KR20080091441A

KR20080091441A - 인자 ｈ 농축물의 제조방법 및 약물의 형태로서의 그의용도

Info

Publication number: KR20080091441A
Application number: KR1020087016073A
Authority: KR
Inventors: 사미 쵸로 압데사따르; 클로딩 마주리; 미첼 플레; 베르나데트 꼬방; 프레드릭 드하이넝뜨
Original assignee: 라보라토이레 프란카이스 듀 프락티온네멘트 에트 데스 바이오테크놀로지스 소시에테 애너님
Priority date: 2005-12-07
Filing date: 2006-12-07
Publication date: 2008-10-13
Also published as: JP2012211189A; US20080318841A1; AU2006323849B2; WO2007066017A3; CN101336111A; EP1962885A2; CA2633102A1; JP2009518368A; WO2007066017A2; FR2894145B1; FR2894145A1; CN102988958A; AU2006323849A1; IL191931A0; BRPI0619728A2

Abstract

본 발명은 용혈성 요독 증후군(HUS ; Hemolytic Uremic Syndrome)의 치료용의 약물의 제조를 위한 인자 H의 용도, 신성동결혈장으로부터 인자 H를 정제하기 위한 방법 및 이러한 방법에 의해 수득된 인자 H에 관한 것으로서, 본 발명의 주 목적은 용혈성 요독 증후군, 특히 전형적인 형태의 용혈성 요독 증후군 또는 비전형적인 형태의 용혈성 요독 증후군의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 인자 H의 용도이다.

용혈성 요독 증후군, 인자 H, 신성동결혈장, 크로마토그래피

Description

인자 Ｈ 농축물의 제조방법 및 약물의 형태로서의 그의 용도 {Method for preparing a factor H concentrate and the use thereof in the form of a drug}

본 발명은 용혈성 요독 증후군(HUS ; Hemolytic Uremic Syndrome)의 치료용의 약물의 제조를 위한 인자 H의 용도, 신성동결혈장으로부터 인자 H를 정제하기 위한 방법 및 이러한 방법에 의해 수득된 인자 H에 관한 것이다.

용혈성 요독 증후군은 미세혈병증성 용혈성 빈혈(micro-angiopathic hemolytic anemia), 저혈소판증(thrombopenia) 및 신장질환(renal affection)의 결합으로 정의된다. 이는 3세 이하의 소아들에서의 급성신부전(acute renal failures)의 주원인이다.

2가지 형태의 용혈성 요독 증후군들이 존재한다.

전형적인 형태에 있어서는, 용혈성 요독 증후군은 하절기 동안에 종종 피가 섞인 설사 이후에 발생한다. 전형적인 용혈성 요독 증후군은 대부분의 경우들에 있어서 장관병원성 대장균(enteropathogenic Escherichia coli), 특히 베로톡신(verotoxins)의 프로듀서(producer)인 세로타입(serotype) O157:H7의 감염의 2차질환이다.

상기 전형적인 형태 이외에, 특정의 환자들은 다른 양상을 갖는다. 비전형 적인 용혈성 요독 증후군들은 전구증(prodromes)들을 나타내지 않으며, 종종 만성신부전을 야기하는 보다 만성적인 경로를 갖는다. 전형적인 용혈성 요독 증후군은 모든 연령들에서 발생할 수 있다. 단지 이 증례들의 5%에 해당하는 양 만이 어린이들에서 나타난다. 이 증후군의 임상적 신호들은 소혈관(small vessels)들 내의 혈소판-풍부 미세덩어리(platelet-rich microclots)들에 기인한다. 이는 특히 급성신부전을 야기하는 신장의 사구체(glomerules)들에 영향을 준다. 전형적인 용혈성 요독 증후군은 돌발성이기는 하나 종종 가족성이기도 하다. 이들 상황들 둘 다에서, 상기 질병은 대체로 악화(exacerbation)에 의한 재발성 발달(recurrent development)을 갖는다. 그 전구증은 낮다. 더욱이, 신장이식 후 이 질병의 재발의 위험이 매우 높으며, 대부분의 경우들에서 이식거부를 야기한다.

용혈성 요독 증후군은 저보체혈증(hypocomplementemia)과 연관될 수 있다.

보체(complement)는 감염성의 매개자(infectious agents)들 및 감염과정들에 대한 유기체들의 방어에 있어서 필수적인 역할을 수행한다.

이는 숙주세포(host cells)들을 자가-공격(self-attack)으로부터 보호하는 세포막조절단백질(membrane regulatory proteins)들과 마찬가지로 특정의 몇몇들이 염증성 세포(inflammatory cells)들 상에 존재하는 많은 서로 다른 많은 세포표면수용기(cell surface receptors)들 및 면역체계의 세포들 상의 다른 것들의 2가지 혈장 단백질들을 포함한다.

상기 보체의 상기 혈장 단백질들은 약 20종이며, 효소들이나 결합단백질들로서 또는 조절자(억제제 또는 활성화제)들로서 작용한다.

상기 보체는 통상 경로와 대체 경로의 2가지 서로 다른 경로들을 통하여 활성화될 수 있다.

효소단계들을 고딕 화살표들로 나타내었다. 조절단백질들은 상자들 내에 기재하였으며, 막단백질들은 고딕체들이고, 순환단백질들(이들 중에는 FH로 언급되는 인자 H들이 속한다)은 이탤릭체들이다.

상기 통상 경로는 이물질입자(foreign particle)에 결합되는 항체들에 의해 활성화된다. 따라서 이는 항체들에 의존한다.

상기 대체 경로는 미생물들의 침입에 의해 활성화되며, 따라서 이는 항체들에 독립적이고 그리고 박테리아성 감염들을 방어함에 있어서 극히 중요하다.

