JP2001261574A - トロンビン製剤およびその製造方法 - Google Patents
トロンビン製剤およびその製造方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 安定化されたトロンビン製剤とその製造方法
の提供。 【解決手段】 トロンビン製剤の製造が記載されてお
り、この製剤は、トロンボプラスチンを添加することな
くトロンビンに活性化した後、疎水性相互作用クロマト
グラフィーにより精製された（これに続いてウイルスを
不活性化または除去することも可能である）プロトロン
ビンから得られる。疎水性相互作用クロマトグラフィー
の前または後に、陽イオン交換クロマトグラフィーを追
加して行うことも可能である。さらに、安定剤として非
共有結合的に結合する阻害剤を含有しており、液体状態
における安定化のためにさらなる安定剤が添加されてい
てもよい。
の提供。 【解決手段】 トロンビン製剤の製造が記載されてお
り、この製剤は、トロンボプラスチンを添加することな
くトロンビンに活性化した後、疎水性相互作用クロマト
グラフィーにより精製された（これに続いてウイルスを
不活性化または除去することも可能である）プロトロン
ビンから得られる。疎水性相互作用クロマトグラフィー
の前または後に、陽イオン交換クロマトグラフィーを追
加して行うことも可能である。さらに、安定剤として非
共有結合的に結合する阻害剤を含有しており、液体状態
における安定化のためにさらなる安定剤が添加されてい
てもよい。
Description
【０００１】本発明は、液体状態で安定であり、かつ高
い純度およびウイルス安全性によって区別されるトロン
ビン製剤、およびその製造方法に関する。
い純度およびウイルス安全性によって区別されるトロン
ビン製剤、およびその製造方法に関する。
【０００２】トロンビンを商業的に製造することが可能
になったので、その幾つかの用途が浮かび上がってきて
いる。現在挙げるべき主な用途は、診断の目的のほか
に、局所的止血物質としての使用、またはフィブリノゲ
ン含有成分と共に組織膠質の成分としての使用である。
医療目的でトロンビンを使用するための前提条件は、高
いウイルス安全性を有し、かつトロンビンまたは他の因
子の不活な副生成物または分解生成物を極少の含有量で
含む安定な製品として、トロンビンを臨床医が入手でき
るようにすることである。
になったので、その幾つかの用途が浮かび上がってきて
いる。現在挙げるべき主な用途は、診断の目的のほか
に、局所的止血物質としての使用、またはフィブリノゲ
ン含有成分と共に組織膠質の成分としての使用である。
医療目的でトロンビンを使用するための前提条件は、高
いウイルス安全性を有し、かつトロンビンまたは他の因
子の不活な副生成物または分解生成物を極少の含有量で
含む安定な製品として、トロンビンを臨床医が入手でき
るようにすることである。
【０００３】トロンビンを安定化するための多数の方法
が既に提案されている。このように、日本特許出願第５
６−３９７８２号には、有機のモノ−またはポリカルボ
ン酸および／またはモノ−またはポリヒドロキシカルボ
ン酸を用いて安定なトロンビン水溶液を製造する方法が
開示されている。日本特許出願第５７−１８９８５号に
は、トロンビン安定剤としてのアルブミンが開示されて
おり、日本特許出願第６２−１０６０２８号には、安定
剤としての緩衝液が開示されている。欧州特許出願第０
３０２ ７５４号では、好ましくは１〜１０重量％の濃
度の糖およびアミノ酸がトロンビン溶液の安定剤として
提案されている。
が既に提案されている。このように、日本特許出願第５
６−３９７８２号には、有機のモノ−またはポリカルボ
ン酸および／またはモノ−またはポリヒドロキシカルボ
ン酸を用いて安定なトロンビン水溶液を製造する方法が
開示されている。日本特許出願第５７−１８９８５号に
は、トロンビン安定剤としてのアルブミンが開示されて
おり、日本特許出願第６２−１０６０２８号には、安定
剤としての緩衝液が開示されている。欧州特許出願第０
３０２ ７５４号では、好ましくは１〜１０重量％の濃
度の糖およびアミノ酸がトロンビン溶液の安定剤として
提案されている。
【０００４】さらにドイツ特許公開明細書第３１ ２２
９２６号には、トロンビン溶液を製造するために、塩化
ナトリウムのほかに、３〜６個の炭素原子を有する多価
アルコール、硫黄を含まないアミノ酸およびポリエチレ
ングリコールを用いた、貯蔵可能なトロンビン製剤が開
示されている。最後に、欧州特許出願第０ ２２１ ７０
０号には、５〜８のpHで緩衝されたトロンビン製剤が記
載されており、これは適切な場合は塩化ナトリウムおよ
びポリヒドロキシ化合物を含有していてもよい。
９２６号には、トロンビン溶液を製造するために、塩化
ナトリウムのほかに、３〜６個の炭素原子を有する多価
アルコール、硫黄を含まないアミノ酸およびポリエチレ
ングリコールを用いた、貯蔵可能なトロンビン製剤が開
示されている。最後に、欧州特許出願第０ ２２１ ７０
０号には、５〜８のpHで緩衝されたトロンビン製剤が記
載されており、これは適切な場合は塩化ナトリウムおよ
びポリヒドロキシ化合物を含有していてもよい。
【０００５】緩衝され安定化されたトロンビン溶液は、
J. Chabbatらによる刊行物［J. Chabbat, M. Tellier,
