JPH04211372A - 改良されたトロンビンの製造方法およびそれにより得られた高純度トロンビン調製物 - Google Patents
改良されたトロンビンの製造方法およびそれにより得られた高純度トロンビン調製物Info
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- JPH04211372A JPH04211372A JP3021348A JP2134891A JPH04211372A JP H04211372 A JPH04211372 A JP H04211372A JP 3021348 A JP3021348 A JP 3021348A JP 2134891 A JP2134891 A JP 2134891A JP H04211372 A JPH04211372 A JP H04211372A
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明はトロンビンの製造、それ
により製造されたトロンビン調製物およびそれらの止血
への応用に関する。
により製造されたトロンビン調製物およびそれらの止血
への応用に関する。
【0002】
【従来の技術】トロンビンはフィブリノゲンをフィブリ
ンに変えるプロトロンビンに由来するタンパク質加水分
解酵素である。正常な血餅形成の際にはトロンビンのタ
ンパク質加水分解作用によりフィブリノゲンから不溶性
タンパク質であるフィブリンが形成される。血餅は大部
分フィブリンで形成される。
ンに変えるプロトロンビンに由来するタンパク質加水分
解酵素である。正常な血餅形成の際にはトロンビンのタ
ンパク質加水分解作用によりフィブリノゲンから不溶性
タンパク質であるフィブリンが形成される。血餅は大部
分フィブリンで形成される。
【0003】ウシおよびヒトトロンビンの調製物はいず
れも止血に用いられている。ウシトロンビンの調製物は
現在外科手術の際、穿刺部位または毛細血管から浸出す
る出血をコントロールするために局所的に用いられる。 トロンビン(USP、米国局方)はウシプロトロンビン
から取得されたタンパク質を含む滅菌凍結乾燥粉末であ
り、そしてカルシウムを含んでいる。凍結乾燥トロンビ
ン調製物はパークデービス社によりTHROMBOST
ATなる商標の下に上市販売されている。液状トロンビ
ン調製物も知られており、また米国特許第4,696,
812号および第4,965,203号の主題となって
いる。使用に先立ち再構成する必要がなくまたすぐに使
用できる形で販売できるので液状トロンビン調製物の方
が好まれる。特別な緩衝系を用いることにより米国特許
第4,696,812号および第4,965,203号
の安定トロンビン組成物が提供されている。
れも止血に用いられている。ウシトロンビンの調製物は
現在外科手術の際、穿刺部位または毛細血管から浸出す
る出血をコントロールするために局所的に用いられる。 トロンビン(USP、米国局方)はウシプロトロンビン
から取得されたタンパク質を含む滅菌凍結乾燥粉末であ
り、そしてカルシウムを含んでいる。凍結乾燥トロンビ
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ATなる商標の下に上市販売されている。液状トロンビ
ン調製物も知られており、また米国特許第4,696,
812号および第4,965,203号の主題となって
いる。使用に先立ち再構成する必要がなくまたすぐに使
用できる形で販売できるので液状トロンビン調製物の方
が好まれる。特別な緩衝系を用いることにより米国特許
第4,696,812号および第4,965,203号
の安定トロンビン組成物が提供されている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】従来よりトロンビンは
ウシ血漿に由来するウシプロトロンビンから調製されて
いる。そのプロトロンビンは塩化カルシウムの存在下に
トロンボプラスチンを用いてトロンビンに変えられる。 それによって得られたトロンビンは濾過されたトロンビ
ンを順次陰イオン交換クロマトグラフィーカラムおよび
陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに通し、次いで
後者のカラムから一段階溶出を行う。この過程は第1図
に概要が示されている。そのようにして得られた製品は
約1,000U/mgの比活性を有し、また曇りのかか
った外観を呈する。
ウシ血漿に由来するウシプロトロンビンから調製されて
いる。そのプロトロンビンは塩化カルシウムの存在下に
トロンボプラスチンを用いてトロンビンに変えられる。 それによって得られたトロンビンは濾過されたトロンビ
ンを順次陰イオン交換クロマトグラフィーカラムおよび
陽イオン交換クロマトグラフィーカラムに通し、次いで
後者のカラムから一段階溶出を行う。この過程は第1図
に概要が示されている。そのようにして得られた製品は
約1,000U/mgの比活性を有し、また曇りのかか
った外観を呈する。
【0005】従来方法には、クロマトグラフィー媒体に
不溶性塩が形成されるため問題がある。これらの塩を除
去するには希酸でルーチン洗浄を行う必要がある。度々
にわたる洗浄は媒体の寿命を著しく短縮する。
不溶性塩が形成されるため問題がある。これらの塩を除
去するには希酸でルーチン洗浄を行う必要がある。度々
にわたる洗浄は媒体の寿命を著しく短縮する。
【0006】前記の従来方法においては、F.D.A.
