CN105839196A - 一种真核生物DNA的Hi-C高通量测序建库方法 - Google Patents

一种真核生物DNA的Hi-C高通量测序建库方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种真核生物DNA的Hi‑C高通量测序建库方法，其中，DNA细胞核内环化步骤包括将末端修复后DNA与环化体系混合并在4‑6℃孵育2‑4h后在16‑22℃下孵育4‑6h获得内环化后物料；其中，所述环化体系的组成成分包括：T4连接酶缓冲液、BSA、T4 DNA连接酶以及选自PEG 4000和PEG 6000中的至少一种的聚乙二醇。本发明所提供的方法能够有效的提高DNA的特性环化效率，获得明显高于传统方法的有效数据率。

Description

一种真核生物DNA的Hi-C高通量测序建库方法
技术领域
本发明属于生物化学领域，具体的，涉及一种真核生物DNA的Hi-C高通量测序建库方法。
背景技术
染色体构象捕获(Chromosome Conformation Capture，3C)技术是一种研究染色体和蛋白互作和染色体构象的技术，在第二代测序技术的引导下发展出了多个方法，这些方法中的第一个就是发表于2009年的Hi-C技术。在Hi-C技术中，以整个细胞核为研究对象，利用高通量测序技术，结合生物信息学方法，研究全基因组范围内整个染色质DNA在空间位置上的关系；通过对染色质内全部DNA相互作用模式进行捕获，获得高分辨率的染色质三维结构信息。Hi-C技术应用十分广泛，贯穿当今生命科学研究的前沿及热点领域。现有的Hi-C技术对构建3C文库的过程进行了稍许修改。具体的，在接合前，使用生物素标记的核苷酸填充酶切产生的粘性末端。平末端接合后，提取DNA并使用超声波对DNA进行修剪，最后抓取生物素标记了的DNA片段以确保用以后续分析的数据更多的来自真实的交互。将通过第二代测序得到的DNA序列对映射到参考基因组后，如果一对序列对应于不同的n段酶切片段，那么就认为这两个片段之间有n次相互作用，从而能够构建一个全基因组中所有酶切片段之间接合频率的矩阵。利用这个频率矩阵，将基因组组装过程中形成的contig、scaffold进行染色体定位、方向没定位，延长拼接结果，辅助基因组组装，尤其对于获得群体困难无法构建遗传图谱的物种意义重大。
基于高通量进行染色体构象捕获的Hi-C技术，是染色体相互作用研究领域的一个巨大的飞跃。但是距离研究普遍揭示生物学功能的目标还很遥远，Hi-C交互数据包含相当高的随机噪声。由于临近染色体的随机靠近，捕获的信号会湮没那些特征性的比较稳定的染色质位点间的联系，检测获得的有效数据率不高。
现有Hi-C高通量测序的上述缺陷限制了该技术在促进功能基因组研究中的应用，因此有必要对该技术进行改进从而提供一种数据率高、适用性广的新的Hi-C高通量测序建库方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的Hi-C高通量测序建库方法中存在的上述缺陷，提供一种有效数据率高、适用性广的Hi-C高通量测序建库方法。
为达到以上目的，本发明提供了一种真核生物DNA的Hi-C高通量测序建库方法，所述方法包括以下步骤：首先对样品进行甲醛交联获得交联后的物料，对所述交联后物料进行内切酶酶切获得酶切后物料，用生物素标记的碱基对所述酶切后物料进行末端修复，获得末端修复后DNA，对所述末端修复后DNA进行DNA细胞核内环化获得内环化后物料，再对所述内环化后物料进行解交联和纯化获得DNA测序文库。
其中DNA细胞核内环化步骤包括将末端修复后DNA与环化体系混合并在4-6℃孵育2-4h后在16-22℃下孵育4-6h获得内环化后物料；为了进一步提高DNA的特异性环化效率，提高Hi-C文库的有效数据率，优选将末端修复后DNA与环化体系混合并在4℃孵育2h后在22℃下孵育4h获得内环化后物料。
内环化的目的是使得具有相互作用的DNA片段之间发生环化。以确保后续测序和分析过程中确定相互作用的DNA的位置。本发明对于末端修复后DNA与环化体系的混合比例没有特别的限制，只要能够使得所述DNA能够实现充分的内环化即可。环化过程中，为了避免染色体间的非特异连接，可以采用较大的连接体系，一般的相对于1g的植物叶片，环化体的用量可以为6ml-8ml。
其中，所述环化体系的组成成分包括：T4连接酶缓冲液、BSA、T4 DNA连接酶以及选自PEG 4000和PEG 6000中的至少一种的聚乙二醇。
