KR960005731B1

KR960005731B1 - 군락-자극 인자 및 그의 제조방법

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Publication number: KR960005731B1
Application number: KR1019880003849A
Authority: KR
Inventors: 후미마로 다까꾸; 가즈오 모또요시; 다꾸지 가와시마; 미노루 사이또; 노부야 야나이; 무네오 야마다; 하지메 요꼬따; 구니오 우지이에
Original assignee: 모리나가뉴교 가부시끼가이샤; 오오노 아끼라
Priority date: 1986-12-07
Filing date: 1988-04-06
Publication date: 1996-05-01
Also published as: EP0276551B1; AU8218187A; EP0276551A1; AU606099B2; DE3777623D1; KR880007565A

Abstract

내용 없음.

Description

군락-자극 인자 및 그의 제조방법

제1도는 본 발명의 CSF의 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)의 다이아그램이다.

제2도 및 제3도는 각각 본 발명의 CSF의 원자외선 CD 스펙트럼 및 적외선 스펙트럼을 나타낸다.

본 발명은 포유류의 단구-대식 세포의 군락 형성을 자극하는 요에서 분리된 신규 군락-자극 인자, 및 세포를 생산하는 군락 자극 인자 및 군락 자극 인자 유전자 재조합 세포에 의해 조정 배치로 부터 그 인자를 제조하는 방법에 관한 것이다.

군락-자극 인자 (이하 "CSF"로 언급함)는 포유류의 골수와 같은 조혈조직에 존재하는 조혈간세포 (stem cell)의 분화 및 증식을 자극하는 조혈인자이고, 대부분의 CSF는 당단백질을 함유한다. 지금까지는, 4개의 인자, 즉 단구-대식 간세포에 작용하는 인자 (M-CSF 또는 CSF-1), 과립구-단구 간세포에 작용하는 인자(GM-CSF), 과립구 간세포에 작용하는 인자 (G-CSF) 및 과립구, 단구, 적혈구 및 거핵구에 공통적인 다능성 간세포에 작용하는 인자 (멀티-CSF, 인터류킨-3 또는 IL-3)가 있었다.

멀티-CSF를 제외한 상기 3개의 인간 발생 CSF을 참고하여, 각각의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자 cDNA를 클로닝하고 그 단백질 구조를 밝혔다 [문헌 G.G. Wong et al, Sci-ence, vol. 228, p810~815, 1985; E.S. Kawasak1 et al, Science, vol. 230, p291~296, 1985; S. Nagata et al, Nature, vol. 319, p415~418, 1986을 참고].

인간요에 존재하는 CSF로서는, 단구-대식세포에 작용하는 인자 (CSF-1 또는 M-CSF) [S.K. Das & E.R. Stanley, Journal of Biological Chemistry, vol. 257, p13679~13684, 1982], 과립구 군락을 자극하는 HGI-당단백질 [일본국 특허공고 제30291/85호 및 대응하는 미합중국 특허 제4275056호] 및 CSF-HU [K. Motoyoshi et al. Blood. vol. 52, p1012~1020, 1978 및 Blood, nol. 60, p1378~1386, 1982]가 보고 되었다.

그중에서, 단구-대식세포에 작용하는 상술한 CSF-1은 완전히 정제되었고, 더 나아가 그 단백질을 코딩하는 cDNA가 클로닝 되었다 (상기 E.S. Kawasaki et al.).

정제된 CSF-1의 구조는 이황화 결합을 통해 생물학적으로 활성인 호모이량체 당사슬 형태를 포함하는 두개의 폴리펩티드의 구조이다. 이 이량체는 이황화 결합을 환원제를 이용하여 깨뜨리면 두 개의 동일한 서브 유니트를 형성한다. 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴 아미드 전기 영동 방법으로 측정된 이생물학적으로 활성인 당단백질의 분자량은 45,000~60,000 달톤이다. 글리코실화 되지 않는 폴리펩티드 서브 유니티의 분자량은 14,000~17,000 달톤이다. 이 CSF-1 서브 유니트의 아미노산 서열을 코딩하는 cDNA로 예측된 아미노산의 수는 224이고 그의 분자량은 26,000 달톤이다.

본 발명가들은 공지되지 않았으며 CSF-1과 몰리화학적으로 구분되는 신규 당단백질 CSF가 인가요에 존재함을 발견했고 그것을 분리하였으며, 그의 물리화학적 및 생물학적 특징을 밝혔다. 결과적으로, 본 발명이 수행되었다.

본 발명의 목적은 신규 CSF 또는 항암 약제를 투여하는 화학치료, 면역 결핍 및 골수 이식등으로 인한 백혈구 감소중에 치료 효과를 갖는 치료 조성물 및 그의 제조 방법을 제공한다.

즉, 본 발명은 하기 물리화학적 특징을 갖고 포유류의 단구-대식세포의 군락 형성을 자극하는 작용을 갖는 당단백질을 함유하는 신규 CSF를 제공한다.

(a) 분자량 :

CSF-1 처럼 환원제를 이용하여 두 개의 동일한 서브유니트로 분리되는 호모이량체이고 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정된 그 분자량은 70,000~90,000 달톤이다. 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정된 환원제로 분리되고 생물학적 작용을 잃은 서브유니트의 분자량은 35,000~45,000 달톤이다.

(b) 서브유니트의 아미노산 서열 :

호모 이량체를 구성하는 서브유니트 단백질은 하기와 같이 189, 214 또는 238의 아미노산 서열을 포함하고 122번째 및 140번째 아스파라진 (Asn)은 각각 아스파라진 (Asn)-X-트레오닌(Thr)/세린(Ser)으로 제시되는 전형적인 IV-글리코시드 결합 부위를 갖는다. X는 임의의 아미노산을 나타낸다.

(c) 등전점 :

폴리아크릴아미드 겔등전 촛점법 및 슈크로오스 밀도-구배등전 촛점법으로 측정된 등전점(p1)는 3.1~3.7이다.

(d) 당사슬의 구성 단당류 :

가수분해후 고성능 액체크로마토그래피로 분석하여 당사슬의 구성 단당류가 만노오스, 갈락토오스, N-아세틸 글루코사민, N-아세틸 갈락토사민 및 N-아세틸 뉴라민산임을 밝혔다.

(e) 원편광 이색성 스펙트럼 :

원평광 이색성 분산 미터에 따른 원자외선 CD 스펙트럼은 208nm 및 222nm에서 최소 피이크를 갖고 α-나선형 구조임을 나타낸다.