認可に係るトロンビン検定法によれば、10単位のトロ
ンボプラスチンは1単位のプロトロンビンをトロンビン
に変える。この量のトロンボプラスチンは濁りの原因と
なり、またクロマトグラフィー媒体へのタンパク質ロー
ドを高めてしまう。
認可に係るトロンビン検定法によれば、10単位のトロ
ンボプラスチンは1単位のプロトロンビンをトロンビン
に変える。この量のトロンボプラスチンは濁りの原因と
なり、またクロマトグラフィー媒体へのタンパク質ロー
ドを高めてしまう。
【0007】従来のトロンビン製造で得られるトロンビ
ン調製物に比べ比活性が増大したトロンビン調製物を与
える改善されたそしてコスト的に効果的なトロンビン製
造方法を提供することが本発明の目的の一つである。
ン調製物に比べ比活性が増大したトロンビン調製物を与
える改善されたそしてコスト的に効果的なトロンビン製
造方法を提供することが本発明の目的の一つである。
【0008】本発明の他の目的の一つは、従来のトロン
ビン調製物の曇りのかかった外観に比し澄明なトロンビ
ン調製物を提供することにある。
ビン調製物の曇りのかかった外観に比し澄明なトロンビ
ン調製物を提供することにある。
【0009】本発明の他の目的の一つは、高い比活性を
有するトロンビン調製物を提供することにある。
有するトロンビン調製物を提供することにある。
【0010】
【課題を解決するための手段】従って本発明は、各単位
のプロトロンビンを従来の(慣用の)トロンボプラスチ
ン・インプットの50%以下とカルシウムの存在下に反
応させ、得られたトロンビンをホスフェート緩衝液と接
触させ、その懸濁液を希釈および濾過し、その濾液を順
次陰イオン交換アガロースカラムおよび陽イオン交換ア
ガロースカラムにかけ、そして後者のカラムからトロン
ビン画分をホスフェート緩衝食塩水で段階的に溶出する
ことより成る液状トロンビン調製物の製造方法を提供す
る。
のプロトロンビンを従来の(慣用の)トロンボプラスチ
ン・インプットの50%以下とカルシウムの存在下に反
応させ、得られたトロンビンをホスフェート緩衝液と接
触させ、その懸濁液を希釈および濾過し、その濾液を順
次陰イオン交換アガロースカラムおよび陽イオン交換ア
ガロースカラムにかけ、そして後者のカラムからトロン
ビン画分をホスフェート緩衝食塩水で段階的に溶出する
ことより成る液状トロンビン調製物の製造方法を提供す
る。
【0011】本発明はまた1,000U/mg以上、よ
り特定的には1,600U/mg以上の比活性を有する
液体トロンビン調製物をも提供する。
り特定的には1,600U/mg以上の比活性を有する
液体トロンビン調製物をも提供する。
【0012】本発明に関連して行われた実験で、従来よ
りトロンビンの調製に用いられるトロンボプラスチンを
そのプロトロンビン活性化能を保持させながら20倍に
希釈できることが分かった。前述の従来方法と比較考慮
すると、本発明によれば5単位以下のトロンボプラスチ
ンが1単位のプロトロンビンをトロンビンに変えること
になる。以下明細書の記載において、各単位のプロトロ
ンビンと反応させるトロンボプラスチンの単位数への言
及がなされる場合、そのトロンボプラスチンの単位数は
前述の検定法で用いられる単位数に基づくものである。
りトロンビンの調製に用いられるトロンボプラスチンを
そのプロトロンビン活性化能を保持させながら20倍に
希釈できることが分かった。前述の従来方法と比較考慮
すると、本発明によれば5単位以下のトロンボプラスチ
ンが1単位のプロトロンビンをトロンビンに変えること
になる。以下明細書の記載において、各単位のプロトロ
ンビンと反応させるトロンボプラスチンの単位数への言
及がなされる場合、そのトロンボプラスチンの単位数は
前述の検定法で用いられる単位数に基づくものである。
【0013】好ましくは、トロンボプラスチンを従来の