可选的，所述环化体系包括以下用量的各组分：
和水，水的用量使得所述环化体系的总量为7ml。
在本发明的一种特别优选的实施方式中，所述环化体系包括以下用量的各组分：
和水，水的用量使得所述环化体系的总量为7ml。
可选的，相对于1g样品，环化体系的用量为6-8ml。
其中，所述T4连接酶缓冲液中的组成成分可以为：50mMTris-HCl(pH 7.5 25℃)，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP，所述T4连接酶为购买的商品化产品，例如可以为NEB公司的T4连接酶，Thermo公司的T4DNA连接酶。
本发明中进行内环化的过程中，可以直接将末端修复后DNA与环化体系进行孵育，现有技术中一般预先用SDS和Triton X-100处理末端修复后DNA。本发明所提供的方法省略了上述步骤，核内环化使得染色体间交互数据的比例显著降低，减少染色质交互数据的噪声，同时可以消除限制性片段长度偏好性。
所述环化步骤优选在分子杂交炉中进行，杂交炉可使DNA和连接酶充分反应，从而提高连接效率。
可选的，所述样品为植物组织、动物组织或白细胞。当样品为植物组织时，优选预先对植物组织进行液氮研磨。优选的，所述样品为水稻叶片或人血液白细胞。
本发明中所述甲醛交联步骤的目的是保存细胞核内蛋白与DNA、DNA与DNA之间的相互作用关系，维持细胞内的3D结构。
当所述样品为植物组织或动物组织时，甲醛交联可以按照以下步骤进行：在15-25℃下将样品与交联体系混合后在15-25℃下孵育10-40min进行甲醛交联，孵育结束后加入甘氨酸至终浓度为0.1M-0.2M，在真空下孵育4-6min后用液氮研磨成粉末获得组织样品；其中，所述交联体系为以NIB缓冲液(核分离缓冲液)为基本缓冲液含有终浓度为0.1％-0.2％的巯基乙醇和1％-2％甲醛。
在本发明的一种具体的实施方式中，在1g样品中加入10-20ml提前预冷的(2-6℃)NIB缓冲液(在使用前加入15μl的巯基乙醇)和1-2ml的36％甲醛溶液，室温条件下，反应10-40min。添加1-2ml2M的甘氨酸，并在真空条件下反应4-6min，所有样品用超纯水清洗2-5次(3000rpm离心15-25min)，收集沉淀并研磨成粉末获得组织样品。
本发明所提供的方法还包括细胞核提取步骤：将1g所述组织样品置于8-12ml预冷的(2-6℃)含有蛋白酶抑制剂的NIB缓冲液中，并在冰上缓慢震荡10-20min，利用孔径为22-25微米的滤膜过滤两次悬浮液，4℃下3000g离心10-20min，收集沉淀，沉淀用8-12ml含有蛋白酶抑制剂的NIB缓冲液重悬后在4℃1900g离心4-6min，收集沉淀，再用1ml含有蛋白酶抑制剂的NIB缓冲液重悬沉淀后在4℃1900g离心5min，收集细胞核；
其中，含有蛋白酶抑制剂的NIB缓冲液中蛋白酶抑制剂的浓度为0.1mM-0.2mM。
当所述样品为白细胞时，甲醛交联的步骤包括：
PBS重悬收集的白细胞，加入甲醛至终浓度为2％，15-25℃下颠倒混匀8-12min，加入甘氨酸至终浓度为0.1M-0.2M，孵育2-3min；3000rpm离心15-25min，收集沉淀；用2-6℃的PBS重悬沉淀一次，离心去上清，加入2-6℃的含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液重悬细胞，2-6℃孵育18-22min后5000rpm离心4-6min，弃去上清。
可选的，所述方法还包括对所述交联后物料进行除蛋白孵育，所述除蛋白孵育的步骤包括：将所述交联后物料与SDS溶液接触混合获得SDS终浓度为0.3％的除蛋白体系，在37℃下孵育0.8-1.2h，孵育结束后加Triton X-100至终浓度为2％，37℃震荡温浴0.8-1.2h。
其中，内切酶酶切步骤的目的是使得交联的序列两侧产生粘性末端，从而保护蛋白与DNA、DNA与DNA之间的距离关系和互作频率。本发明对于内切酶的种类没有特别的限制可以选用六碱基内切酶或四碱基内切酶，可以根据物种基因组选择适合的内切酶。
本发明所提供的方法通过末端修复机制在序列中引入生物素标记的碱基，以便于后续DNA纯化和捕获。
可选的，所述末端修复步骤包括将所述酶切后物料与末端修复体系在37℃下接触孵育45-60min，其中所述末端修复体系包括：1μldNTP(含10mM dATP，10mM dGTP，10mM dTTP)，18.4μl-25μl0.4mM生物素-14和30U Klenow聚合酶。可以按照本领域常规的用量加入所述末端修复体系。
