JPH04211372A - 改良されたトロンビンの製造方法およびそれにより得られた高純度トロンビン調製物 - Google Patents
改良されたトロンビンの製造方法およびそれにより得られた高純度トロンビン調製物Info
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- JPH04211372A JPH04211372A JP3021348A JP2134891A JPH04211372A JP H04211372 A JPH04211372 A JP H04211372A JP 3021348 A JP3021348 A JP 3021348A JP 2134891 A JP2134891 A JP 2134891A JP H04211372 A JPH04211372 A JP H04211372A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はトロンビンの製造、それ
により製造されたトロンビン調製物およびそれらの止血
への応用に関する。
により製造されたトロンビン調製物およびそれらの止血
への応用に関する。
【０００２】
【従来の技術】トロンビンはフィブリノゲンをフィブリ
ンに変えるプロトロンビンに由来するタンパク質加水分
解酵素である。正常な血餅形成の際にはトロンビンのタ
ンパク質加水分解作用によりフィブリノゲンから不溶性
タンパク質であるフィブリンが形成される。血餅は大部
分フィブリンで形成される。
ンに変えるプロトロンビンに由来するタンパク質加水分
解酵素である。正常な血餅形成の際にはトロンビンのタ
ンパク質加水分解作用によりフィブリノゲンから不溶性
タンパク質であるフィブリンが形成される。血餅は大部
分フィブリンで形成される。
【０００３】ウシおよびヒトトロンビンの調製物はいず
れも止血に用いられている。ウシトロンビンの調製物は
現在外科手術の際、穿刺部位または毛細血管から浸出す
る出血をコントロールするために局所的に用いられる。 トロンビン（ＵＳＰ、米国局方）はウシプロトロンビン
から取得されたタンパク質を含む滅菌凍結乾燥粉末であ
り、そしてカルシウムを含んでいる。凍結乾燥トロンビ
ン調製物はパークデービス社によりＴＨＲＯＭＢＯＳＴ
ＡＴなる商標の下に上市販売されている。液状トロンビ
ン調製物も知られており、また米国特許第４，６９６，
８１２号および第４，９６５，２０３号の主題となって
いる。使用に先立ち再構成する必要がなくまたすぐに使
用できる形で販売できるので液状トロンビン調製物の方
が好まれる。特別な緩衝系を用いることにより米国特許
第４，６９６，８１２号および第４，９６５，２０３号
の安定トロンビン組成物が提供されている。
れも止血に用いられている。ウシトロンビンの調製物は
現在外科手術の際、穿刺部位または毛細血管から浸出す
る出血をコントロールするために局所的に用いられる。 トロンビン（ＵＳＰ、米国局方）はウシプロトロンビン
から取得されたタンパク質を含む滅菌凍結乾燥粉末であ
り、そしてカルシウムを含んでいる。凍結乾燥トロンビ
ン調製物はパークデービス社によりＴＨＲＯＭＢＯＳＴ
ＡＴなる商標の下に上市販売されている。液状トロンビ
ン調製物も知られており、また米国特許第４，６９６，
８１２号および第４，９６５，２０３号の主題となって
いる。使用に先立ち再構成する必要がなくまたすぐに使
用できる形で販売できるので液状トロンビン調製物の方
が好まれる。特別な緩衝系を用いることにより米国特許
第４，６９６，８１２号および第４，９６５，２０３号
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【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従来よりトロンビンは
ウシ血漿に由来するウシプロトロンビンから調製されて
いる。そのプロトロンビンは塩化カルシウムの存在下に
トロンボプラスチンを用いてトロンビンに変えられる。 それによって得られたトロンビンは濾過されたトロンビ
ンを順次陰イオン交換クロマトグラフィーカラムおよび
陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに通し、次いで