상기 인자 H는 혈장 내에서 110 내지 615㎍/㎖의 농도로 존재하는 155kDa(킬로달톤) 단백질이다. 이는 간, 마크로파지, 섬유아세포, 내피세포(endothelial cell) 및 혈소판들에서 합성된다. 상기 단백질의 분비된 형태는 60개의 아미노산들의 20개의 반복단위들로 이루어진다. 상기 인자 H는 상기 보체의 상기 대체 경 로의 중심조절자(central regulator)이다. 이는 혈액 내에서의 면역 복합체(immune complexes)들의 비율(rate)의 제어에 관계되며, 따라서 그들의 생성 또는 그들의 분해의 결과를 가져오는 과정들 사이에서의 평형에 관계된다.

인자 I에 대하여는, 상기 인자 H가 유리되거나 또는 상기 세포들의 표면에 결합된 C3b 분자들 둘 다를 비활성화시킨다. 따라서, 상기 C3b 보체의 성분들과 착물화된 항원-항체 복합체로 이루어지는 상기 면역 복합체들은 더 이상 후속하는 상기 보체(C5 내지 C9들의 성분들)의 후속 반응(subsequent cascade)을 활성화시킬 수 없게 된다.

상기 인자 H의 기능은 3가지 주요 활성들로 나누어질 수 있다.

1) 상기 인자 H는 무엇보다도 상기 인자 I의 공동 인자(co-factor)로서 행동한다. 따라서, 상기 인자 H 및 상기 인자 I는 상기 단백질 C3b의 사슬 ㆍ의 절단에 의해 상기 보체의 상기 C3b 단백질의 C3bi(비활성 분자)로의 변형으로 진행한다. 그에 의하여 상기 비활성화된 단백질 C3b는 상기 보체의 작동에 있어서의 그 의 역할을 더 이상 수행하지 못하고, 상기 C3 변환효소(C3 convertase)의 형성에 더 이상 관여할 수 없다.

2) 상기 인자 H는 결합 메카니즘들에서 내피세포들 및 혈소판들에 관여한다.

3) 마지막으로 상기 인자 H는 상기 보체의 활성화의 대체 경로에서 사전형성된 C3 변환효소(C3bBb)의 분해에 관여한다. 이 후자의 활성은 직접적으로 상기 인자 H의 분자 특성(molecular integrity)에 직접적으로 의존하며, 특히 상기 인자 H 내에서 원래의 asn323-asn324 결합의 존재에 보다 특히 의존적이라는 것이 입증되 었다.

상기 인자 H의 결핍 또는 부재는 비전형적인 용혈성 요독 증후군의 많은 케이스들의 원인이 되며, 따라서 상기 보체의 과활성화(hyperactivation)를 야기하고, 이는 특정의 환자들에서 신장의 생검 동안에의 C3 단백질들의 침적의 관찰에 의해 그리고 혈류 중에 존재하는 상기 C3 단백질 수준의 감소에 의해 표현되었다.

비전형적인 용혈성 요독 증후군에 감염된 특정의 환자들에 있어서, 상기 낮은 C3 수준은 단지 상기 질병의 급상 성태 동안에만 관찰되었다. 정성적인 그리고 정량적인 인자 H의 결핍의 역할이 종종 특정의 비전형적인 용혈성 요독 증후군의 발병(pathogeny)에서 C3의 수준에서의 감소와 관련된 것이라는 강력한 논쟁들이 있다(Rougier N, Kazatchkine MD et al., Human complement factor H deficiency associated with hemolytic uremic syndrome, J. Am. Soc. Nephrol. 1998; 9:2318-2326).

인자 H의 결핍은 C3의 낮은 수준을 초래하는 상기 보체의 대체 경로의 영구적인 활성화를 초래한다.

상기 비전형적인 용혈성 요독 증후군과 크로모좀 1(chromosome 1) 상에 위치하는 상기 보체, 특히 인자 H의 조절성 단백질들의 코딩을 위한 영역 사이의 관계가 입증되었다(Noris et al., Hypocomplementemia discloses genetic predisposition to hemolytic uremic syndrome and thrombotic thrombocytopenic purpura: role of Factor H abnormalities, J. Am. Soc. Nephrol. 1999, 10:281-293); (Warwicker et al., Genetic studies into hemolytic uremic syndrome, Kidney Int., 1998; 53:836-844); (Warwicker et al., Familial relapsing hemolytic uremic syndrome and complement Factor H deficiency, Nephrol . Dial . Transplant ., 1999; 14:1229-1233).

계속해서 상기 인자 H의 유전자의 돌연변이들이 열성 또는 우성의 상염색체 유전(autosomal transmission)의 용혈성 요독 증후군의 가족성의 형태로 확인되었다(Buddles et al., Complement Factor H gene mutation associated with autosomal recessive atypical hemolytic uremic syndrome, Am . J. Hum . Genet., 2000; 66:1721-1722); (Caprioli et al, The molecular basis of familial hemolytic uremic syndrome: mutation analysis of Factor H gene reveals a hot spot in short consensus repeat 20, J. Am. Soc . Nephrol. 2001; 12:297-307); (Ohali et al., Hypocomplementemic autosomal recessive hemolytic uremic syndrome with decreased Factor H, Pediatr . Nephrol. 1998; 12:619-624); (Ying et al., Complement Factor H gene mutation associated with autosomal recessive atypical hemolytic uremic syndrome, Am . J. Hum . Genet. 1999; 65:1538-1546).

용혈성 요독 증후군의 비전형적인 형태를 갖는 환자들에서의 이식 후 재발이 약 25%의 케이스로 관찰되었다. 재발의 경우에서의 예후는 좋지 않다; 재발과 관련된 이식의 손실이 일반적이다.

종래 기술

혈장 교체와 함께 또는 교체 없이 신성동결혈장의 관주(perfusion)으로 이루어지는 제1의 의도적 처치가 용혈성 요독 증후군에서의 보체의 역할이 알려지기 훨 씬 이전인 70년대에 경험적으로 착수되었다. 오늘날, 혈장 교체와 함께 또는 교체 없이 신성동결혈장의 관주들은 기본적으로 용혈성 요독 증후군 치료에 기본적으로 사용되고 있다. 그러나, 신성동결혈장의 관주의 양 및 빈도는 여전히 경험적으로 결정된다.