トロンボプラスチン・インプットの20〜40%(約2
〜4単位)となるまで食塩水で希釈する。特に好ましい
態様においては、トロンボプラスチンの使用量はその慣
用インプットの30%(約3単位)程度である。
トロンボプラスチン・インプットの20〜40%(約2
〜4単位)となるまで食塩水で希釈する。特に好ましい
態様においては、トロンボプラスチンの使用量はその慣
用インプットの30%(約3単位)程度である。
【0014】トロンボプラスチンの希釈により精製にあ
たってのタンパク質ロードが軽減される。
たってのタンパク質ロードが軽減される。
【0015】プロトロンビンのトロンビンへの転化は5
〜40mM塩化カルシウム溶液中室温で35〜60分間
行うのが適当である。
〜40mM塩化カルシウム溶液中室温で35〜60分間
行うのが適当である。
【0016】好ましくは、ホスフェート緩衝液(PB)
はpH6.0〜7.0の0.5〜1.5Mホスフェート
緩衝液であって、最終ホスフェート濃度が0.05〜0
.09Mとなるように添加される。特に好ましい態様で
は、使用ホスフェート緩衝液はpH6.5の1.0Mホ
スフェート緩衝液で、0.07Mの最終ホスフェート濃
度となる。ホスフェート緩衝液による処理によってカル
シウムが燐酸カルシウムとして析出する。この処理の結
果、不溶性カルシウム塩の析出が、著しく低下し、クロ
マトグラフィー媒体を0.1M塩酸で度々にわたって洗
浄する必要がなくなくり、従って媒体の寿命が長くなる
。
はpH6.0〜7.0の0.5〜1.5Mホスフェート
緩衝液であって、最終ホスフェート濃度が0.05〜0
.09Mとなるように添加される。特に好ましい態様で
は、使用ホスフェート緩衝液はpH6.5の1.0Mホ
スフェート緩衝液で、0.07Mの最終ホスフェート濃
度となる。ホスフェート緩衝液による処理によってカル
シウムが燐酸カルシウムとして析出する。この処理の結
果、不溶性カルシウム塩の析出が、著しく低下し、クロ
マトグラフィー媒体を0.1M塩酸で度々にわたって洗
浄する必要がなくなくり、従って媒体の寿命が長くなる
。
【0017】使用される陰イオン交換アガロース材料は
高速流動(fast flow)Sepharoseゲ
ル(Sepharoseは商標名である)、特にDEA
E−Sepharose Fast FlowまたはQ
−Sepharose Fast Flowなる商標の
下に市販されているもの、が適している。同じく使用さ
れる陽イオン交換アガロース材料は高速流動Sepha
roseゲル、特にCM−Sepharose Fas
t FlowまたはS−Sepharose Fast
Flowなる商標の下に市販されているものが適して
いる。
高速流動(fast flow)Sepharoseゲ
ル(Sepharoseは商標名である)、特にDEA
E−Sepharose Fast FlowまたはQ
−Sepharose Fast Flowなる商標の
下に市販されているもの、が適している。同じく使用さ
れる陽イオン交換アガロース材料は高速流動Sepha
roseゲル、特にCM−Sepharose Fas
t FlowまたはS−Sepharose Fast
Flowなる商標の下に市販されているものが適して
いる。
【0018】好ましくは、pH6.0〜7.0のホスフ
ェート緩衝食塩水(PBS)による二段階溶出を用いて
トロンビンを陽イオン交換カラムから溶出する。すなわ
ち、好ましい一態様においては、カラムをまずpH6.
5の0.16〜0.18M、特に0.17Mのホスフェ
ート緩衝食塩水で溶出し、次いでそれをpH6.5の0
.26〜0.30M、特に0.28M、ホスフェート緩
衝食塩水で溶出する。
ェート緩衝食塩水(PBS)による二段階溶出を用いて
トロンビンを陽イオン交換カラムから溶出する。すなわ
ち、好ましい一態様においては、カラムをまずpH6.