(f) 열안정성 :

생물학적 활성은 60±0.5℃에서 60분간 가열해도 소실되지 않는다.

(g) 적외선 스펙트럼 :

적외선 스펙트럼은 제3도에 나타낸다.

본 발명은 군락-자극 인자를 제조하는 하기 방법을 제공한다.

그러므로, 본 발명은 보통 인간요에서 분자량이 70,000달톤 이상인 단백질 분획을 수거하고, 그 분획을 1~4M 염-포함 완충액으로 평형시킨 친소수성 물질과 접촉시킴으로써 흡착처리하고 0.5~1.0M 염-포함 완충액으로 용출 처리시키고, 고성능 액체 겔 여과시켜 분자량이 70,000~150,000탈톤인 성분을 포함하는 분획을 회수하고, 그 분획을 pH 1~2에서 역상 고성능 액체 크로마토그래피시켜 0.1% 트리플루오로아세트산을 포함하는 용매를 이용하여 직선 구배농도법으로 군락-자극 당단백질을 회수함을 특징으로 하는 과정을 제공한다 : 상기 정제 단계는 특별한 언급이 없는한 pH 6.5~7.5에서 수행한다 (이과정을 이하 "첫번째 제조방법"으로 언급함).

분자량이 70,000탈톤 이상인 분획의 수거는 예를들면, 청징화후 한외여과에 의해 요를 탈염 및 농축시키고, 요를 양이온 교환기에 접촉시켜 0.2~0.4M 완충액으로 용출시킨후 용출액을 1~4M 완충액에서 겔 여과시키는 통상적인 방법에 의해 수행할 수 있는데, 이 단계는 pH 6.5~7.5에서 수행한다.

게다가, 본 발명은 본 발명의 군락-자극 당단백질에 대한 특이적 항체를 포유류의 단구-대식 세포의 군락 형성을 자극하는 작용을 갖는 군락-자극 당당백질로 면역된 포유류의 혈청에서 분리 및 정제하고, 이 특이적 항체를 불용성 지지체에 결합시켜 항체 결합 지지체를 제조하고, 상술한 군락-자극 당단백질을 포함하는 용액을 상술한 항체 결합 지지체와 접촉시켜 상술한 용액에 포함된 군락-자극 당단백질을 흡착시키고 상술한 항체 결합 지지체에서 군락-자극 당단백질을 용출시킴을 특징으로 하는 군락-자극 당단백질 인자의 제조방법을 제공한다 (이방법은 이하 "두번째 제조방법"으로 언급함).

더 상세히, 본 발명의 CSF는 하기 첫번째 및 두번째 방법에 의해 제조한다 :

(1) CSF의 제조 (첫번째 제조방법) :

정상 인간요를 pH 8.0~9.0으로 조정하여 침전시키고 요내의 점성 물질을 제거하고 상층액을 10,000~50,000달톤의 분자량이 통과할 수 있는 한외여과로 농축 및 탈염시킨다.

탈염된 인간요를 최대한 200배 농축시키고 [최소한 1%(w/v)의 단백질 농도), pH를 6.5~7.5로 조정하고, 원한다면 바이러스를 불활성화시키기 위해 60℃에서 10시간동안 열처리한다. 생성된 침전물을 원심분리로 제거하고 유효 성분을 DEAE-셀룰로오스 등과 같은 음이온 교환기에 흡착시킨다. 그런후, 이 음이온 교환기를 0.05~0.1M 완충액 (pH 6.5~7.5)로 세척한후 유효 성분을 0.2~0.4M 완충액 (pH 6.5~7.5)로 용출시킨다. 이 용출액을 필요하다면 한외여과로 농축시키고 황산암모늄 또는 염화나트륨과 같은 1M~4M 염을 포함하는 완충액 (pH 6.5~7.5)로 평형 시켜 놓은 예를 들면, 세파크릴

S-@300 (Sephacryl

S-300, Pharmacia Co. 제품)과 같은 겔 여과제로 겔 여과시켜 분자량이 70,000~150,000인 분획을 회수한다.

그런후, 이 분획을 완추액을 포함하는 상술산 1M~4M 염으로 평형시켜놓은 페닐-세파로오스 (Phenyl-Sepharose, Pharmacia Co,)와 같은 친 소수성 물질과 접촉시킴으로써 흡착 처리하고, 0.5~1.0M 염을 포함하는 완충액 (pH 6.5~7.5)으로 용출 처리시킨다. 용출액을 한의 여과로 농축시키고 TSKG-3000SW (Toyo Soda Inc. 제품)와 같은 고성능 액체 겔 여과 컬럼으로 겔 여과시켜 분자량이 70,000~150,000탈톤 범위의 분획을 회수한다. 이 분획을 다시 농축시키고 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA) 용액(pH1.2)로 평형시킨 하이-포어

RP-304 (Hl-Pore

RP-304, Biorado Co. 제품)과 같은 고성능 액체 역상 컬럼으로 흡착처리시키고, 0.1% TFA를 포함하는 아세토니트릴 또는 이소프로판올과 같은 용매를 이용하여 직선 구배 농도법으로 용출 처리시킨다. 이렇게 수득된 CSF는 최소한 1×10⁸단위/mg 단백질의 고유 활성도를 갖는 수수한 물질이다.

(2) CSF의 물리 화학적 성질 :

상술한대로 제조된 본 발명의 CSF는 하기 물리 화학적 성질을 갖는다 :

(a) 분자량

CSF의 분자량은 라엠리 방법 (Nature, vol. 227, P 680 685, 1970)에 따라 환원제 부제하에서 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정하여 70,000~90,000달톤임을 밝혔다.

그런후, CSF는 0.2M 메트캅토에탄올로 환원시켜 서브유니트로 분리하고 서브유니트의 분자량을 동일한 방법으로 측정하여 35,000~45,000달톤으로 결정했다 (제1도).

제1도는 본 발명의 CSF의 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동의 전기영동 다이아그램인데, A~E는 비환원 CSF (이량체)를 나타내고, F 및 G는 분자량 마커(marker) 단백질로 나타내고 H~L은 환원 CSF (서브유니트)를 나타내며 세로측은 분자량(×10³달톤)을 나타낸다.