本发明所提供的方法还包括在内环化步骤结束后将DNA解交联，解交联的方式为将内环化后物料与蛋白酶K进行孵育。孵育结束后对DNA进行纯化，本发明对于DNA纯化的方式没有特别的限制，可以利用本领域常规的纯化方式进行，在一种优选的实施方式中，可以将解交联获得的物料与含有醋酸钠、糖原和无水乙醇的溶液混合在-80℃下接触孵育1-3h，而后离心并用水溶解沉淀，加RNase A去RNA，再用苯酚/氯仿进行抽提，最后用去离子水溶解DNA沉淀，获得纯化后的DNA。
所述方法还包括在纯化后将DNA破碎为300bp-700bp的片段获得打断产物，再对所述打断产物进行二次末端修复，以便进行后续建库步骤。
本发明所提供的方法可以适用于那些利用常规Hi-C高通量测序建库方法获得的环化效率低、有效数据率低的真核生物样品。特别适用于植物Hi-C文库的构建。而且，本发明所提供的方法应用于人血液白细胞样品时，也能够获得较高的环化效率和有效数据率。
本发明的高通量测序建库方法，具有以下优点及有益效果：
(1)能够有效的提高DNA的特性环化效率，获得的有效数据率明显高于传统方法。
(2)该方法提供的整体操作流程简便所有实验室均有条件实现。
(3)该方法可用于植物Hi-C文库的构建，还能用于细胞和动物组织的Hi-C文库的构建，适用性广泛。
(4)该方法构建的Hi-C文库可用于辅助复杂基因组的Denovo组装，尤其是林木和水产这些杂合度高，配制遗传群体难的物种。
附图说明
图1为Hi-C数据各类型在Uniq Mapped Read Pair比例分布图，说明Hi-C数据中不同片段类型，以及各类型所占比例。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。超声波清洗仪由江苏苏美电器公司生产，型号为KQ-50E；琼脂糖为Bio-RadLaboratories，Inc提供的CertifiedTM Low Range Ultra Agarose(#161-3107)；胶回收试剂盒为QIAGEN公司提供的QIAquick GelExtraction Kit(28706)和MinElute PCR Purification Kit(28006)，建库试剂由NEB提供的NEBNext DNA超快速文库制备试剂盒-illumina(E7370S)，纯化磁珠使用的是Beckman Coμlter公司的AMPure XP Beads(A63882)，DNA Marker买自New England Lab(NEB)公司的50bp DNA Ladder(N3236L)，末端修复模块为NewEngland Lab(NEB)公司的NEBNext末端修复模块，蛋白酶抑制剂为Roche的Complete EDTA-free Roche coctail(04693132001)。其它化学试剂采购与索莱宝生物科技有限公司。
实施例1 本发明的适用于水稻Hi-C的高通量测序建库方法
1.收集1g新鲜叶片(保证染色体互相作用完整)，并置于冰上。
2.将收集的新鲜组织放置于50ml离心管上，并添加15ml提前预冷的4℃NIB缓冲液(在使用前加入15μl的巯基乙醇)和1ml的36％甲醛溶液，25℃下孵育40min，只要保证样品沉于管底保证充分交联。添加2M的甘氨酸使其终浓度为0.1M，并在真空条件下反应5min，所有样品用超纯水清洗几次，并用液氮将样品研磨成粉末。
3.1g组织样品转移至含有10ml预冷的4℃NIB缓冲液(其中蛋白酶抑制剂的浓度为0.1mM)，并在冰上缓慢震荡15min，利用孔径为25微米过滤两次悬浮液，4℃3000g离心15min，收集细胞核，用1ml NIB缓冲液(其中蛋白酶抑制剂的浓度为0.1mM)重悬细胞核，然后4℃1900g离心5min，收集细胞核，用1ml NIB缓冲液(其中蛋白酶抑制剂的浓度为0.1mM)重悬细胞核，然后4℃1900g离心5min，收集细胞核。
4.用500μl 1.2×NEB 2缓冲液重悬细胞核，添加7.5μl 20％的SDS至SDS终浓度为0.3％，65℃温浴40min，然后37℃800rpm摇动温浴，去掉未与DNA结合的多余蛋白，添加50μl 20％(v/v)TritonX-100至Triton X-100终浓度为2％，37℃震荡温浴1h，隔离SDS，添加4μl 200U的Hind III，37℃震荡温浴12h，第二天添加1-2μl HindIII酶，继续酶切2-4h。然后用600μl 1×NEB 2缓冲液稀释酶切产物，并将酶切产物等分至两个1.5ml离心管中。然后用1μl dNTP(含10mM dATP，10mM dGTP，10mM dTTP)，18.4μl 0.4mM生物素-14-dCTP和30U Klenow polymerase，37℃45min，对DNA进行末端修复。