P. PorteおよびM. Steinbuch; Properties of a new fi
bringlue stable in liquid state（液体状態で安定な
新しいフィブリン膠質の特性）、Thromb. Res. 76：525
-533(1994)］にも開示されている。
J. Chabbatらによる刊行物［J. Chabbat, M. Tellier,
P. PorteおよびM. Steinbuch; Properties of a new fi
bringlue stable in liquid state（液体状態で安定な
新しいフィブリン膠質の特性）、Thromb. Res. 76：525
-533(1994)］にも開示されている。
【０００６】加えて、D.V. Brezniak, H.I. Hassounaお
よびJ.W. Fenton IIによる刊行物［Blood Coagulation
and Fibrinolysis（血液凝固およびフィブリン溶解）、
6, 847-848(1994)］には、希薄α−トロンビン溶液の安
定性に対する塩の効果が既に記載されている。この研究
では、０.３モル／リットル以上の塩化ナトリウム濃度
が希薄トロンビン溶液に対して顕著な安定化効果を有す
ることが示された。トロンビンは塩化ナトリウム含有溶
液中で３７℃において約２週間安定であり、従ってこの
安定性は塩化カルシウム含有溶液よりも高く、このこと
は、おそらく変性に関してより良好な熱安定性によって
説明できるであろうと述べられている。
よびJ.W. Fenton IIによる刊行物［Blood Coagulation
and Fibrinolysis（血液凝固およびフィブリン溶解）、
6, 847-848(1994)］には、希薄α−トロンビン溶液の安
定性に対する塩の効果が既に記載されている。この研究
では、０.３モル／リットル以上の塩化ナトリウム濃度
が希薄トロンビン溶液に対して顕著な安定化効果を有す
ることが示された。トロンビンは塩化ナトリウム含有溶
液中で３７℃において約２週間安定であり、従ってこの
安定性は塩化カルシウム含有溶液よりも高く、このこと
は、おそらく変性に関してより良好な熱安定性によって
説明できるであろうと述べられている。
【０００７】また、多数の特許出願に、高純度トロンビ
ン製剤の製造方法が記載されている。このように、欧州
特許出願第０ ４３９ １５６号には、止血のために使用
可能な、１６００ Ｕ／mgより高い比活性を有する精製
トロンビンの製造方法が開示されている。この方法は、
トロンビンを活性化するためのトロンボプラスチンの使
用、およびアガロースに基づく支持体材料を用いる陰イ
オン交換クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマ
トグラフィーの使用を伴う。約８０００〜１１,０００
NIH Ｕ／mgの比活性を有する「超純粋な」無色透明のウ
シトロンビンが米国特許第５ ３９７ ７０４号に記載さ
れている。ここでは、ウシ肺からのトロンボプラスチン
がプロトロンビンの活性化のために用いられ、このタン
パク質の精製のために陰イオン交換クロマトグラフィー
および陽イオン交換クロマトグラフィーが用いられる。
ン製剤の製造方法が記載されている。このように、欧州
特許出願第０ ４３９ １５６号には、止血のために使用
可能な、１６００ Ｕ／mgより高い比活性を有する精製
トロンビンの製造方法が開示されている。この方法は、
トロンビンを活性化するためのトロンボプラスチンの使
用、およびアガロースに基づく支持体材料を用いる陰イ
オン交換クロマトグラフィーおよび陽イオン交換クロマ
トグラフィーの使用を伴う。約８０００〜１１,０００
NIH Ｕ／mgの比活性を有する「超純粋な」無色透明のウ
シトロンビンが米国特許第５ ３９７ ７０４号に記載さ
れている。ここでは、ウシ肺からのトロンボプラスチン
がプロトロンビンの活性化のために用いられ、このタン
パク質の精製のために陰イオン交換クロマトグラフィー
および陽イオン交換クロマトグラフィーが用いられる。
【０００８】しかしながら、今日まで開示されたどの方
法も、液体状態において０℃以上の温度で安定であり、
トロンビン活性が１２か月以上後に最初のレベルのなお
７０〜８０％を越える、カルシウムイオンを含有するウ
イルス安全性の精製トロンビン製剤の製造を可能にして
いない。それ故に、本発明の目的は、このようなトロン
ビン製剤を製造する方法を開発することであり、その意
図は、生成物の安全性の理由で、プロトロンビンを活性
化するためにトロンボプラスチンを使用しないで済ませ
ることである。追加の目的は、添加される安定剤として
のポリオールの高濃度が製剤の粘度を望ましくなく上昇
させるので、この高濃度を回避することであった。
法も、液体状態において０℃以上の温度で安定であり、
トロンビン活性が１２か月以上後に最初のレベルのなお
７０〜８０％を越える、カルシウムイオンを含有するウ
イルス安全性の精製トロンビン製剤の製造を可能にして
いない。それ故に、本発明の目的は、このようなトロン
ビン製剤を製造する方法を開発することであり、その意
図は、生成物の安全性の理由で、プロトロンビンを活性
化するためにトロンボプラスチンを使用しないで済ませ
ることである。追加の目的は、添加される安定剤として
のポリオールの高濃度が製剤の粘度を望ましくなく上昇
させるので、この高濃度を回避することであった。