(b) 서브유니트 단백질의 아미노산 서열 :

NH₂-말단 아미노산 서열은 기체상 아미노산 시퀀서를 사용하는 통상적인 방법으로 정제된 CSF를 분석하여 결정한다. 그런후, 정제된 CSF를 6M 구아니딘으로 변형시키고, 모노요오도 아세트산으로 알킬화시킨후, 탈염시키고 트립신 소화 및 시아노겐브로마이드 절단시킨다. 트립신 소화 및 시아노겐브로마이드 절단된 펩티드는 비닥 C-18(Vydac C-18) 역상 고성능 액체 크로마토그래피로 분별시켜 절단된 펩티드 분획을 수득하고 각 분획은 기체상 아미노산 서열로 분석하여 펩티드 단편의 아미노산 서열을 분석했다. 발명가들에 의해 분리된 mRNA를 코딩하는 인간 CSF-1으로 예상된 서열을 확인하여, 서브유니트 단백질의 일차 구조를 트립신소화 및 시아노겐브로마이드 절단 펩티드 서열을 정렬시켜 결정한다. 결과는 서브유니트가 하기 일반식에 제시된 189, 214 또는 238 아미노산의 아미노산 서열을 포함함이 밝혀졌다.

NH₂-말단의 아미노산인 글루탐산-149번째 글루타민의 아미노산은 공지된 CSF-1의 서열과 동일하지만, 150번째~189번째, 214번째 또는 238번째의 40, 65 또는 89아미노산은 공지된 CSF-1의 서열과 완전히 다르다.

189 아미노산의 아미노산 서열의 경우에, 이 아미노산 α, β 및 γ는 189번째 루이신의 뒤에 존재하고, α, β 및 γ는 각각 트레오닌, 트립토판 및 글루탐산일 것으로 예측된다.

COO-말단 아미노산에 대해서, 서브유니트 단백질의 분자량에 따라 189번째가 루이신, 214번째가 프롤린 및 238번째가 라이신으로 밝혀졌다. 122번째 및 140번째에 아스파라진은 Asn-X-Ser/Thr의 전형적인 N-글루코시드 결합을 갖고 당사슬은 이 위치에 결합된 것으로 예측된다. "X"는 임의의 아미노산을 나타낸다.

(c) 당사슬의 구성 단당류

폴리펩티드에 결합된 당사슬의 구성 단당류는 가수분해로 유리시킨후 고성능 액체 크로마토그래피로 분석한다. 보르산 완충액 농도 구배법에 따라서 알도오스 및 시알산을 음이온 교환 컬럼으로 분별시키고 헥소사민은 양이온 교환 컬럼으로 분별시키고 시아노아세트 아미드 또는 아르기닌으로 포스트-컬럼 라벨링 시킨후 형광법으로 확인한다. 이 CSF에 포함된 당사슬은 동일하지 않고 정량 분석은 어렵지만, 탄노오스, 갈락토오스, N-아세틸 글루코사민, N-아세틸 갈락토사민 및 N-아세틸뉴란인산이 구성 단당류도 밝혀졌다.

(d) 등전점

등전점은 폴리아크릴아미드 겔등전 촛점법 및 슈크로오스 밀도 구배등전 촛점법으로 측정하여 p1가 3.1~3.7임을 밝혔다.

(e) 원편광 이색성 (CD) 스펙트럼

원 자외선 영역에서 CD 스펙트럼을 디크로그라프 (J-600, JASCO Co. 제품)로 측정한다 (제2도).

제2도는 본 발명의 CSF의 CD 스펙트럼을 나타내는데 가로측은 파장(nm)을 나타내고, 새로측은 타원률(mdag)을 나타낸다. 최소 피크는 208nm 및 222nm의 파장에서 인지되고 CSF의 이차 구조는 α-나선형 구조를 포함할 것으로 예측된다.

(f) 열 안정성

CSF를 희석 완충액 (pH7.0)에 1μg/ml의 농도로 용해시키고 60±0.5℃에서 60분동안 가열한후 군락-자극 작용 (이하 언급함)을 측정하여 실질적으로 작용이 감소하지 않았음을 밝혔다.

(g) 적외선 흡광 스펙트럼

포우리어트랜스폼(Fourier transform) 적외선 스펙트로미터 (5DXC, Nicolet Co. 제품)를 사용하는 투과법(KBr 타블렛)으로 측정된 이 CSF의 동결 건조 분말의 적외선 흡광 스펙트럼을 제3도에 제시한다. 제3도에서 가로측은 파수(cm^-1)를 나타내고 세로측은 퍼센트 투과률을 나타낸다.

이 CSF는 1650cm^-1, 1201cm^-1및 1133cm^-1에서 강한 흡광을 나타내고 1537cm^-1, 1432cm^-1및 1068cm^-1에서 중간 흡광을 나타낸다.

(3) CSF의 제조 (두번째 제조방법)

두번째 제조방법은 하기 세단계를 특징으로 한다 :

① 군락-자극 당단백질에 대한 특이항체 (이하 "안리-CSF 항체"로 언금합)의 제조

토끼, 염소, 양 및 말과 같은 포유류를 상기 첫번째 제조방법 또는 해당되는 두번째 제조방법으로 수득된 본 발명의 CSF로 면역시킨다. 즉, 본 발명의 CSF를 01~1.0mg/ml의 농도로 생리적 식염수에 용해시키고 동일한 양의 완전프로인트 보조제와 혼합한다. 혼합물을 포유류의 4~8주 동안 일주일에 1회 또는 2회 피하투여하는 그것을 면역시킨다. 면역된 동물의 혈액 항체 타이터(titer)가 증가하면, 정맥 또는 피하주사로 추가 면역을 수행하고 혈핵을 추가 면역후 3~7일째에 수거하고 CSF 안티혈청을 수거한다. CSF에 대한 수거된 안티 혈청의 항체 타이터는 하기에서 언급될 CSF 생물학적 타이터 중화 시험으로 측정하고 안티혈청내의 안티-CSF 항체 타이터를 위해, 1ml 당 최소한 5×10⁶단위의 CSF 생물학적 작용을 증화하는 안티혈청을 선택하는 것이 바람직하다. 수거된 안티혈청을 두차례의 황산 암모늄 염석 및 DEAE-셀룰로오스 크로마토그래피로 정제하여 면역 글로불린 G 또는 M 분획의 안티-CSF 항체를 제조한다. 필요하다면, 안티-CSF 항체를 오직 안티-CSF 항체만 흡착하도록 또는 불순 단백질을 흡착하도록 CSF 또는 안-CSF 항체와 교차 반응을 보이는 불순 단백질을 리간드로서 갖는 항원 컬럼을 통과 시킴으로써 더 정제한다.

