンチプレス処理など）を用いて菌
体を破砕して、遠心分離によって不溶性の凝集体をとり
出す。この凝集体を適当な可溶化剤（例えば高濃度のグ
アニジン塩酸又は尿素）及び、分子内及び分子間に存在
すると思われるジスルフィド結合を切断するための還元
剤（例えば２−メルカプトエタノール）を用いて可溶化
する。還元体として含まれるＧＭ−Ｃ３Ｆをゲルろ過ク
ロマトグラフィーなどの手段によって一次精製する。凝
集体をとり出す段階でＧＭ−Ｃ３Ｆに夾雑している宿主
由来のタンパク質や核酸、また、細胞膜成分などのうち
可溶性成分および０ＭＣ５Ｆと分子鼠の異なる夾雑成分
を上記の操作により除く。

このようにして得られたＧＭ−Ｃ３Ｆの還元体は適当な
酸化還元系（例えばグルタチオン又はシスティンの酸化
型及び還元型の混合物）を有する溶液中で透析等を行い
、２組のジスルフィド結合を形成させ、活性なＧＭ−Ｃ
３Ｆを再生させる。この再生溶液には、−次槽製によっ
て除き得なかった宿主由来物質の他、酸化還元剤、キレ
ート剤等の夾雑物が存在するので、イオン交換高速液体
クロマトグラフィーを用いて該夾雑物を除去する。

このようにして各種ＧＭ−Ｃ３Ｆの混合物が得られる。

混合物中のＧＭ−Ｃ３Ｆのうち、メチオニン残基が、少
なくともひとつ以上スルホキシド化されたＧＭ−Ｃ３Ｆ
の生成比率をさらに高めるためには各操作において空気
とＧＭ−Ｃ３Ｆの接触頻度を多くし、酸化反応を促進さ
せるのが好ましい。たとえば、還元体ＧＭ−Ｃ３Ｆから
活性なＧＭ−Ｃ３Ｆを再生させる時の透析の際に、通常
より激しく再生液を撹拌し、空気とＧＭ−Ｃ３Ｆの接触
頻度を多くすることが挙げられる。このようにして得ら
れた各種ＧＭ−Ｃ３Ｆの混合物を逆相高速液体クロマト
グラフィーにより分離する。各ＣＭ−Ｃ３Ｆ活性画分を
分取し、さらに精製を行い、各ＣＭ−Ｃ３Ｆの構造を検
定することにより、目的のＧＭ−Ｃ３Ｆを得ることがで
きる。

以上の各操作により得られたＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ｂ型Ｃ型
、Ｄ型、Ｅ型はＡ型と同様、好中球生存維持活性および
ハムスター骨髄細胞コロニー形成活性などの生物活性を
有することが認められた。

災膳炎上 ヒト白血病細胞０９３７株（ＡＴＣＣＣＲＬＩ５９３）
由来のｈＧＭ−Ｃ３Ｆ遺伝子を有するプラスミドによっ
て大腸菌に一１２株由来の５Ｇ９３６株（ＡＴＣＣ３９
２６４）を形質転換し、得られた大腸菌（ＤＳＭ３４７
４）（ＰＣＴ出願ＷＯ３７１０２０６０に記載の公知の
菌株）を用いてアンピシリン、カナマイシンを含むしブ
ロス培地で１４時間、３０゛Ｃで培養し、次に４２゛Ｃ
に温度をあげて誘導をかけ、さらに３時間培養した。