5.DNA环化处理，环化体系如下表1所示：
表1
试剂 用量
10X T4连接酶缓冲液(fermentas/Fisher) 700μl
50％PEG4000 700μl
10mg/mlBSA 70μl
T4DNA连接酶 50U
水 至体系总量为7ml
将末端修复后DNA与环化体系混合并在4℃2h然后22℃4h。
6.10mg/mL蛋白酶K 50μl，65℃过夜培养，解交连，10mg/mL蛋白酶K 25μl，继续培养2h。
7.DNA纯化：将上清转移至两个50ml低吸附离心管中，并添加水至15ml对样品进行稀释，添加1.5ml的3M NaCl，20μl糖原和35ml冰浴的无水乙醇，分装至4个10ml离心管中，-80℃孵育2h，离心后弃上清，并用1ml水溶解沉淀，并添加1μl RNase A，37℃温浴20min，去RNA，将用等体积苯酚:氯仿/异戊醇抽提的DNA用苯酚/氯仿进行抽提，并用86μl ddH2O溶解DNA沉淀，获得纯化后的DNA。
8.在超声清洗器(KQ-50E，连接稳压器)中加入冰水混合物(冰极少量或不可见)至刻度线下方，将塑料泡沫浮漂靠左上角放置(如果有冰将冰推至右下角)，打断条件如下表2所示：
表2
9.二次末端修复，修复体系如下表3所示：
表3
试剂 用量
10x ligation缓冲液(NEB) 5μl
10mM dNTP mix 2μl
T4DNA polymerase(NEB) 2.5μl
T4polynucleotide kinase(NEB) 2.5μl
Klenow DNA polymerase(NEB) 0.5μl
打断产物 38μl
总体积 50
20℃孵育30min。添加12μl 10×loading buffer(Takara Code No.9157)，65℃处理10min。
10.修复产物，点样于1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳条件100V，60min；切取“300bp下-600bp上”范围内凝胶，并用QIAGEN公司提供的QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒进行回溶，回溶体积300μl。
11.生物素下拉和双向测序：(所有的步骤均用Eppendorf的低吸附离心管)生物素标记的Hi-C DNA用Dynabeads MyOneStreptavin C1Beads吸附，具体步骤见Dynabeads MyOne StreptavinC1Beads操作说明书。
12.文库构建使用Nextera Mate Pair Sample Preparation Kit，超快速文库制备试剂盒-illumina(FC-132-1001)，具体操作步骤见试剂盒说明书。
13.用Hi-cup软件对Hi-C数据进行分析。由表4可知，水稻Hi-C文库的有效数据率为43.93％(如图1所示)。
14.利用LACHESIS软件对初步组装序列进行群组的划分、排序和定向，可以将二代测序拼接结果中的99.90％congtig和scaffold排列至相应的染色体中，其中准曲率为96.23％。
表4 水稻组装结果说明
组装指标 组装结果
组装总长度，包括缺口(Mb) 372.31756
contigs或scaffolds的数量 2,128
N50scaffold大小(Kb) 293.135
定位*
挂到染色体的比例 99.90(98.36)
挂到染色体错误比例 0.571(0.76)
定序*
确定染色体上顺序的比例 96.23(75.87)
定序错误的比例 0.05(0.13)
方向错误的比例 0.19(0.44)
注：*：定位和定序下的contigs均指初步组装序列中的contig或者scaffold序列；定序错误指相对参考基因组，在确定顺序的序列中与邻近contig或者scaffold序列顺序不一致的比例；方向错误在确定order序列中，与其直接相邻的contig或者scaffold序列方向不一致所占的比例。