② 항체 결합 지지체의 제조단계 :

CSF 항체와 결합 가능한 불용성 지지체로서, 항체 단백질의 NH₂-기 또는 COOH-기와 화학적으로 결합할 수 있는 공지된 지지체중 어느 것을 사용할 수 있다. 이것은, 예를들면, 시아노겐브로아미드 활성화 또는 에폭사이드와 다당류겔, 포르밀화 다당류겔, 아미노에틸화 또는 히드라지드와 중합체등을 포함한다. 불용성 지지체 및 안티-CSF 항체간의 결합 반응은 선택된 불용성 지지체의 결합기에 따른 조건에 있어서 다르므로 항체는 최적 조건을 얻기 위해서 선택된다. 예를들면, 항체를 시아노겐브로마이드 활성 지지체의 경우에는 pH 8~10의 탄산염 완충액에, 에폭사이드 지지체의 경우에는 pH 10이상의 용액에, 그리고 프로밀화 지지체의 경우에는 중성용액에 용해시킨다. 결합 반응의 온도조건은 또한 불용성 지지체에 따라 다양하지만, 본 발명의 결합 반응의 경우에는 25℃ 이하의 저온에서 반응을 수행하는 것이 바람직하다. 특히, 시아노겐브로마이드 활성지지체의 경우에는, 반응을 4℃ 이하에서 수행한다. 결합된 항체의 양은 불용성 지지체 1g (습윤 중량)당 10~50mg이고 바람직하게는 20~30mg이며 결합 반응에서 항체 농도는 1~4%(w/v)에 조정한다. 결합 반응을 완결한 후, 지지체에 남아있는 항체-비결합 반응기를 적절한 처리로 불황성화시켜 항체 결합 지지체를 수득한다.

③ 항체 결합 지지체에 의한 CSF의 정제 단계 :

항체 결합 지지체를 염화 나트륨과 같은 0.5~1.0 염을 포함하는 pH 6~8의 완충액으로 세척한다. 세척된 항체 결합 지지체를 컬럼에 팩킹시키거나 또는 완충액에 현탁시킨다. 전자는 컬럼크로마토그래피로 사용되고 후자는 배치-식 크로마토그래피로 사용된다. 본 발명의 CSF를 포함하는 용액으로는, 예를들면 인간요 농축액, CSF 형성 세포 배양액 상측액 또는 CSF 유전체 재조합 세포 배양액 상층액을 사용할 수 있다. 이것을 pH 6~8로 조정한 후 상기 항체 결합 지지체의 세척용으로 사용되었던 동일한 완충액으로 평형시키거나 염화나트륨을 0.5~1.0M의 농도로 여기에 첨가한다. 이렇게 처리된 용액을 항체 결합 지지체와 접촉시킨다. 이 접촉은 컬럼 또는 배치-식 크로마토그래피에서 수행한다. 컬럼형 크로마토그래피의 경우에, 용액을 실온이하에서, 바람직하게는 10℃ 이하에서 5~20mc/㎠, 시간의 유동물로 여기를 통과시켜 CSF를 항체 결합 지지체의 컬럼에 흡착시킨다. 사용된 CSF 중에서 항체 결합 지지체 1g(습윤 중량)당 5백단-2천만 단위가 바람직하다. 흡착이 완결된 후, 상술한 완충액을 통과시켜 오염물을 제거한다. 배치-식 크로마토그래피의 경우에, 상술한 용액을 실온 또는 10℃ 이하에서 항체 결합 지지체와 혼합하고 혼합물을 1~1-시간동안 고반후 후 유리 여과기 등으로 여과하여 항체 결합 지지체를 회수한다. 이 항체 결합 지지체를 상술한 완충액으로 세척하여 오염물을 완전히 제거한다. 항체 결합 지지체에 특별히 흡착시켜 놓은 CSF를 pH 2~3의 아세테이트 완충액, 3~4M의 티오시아네이트, 또는 0.1~0.2M의 2,4-디니트로페놀 같은 항원-항체 복합체의 분리 용액을 이용하여 항체 결합 지지체로 부터 용출시킨다. CSF는 컬럼 크로마토그래피의 경우에 용리액을 컬럼에 통과시킴으로써 그리고 배치-식 크로마토그래피의 경우에 항체 결합 지지체를 용리액에 현탁시키고 현탁액을 교반함으로써 용출시킨다. 이렇게 수득된 CSF는 불순물을 포함하지 않는 순수한 CSF 이다. 본 발명의 두번째 제조방법은 상기 단계 ①~③을 특징으로 한다. 이것은 하기 실험예에서 더 자세히 설명된다.

[실험예 1]

토끼를 사용한 안티-CSF 항체의 제조

첫번째 제조 방법으로 제조된 본 발명의 CSF를 0.4mg/ml의 농도로 생리적 식염수에 용해시키고 이 용액을 동일한 양의 완전 프로인트 보조제와 혼합한다. 0.5ml의 이 혼합물을 체중이 2.5~3.5kg인 토끼(백색)의 등에 일주일에 일회씩 4주 동안 피하투여하여 면역시키고 토끼를 5주째될때 정맥주사로 증가시킨다. 혈액을 증강후 5일째될때 수거하고 안티-CSF 혈청을 수득한다. 면역 동안에, 혈액을 일주일에 일회씩 귀의 정맥에서 수거하여 CSF 항체 타이터 증가를 시험한다.

안티-CSF 항체 타이터를 하기 CSF 생물학적 활성 중화 시험에 의해 수득한다. 즉, 수거된 혈청을 생리점 식염수로 단계적 회석하고 0.5㎖의 그 용액을 0.5ml의 CSF 용액(2,000단위/ml, 0.02μg/ml)과 실온에서 5분 동안 혼합한다. 그런후, 0.1ml의 혼합물을 1×10⁵쥐골수세포, 20%의 소의 태아 혈청 0.3%의 한천을 포함하는 1ml의 맥코이(McCoy's) 5A 배치에 첨가하고 이것을 습윤된 7.5% CO₂대기에서 7일동안 37℃에서 보온시킨다. 그런후, CSF에 의해 형성된 군락을 센다. 안티-CSF 항체 타이터를 하기식에 의해 수득한다; 안티-CSF 항체 타이터(중화단위/㎖)=(혈청 첨가없이 형성된 군락수)-(혈청 첨가시 형성된 군락수)×(혈청 회석속도 (시간)×10

CSF로 면역된 토끼 세마리의 혈액 안티-CSF 항체 타이터의 변화가 표 1에 제시된다.