後者のカラムから一段階溶出を行う。この過程は第１図
に概要が示されている。そのようにして得られた製品は
約１，０００Ｕ／ｍｇの比活性を有し、また曇りのかか
った外観を呈する。
ウシ血漿に由来するウシプロトロンビンから調製されて
いる。そのプロトロンビンは塩化カルシウムの存在下に
トロンボプラスチンを用いてトロンビンに変えられる。 それによって得られたトロンビンは濾過されたトロンビ
ンを順次陰イオン交換クロマトグラフィーカラムおよび
陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに通し、次いで
後者のカラムから一段階溶出を行う。この過程は第１図
に概要が示されている。そのようにして得られた製品は
約１，０００Ｕ／ｍｇの比活性を有し、また曇りのかか
った外観を呈する。
【０００５】従来方法には、クロマトグラフィー媒体に
不溶性塩が形成されるため問題がある。これらの塩を除
去するには希酸でルーチン洗浄を行う必要がある。度々
にわたる洗浄は媒体の寿命を著しく短縮する。
不溶性塩が形成されるため問題がある。これらの塩を除
去するには希酸でルーチン洗浄を行う必要がある。度々
にわたる洗浄は媒体の寿命を著しく短縮する。
【０００６】前記の従来方法においては、Ｆ．Ｄ．Ａ．
認可に係るトロンビン検定法によれば、１０単位のトロ
ンボプラスチンは１単位のプロトロンビンをトロンビン
に変える。この量のトロンボプラスチンは濁りの原因と
なり、またクロマトグラフィー媒体へのタンパク質ロー
ドを高めてしまう。
認可に係るトロンビン検定法によれば、１０単位のトロ
ンボプラスチンは１単位のプロトロンビンをトロンビン
に変える。この量のトロンボプラスチンは濁りの原因と
なり、またクロマトグラフィー媒体へのタンパク質ロー
ドを高めてしまう。
【０００７】従来のトロンビン製造で得られるトロンビ
ン調製物に比べ比活性が増大したトロンビン調製物を与
える改善されたそしてコスト的に効果的なトロンビン製
造方法を提供することが本発明の目的の一つである。
ン調製物に比べ比活性が増大したトロンビン調製物を与
える改善されたそしてコスト的に効果的なトロンビン製
造方法を提供することが本発明の目的の一つである。
【０００８】本発明の他の目的の一つは、従来のトロン
ビン調製物の曇りのかかった外観に比し澄明なトロンビ
ン調製物を提供することにある。
ビン調製物の曇りのかかった外観に比し澄明なトロンビ
ン調製物を提供することにある。
【０００９】本発明の他の目的の一つは、高い比活性を
有するトロンビン調製物を提供することにある。
有するトロンビン調製物を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】従って本発明は、各単位
のプロトロンビンを従来の（慣用の）トロンボプラスチ
ン・インプットの５０％以下とカルシウムの存在下に反
応させ、得られたトロンビンをホスフェート緩衝液と接
触させ、その懸濁液を希釈および濾過し、その濾液を順
次陰イオン交換アガロースカラムおよび陽イオン交換ア
ガロースカラムにかけ、そして後者のカラムからトロン
ビン画分をホスフェート緩衝食塩水で段階的に溶出する
ことより成る液状トロンビン調製物の製造方法を提供す
る。
のプロトロンビンを従来の（慣用の）トロンボプラスチ
ン・インプットの５０％以下とカルシウムの存在下に反
応させ、得られたトロンビンをホスフェート緩衝液と接
触させ、その懸濁液を希釈および濾過し、その濾液を順
次陰イオン交換アガロースカラムおよび陽イオン交換ア
ガロースカラムにかけ、そして後者のカラムからトロン
ビン画分をホスフェート緩衝食塩水で段階的に溶出する
ことより成る液状トロンビン調製物の製造方法を提供す
る。
【００１１】本発明はまた１，０００Ｕ／ｍｇ以上、よ
り特定的には１，６００Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有する
液体トロンビン調製物をも提供する。
り特定的には１，６００Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有する