【０００９】この目的は、血漿または血漿画分から得ら
れるプロトロンビンを、トロンボプラスチンを添加する
ことなくトロンビンに活性した後、および適切な場合は
さらなる処理工程の後、疎水性相互作用クロマトグラフ
ィーにより精製し、次いで適切な場合はウイルスを不活
性化または除去することによるトロンビン製剤の製造方
法によって達成されることが見出された。
れるプロトロンビンを、トロンボプラスチンを添加する
ことなくトロンビンに活性した後、および適切な場合は
さらなる処理工程の後、疎水性相互作用クロマトグラフ
ィーにより精製し、次いで適切な場合はウイルスを不活
性化または除去することによるトロンビン製剤の製造方
法によって達成されることが見出された。
【００１０】この方法のさらなる改善は、疎水性相互作
用クロマトグラフィーの前または後に陽イオン交換クロ
マトグラフィーを追加して行う場合に可能である。この
場合、これらのクロマトグラフィーは「正の」（トロン
ビンの結合）または「負の」（不純物の結合）クロマト
グラフィーとして行うことができる。
用クロマトグラフィーの前または後に陽イオン交換クロ
マトグラフィーを追加して行う場合に可能である。この
場合、これらのクロマトグラフィーは「正の」（トロン
ビンの結合）または「負の」（不純物の結合）クロマト
グラフィーとして行うことができる。
【００１１】液体状態における高いトロンビン安定性を
達成するためには、用いられるトロンビン溶液の充分な
純度が必要なので、高いウイルス安全性を有する高純度
トロンビンを用いる簡単で改善された方法が求められ
た。例えば欧州特許出願第０５４３ １７８号に記載さ
れたトロンビン濃縮物の製造方法を基礎として用いるこ
とが可能である。しかしながら、本発明によれば、部分
的に精製されたプロトロンビンをカルシウム塩の存在下
にトロンビンに活性化する他の方法を、トロンビン製剤
を製造するための出発材料として用いることもできる。
達成するためには、用いられるトロンビン溶液の充分な
純度が必要なので、高いウイルス安全性を有する高純度
トロンビンを用いる簡単で改善された方法が求められ
た。例えば欧州特許出願第０５４３ １７８号に記載さ
れたトロンビン濃縮物の製造方法を基礎として用いるこ
とが可能である。しかしながら、本発明によれば、部分
的に精製されたプロトロンビンをカルシウム塩の存在下
にトロンビンに活性化する他の方法を、トロンビン製剤
を製造するための出発材料として用いることもできる。
【００１２】トロンビンを精製するために疎水性相互作
用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を単独でまたは陽イオ
ン交換クロマトグラフィー（ＣＥＣ）と組み合わせて用
いるならば、これによって効果的かつ簡単な精製が達成
される。さらに、これら二つのクロマトグラフィーの順
序が望ましい。クロマトグラフィーを最初に疎水性支持
体を用いて行うならば、トロンビン溶離物を直接に陽イ
オン交換体に結合させ、塩勾配を用いてそれから溶離す
ることができる。これら二つの分離原理の組み合わせ
は、二つの精製工程にわたり約７０％を越える良好な収
率で高純度のトロンビン製剤をもたらす。これによっ
て、活性化または未活性化の凝固因子のような副生成
物、および凝固試験で殆どまたは全く活性を示さないト
ロンビン形態（例えばプロトロンビン、β−トロンビ
ン、γ−トロンビン、または他のトロンビンまたはプロ
トロンビン断片）の良好な除去が同時に達成される。上
記の二つのクロマトグラフィーの組み合わせは、イオン
交換クロマトグラフィー方法を単独で用いた場合よりも
高い純度をもたらす。
用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を単独でまたは陽イオ
ン交換クロマトグラフィー（ＣＥＣ）と組み合わせて用
いるならば、これによって効果的かつ簡単な精製が達成
される。さらに、これら二つのクロマトグラフィーの順
序が望ましい。クロマトグラフィーを最初に疎水性支持
体を用いて行うならば、トロンビン溶離物を直接に陽イ
オン交換体に結合させ、塩勾配を用いてそれから溶離す
ることができる。これら二つの分離原理の組み合わせ
は、二つの精製工程にわたり約７０％を越える良好な収
率で高純度のトロンビン製剤をもたらす。これによっ
て、活性化または未活性化の凝固因子のような副生成
物、および凝固試験で殆どまたは全く活性を示さないト
ロンビン形態（例えばプロトロンビン、β−トロンビ
ン、γ−トロンビン、または他のトロンビンまたはプロ
トロンビン断片）の良好な除去が同時に達成される。上
記の二つのクロマトグラフィーの組み合わせは、イオン
交換クロマトグラフィー方法を単独で用いた場合よりも
高い純度をもたらす。
【００１３】本発明の製造方法は、最初に低純度または
中程度の純度のトロンビンを製造するような手段で行わ
れる。これは、血漿または血漿画分からのプロトロンビ
ンをイオン交換体上に吸着させることによって行うこと
ができる。次いで、このようにして得られたプロトロン
ビンを、例えば低温滅菌法または他の公知の方法、およ
び適切な場合はさらなる処理工程によるウイルスの不活
性化に付することができ、動物組織から得られたトロン
ボプラスチンを添加することなく、それ自体公知の方法
によりトロンビンを活性化することができる。次いで、
後続の疎水性相互作用クロマトグラフィーは、狭雑して