상기 표 1에서 토끼번호 1 및 3의 각각 50ml이 안티-혈청을 하기 실시예에 따라 정제한다. 정제는 4℃에서 수행한다. 50ml의 안티혈청에 포화 황산 암모늄 용액을 40%(v/v)의 농도로 교반하에서 첨가하여 항체를 침전시킨다. 침전물을 증류수에 다시 용해시킨후 여기에 다시 포화황산 암모늄을 33%(v/v)의 농도로 첨가하여 항체를 침전시킨다. 침전물을 증류수에 용해시키고 용액을 0.02M 트리스-HCl 완충액 (pH 8.6)에 대해 투석시킨 후 상술한 트리스-HCl 완충액으로 평형시켜 놓은 DEAE-셀룰로오스 컬럼을 통과시켜 IgG 분획의 안티-CSF 항체로 정제된 비흡착 IgG 분획을 수거한다. 수득된 안티-CSF 항체는 각각 480mg 및 460mg이다.

[실험예 2]

항체 결합 지지체의 제조

불용성 지지체와 안티-CSF 항체의 최적 결합 조건을 시아노겐 브로마이드 화성 세파로오스 4B (Sepharose 4B, Pharma-cia Co. 제품) 및 포리밀-셀룰로핀 (Formyl-Cellulofine, Chisso Co. 제품)을 불용성 지지체로서 사용하여 조사한다. 시아노겐 브로마이드 활성 세파로오스 4B를 사용하면, 안티-CSF 항체를 0.1M 탄산염 완충액 (ph 9.0)에 용해시켜 항체 용액을 수득한다. 시아노겐 브로마이드 활성화 세파로오스 4B를 1mM 염산 용액에서 부풀리고 0.1M 탄산염 완충액으로 세척한다. 그런후, 완충액을 흡입 여과로 제거하고 1g (습윤 중량)의 시아노겐 브로마이드 활성화 세파로오스 4B 겔을 50㎖ 원추형 플라스크에 넣는다. 여기에 표 2에 제시된대로 각각 2㎖의 4가지 농도의 항체용액을 첨가하고 각각 4℃에서 18시간동안 진탕시켜 항체를 지지체에 결합시킨다. 결합이 완결된 후 지지체를 0.1M 탄산염 완충액으로 세척한 후 지지체의 반응기를 0.2M 트리스-HCl 완충액 (pH 7.0)으로 불활성화 시킨다.

포르밀-셀룰로핀을 사용하면, 안티-CSF 항체를 0.1M 인산 나트륨 완충액 (pH 7.0)에 용해시키고 이것을 항체용액으로 사용한다. 포르밀-셀룰로핀을 증류수 및 0.1M 인산 나트륨으로 세척한 후 완충액을 흡입 여과하고 제거하고 1g (습윤 중량)의 포르밀-셀룰로핀을 50ml 원추형 플라스크에 넣는다. 여기에 표 3에 제시된대로 각각 2ml의 4가지 농도의 항체용액을 첨가한다. 각각을 실온에서 2시간동안 고반한 후, 7mg의 소듐 시아노보로히드라이드를 첨가하고 실온에서 10시간 더 교반시켜 항체를 지지체에 결합시킨다. 결합후, 지지체를 0.2M 트리스-HCl 완충액 (pH 7.0)으로 세척하고 여기에 5mg의 소듐 시아노보로히드라이드를 포함하는 2ml의 트리스-HCl 완충액을 첨가하고, 실온에서 4시간동안 교반시켜 반응기를 불활성화 시킨다.

시아노겐브로마이드 활성화 세파로오스 4B 및 포르밀-셀룰로핀에 결합된 항체의 양은 표 2 및 3에 제시된다.

안티-CSF 항체가 유효량 및 과량으로 불용성 지지체에 결합하기 위한 항체 농도는 시아노겐브로마이드 활성화 세파로오스 4B 및 포르밀-셀룰로핀에 20~30mg/ml이다. 더 낮은 농도인 경우에는, 결합율이 높지만 항체 결합향이 적고 더 높은 농도인 경우에는, 결합 양은 많지만 결합율이 낮다.

[실험예 3]

항체 지지체에 의한 CSF의 제조

불용성 지지체로서 포르밀-셀룰로핀을 함유하고 항체 결합 양이 31mg/g 겔인 항체 결합 지지체를 실험에 2와 동일한 방법으로 제조한다. 인간 요를 DEAE-셀룰로오스 처리 및 겔여과 시킴으로서 수득된 고유 활성도 2×10⁵단위/mg의 부분 정제된 CSF (순도 : 1% 미만)를 포함하는 용액을 CSF로 사용하고 CSF 정제에 대한 조사는 배치-식 크로마토그래피로 수행한다.

항체 결합 지지체를 0.5M 염화 나트륨을 포함하는 0.02M인 산염 완충액 (pH 7.0)으로 세척하고 흡입 여과시킨다.

용액을 포함하는 이 CSF는 상술한 인산염 완충액으로 평형시켜 놓는다. 1g의 항체 결합 지지체에 용액을 포함하는 CSF를 표 4에 제시된대로 4가지의 첨가량으로 첨가한 후, 10℃에서 6시간동안 교반하고 상술한 완충액으로 충분히 세척하고 CSF를 0.2M 아세테이트-염산 완충액 (pH 2.5)로 용출시킨다.

표 4에 제시한대로, 고회수율로 CSF를 정제하기 위해, 1g (습윤 중량)의 항체결합 지지체 당 0.6~1.5×10⁷단위의 양으로 CSF를 충전시키는 것이 적당하다. 게다가 회수된 CSF를 고유활성 및 SDS-PAGE로 순도를 시험한다.

결과는 표 5에 제시된다.

표 5에 제시된대로, 부분 정제된 CSF를 포르밀-셀룰로핀을 이용한 친화성-크로마토그래피로 최소한 245배 정제하면 그 생성물은 SDS-PAGE에 따르면 순도가 90% 이상인 균질상 당단백질이다.

본 발명의 CSF에 존재하는 바이러스는, 만약 있다면, 본 발명의 CSF의 열안정성 때문에, 첫번째 및 두번째 제조 방법의 어느 단계에서 10시간동안 60℃에서 가열함으로써 불활성화 시킬 수 있다.