液体トロンビン調製物をも提供する。
【００１２】本発明に関連して行われた実験で、従来よ
りトロンビンの調製に用いられるトロンボプラスチンを
そのプロトロンビン活性化能を保持させながら２０倍に
希釈できることが分かった。前述の従来方法と比較考慮
すると、本発明によれば５単位以下のトロンボプラスチ
ンが１単位のプロトロンビンをトロンビンに変えること
になる。以下明細書の記載において、各単位のプロトロ
ンビンと反応させるトロンボプラスチンの単位数への言
及がなされる場合、そのトロンボプラスチンの単位数は
前述の検定法で用いられる単位数に基づくものである。
りトロンビンの調製に用いられるトロンボプラスチンを
そのプロトロンビン活性化能を保持させながら２０倍に
希釈できることが分かった。前述の従来方法と比較考慮
すると、本発明によれば５単位以下のトロンボプラスチ
ンが１単位のプロトロンビンをトロンビンに変えること
になる。以下明細書の記載において、各単位のプロトロ
ンビンと反応させるトロンボプラスチンの単位数への言
及がなされる場合、そのトロンボプラスチンの単位数は
前述の検定法で用いられる単位数に基づくものである。
【００１３】好ましくは、トロンボプラスチンを従来の
トロンボプラスチン・インプットの２０〜４０％（約２
〜４単位）となるまで食塩水で希釈する。特に好ましい
態様においては、トロンボプラスチンの使用量はその慣
用インプットの３０％（約３単位）程度である。
トロンボプラスチン・インプットの２０〜４０％（約２
〜４単位）となるまで食塩水で希釈する。特に好ましい
態様においては、トロンボプラスチンの使用量はその慣
用インプットの３０％（約３単位）程度である。
【００１４】トロンボプラスチンの希釈により精製にあ
たってのタンパク質ロードが軽減される。
たってのタンパク質ロードが軽減される。
【００１５】プロトロンビンのトロンビンへの転化は５
〜４０ｍＭ塩化カルシウム溶液中室温で３５〜６０分間
行うのが適当である。
〜４０ｍＭ塩化カルシウム溶液中室温で３５〜６０分間
行うのが適当である。
【００１６】好ましくは、ホスフェート緩衝液（ＰＢ）
はｐＨ６．０〜７．０の０．５〜１．５Ｍホスフェート
緩衝液であって、最終ホスフェート濃度が０．０５〜０
．０９Ｍとなるように添加される。特に好ましい態様で
は、使用ホスフェート緩衝液はｐＨ６．５の１．０Ｍホ
スフェート緩衝液で、０．０７Ｍの最終ホスフェート濃
度となる。ホスフェート緩衝液による処理によってカル
シウムが燐酸カルシウムとして析出する。この処理の結
果、不溶性カルシウム塩の析出が、著しく低下し、クロ
マトグラフィー媒体を０．１Ｍ塩酸で度々にわたって洗
浄する必要がなくなくり、従って媒体の寿命が長くなる
。
はｐＨ６．０〜７．０の０．５〜１．５Ｍホスフェート
緩衝液であって、最終ホスフェート濃度が０．０５〜０
．０９Ｍとなるように添加される。特に好ましい態様で
は、使用ホスフェート緩衝液はｐＨ６．５の１．０Ｍホ
スフェート緩衝液で、０．０７Ｍの最終ホスフェート濃
度となる。ホスフェート緩衝液による処理によってカル
シウムが燐酸カルシウムとして析出する。この処理の結
果、不溶性カルシウム塩の析出が、著しく低下し、クロ
マトグラフィー媒体を０．１Ｍ塩酸で度々にわたって洗
浄する必要がなくなくり、従って媒体の寿命が長くなる
。
【００１７】使用される陰イオン交換アガロース材料は
高速流動（ｆａｓｔ ｆｌｏｗ）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅゲ
ル（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅは商標名である）、特にＤＥＡ
Ｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗまたはＱ
−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗなる商標の
下に市販されているもの、が適している。同じく使用さ
れる陽イオン交換アガロース材料は高速流動Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅゲル、特にＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓ
ｔ ＦｌｏｗまたはＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ
Ｆｌｏｗなる商標の下に市販されているものが適して
いる。
高速流動（ｆａｓｔ ｆｌｏｗ）Ｓｅｐｈａｒｏｓｅゲ
ル（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅは商標名である）、特にＤＥＡ
Ｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗまたはＱ
−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗなる商標の
下に市販されているもの、が適している。同じく使用さ
れる陽イオン交換アガロース材料は高速流動Ｓｅｐｈａ
ｒｏｓｅゲル、特にＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓ
ｔ ＦｌｏｗまたはＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ
Ｆｌｏｗなる商標の下に市販されているものが適して
いる。
【００１８】好ましくは、ｐＨ６．０〜７．０のホスフ
ェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）による二段階溶出を用いて
トロンビンを陽イオン交換カラムから溶出する。すなわ
ち、好ましい一態様においては、カラムをまずｐＨ６．
５の０．１６〜０．１８Ｍ、特に０．１７Ｍのホスフェ
ート緩衝食塩水で溶出し、次いでそれをｐＨ６．５の０
．２６〜０．３０Ｍ、特に０．２８Ｍ、ホスフェート緩
衝食塩水で溶出する。
ェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）による二段階溶出を用いて
トロンビンを陽イオン交換カラムから溶出する。すなわ
ち、好ましい一態様においては、カラムをまずｐＨ６．
５の０．１６〜０．１８Ｍ、特に０．１７Ｍのホスフェ
ート緩衝食塩水で溶出し、次いでそれをｐＨ６．５の０
．２６〜０．３０Ｍ、特に０．２８Ｍ、ホスフェート緩
衝食塩水で溶出する。
【００１９】この段階的溶出の第一段階により混入タン
パク質物質が除かれ、また同溶出の第二段階により高度
に精製されたトロンビン調製物が得られる。
パク質物質が除かれ、また同溶出の第二段階により高度
に精製されたトロンビン調製物が得られる。
【００２０】プロトロンビンからトロンビンへの転化を
伴う段階は別として、本発明の方法は２〜８℃の範囲の
温度で行われる。
伴う段階は別として、本発明の方法は２〜８℃の範囲の
温度で行われる。
【００２１】本発明により得られる生成物の純度は後述
の如く電気泳動によっても確認される。
の如く電気泳動によっても確認される。
【００２２】本発明の方法により得られるバルクのトロ
ンビン生成物は賦形剤と混合し、濾過しそして無菌条件
下にバイアルに充填するのが適当である。
ンビン生成物は賦形剤と混合し、濾過しそして無菌条件
下にバイアルに充填するのが適当である。
【００２３】ここに用いられる「トロンビン調製物」と
いう用語は、液状または凍結乾燥状のトロンビンが一種
以上のグリコール、緩衝剤および他の賦形剤との組合せ
で存在するあらゆるタイプの組成物を包含するものであ
る。
いう用語は、液状または凍結乾燥状のトロンビンが一種
以上のグリコール、緩衝剤および他の賦形剤との組合せ
で存在するあらゆるタイプの組成物を包含するものであ
る。
【００２４】本発明による液状トロンビン調製物は室温
では６ケ月を超える期間安定に保たれる。安定化量の米
国特許第４，６９６，８１２号および第４，９６５，２
０３号に特定されたタイプの緩衝剤と混合した場合、か
かる液状トロンビン調製物は室温で６ケ月貯蔵した後も
当初の血餅形成活性を１００％維持することが認められ
る。 本発明によるトロンビン調製物の初期血餅形成活性は少
なくとも１，０００単位／ｍｌである。
では６ケ月を超える期間安定に保たれる。安定化量の米
国特許第４，６９６，８１２号および第４，９６５，２