5の0.16〜0.18M、特に0.17Mのホスフェ
ート緩衝食塩水で溶出し、次いでそれをpH6.5の0
.26〜0.30M、特に0.28M、ホスフェート緩
衝食塩水で溶出する。
【0019】この段階的溶出の第一段階により混入タン
パク質物質が除かれ、また同溶出の第二段階により高度
に精製されたトロンビン調製物が得られる。
パク質物質が除かれ、また同溶出の第二段階により高度
に精製されたトロンビン調製物が得られる。
【0020】プロトロンビンからトロンビンへの転化を
伴う段階は別として、本発明の方法は2〜8℃の範囲の
温度で行われる。
伴う段階は別として、本発明の方法は2〜8℃の範囲の
温度で行われる。
【0021】本発明により得られる生成物の純度は後述
の如く電気泳動によっても確認される。
の如く電気泳動によっても確認される。
【0022】本発明の方法により得られるバルクのトロ
ンビン生成物は賦形剤と混合し、濾過しそして無菌条件
下にバイアルに充填するのが適当である。
ンビン生成物は賦形剤と混合し、濾過しそして無菌条件
下にバイアルに充填するのが適当である。
【0023】ここに用いられる「トロンビン調製物」と
いう用語は、液状または凍結乾燥状のトロンビンが一種
以上のグリコール、緩衝剤および他の賦形剤との組合せ
で存在するあらゆるタイプの組成物を包含するものであ
る。
いう用語は、液状または凍結乾燥状のトロンビンが一種
以上のグリコール、緩衝剤および他の賦形剤との組合せ
で存在するあらゆるタイプの組成物を包含するものであ
る。
【0024】本発明による液状トロンビン調製物は室温
では6ケ月を超える期間安定に保たれる。安定化量の米
国特許第4,696,812号および第4,965,2
03号に特定されたタイプの緩衝剤と混合した場合、か
かる液状トロンビン調製物は室温で6ケ月貯蔵した後も
当初の血餅形成活性を100%維持することが認められ
る。 本発明によるトロンビン調製物の初期血餅形成活性は少
なくとも1,000単位/mlである。
では6ケ月を超える期間安定に保たれる。安定化量の米
国特許第4,696,812号および第4,965,2
03号に特定されたタイプの緩衝剤と混合した場合、か
かる液状トロンビン調製物は室温で6ケ月貯蔵した後も
当初の血餅形成活性を100%維持することが認められ
る。 本発明によるトロンビン調製物の初期血餅形成活性は少
なくとも1,000単位/mlである。
【0025】このようにして、本発明により得られる液
状トロンビン調製物は澄明であって曇りがなく、高くか
つ持続可能な血餅形成活性を持ち、実質的にカルシウム
を含まず、典型的には1,600U/mg以上である高
い活性を有することで特徴付けられる。
状トロンビン調製物は澄明であって曇りがなく、高くか
つ持続可能な血餅形成活性を持ち、実質的にカルシウム
を含まず、典型的には1,600U/mg以上である高
い活性を有することで特徴付けられる。
【0026】本発明による液状トロンビン調製物は慣用
の止血物質例えばAVICEL、GELFOAM、SU
RGICELおよびコラーゲンなどと共に用いてもよい
(AVICEL、GELFOAMおよびSURGICE
Lは商標名である)。
の止血物質例えばAVICEL、GELFOAM、SU
RGICELおよびコラーゲンなどと共に用いてもよい
(AVICEL、GELFOAMおよびSURGICE
Lは商標名である)。
【0027】本発明によるトロンビン調製物は、例えば
前記止血物質上に吸着させ、そして得られる生成物を凍
結乾燥してもよい。
前記止血物質上に吸着させ、そして得られる生成物を凍
結乾燥してもよい。
【0028】本発明によるトロンビン調製物は(特に火
傷治療に用いようとする場合には)一種以上の抗微生物
剤を含むこともできる。
傷治療に用いようとする場合には)一種以上の抗微生物
剤を含むこともできる。
【0029】本発明によるトロンビン調製物は凍結乾燥
されていてもよい。
されていてもよい。
【0030】本発明を更に以下の実施例により例説する
。
。
【0031】
【実施例】トロンボプラスチンの調製
115kgの新鮮なウシ肺臓を洗浄し、細かく切り刻み
、そして連続的に混合しながら1〜5℃で48時間まで
0.9%塩化ナトリウム中に懸濁した。その懸濁液を遠
心分離し、そしてその溶出液(effluent)を水
酸化マグネシウムで処理しそして再び遠心分離した。そ
の溶出液を硫酸アンモニウムで2回処理することにより
同上澄からトロンボプラスチンを抽出した。最終沈殿を
20lの0.9%塩化ナトリウムに再溶解し、水に対し
て透析し、そして限外濾過により約9lまで濃縮した。 最終量を、塩化ナトリウムを0.9%の最終濃度となる
まで添加することにより、11lに調整しそして凍結さ
せた。
、そして連続的に混合しながら1〜5℃で48時間まで