いる血漿タンパク質、活性化された因子またはそれらの
断片、およびトロンビン分解生成物の濃度を低下させ
る。この精製効果は後続の陽イオン交換クロマトグラフ
ィーによってさらに高められる。
中程度の純度のトロンビンを製造するような手段で行わ
れる。これは、血漿または血漿画分からのプロトロンビ
ンをイオン交換体上に吸着させることによって行うこと
ができる。次いで、このようにして得られたプロトロン
ビンを、例えば低温滅菌法または他の公知の方法、およ
び適切な場合はさらなる処理工程によるウイルスの不活
性化に付することができ、動物組織から得られたトロン
ボプラスチンを添加することなく、それ自体公知の方法
によりトロンビンを活性化することができる。次いで、
後続の疎水性相互作用クロマトグラフィーは、狭雑して
いる血漿タンパク質、活性化された因子またはそれらの
断片、およびトロンビン分解生成物の濃度を低下させ
る。この精製効果は後続の陽イオン交換クロマトグラフ
ィーによってさらに高められる。
【００１４】純粋なトロンビンの溶離に続いて、好適な
緩衝物質の添加により製剤のpHを５〜８の範囲に調節
し、安定剤を添加する。緩衝物質および安定剤を一緒に
添加することも可能である。
緩衝物質の添加により製剤のpHを５〜８の範囲に調節
し、安定剤を添加する。緩衝物質および安定剤を一緒に
添加することも可能である。
【００１５】クロマトグラフィー法としてそれ自体公知
である疎水性相互作用クロマトグラフィーに用いられる
吸着剤は、結合した疎水性基を有するゲルである。この
場合に特に好適な疎水性基は、フェニル基または同様の
疎水性を有する他のリガンドである。好ましく用いられ
る陽イオン交換体は、種々のトロンビン変異体に対して
高い分離能を有するゲルである。好適な陽イオン交換ゲ
ルの例は、FractogelEMD SO3(Merck, Darmstadt)、Macr
o Prep 50S (Biorad, Munich)、または精製および滅菌
可能性に関する必要条件を満たす他の陽イオン交換体で
ある。
である疎水性相互作用クロマトグラフィーに用いられる
吸着剤は、結合した疎水性基を有するゲルである。この
場合に特に好適な疎水性基は、フェニル基または同様の
疎水性を有する他のリガンドである。好ましく用いられ
る陽イオン交換体は、種々のトロンビン変異体に対して
高い分離能を有するゲルである。好適な陽イオン交換ゲ
ルの例は、FractogelEMD SO3(Merck, Darmstadt)、Macr
o Prep 50S (Biorad, Munich)、または精製および滅菌
可能性に関する必要条件を満たす他の陽イオン交換体で
ある。
【００１６】次いで、クロマトグラフィー精製後に得ら
れたトロンビン溶液を直接に、ウイルスの不活性化に付
するか、または最小のウイルスでさえも効果的な除去を
可能にする一方で高収率のトロンビンが得られる、例え
ば小孔膜を通すろ過のようなウイルスの削減に付するこ
とができる。しかしながら、ウイルスの不活性化または
削減は、トロンビンのクロマトグラフィー精製の前に行
うこともできる。これは、この順序が方法全体を容易に
する場合である（例えば後続のクロマトグラフィーにお
いて好ましくない成分または副生成物を除去することに
よる）。
れたトロンビン溶液を直接に、ウイルスの不活性化に付
するか、または最小のウイルスでさえも効果的な除去を
可能にする一方で高収率のトロンビンが得られる、例え
ば小孔膜を通すろ過のようなウイルスの削減に付するこ
とができる。しかしながら、ウイルスの不活性化または
削減は、トロンビンのクロマトグラフィー精製の前に行
うこともできる。これは、この順序が方法全体を容易に
する場合である（例えば後続のクロマトグラフィーにお
いて好ましくない成分または副生成物を除去することに
よる）。
【００１７】組織膠質中で用いられるか、または単独で
局所止血剤として用いられる、液体状態および適切な場
合は凍結状態で安定かつ貯蔵可能な成分としてトロンビ
ン製剤を処方するためには、緩衝剤を用いて約５.０〜
８.０のpHに調節すべきである。次いで、使用および安
定化に対して所望の効果を達成するために、可溶性カル
シウム塩、塩化ナトリウム、糖または純アルコールおよ
び／またはアミノ酸、そうでなければモノ−またはポリ
カルボン酸の塩および／またはモノ−またはポリヒドロ
キシカルボン酸の塩を製剤に添加する。これは液体状態
および／または凍結状態で１２か月以上の貯蔵時間、良
好な安定性をもたらす。
局所止血剤として用いられる、液体状態および適切な場
合は凍結状態で安定かつ貯蔵可能な成分としてトロンビ
ン製剤を処方するためには、緩衝剤を用いて約５.０〜
８.０のpHに調節すべきである。次いで、使用および安
定化に対して所望の効果を達成するために、可溶性カル
シウム塩、塩化ナトリウム、糖または純アルコールおよ
び／またはアミノ酸、そうでなければモノ−またはポリ
カルボン酸の塩および／またはモノ−またはポリヒドロ
キシカルボン酸の塩を製剤に添加する。これは液体状態
および／または凍結状態で１２か月以上の貯蔵時間、良
好な安定性をもたらす。
【００１８】トロンビン活性をインビトロで非共有結合
的に阻害する物質を添加すると、特に室温において、ト
ロンビンの自己溶解を減少させることにより、表面的だ
けでも安定性をいっそう高めうることも明らかになっ