CSF의 생물학적 작용

(a) 군락-자극 작용 및 고유 활성도 :

본 발명의 CSF의 군락-자극작용은 생쥐 골수 세포를 이용한 단층의 연한 한천 겔을 사용하는 군락 형성방법으로 결정한다. 결국, 각각의 CSF 시료를 0.3%의 한천, 20%의 소의 태아 혈청(FCS) 및 1×10⁵생쥐 골수 세포를 포함하는 1ml의 맥코이 5A 베지와 혼합하고 혼합물을 습윤된 이산화탄소 대기에서 7일동안 37℃에서 보온시킨다. 보온 후, 형성된 군락의 수를 세고, 여기서 세포집성을 의미하는 "군락"이란 어휘는 최소한 50세포를 포함한다. 군락 자극작용을 단위로 나타낸다. 1단위는 1군락을 형성하는 데 필요한 CSF의 양을 의미한다. 고유 활성도는 1mg의 CSF 단백질당 형성된 군락(단위)의 수로 나타낸다. 본 발명의 CSF는 고유 활성도가 1.4×10⁸단위/mg 단백질임이 밝혀졌다. 형성된 군락을 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin)염색시켜 형태학적으로 최소한 95%의 군락이 단구-대식세포임을 밝혔따. (b) 생쥐 골수 단구-대식 간세포(CFU-M)의 시험관내 및 세포내증식에 대한 자극효과 (b)-1 : 시험관내 시험 플레이트 접착법을 사용하여 제조된 비접착성 C₅₇BL 생쥐 골수 세포를 1×10⁶세포/ml의 농도로 20% CSF를 포함하는 맥코이 5A 배지에 현탁시키고 본 발명의 첫번째 제조방법으로 정제된 CSF, O(대조), 100단/ml, 500단위/ml. 1000단위/ml 및 200단위/ml를 첨가하고, 이 배지를 습윤된 7.5% CO₂대기에서 24시간동안 37℃에서 보온시킨다. 보온 후, 골수 세포를 원심분리로 세척하고 CSF가 없는 동일한 배지로 5배 희석시킨다. 0.1ml 분액과 각 시료의 희석 골수세포 용액을 4배향 디쉬에 나누고 1000단위의 CSF, 0.3% 한천 및 20% FCS로 보충된 1ml의 맥코이 5A 배지와 혼합한다. 그것을 습윤된 7.5% CO₂대기에서 7일동안 37℃로 보온시킨다. 보온 후, 형성된 CFU-M의 수를 센다. 이경우에, 최소한 50세포를 포함하는 세포집성을 단구-거대간세포(CFU-M)로 간주한다. 결과는 표 6에 제시된다.

주 : * 및 **는 각각 5% 및 1%의 중요한 수준을 제시한다.

표 6에 제시된 대로, 생쥐 골수세포에서 CFU-M의 수는 첨가된 CSF의 농도에 따라 증가된다. (b)-2 : 세포내 시험 C₅₇BL 생쥐(5마리/군)에 CSF를 0(생리적 식염수), 80×10⁴단위/kg 체중, 160×10⁴단위/kg 및 320×10⁴단위/kg의 양으로, 하루에 1회씩 연 3일간 복강내 주사로 투여한다. 투여가 완결된 다음날, 대퇴골수 및 이자를 각각의 생쥐에서 제거하고 기관마다 단구-대식간세포 (CFU-M)의 수를 상기 시험관내 시험에서 언급했던 동일한 방법대로 측정한다. 결과는 표 7 및 표 6에 제시된다.

주 : **는 1%의 중요한 수준을 나타낸다.

주 : **는 1%의 중요한 수준을 나타낸다.

표 7 및 표 8에 제시된대로, 80×10⁴단위/kg 체중의 CSF 투여는 골수 및 이자에서의 CFU-M의 증가를 초래하고, 160×10⁴단위/kg의 투여는 놀라울 정도의 증가를 초래한다.

상기 언급한 물리의 화학적 성질 및 생물학적 작용을 갖는 본 발명의 CSF는 하기와 같이 공지된 유사물질과 비교된다.

본 발명의 CSF는 당 사슬을 포함하는 두개의 폴리펩티드가 CSF-1과 유사하고, 이황화 결합으로 결합되고 분자량이 CSF-1의 분자량보다 큰 70,000~90,000달톤인 생물학적으로 활성인 호모 이량체의 구조이다. 게다가, 본 발명의 CSF를 구성하는 서브유니트의 폴리펩티드는 최소한 189, 214 또는 238아미노산을 갖고 분자량은 CSF-1의 14,000~17,000달톤보다 큰 35,000~45,000달톤이다. 서브유니트의 아미노산 서열을 CSF01의 아미노산 서열과 비교하여 NH₂-말단의 첫번째~149번째의 아미노산 서열은 동일하지만, 150번째~189번째, 214번째 또는 238번째의 아미노산 서열은 CSF-1의 cDNA서열과 다르며 CSF-1 유전자에서는 코딩하지 않는다. 결국, 본 발명의 CSF는 CSF-1과 부분적으로는 동일하지만, 공지된 CSF-1과는 유전적으로 및 구조적으로 다르다. 게다가, 본 발명의 CSF는 상술한 공지된 HGI-당단백질 및 CSF-HU와 생물학적 성질 및 물리화학적 성질에 있어서 완전히 다르다.

본 발명의 실시예는 하기에 제시된다.

[실시예 1]

200ℓ의 정상 인간요를 pH8.5로 조정하고 침전물을 여과로 제거한다. 여액을 분자량 50,000달톤을 분별시키는 한외여과(막 H10×50이다, Amicon Corp. 제품)로 농축 및 탈염시킨다. 그런 후, 농축액을 pH 7.0으로 조정하고 60℃에서 10시간동안 밀봉 용기에서 가열 살균한다. 살균 후, 농축액을 원심분리(5,000×g, 30분간)하여 침전물을 제거한 후, 0.02M 인산염 완충액(pH 7.2)로 평형시킨 DEAE-셀룰로오스와 혼합하여 액체를 흡착시킨다. 이 DEAE-셀룰로오스를 0.02M 인산염 완충액 및 0.05M 염화나트륨을 포함하는 0.02M 인산염 완충액(pH 7.2)으로 세척한 후 0.25M 염화나트륨을 포함하는 0.02M 인산염 완충액(pH 7.2)로 용출시킨다. 용출액을 한외여과(막은 H1P 10이다, Amicon Corp. 제품)로 농축시키고 세파크릴 S-300(ψ4×80cm, Pharmacia Co. 제품)을 사용하여 완충액 (pH 7.2)이 첨가된 1M 황산암모늄으로 겔-여과한다. 겔-여과로 수득된 분자량 70,000-150,000달톤의 분획을 상술한 1M 황산암모늄 완충액으로 평형된 페닐-세파로오스 4B 컬럼(ψ2×20cm, Pharmacia Co. 제품)에 흡착시킨 후 완충액이 첨가된 0.5M 황산암모늄(pH 7.2)로 용출시킨다. 용출액을 한외여과(막은 NM-3이다, Ashai Kasei Kogyo K.K. 제품)로 농축시키고 TSKG-30,000SW 컬럼(ψ4×600mm×2, Toyo Soda Inc. 제품)을 통과시킴으로써 고성능 액체 크로마토그래피시켜 분자량이 70,000~150,000인 분획을 수득한다. 이 분획을 다시 농축시키고 1% 트리플루오로아세트산을 포함하는 아세토니트릴 0~100%(pH 2.0)의 직선구배농도로 하이-포이 RP-304(ψ4×150mm, Biolad Co. 제품)의 역상 컬럼을 통과시켜 고성능 액체 크로마토그래피시킨 후 CSF를 용출시켜 고유 활성도가 1.4×10⁸단위/mg 단백질인 정제된 CSF를 수득한다. 각 단계에서의 CSF 정제도는 표 9에 제시된 대로이다.