培養後に、菌体を超音波破砕により破壊し、１２０００
ｒｐｍで３０分間遠心分離してベレット化した。

得られたペレットを０．１Ｍ　Ｔｒｉ−ＨＣＩ（ｐＨ７
，５）で洗浄後、６Ｍグアニジン塩酸及び１０ｍＭ　　
２−メルカプトエタノールを含む０．１Ｍ　Ｔｒｉ−１
１ＣＩ（ｐＨ７，５）を用いて可溶化し、次いでセファ
クリル５２００スーパーフアインカラム　（商標：ファ
ルマシア社製）（２，６ｃｍ　　Ｘ９４ｃｍ、５００ｍ
Ｅ樹脂）にかけて４°Ｃでゲルろ過クロマトグラフィー
を行った。ン容出したＧＭＣ３Ｆ含有画分を４ｍＭシス
ティン０．４ｍＭシスチンを含む０．１Ｍ　Ｔｒｉ−Ｍ
ＣＩ（ｐＨ７，５）で４°Ｃ１１２時間透析を行い、さ
らに新しいバッファー溶液で４°Ｃ１１晩透析を行って
、酸化型ＧＭ−Ｃ３Ｆを含む再生溶液を得た。この時、
透析外液の撹拌のためのマグネチンクスクーラーの回転
数を空気が十分液に懸濁されるように１００Ｏｒρｍに
した。以上の各操作を行って得られたＧＭ−Ｃ３Ｆとし
て８２゜３ｍｇを含む再生溶液について、下記条件でＨ
Ｐ　ＬＣにより精製を行った。

ｒＨＰＬｃ−１） カラム：　ＴＳＫｇｅｌ　ＤＥＡＥ−５ＰＷ（東ソー製
）（粒子径１０μｍ、孔径１００ｎｍ１００ｎ、５　Ｘ
１５０ｍｍ　）移動相：Ａ液２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＩＩ
Ｃ１緩衝液（ＰＩ＋７．３）Ｂ液０．５Ｍ塩化ナトリウ
ム含有２０ｍＭＴｒｉｓ−ＩＩｃＩ　１１衝液（Ｐ）１
７．３）グラジェント条件：Ｂ液を５％で１ｏ分間流し
た後、Ｂ液を４５％まで６０分間で直線 的に増加させる。

流ＦｆＪ：　　８，０ｍｆｆ１／ｍｉｎカラム温度：室
温 検出器：紫外線吸収計（測定波長２８０ｎｍ）保持時間
：４３分 上記の溶出液をさらに下記条件によりＨＰＬＣを用いて
ＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ａ型、Ｂ型、Ｃ型１　Ｄ型。

Ｅ型を分画した。

ＣＨＰ　Ｌ　Ｃ−２］ カラム：マイクロボンダスフェア−Ｃ１０（粒子５μｍ
、細孔径１２ｎｍ）　（１９Ｘ　１５０＋ｎｍ）（ミリ
ポア製） 移動相：Ａ？ｆｉ、　　５ｍＭテトラ−ｎ−ブチルアン
モニウム含有２０ｍＭリン酸塩緩衝液（Ｐｌ！７．０）
Ｂ液　アセトニトリル グラジェント条件：Ｂ液を２０％で１０分間流した後２
ｏ％から３７％まで２０分間、３７ ％から４０％までを９０分間、次 いで４０％から６０％までを１０分 間でそれぞれ直線的に増加さ せる。

流Ｎ：８ｍＲ／ｍｉｎ カラム温度：室温 検出器：紫外線吸収計（測定波長２８０ｎｍ）保持時間
：ＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ａ型　９１分Ｂ型　８４分 Ｃ型　６８分 り型　６３分 Ｅ型　７５分 以上の方法により分画したＧＭ−Ｃ３Ｆについてそれぞ
れ下記条件によりＨＰＬＣを用いて測定した結果　Ａ型
５９．３ｇ、　Ｂ型６．９ｍｇ、　Ｃ型１．６ｍｇ、　
Ｂ型２．５ｍｇ、　Ｂ型３．２ｍｇを得た。

ＧＭ−Ｃ３Ｆの粗精製品の高速液体クロマトグラフを第
２図に示す。

（ＨＰＬＣ条件〕 カラム二マイクロボンダスフェア−ＣＩ６（粒子径５μ
ｍ、細孔径１２ｒ＋ｍ）　（４，６Ｘ　２５ｃｍ）（ミ
リボア！！り 移動相：ＡＭ　　５ｍＭテトラ−ｎ−ブチルアンモニウ
ム含を２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ＰＨ７，０）Ｂ？夜　
アセトニトリル グラジェント条件：Ｂ？Ｆｊ、を２０％から３８％まで
１０分間、３８％から４２％まで４０分間 で直線的に増加させる。