た。この目的に好適な物質は、ベンズアミジンまたはｐ
−アミノベンズアミジンのような化合物、または低親和
性ないし中親和性の他のプロテアーゼ阻害剤である。こ
れらの低親和性ないし中親和性のプロテアーゼ阻害剤の
添加は、フィブリノゲンのような物質に関するトロンビ
ンの活性を、従って例えば組織膠質の成分としての後の
使用をも、無視しうるほどしか損なわない。
的に阻害する物質を添加すると、特に室温において、ト
ロンビンの自己溶解を減少させることにより、表面的だ
けでも安定性をいっそう高めうることも明らかになっ
た。この目的に好適な物質は、ベンズアミジンまたはｐ
−アミノベンズアミジンのような化合物、または低親和
性ないし中親和性の他のプロテアーゼ阻害剤である。こ
れらの低親和性ないし中親和性のプロテアーゼ阻害剤の
添加は、フィブリノゲンのような物質に関するトロンビ
ンの活性を、従って例えば組織膠質の成分としての後の
使用をも、無視しうるほどしか損なわない。
【００１９】本発明の方法によれば、液体状態および／
または凍結状態で数か月または数年間貯蔵可能であり、
かつ、この期間中に活性が７０〜８０％以下には低下し
ないトロンビン製剤を製造することができる。
または凍結状態で数か月または数年間貯蔵可能であり、
かつ、この期間中に活性が７０〜８０％以下には低下し
ないトロンビン製剤を製造することができる。
【００２０】本発明の方法を用いると、トロンビンの熱
安定性を低下させるカルシウム塩[B.H. Landis, K.A. K
oehlerおよびJ.W. Fenton II; Human Thrombins. J Bio
l chem 256; 4604-4610(1981)]の存在下でさえも、凝固
試験で実証できるように、４℃で２４か月以上までの間
の高い安定性をもたらすトロンビン製剤を製造すること
が可能である。表４に示すトロンビン製剤の多くは凍結
状態においても安定であり、大部分の場合、室温で３〜
６か月間の安定性を示す。室温における安定性は、特
に、例えばベンズアミジン、ｐ−アミノベンズアミジン
または他のプロテアーゼまたはトロンビン阻害剤のよう
な低親和性ないし中親和性のトロンビン阻害剤によって
高めることができ、これは凝固試験においてフィブリノ
ゲンに関する有意な活性低下を伴わない。
安定性を低下させるカルシウム塩[B.H. Landis, K.A. K
oehlerおよびJ.W. Fenton II; Human Thrombins. J Bio
l chem 256; 4604-4610(1981)]の存在下でさえも、凝固
試験で実証できるように、４℃で２４か月以上までの間
の高い安定性をもたらすトロンビン製剤を製造すること
が可能である。表４に示すトロンビン製剤の多くは凍結
状態においても安定であり、大部分の場合、室温で３〜
６か月間の安定性を示す。室温における安定性は、特
に、例えばベンズアミジン、ｐ−アミノベンズアミジン
または他のプロテアーゼまたはトロンビン阻害剤のよう
な低親和性ないし中親和性のトロンビン阻害剤によって
高めることができ、これは凝固試験においてフィブリノ
ゲンに関する有意な活性低下を伴わない。
【００２１】本明細書に記載した方法により製造された
トロンビン製剤は、特にドイツ特許出願第１９８ ５３
０３３.１号に記載されているように、２成分、例えば
トロンビン含有成分およびフィブリノゲン含有成分から
なるか、あるいは３成分、例えばトロンビン含有成分、
フィブリノゲン含有成分および因子XIII含有成分からな
る液体状態または凍結状態で貯蔵可能な、特にフィブリ
ン膠質の成分として用いることができる。さらに、この
ようにして製造されたトロンビン製剤を他の成分とその
場で混合するか、あるいは３成分フィブリン膠質の場合
は、第三成分を添加する前にこれらの成分の一つと予め
混合することも可能である。しかしながら、治療目的の
ために本発明の方法を用いて凍結乾燥トロンビン製剤を
製造することも可能であり、この場合、再構成後の液体
状態で同様に高い安定性が観察される。
トロンビン製剤は、特にドイツ特許出願第１９８ ５３
０３３.１号に記載されているように、２成分、例えば
トロンビン含有成分およびフィブリノゲン含有成分から
なるか、あるいは３成分、例えばトロンビン含有成分、
フィブリノゲン含有成分および因子XIII含有成分からな
る液体状態または凍結状態で貯蔵可能な、特にフィブリ
ン膠質の成分として用いることができる。さらに、この
ようにして製造されたトロンビン製剤を他の成分とその
場で混合するか、あるいは３成分フィブリン膠質の場合
は、第三成分を添加する前にこれらの成分の一つと予め
混合することも可能である。しかしながら、治療目的の
ために本発明の方法を用いて凍結乾燥トロンビン製剤を
製造することも可能であり、この場合、再構成後の液体
状態で同様に高い安定性が観察される。
【００２２】最後に、本発明により製造されたトロンビ
ン濃縮物は、単独でまたは担体と組み合わせて、出血を
局所的に止めるための物質として使用することもでき
る。本発明の方法を以下の実施例によって、より詳細に
説明する。
ン濃縮物は、単独でまたは担体と組み合わせて、出血を
局所的に止めるための物質として使用することもでき
る。本発明の方法を以下の実施例によって、より詳細に
説明する。
【００２３】
【実施例】実施例１：トロンビンの精製 公知の方法により製造された低純度ないし中純度のトロ