实施例2 本发明的适用于人类血液Hi-C高通量测序建库方法及其与非本发明的建库方法之间的比较
一、非本发明的Hi-C建库方法实验步骤及结果：
1.收集1ml新鲜血液中的白细胞(保证染色体互相作用完整)，并置于冰上。
2.将收集的白细胞放置于15ml离心管中，用12ml新鲜配置的PBS重悬。加入686μl 37％的甲醛(终浓度2％)，室温颠倒混匀10min。添加1.8ml 1M的甘氨酸(终浓度0.125M)，混匀2-3min。3000rpm离心20min，收集白细胞；预冷的4℃PBS重悬沉淀一次，离心去上清。5ml预冷的4℃裂解缓冲液(加入蛋白酶抑制剂)重悬白细胞，冰上静置20mins(随时颠倒混匀)。5000rpm离心5mins，弃去上清。
3.用500μl 1.2×NEB 2缓冲液重悬细胞核，添加7.5μl 20％的SDS至SDS终浓度为0.3％，65℃温浴40min，然后37℃800rpm摇动温浴，去掉未与DNA结合的多余蛋白，添加50μl 20％(v/v)TritonX-100至Triton X-100终浓度为2％，37℃震荡温浴1h，隔离SDS，添加4μl 200U的Hind III，37℃震荡温浴12h，第二天添加1-2μl HindIII酶，继续酶切2-4h。然后用600μl 1×NEB 2缓冲液稀释酶切产物，并将酶切产物等分至两个1.5ml离心管中。然后用1μl dNTP(含10mM dATP，10mM dGTP，10mM dTTP)，18.4μl 0.4mM生物素-14-dCTP和30U Klenow polymerase，37℃45min，对DNA进行末端修复。
4.DNA环化处理：去除细胞核：管中加入86μl 10％SDS，65℃孵育30min，立即置冰上。准备15ml管，管中加入7ml ligation mix，由以下表5成分组成。
表5
试剂 用量
10％Triton X-100 700μl
10x ligation缓冲液 700μl
PEG4000 700μl
10mg/ml BSA 75μl
T4DNA连接酶 50U
水 4.85ml
消化好的染色体转入相对应的管中。在16℃孵育4h。
5.10mg/mL蛋白酶K 50μl，65℃过夜培养，解交连，10mg/mL蛋白酶K 25μl，继续培养2h。
6.DNA纯化：将上清转移至两个50ml低吸附离心管中，并添加水至15ml对样品进行稀释，添加1.5ml的3M NaCl，20μl糖原和35ml冰浴的无水乙醇，分装至4个10ml离心管中，-80℃孵育2h，离心后弃上清，并用1ml水溶解沉淀，并添加1μl RNase A，37℃温浴20min，去RNA，将用等体积苯酚：氯仿/异戊醇抽提的DNA用苯酚/氯仿进行抽提，并用86μl ddH2O溶解DNA沉淀，获得纯化后的DNA。
7.在超声清洗器(KQ-50E，连接稳压器)中加入冰水混合物(冰极少量或不可见)至刻度线下方，将塑料泡沫浮漂靠左上角放置(如果有冰将冰推至右下角)，打断条件如表2所示。
8.二次末端修复，修复体系如表3所示：20℃孵育30min。添加12μl 5×loding buffer，65℃处理10min。
9.修复产物点样于2.0％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳条件110V，120min；切取“300bp下-600bp上”范围内凝胶，并用QIAGEN公司提供的QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒进行回溶，回溶体积300μl；
10.生物素下拉和双向测序：(所有的步骤均用Eppendorf的低吸附离心管)生物素标记的Hi-C DNA用Dynabeads MyOne StreptavinC1Beads吸附，具体步骤见Dynabeads MyOne Streptavin C1Beads操作说明书。
11.文库构建使用Nextera Mate Pair Sample Preparation Kit超快速文库制备试剂盒-illumina(FC-132-1001)，具体操作步骤见说明书。
12.用Hi-cup软件对Hi-C数据进行分析。
二、本发明的高通量建库方法实验步骤及结果：
1.收集1ml新鲜血液中的白细胞(保证染色体互相作用完整)，并置于冰上。