(주) CSF억제제가 비처리 인간요에 존재하고 정확한 활성도를 측정할 수 없기 때문에, DEAE-셀룰로오스 처리후의 활성도를 제시한다.

[실시예 2]

세파크릴 S-300을 TSKG-3,000SW(HLC-837, Toyo Soda Inc. 제품)으로 대치하고 페닐-세파로오스 4B를 TSK 페닐-5PW(Toyo Soda Inc. 제품)으로 대치하는 것을 제외하고는 실시예 1을 반복하고 정제를 고성능 액체 크로마토그래피로 모두 수행한다. 수득된 CSF는 고유 활성도가 1.5×10⁸단위/mg이고 회수률은 실시예 1의 것과 유사하다.

[실시예 3]

안티-CSF 안티혈청을 실시예 1에서 수득된 CSF로 면역시키고 충분히 항체 타이터가 증가된 10마리의 토끼에서 수거하고, 실험예 1의 방법으로 정제된 약 4g의 안티-CSF 항체를 수득한다. 안티-CSF 항체를 0.1M 인산염 완충액 pH 7.0)에 투석시키고 20mg/ml 농도로 조정한다. 200ml의 항체 용액을 증류수 및 0.1M 인산염 완충액으로 세척해 놓은 100g의 포르밀-셀룰로핀에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 2시간동안 교반한다. 그런후, 여기에 700mg의 소듐시아노보로히드라이드를 첨가하고, 16시간 더 교반시켜 안티-CSF 항체를 포르밀-셀룰로핀에 결합시켜 항체 결합 지지체를 수득한다. 결합시킨 후, 이 지지체를 0.2M 트리스-HCl 완충액으로 세척하고, 여기에 500mg의 소듐시아노보로히드라이드를 포함하는 200ml의 트리스-HCl 완충액을 첨가하고 실온에서 4시간동안 교반시켜 반응하지 않은 기를 불활성화 시킨다. 그런 후, 이 항체 결합 지지체를 0.5M NaCl을 포함하는 0.02M 인산염 완충액으로 충분히 세척한다. 항체 결합 지지체를 여기에 결합된 29.5mg/g 지지체의 안티-CSF 항체를 갖는다. 그런 후, 1,000ℓ의 정상 인간요를 한외여과로 농축시키고 탈염시킨 후 DEAE-셀룰로오스에 흡착시켜 오염물을 제거하고 0.3M NaCl 용액으로 용출시킨다. 용출액에 0.5M의 농도로 염화나트륨을 첨가하여 CSF를 포함하는 용액을 수득한다. 이 CSF는 고유 활성도가 2×10⁵단위/mg이다. 100g의 상술한 항체 결합 지지체에 CSF를 포함하는 상술한 용액을 첨가하고(총량 500ml), 10℃ 이하에서 밤새도록 교반하고 배치-식 크로마토그래피 시킨다. 그런 후, 혼합물을 유리 여과기로 여과하여 0.5M NaCl을 포함하는 0.02M 인산염 완충액으로 충분히 세척하고 항체 결합 지지체를 수거한다. 그런 후, 여기에 500ml의 0.2M 아세테이트 완충(pH2.5)를 첨가하고, 10℃에서 1시간동안 교반하여 CSF를 용출시킨다. 용출액을 pH7.0으로 조정한 후 한외여과로 농축 및 탈염시켜 약 10mg의 정제된 CSF를 수득한다. 이 정제된 CSF는 고유 활성도가 5.2×10⁷단위/mg이고 SDS-PAGE 방법에 따르면 순도가 최소한 90%이다.

[실시예 4]

실시예 3에서 제조한대로 10g의 동일한 항체 결합 지지체를 컬럼(ψ15×100mm)에 팩킹시키고 1.0M NaCl을 포하하는 0.02M 인산염 완충액(pH 7.0)을 통과시켜 세척한다. CSF 생산 세포 배양 상층액으로부터 CSF의 분리 및 정제는 상술한 컬럼을 사용하여 수행한다. 인간 췌장 암세포(이하 "MIA-PaCa-2 세포"로 언급함)을 CSF 생산세포로 사용한다. MIA-PaCa-2 세포를 5%의 소아 태아 혈청을 포함하는 둘배코의 MEM 배지에서 7일동안 보온시키고 1ℓ의 이 배양상측액을 한외여과로 농축시켜 CSF를 포함하는 용액을 제조한다. 이 CSF는 고유 활성도가 4×10⁵단위/mg이다. 100ml의 이 용액에 1.0M의 농도로 염화나트륨을 첨가하고 용액을 10℃에서 상술한 컬럼에 통과시킨다. 그런 후, 컬럼을 1.0M NaCl을 포함하는 인산염 완충액으로 세척한 후 CSF를 3.5M 소듐티오시아네이트로 용출시킨다. 용출액을 0.02M 인산염 완충액에 투석시킨 후 한외여과로 농축시켜 약 1mg의 정제된 CSF를 수득한다. 이 CSF는 고유 활성도가 7.8×10⁷단위/mg이고 순도는 SDS-PAGE 방법에 따르면 최소한 90%이다.

상술한 대로, 본 발명은 포유류의 단구-대식 세포의 군락 형성을 자극하는 신규 CSF를 제공한다.