ンビン濃縮物から出発して、二つのクロマトグラフィー
工程を行った。最初に、トロンビン溶液を０.６モル／
リットルの硫酸ナトリウムと混合し、０.６モル／リッ
トルの硫酸ナトリウムを含有する緩衝液Ａ（１０ミリモ
ル／リットルのリン酸Ｎａ、pH６.５）で予め平衡化し
た疎水性クロマトグラフィーゲル（この場合：Phenyl-S
epharose HP、製造業者：Amersham Pharmacia, Freibur
g, Germany）に吸着させた。０.６モル／リットルの硫
酸ナトリウムを含有する緩衝液Ａで洗浄した後、緩衝液
Ａ中の硫酸ナトリウム含有量の低下勾配により、結合し
たトロンビンを溶離した。不純物およびトロンビン断片
の大部分は流通画分または洗浄画分中に除去された。
ンビン濃縮物から出発して、二つのクロマトグラフィー
工程を行った。最初に、トロンビン溶液を０.６モル／
リットルの硫酸ナトリウムと混合し、０.６モル／リッ
トルの硫酸ナトリウムを含有する緩衝液Ａ（１０ミリモ
ル／リットルのリン酸Ｎａ、pH６.５）で予め平衡化し
た疎水性クロマトグラフィーゲル（この場合：Phenyl-S
epharose HP、製造業者：Amersham Pharmacia, Freibur
g, Germany）に吸着させた。０.６モル／リットルの硫
酸ナトリウムを含有する緩衝液Ａで洗浄した後、緩衝液
Ａ中の硫酸ナトリウム含有量の低下勾配により、結合し
たトロンビンを溶離した。不純物およびトロンビン断片
の大部分は流通画分または洗浄画分中に除去された。
【００２４】このトロンビン画分を、さらに処理するこ
となく直接に、緩衝液Ａで平衡化した陽イオン交換カラ
ム（この場合：Fractogel（登録商標）EMD SO3、製造業
者：Merck, Darmstadt, Germany）に負荷し、平衡緩衝
液Ａで洗浄し、緩衝液Ａ中の０〜１.０モル／リットル
の塩化ナトリウムの勾配により溶離した。分離する間
に、得られるα−トロンビン溶離物が約３５００ IU／m
gの高い比純度［２８０nmにおける吸収を測定し、J.W.
Fenton, II, M.J. Fasco, A.B. Stackrow, D.L.Aronso
n, A.M. YoungおよびJ.S. Finlayson, Human Thrombin
s. J Biol Chem 252; 3587-3598(1977)に従い、０.１％
濃度の溶液について１.７４の換算係数を用いてタンパ
ク質を決定］を有するように、最終的な副生成物および
トロンビン断片を除去した。表１に、このトロンビン精
製の結果および得られた比活性を示す。
となく直接に、緩衝液Ａで平衡化した陽イオン交換カラ
ム（この場合：Fractogel（登録商標）EMD SO3、製造業
者：Merck, Darmstadt, Germany）に負荷し、平衡緩衝
液Ａで洗浄し、緩衝液Ａ中の０〜１.０モル／リットル
の塩化ナトリウムの勾配により溶離した。分離する間
に、得られるα−トロンビン溶離物が約３５００ IU／m
gの高い比純度［２８０nmにおける吸収を測定し、J.W.
Fenton, II, M.J. Fasco, A.B. Stackrow, D.L.Aronso
n, A.M. YoungおよびJ.S. Finlayson, Human Thrombin
s. J Biol Chem 252; 3587-3598(1977)に従い、０.１％
濃度の溶液について１.７４の換算係数を用いてタンパ
ク質を決定］を有するように、最終的な副生成物および
トロンビン断片を除去した。表１に、このトロンビン精
製の結果および得られた比活性を示す。
【００２５】この段階で、トロンビンをさらに処理する
まで冷却状態または急速凍結状態で貯蔵することができ
る。
まで冷却状態または急速凍結状態で貯蔵することができ
る。
【表１】
【００２６】実施例２：トロンビンの精製 中程度の純度または低純度のトロンビン濃縮物から出発
して、二つのクロマトグラフィー工程を行った。最初
に、トロンビン溶液を０.６モル／リットルの硫酸ナト
リウムと混合し、０.６モル／リットルの硫酸ナトリウ
ムを含有する緩衝液Ｂ（１０ミリモル／リットルのリン
酸Ｎａ、０.１％のＰＥＧ、pH６.５；［この場合はＰＥ
Ｇ ６０００であるが、他の分子量範囲も使用でき
る］）で予め平衡化した疎水性クロマトグラフィーゲル
（この場合：Phenyl-Sepharose HP、製造業者：Amersha
m Pharmacia, Freiburg, Germany）に吸着させた。０.
６モル／リットルの硫酸ナトリウムを含有する緩衝液Ｂ
で洗浄した後、緩衝液Ｂ中の硫酸ナトリウム含有量の低
下勾配により、結合したトロンビンを溶離した。不純物
およびトロンビン断片の大部分は流通画分または洗浄画
分中に除去された。
して、二つのクロマトグラフィー工程を行った。最初
に、トロンビン溶液を０.６モル／リットルの硫酸ナト
リウムと混合し、０.６モル／リットルの硫酸ナトリウ
ムを含有する緩衝液Ｂ（１０ミリモル／リットルのリン
酸Ｎａ、０.１％のＰＥＧ、pH６.５；［この場合はＰＥ
Ｇ ６０００であるが、他の分子量範囲も使用でき
る］）で予め平衡化した疎水性クロマトグラフィーゲル
（この場合：Phenyl-Sepharose HP、製造業者：Amersha
m Pharmacia, Freiburg, Germany）に吸着させた。０.