０３号に特定されたタイプの緩衝剤と混合した場合、か
かる液状トロンビン調製物は室温で６ケ月貯蔵した後も
当初の血餅形成活性を１００％維持することが認められ
る。 本発明によるトロンビン調製物の初期血餅形成活性は少
なくとも１，０００単位／ｍｌである。
【００２５】このようにして、本発明により得られる液
状トロンビン調製物は澄明であって曇りがなく、高くか
つ持続可能な血餅形成活性を持ち、実質的にカルシウム
を含まず、典型的には１，６００Ｕ／ｍｇ以上である高
い活性を有することで特徴付けられる。
状トロンビン調製物は澄明であって曇りがなく、高くか
つ持続可能な血餅形成活性を持ち、実質的にカルシウム
を含まず、典型的には１，６００Ｕ／ｍｇ以上である高
い活性を有することで特徴付けられる。
【００２６】本発明による液状トロンビン調製物は慣用
の止血物質例えばＡＶＩＣＥＬ、ＧＥＬＦＯＡＭ、ＳＵ
ＲＧＩＣＥＬおよびコラーゲンなどと共に用いてもよい
（ＡＶＩＣＥＬ、ＧＥＬＦＯＡＭおよびＳＵＲＧＩＣＥ
Ｌは商標名である）。
の止血物質例えばＡＶＩＣＥＬ、ＧＥＬＦＯＡＭ、ＳＵ
ＲＧＩＣＥＬおよびコラーゲンなどと共に用いてもよい
（ＡＶＩＣＥＬ、ＧＥＬＦＯＡＭおよびＳＵＲＧＩＣＥ
Ｌは商標名である）。
【００２７】本発明によるトロンビン調製物は、例えば
前記止血物質上に吸着させ、そして得られる生成物を凍
結乾燥してもよい。
前記止血物質上に吸着させ、そして得られる生成物を凍
結乾燥してもよい。
【００２８】本発明によるトロンビン調製物は（特に火
傷治療に用いようとする場合には）一種以上の抗微生物
剤を含むこともできる。
傷治療に用いようとする場合には）一種以上の抗微生物
剤を含むこともできる。
【００２９】本発明によるトロンビン調製物は凍結乾燥
されていてもよい。
されていてもよい。
【００３０】本発明を更に以下の実施例により例説する
。
。
【００３１】
【実施例】トロンボプラスチンの調製
１１５ｋｇの新鮮なウシ肺臓を洗浄し、細かく切り刻み
、そして連続的に混合しながら１〜５℃で４８時間まで
０．９％塩化ナトリウム中に懸濁した。その懸濁液を遠
心分離し、そしてその溶出液（ｅｆｆｌｕｅｎｔ）を水
酸化マグネシウムで処理しそして再び遠心分離した。そ
の溶出液を硫酸アンモニウムで２回処理することにより
同上澄からトロンボプラスチンを抽出した。最終沈殿を
２０ｌの０．９％塩化ナトリウムに再溶解し、水に対し
て透析し、そして限外濾過により約９ｌまで濃縮した。 最終量を、塩化ナトリウムを０．９％の最終濃度となる
まで添加することにより、１１ｌに調整しそして凍結さ
せた。
、そして連続的に混合しながら１〜５℃で４８時間まで
０．９％塩化ナトリウム中に懸濁した。その懸濁液を遠
心分離し、そしてその溶出液（ｅｆｆｌｕｅｎｔ）を水
酸化マグネシウムで処理しそして再び遠心分離した。そ
の溶出液を硫酸アンモニウムで２回処理することにより
同上澄からトロンボプラスチンを抽出した。最終沈殿を
２０ｌの０．９％塩化ナトリウムに再溶解し、水に対し
て透析し、そして限外濾過により約９ｌまで濃縮した。 最終量を、塩化ナトリウムを０．９％の最終濃度となる
まで添加することにより、１１ｌに調整しそして凍結さ
せた。
【００３２】必要な場合に、トロンボプラスチンを融解
し、そして０．９％塩化ナトリウムで約１：３に希釈し
た。
し、そして０．９％塩化ナトリウムで約１：３に希釈し
た。
【００３３】トロンビンの調製
ウシプロトロンビン２８０百万単位（ＭＭＵ）（２億８
千万単位）を９ｍＭ塩化カルシウム溶液の存在下に２５
℃の温度で６０分間希釈トロンボプラスチン（８４０Ｍ
ＭＵ）と反応させた。約６ｌの１．０Ｍホスフェート緩
衝液（ｐＨ６．５）をその溶液に添加し、冷却し、そし
て最低１５分間保持した。その懸濁液を更に約０．０７
Ｍホスフェートとなるまで希釈し、次いで５μｍに濾過
し、そして濾液を０．１Ｍホスフェート緩衝食塩水（ｐ
Ｈ６．５）中のＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓ
ｔ Ｆｌｏｗ陰イオン交換カラムにかけ、そして部分精
製されたトロンビンを同じ緩衝液で溶出した。
千万単位）を９ｍＭ塩化カルシウム溶液の存在下に２５