이들 관주들은 주 2회 내지 월 2회의 정기적인 시간간격으로 반복되어야 하며, 각 관주는 2 내지 3시간이 걸린다.

따라서 이러한 처치는 환자로서는 시간이 많이 걸리고 반복적이다.

주입된, 신성동결혈장의 양은 상당하며, 이는 신성동결혈장 관주의 표준 위험(standard risks)들을 증가시킨다.

첫 번째로, 신성동결혈장(FFP)은 항-A 또는 항-B 해몰리신(haemolysines)들을 포함하며, 이는 대응하는 해몰리신에 대하여 동일한 ABO 그룹을 갖는 환자들 또는 기껏해야 항원 A 또는 항원 B들을 결여하는 환자들에 지정되어야 한다(적혈구 세포들에 대해 대향되는 적합성의 법칙). 이들 법칙들의 불이행은 이를 받는 사람(receiver)을 수혈-후 ABO 부적합에 의한 적혈구 세포들의 용혈에 노출시킨다.

더욱이, 레서스 시스템(Rhesus system)의 항원 D에 대한 동종면역의 어떠한 위험도 피하기 위한 목적으로, 무엇보다도 위험한 환자(소녀들, 출산기의 여성들, 다중-수혈자)들에서 관주들이 수행될 필요가 있으며, 여기에서 상기 환자 및 기증자(donor)는 이 항원의 수준에서 동일한 특성들을 갖는다.

두 번째로, 신성동결혈장, 특히 인비로순화혈장(VAP ; in viro-attenuated plasma) 내의 인산 농도가 매우 높기(9 내지 12mmol/ℓ) 때문에 신성동결혈장이 용 혈성 요독 증후군 환자들에서 고인산혈증(hyperphosphatemia)을 야기할 수 있으며, 상기 용혈성 요독 증후군 환자는 신부전으로 고통을 받는다. 인비로순화혈장 내에서의 높은 인산 농도는 인비로순화혈장을 수혈한 환자들에서 다음과 같은 많은 경우들에서 고인산혈증을 야기하는 것으로 여겨진다:

- 수혈된 인비로순화혈장 용적들이 충분하고,

- 이들이 매일 반복되고,

- 환자에서 신부전이 이미 존재하고,

- 환자에서 고인산혈증이 이미 존재함.

다음으로, 인비로순화혈장의 수혈 양은 단백질 과부하 및/또는 순환되는 칼슘의 농도를 감소시키는 구연산염 과부하를 야기할 수 있다.

마지막으로, 인비로순화혈장은 감염성 매개자들의 전염과 마찬가지로 알러지의 위험을 야기한다. 결국, 현재의 검출 및 비활성화 방법들은 신성동결혈장 내에 잠재적으로 존재하는 감염성의 매개자들의 검출의 허용 및 제거에 대하여 항상 충분한 민감도 및 비활성화 능력을 갖지는 못하고 있다.

이뇨에 의해 제거된 것과 정상적인 동맥의 압력에 대해 관주된 용량들이 너무 큰 경우, 신성동결혈장 관주들로의 혈장 교체들의 결합이 필수적이다. 이러한 결합은 주로 혈관 접근(중앙 경로의 요구), 용량 과부하, 과민 반응, 응집의 문제점들 및 바이러스성 질병들의 전염에 주로 기인하는 명백한 부가적인 위험들을 갖는다.

더욱이, 혈장 교체들은 어린 아이들에 적용하기에는 어렵다.

또 다른 처치는 신장 이식으로 구성된다. 그러나, 이식 후의 재발의 위험이 매우 높다.

더욱이, 비전형적인 용혈성 요독 증후군 환자들에서의 신장이식 이후의 진단은 매우 어려울 수 있다. 이식의 생검에 대한 재발과 급성 혈관 거부 또는 만성 거부를 구별하는 것은 어려울 수 있다.

재발의 처치는 신성동결혈장의 관주, 매우 예기할 수 없는 결과들을 갖는 혈장 관주들과 함께 또는 관주들 없이의 혈장 교체들로 이루어진다. 이들 예기할 수 없는 결과들은 각 관주가 여러 기증자들로부터의 기증들의 집단(pool)이며, 균질한 배치(homogenous batch)를 갖는 상기 신성동결혈장의 관주들의 횟수 및 용량들로 설명될 수 있다.

상기 인자 H가 간에서 합성되기 때문에, 간 이식 또는 간-신장의 복합 이식의 제안이 논리적인 것으로 보여진다.

이러한 이식은 의사들과 환자들에게는 항상 어려운 선택이며, 수술 위험들 및 간 이식의 거부의 위험성들을 갖는다.

발명의 요약

선행기술들의 이들 단점들의 치유책을 찾기 위하여, 본 출원인은 놀랍게도 용혈성 요독 증후군의 치료를 위하여 고안된 약물의 제조에 인자 H를 사용하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다.

예를 들면 신성동결혈장으로부터 유도되는 인자 H 농축물로서의 상기 인자 H에 대하여는, 용혈성 요독 증후군에 감염된 환자들에서의 인자 H의 결핍을 회복하는 한편으로 안전하고 안정하며 효과적인 제품으로 주입되는 용적들 및 주사 횟수들을 감소시키는 것이 가능하다.

특히, 간 이식 직후의 기간에서 상기 인자 H를 관리하는 것에 의하여 이식된 간에 의한 낮은 인자 H 생성 및 그에 따른 즉각적인 이식의 악화 및 거부를 보완하는 것이 가능하다.