流用：ｌｒｄ／免ｉｎ カラム温度：室温 検出器：紫外線吸収計（測定波長２３０ｎｍ）尖膳炭Ｉ 実験例１で得たＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ａ型を１％炭酸水素ア
ンモニウム溶ｆｉ（ＰＨ８，０）に溶解し、トリプノン
を用いて常法通り分解した。得られた分解物について高
速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣと記す）を
用いて下記条件で分画をおこない次いで、各両分につい
てＦＡＢ−マススペクトルを測定し、それぞれに相当す
るペプチド断片を同定した。

（１（ＰＬＣ条件〕 カラム：ＴＳＫ　　０ＤＳ−１２０７（粒子径５μ。

４．６ｍｍＸ２５０ｍｍ）　（東ソー製）移動相：Ａ液
　０．１２％トリフルオロ酢酸水溶液Ｂ？ｔＩ　　Ｏ，
１％トリフルオロ酢酸アセトニトリル溶？夜 グラジェント条件：Ｂ液を５％から３６％まで３１分間
で、次いで３６％から６５％ま で５８分間でそれぞれ直線的に 増加させる。

流　量：１ｍ１／ｍｉｎ カラム温度二室温 検出基：紫外線吸収計（測定波長２３０ｍｍ）同様に、
ＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ｅ型のトリプシン分解物をＨＰＬＣを
用いて分析し、Ａ型のトリプシン分解物のＨＰＬＣによ
る分析結果と比較したところ、Ａ型のアミノ酸配列７６
番から８６番のペプチド断片に相当するピークが消失し
、新たなピークが検出された。

以上の結果より、ＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ｅ型は、アミノ酸配
列７６番目から８６番目のペプチド断片中に０ＭＣ３Ｆ
　　Ａ型との相違点を有することが推定された。

次に、ＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ｅ型のトリプシン分解物につい
てＦＡＢ−マススペクトルを測定し、−次構造の解析を
おこなったところ、アミノ酸配列７６番目から８６番の
ペプチド断片に相当するピークより分子量にして１６大
きいピークが検出された。その他のシグナルはＧＭ−Ｃ
３Ｆ　　Ａ型と一敗した。

以上の結果より、８０番目のアミノ酸であるメチオニン
が、スルホキシド化されていると推定された。

また、ＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ｅ型のトリプシン分解物のうち
ジスルフィド結合を含むペプチド断片をＨＰＬＣにより
分画し、次いでスタヒロコツ力ル　プロテアーゼＶ　Ｂ
　（Ｓｔａｐｌｙｌｏｃｏｃｃａｌ　ｐｒｏｔｅａｓｅ
Ｖ　８　）を用いて常法通り分解した。得られた分解物
についてＦＡＢ−マススペクトルを測定し、−次構造の
解析をおこなったところＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ａ型のピーク
と一敗した。

この結果、ＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ｅ型のジスルフィド結合は
ＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ａ型と同一であるこ七が確認された。

次に、ＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ａ型のアミノ酸配列７６番から
８６番のペプチド断片をＨＰＬＣを用いて分画し、２％
Ｈ２０□で酸化を行った。酸化物をＨＰＬＣを用いて分
析したところ、メチオニンスルホキシド体と推定された
ピークと同じ保持時間に溶出された。また、この酸化物
とＨＰＬＣを用いて分画したＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ｅ型のメ
チオニンスルホキシド体と推定されるペプチド断片を混
合して分析したところ完全に溶出位置は重なった。

以上の結果からＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ｅ型は８０番目のメチ
オニンがスルホキシド化されたものであることが判明し
た。

同様にＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型について一次
構造の解析をおこなった結果、Ｂ型はＮ末端のメチオニ
ンがスルホキシド化されたもの、Ｃ型は３７番目のメチ
オニンがスルホキシド化されたもの、Ｄ型は４７番目の
メチオニンがスルホキシド化されたものであることが判
明した。