2.将收集的白细胞放置于15ml离心管中，用12ml新鲜配置的PBS重悬。加入686μl 37％的甲醛(终浓度2％)，室温颠倒混匀10min。添加1.8ml 1M的甘氨酸(终浓度0.125M)，混匀2-3min。3000rpm离心20min，收集白细胞；预冷的4℃PBS重悬沉淀一次，离心去上清。5ml预冷的4℃裂解缓冲液(加入蛋白酶抑制剂，蛋白酶抑制剂的浓度为0.1mM。裂解缓冲液(配方为：10mM Tris-Hcl PH：8.0；10mM NaCl；0.2％CA-630(SIGMA,18896))重悬白细胞，冰上静置20min(随时颠倒混匀)。5000rpm离心5min，弃去上清。
3.用500μl 1.2×NEB 2缓冲液重悬，添加7.5μl 20％的SDS至SDS终浓度为0.3％，65℃温浴40min，然后37℃800rpm摇动温浴，去掉未与DNA结合的多余蛋白，添加50μl 20％(v/v Triton X-100至Triton X-100终浓度为2％，37℃震荡温浴1h，隔离SDS，添加4μl200U的Hind III，37℃震荡温浴12h，第二天添加1-2μl Hind III酶，继续酶切2-4h。然后用600μl 1×NEB 2缓冲液稀释酶切产物，并将酶切产物等分至两个1.5ml离心管中。然后用1μl dNTP(含10mMdATP，10mM dGTP，10mM dTTP)，18.4μl 0.4mM生物素-14-dCTP和30U Klenow polymerase，37℃45min，对DNA进行末端修复。
4.DNA细胞核内环化处理，环化体系如下表6
表6
试剂 用量
10X T4连接酶缓冲液(fermentas/Fisher) 700μl
50％PEG4000 700μl
10mg/mlBSA 70μl
T4DNA连接酶 50U
水 至体系总量为7ml
将末端修复后DNA与环化体系混合并在4℃2h然后22℃4h。
5.10mg/mL蛋白酶K50μl，65℃过夜培养，解交连，10mg/mL蛋白酶K 25μl，继续培养2h。
6.DNA纯化：将上清转移至两个50ml低吸附离心管中，并添加水至15ml对样品进行稀释，添加1.5ml的3M NaCl，20μl糖原和35ml冰浴的无水乙醇，分装至4个10ml离心管中，-80℃度孵育2h，离心后弃上清，并用1ml水溶解沉淀，并添加1μl RNase A，37℃温浴20min，去RNA，将抽提的DNA用苯酚/氯仿进行抽提，并用86μl溶解DNA沉淀，获得纯化后的DNA。
7.在超声清洗器(KQ-50E，连接稳压器)中加入冰水混合物(冰极少量或不可见)至刻度线下方，将塑料泡沫浮漂靠左上角放置(如果有冰将冰推至右下角)，打断条件如表2所示。
8.二次末端修复，修复体系如表3所示：20℃孵育30min。添加12μl 5×loding buffer，65℃处理10min。
9.修复产物点样于1.50％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳条件10V，60min；切取“300bp下-600bp上”范围内凝胶，并用QIAGEN公司提供的QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒进行回溶，回溶体积300μl。
10.生物素下拉和双向测序：(所有的步骤均用Eppendorf的低吸附离心管)生物素标记的Hi-C DNA用Dynabeads MyOneStreptavin C1Beads吸附，具体步骤见Dynabeads MyOne StreptavinC1Beads操作说明书。
11.文库构建使用Nextera Mate Pair Sample Preparation Kit超快速文库制备试剂盒-illumina(FC-132-1001)，具体操作步骤见说明书。
12.用Hi-cup软件对Hi-C数据进行分析。
由表7可知，本发明方法在有效数据率方面明显高于传统方法，由原来的27.27％提升至59.21％。
表7 两种建库方法数据比较
类型 本发明方法 常规方法
有效读长对数 2584608(52.65) 1225845(27.27)
无效读长对数 321596(6.55) 933595(20.77)
自连类型 58463(1.19) 319568(7.11)
末端“悬挂”类型 5592(0.11) 60861(1.35)
“中间”类型 49371(1.01) 206250(4.59)
相邻连接类型 127319(2.59) 218995(4.87)
连续连接型 8568(0.17) 9161(0.2)