또한 본 발명은 인자 H를 정제하는 방법에 관한 것으로서, 이는

1) 혈장의 냉동침전물(cryoprecipitate)의 상층액(supernatant)을 준비하는 단계,

2) 이 상층액을 음이온교환형(anion exchange type)의 겔/수지 상에서 크로마토그래피에 적용시키는 단계,

3) 보류되지 않은 분획을 헤파린 형태(heparin type)의 분지된 리간드를 포함하는 겔/수지 상에서의 크로마토그래피에 적용시키는 단계,

4) 상기 단계 3)의 크로마토그래피 후의 보류되지 않은 분획의 pH를 조정하여 상기 인자 H가 헤파린 형태의 분지된 리간드를 포함하는 크로마토그래피의 지지체 겔/수지에 결합되는 것을 허용하도록 하는 단계,

5) 상기 인자 H를 상기 겔/수지를 평형화시키기 위한 완충제(buffer)의 이온력 보다 더 큰 이온력의 완충제로 용리시키는 단계,

6) 상기 용리된 분획을 희석시키고 그리고 계속해서 이를 강산 양이온교환 형태의 겔/수지 상에서의 크로마토그래피에 적용시키는 단계,

7) 상기 인자 H를 상기 겔/수지를 평형화시키기 위한 완충제의 이온력 보다 더 큰 이온력의 완충제로 용리시키는 단계,

8) 상기 용리된 분획을 희석시키고 그리고 계속해서 이를 강산 음이온교환 형태의 겔/수지 상에서의 크로마토그래피에 적용시키는 단계,

9) 상기 겔/수지를 세척하고 그리고 상기 인자 H를 용리시키는 단계, 및

10) 인자 H의 농축물을 준비하는 단계

를 포함하여 이루어진다.

도 1은 인자 H를 정제하는 방법을 나타내는 다이아그램이다.

도 2는 인자 H에 의한 C3 변환효소의 분해를 나타내는 그래프이다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 주 목적은 용혈성 요독 증후군, 특히 전형적인 형태의 용혈성 요독 증후군 또는 비전형적인 형태의 용혈성 요독 증후군의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 인자 H의 사용이다.

본 발명의 바람직한 실시예는 용혈성 요독 증후군의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 인자 H의 용도이며, 상기 인자 H는 신선한 인간 혈장 또는 당해 기술분야에서 숙련된 자에게 잘 알려진 표준 방법들에 의한 정제로부터 유래되는 혈장 분획들이다.

이러한 정제는 당해 기술분야에서 숙련된 자에게는 잘 알려진 것이다. 이는 리신-세파로스(lysine-sepharose), QAE-세파덱스(4급아민트리메틸아미노에틸(quaternary amine(trimethyl-aminoethyl)-Sephadex), DEAE-토요펄(DEAE(Diethylaminoethyl)-Toyopearl), 세파크릴 에스-300(Sephacryl S-300) 및 히드록시아파타이트(hydroxyapatite) 컬럼들을 사용하는 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다.

이는 이하의 문서들에서 상세하게 설명되어 있다(Fearon, J. Immunol. 119, 1248-1252 (1977); Crossley et al., Biochem . J., 191, 173-182, (1980); Nagasawa et al., J. Immunol., 125, 578-582, (1980); Weiler et al., P.N.A.S., 73, 3268-3272, (1976) and Whaley et al., J. Exp . Med., 144, 1147-1163 (1976)).

신성동결혈장으로부터 정제된 결과의 인자 H는 예를 들면 인자 H 농축물의 형태로 발견된다.

본 발명의 다른 실시예는 용혈성 요독 증후군의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 인자 H의 사용이며, 상기 인자 H는 유전공학에 의해, 박테리아, 효모, 곰팡이 또는 포유동물 세포들로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 세포 내에서의 그의 유전자의 발현에 의해 수득된 것이 될 수 있다.

본 발명의 특정의 실시예는 용혈성 요독 증후군의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 인자 H의 사용이며, 그에 의해 수득된 약물은 동결건조된 형태가 될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예는 용혈성 요독 증후군의 치료를 위한 약물의 제조 를 위한 인자 H의 사용이며, 그에 의해 수득된 약물은 적어도 하나의 감염성의 매개자를 제거하거나 또는 비활성화시키는 적어도 하나의 방법에 적용된다.

상기 감염성의 매개자들 중에는, 바이러스 및 프라이언 단백질(prion protein) 등과 같은 비전형적인 전염성의 매개자(NCTA ; non-conventional transmissible agents)들이 언급될 수 있다.

특히, 상기 약물은 바이러스성으로 비활성화될 수 있다.

"바이러스성으로 비활성화"는 상기 약물이 예를 들면 용제/계면활성제 등과 같은 화학약품들의 처치, 및/또는 예를 들면 건열처리(dry heating) 또는 멸균처리 등과 같은 열에 의해, 및/또는 나노여과(nanofiltration)에 의해 당해 기술분야에서 숙련된 자에게 공지된 적어도 하나의 바이러스성 비활성화 방법에 적용되는 것을 의미한다.

이들 방법들 중의 어느 것에 의해 비활성화될 수 있는 바이러스들에는 인간면역결핍바이러스(HIV ; human immunodeficiency virus), A형간염바이러스(HAV ; hepatitis A virus), B형간염바이러스(HBV ; hepatitis B virus), B19파보바이러스(B19 parvovirus), 세포거대바이러스(CMV ; cytomegalovirus (CMV), 돼지파보바이러스(porcine parvovirus), 소아마비바이러스(polio virus), 소바이러스성설사바이러스(BVDV ; bovine viral diarrhea virus) 등이 포함된다.