본 발명의 CSF의 첫번째 제조방법에 따라서, CSF를 쉽게 구할 수 있는 인간요에서 정제할 수 있다. 두번째 제조방법에 따라서, CSF 생산세포 또는 CSF 유전자 제조합 세포의 배양용액과 같은 CSF를 포함하는 다른 용액을 사용할 수 있으며, 또한 본 발명의 CSF는 항체 결합 지지체를 사용하여 각종 오염물 및 다른 인자를 포함하는 다른 용액으로부터 선택적으로 분리 및 정제할 수 있다. 인간 단백질 보다는 다른 종류의 단백질을 제거하는데 우월한 작용을 갖기 때문에, 고정제 CSF는 약제로서 저렴하게 제공할 수 있다.

Claims

하기 일반식에 제시된 서브유니트의 아미노산 서열을 가지며, 수듐도데실설페이트 폴리아크릴아미드 전기영동법으로 측정하여 35,000~45,000달톤의 분자량을 갖는 두개의 동일한 글리코폴리펩티드 서브유니트의 호모 이량체의 구조이고, 동일한 방법으로 측정하여 분자량이 70,000~90,000달톤이며, 5.2×10⁷유니트/mg의 특이적 활성을 가지는 포유류의 단구-대식세포의 군락 형성을 자극하는 작용을 갖는 군락-자극 당단백질 :
제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열에서 122번째 및 140번째 아스파라진이 각각 아스파라진 (Asn)-X-트레오닌 (Thr)/세린 (Ser) (X는 임의의 아미노산을 나타냄)으로 표시된 전형적인 N-글리코시드 결합 부위를 갖는 군락-자극 당단백질.
제1항에 있어서, 등전점 (PI)이 폴리아크릴아미드 겔 등전 촛점점 및 슈크로오스 밀도-구배 등전 촛점법으로 측정하여 3.1~3.7인 군락-자극 당단백질.
제1항에 있어서, 그것에 포함된 탄수화물이 만노오스, 갈락토오스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민 및 N-아세틸뉴라민산인 군락-자극 당단백질.
제1항에 있어서, 208nm 및 222nm에서 최소 피크를 갖는 원편광 이색성 스펙트럼이 α-나선 구조임을 나타내는 군락-자극 당단백질.
제1항에 있어서, 생물학적 활성이 60±0.5℃에서 60분간 가열하여도 소실되지 않는 군락-자극 당단백질.
제1항에 있어서, 적외선 스펙트럼이 제3도에 나타낸 것과 같은 군락-자극 당단백질.
제1항에 있어서, 상기 아미노산 서열에서 122번째 및 140번째 아스파라진이 각각 아스파라진 (Asn)-X-트레오닌 (Thr)/세린 (Ser) (x는 임의의 아미노산을 나타냄)으로 표시된 전형적인 N-글리코시드 결합 부위를 가지며, 그것에 포함된 탄수화물은 만노오스, 갈락토오스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민 및 N-아세틸뉴라민산이고; 등전점 (pI)은 폴리아크릴아미드 겔 등전 첫점법 및 슈크로오스 밀도-구배 등전 촛점법으로 측정하여 3.1~3.7이고, 208nm 및 222nm에서 최소 피크를 갖는 원편광 이색성 스펙트럼이 α-나선 구조임을 나타내고, 적외선 스펙트럼은 제3도에 나타낸 바와 같으며, 열안정성은 60±0.5℃에서 60분 동안 가열해도 생물학적 활성이 소실되지 않는 군락-자극 당단백질.
정상인요에서 분자량이 70,000달톤 이상인 단백질 분획을 수거하고, 그 분획을 1~4M 염-포함 완충액으로 평형시킨 친소수성 물질과 접촉시킴으로써 흡착처리 및 0.5~1.0M 염-포함 완충액으로 용출처리시키고, 고성능 액체 겔 여과시켜 분자량이 70,000~150,000달톤인 성분을 포함하는 분획을 회수하고, 그 분획을 pH 1~2에서 역상고성능 액체 크로마토그래피시켜 0.1% 트리플루오로아세트산을 포함하는 용매를 이용하여 직선구배 농도법으로 군락-자극 단당백질을 회수하며; 상기 정제 단계는 특별한 언급이 없는 한 pH 6.5~7.5에서 수행함을 특징으로 하는 제1항이 군락-자극 당단백질의 제조방법.
제9항에 있어서, pH 6.5~7.5에서, 청징화 후 한외여과에 의해 요를 탈염 및 농축시키고, 그 요를 음이온 교환기와 접촉시켜 0.2~0.4M 완충액으로 용출시키고, 용출액을 1~4M 완충액에서 겔 여과시킴으로써 분자량이 70,000달톤 이상인 분획의 수거를 수행하는 제조방법.
포유류의 단구-대식 세포의 군락 형성에 자극 작용을 갖는 군락-자극 당단백질로 면역시킨 포유류의 혈청에서 군락-자극 당단백질에 대한 특이 항체를 분리 및 정제하고, 이 특이항체를 불용성 지지체에 결합시켜 항체 결합 지지체를 제조하고, 군락-자극 당단백질을 포함하는 용액을 항체 결합 지지체와 접촉시켜 용액에 포함된 군락-자극 당단백질을 흡착시키고 흡착된 항체 결합 지지체에서 군락-자극 당단백질을 용출시킴을 특징으로 하는 제1항의 군락-자극 당단백질의 제조방법.
제11항에 있어서, 군락-자극 당단백질을 포함하는 용액을 인간요, 군락-자극 당단백질 생산세포 또는 군락-자극 인자 유전자 재조합 세포의 배양용액 및 그의 농축액으로 구성된 군에서 선택되는 제조방법.
제11항에 있어서, 포유류가 토끼, 염소, 양 또는 말인 제조방법.
제11항에 있어서, 불용성 지지체가 시아노겐브로마이드 활성화, 에폭사이드화 또는 포르밀화 다당류 겔, 또는 아미노 에틸화 또는 히드라지드화 중합체인 제조방법.
제11항에 있어서, 접촉을 5백만~2천만 단위의 군락-자극 당단백질이 1g (습윤 중량)의 항체 결합 지지체와 접촉되도록 수행하고, 용출을 pH 2~3의 아세테이트 완충액, 3~4M의 티오시아네이트 또는 0.1~0.2M의 2,4-디니트로페놀로 수행하는 제조방법.
제1항의 당단백질 및 생리학적으로 수용가능한 회석제를 함유함을 특징으로 하는 백혈구 감소중에 치료효과를 갖는 조성물.
제16항에 있어서, 제1항의 당단백질을 바이러스 불활성화 열처리시킨 조성물.