６モル／リットルの硫酸ナトリウムを含有する緩衝液Ｂ
で洗浄した後、緩衝液Ｂ中の硫酸ナトリウム含有量の低
下勾配により、結合したトロンビンを溶離した。不純物
およびトロンビン断片の大部分は流通画分または洗浄画
分中に除去された。
【００２７】このトロンビン画分を、さらに処理するこ
となく直接に、緩衝液Ｃ（１０ミリモル／リットルのリ
ン酸Ｎａ、１６６ミリモル／リットルのＬ−アルギニ
ン、pH６.５）で平衡化した陽イオン交換カラム（この
場合：Fractogel（登録商標）EMD SO3、製造業者：Merc
k, Darmstadt, Germany）に負荷し、平衡化緩衝液Ｃで
洗浄し、緩衝液Ｃ中の０〜１.０モル／リットルの塩化
ナトリウムの勾配により溶離した。分離する間に、得ら
れるα−トロンビン溶離物が約３３００ IU／mgの高い
比純度を有するように、最終的な副生成物およびトロン
ビン断片を除去した（表２参照）。
となく直接に、緩衝液Ｃ（１０ミリモル／リットルのリ
ン酸Ｎａ、１６６ミリモル／リットルのＬ−アルギニ
ン、pH６.５）で平衡化した陽イオン交換カラム（この
場合：Fractogel（登録商標）EMD SO3、製造業者：Merc
k, Darmstadt, Germany）に負荷し、平衡化緩衝液Ｃで
洗浄し、緩衝液Ｃ中の０〜１.０モル／リットルの塩化
ナトリウムの勾配により溶離した。分離する間に、得ら
れるα−トロンビン溶離物が約３３００ IU／mgの高い
比純度を有するように、最終的な副生成物およびトロン
ビン断片を除去した（表２参照）。
【００２８】この段階で、得られたトロンビンをさらに
処理するまで冷却状態または急速凍結状態で貯蔵するこ
とができる。
処理するまで冷却状態または急速凍結状態で貯蔵するこ
とができる。
【表２】
【００２９】実施例３：トロンビンの精製 トロンビンの精製を実施例１と同様にして行ったが、相
違点は、クロマトグラフィーに用いた緩衝液がリン酸ナ
トリウムの代わりに２０ミリモル／リットルのＬ−ヒス
チジンを含有していたことであった。この改変を用いた
精製の結果は実施例１に匹敵するが、この場合、例えば
ヒスチジンを緩衝物質として存在させようとするとき
に、最終生成物へのさらなる処理過程を単純化すること
ができる。
違点は、クロマトグラフィーに用いた緩衝液がリン酸ナ
トリウムの代わりに２０ミリモル／リットルのＬ−ヒス
チジンを含有していたことであった。この改変を用いた
精製の結果は実施例１に匹敵するが、この場合、例えば
ヒスチジンを緩衝物質として存在させようとするとき
に、最終生成物へのさらなる処理過程を単純化すること
ができる。
【００３０】実施例４：トロンビンの精製およびろ過 実施例１〜３と同様にして精製された、疎水性相互作用
クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィ
ーの後のトロンビン溶離物から出発して、小さい孔径を
有する膜（例えばPlanovaTM、15nm）上でろ過を行っ
た。パルボウイルスのような小さいウイルスでさえも、
この膜で効果的に除去することができる。この精製トロ
ンビンを出発材料として用いると、トロンビン活性およ
びタンパク質に関して極めて良好な収率が良好なろ過速
度で得られることが認められた（表３参照）。従って、
この方法は高いウイルス削減率でトロンビン濃縮物を製
造するのに適している。
クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィ
ーの後のトロンビン溶離物から出発して、小さい孔径を
有する膜（例えばPlanovaTM、15nm）上でろ過を行っ
た。パルボウイルスのような小さいウイルスでさえも、
この膜で効果的に除去することができる。この精製トロ
ンビンを出発材料として用いると、トロンビン活性およ
びタンパク質に関して極めて良好な収率が良好なろ過速
度で得られることが認められた（表３参照）。従って、
この方法は高いウイルス削減率でトロンビン濃縮物を製
造するのに適している。
【表３】
【００３１】実施例５：トロンビン処方物 クロマトグラフィーにより精製したトロンビンから出発
して、種々の処方物を製造し、−２０℃、４℃、２０〜
２５℃、および幾つかの場合には３７℃で貯蔵した。こ
れらのトロンビン溶液は、精製トロンビン濃縮物を処方
緩衝液に対してダイアフィルトレーションすることによ
り、または塩基性緩衝液に対してダイアフィルトレーシ
ョンし、残余の添加剤を添加し、pHを調節し、トロンビ
ン濃度を調節することにより製造された。このようにし
て約１〜約１５,０００ IU／mlのトロンビン濃縮物を得
ることができる。
して、種々の処方物を製造し、−２０℃、４℃、２０〜
２５℃、および幾つかの場合には３７℃で貯蔵した。こ
れらのトロンビン溶液は、精製トロンビン濃縮物を処方
緩衝液に対してダイアフィルトレーションすることによ
り、または塩基性緩衝液に対してダイアフィルトレーシ
ョンし、残余の添加剤を添加し、pHを調節し、トロンビ
ン濃度を調節することにより製造された。このようにし
て約１〜約１５,０００ IU／mlのトロンビン濃縮物を得
ることができる。
【００３２】フィブリノゲンを基質として用いた凝固試
験でトロンビン活性を測定することにより、処方物の安
定性を試験した。表４に本発明の処方物の選択およびそ
れらの安定剤組成を示し、表５に三つまでの温度におけ
る相当する安定性データを示す。
験でトロンビン活性を測定することにより、処方物の安
定性を試験した。表４に本発明の処方物の選択およびそ
れらの安定剤組成を示し、表５に三つまでの温度におけ
る相当する安定性データを示す。
【００３３】
【表４】
【００３４】
【表５】
【００３５】
【表６】
【００３６】
【表７】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 47/26 Ａ６１Ｐ 7/04 Ａ６１Ｐ 7/04 Ｃ１２Ｎ 9/74 // Ｃ１２Ｎ 9/74 Ａ６１Ｋ 37/547
Claims (15)