試験方法：ハムスター大腿骨を無菌的に摘出し、２％牛
脂児血清含存ａ　−Ｍ　Ｅ　Ｍ培養液（Ｓｔａｎｎｅｒ
ｓＣ，Ｐ、、ｅｔ、ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　Ｎｅｗ　Ｂ
ｉｏｌｏｇｙ、２３０：５２（１９７２）（Ｆｌｏｗ社
製））を注入し、骨髄細胞を洗い出した。

この細胞をピペンティングでばらばらにし、３分間静置
する。細胞浮遊液をとり、同じ培養液で洗浄した後、４
０％牛脂児血清含有α−ＭＥＭ培養液でｌＸｌ０／ｍｆ
ｆ１の細胞濃度に調製する。この骨髄細胞浮遊液および
２％牛脂児血清含有α−ＭＥＭ培養液で段階的に希釈し
たヒトＧＭ−Ｃ３Ｆをウェルに１００μｌずつ入れて３
７°Ｃ１５％−酸化炭素の条件下で培養する。培養４２
時間後にα−ＭＥＭ培養ン夜で４０μｃ　ｉ　／　ｍｌ
に８周製したトリチウム１５識チミジンを２５μ！ずつ
各ウェルに添加しさらに６時間培養後、細胞に取り込ま
れた放射活性を測定する。

（ｃｖ／ｃｃ）　／　２のトリチウム標識チミジン取り
込みを誘導するＣＭ−Ｃ３ＦＩを５０単位／ｍρと定義
して、Ｃ，Ｍ−Ｃ３Ｆの比活性を求めた。但し、ＣＶは
最大トリチウム標識チミジン取り込み量、ＣＣはＧＭ−
Ｃ３Ｆ非存在下に取り込まれたトリチウム標識チミジン
量を表わす。

試験結果： 表　　１ 表１の結果から、ＣＭ−Ｃ３Ｆ　　Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型お
よびＥ型はＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ａ型と同様、ハムスター骨
髄細胞コロニー形成活性を有することが認められた。

試験方法：　Ｃ，Ｇ、　Ｂｅｇｌｅｙらの方法（Ｃ，Ｇ
、　Ｂｅｇｌｅｙｅｔ　ａｌ、　Ｂｌｏｏｄ　　６８１
６２−１６６（１９８６））により行なった。なおＧＭ
−Ｃ３Ｆ　　Ａ型のヒト骨ＶＢ細胞コロニー形成能を試
験し、その活性値（１，ＯＸ　１０９単位／ｍ１）を対
照として他のＧＭ−Ｃ３ＦＯ比活性を算出した。

試験結果： 表２ ン、Ｙ＝チロシンを各々表す。

第２図は実施例にて用いた粗製品ＧＭ Ｃ３Ｆの 高速液体クロマトグラムを示す。

表２の結果から、ＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、
Ｅ型はＧＭ−Ｃ３Ｆ　　Ａ型と同様、好中球生存維持活
性を有することが認められた。

【図面の簡単な説明】

第１図は組み換え大腸菌由来のＧＭ−Ｃ３Ｆのアミノ酸
配列を示す。 但し、Ａ：アラニン、Ｃニジスティン、Ｄ：アスパラギ
ン酸、Ｅ：グルタミン酸、Ｆ：フェニルアラニン、Ｇ：
グリシノ、Ｈ：ヒスチジン、■；イソロイシン、Ｋ：リ
ジン、Ｌ：ロイシン、Ｍ；メチオニン、Ｎ：アスパラギ
ン、Ｐニブロリン、Ｑ：グルタミン、Ｒ：アルギニン、
Ｓ：セリン、Ｔ：スレオニン、■ｚバリン、Ｗ：トリプ
トファ第１図 保持時間（分）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）第１図記載のアミノ酸配列で特定されるヒト顆粒
   球マクロファージコロニー刺激因子のＮ末端のメチオニ
   ン残基あるいは、ポリペプチド中のメチオニン残基が、
   少なくともひとつ以上スルホキシド化されたポリペプチ
   ド
2. （２）第１図記載のアミノ酸配列のＮ末端、３７番目、
   ４７番目、或いは８０番目のアミノ酸であるメチオニン
   残基のうちのいずれかがスルホキシド化された請求項１
   記載のポリペプチド