0.9%塩化ナトリウム中に懸濁した。その懸濁液を遠
心分離し、そしてその溶出液(effluent)を水
酸化マグネシウムで処理しそして再び遠心分離した。そ
の溶出液を硫酸アンモニウムで2回処理することにより
同上澄からトロンボプラスチンを抽出した。最終沈殿を
20lの0.9%塩化ナトリウムに再溶解し、水に対し
て透析し、そして限外濾過により約9lまで濃縮した。 最終量を、塩化ナトリウムを0.9%の最終濃度となる
まで添加することにより、11lに調整しそして凍結さ
せた。
【0032】必要な場合に、トロンボプラスチンを融解
し、そして0.9%塩化ナトリウムで約1:3に希釈し
た。
し、そして0.9%塩化ナトリウムで約1:3に希釈し
た。
【0033】トロンビンの調製
ウシプロトロンビン280百万単位(MMU)(2億8
千万単位)を9mM塩化カルシウム溶液の存在下に25
℃の温度で60分間希釈トロンボプラスチン(840M
MU)と反応させた。約6lの1.0Mホスフェート緩
衝液(pH6.5)をその溶液に添加し、冷却し、そし
て最低15分間保持した。その懸濁液を更に約0.07
Mホスフェートとなるまで希釈し、次いで5μmに濾過
し、そして濾液を0.1Mホスフェート緩衝食塩水(p
H6.5)中のDEAE−Sepharose Fas
t Flow陰イオン交換カラムにかけ、そして部分精
製されたトロンビンを同じ緩衝液で溶出した。
千万単位)を9mM塩化カルシウム溶液の存在下に25
℃の温度で60分間希釈トロンボプラスチン(840M
MU)と反応させた。約6lの1.0Mホスフェート緩
衝液(pH6.5)をその溶液に添加し、冷却し、そし
て最低15分間保持した。その懸濁液を更に約0.07
Mホスフェートとなるまで希釈し、次いで5μmに濾過
し、そして濾液を0.1Mホスフェート緩衝食塩水(p
H6.5)中のDEAE−Sepharose Fas
t Flow陰イオン交換カラムにかけ、そして部分精
製されたトロンビンを同じ緩衝液で溶出した。
【0034】その溶出液を次に0.1M PBS(pH
6.5)中のCM−Sepharose Fast F
low陽イオン交換カラムにかけた。次にそのカラムを
0.17M PBSで段階的に溶出して非トロンビンタ
ンパク質を溶出した後0.28M PBSで溶出して純
粋なトロンビンを溶出した。
6.5)中のCM−Sepharose Fast F
low陽イオン交換カラムにかけた。次にそのカラムを
0.17M PBSで段階的に溶出して非トロンビンタ
ンパク質を溶出した後0.28M PBSで溶出して純
粋なトロンビンを溶出した。
【0035】図3はプロトロンビンをトロンビンに変え
るトロンボプラスチンの能力に対し従来(慣用)量のト
ロンボプラスチンを希釈することの影響を三つの異なる
ロットのトロンボプラスチンについて示したものである
。
るトロンボプラスチンの能力に対し従来(慣用)量のト
ロンボプラスチンを希釈することの影響を三つの異なる
ロットのトロンボプラスチンについて示したものである
。
【0036】濾過段階に先立って行われる燐酸カルシウ
ム沈殿によるカルシウムの除去を図4に示すが、これは
三つの異なる実験についての結果を示している。
ム沈殿によるカルシウムの除去を図4に示すが、これは
三つの異なる実験についての結果を示している。
【0037】全体の過程は図2に図解的に示され、また
CM−Sepharoseカラムの段階的溶出は図6に
示される。
CM−Sepharoseカラムの段階的溶出は図6に
示される。
【0038】図6に示されるように、第3不活性ピーク
は0.5M PBSを用いて溶出することができる。従
来方法では、活性トロンビンピーク(ピーク2)と混入
物質の二つのピーク(ピーク1および3)は0.5M
PBSを用いて単一画分として溶出される。すなわち、
従来方法の代表例である図5の単一ピークに対し、図6
は三つのピークを示している。図6の主ピークがトロン
ビンを表し、小ピークが非活性タンパク質物質を表わす
ことはフィブロメーターを用いてトロンビン血餅形成活
性の測定によって決定される。図5および図6の各々に
おいて、曲線aは光学密度(O.D.)を表し、そして
曲線bはイオン濃度をモル/リットル単位で表している
。
は0.5M PBSを用いて溶出することができる。従
来方法では、活性トロンビンピーク(ピーク2)と混入
物質の二つのピーク(ピーク1および3)は0.5M
PBSを用いて単一画分として溶出される。すなわち、
従来方法の代表例である図5の単一ピークに対し、図6
は三つのピークを示している。図6の主ピークがトロン
ビンを表し、小ピークが非活性タンパク質物質を表わす
ことはフィブロメーターを用いてトロンビン血餅形成活
性の測定によって決定される。図5および図6の各々に
おいて、曲線aは光学密度(O.D.)を表し、そして