본 발명의 또 다른 목적은 예를 들어 앞서 기술한 바와 같이 동결건조되고 그리고 비활성화되었으며, 인자 H 및 약제학적으로 수용가능한 부형제들 및/또는 담체들을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 인자 H를 정제하는 방법에 관한 것으로서, 이는

1) 혈장의 냉동침전물의 상층액을 준비하는 단계,

2) 이 상층액을 음이온교환형의 겔/수지 상에서 크로마토그래피에 적용시키는 단계,

3) 보류되지 않은 분획을 헤파린 형태의 분지된 리간드를 포함하는 겔/수지 상에서의 크로마토그래피에 적용시키는 단계,

5) 상기 인자 H를 상기 겔/수지를 평형화시키기 위한 완충제의 이온력 보다 더 큰 이온력의 완충제로 용리시키는 단계,

10) 인자 H의 농축물을 준비하는 단계

를 포함하여 이루어진다.

본 발명의 특정의 실시예에 있어서, 그 위에 단계 3)을 위한 헤파린 리간드가 분지되는 상기 크로마토그래피 지지체는 세파로스 헤파린 겔/수지(sepharose heparin gel/resin)이다.

본 발명의 특정의 실시예에 있어서, 그 위에 단계 4)를 위한 헤파린 리간드가 분지되는 상기 크로마토그래피 지지체는 세파로스 헤파린 겔/수지이다.

본 발명의 특정의 실시예에 있어서, 단계 6)의 상기 강산 양이온교환 형태의 겔/수지 상에서의 크로마토그래피는 에스피 세파로스 형태(SP sepharose type)의 크로마토그래피이다.

본 발명의 특정의 실시예에 있어서, 단계 8)의 상기 강산 음이온교환 형태의 겔/수지 상에서의 크로마토그래피는 큐 세파로스 에프에프 형태(Q sepharose FF type) 또는 동등물의 크로마토그래피이다.

유리하게, 단계 4)의 상기 보류되지 않은 분획의 pH는 pH 5.5 내지 6.5의 범위 이내에 포함되도록 그리고 바람직하게는 pH 6.0과 동일하게 되도록 조정된다.

유리하게, 단계 8)의 상기 희석된 분획의 pH는 pH 6.5 내지 7.5의 범위 이내에 포함되도록 조정된다.

본 발명의 정제 방법은 공업화될 수 있는 것으로 입증된 것으로서 혈장으로부터 유래하는 인자 H를 정제하기 위한 유일하게 공지된 방법이며, 이 방법으로 화학적인 또는 합성의 프로테아제(proteases)들 없이 정제된 인자 H 농축물이 수득될 수 있으며, 따라서 최종 생성물에서 이들 저해제들의 어떠한 흔적량도 남기지 않는다.

결국, 당해 기술분야의 현재 상태에서 공지된, 인간 혈장으로부터 인자 H를 정제하기 위한 방법들이 때로 침전정제기법들(예를 들면 PEG ; 황산암모늄)에 의해 기초연구의 관점에서 적용되었으며, 이는 공업화되기 어려우며, 프로테아제 저해제들을 가지고 있다. 이들 프로테아제 저해제들은 혈청 및 혈장 내에 존재하는 트립신 형의 단백질들의 작용을 저해하며, 이는 상기 인자 H 분자의 asn323 및 asn324 아미노산들을 결합하는 단백질 결합을 절단한다. 따라서, 프로테아제 저해제들의 첨가는 이 인자의 단백질분해를 감소시키는 데 기여하며, 따라서 그의 안정성을 증가시킨다. 그러나, 상기 프로테아제 저해제들은 종종 고도로 독성인 화합물들이며, 이는 치료적인 용도를 목적으로 하는 인자 H의 생산을 위한 공업적인 방법으로는 적절하지 못하도록 한다.

더욱이, 본 발명의 상기 방법은 3가지 형태들의 주요 활성들이 보류된 인자 H 농축물이 수득될 수 있다는 명백한 잇점을 가지며, 이는 당해 기술분야에서의 현재 상태에서 기술된 인자 H들 중 어느 것도 가지지 못하고 있는 것이다. 따라서 본 발명의 상기 방법에 의해 수득되는 상기 인자 H는 상기 보체의 대체 경로의 중심조절자의 활성을 만족하며, 이 활성은 용혈성 요독 증후군에 의해 그러고 주로 비전형적인 용혈성 요독 증후군에 의해 감염된 환자들에서 결핍된 것으로 증명된 것이다. 특히, 본 발명의 상기 방법에 의해 생산된 상기 인자 H는 상기 보체의 상기 대체 경로에서 사전형성된 C3 변환효소를 해리시키는 활성을 보류하며, 그의 완전한 기능적인 활성의 수단들에 의해 용혈성 요독 증후군을 치료하는 데 사용할 수 있는 것으로 증명된 것이다.

더욱이 본 발명의 상기 방법에 의해 수득된 상기 인자 H 농축물은 1(AS = 0.8 내지 0.9)에 근접하는 특정의 활성을 가지며, 이는 본 출원의 도입부에서 기술된 바와 같이 비록 치료학적으로 유효하기는 하나 많은 단점들을 갖는 신성동결혈장의 용액(AS=0.008)에 비해 보다 효과적이다. 이들 단점들중에서, 혈장의 투여는 용혈성 요독 증후군의 치료를 위한 불필요한 부가적인 단백질들을 유기체 내로 도입시키며(알부민, 피브리노겐...), 이들은 다른 한편으로는 단백질 과부하와 관련된 바람직하지 않은 반응들을 촉발시키거나 또는 "혈청병(serum disease)"라고 알려진 알러지 반응들을 야기할 수 있다.

마지막으로, 혈장 내에 존재하는 전염가능한 바이러스들의 비활성화는 대체로 더 어렵고 또한 혈액 유도체들 내에 존재하는 바이러스들을 비활성화시키는 것 보다 덜 수행되고 있다. 따라서, 본 발명의 상기 방법에 의해 수득된 상기 인자 H 농축물은 기록된 바이러스성 안전성을 제공하는 인지되고 그리고 시험된 처치들로부터 잇점을 가질 수 있다.