- 【請求項１】 非共有結合的に結合する阻害剤を安定剤
として含むトロンビン製剤。 - 【請求項２】 安定剤としての可溶性カルシウム塩およ
び塩化ナトリウムのほかに、 緩衝物質、 糖または糖アルコールおよび／またはアミノ酸および／
またはモノ−またはポリカルボン酸の塩またはモノ−ま
たはポリヒドロキシカルボン酸の塩を含む請求項１に記
載の液体状態で安定なトロンビン製剤。 - 【請求項３】 血漿または血漿画分から得られるプロト
ロンビンを、トロンビンに活性化した後、および適切な
場合はさらなる処理工程の後、疎水性相互作用クロマト
グラフィーにより精製することからなるトロンビン製剤
の製造方法。 - 【請求項４】 トロンビンを活性化するために用いるプ
ロトロンビンを、トロンビン製剤の製造中にウイルスの
不活性化または削減に付する請求項３に記載のトロンビ
ン製剤の製造方法。 - 【請求項５】 上記トロンビンを、上記クロマトグラフ
ィー精製の前または後にも、さらにウイルスの不活性化
または削減に付する請求項３または４に記載のトロンビ
ン製剤の製造方法。 - 【請求項６】 上記疎水性相互作用クロマトグラフィー
の前または後に、さらに陽イオン交換クロマトグラフィ
ーをも行う請求項３〜５のいずれかに記載の方法。 - 【請求項７】 上記トロンビン製剤を５.０〜８.０のpH
に調節する請求項３〜６のいずれかに記載の方法。 - 【請求項８】 安定剤としての可溶性カルシウム塩およ
び塩化ナトリウムのほかに、 緩衝物質、 糖または糖アルコールおよび／またはアミノ酸および／
またはモノ−またはポリカルボン酸の塩またはモノ−ま
たはポリヒドロキシカルボン酸の塩を上記トロンビン製
剤に添加する請求項３〜７のいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】 トロンビン活性を阻害する物質を安定剤
として添加する請求項３〜８のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１０】 上記トロンビン活性を阻害する物質と
してベンズアミジンまたはｐ−アミノベンズアミジンを
添加する請求項９に記載の方法。 - 【請求項１１】 結合した疎水性基を有するゲルを上記
疎水性相互作用クロマトグラフィーのための吸着剤とし
て用いる請求項３〜１０のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１２】 吸着剤として用いられる上記ゲルの疎
水性基がフェニル基または同様の疎水性を有するリガン
ドである請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 ウイルスを除去するのに適した孔径を
有する膜を通して上記トロンビン製剤をろ過する請求項
３〜１２のいずれかに記載の方法。 - 【請求項１４】 請求項３〜１３のいずれかに記載の方
法により得られるトロンビン製剤。 - 【請求項１５】 請求項１、２または１４のいずれかに
記載のトロンビン製剤の止血剤、止血剤の成分または組
織膠質の成分としての使用。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10012732:0 | 2000-03-18 | ||
| DE10012732A DE10012732A1 (de) | 2000-03-18 | 2000-03-18 | Thrombin-Zubereitungen und Verfahren zu ihrer Herstellung |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001261574A true JP2001261574A (ja) | 2001-09-26 |
| JP5577005B2 JP5577005B2 (ja) | 2014-08-20 |
Family
ID=7634888
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001076700A Expired - Fee Related JP5577005B2 (ja) | 2000-03-18 | 2001-03-16 | トロンビン製剤およびその製造方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7351561B2 (ja) |
| EP (1) | EP1136084B1 (ja) |
| JP (1) | JP5577005B2 (ja) |
| KR (1) | KR100916131B1 (ja) |
| AU (2) | AU784992B2 (ja) |
| CA (2) | CA2735316C (ja) |
| DE (1) | DE10012732A1 (ja) |
| ES (1) | ES2654312T3 (ja) |
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| KR20220154375A (ko) * | 2021-05-13 | 2022-11-22 | 주식회사 덴하우스 | 순수도가 향상된 트롬빈 대량 정제 방법 |
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| CA2351544C (en) | 1998-11-18 | 2009-07-07 | Aventis Behring Gmbh | Stabilised protein preparations for a tissue adhesive |
| US7572769B2 (en) | 1998-12-23 | 2009-08-11 | Csl Behring Gmbh | Fibrin adhesive granulate and method for its preparation |
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