℃の温度で６０分間希釈トロンボプラスチン（８４０Ｍ
ＭＵ）と反応させた。約６ｌの１．０Ｍホスフェート緩
衝液（ｐＨ６．５）をその溶液に添加し、冷却し、そし
て最低１５分間保持した。その懸濁液を更に約０．０７
Ｍホスフェートとなるまで希釈し、次いで５μｍに濾過
し、そして濾液を０．１Ｍホスフェート緩衝食塩水（ｐ
Ｈ６．５）中のＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓ
ｔ Ｆｌｏｗ陰イオン交換カラムにかけ、そして部分精
製されたトロンビンを同じ緩衝液で溶出した。
【００３４】その溶出液を次に０．１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ
６．５）中のＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆ
ｌｏｗ陽イオン交換カラムにかけた。次にそのカラムを
０．１７Ｍ ＰＢＳで段階的に溶出して非トロンビンタ
ンパク質を溶出した後０．２８Ｍ ＰＢＳで溶出して純
粋なトロンビンを溶出した。
６．５）中のＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆ
ｌｏｗ陽イオン交換カラムにかけた。次にそのカラムを
０．１７Ｍ ＰＢＳで段階的に溶出して非トロンビンタ
ンパク質を溶出した後０．２８Ｍ ＰＢＳで溶出して純
粋なトロンビンを溶出した。
【００３５】図３はプロトロンビンをトロンビンに変え
るトロンボプラスチンの能力に対し従来（慣用）量のト
ロンボプラスチンを希釈することの影響を三つの異なる
ロットのトロンボプラスチンについて示したものである
。
るトロンボプラスチンの能力に対し従来（慣用）量のト
ロンボプラスチンを希釈することの影響を三つの異なる
ロットのトロンボプラスチンについて示したものである
。
【００３６】濾過段階に先立って行われる燐酸カルシウ
ム沈殿によるカルシウムの除去を図４に示すが、これは
三つの異なる実験についての結果を示している。
ム沈殿によるカルシウムの除去を図４に示すが、これは
三つの異なる実験についての結果を示している。
【００３７】全体の過程は図２に図解的に示され、また
ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの段階的溶出は図６に
示される。
ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの段階的溶出は図６に
示される。
【００３８】図６に示されるように、第３不活性ピーク
は０．５Ｍ ＰＢＳを用いて溶出することができる。従
来方法では、活性トロンビンピーク（ピーク２）と混入
物質の二つのピーク（ピーク１および３）は０．５Ｍ
ＰＢＳを用いて単一画分として溶出される。すなわち、
従来方法の代表例である図５の単一ピークに対し、図６
は三つのピークを示している。図６の主ピークがトロン
ビンを表し、小ピークが非活性タンパク質物質を表わす
ことはフィブロメーターを用いてトロンビン血餅形成活
性の測定によって決定される。図５および図６の各々に
おいて、曲線ａは光学密度（Ｏ．Ｄ．）を表し、そして
曲線ｂはイオン濃度をモル／リットル単位で表している
。
は０．５Ｍ ＰＢＳを用いて溶出することができる。従
来方法では、活性トロンビンピーク（ピーク２）と混入
物質の二つのピーク（ピーク１および３）は０．５Ｍ
ＰＢＳを用いて単一画分として溶出される。すなわち、
従来方法の代表例である図５の単一ピークに対し、図６
は三つのピークを示している。図６の主ピークがトロン
ビンを表し、小ピークが非活性タンパク質物質を表わす
ことはフィブロメーターを用いてトロンビン血餅形成活
性の測定によって決定される。図５および図６の各々に
おいて、曲線ａは光学密度（Ｏ．Ｄ．）を表し、そして
曲線ｂはイオン濃度をモル／リットル単位で表している
。
【００３９】従来方法により（図１）および本発明の方
法により（図２）調製されたトロンビンをＳＤＳを含む
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
にかけた。それらの結果をそれぞれ図７および図８に示