曲線bはイオン濃度をモル/リットル単位で表している
。
【0039】従来方法により(図1)および本発明の方
法により(図2)調製されたトロンビンをSDSを含む
ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)
にかけた。それらの結果をそれぞれ図7および図8に示
す。
法により(図2)調製されたトロンビンをSDSを含む
ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)
にかけた。それらの結果をそれぞれ図7および図8に示
す。
【0040】PHASTGEL(商標)ポリアクリルア
ミドゲルを用いたPharmacia社により商標PH
ASTSYSTEMの下に上市されている自動式電気泳
動・現像システムを用いるSDS−PAGEによる分子
量による特徴付けを行うべく、両生成物を等しく1,0
00単位/mlまで希釈した。分離後、ゲルを該システ
ムの現像ユニットに移し、銀染色法を用いて染色しそし
て一夜空気乾燥した。
ミドゲルを用いたPharmacia社により商標PH
ASTSYSTEMの下に上市されている自動式電気泳
動・現像システムを用いるSDS−PAGEによる分子
量による特徴付けを行うべく、両生成物を等しく1,0
00単位/mlまで希釈した。分離後、ゲルを該システ
ムの現像ユニットに移し、銀染色法を用いて染色しそし
て一夜空気乾燥した。
【0041】Phast Image(商標)デンシト
メーターを用いて546nmにおいて透過率モードでゲ
ルを走査し、そしてゲルに沿って移動した距離に対して
O.D.をプロットしたものを各サンプルについて得た
(図7および図8)。546nmは銀染色ゲルに対して
用いるのに最適である。
メーターを用いて546nmにおいて透過率モードでゲ
ルを走査し、そしてゲルに沿って移動した距離に対して
O.D.をプロットしたものを各サンプルについて得た
(図7および図8)。546nmは銀染色ゲルに対して
用いるのに最適である。
【0042】図7および図8の各々の場合において、主
たる中央ピークは32,000の分子量を有することが
示される活性トロンビンを表している。
たる中央ピークは32,000の分子量を有することが
示される活性トロンビンを表している。
【0043】本発明により調製されたトロンビンの比活
性を従来法により得られたものと比較した。各場合に、
三つの別個のロットのトロンビンの比活性を測定した。 それらの結果を以下の表に示す。
性を従来法により得られたものと比較した。各場合に、
三つの別個のロットのトロンビンの比活性を測定した。 それらの結果を以下の表に示す。
【0044】
【表1】
【図1】従来のトロンビン製造方法を図解的に示したも
のである。
のである。
【図2】本発明によるトロンビン製造方法の一態様を図
解的に示したものである。
解的に示したものである。
【図3】トロンボプラスチンの希釈率(パーセント)に
対してトロンビンに転化されたプロトロンビンの単位(
NIH(National Institute of
Health)単位/ml(単位:千))をプロット
したものである。
対してトロンビンに転化されたプロトロンビンの単位(
NIH(National Institute of
Health)単位/ml(単位:千))をプロット
したものである。
【図4】本発明による方法における濾過段階に先立つホ
スフェート添加(M)に対しカルシウム消耗(M)をプ
ロットしたものである。
スフェート添加(M)に対しカルシウム消耗(M)をプ
ロットしたものである。
【図5】図1に示された方法による陽イオン交換カラム
からの一段階溶出について、溶出液容量に対して280
nmにおける光学密度をプロットしたものである。
からの一段階溶出について、溶出液容量に対して280
nmにおける光学密度をプロットしたものである。
【図6】図2に示された方法による陽イオン交換カラム
からの段階的溶出について、溶出液容量に対して280
nmにおける光学密度をプロットしたものである。
からの段階的溶出について、溶出液容量に対して280
nmにおける光学密度をプロットしたものである。
【図7】図1に示された従来法により調製されたトロン
ビンサンプルについて、SDS−PAGEを用いた電気
泳動に従って適用点から移動した距離(mm)に対して
546nmにおけるO.D.をプロットしたものである
。
ビンサンプルについて、SDS−PAGEを用いた電気
泳動に従って適用点から移動した距離(mm)に対して
546nmにおけるO.D.をプロットしたものである
。
【図8】実施例に記載の本発明により調製されたサンプ
ルについて、SDS−PAGEを用いた電気泳動に従っ
て適用点から移動した距離(mm)に対して546nm