실시예

실시예 1 : 인자 H의 정제 방법

상기 인자 H를 정제하기 위하여 적용한 방법을 도 1에 계통적으로 나타내었다.

인간 신성동결혈장을 1 내지 6℃ 사이의 온도에서 해동시키고, 계속해서 상기 냉동침전물의 상기 혈장 상층액을 원심분리에 의해 상기 냉동침전물의 불용분획(insoluble fraction)으로부터 분리시켰다.

인자 H의 농도가 인자 H/ℓ의 400 내지 500㎎의 범위로 포함된 상기 수득된 냉동침전물의 상기 혈장 상층액을 음이온교환 형태의 수지/겔(예를 들면, DEAE 세파덱스 형태의 겔/수지) 상에서 크로마토그래피에 적용시켜 상기 수지/겔 상에서 이들 인자들을 보류시키는 것에 의해 상기 혈장 상층액으로부터 비타민 K에 따라 상기 인자들을 분리시켰다.

계속해서 인자 H의 농도가 인자 H/ℓ의 400 내지 500㎎의 범위로 포함된 상기 보류되지 않은 혈장 상층액 분획(분획 A)을 헤파린 세파로스 에프에프 형태(heparin sepharose FF type)의 겔/수지 상에서 친화성 크로마토그래피에 적용시켜 상기 수지/겔 상에서 항트롬빈III(antithrombin III)을 보류시키는 것에 의하여 이 분획 A로부터 항트롬빈 III을 분리시켰다.

인자 H의 농도가 인자 H/ℓ의 300 내지 400㎎의 범위로 포함된 이 보류되지 않은 분획 A의 pH(분획 B)는 pH 5.5 내지 6.5의 범위 내에 포함되도록, 바람직하게는 pH 6.0과 동일하게 되도록 조정된다.

그 pH가 조정된 상기 분획 B는 헤파린 세파로스 에프에프 형태의 제2 겔/수지 또는 헤파린 형태의 분지된 리간드들을 포함하는 임의의 다른 크로마토그래피 지지체 상에서 크로마토그래피에 적용되었다. 계속해서 혈장 분획 B 내에 포함된 대부분의 단백질들이 크로마토그래피 여과로 용리되었다. 상기 겔/수지 상에 약하게 흡착된 상기 단백질들은 일련의 세척 및 사전-용리(pre-elutions)에 의해 제거되었다. 계속해서 상기 겔/수지 상에 보류된 상기 인자 H를 상기 겔/수지를 평형화시키기 위한 완충제의 이온력 보다 더 큰 이온력의 완충제로 용리시켰다.

상기 인자 H를 포함하는 상기 용리된 분획(분획 C)을 희석시키고, 그리고 계속해서 이를 강산 양이온교환 형태, 예를 들면 에스피 세파로스 에프에프 형태(SP sepharose Ff type) 또는 그의 동등물의 겔/수지와 같은 겔/수지 상에서의 크로마토그래피에 적용시켰다. 계속해서 상기 겔/수지 상에 약하게 흡착된 상기 단백질들은 일련의 세척 및 사전-용리에 의해 제거되었다. 계속해서 상기 겔/수지 상에 보류된 상기 인자 H를 상기 겔/수지를 평형화시키기 위한 완충제의 이온력 보다 더 큰 이온력의 완충제로 용리시켰다.

계속해서 상기 인자 H를 포함하는 상기 용리된 분획(분획 D)을 계면활성제 형태, 예를 들면 폴리소르베이트 80(Polysorbate 80) 및 TnBP(트리(n-부틸)인산 ; tri(n-butyl) phosphate) 등과 같은 용제로의 처리에 의한 바이러스성 비활성화 단계에 적용시켰다. 이러한 처리로, 주로 상기 바이러스들, 특히 캡슐화된 형태(encapsulated type)의 바이러스들을 효과적으로 비활성화시키는 것이 가능하다.

계속해서 상기 분획 D를 희석시키고, 그리고 이 분획의 pH를 조정하여 pH 6.5 내지7.5의 범위 이내로 포함되도록 하였다. 계속해서 상기 분획 D를 강산 음이온교환 형태, 예를 들면 큐 세파로스 에프에프 형태(Q sepharose FF type) 또는 그의 동등물 등의 겔/수지와 같은 겔/수지 상에서 크로마토그래피에 적용시켰다. 일련의 세척 후에, 상기 겔/수지 상에 보류된 상기 인자 H를 상기 겔/수지를 평형화시키기 위한 완충제의 이온력 보다 더 큰 이온력의 완충제로 용리시켰다.

상기 계면활성제 형태의 용제로의 처리에 의한 바이러스성 비활성화를 달성하기 위해 앞서 도입된 상기 시약들을 이 크로마토그래피 단계 동안에 제거하였고 그리고 상기 인자 H의 순도 수준을 증가시켰다.

계속해서 상기 인자 H를 포함하는 상기 용리된 분획(분획 E)을 약 15㎚의 기공을 갖는 필터 상에서의 나노여과에 의한 바이러스 제거 단계에 적용시켰다. 이 바이러스 제거 처리는 바이러스들, 특히 작은 크기의 캡슐화되지 않은 바이러스(non-encapsulated viruses)들의 유효한 제거를 제공한다. 그 결과의 용액(분획 F)은 최종적으로 농축되고 그리고 한외여과(ultrafiltration)에 의해 조정하고 계속해서 0.22㎛ 필터 상에서 여과시켰다.

앞서 기술된 상기 정제 방법의 수율 및 이 방법에 의해 정제된 상기 인자 H의 특정의 활성을 2개의 별도의 배치들 상에서 측정하였다. 그에 대응하는 결과들을 하기 표 1에 나타내었다. 상기 특정의 활성(specific activity ; A.S.)을 단백질 ㎎ 당의 인자 H 형태의 항원(㎎)으로 나타내었다.