插入片段长度错误 72283(1.47) 118760(2.64)
总读长对数 2906204(59.21) 2159440(48.04)
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种真核生物DNA的Hi-C高通量测序建库方法，其特征在于，DNA细胞核内环化步骤包括将末端修复后DNA与环化体系混合并在4-6℃孵育2-4h后在16-22℃下孵育4-6h获得内环化后物料；
其中，所述环化体系的组成成分包括：T4连接酶缓冲液、BSA、T4DNA连接酶以及选自PEG 4000和PEG 6000中的至少一种的聚乙二醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述环化体系包括以下用量的各组分：
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：首先对样品进行甲醛交联获得交联后的物料，对所述交联后物料进行内切酶酶切获得酶切后物料，用生物素标记的碱基对所述酶切后物料进行末端修复，获得末端修复后DNA，对所述末端修复后DNA进行DNA细胞核内环化获得内环化后物料，再对所述内环化后物料进行解交联和纯化获得DNA测序文库。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，末端修复步骤包括将所述酶切后物料与末端修复体系在37℃下接触孵育45-60min，末端修复体系包括：1μl 10mM dATP，1μl 10mM dGTP、1μl 10mMdTTP、1μl 10mM dCTP、18.4μl-25μl 0.4mM生物素-14和30UKlenow聚合酶。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对所述交联后物料进行除蛋白孵育，所述除蛋白孵育的步骤包括：将所述交联后物料与SDS溶液接触混合获得SDS终浓度为0.3％的除蛋白体系，在37℃下孵育0.8-1.2h，孵育结束后加Triton X-100至终浓度为2％，37℃震荡温浴0.8-1.2h。
6.根据权利要求1或5所述的方法，其特征在于，所述样品为植物组织、动物组织或白细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述样品为植物组织或动物组织，甲醛交联的步骤包括：在15-25℃下将样品与交联体系混合后在15-25℃下真空孵育10-40min进行甲醛交联，孵育结束后加入甘氨酸至终浓度为0.1M-0.2M，在真空下孵育4-6min后用液氮研磨成粉末获得组织样品；
其中，所述交联体系为以NIB缓冲液为基本缓冲液含有终浓度为0.1％-0.2％的巯基乙醇和1％-2％甲醛。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括细胞核提取步骤：将1g所述组织样品置于8-12ml预冷的含有蛋白酶抑制剂的NIB缓冲液中，并在冰上缓慢震荡10-20min，利用孔径为22-25微米的滤膜过滤两次悬浮液，4℃下3000g离心10-20min，收集沉淀，沉淀用8-12ml含有蛋白酶抑制剂的NIB缓冲液重悬后在4℃1900g离心4-6min，收集沉淀，再用1ml含有蛋白酶抑制剂的NIB缓冲液重悬沉淀后在4℃1900g离心5min，收集细胞核；
其中，含有蛋白酶抑制剂的NIB缓冲液中蛋白酶抑制剂的浓度为0.1mM-0.2mM。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述样品为白细胞，甲醛交联的步骤包括：
PBS重悬收集的白细胞，加入甲醛至终浓度为2％，15-25℃下颠倒混匀8-12min，加入甘氨酸至终浓度为0.1M-0.2M，孵育2-3min；3000rpm离心15-25min，收集沉淀；用2-6℃的PBS重悬沉淀一次，离心去上清，加入2-6℃的含蛋白酶抑制剂的裂解缓冲液重悬细胞，2-6℃孵育18-22min后5000rpm离心4-6min，弃去上清。
10.根据权利要求1、7-9中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在纯化后将DNA破碎为300bp-700bp的片段获得打断产物，再对所述打断产物进行二次末端修复。
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