す。
法により（図２）調製されたトロンビンをＳＤＳを含む
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
にかけた。それらの結果をそれぞれ図７および図８に示
す。
【００４０】ＰＨＡＳＴＧＥＬ（商標）ポリアクリルア
ミドゲルを用いたＰｈａｒｍａｃｉａ社により商標ＰＨ
ＡＳＴＳＹＳＴＥＭの下に上市されている自動式電気泳
動・現像システムを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子
量による特徴付けを行うべく、両生成物を等しく１，０
００単位／ｍｌまで希釈した。分離後、ゲルを該システ
ムの現像ユニットに移し、銀染色法を用いて染色しそし
て一夜空気乾燥した。
ミドゲルを用いたＰｈａｒｍａｃｉａ社により商標ＰＨ
ＡＳＴＳＹＳＴＥＭの下に上市されている自動式電気泳
動・現像システムを用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子
量による特徴付けを行うべく、両生成物を等しく１，０
００単位／ｍｌまで希釈した。分離後、ゲルを該システ
ムの現像ユニットに移し、銀染色法を用いて染色しそし
て一夜空気乾燥した。
【００４１】Ｐｈａｓｔ Ｉｍａｇｅ（商標）デンシト
メーターを用いて５４６ｎｍにおいて透過率モードでゲ
ルを走査し、そしてゲルに沿って移動した距離に対して
Ｏ．Ｄ．をプロットしたものを各サンプルについて得た
（図７および図８）。５４６ｎｍは銀染色ゲルに対して
用いるのに最適である。
メーターを用いて５４６ｎｍにおいて透過率モードでゲ
ルを走査し、そしてゲルに沿って移動した距離に対して
Ｏ．Ｄ．をプロットしたものを各サンプルについて得た
（図７および図８）。５４６ｎｍは銀染色ゲルに対して
用いるのに最適である。
【００４２】図７および図８の各々の場合において、主
たる中央ピークは３２，０００の分子量を有することが
示される活性トロンビンを表している。
たる中央ピークは３２，０００の分子量を有することが
示される活性トロンビンを表している。
【００４３】本発明により調製されたトロンビンの比活
性を従来法により得られたものと比較した。各場合に、
三つの別個のロットのトロンビンの比活性を測定した。 それらの結果を以下の表に示す。
性を従来法により得られたものと比較した。各場合に、
三つの別個のロットのトロンビンの比活性を測定した。 それらの結果を以下の表に示す。
【００４４】
【表１】
【図１】従来のトロンビン製造方法を図解的に示したも
のである。
のである。
【図２】本発明によるトロンビン製造方法の一態様を図
解的に示したものである。
解的に示したものである。
【図３】トロンボプラスチンの希釈率（パーセント）に
対してトロンビンに転化されたプロトロンビンの単位（
ＮＩＨ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ
Ｈｅａｌｔｈ）単位／ｍｌ（単位：千））をプロット
したものである。
対してトロンビンに転化されたプロトロンビンの単位（
ＮＩＨ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ
Ｈｅａｌｔｈ）単位／ｍｌ（単位：千））をプロット
したものである。
【図４】本発明による方法における濾過段階に先立つホ
スフェート添加（Ｍ）に対しカルシウム消耗（Ｍ）をプ
ロットしたものである。
スフェート添加（Ｍ）に対しカルシウム消耗（Ｍ）をプ
ロットしたものである。
【図５】図１に示された方法による陽イオン交換カラム
からの一段階溶出について、溶出液容量に対して２８０
ｎｍにおける光学密度をプロットしたものである。
からの一段階溶出について、溶出液容量に対して２８０
ｎｍにおける光学密度をプロットしたものである。
【図６】図２に示された方法による陽イオン交換カラム
からの段階的溶出について、溶出液容量に対して２８０
ｎｍにおける光学密度をプロットしたものである。
からの段階的溶出について、溶出液容量に対して２８０
ｎｍにおける光学密度をプロットしたものである。
【図７】図１に示された従来法により調製されたトロン
ビンサンプルについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた電気
泳動に従って適用点から移動した距離（ｍｍ）に対して
５４６ｎｍにおけるＯ．Ｄ．をプロットしたものである
。
ビンサンプルについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた電気
泳動に従って適用点から移動した距離（ｍｍ）に対して
５４６ｎｍにおけるＯ．Ｄ．をプロットしたものである
。
【図８】実施例に記載の本発明により調製されたサンプ
ルについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた電気泳動に従っ
て適用点から移動した距離（ｍｍ）に対して５４６ｎｍ
におけるＯ．Ｄ．をプロットしたものである。
ルについて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた電気泳動に従っ
て適用点から移動した距離（ｍｍ）に対して５４６ｎｍ
におけるＯ．Ｄ．をプロットしたものである。
Claims (12)
- 【請求項１】 各単位のプロトロンビンを従来のトロ
ンボプラスチン・インプットの５０％以下とカルシウム
の存在下に反応させ、得られたトロンビンをホスフェー
ト緩衝液と接触させ、その懸濁液を希釈および濾過し、
その濾液を順次陰イオン交換アガロースカラムおよび陽
イオン交換アガロースカラムにかけ、そして後者のカラ
ムからトロンビン画分をホスフェート緩衝食塩水で段階
的に溶出することより成る液状トロンビン調製物の製造
方法。 - 【請求項２】 トロンボプラスチンの使用量が従来の
インプットの２０〜４０％である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 トロンボプラスチンの使用量が従来の
インプットの３０％程度である請求項１または２記載の
方法。 - 【請求項４】 使用されるホスフェート緩衝液がｐＨ
６．０〜７．０の０．５〜１．５Ｍホスフェート緩衝液
である請求項１〜３のいずれかに記載の方法。 - 【請求項５】 使用されるホスフェート緩衝液がｐＨ
６．５の１．０Ｍホスフェート緩衝液である請求項４記
載の方法。 - 【請求項６】 陽イオン交換アガロースカラムの溶出
が二段階溶出である請求項１〜５のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項７】 カラムがｉ）０．１６〜０．１８Ｍホ
スフェート緩衝食塩水およびｉｉ）０．２６〜０．３０
Ｍホスフェート緩衝食塩水で順次溶出される請求項６記
載の方法。 - 【請求項８】 カラムがｉ）０．１７Ｍホスフェート
緩衝食塩水およびｉｉ）０．２８Ｍホスフェート緩衝食
塩水で順次溶出される請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 １，６００Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有
する液状トロンビン調製物。 - 【請求項１０】 澄明であり、曇りがないことを特徴
とする請求項９記載のトロンビン調製物。 - 【請求項１１】 実質的にカルシウムを含まないこと
を特徴とする請求項９または１０記載のトロンビン調製
物。 - 【請求項１２】 請求項９〜１１のいずれかに記載の
液状トロンビン調製物を含んで成る、または該調製物か
ら導かれる、トロンビンを含んで成る止血剤。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IE266/90 | 1990-01-24 | ||
| IE26690A IE73210B1 (en) | 1990-01-24 | 1990-01-24 | Process for the production of thrombin and high purity thrombin preparation thereby obtained |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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