단계	배치 1		배치 2
단계	수율(%)	A.S.	수율(%)	A.S.
시작	100	0.008	100	0.005
헤파린 세파로스 에프에프 이후	39.2	0.27	44	0.15
에스피 세파로스 이후	92.9	0.68	91	0.55
큐 세파로스 이후	98.8	1.1	86.7	0.9
농축 이후	88.6	0.98	90.7	0.87
여과 이후	81.3	0.92	93.2	0.89

실시예 2: 인자 H의 활성에 대한 용량에 대한 방법

엘리사 플레이트(ELISA plate ; 96-웰 타입)의 웰(well)들을 0.2M 탄산나트륨 완충제 내의 2.5ㆍg/㎖의 농도를 갖는 정제된 C3b 단백질의 용액으로 피복하였다. 이를 위하여, 100㎕의 용액을 상기 웰들 내로 도입시키고 그리고 상기 플레이트들을 37℃에서 1시간 동안 그리고 4℃에서 하룻밤 동안 배양시켰다.

10mM 인산나트륨 완충제, 25mM 염화나트륨, 0.1% 트윈 20(Tween 20)으로 pH 7.2에서 300㎕/웰로 3회의 세척들을 수행하였다.

계속해서 상기 비특이적인 자리(aspecific sites)들이 37℃에서 pH 7.2에서 10mM 인산나트륨 완충제, 25mM 염화나트륨, 트윈 20 0.05%의 용액 300㎕/웰로 1시간 동안 배양시키는 것에 의해 포화시켰다. 다음으로, 앞서 기술한 바와 같은 세척 용액으로 상기 웰들의 세척을 수행하였다.

- 75㎕의 20mM NiCl₂ 모용액(mother solution)(최종 농도 1.5mM) ;

- 1㎎/㎖의 농도의 4㎕의 인자 B(칼바이오켐(Calbiochem) 참조번호 341262) ;

- 1㎎/㎖의 농도의 3㎕의 인자 D(칼바이오켐 참조번호 341273) ; 및

- 918㎕의 10mM의 인산나트륨 완충제, 25mM 염화나트륨, 4% 소혈청알부민(BSA ; Bovine serum albumin)

을 포함하며, pH 7.2의 용액 100㎕를 각 웰에 투입하고 그 후에 37℃에서 2시간 동안 배양시켰다.

계속해서 10mM의 인산나트륨 완충제, 25mM 염화나트륨, 0.1% 트윈 20의 용액으로 pH 7.2에서 300㎕/웰로의 3회의 연속적인 세척을 수행하였다.

각각 20㎍/㎖, 10㎍/㎖, 1㎍/㎖, 0.25㎍/㎖, 0.0625㎍/㎖, 0.015625㎍/㎖, 0.00390625㎍/㎖ 및 0.001㎍/㎖의 인자 H 농도를 갖는 인자 H 용액들의 영역들을 준비하였다. 각 용액 100㎖들을 서로 다른 웰들 내에 투입하고 37℃에서 30분간 배양을 수행하였다.

염소 항-인간 인자 B 항체 용액(goat anti-human factor B antibody solution ; 칼바이오켐 참조번호 341272)을 0.1% 소혈청알부민을 포함하는 pH 7.4의 인산완충용액(PBS ; Phosphate Buffered Saline ; 시그마사 P-3813) 내에서 1/2,000으로 희석시키고, 계속해서 100㎕의 상기 희석된 용액을 상기 웰들 내에 투입시키고 그리고 37℃에서 1시간 동안 배양을 수행하였다.

계속해서 인산완충용액, 0.1% 트윈 20의 용액으로 pH 7.2에서 300㎕/웰로의 3회의 연속적인 세척을 수행하였다. 다음으로, 계속해서 페록시다아제(peroxidase)로 표지되고 그리고 0.1% 소혈청알부민을 포함하는 인산완충용액 내에서 1/10,000으로 희석시킨 항-염소 토끼 항체를 포함하는 용액(a solution containing an anti-goat rabbit antibody labeled with peroxidase (칼바이오켐 참조번호 401515, 1　㎎/㎖) 100㎕를 상기 웰들 내에 투입하여 실온에서 20 내지 25분간 배양시켰다.

계속해서 인산완충용액, 0.1% 트윈 20의 용액으로 pH 7.2에서 300㎕/웰로의 3회의 연속적인 세척을 수행하였다.

구연산나트륨 용액 내의 5㎎/10㎖의 농도의 OPD 페록시다아제(시그마사)의 기질(substrate)을 상기 웰들에 첨가하고 마찬가지로 마지막으로 10㎕의 H₂O₂들을 100㎕/웰의 양으로 첨가하였다. 그 반응 혼합물을 상기 웰들과 약 10분간 접촉하도록 방치한 후, 웰당 50㎕의 4N 황산을 첨가하는 것에 의하여 반응을 종결시켰다.

계속해서 상기 웰들 내에 포함된 상기 용액의 흡광도를 492㎚의 파장에서 측정하였다. 그에 대응하는 결과들을 도 2에 나타내었다. 도 2에서 설명을 위하여 표시된 그래프는 인자 H 농도에 대한 또는 단백질 농도(SAH)에 대한 측정된 흡광도의 값을 나타내고 있다.

인자 H의 활성에 대한 용량에 대한 유사한 방법이 문헌(McRae et al., The Journal of Immunology, 2005, 174: 6250-6256)에 기술되어 있다.

본 발명은 용혈성 요독 증후군의 치료용의 약물의 제조를 위한 인자 H의 용도, 신성동결혈장으로부터 인자 H를 정제하기 위한 방법 및 이러한 방법에 의해 수득된 인자 H에 관한 것으로서, 미세혈병증성 용혈성 빈혈(micro-angiopathic hemolytic anemia), 저혈소판증(thrombopenia), 신장질환 및 신부전 등의 치료에 사용될 수 있다.