におけるO.D.をプロットしたものである。
ルについて、SDS−PAGEを用いた電気泳動に従っ
て適用点から移動した距離(mm)に対して546nm
におけるO.D.をプロットしたものである。
Claims (12)
- 【請求項1】 各単位のプロトロンビンを従来のトロ
ンボプラスチン・インプットの50%以下とカルシウム
の存在下に反応させ、得られたトロンビンをホスフェー
ト緩衝液と接触させ、その懸濁液を希釈および濾過し、
その濾液を順次陰イオン交換アガロースカラムおよび陽
イオン交換アガロースカラムにかけ、そして後者のカラ
ムからトロンビン画分をホスフェート緩衝食塩水で段階
的に溶出することより成る液状トロンビン調製物の製造
方法。 - 【請求項2】 トロンボプラスチンの使用量が従来の
インプットの20〜40%である請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 トロンボプラスチンの使用量が従来の
インプットの30%程度である請求項1または2記載の
方法。 - 【請求項4】 使用されるホスフェート緩衝液がpH
6.0〜7.0の0.5〜1.5Mホスフェート緩衝液
である請求項1〜3のいずれかに記載の方法。 - 【請求項5】 使用されるホスフェート緩衝液がpH
6.5の1.0Mホスフェート緩衝液である請求項4記
載の方法。 - 【請求項6】 陽イオン交換アガロースカラムの溶出
が二段階溶出である請求項1〜5のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項7】 カラムがi)0.16〜0.18Mホ
スフェート緩衝食塩水およびii)0.26〜0.30
Mホスフェート緩衝食塩水で順次溶出される請求項6記
載の方法。 - 【請求項8】 カラムがi)0.17Mホスフェート
緩衝食塩水およびii)0.28Mホスフェート緩衝食
塩水で順次溶出される請求項7記載の方法。 - 【請求項9】 1,600U/mg以上の比活性を有
する液状トロンビン調製物。 - 【請求項10】 澄明であり、曇りがないことを特徴
とする請求項9記載のトロンビン調製物。 - 【請求項11】 実質的にカルシウムを含まないこと
を特徴とする請求項9または10記載のトロンビン調製
物。 - 【請求項12】 請求項9〜11のいずれかに記載の
液状トロンビン調製物を含んで成る、または該調製物か
ら導かれる、トロンビンを含んで成る止血剤。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IE266/90 | 1990-01-24 | ||
IE26690A IE73210B1 (en) | 1990-01-24 | 1990-01-24 | Process for the production of thrombin and high purity thrombin preparation thereby obtained |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04211372A true JPH04211372A (ja) | 1992-08-03 |
JP3276964B2 JP3276964B2 (ja) | 2002-04-22 |
Family
ID=11009586
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP02134891A Expired - Fee Related JP3276964B2 (ja) | 1990-01-24 | 1991-01-23 | 改良されたトロンビンの製造方法およびそれにより得られた高純度トロンビン調製物 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5151355A (ja) |
EP (1) | EP0439156B1 (ja) |
JP (1) | JP3276964B2 (ja) |
AT (1) | ATE140026T1 (ja) |
CA (1) | CA2034826A1 (ja) |
DE (1) | DE69120550D1 (ja) |
IE (1) | IE73210B1 (ja) |
ZA (1) | ZA91500B (ja) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1995031536A1 (fr) * | 1994-05-18 | 1995-11-23 | The Green Cross Corporation | Procede pour la production de thrombine |
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