Claims

용혈성 요독 증후군의 치료를 위한 약물의 제조를 위한 것을 특징으로 하는 인자 H의 용도.
제 1 항에 있어서,

상기 약물이 전형적인 형태의 용혈성 요독 증후군의 치료를 위한 것임을 특징으로 하는 인자 H의 용도.
제 1 항에 있어서,

상기 약물이 비전형적인 형태의 용혈성 요독 증후군의 치료를 위한 것임을 특징으로 하는 인자 H의 용도.
제 1 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서,

상기 인자 H가 신성동결혈장 또는 혈장 분획으로부터 정제된 것임을 특징으로 하는 인자 H의 용도.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 인자 H가 유전공학에 의해, 박테리아, 효모, 곰팡이 또는 포유동물 세포들로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 세포 내에서의 그의 유전자의 발현에 의 해 수득된 것임을 특징으로 하는 인자 H의 용도.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 약물이 동결건조된 형태로 제조되는 것을 특징으로 하는 인자 H의 용도.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 약물이 적어도 하나의 전염성 매개자를 제거하거나 또는 비활성화시키기 위한 방법에 적용되는 것을 특징으로 하는 인자 H의 용도.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 약물이 바이러스성 비활성화를 위한 적어도 하나의 방법에 적용되는 것을 특징으로 하는 인자 H의 용도.
인자 H 및 약제학적으로 수용가능한 부형제들 및/또는 담체들을 포함하는 바이러스성 비활성화 및 동결건조된 약제학적 조성물.
1) 혈장의 냉동침전물의 상층액을 준비하는 단계,

2) 이 상층액을 음이온교환형의 겔/수지 상에서 크로마토그래피에 적용시키는 단계,

3) 보류되지 않은 분획을 헤파린 형태의 분지된 리간드를 포함하는 겔/수지 상에서의 크로마토그래피에 적용시키는 단계,

4) 상기 단계 3)의 크로마토그래피 후의 보류되지 않은 분획의 pH를 조정하여 상기 인자 H가 헤파린 형태의 분지된 리간드를 포함하는 크로마토그래피의 지지체 겔/수지에 결합되는 것을 허용하도록 하는 단계,

5) 상기 인자 H를 상기 겔/수지를 평형화시키기 위한 완충제의 이온력 보다 더 큰 이온력의 완충제로 용리시키는 단계,

6) 상기 용리된 분획을 희석시키고 그리고 계속해서 이를 강산 양이온교환 형태의 겔/수지 상에서의 크로마토그래피에 적용시키는 단계,

7) 상기 인자 H를 상기 겔/수지를 평형화시키기 위한 완충제의 이온력 보다 더 큰 이온력의 완충제로 용리시키는 단계,

8) 상기 용리된 분획을 희석시키고 그리고 계속해서 이를 강산 음이온교환 형태의 겔/수지 상에서의 크로마토그래피에 적용시키는 단계,

9) 상기 겔/수지를 세척하고 그리고 상기 인자 H를 용리시키는 단계, 및

10) 인자 H의 농축물을 준비하는 단계

를 포함하여 이루어짐을 특징으로 하는 인자 H를 정제하는 방법.
제 10 항에 있어서,

단계 3)의 상기 헤파린 형태의 분지된 리간드를 포함하는 크로마토그래피 지지체가 헤파린 세파로스 겔/수지인 것을 특징으로 하는 인자 H를 정제하는 방법.
제 10항 또는 제 11 항에 있어서,

단계 4)의 헤파린 형태의 분지된 리간드를 포함하는 크로마토그래피 지지체가 헤파린 세파로스 겔/수지인 것을 특징으로 하는 인자 H를 정제하는 방법.
제 10 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,

단계 6)의 상기 강산 양이온교환 형태의 겔/수지 상에서의 크로마토그래피가 에스피 세파로스 형태의 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 인자 H를 정제하는 방법.
제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,

단계 8)의 상기 강산 음이온교환 형태의 겔/수지 상에서의 크로마토그래피가 큐 세파로스 에프에프 형태의 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 인자 H를 정제하는 방법.
제 10 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,

단계 4)의 보류되지 않은 분획의 pH가 pH 5.5 내지 6.5의 범위 이내에 포함되도록, 바람직하게는 pH 6.0과 동일하게 되도록 조정되는 것을 특징으로 하는 인자 H를 정제하는 방법.
제 10 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,

단계 8)에서 용리된 상기 분획의 pH가 pH 6.5 내지 7.5의 범위 이내에 포함되도록 조정되는 것을 특징으로 하는 인자 H를 정제하는 방법.
청구항 제 10 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 인자 H 농축물.
보체의 활성화의 불충분한 제어에 기인하는 질병들의 치료를 위한 용도의, 청구항 제 10 항 내지 제 16 항들 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 인자 H 농축물.
용혈성 요독 증후군의 치료를 위한 용도의, 청구항 제 10 항 내지 제 16 항들 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 인자 H 농축물.
비전형적인 형태의 용혈성 요독 증후군의 치료를 위한 용도의, 청구항 제 10 항 내지 제 16 항들 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 인자 H 농축물.
시험관 내 또는 체외에서 보체의 활성화를 제어하기 위한 청구항 제 10 항 내지 제 16 항들 중의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 인자 H 농축물의 용도.
보체의 활성화의 불충분한 제어로부터 야기되는 질병들의 치료 또는 예방적 치료를 위한 약물을 수득하기 위한 청구항 제 10 항 내지 제16 항들 중의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 인자 H 농축물의 용도.
용혈성 요독 증후군의 치료 또는 예방적 치료를 위한 약물을 수득하기 위한 청구항 제 10 항 내지 제 16 항들 중의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 인자 H 농축물의 용도.
비전형적인 형태의 용혈성 요독 증후군의 치료 또는 예방적 치료를 위한 약물을 수득하기 위한 청구항 제 10 항 내지 제 16 항들 중의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 인자 H 농축물의 용도.